CN109939127A - Nk细胞的应用及包括该nk细胞的药物组合物及其应用 - Google Patents

Nk细胞的应用及包括该nk细胞的药物组合物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种NK细胞的应用及包括该NK细胞的药物组合物及其应用，所述应用为NK细胞在制备肿瘤微环境中PD‑1或PD‑L1由阴转阳或由低表达到高表达的药物中的应用；所述抗肿瘤的药物组合物，包括有效治疗量的上述NK细胞，以及与PD‑1或PD‑L1特异结合靶点药物，所述靶点药物通过与PD‑1或PD‑L1特异结合阻断PD‑1和PD‑L1的相互作用。本发明的有益效果为：通过将NK细胞添加在PD‑1或PD‑L1阴性或低表达的癌(肿瘤)细胞中，意外地发现能够使肿瘤细胞中PD‑1或PD‑L1由阴转阳，或由低表达到高表达，从而有效阻止肿瘤细胞中免疫逃逸的发生，提高治疗效果。

Description

NK细胞的应用及包括该NK细胞的药物组合物及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术，涉及一种NK细胞的应用及包括该NK细胞的药物组合物及其应用。
背景技术
随着肿瘤免疫治疗研究的逐步进展，程序性死亡生长因子-1(PD-1/CD 279)及其配体PD-L1/2(B7-H1/CD274)作为肿瘤微环境中的重要成员获得众多研究者的青睐。PD-L1全称程序性死亡受体-配体1，英文名字programmed cell death-Ligand 1，是大小为40kDa的第一型跨膜蛋白。PD-1全称程序性死亡受体1，英文名字为programmed death 1，是一种重要的免疫抑制分子，为CD28超家族成员。PD-1(programmed death-1)主要表达于T细胞及初级B细胞表面，PD-1的两个配体(PD-L1和PD-L2)，广泛表达于抗原提呈细胞(APC)等。PD-1与其配体的相互作用，在免疫应答的负性调控方面发挥着重要作用。在许多人类肿瘤组织，如卵巢癌、膀胱癌、恶性黑色素瘤和胶质瘤中均可检测到PD-L1蛋白的表达，肿瘤部位的微环境可诱导肿瘤细胞上的PD-L1的表达，表达的PD-L1有利于肿瘤的发生和生长，诱导抗肿瘤T细胞的凋亡，进而逃避免疫系统的攻击。PD-1与配体PD-L1/2结合使ITIM和ITSM内的酪氨酸磷酸化，ITIM、IT SM与SH P-1和SH P-2结合，通过BC L·XL的下调表达和T细胞的分化传递T细胞抑制性信号，间接导致细胞死亡。PD-1PD-L1/2途径也被认为是介导免疫抑制的路径，PD-1作为一个负性调控点起作用。抑制PD-1与其配体的结合，可以使肿瘤细胞暴露于免疫系统的杀伤视野，进而达到杀伤肿瘤组织及治疗癌症的作用。
2014年9月4号，美国食品及药物管理局(food and drug adm-inistration，FDA)批准了Keytruda(pembrolizumab)用于治疗对其它药物治疗无效的晚期或无法切除的黑色素瘤患者，成为阻断PD-1细胞通路的首款获得FDA批准的药物。在2016 AACR年会上，华盛顿大学医学院皮肤病学科教授Paul T.Nghiem，MD，PhD做出报道，pembrolizumab这一具有抗PD-1作用的单克隆抗体可诱导高级别默克尔细胞癌的高反应性，中位无进展生存期PFS是9个月，传统化疗的患者PFS是3个月。近日百时美PD-1抑制剂Opdivo在临床试验方面取得新进展，发布了两组数据，其中一组显示，对当前任何药物均无治疗反应的晚期黑色素瘤的患者在使用Opdivo治疗中取得了34％五年生存率的结果。值得注意的是，IV期黑色素瘤患者的五年生存率通常只有15％到20％。另一组数据表明Opdivo和Yervoy联用治疗晚期黑色素瘤患者中取得22％的总缓解率，并且达到了69％两年总体生存率。另一项研究表明难治复发性或转移性头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)患者在使用Opdivo治疗后生存期和存活率大大提高。数据表明，与对照组相比Opdivo治疗组死亡风险显著降低30％，中位总生存期显著延长。Opdivo治疗组一年存活率为36％，对照组为16.6％。此外，该研究还通过口咽部肿瘤HPV状态及PD-L1表达状态评估了Opdivo相对于对照方案的疗效。近期，Keytruda获FDA治疗复发性或难治性(R/R)经典型霍奇金淋巴瘤(cHL)的突破性药物资格。
自然杀伤(NK)细胞是用于过继癌症免疫治疗的重要效应细胞类型。类似于T细胞，NK细胞可修饰以表达嵌合抗原受体(CARs)，以增强抗肿瘤活性。CD19CAR-T细胞在CD19阳性恶性肿瘤患者的成功应用，证明这种方法用于癌症免疫治疗(see e.g.Grupp et al,2013)的可行性。CAR-T细胞靶向多种不同的肿瘤抗原正在积极的进行临床开发(Kalosetal.,2013)。NK细胞在癌症免疫监视中起重要作用，并且代表用于过继癌症免疫疗法的重要效应细胞类型。与T细胞相比，它们不需要事先活化和识别复合体MHC分子呈递的肽抗原。相反，通过编码的细胞表面受体偶联CD3ζ分子，在适当的刺激下，NK细胞可表现出杀伤活性。
但是目前用PD-1抗体或PD-L1抗体治疗癌症的过程中发现，有很大一部分患者用药后效果不明显，可能是患者体内存在某些与PD-1或PD-L1结合的保护因子，或者这些肿瘤患者体内PD-1或PD-L1为阴性或低表达，使PD-1抗体或PD-L1抗体无法与PD-1或PD-L1结合，从而无法通过PD-1抗体或PD-L1抗体抑制肿瘤细胞内的免疫逃逸现象，进而无法杀伤和治疗肿瘤。如何能够有效地解决这一问题，成为当前通过PD-1抗体或PD-L1抗体有效治疗癌症急需解决的问题。
发明内容
针对上述技术问题，本发明的一个目的是提供一种NK细胞，本发明的另一个目的是提供一种包括NK细胞的抗肿瘤药物组合物，本发明的又一个目的是提供一种上述药物组合物的应用，通过添加NK细胞使肿瘤细胞中PD-1或PD-L1由阴转阳，或由低表达到高表达，从而通过PD-1抗体或PD-L1抗体抑制肿瘤细胞内的免疫逃逸现象，使NK细胞与PD-1或PD-L1抗体联合使用的情况下，有效地治疗癌症。
本发明提供一种NK细胞在制备肿瘤微环境中PD-1或PD-L1由阴转阳或由低表达到高表达的药物中的应用。
在本发明的一个优选实施例中，所述NK细胞为CAR-NK细胞。
在本发明的一个优选实施例中，所述CAR-NK细胞为ROBO1CAR-NK细胞。
在本发明的一个优选实施例中，所述肿瘤为肿瘤细胞中PD-1或PD-L1呈阴性或低表达的肿瘤。
在本发明的一个优选实施例中，所述肿瘤为胶质母细胞瘤、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、肾细胞癌、头颈部及食管鳞状细胞癌或非小细胞肺癌。
本发明还提供一种抗肿瘤药物组合物，包括有效治疗量的上述NK细胞，以及与PD-1或PD-L1特异结合靶点药物，所述靶点药物通过与PD-1或PD-L1特异结合阻断PD-1和PD-L1的相互作用。
在本发明的一个优选实施例中，所述NK细胞与肿瘤细胞的效靶比为(0.1～5)：1：1；所述靶点药物的浓度为0～10mg/ml。
在本发明的一个优选实施例中，所述靶点药物的浓度为10μg/ml。
在本发明的一个优选实施例中，所述靶点药物为PD-1或PD-L1抗体或抗原结合片段。
在本发明的一个优选实施例中，所述PD-1或PD-L1抗体为PD-1或PD-L1单抗药物。
在本发明的一个优选实施例中，所述靶点药物为PD-L1 CAR-T细胞药物或PD-L1CAR-NK细胞药物。
在本发明的一个优选实施例中，所述靶点药物为PD-1或PD-L1分子抑制剂。
在本发明的一个优选实施例中，所述药物组合物还包括药学上可接受的盐、载体、赋型剂和辅料。
按照本发明所属技术领域的一些通用方法，本发明的药物可制成药学上可接受的各种剂型，如片剂、胶囊剂、口服液剂、锭剂、注射剂、软膏剂、颗粒剂或各种缓控释制剂等。优选为注射剂，可经皮下注射给药。
本发明药物的载体可以是药学领域中可得到的常见类型，包括：黏合剂、润滑剂、崩解剂、助溶剂、稀释剂、稳定剂、悬浮剂或基质等。
在本发明的一个优选实施例中，所述肿瘤为肿瘤中PD-1或PD-L1呈阴性或低表达的肿瘤。
在本发明的一个优选实施例中，所述肿瘤为胶质母细胞瘤、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、肾细胞癌、头颈部及食管鳞状细胞癌或非小细胞肺癌。
本发明还提供一种上述抗肿瘤药物组合物在用于制备抗癌药物中的应用。
本发明的有益效果为：通过添加将NK细胞添加在PD-1或PD-L1阴性或低表达的癌(肿瘤)细胞中，意外地发现能够使肿瘤细胞中PD-1或PD-L1由阴转阳，或由低表达到高表达，并使产生的PD-1或PD-L1与PD-1抗体或PD-L1抗体结合，从而有效组织肿瘤细胞中免疫逃逸的发生，提高治疗效果；也就是通过PD-1或PD-L1抗体的联合使用，能够有效地解决PD-1抗体或PD-L1抗体治疗PD-1或PD-L1阴性或低表达的肿瘤细胞时，治疗效果不明显的技术问题，从而有效地治疗癌症，提高PD-1抗体或PD-L1抗体的广谱性，能够极大地节约成本，为癌症的治疗开拓新的里程。
附图说明
参照附图，根据下面的详细描述，可以更加清楚地理解本发明，其中：
图1为本发明实施例1提供的慢病毒质粒载体PRRLSIN-SCFV(anti ROBO1-FN3)的结构示意图；
图2a-2b为本发明实施例3提供的ROBO1 CAR-NK流式检测CAR细胞阳性率的结果图；
图3a-3b所示为本发明实施例3提供的ROBO1 CAR-NK流式检测CD56分子阳性率的结果图；
图4a-f为本发明的实施例4中将ROBO1 CAR-NK细胞加入乳腺癌细胞后的流式检测MCF-7表面的PDL1的表达变化情况，其中，图4a、图4b、图4c、图4d、图4f分别为0h、8h、10h、12h、14h和16h的表达情况；
图5为本发明的实施例4中将ROBO1 CAR-NK细胞加入乳腺癌细胞后流式检测MCF-7表面的PDL1的表达变化情况的统计结果；
图6a-c为本发明的实施例5中将ROBO1 CAR-NK细胞加入乳腺癌细胞的试验中通过流式检测MCF-7表面的PD-L1的表达变化情况，其中，图6a为负对照，图6b为0h的表达情况，图6c为16h的表达情况，图6d为ROBO1 CAR-NK的表达情况；
图7为本发明的实施例5中将ROBO1 CAR-NK细胞加入PD-L1上调后的MCF-7细胞16h后的杀伤结果，其中，MCF7为MCF-7细胞作为对照组，MCF7-16hr为ROBO1 CAR-NK杀伤16h后的MCF-7细胞(PD-L1上调后的MCF-7细胞)，Robo1 0.5：1表示以0.5:1的效靶比加入ROBO1CAR-NK细胞，Robo1 1：1表示以1:1的效靶比加入ROBO1 CAR-NK细胞；
图8为本发明的实施例5中将PD-L1抗体加入PD-L1上调后的MCF-7细胞24h后的杀伤结果，其中，MCF7为MCF-7细胞作为对照组，MCF7-16hr为ROBO1 CAR-NK杀伤16h后的MCF-7细胞，10ug/ml为加入10μg/ml PD-L1抗体的杀伤结果，100ug/ml为加入100μg/ml PD-L1抗体的杀伤结果，1mg/ml为加入1mg/ml PD-L1抗体的杀伤结果，10mg/ml为加入10mg/ml PD-L1抗体的杀伤结果，100mg/ml为加入100mg/ml PD-L1抗体的杀伤结果；
图9为本发明的实施例5中将PBMC和PD-L1抗体加入PD-L1上调后的MCF-7细胞24h后的杀伤结果，其中，MCF7为MCF-7细胞作为对照组，MCF7-16hr为ROBO1 CAR-NK杀伤16h后的MCF-7细胞，其中，PBMC5:1为以5:1的效靶比加入PBMC的杀伤结果，PBMC+10ug/ml为以5:1的效靶比加入PBMC和10μg/ml PD-L1抗体的杀伤结果，PBMC+100ug/ml为以5:1的效靶比加入PBMC和100μg/ml PD-L1抗体的杀伤结果，PBMC+1mg/ml为以5:1的效靶比加入PBMC和1mg/ml PD-L1抗体的杀伤结果，PBMC+100mg/ml为以5:1的效靶比加入PBMC和100mg/ml PD-L1抗体的杀伤结果；
图10a为本发明的实施例6中介入穿刺针将细胞送到肝区肿瘤转移灶的影像图片结果；
图10b为本发明的实施例6中穿刺针从肝区肿瘤转移拔出，细胞留在病灶处的影像图片结果；
图11a为本发明的实施例6中未经治疗的转移灶ROBO1抗体染色结果；
图11b为本发明的实施例6中未经治疗的转移灶PD-L1抗体染色结果；
图12a为本发明的实施例6中治疗后肝区转移灶ROBO1抗体染色结果；
图12b为本发明的实施例6中治疗后肝区转移灶PD-L1抗体染色结果；
图12c为本发明的实施例6中治疗前肝区转移灶PD-L1抗体染色结果。
具体实施方式
现在将参照附图来详细描述本发明的各种示例性实施例。应注意到：除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的方法和步骤的参数数值不限制本发明的范围。
以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。
对于相关领域普通技术人员已知的技术、方法可能不作详细讨论，但在适当情况下，所述技术、方法当被视为说明书的一部分。
除非特别指明，本文中的“PD-1”和“PD-L1”包括由细胞自然表达的任何变体或同种型和/或其片段，该片段具有全长多肽的至少一种生物活性。
除非特别指明，本文中的“NK细胞”包括“外周血NK细胞、NK92细胞和其他NK细胞”。
除非特别指明，本文中的“ROBO1 CAR-NK”是指“以ROBO1为靶点的嵌合抗原受体细胞，特别是一种以ROBO1为靶点的加强型CAR-T细胞和CAR-NK细胞”，且本文中出现的英文名称不区分大小写，如ROBO1、Robo1、robo1等表示的含义相同；Robo1 CAR-NK、Robo1-CAR NK表示的含义相同。
除非特别指明，本发明所述的“NK”为人体正常NK细胞或NKT细胞或NK细胞系，其包括NK-92细胞，YT细胞，NKL细胞，HANK-1细胞，NK-YS细胞，KHYG-1细胞，SNK-6细胞和IMC-1细胞等。本发明的具体实施例中以NK-92细胞为例进行说明。
除非特别指明，本文中的“肿瘤微环境”包括“肿瘤细胞以及肿瘤细胞中的免疫T细胞”。
除非特别指明，本文中的“MCF7-16hr”为“ROBO1 CAR-NK杀伤16h后的MCF-7细胞”。
除非特别指明，本文中的“PD-L1”与“PDL1”的意思相同。
除非特别指明，本文中的“载体”为物质组合物，其包括分离的核酸，并且其可用于传递分离的核酸至细胞内部。很多载体在本领域中是已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两性分子化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语也应被解释为包括便于将核酸转移入细胞的非质粒和非病毒化合物，诸如例如聚赖氨酸化合物、脂质体等等。病毒载体的例子包括但不限于，腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体等等。
除非特别指明，本文中的“抗体”包括整个抗体及其任意抗原结合片段(即，“抗原结合部分”)或单链。
除非特别指明，本文中的试剂均为分析级纯，且可从正规渠道商购获得。
下述实施例中的材料来源：
NK-92细胞(CRL-2407)，乳腺癌MCF7购自中国科学院上海生科院细胞资源中心。
实施例1慢病毒载体的制备
分别合成SCFV(Anti ROBO1-FN3)-CD8-4-1BB-CD3ζ融合基因序列(其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，基因序列如SEQ ID NO：2所示)和突变型SCFV(Anti ROBO1-FN3)-CD8-4-1BB-CD3ζ融合基因序列(其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，基因序列如SEQ ID NO：4所示)。以SCFV(Anti ROBO1-FN3)-CD8-4-1BB-CD3ζ融合基因为例说明ROBO1 CAR-NK细胞的制备过程，突变型SCFV(Anti ROBO1-FN3)-CD8-4-1BB-CD3ζ融合基因制备ROBO1M CAR-NK细胞的过程与其相同。
通过酶切，将SCFV(Anti ROBO1-FN3)-CD8-4-1BB-CD3ζ融合基因序列转化连接到PRRSLIN载体中，基因上游为EF-1α启动子。载体转化Stbl3大肠杆菌菌株，氨苄青霉素筛选，获得阳性克隆，提取质粒，酶切鉴定克隆，获得PRRLSIN-SCFV(anti ROBO1-FN3)慢病毒转染载体(如图1所示)。
实施例2慢病毒的制备
(1)转染前24小时，以每皿约8×106个细胞将293T细胞接种至15cm培养皿中。确保转染时细胞在80％左右的汇合度且均匀分布于培养皿中。
(2)准备溶液A和溶液B
溶液A：6.25ml 2×HEPES buffer缓冲液(5个大皿一起包装的量，效果最好)。
溶液B为分别加入以下质粒的混合物：112.5μg PRRLSIN-SCFV(anti ROBO1-FN3)(target plasmid)；39.5μg pMD2.G(VSV-G envelop)；73μg pCMVR8.74(gag，pol，tat，rev)；625μl 2M钙离子溶液。溶液A总体积：6.25ml。
充分混匀溶液B，轻轻涡旋溶液A的同时，逐滴加入溶液B，得到溶液A和B的混合溶液，静置5-15分钟。轻轻涡旋上述A和B的混合溶液，逐滴加入含293T细胞的培养皿中，轻轻前后晃动培养皿使DNA与钙离子的混合物均匀分布。再将该培养皿(不要旋转培养皿)放置于培养箱中培养16-18小时。更换新鲜培养基，继续培养，分别在48小时和72小时后收集含病毒的上清液。500g，25℃离心10分钟。PES膜(0.45μm)过滤。以70％乙醇消毒贝克曼库尔特Ultra-clear SW28centrifuge tubes，并置于紫外灯下消毒30分钟。将已过滤的含慢病毒的上清液转移至离心管中。在离心管底部小心铺上一层20％蔗糖(每8ml上清液加1ml蔗糖)。以PBS平衡离心管，25000rpm(82，700g)，4℃离心2小时。小心取出离心管，倒掉上清液，倒置离心管去掉残余液体。加入100μl PBS，密封离心管，在4℃放置2小时，每20分钟轻轻涡旋一次，500g离心1分钟(25℃)，收集病毒上清。冰上冷却后，置于-80℃保存。
实施例3 ROBO1 CAR-NK细胞的制备
将NK-92细胞密度调整至2～3×105个/ml，按体积比(V/V)病毒：细胞培养基＝1:5比例添加病毒，同时添加聚凝胺8μg/ml。4h之后，补加等量的新鲜的完全培养基将细胞密度调整至1×105个/ml继续培养。次日，将所有的细胞离心，加入新鲜的培养基，继续培养。每隔1-2天进行补液，使维持细胞密度在2～3×105个/ml。72h后进行CAR抗体染色，同时流式分选ROBO1 CAR NK-92阳性细胞并扩大培养。每天观察培养基的颜色变化、细胞密度、细胞形态并作相应记录。
流式分选后，阳性ROBO1 CAR NK-92细胞在GMP车间进行持续培养，将其扩增到临床使用所需计量后，进行离心和三次洗涤(PBS溶液)，最终将ROBO1 CAR-NK 92重悬在生理盐水中，用于临床治疗回输。
临床治疗回输前，参考药典的检测方法，对ROBO1 CAR-NK 92进行质量检测，保证细胞质量的安全性。检测结果如表1所示。
表1 ROBO1 CAR NK-92细胞质量检测
放行参数 GMP放行标准 实际检测结果
无菌检测(液体培养法) 阴性 阴性
无菌检测(革兰氏染色法) 阴性 阴性
细胞活率(台酚蓝染色) >95％ 98％
内毒素(鲎试剂法) <5EU/kg/h <5EU/kg/h
CAR阳性率(流式检测) >90％ 96.31％(见图2)
支原体DNA(PCR法) 阴性 阴性
CD56+(流式检测) 阳性 阳性(见图3)
利用流式检测CAR NK-92细胞阳性率，流式检测结果如图2a和图2b所示。图2a和图2b中，所采用的抗体为APC荧光标记，在横坐标上进行表示，NK92细胞若成功表达CAR分子，该信号值将显著升高。从图2a和图2b中可以看出，APC荧光标记的信号值显著升高，表明NK-92细胞成功表达出CAR分子，CAR-NK92阳性率为98.89％。
图3a和图3b为ROBO1 CAR-NK流式检测CD56分子阳性率的结果图。图3a为对照组，图3b实验组。从图3a和3b中可以看出，CD56分子为阳性，说明制备的CAR-NK92细胞未丢失CD56分子，未发生其它形式的分化，保存NK细胞的基本特性。
以同样的方法制备ROBO1M CAR-NK细胞，下述实施例中用于肿瘤治疗的为ROBO1MCAR-NK细胞。
实施例4 ROBO1 CAR-NK细胞介入治疗肿瘤细胞
将乳腺癌细胞MCF-7细胞，以DMEM培养基添加10％FBS培养于含5％CO2的37℃培养箱。再将培养的乳腺癌细胞MCF-7提前铺板贴壁，按照效靶比E:T＝0.1:1，再加入效应细胞ROBO1 CAR-NK，作用时间0h，8h，10h，12h，14h，16h，然后流式检测MCF-7表面的PD-L1的表达变化，结果如图4a-4f所示，并将其进行统计，结果如图5所示。
从图中可以看出，MCF-7细胞的表面PD-L1表达在杀伤后，0-16h小时内是逐渐升高的，说明ROBO1 CAR-NK细胞的加入能够提高MCF-7细胞中PD-L1的表达。
实施例5 ROBO1 CAR-NK细胞和PDL1抗体联用治疗肿瘤细胞
ROBO1 CAR-NK细胞作用MCF7细胞以0.1:1的效靶比作用16小时，将MCF7靶细胞重新消化铺板，同时MCF7细胞作为对照，分别用一定浓度梯度的PD-L1的抗体作用MCF7和PD-L1上调的MCF7细胞，以及PBMC和PD-L1联合对MCF7和MCF7-PDL1的杀伤效果；用CCK8的方法检测，结果如图6a-d，图7-9所示。
从图6a-d可以看出，MCF7细胞中加入ROBO1 CAR-NK细胞后，PD-L1明显上升，说明ROBO1 CAR-NK细胞能够有效地提高MCF7细胞中PD-L1的表达量。
从图7可以看出，ROBO1CAR-NK细胞对PD-L1上调的MCF7依然有较好的杀伤效果，稍微差于对照MCF7细胞。
从图8可以看出，PD-L1抗体对MCF7和MCF7-16hr(PD-L1上调的MCF7)有不同的杀伤效果，MCF7在100μg/ml有较好的效果，但是对MCF7-16hr的效果不敏感。
从图9可以看出，PBMC以效靶比为5:1，并且联合一定的浓度梯度的PD-L1抗体分别对MCF7和MCF7-16hr(PD-L1上调的MCF7)作用24小时，可以看出对照MCF7，随着PD-L1抗体浓度的增大，杀伤效果逐渐增高，而对MCF7-16hr细胞，在10μg/ml已表现较好的杀伤效果。
上述结果说明，MCF-7细胞通过加入ROBO1 CAR-NK细胞使得PD-L1的表达上调，再单独加入PD-L1抗体后，对MCF7细胞的杀伤效果不明显，但是同时将PBMC和PD-L1抗体加入后，对MCF7细胞的杀伤效果明显(这是因为PD-1存在于免疫细胞中，需要通过添加的PBMC，从而使表达量提高的PD-L1与PD1形成PD-1信号通路，并联合PD-L1抗体，阻断肿瘤细胞的免疫逃逸，从而提高对肿瘤的杀伤效果)，并且加入10μg/ml的PD-L1抗体达到的杀伤效果，就与对照MCF7细胞加入100mg/ml PD-L1抗体达到的杀伤效果相当，PD-L1抗体在10μg/ml-10mg/ml加入量范围内，均能达到较好的杀伤效果，当PD-L1抗体的加入量为100mg/ml时杀伤效果已经饱和，说明ROBO1 CAR-NK细胞和PD-L1抗体的联用能够通过提高PD-L1的上调，从而提高对MCF7细胞的杀伤效果，大大减少PD-L1抗体的使用量。
实施例6临床试验
1.患者情况
卞**，年龄：47岁，性别：男，临床诊断：胰腺恶性肿瘤，肝继发恶性肿瘤。
2017年12月28日患者因“腹泻一年，加重2月伴右上腹疼痛”入院，CT检查结果：胰体尾癌伴肝多发转移瘤，脾动脉、静脉可疑受累及；左肾盂旁囊肿。
2018年1月22日PET-CT检查结果：1、胰腺体部低密度灶，代谢增高，考虑恶性病变；2、肝脏多发低密度灶，胰腺旁肿大淋巴结，代谢增高，考虑转移；3、右上颌窦粘膜增厚，代谢不高，考虑副鼻窦炎；4、双肺上叶条索影，代谢不高，考虑炎性病变，双侧胸腔积液；等。
2018年2月27日PET-CT检查1、胰腺体尾部低密度灶，代谢增高，考虑恶性病变；2、肝脏多发低密度灶，代谢增高，考虑转移；3、左侧紧上腺增粗，代谢增高，考虑转移可能；4、胸骨右侧、心隔角见肿大淋巴结，代谢稍高，考虑转移可能。
2.病人采用肝区穿刺局部介入治疗
卞**，年龄：47岁，性别：男，临床诊断：胰腺恶性肿瘤，肝继发恶性肿瘤(已签订知情同意书)。通过穿刺针将ROBO1 CAR-NK细胞送入到肝部肿瘤转移病灶，其中有三个转移灶坚持穿刺介入治疗，其余转移灶未进行介入治疗，如图10a-10b所示。静脉滴注为通过静脉滴注方式将ROBO1CAR-NK输入到病人体内，输入时间为2h。治疗剂量和给药时间如下表2。
表2
2.免疫后检测
经过多次治疗后，取病人肝区转移灶进行免疫组化检查。转移灶包括连续接受介入治疗和未经介入治疗的，免疫组化流程包括切片、制片，以及将制得的切片进行组织染色；再将染色后的切片晾干半天，于显微镜下拍照，免疫统计结果如下述表3所示。
表3.免疫组化统计表格
结果如图11a-12b，及图12a-12c所示，从图中可以看出，结果显示，肝区转移肿瘤病灶在注射ROBO1CAR-NK细胞药物前，免疫组化结果显示肿瘤PD-L1表达为阴性，即不表达PD-L1分子。当ROBO1 CAR-NK细胞药物给药后，介入给药的病灶PD-L1表达为阳性，而未经局部介入给药的转移病灶PD-L1表达仍为阴性。说明ROBO1 CAR-NK局部介入治疗可以调变肿瘤PD-L1分子的表达，由不表达变成表达PD-L1分子。为PD-1或PD-L1抗体药物使用奠定了分子基础。
本发明的描述是为了示例和描述起见而给出的，而并不是无遗漏的或者将本发明限于所公开的形式。很多修改和变化对于本领域的普通技术人员而言是显然的。选择和描述实施例是为了更好说明本发明的原理和实际应用，并且使本领域的普通技术人员能够理解本发明从而设计适于特定用途的带有各种修改的各种实施例。
序列表
<110> 阿思科力（苏州）生物科技有限公司
<120> NK细胞的应用及包括该NK细胞的药物组合物及其应用
<130> 1046
<150> 2018106060216
<151> 2018-06-13
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 480
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp
35 40 45
Ile Ser Asn Phe Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser
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Lys Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn
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Thr Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Gln
130 135 140
Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser
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Lys Leu Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly Asp Ile Val Pro
180 185 190
Asn Asn Gly Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Asn Phe Arg Gly Lys Ala Thr
195 200 205
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210 215 220
Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Phe Ser Asn
225 230 235 240
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Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala
275 280 285
Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr
290 295 300
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Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp
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355 360 365
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370 375 380
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435 440 445
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
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<211> 1440
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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taccagcagg gccagaacca gctctataac gagctcaatc taggacgaag agaggagtac 1200
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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Claims (10)

1.NK细胞在制备肿瘤微环境中PD-1或PD-L1由阴转阳或由低表达到高表达的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述NK细胞为CAR-NK细胞；优选地，所述CAR-NK细胞为ROBO1CAR-NK细胞。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为肿瘤细胞中PD-1或PD-L1呈阴性或低表达的肿瘤；优选地，所述肿瘤为胶质母细胞瘤、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、肾细胞癌、头颈部及食管鳞状细胞癌或非小细胞肺癌。
4.一种抗肿瘤的药物组合物，包括有效治疗量的权利要求1至3中任一项中所述的NK细胞，以及与PD-1或PD-L1特异结合的靶点药物，所述靶点药物通过与PD-1或PD-L1特异结合阻断PD-1和PD-L1的相互作用。
5.根据权利要求4所述的抗肿瘤的药物组合物，其特征在于，所述NK细胞与肿瘤细胞的效靶比为(0.1～5)：1；所述靶点药物的浓度为0～10mg/ml；优选地，所述靶点药物的浓度为10μg/ml。
6.根据权利要求4或5所述的抗肿瘤的药物组合物，其特征在于，所述靶点药物为PD-1或PD-L1抗体或抗原结合片段。
7.根据权利要求6所述的抗肿瘤的药物组合物，其特征在于，所述PD-1或PD-L1抗体为PD-1或PD-L1单抗药物。
8.根据权利要求4或5所述的抗肿瘤的药物组合物，其特征在于，所述靶点药物为PD-L1CAR-T细胞药物或PD-L1 CAR-NK细胞药物；或
所述靶点药物为PD-1或PD-L1分子抑制剂。
9.根据权利要求4至8中任一项所述的抗肿瘤的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的盐、载体、赋型剂和辅料。
10.根据权利要求4至9中任一项所述的抗肿瘤的药物组合物在用于制备抗肿瘤药物中的应用。
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