CN103816535B - 一种肿瘤疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肿瘤疫苗及其制备方法。所述肿瘤疫苗为采用肼苯哒嗪和SAHA共同处理肿瘤细胞获得exosomes肿瘤疫苗。本发明还公布了一种肿瘤疫苗的制备方法，包括使用肼苯哒嗪联合SAHA处理肿瘤细胞，分离与纯化肿瘤细胞分泌的exosomes。本发明提高exosomes肿瘤疫苗治疗效果，具有重要的临床应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种疫苗，具体涉及一种肿瘤疫苗及其制备方法，更具体的涉及一种exosomes肿瘤疫苗及其制备方法。
背景技术
近年来，肿瘤作为一种严重威胁人们生命的疾病，其治疗方法已成为众多科研工作者致力于研究的课题，随着免疫学、细胞生物学与分子生物学的飞速发展，继肿瘤手术、放疗及化疗三大疗法之后，肿瘤的生物治疗已经成为第四大疗法。肿瘤生物治疗中包括免疫治疗、基因治疗、干细胞治疗、诱导肿瘤细胞分化及凋亡、抑制肿瘤新生血管治疗等。免疫方法治疗肿瘤，因其毒性较低而备受关注，其中肿瘤疫苗的研制开发更是人们关注的焦点。
肿瘤疫苗主要通过激活患者自身免疫系统，利用肿瘤细胞或肿瘤抗原物质诱导机体的特异性细胞免疫和体液免疫反应，增强机体的抗癌能力，阻止肿瘤的生长、扩散和复发，以达到清除或控制肿瘤的目的。肿瘤疫苗大致可分为肿瘤细胞疫苗、肿瘤抗原及抗原类分子疫苗、核酸疫苗、重组病毒、病菌疫苗以及树突状细胞(dendritic cell，DC)疫苗。肿瘤细胞疫苗是从机体肿瘤组织中提取肿瘤细胞，灭活处理后使肿瘤细胞丧失致瘤性，但仍保持其免疫原性，然后对机体进行免疫；肿瘤抗原及抗原类分子疫苗是利用肿瘤抗原或类抗原决定簇多肽、抗独特型抗体制备的疫苗接种病人诱导免疫应答；核酸疫苗是指将含有编码某种抗原蛋白基因序列的质粒作为疫苗，直接导入动物细胞内，通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，从而使被接种动物获得相应的免疫保护；重组病毒、病菌疫苗以及树突状细胞疫苗是指人们将携带编码肿瘤抗原、细胞因子、共刺激分子的基因的病毒接种患者，通过他们在体内的表达诱发机体针对肿瘤的免疫应答；树突状细胞疫苗是指被激活的来源于骨髓的树突细胞在细胞表面表达高水平的MHC I、MHC II及细胞间黏附因子和B7，并能激活初始T细胞增殖，诱导免疫应答。
虽然国内外对肿瘤疫苗的相关研究很多，但到目前为止取得突破性进展的却不多见，存在的主要问题有：将DNA导入到特定细胞进行表达这一技术尚不成熟，并且使用外源DNA的安全性问题尚未解决；由于肿瘤细胞呈现高度异质性，属于同一类型肿瘤的多个瘤细胞上可以表达不同的抗原，由一种肿瘤抗原所激活的T细胞只能杀伤一部分的肿瘤细胞，不表达该抗原的瘤细胞则不能被杀伤；肿瘤细胞疫苗虽然可以包含几乎全部的肿瘤抗原，但目前的研究表明其激活T细胞的作用有限，将其作为疫苗的效果并不理想。
因此，如何提供一种肿瘤疫苗，不存在使用安全性问题并且能对几乎全部的肿瘤抗原有效，成为有待解决的问题。
exosomes是一类起源于内吞体系统并被排出于细胞外，直径在40-100nm之间的双层膜性囊泡。exosomes可以由包括树突状细胞、肿瘤细胞等在内的多种细胞分泌。含有大量与其来源和功能密切相关的蛋白质和脂质成分，作为细胞间传递信息的重要载体，参与多种病理生理过程。肿瘤细胞来源的exosomes含有肿瘤共同抗原、热体克蛋白等重要的免疫分子，可以通过多种途径表现出抗肿瘤的作用，且其作为一种新型的肿瘤疫苗，较DC疫苗有明显的优势。
exosomes是由细胞内的多泡体(multivesicular bodies，MVB)与细胞膜融合后，释放到细胞外环境中的囊泡，可由多种细胞分泌，如树突状细胞、B细胞、T细胞、肥大细胞、肿瘤细胞等。exosomes可表达抗原呈递相关分子MHCI和MHCII类分子，并带有相关的肿瘤抗原信息，具有抗原提呈能力。不同细胞来源的exosomes所含蛋白不同，其功能也不相同。exosomes除含有细胞非特异性蛋白成分外，还含有肿瘤抗原如MAGE，NY-ESO-l及抗原递呈过程中的分子伴侣-热休克蛋白(heat shock protein，HSP)，可作为新的肿瘤抗原，呈递给DC而活化产生肿瘤特异性CD8+T细胞免疫反应，且这种免疫效应具有交叉治疗作用。此外，exosomes为非细胞结构，理化性质稳定、耐高温、制备时可质控，较细胞性瘤苗更具优越性。
然而，近年来却有一些相关实验显示，一些肿瘤来源的exosomes可以抑制甚至是破坏在肿瘤中发挥作用的免疫细胞，比如下调一些NK受体的表达，影响到肿瘤免疫中一些固有免疫细胞的激活，还有的可以显著抑制IL-2从而抑制人类淋巴细胞的增殖，因而在肿瘤的免疫治疗中起到一些负面作用。这些由肿瘤来源的exosomes可能就是肿瘤组织逃逸机体免疫系统清除的关键因素，给肿瘤的免疫治疗带来很多困难和挑战。因此，如何提高肿瘤细胞来源exosomes的免疫刺激能力，而减少它的免疫抑制能力在肿瘤的免疫治疗中有重大的实际意义。
本发明创造性的用肼苯哒嗪联合SAHA处理肝癌细胞系H22细胞分泌的exosomes及其上清液，结果显示，肝癌细胞H22分泌的纳米级小囊泡--exosomes及其可溶性免疫分子对淋巴细胞增殖功能具有显著的抑制作用；而经肼苯哒嗪联合SAHA处理肝癌细胞系H22细胞分泌的exosomes及其可溶性免疫分子则能显著改善这种抑制作用。本发明提高exosomes肿瘤疫苗治疗效果，具有重要的临床应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种肿瘤疫苗及其制备方法。
本发明的目的在于提供一种肿瘤疫苗，所述肿瘤疫苗含肿瘤细胞分泌的小体(exosomes)。
进一步，所述的肿瘤疫苗包含药物处理过的肿瘤细胞分泌的exosomes及可接受的药物载体。
进一步，所述的药物处理时指采用DNA甲基转移酶抑制剂和/或组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理。
作为本领域的基本知识，DNA甲基转移酶抑制剂是指能抑制DNA甲基转移酶活性，阻断DNA的高度甲基化来抑制或杀死肿瘤细胞的化合物。正在研究开发的DNA甲基转移酶抑制剂较多，其化学结构主要有核苷及非核苷两大类，按作用机制分为：掺入DNA并与DNA甲基转移酶共价结合；非共价地阻断DNA甲基转移酶的活性位点；干扰DNA甲基转移酶与DNA的结合位点；抑制DNA甲基转移酶的基因表达等。
作为本领域的基本知识，组蛋白去乙酰化酶抑制剂是指通过调节组蛋白N-端的赖氨酸残基的乙酰化和去乙酰化，激活抑癌基因，抑制癌症基因，从而抑制肿瘤细胞生长，诱导肿瘤细胞凋亡的一类化合物。
所述药物处理肿瘤细胞优选采用常见的DNA甲基转移酶抑制剂(DNAmethyltransferase inhibitor，DNMTi)进行处理。常见的DNA甲基转移酶抑制剂包括但不限于：阿扎胞苷(5-azacytidine)、5-氮杂-2’-脱氧胞苷(又名地西他滨decitabine)、Zebularine、5-F-CdR、Hydralazine、SGI-1027、RG108、EGCC、肼苯哒嗪胺(procainamide)、肼苯哒嗪(procaine)、MG-98、Psammapl in A、姜黄素(curcumin)等。
所述药物处理肿瘤细胞优选采用常见的组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor，HDACi)进行处理。常见的组蛋白去乙酰化酶抑制剂包括但不限于：丁酸、戊酸和苯丁酸及其盐类化合物、曲古抑菌素(trichostatin A，TSA)、SAHA(suberoylanilide hydroxamic)、NVP-LAQ824、Pyroxamide、CBHA、Oxamflatin、Scriptaid、MM232、Trapoxin、Apicidin、FK228、WF3161、CHAP31、HC-toxin、LBH589、PDX-101、Tubacin、ACY-1215、MGCD0103、SAHA、Pomidepsin、Plitidepsin等。
进一步优选采用DNA甲基转移酶抑制剂和组蛋白去乙酰化酶抑制剂共同处理exosomes制备获得exosomes肿瘤疫苗。
进一步优选采用肼苯哒嗪和SAHA共同处理exosomes制备获得exosomes肿瘤疫苗。
本发明提供一种药物组合物，包含DNA甲基转移酶抑制剂和/或组蛋白去乙酰化酶抑制剂，所述的药物组合物可用于制备肿瘤疫苗。
进一步优选，DNA甲基转移酶抑制剂和组蛋白去乙酰化酶抑制剂比例为1：1。
本发明提供一种exosomes肿瘤疫苗的制备方法，包括药物处理肿瘤细胞，分离与纯化肿瘤细胞分泌的exosomes。
进一步，所述的exosomes肿瘤疫苗的制备方法，包括使用DNA甲基转移酶抑制剂或组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理肿瘤细胞，分离与纯化肿瘤细胞分泌的exosomes。
进一步，所述的exosomes肿瘤疫苗的制备方法，包括使用DNA甲基转移酶抑制剂联合组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理肿瘤细胞，分离与纯化肿瘤细胞分泌的exosomes。
进一步的，所述肿瘤细胞包括卵巢癌细胞、黑色素瘤细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、结肠癌细胞、肝癌细胞、膀胱癌细胞、白血病细胞或胶质瘤细胞。
优选加药后12-48小时后收集上清液，更优选24小时后收集上清液。
优选通过可行的方法使所收集的exosomes的粒径基本为40-100纳米的微颗粒。更优选的，将收集到的肿瘤细胞培养上清液以300g离心10min去除细胞，取上清液；以1500g离心30min去除细胞碎片，收集上清液，通过100kU MWCOCentriplus离心超滤管浓缩超滤，以1500g离心30min得到6ml浓缩液，将分离纯化的浓缩液移至1.5ml的离心管中，4℃下用水平转角以100kg超速离心60min所得沉淀即含有exosomes。
进一步的，所述肿瘤疫苗的剂型包括注射剂。
进一步的，肿瘤细胞分泌的exosomes与佐剂制成的肿瘤疫苗。
进一步的，所述佐剂为铝佐剂。
优选的exosomes肿瘤疫苗的制备方法，包括：肿瘤细胞用含100ml/L胎牛血清的DMEI培养液，在37℃50ml/L C02孵箱中培养，细胞呈单层贴壁生长，每3-4天传代1次，待细胞生长至对数期时，按3×106/100ml接种；接种24h后用1×10-6mol/L的药物处理，分别在加药后24h收集培养上清液，并4℃保存。将收集到的肿瘤细胞培养上清液以300g离心10min去除细胞，取上清液；以1500g离心30min去除细胞碎片，收集上清液，通过100kU MWCO Centriplus离心超滤管浓缩超滤，以1500g离心30min得到6ml浓缩液，将分离纯化的浓缩液移至1.5ml的离心管中，4℃下用水平转角以100kg超速离心60min所得沉淀即含有exosomes。
本发明提供的肿瘤疫苗可以是任何适于临床应用的剂型和用药规格，例如，可以是注射剂。所述肿瘤疫苗的制备方法还包括按照常规的疫苗制备方法制成所需要的剂型，例如制成注射剂，可以是通过加入生理盐水制成注射针剂，也可以制成粉针剂等。
进一步的，exosomes肿瘤疫苗加入相应佐剂。
进一步的，所述佐剂为铝佐剂。
本发明提供的肿瘤疫苗可以通过皮下或肌肉注射给药，对个体进行免疫，以抑制肿瘤发生或杀伤肿瘤细胞。
本发明提供所述肿瘤疫苗在制备抗肿瘤药物中的应用。
进一步所述抗肿瘤可以是抗血癌、骨癌、淋巴癌、肠癌、肝癌、胃癌、盆腔癌、肺癌、脑癌、神经癌、乳腺癌、食道癌、肾癌的一种或几种。
本发明提供的方案具有以下优点：
(1)本发明提供的肿瘤疫苗，其细胞囊泡包含的肿瘤抗原谱广泛、全面，能实现对几乎所有肿瘤细胞的有效杀伤。
(2)本发明提供的肿瘤疫苗，对机体的毒副作用小，使用安全。
(3)本发明提供的肿瘤疫苗，可以作为治疗性疫苗也可以作为预防性疫苗，在不同的肿瘤治疗阶段使用，通过激活机体免疫系统，预防肿瘤的发生或对已有肿瘤细胞进行有效杀伤。
具体实施方式
图1exosomes小体电镜图
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。
实施例1细胞培养
实验材料：H22细胞株、10％胎牛血清、青链霉素混合液(北京泰格美公司)。
实验方法：将H22细胞株培养于含10％胎牛血清、青霉素100IU/mL、链霉素100×μg/mL的培养液中，在37℃5％C02孵箱中培养，待细胞生长至对数期时，按3×106/100ml接种。
实施例2药物处理
实验材料：肼苯哒嗪、SAHA(均购自sigma公司)。
实验分组：细胞培养液体积每组严格一致，空白对照组、exosomes对照组(不加药组)、exosomes实验组1(加药肼苯哒嗪)、exosomes实验组2(加药SAHA)、exosomes实验组3(肼苯哒嗪和SAHA联合加药)。
实验方法：对照组，接种后不加药物，24h后收集上清液150ml作为对照；加药组1，接种24h后用浓度1×10-6mol几的肼苯哒嗪处理，分别在加药后24h收集培养上清液各150ml；加药组2，接种24h后用浓度1×10-6mol/L的SAHA处理，分别在加药后24h收集培养上清液各150ml；加药组3，接种24h后用1×10-6mol/L的肼苯哒嗪和1×10-6mol/L的SAHA处理，分别在加药后24h收集培养上清液各150ml，并4℃保存。
实施例3exosomes的分离与纯化
实验仪器：HMAC-CP7OG低温超高速离心机，100KU MW C0Millipore Amicon高回收率高流速切向流超滤离心管(Millipore公司)。
实验方法：将收集到的实验组和对照组细胞培养上清液以300g离心10min去除细胞，取上清液；以1500g离心30min去除细胞碎片，收集上清液，通过100kUMWCO Centriplus离心超滤管浓缩超滤，以1500g离心30min得到6ml浓缩液，将分离纯化的浓缩液移至1.5ml的离心管中，4℃下用水平转角以100kg超速离心60min所得沉淀即含有exosomes。
实施例4exosomes的电镜鉴定
滴20-30μ1exosomes悬液于载样铜网上，室温静置lmin用滤纸从侧而吸干液体，滴加20ml/L磷钨酸溶液(pH6.8)约30μl于铜网上，室温负染lmin滤纸吸干负染液，室温下晾干约10min透射电镜下观察照相。结果如图1所示。电镜下H22细胞分泌的exosomes小体直径为30-80nm的膜性微囊结构，呈圆形或椭圆形，腔内为低电子密度成分。(增加结果的描述及讨论部分)
实施例5H3-TdR掺入法检测PBMC细胞增殖状况
实验材料：H3-TdR(上海原子核研究所)、青链霉素混合液(北京泰格美公司)、胎牛血清
实验仪器：β-液体闪烁计数器测量(FJ-2107G型)
实验分组：空白对照组(只加植物凝集素和PBMC细胞)、exosomes对照组(不加药组)、exosomes实验组1(加药肼苯哒嗪)、exosomes实验组2(加药SAHA)、exosomes实验组3(肼苯哒嗪和SAHA联合加药)、exosomes提取后上清对照组(不加药组)，exosomes提取后上清实验组1(加药肼苯哒嗪)、exosomes提取后上清实验组2(加药SAHA)、exosomes提取后上清实验组3(肼苯哒嗪和SAHA联合加药)，每组分为三复孔。
实验方法：分离好的PBMC细胞加入5m1含10％胎牛血清的新鲜RPMI1640培养基，细胞计数后，稀释为5000个/50微升，按照先前做好的标记，以50微升/孔加入96孔板中，同时以1：1000的比例加入青霉素100IU/mL、链霉素100×μg/mL的混合液，再加入50μl样本，最后加入100μ1IPHA。放入37℃50％C02孵箱过夜，第二天可在10×的倒置显微镜下观察到PBMC细胞呈团状增殖，将H3-TdR加入培养板中，每孔3.7×104个Bq继续培养6h后，去培养基，用1×PBS洗3次，lmol/L的NaOH破细胞膜，加入闪烁液及适量反淬灭剂，用β-液体闪烁计数器测量，记录cpm值(分钟计数)。结果如表1所示。
表1经联合药物处理前后的exosomes及提取后的上清对PBMC细胞增殖的影响
| 组别 | 组数 | cpm值(X±S) |
| 空白对照 | 3 | 23086±2123.56 |
| exosomes对照组 | 3 | 4012±21.35 |
| exosomes实验组1 | 3 | 18361±766.52 |
| exosomes实验组2 | 3 | 18579±752.31 |
| exosomes实验组3 | 3 | 22983±2021.82 |
| exosomes提取后上清对照组 | 3 | 3855±412.84 |
| exosomes提取后上清实验组1 | 3 | 19826±5485.21 |
| exosomes提取后上清实验组2 | 3 | 19714±5618.33 |
| exosomes提取后上清实验组3 | 3 | 22839±5196.56 |
结果显示：与空白对照组相比，未经过药物处理的exosomes与PBMC细胞共培养后，对淋巴细胞增殖有显著影响，明显降低(P<0.05)；经过药物处理，可明显改善exosomes对淋巴细胞增殖功能的抑制，其中经药物组合物处理后获得的exosomes(exosomes实验组3)对淋巴细胞增殖功能的抑制最小，明显小于单独药物处理后获得exosomes(exosomes实验组1和exosomes实验组2)对淋巴细胞增殖的抑制，PBMC增殖值与exosomes对照组比较统计学存在显著差异(P<0.05)，与空白对照组比较无显著差异(P>0.05)。在实验组，经exosomes提取后的药物处理的上清液与PBMC细胞共培养后，对细胞增殖几乎无影响，与空白对照组比较无显著统计学差异(P>0.05)，未经药物处理的上清液则对淋巴细胞增殖功能有显著性影响，与空白对照组或上清实验组相比统计学上均有显著差异(P<0.05)。
实施例6体内抑瘤实验
实验材料：健康昆明系小鼠，小鼠肝癌细胞(H22)，RPMl1640培养基(购自GIBCO)，胎牛血清
实验方法：
(1)建立荷瘤鼠模型：无菌操作取H22小鼠腹水，台盼蓝染色，光镜下瘤细胞计数，活瘤细胞9000，调整细胞浓度为1×107个/ml，于每只小鼠右腋皮下接种0.2ml，制成实体型荷瘤鼠模型。
(2)制备肿瘤疫苗：根据所述实施例1进行细胞培养；将培养的细胞分为4组，第一组不加药，第二组加药肼苯哒嗪，第三组加药SAHA，第四组肼苯哒嗪和SAHA联合加药，具体加药处理参照实施例2；将收集到的各组细胞培养上清液参照实施例3制备exosomes肿瘤疫苗。
(3)分组和治疗：将小鼠30只随机分为5组，每组各6只。空白对照组：荷瘤小鼠腹腔注射生理盐水；exosomes对照组：肿瘤细胞接种当天，于小鼠腿根部皮下注射第一组制备的肿瘤疫苗(10μg/只)；exosomes实验组1：肿瘤细胞接种当天，于小鼠腿根部皮下注射第二组制备的肿瘤疫苗(10μ g/只)；exosomes实验组2：肿瘤细胞接种当天，于小鼠腿根部皮下注射第三组制备的肿瘤疫苗(10μ.g/只)；exosomes实验组3：肿瘤细胞接种当天，于小鼠腿根部皮下注射第四组制备的肿瘤疫苗(10μg/只)。每间隔1天重复1次，共1次。所有小鼠在接种肿瘤后第15天处死，取瘤体，称重、测肿瘤体积，计算瘤重抑制率、肿瘤体积抑制率。
(4)称取肿瘤重量并计算肿瘤抑制率
小鼠处死后，分别取出肿瘤瘤体，剥离干净后，以滤纸拭净血污，电子天平称取瘤重，计算抑瘤率：
抑瘤率(％)=(对照组肿瘤大小-治疗组肿瘤大小)/对照组肿瘤大小×100％。
表2肿瘤疫苗对肝癌移植瘤的抑制作用
| 实验分组 | 肿瘤平均 |
| 空白对照组 | 3.11±0.31 |
| exosomes对照组 | 1.72±0.16 |
| exosomes实验组1 | 1.46±0.26 |
| exosomes实验组2 | 1.38±0.23 |
| exosomes实验组3 | 0.99±0.11 |
采用exosomes肿瘤疫苗治疗后肝癌移植瘤生长受到抑制，exosomes实验组1、exosomes实验组2、exosomes实验组3瘤质量分别为(1.46±0.26)g、(1.38±0.23)g、(0.99±0.11)g，与空白对照组(3.11±0.31)g、exosomes对照组(1.72±0.16)g比差异显著(P<0.05)，肼苯哒嗪和SAHA联合加药制备的肿瘤疫苗抑制作用最强，瘤质量为(0.99±0.11)g，抑瘤率达68.17％。
本发明创造性提供了一种肿瘤疫苗，使用该exosomes肿瘤疫苗能显著改善原exosomes对淋巴细胞增殖功能的抑制作用。动物实验表明，采用本发明exosomes肿瘤疫苗治疗肿瘤效果显著，具有重要的临床应用价值。
Claims (6)
1.一种肝癌疫苗，包括肝癌细胞分泌的小体exosomes，所述的肝癌细胞是经肼苯哒嗪和SAHA联合加药处理的，其特征在于，肼苯哒嗪和SAHA比例为1:1。
2.根据权利要求1所述的肝癌疫苗，其特征在于，所述肝癌疫苗还包括佐剂。
3.肼苯哒嗪和SAHA组成的药物组合物在制备权利要求1-2任意一项所述的肝癌疫苗中的应用。
4.一种权利要求1-2任意一项所述的肝癌疫苗的制备方法，包括：使用肼苯哒嗪和SAHA药物组合物处理肝癌细胞，所述药物组合物中肼苯哒嗪和SAHA比例为1:1；分离与纯化肝癌细胞分泌的exosomes。
5.根据权利要求4所述的制备肝癌疫苗的方法，包括：肝癌细胞用含100ml/L胎牛血清的DMEI培养液，在37℃5Oml/L CO2孵箱中培养，细胞呈单层贴壁生长，每3-4天传代1次，待细胞生长至对数期时接种；接种24h后用肼苯哒嗪和SAHA处理细胞，分别在加药后24h收集培养上清液，并4℃保存；将收集到的肝癌细胞培养上清液离心去除细胞，取上清液；再离心去除细胞碎片，收集上清液，通过100kU MWCO Centriplus离心超滤管浓缩超滤，离心得到浓缩液，将分离纯化的浓缩液移至1.5ml的离心管中，4℃下用水平转角以100kg超速离心，所得沉淀即含有exosomes。
6.一种权利要求1-2任意一项所述肝癌疫苗在制备抗肝癌药物中应用。
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