CN103648524A - 使用树突细胞和由高静水压力杀死的肿瘤细胞对癌症进行主动细胞免疫治疗的手段和方法 - Google Patents

Abstract

本发明披露了一种用于诱导针对肿瘤细胞的免疫应答的药物组合物以及制备此类组合物的方法，所述药物组合物包含树突细胞和用高静水压力处理造成凋亡的肿瘤细胞。

Description

使用树突细胞和由高静水压力杀死的肿瘤细胞对癌症进行主动细胞免疫治疗的手段和方法

技术领域

本发明涉及一种用于诱导针对肿瘤细胞的免疫应答的药物组合物以及制备此类组合物的方法，所述药物组合物包含树突细胞和用高静水压力处理造成凋亡的肿瘤细胞。

背景技术

在医学和人类健康中，由不同肿瘤导致的疾病仍然是一个主要的问题。外科手术、化学疗法和放射疗法的联合极大地改进了癌症患者的预后。尽管这些方法都能导致肿瘤大小的显著减少，但是，常常会有一小群前体肿瘤细胞或癌症干细胞存活下来，进而会产生一群新的导致恶化的肿瘤细胞。甚至当主要的肿瘤通过外科手术和/或其他治疗方法移除之后，数量稀少的循环肿瘤细胞还是可以导致身体其他部分发生转移性肿瘤。因此，一直存在着对于不同的药物和治疗方法的需求，这些治疗方法既可以单独使用，更优选与其他肿瘤治疗方法联合使用。

现有技术

WO2006/095330描述了通过热方法、机械性和/或化学性损伤含抗原细胞并诱导与抗原呈递细胞共聚的所述细胞到患者体内来抑制细胞群体增长的方法。

Frank et al.“Harnessing Naturelly Occuring Tumor Immunity;A Clinical VaccineTrial in Prostate Cancer”,PLOS ONE,vol.5,no.9,1January2010(2010-01-01),pageE12367，描述了包含自体树突细胞和凋亡的UV-辐射LNcap细胞的肿瘤疫苗。

Minarik et al.“Phase I/II of Clinical Study of Prostate Cancer Immunotherapy UsingDendritic Cell Vaccination Strategy-First Results”,European Urology Supplements,vol.9,no.6,1September2010,page629，披露了使用被UVA辐射杀死的凋亡LNCap细胞脉冲刺激的树突细胞免疫治疗前列腺癌的I/II期临床研究的初步结果。

Weiss et al.“Ex vivo-and in vivo-induced dead tumor cells as modulators ofantitumor responses”,Annals of the New York Academy of Sciences,vol.1209,no.1,1October2010(2010-10-01),pages109-117，披露了高静水压力处理肿瘤细胞。这些死亡的肿瘤细胞作为癌症疫苗直接用于动物模型。

Weiss et al.“High hydrostatic pressure treatment generates inactivated mammaliantumor cells with immunogeneic features”,Journal of Immunotoxicology,vol.7,no.3,1September2010,pages194-204，披露了高静水压力处理会导致细胞凋亡，其中肿瘤细胞是失活并且具有免疫原性的。在小鼠模型中生产和确认了直接针对肿瘤细胞的抗体。

US2008/0286314披露了能够用于治疗癌症患者的包含抗原呈递细胞的癌症疫苗，所述抗原呈递细胞装载有非凋亡的热激癌细胞。

发明内容

本发明涉及一种用于诱导抗-肿瘤免疫应答的药物组合物，特别是一种引起机体针对肿瘤细胞发生免疫反应的肿瘤疫苗。

由诸如放射性的标准模式所杀死的肿瘤细胞正常来说是不具有免疫原性的。如果要用于生产癌症免疫疗法的产品，经过放射的肿瘤细胞需要与有效的佐剂共同施用。当用于脉冲刺激诸如树突细胞(DCs或DC)的抗原呈递细胞时，放射性杀死的肿瘤细胞并不会提供激活信号。因此，树突细胞需要用其他的物质，例如病原体衍生分子来进行激活。

本发明披露了一种新的诱导人肿瘤细胞、尤其是卵巢和前列腺癌细胞和人源急性淋巴细胞性白血病细胞的免疫原性死亡的方法。由高静水压力(下面也称为HHP)杀死的肿瘤细胞可以向树突细胞、尤其是向未成熟的树突细胞提供有效的活化刺激原，甚至在没有额外的刺激原存在的情况下也如此。由该方法所杀死的肿瘤细胞表达高水平的免疫原性细胞死亡标记，而装载有这些免疫原性肿瘤细胞的树突细胞诱导了大量的肿瘤特异性T淋巴细胞而没有扩大不期望的调节性T淋巴细胞的数量。本发明的实验数据显示，使用高静水压力杀死的肿瘤细胞与树突细胞的联合使用导致吞噬作用以及肿瘤抗原的有效呈递，从而诱导强烈的抗肿瘤免疫应答。

肿瘤细胞不具有或只是具有很小的免疫原性，如果在没有强力佐剂的情况下使用，它们通常并不具有诱导肿瘤特异性免疫应答的能力。近期的研究表明，由一些诸如硼替佐米(bortezomib)、奥沙利铂和蒽环类抗生素(anthracyclines)的化疗方法杀死的肿瘤细胞可以诱导肿瘤特异性免疫应答。该免疫原性细胞死亡以所述的所有化疗都具备的分子事件为特征。在免疫原性细胞死亡开始之后的几个小时内，凋亡前的肿瘤细胞将使钙网络蛋白和热激蛋白与其他作为“吃我”信号的分子(磷脂酰丝氨酸)一起，从内质网上移动到细胞表面。

同时，经历免疫原性肿瘤细胞死亡的肿瘤细胞会下调‘别吃我’信号(例如表面CD47)的表达，以便树突细胞对肿瘤细胞的识别和吞食。此外，在质膜的通透化之后，细胞会向胞外环境释放细胞凋亡后期的标记高迁移率族蛋白1(HMGB1)。HMGB1能够结合许多模式识别受体(PRRs)，例如Toll样受体2(TLR2)，TLR4以及高级糖基化终产物(RAGE)的受体。该蛋白的释放似乎是优化呈递来自树突细胞引导的死亡肿瘤细胞、T细胞的抗原以及后续的T细胞介导的肿瘤清除所必需的。

以让肿瘤细胞具有免疫原性的方式杀死的肿瘤细胞的用途对于癌症免疫治疗方案的设计非常重要。施用免疫原性的肿瘤细胞能够诱导肿瘤特异性的免疫应答，这种应答能够控制肿瘤细胞的生长。这将会减慢甚至停止疾病的进展并且改善癌症患者的预后。同样也认为，在体内循环的肿瘤细胞的分布以及转移癌的形成至少也会被大量地减少。

附图说明

本发明和实验获得的结果如图所描述：

图1

该示意图显示了本发明的药物组合物是如何获得的。获自患者或细胞系的肿瘤细胞用高压处理，从而使细胞凋亡。

通过白血球分离术(leukapheresis)分离树突细胞。将未成熟的树突细胞和凋亡的肿瘤细胞合并，从而产生可用作疫苗的成熟的树突细胞。

图2

高静水压力在人肿瘤细胞中诱导热激蛋白的表达。显示了总共5个实验的总结。*P值是与经辐射的肿瘤细胞的对比，P<0.05。还显示了在两个肿瘤细胞系(OV90和LNcap)中由不同的处理所引起的标记分子HSP70、HSP90和钙网织蛋白的时间依赖性表达。

图3

高静水压力诱导HMGB1(高迁移族蛋白B1)从经处理的肿瘤细胞(OV90和LNcap)中释放。HMGB1是一种炎症的细胞因子调节子。显示了总共5个实验的总结。*P值是与经辐射的肿瘤细胞的对比，P<0.05。图3显示了考虑到HMGB1的时间依赖性释放，HHP处理比其他传统处理更为有效。

图4

未成熟DCs对高静水压力处理的肿瘤细胞吞噬作用的动力学。显示了5个独立实验和代表性数据的总结。在实验中，使用OV90或LNcap肿瘤细胞。HHP处理与UV处理在0℃和37℃下进行对比。

图5

显示了基于标记CD86和HLA-DR的树突细胞在与高静水压力杀死的肿瘤细胞(OV90和LNcap)相互作用之后的表型。第5天的未成熟的DCs与经HHP或辐射杀死的肿瘤细胞培养24小时。24小时之后，用流式细胞术分析成熟相关分子在DCs上的表达。使用LPS作为对照。显示了平均荧光强度(MFI)。*P值是与经辐射的肿瘤细胞的对比，P<0.05。

图6

比较了装载有被高静水压力杀死的肿瘤细胞(OV90和LNcap)的树突细胞与装载有UV辐射杀死的肿瘤细胞的树突细胞对肿瘤特异性T细胞的诱导。数据显示了5个独立实验的总结。*P值是与经辐射的肿瘤细胞的对比，P<0.05。

图7

图7表明了用高静水压力(HHP)处理肿瘤细胞相比起用UV辐射(UV irr)杀死的肿瘤细胞的优势所在。检测是在前列腺癌细胞系(LNCap)和卵巢肿瘤细胞系(OV90)中进行的。对照是在单独的树突细胞以及被Poly I：C刺激的细胞中进行的。

总结在图7的结果显示了装载有被高静水压力杀死的肿瘤细胞(分别是OV90和LNcap)的树突细胞对前列腺特异性抗原(PSA)-特异性T细胞的诱导。在单独的高静水压力杀死的肿瘤细胞和装载有被UV辐射杀死的肿瘤细胞的树突细胞之间进行了对比。图7所展示的数据中显示了5个独立实验的总结。*P值是与经辐射的肿瘤细胞的对比，P<0.05。图7总结了由示例7获得的结果。

图8

由高静水压力杀死的肿瘤细胞对调节性T细胞的诱导与经UV辐射的肿瘤细胞对Tregs的诱导进行对比。数据显示了5个独立实验的总结。

图8中总结的实验显示了本发明的教导可以应用于不同种类的肿瘤。图8的上部分显示了在卵巢癌细胞(OV90)中的实验。下部分显示了在前列腺癌细胞(LNCap)中的实验。在实验中，确定了Fox P3(Forkhead Box B3)的浓度以便能够进一步分化调节性T细胞(Tregs)。这些实验显示了根据本发明用HHP处理的肿瘤细胞的确比UV辐射的肿瘤细胞诱导了更少量的调节性T细胞。

图9

显示了体内研究的结果，其中用本文所披露的肿瘤疫苗治疗患者。所有的患者经历过根治(radical)的前列腺切除或放射疗法。作为相关参数，确定了PSA加倍时间。根据Antonarakis et al.,BJU Int.2011,108(3),p.378-385，PSA加倍时间是患有前列腺特异抗原(PSA)-复发性前列腺肿瘤患者的无转移存活时间和总体存活时间的最强的决定因素。PSA加倍时间是指PSA值加倍时的时间差异。PSA加倍时间越高，治疗患者的存活预期也就越好。通过施用本发明的肿瘤疫苗，PSA加倍时间被显著地延长。

*P值是与经辐射的肿瘤细胞的对比，P<0.05。

图10

图10是本发明方法治疗的处于前列腺晚期的患者的Kaplan-Meier存活曲线。

在Kaplan-Meier存活曲线中，每个患者的死亡导致存活百分数从100%到低值的降低。Halabi列线图是存活者的正常的预期减少，其中中位存活时间是12个月。

本文所描述的使用癌症疫苗的主动癌症免疫疗法导致中位存活时间延长至23个月。

具体实施方式

本发明披露了一种新的能够比最近描述的化疗方法在更大程度上诱导人肿瘤、特别是卵巢癌细胞和前列腺癌细胞和急性淋巴细胞性白血病细胞的免疫原性细胞死亡的方法和组合物。通过这种方法杀死的并被树突细胞捕获的肿瘤细胞表达高水平的免疫原性细胞死亡标记，在不诱导调节性T细胞的情况下能诱导大量地肿瘤特异性T淋巴细胞，而所述调节性T细胞会抑制抗肿瘤免疫应答。已经发现通过本发明处理的肿瘤细胞联合树突细胞所获得的抗肿瘤免疫应答的程度是单独使用免疫原性肿瘤细胞所诱导的免疫应答的约10倍。

图1显示了基于施用装载被杀死肿瘤细胞的成熟树突细胞的优选癌症免疫治疗方法的大致流程。生产出最终药物组合物的所有步骤是在GMP设备中在良好作业规范条件下进行的。

在一个优选实施方式中，生产针对每个患者的药物组合物过程中的第一个步骤是白细胞分离术，其目的是从外周血中收集大量单核细胞。在一个优选实施方式中，白细胞分离术的产物溶解于合适的缓冲液如PBS+1mM EDTA(Lonza，Vierviers，Belgium)中，使用Premium Ficoll Paque(GE Healthcare，Little Chalfont，UK)梯度离心来分离单核细胞。然后对收集的单核细胞(PBMC)进行洗涤[例如，在PBS+1mMEDTA(Lonza)中]，并在Cell Gro培养基中重悬，以每cm²表面积1×10⁶个细胞铺板于三个培养瓶中(例如，NUNC，Roskilde，Denmark)。两个小时后，未附着的细胞用PBS(Lonza)洗去。附着的单核细胞在含有20ng/ml IL-4(Gentaur)和500U/mlGM-CSF(Gentaur)的Cell Gro培养基中培养6天，在第三天加入新鲜的细胞因子。

于第6天收集未成熟的DCs，用被杀死的肿瘤细胞进行装载(例如，前列腺癌细胞系，卵巢癌细胞系，急性淋巴细胞性白血病细胞系)。将新鲜解冻的未成熟DCs(3-6天)与肿瘤细胞以5:1的固定DC：肿瘤细胞比例培养4个小时。树突细胞和处理的肿瘤细胞的比例优选在1:1至10:1之间的范围内，更优选在约4:1和6:1之间。

根据本发明，处于不同分化、成熟和/或激活阶段的树突细胞均能被使用。树突细胞的成熟阶段会受到成熟因子的影响。

肿瘤细胞脉冲的DCs随后优选通过25μg/ml的Poly I:C在过夜孵育时被成熟化，并被冷藏保存和储藏在液氮中。施用前，用肿瘤细胞脉冲的1×10⁷个成熟DCs重悬于0.9%NaCl(Baxter)中，在12小时内，优选30分钟至12小时内皮下注射进腹股沟和臂区域。这种形式的癌症免疫治疗的施用优选规律的2-6周间隔重复，以便持续地促进免疫应答。认为这里所披露的方法能够阻止肿瘤诱导的免疫耐受的重新建立。这种形式的免疫治疗的治疗效果已经在患者中所证实，这些患者处于不同临床阶段，前列腺癌症的生化复发阶段，去雄抗性转移性前列腺癌症阶段，推测还有转移性激素敏感阶段的前列腺癌。

尽管如此，上述优选实施方案并不是限制性的。本发明是在最大范围内，根据肿瘤治疗的特定需求以不同的方法来实施。上述确定的优选实施方式描述了本发明，其中肿瘤细胞既可以从待治疗的患者中获得，也可以从肿瘤细胞系或肿瘤细胞系库中获得。树突细胞同样优选从待治疗的患者中获得。

尽管如此，在一个更一般性的方式中，本发明涉及诱导针对肿瘤细胞的免疫应答的药物组合物，其包括

a)凋亡的肿瘤细胞，其中细胞凋亡是由静水压力处理所引起的，以及

b)树突细胞。

这是本发明一个重要的方面，即在药物组合物中使用的肿瘤细胞是凋亡细胞而不是坏死细胞。本领域技术人员明了凋亡(apoptosis)和坏死(necrosis)之间的差别。细胞死亡以及后续的死后变化，即坏死，是正常发育和成熟循环中必需的组成部分。虽然这个过程很重要，但关于细胞死亡的机制现在仍不清楚，尽管已经有很多公开文献涉及到细胞死亡时所发生的机制。本发明的(细胞)凋亡理解为程序性的、调控形式的细胞死亡，而细胞坏死则是无序的，是细胞死亡的偶然形式。

在本发明中，凋亡可以理解为细胞死亡的这样一种形式：它发生于正常的生理条件下，并且细胞是其自身死亡的主动参与者。发生凋亡的细胞会表现出特征性形态学和生物化学特征。这些特征包括染色质聚集，核和胞质浓缩，胞质和核的间隔化进入膜结合的囊泡中(凋亡小体)，所述囊泡含有核糖体，形态完整的线粒体和核物质。因为这些凋亡小体在体内是能够被正常识别并且能够被巨噬细胞或附近的上皮细胞所吞噬，因此本方法所使用的肿瘤细胞尽可能地类似凋亡的肿瘤细胞是非常重要的。(细胞)凋亡通常只限于单个细胞中，而不会引起炎症反应。

另一方面，(细胞)坏死发生于细胞暴露在极端的生理条件下，这些生理条件可能导致质膜的损坏。当细胞维持止血(hemostasis)的能力受到破坏时，坏死就开始了，这将导致水和胞外离子的流入。细胞内的细胞器，尤其是线粒体和整个细胞膨胀，破裂。由于质膜最终被破坏，胞质内容物，包括溶酶，将会释放到胞外液体中。因此，体内坏死细胞的死亡通常会伴有大量的组织损伤，进而引起严重的炎症响应。用于药物组合物中的肿瘤细胞是凋亡的而不是坏死的，这非常重要。

依据本发明，通过高静水压力处理来生产凋亡细胞。本发明所理解的高静水压力被定义为等于或大于100MPa[1MPa=10bar=9.86923atm=145.0377psi]的压力。高静水压力可以通过仪器来产生，例如Weiss et al.,journal of Immunotoxicology,2010,pp194-209中，尤其是在图1中描述的仪器。

高静水压力处理肿瘤细胞优选在压力容器中进行。肿瘤细胞置于合适的低温瓶中，所述瓶子装满细胞悬液，紧密封闭以避免空气泡出现。之后，用韧性薄膜(例如，

)密封瓶子，将准备好的瓶子放入充满压力传送介质的压力腔中。之后，使用合适的仪器产生高压，让细胞在该高压下维持足够的时间。

在一个优选实施方式中，高静水压力以至少200MPa下维持至少10分钟。在一个更加优选的实施方式中，肿瘤细胞在200-300MPa，优选200-250MPa范围的压力下维持10分钟至12小时，优选10分钟至1小时，特别优选10至30分钟。

药物组合物中所使用的肿瘤细胞可以来自于不同的来源。在一个特定实施方式中，肿瘤细胞可来自于待治疗患者的原发性肿瘤或转移性肿瘤。可以通过活体解剖或外科手术获得肿瘤细胞。将组织分解，分离和纯化的肿瘤细胞就可以立即使用。同样优选建立一个原发性肿瘤细胞系，和将这样获得的细胞用于肿瘤接种。或者，此类肿瘤细胞系可以用自体肿瘤来制备。或者，也可以使用诸如ATCC的保藏机构商业提供的肿瘤细胞。

药物组合物中的另一组分是树突细胞。根据本发明，可以使用各个阶段的树突细胞。可以使用通过从血液中分离树突细胞直接从患者获得的任何树突细胞。尽管如此，还可进一步根据树突细胞所处的阶段来对它们进行分类。在本发明的一个具体实施方式中，从外周血单核细胞分化得到的树突细胞用于制备肿瘤疫苗。

已知在外周淋巴器官中有三种主要的能够激活T细胞的抗原呈递细胞，即树突细胞，巨噬细胞和B细胞。其中最有影响的是树突细胞，其已知的功能是向T细胞呈递外源抗原。未成熟树突细胞位于全身的组织中，包括皮肤，内脏和呼吸道。树突细胞存在两种功能和形态不同的阶段，即，未成熟和成熟的树突细胞。未成熟树突细胞具有很高的胞吞活性，其专门用于抗原捕获和加工，且存在于体内的外周组织。未成熟树突细胞在外周耐受的诱导和维持中起着关键性作用。当暴露于病原体衍生产物或先天前炎性信号下，树突细胞会失去其吞噬活性，并且当它们变为成熟树突细胞时会迁移到引流淋巴结中。由于表达高水平的抗原呈递、附着和共刺激分子以及其他的诸如CD83和DC-LAMP的树突细胞特异性标记，成熟树突细胞具有很高的抗原呈递能力和T细胞激活能力。

用于药物组合物中的未成熟树突细胞可以获自不同的来源。在一个优选实施方式中，未成熟的树突细胞由待治疗的患者的单核细胞中分化得到。或者，尽管如此，未成熟树突细胞可以从其他来源获得，例如从血液采集机构获得商业提供的血产品。

为制备依据本发明的药物组合物，要制备合适的未成熟树突细胞。可以利用不同的方法制备树突细胞(DCs)，这些细胞可能显示出不同的特点。在本发明的一个优选实施方式中，树突细胞可以从通过白细胞分离术分离的单核细胞中获得。

在外周血中，DCs含有不到1%的单核细胞。白血球分离术可以用于分离大约10⁶至10⁷个树突细胞，可以与阳性选择或阴性选择技术联合。虽然从外周血中直接分离树突细胞允许快速制备树突细胞，但是如果在实验中需要多重免疫的话，则需要重复进行白血球分离术。

在本发明的一个优选实施方式中，通过在塑料材料上附着可通过白血球分离术来富集单核细胞。在细胞因子、优选多种细胞因子的组合(cocktail)的存在下，树突细胞被诱导分化，其中优选粒细胞-巨噬集落刺激因子(GM-CSF)与白介素4联合使用。

一个制备树突细胞的特别优选的方法是体外生产。单核细胞是树突细胞的前体，它们可以通过很多技术从外周血中富集，例如白血球分离术、塑料附着、密度梯度离心，CD14+细胞阳性选择，B-细胞和T-细胞阴性选择及其组合。可以用细胞因子，特别是粒细胞-巨噬集落刺激因子(GM-CSF)+白介素4或白介素13处理富集的前体细胞群体约3-7天、优选7天，以此来培养和分化DC。该实施方式的一个优势是超过10⁹个DC可以从单个白血球分离术产物中制备出来，通过低温储藏DC制剂，优选在液氮中，可以将此类制剂用于多次进一步接种中。而DCs可以在很多培养基中进行培养，优选使用无血清培养基或包含自体血清的培养基。对于药物组合物的工业制备，特别优选以避免(例如由于胎牛血清)发生过敏反应或病毒污染的方式大规模制备未成熟的树突细胞。

在药物组合物制备的下一步，用凋亡的肿瘤细胞装载未成熟的树突细胞，所述肿瘤细胞通过用高静水压力处理来获得。在一个优选实施方式中，通过使用很多刺激因子，例如肿瘤坏死因子α(TNF-α)或者脂多糖或poly I:C，使与凋亡肿瘤细胞接触的未成熟树突细胞成熟化。

获得的药物组合物保藏待用，优选通过低温保藏。生物样品的低温保藏在临床医学和生物医学研究中被广泛使用。尽管如此，这种技术对于细胞活力和尤其是细胞功能的影响有时是被低估的。因此，应当仔细考虑所用的在用于癌症疫苗前冷冻细胞制剂的方法。低温冷藏的效果当然也取决于所使用的特定的细胞，也应当检测药物组合物的生物学活性是否被低温保藏所改变。还需要加入一些保护组分，如非免疫原性的多糖或DMSO。

本发明的药物组合物可以静脉内(IV)、皮内、皮下或淋巴内施用，其中特别优选皮下施用。

药物组合物的免疫最优剂量和频率取决于肿瘤种类，患者的年龄和情况以及肿瘤疾病的进展阶段。在一个优选实施方式中，第一次是以免疫剂量施用药物组合物，然后在2-8周的间隔范围内应用长期加强注射施用。

这里所描述的肿瘤疫苗接种可以成功应用于所有形式的肿瘤。在一个优选实施方式中，药物组合物用于治疗处于癌症晚期以及处于癌症早期的患者。在一个特别优选的实施方式中，肿瘤疫苗接种被应用于处于前列腺癌症晚期，并且是激素治疗耐受的转移性前列腺癌症的患者中。“癌症的早期阶段”可以理解这些癌症是可能诊断的。通常患者并不会显示出疾病的信号。在“癌症的晚期阶段”，患者常常遭受强烈的疾病后果，例如疼痛和虚弱。

尽管本领域已知在肿瘤治疗疫苗接种中使用佐剂，但在本发明过程中优选不使用任何进一步的佐剂，例如脂多糖，弗氏不完全佐剂(incomplete Freund’s adjuvant)或热激蛋白。

本发明很重要的一个方面，用高静水压力处理的肿瘤细胞处于这样一个阶段，即当施用给患者后，它们不能生长和形成转移性肿瘤。这已经被很多实验方法所证实，包括克隆形成测定(clonogenic assay)。

这里所描述的药物组合物可以通过癌症免疫疗法(疫苗接种)用于治疗人。衍生于待治疗患者的肿瘤细胞通过上述的高静水压力处理被带入凋亡的阶段。可选使用多种合适的肿瘤细胞系。未成熟树突细胞优选利用白血球分离术从同一个患者中获得，并且用细胞因子进行处理以在体外培养细胞。用凋亡的肿瘤细胞装载合适数量(例如10⁷-10⁸个细胞)的此类未成熟树突细胞，其中未成熟树突细胞：凋亡细胞的最优比例范围是10:1至1:1，优选5:1至3:1。

在树突细胞成熟后，药物组合物可以被应用于患者。捕获了被高静水压力杀死的肿瘤细胞的树突细胞可以直接用于肿瘤疫苗。尽管如此，在施用给患者前可以进一步激活或使细胞成熟，例如通过细胞因子的处理。

根据本发明，优选使用下述材料和方法：

据显示，用在高静水压力(200MPa)在约21℃下处理卵巢癌细胞和前列腺癌细胞以及急性淋巴细胞性白血病细胞10分钟会导致肿瘤细胞的免疫原性细胞死亡的诱导。被HHP(高静水压力)杀死的肿瘤细胞的免疫原性程度大大高过被蒽环类抗生素，已知的唯一诱导免疫原性细胞死亡的细胞抑制剂或UV放射杀死的肿瘤细胞。HHP-杀死的肿瘤细胞被抗原呈递细胞疯狂地吞噬，并在甚至没有额外病原体衍生刺激物，例如LPS的情况下诱导它们的激活。装载有HHP杀死的肿瘤细胞的抗原呈递细胞诱导强烈的CD4和CD8介导的肿瘤特异性T细胞响应，而不会诱导可能有害的调节性T细胞。因此，HHP杀死的肿瘤细胞成为临床癌症免疫治疗方法中的一个有力的工具。

尽管持续引入新的药物和进一步开发化疗方法，但是似乎在一定程度上化疗已经达到了它的极限，其临床效果也处于停滞水平。此外，尽管不能否认一些恶性肿瘤治疗方法所取得的成功，但在一些肿瘤中，尤其是实体瘤中，化疗很少见效。治疗方案的联合应用已经成为癌症治疗的标准策略，典型的例子是外科手术和化疗或放射性治疗的联合使用。应该不仅仅致力于设计现代的免疫治疗策略，还应当致力于将免疫治疗方法整合到当前化疗方法之中。今后，化学疗法和免疫疗法不应当被认为是两种相互对抗的治疗类型，更可信的是它们进行适当的联合，这将会大大促进癌症患者的疾病预后。

优选的细胞系：使用急性淋巴细胞性白血病细胞系(REH，DSMZ，Braunschweig，Germany)，卵巢癌细胞(OV90，ATCC，Teddington，UK)，前列腺癌细胞(LNCap，ATCC，Teddington，UK)。所有的细胞系均在RPMI1640培养基(Gibco)中培养。所有的培养基都补充以10%的热失活胎牛血清(Lonza)，100U/ml盘尼西林和2mmol/L L-谷氨酰胺。

原发性肿瘤细胞的分离：原发性卵巢癌细胞和前列腺癌细胞从进行手术的患者中获得。通过Ficoll梯度梯度离心，患有急性淋巴细胞性白血病患者的未成熟淋巴细胞获得自(所有)患者的骨髓。

凋亡诱导和检测：用高静水压力处理10分钟以诱导肿瘤细胞死亡。在对照实验中，用UV光照射诱导肿瘤细胞死亡。在这种情况下施用7.6J/cm²能量10分钟。通过annexin V异硫氰酸荧光素染色来评估细胞的死亡。简言之，每个样品收集2×10⁵个细胞，用PBS洗涤，沉淀(pellet)，在孵育缓冲液中重悬，所述缓冲液含有annexin V异硫氰酸荧光素抗体。在黑暗中保存样品，在加入400μl的0.1%的碘化丙啶孵育缓冲液之前孵育15分钟，之后用FlowJo软件在Aria荧光-激活细胞分选器(BD Bioscience)中进行后续的分析。

流式细胞分析细胞表面的hsp70、hsp90和CRT(钙网络蛋白)：总数10⁵个细胞置于12孔板中，在接下来的一天中用所示试剂处理，或者是作为对照的UV-辐射(7.6J/cm²)处理6、12或24小时，或者在21摄氏度下用高静水压力处理10分钟。收集细胞，用PBS洗涤两次。将细胞用稀释于冷冻封闭缓冲液(含有2%胎牛血清的PBS)中的一抗(primary antibody)孵育30分钟，然后洗涤并在封闭溶液中与Alexa648连接的单克隆二抗(secondary antibody)孵育。通过FACScan(BD Bioscience)分析每个样品以确定细胞表面的hsp70，hsp90和CRT。

检测HMGB1的释放：HMGB1酶联免疫吸附法II试剂盒获自SHINO-TESTCORPORATION(Tokyo，Japan)。REH细胞，OV90细胞，LNCap细胞，原发性卵巢癌细胞和白血病细胞(10⁶)置于1ml适合细胞类型的全培养基中。在不同的时间点收集上清液，通过离心去除死亡的肿瘤细胞，分离出上清液，立即冻住。上清液中HMGB1的定量根据操作手册利用酶联免疫吸附法进行测定。

荧光显微镜：免疫荧光：对于CRT的表面检测，将细胞置于冰上，用PBS洗涤两次，在0.25%的多聚甲醛的PBS溶液中固定5分钟。然后在PBS中洗涤细胞两次，加入溶于冷冻封闭缓冲液中的一抗30分钟。在用冷PBS洗涤两次后，将细胞与合适的Alexa648连接的单克隆二抗孵育30分钟。用4%的多聚甲醛固定细胞20分钟，用PBS洗涤20分钟，安装于玻片上。

对于吞噬作用，将DCs用

Dio细胞标记溶液(Invitrogen)进行染色。用

Dil细胞标记溶液(Invitrogen)对肿瘤细胞进行染色，并且在蒽环类抗生素存在的情况下培养，用UV光照射或在21摄氏度下高静水压力处理10分钟。以DC/肿瘤细胞1:5的比例，将肿瘤细胞提供(feed)给未成熟的DCs(第5天)。用4%的多聚甲醛固定细胞20分钟，用PBS洗涤20分钟，用ProLong Gold antifade试剂(Invitrogen)装载于玻片上。

装载有肿瘤细胞的DCs的产生以及肿瘤细胞死亡的诱导：通过培养纯化的CD14⁺细胞来产生DCs，所述CD14⁺细胞是在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(Gentaur，Brussels，Belgium)和白介素4(IL-4，Gentaur，Brussels，Belgium)存在的情况下从棕黄层中分离出来的。在21摄氏度下高静水压力处理10分钟以杀死肿瘤细胞，或者，用作对照的通过UV辐射或蒽环类抗生素杀死肿瘤细胞。用annexin V/PI染色来监测细胞凋亡的程度。在提供DC前，全面洗涤细胞。以DC/肿瘤细胞1:5的比例，将肿瘤细胞提供给未成熟的DCs(第5天)。在一些实验中，以100ng/ml的脂多糖(LPS)(Sigma)处理12小时或用25μg/ml的Poly I:C(由Invitrigen获得)以刺激脉冲的DCs。

在与被杀死的肿瘤细胞相互作用后FACS分析DCs表型：用流式细胞术来检测用肿瘤细胞培养的DCs的表型。利用选择的细胞生长抑制剂或UV辐射(对照实验)或21摄氏度高静水压力处理10分钟(依据本发明)来杀死肿瘤细胞，将其与未成熟DCs共培养24小时。对于一些实验，在共培养以监测细胞吞噬作用前，用染料标记DC和肿瘤细胞。使用针对下述分子的单克隆抗体(mAbs)：CD80-FITC，CD83-FITC，CD86-PE，CD14-PE(Immunotech，Marseille，France)，CD11c-PE，HLA-DR(BD Biosciences，San Jose，CA)。

在4℃对DCs染色30分钟，在磷酸盐缓冲液(PBS)中洗涤两次，用FlowJO软件，FACS Aria(BD Biosciences)进行分析。根据FSC和SSC特征来截住(gate)DCs。其中包括了合适的同种型对照，每个实验都需要50000个活的DCs。

IFN-γ诱导肿瘤特异性T细胞的评估：在培养的第0天和第7天，以比例1:10将未脉冲或肿瘤细胞装载的DCs加入到自体T细胞中。在培养的第2天和第7天加入IL-2(25-50国际单位/mL；Peprotech)。在DCs最后一次刺激之后的7至9天，检测培养物中是否存在肿瘤特异性T细胞。肿瘤装载的DCs对前列腺特异性抗原(PSA)反应性T细胞中的肿瘤-反应性、产生干扰素(IFN)-γ的T细胞的诱导通过流式细胞术进行确定。用抗-人CD8/IFNγ对T细胞进行染色。培养物中的调节性T淋巴细胞的频率通过用CD4/CD25和FoxP3染色来进行分析。调节性T细胞通过流式细胞术确定为是CD4阳性、CD25阳性和FoxP3阳性。

本发明进一步在下述实施例中被阐述，但不局限于下述实施例：

实施例1

在用高静水压力处理后，人癌细胞系和人原发性肿瘤细胞中免疫原性细胞死亡标记hsp70、hsp90和钙网织蛋白的表达

白血病、卵巢和前列腺癌细胞系和原发性肿瘤细胞用高静水压力(HHP，200MPa)在21摄氏度下处理10分钟，在6、12和24小时时监控已知免疫原性细胞死亡标记hsp70、hsp90和钙网织蛋白的表达。在所有待测肿瘤模型中，HHP处理后6、12和24小时后检测到免疫原性细胞死亡标记钙网织蛋白、hsp70和hsp90的显著表达。这些免疫原性分子的表达显著高于由蒽环类抗生素(已知仅有的免疫原性细胞死亡的诱导子)所诱导的表达(图2)。HHP处理后钙网织蛋白和热激蛋白的增高表达伴随着它们在细胞表面上的易位。HHP处理还诱导了HMGB1的快速和大量地释放，其中HMGB1是免疫原性细胞死亡的可溶性标记。HMGB1的释放要比UV辐射或蒽环类抗生素处理时高得多(图3)。

在诱导肿瘤细胞死亡的48小时后，检测到了HMGB1核蛋白的最大释放。

实施例2

高静水压力处理肿瘤细胞提高了其被抗原呈递细胞的吞噬

考虑到钙网织蛋白所建立起来的“吃我”信号的作用，研究了树突细胞(DCs)对于被高静水压力杀死的肿瘤细胞的吞噬率，而树突细胞是最有效的抗原呈递细胞，它对于免疫应答的引发是非常关键的。与其他方式例如蒽环类抗生素和UV辐射所杀死的肿瘤细胞相比，高静水压力处理的肿瘤细胞以更快的速率和更高的程度被吞噬。12小时后，用HHP处理的白细胞的吞噬程度是由UV辐射杀死的细胞的吞噬程度的4倍(图4a和图4b)。

实施例3

高静水压力处理的肿瘤细胞的吞噬诱导DCs的成熟。

DCs激活免疫应答的能力取决于它们的活化状态以及协同刺激分子的表达。在正常环境下，最有效的DCs的成熟是由衍生于病原体的分子所诱导的，例如革兰氏阴性菌中的脂多糖(LPS)。只有激活的(成熟的)表达高水平协同刺激分子的DCs能够引发免疫应答。我们分析了吞噬被HHP杀死的肿瘤细胞的树突细胞的表型。DCs与HHP-处理的肿瘤细胞的相互作用诱导了协同刺激因子(CD86，CD83)和成熟相关分子(HLA-DR)调到与被LPS激活类似的程度(图5)。因此，被HHP杀死的肿瘤细胞能够与病原体来源的LPS相当地诱导DCs的成熟。

实施例4

呈递高静水压力处理的肿瘤细胞的DCs诱导肿瘤特异性T细胞并且诱导低数量的抑制性调节性T细胞

为了研究HHP处理的且表达免疫原性细胞死亡标记的肿瘤细胞是否诱导抗-肿瘤免疫，我们评估了装载肿瘤细胞的DCs激活肿瘤细胞特异性T细胞响应的能力。HHP杀死的肿瘤细胞与未成熟DCs共培养，随后使用或不使用LPS成熟化。这些DCs被用做自体T细胞的刺激物，在用肿瘤细胞装载的DCs再刺激之后的一周，分析了产生IFN-γ的T细胞的频率。与使用经辐射细胞脉冲的DCs相比，即便是没有加入成熟刺激物(LPS)的情况下，用HHP杀死的肿瘤细胞装载的DCs也诱导了更多数量的肿瘤特异性的产生IFN-γ的T细胞。

此外，在DC和T细胞共培养物中还检测了调节型T细胞(Tregs)的频率。在肿瘤免疫中，Tregs的诱导是不需要的，因为Tregs会抑制靶向肿瘤的免疫应答。与未成熟的DCs和LPS激活的DCs相比，用HHP杀死的肿瘤细胞脉冲的DCs具有更低的产生调节型T细胞的能力(图8)。FoxP3表面标记物对于调节型T细胞是特异性的。

实施例5

在通过手术或放射初步治疗肿瘤后，主动细胞免疫治疗在治疗最小残余疾病的情况中可作为单独治疗模式来施用。在前列腺癌症中，它可涉及具有生化复发信号的患者(通过超灵敏的方法，外周血中的前列腺特异性抗原PSA的水平增高)。

当通过手术将原发性肿瘤从患者中移除后，本发明可获得最好的效果。在本申请中所描述的药物组合物可以从肿瘤细胞中生产，所述肿瘤细胞是从肿瘤组织或从肿瘤细胞系中分离得到。

一名患有前列腺癌的患者(68岁)在肿瘤早期被诊断出来。肿瘤被切除，但是手术后几个月又检测到了PSA水平的上升。因此，患者被进行白血球分离术，以及从分离的单核细胞中分化了未成熟树突细胞。对从前列腺癌细胞系中获得的肿瘤细胞被进行如本发明所述的高静水压力凋亡处理，将凋亡的肿瘤细胞与未成熟的树突细胞接触以制备疫苗组合物。

药物组合物被划分成几等份，冻在液氮中待用。第一次施用肿瘤疫苗接种是在检测到前列腺癌症的生化复发信号之后4周。接着在一年之内每4周施用一次。

疫苗诱导了针对少量存活肿瘤细胞的免疫应答，从而导致肿瘤细胞生长的显著变慢以及导致了患者生存时间的延长。

实施例6

在后期的癌症患者中，根据化学-免疫治疗概念，激活的细胞免疫治疗应当与化疗相结合(即，前列腺癌中的多西他奇)。

一名患有后期前列腺癌的患者(76岁)用本发明的方法治疗。这里披露了常用的化疗方法与激活的细胞免疫治疗相结合。该患者在65岁时就进行前列腺肿瘤治疗。在手术切除肿瘤和激素治疗之后，PSA(前列腺特异性抗原)水平保持在一个较低的水平，这表明前列腺癌细胞并没有生长。在激素治疗后12个月后，转移性前列腺癌症在身体的不同部位(尤其是骨头中)发展，肿瘤变为激素抗性。该患者被获准用多西他奇与基于树突细胞的主动细胞免疫疗法联合治疗激素抗性(hormonerefractory)前列腺癌。

在化疗开始之前，从在白血球分离术时获得的单核细胞中产生未成熟的树突细胞。从前列腺癌细胞系中获得的肿瘤细胞在21摄氏度下，用210MPa的高静水压力处理30分钟。根据本发明所处理的10⁹个肿瘤细胞被用于脉冲10⁹个未成熟树突细胞，之前已被这些肿瘤细胞脉冲的成熟树突细胞等份被深度冻存于液氮中，以便后续的使用。

主动癌症免疫疗法每4-6周与标准的多西他奇化疗交替循环施用或单独使用(多西他奇治疗结束之后)一年。联合的化学免疫疗法使疾病稳定，骨髓转移密度降低以及存活时间超出预期。患者现在已经存活超过3年，超出了在治疗初期所预期的6个月存活时间。

实施例7

体外实验显示了HHP杀死的肿瘤细胞相对于UV杀死的肿瘤细胞的优势

在体外实验中，检测了未成熟树突细胞，poly I:C激活的成熟树突细胞、装载有被HHP处理的肿瘤细胞和UV辐射的肿瘤细胞的树突细胞诱导肿瘤特异性免疫的能力。肿瘤特异性免疫通过肿瘤特异性T淋巴细胞百分比来测量。

含有HHP杀死的肿瘤细胞的树突细胞与单独的HHP杀死的肿瘤细胞和装载有UV辐射杀死的肿瘤细胞的树突细胞进行比较。这些实验的结果显示在图7中。

为了检测未脉冲的或装载有肿瘤细胞的树突细胞诱导肿瘤特异性T细胞的能力，在培养的第0天和7天以1:10的比例向细胞中加入自体T细胞。在第2天和7天向培养物中加入25-50国际单位/ml的IL-2(PeproTech)。在最后一次对DCs的刺激后7-9天，检测培养物中是否存在肿瘤特异性T细胞。肿瘤装载的DCs对前列腺特异性抗原(PSA)反应性T细胞的肿瘤反应性、产生干扰素-γ的T细胞的诱导由流式细胞术所确定。用抗人-CD8/干扰素-γ对T细胞染色。

将装载有高静水压力杀死的肿瘤细胞(LNCap)的树突细胞对前列腺特异性抗原(PSA)特异性T细胞的诱导与单独的高静水压力杀死的肿瘤细胞以及装载有UV辐射杀死的肿瘤细胞的树突细胞进行比较。

这些实验的结果显示于图7中。图7的上部显示了甚至在没有成熟信号的情况下，装载有HHP杀死的肿瘤细胞的DC能够诱导肿瘤特异性T细胞。装载有UV处理杀死的肿瘤细胞和单独的HHP杀死的肿瘤细胞的树突细胞并不能诱导肿瘤免疫。惊奇的是，只有HHP处理的肿瘤细胞(根据本发明)和成熟的树突细胞能够诱导肿瘤特异性免疫应答，然而UV处理的肿瘤细胞和未成熟的树突细胞并不能获得该结果。不期望受到理论的束缚，似乎只有HHP处理的肿瘤细胞与未成熟的树突细胞一起才能诱导肿瘤特异性T细胞免疫应答。HHP处理的肿瘤细胞似乎是作为未成熟树突细胞的一种激活物，而UV处理的肿瘤细胞并不具有这种效果。

图7的下部显示当应用poly I：C处理的时候，相比起用UV辐射的肿瘤细胞，HHP肿瘤细胞能够更好地诱导特异性T淋巴细胞。

实施例8

以根据本发明的肿瘤疫苗接种获得的体内数据

树突细胞从和上述相似的患者群中得到。用上述杀死的肿瘤细胞对树突细胞进行脉冲，以4-6周的间隔向患者重复施用最高达12剂的肿瘤疫苗接种，所述患者在根治的前列腺切除或放射治疗之后出现了前列腺癌症的生化复发。每个患者的疾病进展通过PSA加倍时间来进行评估。在PSA加倍时间中，该时间被理解为使PSA值加倍的时间。PSA加倍时间显示为患有前列腺癌男性总体存活和无转移存活的最强和最可靠决定因素。短的PSA加倍时间与缩短的生存时间和转移性肿瘤出现时间相关(Antonarakis et al.,BJU Int.,2012,108(3);pp378-385。

正如图9中所显示的，向根治前列腺切除或放射性治疗之后患有前列腺癌生化复发的患者中持续地施用本发明的肿瘤疫苗接种导致了PSA加倍时间显著加长。已经发现通过使用这里所披露的肿瘤疫苗接种后，平均PSA加倍时间从癌症免疫治疗前的5个月提高到12个月免疫治疗后的30个月。这代表着患有前列腺癌症生化复发的患者一个显著的益处。

实施例9

处于前列腺癌症晚期的患者的临床实验

在这个临床实验中，如这里所描述的，用被杀死的肿瘤细胞对树突细胞进行脉冲。向处于前列腺癌症晚期的患者重复施用肿瘤疫苗。所述患者患有去雄抗性转移性前列腺癌。在这些患者中，与多西他奇化学疗法一起，以不同的剂量计划施用免疫治疗方法。

治疗后的群体的存活与历史性定群或Halabi列线表所评估的存活相比较。据显示，与基于Halabi列线表所计算的预期存活时间(13个月)的历史性对照定群相比，主动肿瘤免疫疗法的持续性施用显著地延长了被治疗患者的存活时间(中位存活23个月)。

该实验证实了本发明的肿瘤疫苗接种大大地延长了处于前列腺癌症晚期的患者的存活时间。这样的患者的平均预期存活时间没有经历过治疗是13个月，相比之下，以本发明的肿瘤疫苗接种治疗后是23个月。对于极其难以用药物治疗成功的患者而言，这代表着显著的进步。

Claims (14)

1.用于诱导针对肿瘤细胞的免疫应答的药物组合物，包含：

a)由高静水压力处理造成凋亡的肿瘤细胞，和

b)树突细胞。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于用静水压力在至少200MPa的压力下处理所述肿瘤细胞至少10分钟。

3.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于用静水压力在200～250MPa压力下处理所述肿瘤细胞10分钟至2小时。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的药物组合物，其特征在于所述凋亡的肿瘤细胞不是坏死的。

5.根据前面权利要求中任一项所述的药物组合物，其特征在于所述肿瘤细胞衍生自肿瘤细胞系。

6.根据权利要求1-4中任一项所述的药物组合物，其特征在于所述肿瘤细胞衍生自从待治疗患者中分离出来的肿瘤。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的药物组合物，其特征在于未成熟的树突细胞装载有用高静水压力处理过的凋亡肿瘤细胞。

8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于未成熟的树突细胞通过白血球分离术获得。

9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于未成熟的树突细胞通过白血球分离术并在细胞因子存在的情况下体外培养而获得。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的药物组合物，其用于患有早期癌症或晚期癌症的患者。

11.根据权利要求10中的药物组合物，其中所述晚期癌症是激素治疗抗性转移性前列腺癌。

12.如权利要求1-11中任一项所述的药物组合物的制备方法，其特征在于将未成熟的树突细胞装载由高静水压力处理过的凋亡肿瘤细胞，然后使该树突细胞成熟化。

13.用癌症疫苗治疗人的方法，包括从患者分离未成熟的树突细胞和从患者分离肿瘤细胞，其中所述肿瘤细胞可通过用高静水压力处理使其转向凋亡阶段、装载至未成熟的树突细胞上，以及使所述树突细胞成熟化，然后将药物组合物施用给患者。

14.用癌症疫苗治疗人的方法，包括从患者体内分离未成熟的树突细胞和将获自肿瘤细胞系的肿瘤细胞装载到所述树突细胞中，其中所述肿瘤细胞可通过用高静水压力处理使其转向凋亡阶段，其中任选使所述树突细胞成熟化，然后将药物组合物施用给患者。

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