KR102035873B1 - 높은 정수압에 의해서 사멸된 종양 세포 및 수지상 세포를 사용하는 암의 활성 세포 면역요법의 수단 및 방법 - Google Patents
높은 정수압에 의해서 사멸된 종양 세포 및 수지상 세포를 사용하는 암의 활성 세포 면역요법의 수단 및 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR102035873B1 KR102035873B1 KR1020137032259A KR20137032259A KR102035873B1 KR 102035873 B1 KR102035873 B1 KR 102035873B1 KR 1020137032259 A KR1020137032259 A KR 1020137032259A KR 20137032259 A KR20137032259 A KR 20137032259A KR 102035873 B1 KR102035873 B1 KR 102035873B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- cells
- tumor
- tumor cells
- dendritic cells
- pharmaceutical composition
- Prior art date
Links
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 182
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 155
- 238000009931 pascalization Methods 0.000 title claims abstract description 59
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims description 85
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 title claims description 19
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 title description 11
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 title description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 39
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 claims abstract description 22
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 89
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 42
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 34
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 34
- 230000035800 maturation Effects 0.000 claims description 15
- 230000002706 hydrostatic effect Effects 0.000 claims description 14
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 claims description 13
- 230000037449 immunogenic cell death Effects 0.000 claims description 12
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 claims description 12
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 9
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 9
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 8
- 229940045799 anthracyclines and related substance Drugs 0.000 claims description 8
- 238000009566 cancer vaccine Methods 0.000 claims description 7
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 claims description 7
- 208000010658 metastatic prostate carcinoma Diseases 0.000 claims description 5
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims description 4
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 claims description 3
- 101710163595 Chaperone protein DnaK Proteins 0.000 claims description 2
- 101710178376 Heat shock 70 kDa protein Proteins 0.000 claims description 2
- 101710152018 Heat shock cognate 70 kDa protein Proteins 0.000 claims description 2
- 101710113864 Heat shock protein 90 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100034051 Heat shock protein HSP 90-alpha Human genes 0.000 claims description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 2
- 230000032832 immune response to tumor cell Effects 0.000 claims 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 abstract description 10
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 abstract description 5
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 32
- 102000007066 Prostate-Specific Antigen Human genes 0.000 description 27
- 108010072866 Prostate-Specific Antigen Proteins 0.000 description 27
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 21
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 20
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 19
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 16
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 15
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 14
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 14
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 13
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 13
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 13
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 13
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 13
- 102100037907 High mobility group protein B1 Human genes 0.000 description 12
- 101001025337 Homo sapiens High mobility group protein B1 Proteins 0.000 description 11
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 10
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 9
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 9
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 9
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 7
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 7
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 7
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 6
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 6
- 108091036414 Polyinosinic:polycytidylic acid Proteins 0.000 description 6
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 6
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 206010024378 leukocytosis Diseases 0.000 description 6
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 6
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 101100016370 Danio rerio hsp90a.1 gene Proteins 0.000 description 5
- 101100285708 Dictyostelium discoideum hspD gene Proteins 0.000 description 5
- 101100125027 Dictyostelium discoideum mhsp70 gene Proteins 0.000 description 5
- 101150031823 HSP70 gene Proteins 0.000 description 5
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 5
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 5
- ZDZOTLJHXYCWBA-VCVYQWHSSA-N N-debenzoyl-N-(tert-butoxycarbonyl)-10-deacetyltaxol Chemical compound O([C@H]1[C@H]2[C@@](C([C@H](O)C3=C(C)[C@@H](OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)OC(C)(C)C)C=4C=CC=CC=4)C[C@]1(O)C3(C)C)=O)(C)[C@@H](O)C[C@H]1OC[C@]12OC(=O)C)C(=O)C1=CC=CC=C1 ZDZOTLJHXYCWBA-VCVYQWHSSA-N 0.000 description 5
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 5
- 101100071627 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) swo1 gene Proteins 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- 101150052825 dnaK gene Proteins 0.000 description 5
- 229960003668 docetaxel Drugs 0.000 description 5
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 5
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 5
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 5
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102100029968 Calreticulin Human genes 0.000 description 4
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 4
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 4
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 4
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 4
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 4
- 230000005975 antitumor immune response Effects 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 4
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 4
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 230000037455 tumor specific immune response Effects 0.000 description 4
- 102000004121 Annexin A5 Human genes 0.000 description 3
- 108090000672 Annexin A5 Proteins 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 3
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 3
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 3
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 description 3
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 3
- 238000009125 cardiac resynchronization therapy Methods 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 3
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 3
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 3
- 238000011472 radical prostatectomy Methods 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 102100035793 CD83 antigen Human genes 0.000 description 2
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 101000946856 Homo sapiens CD83 antigen Proteins 0.000 description 2
- 101000793651 Homo sapiens Calreticulin Proteins 0.000 description 2
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 2
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 2
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 2
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 2
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 2
- 240000002390 Pandanus odoratissimus Species 0.000 description 2
- 235000005311 Pandanus odoratissimus Nutrition 0.000 description 2
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 2
- 102100024333 Toll-like receptor 2 Human genes 0.000 description 2
- 108010060888 Toll-like receptor 2 Proteins 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011194 good manufacturing practice Methods 0.000 description 2
- 238000001794 hormone therapy Methods 0.000 description 2
- 231100000619 immunotoxicology Toxicity 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 description 2
- 102000007863 pattern recognition receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010089193 pattern recognition receptors Proteins 0.000 description 2
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 2
- 238000011277 treatment modality Methods 0.000 description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010005094 Advanced Glycation End Products Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108090000549 Calreticulin Proteins 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 208000005443 Circulating Neoplastic Cells Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 102100027581 Forkhead box protein P3 Human genes 0.000 description 1
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710168537 High mobility group protein B1 Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000861452 Homo sapiens Forkhead box protein P3 Proteins 0.000 description 1
- 101000868279 Homo sapiens Leukocyte surface antigen CD47 Proteins 0.000 description 1
- 101000669447 Homo sapiens Toll-like receptor 4 Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000003816 Interleukin-13 Human genes 0.000 description 1
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 102100032913 Leukocyte surface antigen CD47 Human genes 0.000 description 1
- 108010009489 Lysosomal-Associated Membrane Protein 3 Proteins 0.000 description 1
- 102100038213 Lysosome-associated membrane glycoprotein 3 Human genes 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 208000035992 Postmortem Changes Diseases 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 208000007660 Residual Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000037453 T cell priming Effects 0.000 description 1
- 102100039360 Toll-like receptor 4 Human genes 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 229940126675 alternative medicines Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005809 anti-tumor immunity Effects 0.000 description 1
- 230000006023 anti-tumor response Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000003969 blast cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 1
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- GXJABQQUPOEUTA-RDJZCZTQSA-N bortezomib Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)B(O)O)NC(=O)C=1N=CC=NC=1)C1=CC=CC=C1 GXJABQQUPOEUTA-RDJZCZTQSA-N 0.000 description 1
- 229960001467 bortezomib Drugs 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000011342 chemoimmunotherapy Methods 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 238000009643 clonogenic assay Methods 0.000 description 1
- 231100000096 clonogenic assay Toxicity 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000011254 conventional chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 210000003722 extracellular fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000012997 ficoll-paque Substances 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000004941 influx Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000011221 initial treatment Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 210000005061 intracellular organelle Anatomy 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 201000002364 leukopenia Diseases 0.000 description 1
- 231100001022 leukopenia Toxicity 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005210 lymphoid organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 230000004987 nonapoptotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011824 nuclear material Substances 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 229960001756 oxaliplatin Drugs 0.000 description 1
- DWAFYCQODLXJNR-BNTLRKBRSA-L oxaliplatin Chemical compound O1C(=O)C(=O)O[Pt]11N[C@@H]2CCCC[C@H]2N1 DWAFYCQODLXJNR-BNTLRKBRSA-L 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 230000000861 pro-apoptotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000023958 prostate neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002787 reinforcement Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000011255 standard chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
- A61K2239/58—Prostate
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/36—Skin; Hair; Nails; Sebaceous glands; Cerumen; Epidermis; Epithelial cells; Keratinocytes; Langerhans cells; Ectodermal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4615—Dendritic cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
- A61K39/4622—Antigen presenting cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/464493—Prostate associated antigens e.g. Prostate stem cell antigen [PSCA]; Prostate carcinoma tumor antigen [PCTA]; Prostatic acid phosphatase [PAP]; Prostate-specific G-protein-coupled receptor [PSGR]
- A61K39/464494—Prostate specific antigen [PSA]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0639—Dendritic cells, e.g. Langherhans cells in the epidermis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Oncology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Virology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
본 발명은 높은 정수압으로 처리하여 세포사멸성으로 만든 종양 세포 및 수지상 세포를 포함하는, 종양 세포에 대한 면역반응을 유도하기 위한 약제학적 조성물, 및 이러한 조성물을 생산하는 방법을 기술한다.
Description
다양한 종양에 의해서 야기된 질병은 의료 및 인체 건강에서 여전히 주된 문제이다. 수술, 화학요법 및 방사선요법의 조합은 암 환자의 예후를 크게 개선시켰다. 이러한 접근방법이 흔히 종양 덩어리의 상당한 감소를 야기함에도 불구하고, 전구체 종양 세포 또는 암 줄기 세포의 소집단은 종종 생존하고, 추후에 재발을 초래하는 종양 세포의 새로운 집단을 발생시킨다. 비록 주된 종양이 수술 및/또는 다른 치료에 의해서 제거된다고 하더라도, 미량의 순환 종양 세포는 신체의 다른 영역에서 전이성 종양을 야기할 수 있다. 따라서, 단독으로 사용될 수 있거나, 바람직하게는 종양 치료의 다른 방법과 조합될 수 있는 대체 의약 및 치료방법에 대한 영구적인 필요성이 존재한다.
국제출원공보 WO 2006/095330은 항원-보유 세포를 열, 기계 및/또는 화학적으로 손상시키고, 상기 세포를 항원-제시 세포와의 응집체로서 환자에게 도입시킴으로써 세포 집단의 성장을 억제하는 방법을 기술하였다.
프랑크 등 [Frank et al., "Harnessing Naturally Occurring Tumor Immunity; A Clinical Vaccine Trial in Prostate Cancer", PLOS ONE, vol. 5, no. 9, 1 January 2010 (2010-01-01), page E12367]은 자가유래 수지상 세포 및 세포사멸성 UV-조사 LNCaP 세포를 포함하는 종양 백신을 개시하였다.
미나리크 등 [Minarik et al., "Phase I/II of Clinical Study of Prostate Cancer Immunotherapy Using Dendritic Cell Vaccination Strategy - First Results", European Urology Supplements, vol. 9, no. 6, 1 September 2010, page 629]은 UVA 조사에 의해서 사멸된 세포사멸성 LNCaP 세포에 의해서 펄싱된 (pulsed) 수지상 세포를 사용한 전립선암 면역요법의 I/II 기 임상시험의 예비 결과를 개시하였다.
바이스 등 [Weiss et al., "Ex vivo- and in vivo-induced dead tumor cells as modulators of antitumor responses", Annals of the New York Academy of Sciences, vol. 1209, no. 1, 1 October 2010 (2010-10-01), pages 109-117]은 종양 세포의 높은 정수압 (high hydrostatic pressure) 치료를 개시하였다. 죽은 종양 세포가 동물 모델에서 암 백신으로 직접 사용된다.
바이스 등 [Weiss et al. "High hydrostatic pressure treatment generates inactivated mammalian tumor cells with immunogeneic features", Journal of Immunotoxicology, vol. 7, no. 3, 1 September 2010, pages 194-204]은 높은 정수압 치료가 세포사멸을 유도하며, 여기에서 종양 세포는 불활성이고 면역원성이라고 개시하였다. 종양 세포에 대해서 지시된 항체는 마우스 모델에서 생산 및 확인되었다.
US 2008/0286314는 암 환자를 치료하기 위해서 사용될 수 있는, 비-세포사멸성인 열-쇼크 암 세포가 부하된 항원 제시 세포를 포한하는 암 백신을 개시하였다.
본 발명은 항-종양 면역반응의 유도를 위해서, 특히 신체가 종양 세포에 대한 면역원성 반응을 일으키도록 야기하는 종양 백신접종에서 사용될 수 있는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
조사(irradiation)와 같은 표준 양식에 의해서 사멸된 종양 세포는 통상적으로 비-면역원성이다. 암 면역요법 생성물의 생성을 위해서 사용되는 경우에, 조사된 종양 세포는 강력한 보조제와 함께 투여하는 것이 필요하다. 수지상 세포와 같은 항원 제시 세포의 펄싱 (pulsing)을 위해서 사용되는 경우에, 조사된 사멸 종양 세포는 활성화 시그날을 제공하지 않는다. 따라서, 수지상 세포는 병원체 유도된 분자와 같은 또 다른 물질에 의해서 활성화되는 것이 필요하다.
인간 종양 세포, 특히 인간 기원의 난소 및 전립선 암 세포 및 급성 림프구성 백혈병 세포의 면역원성 사망을 유도하는 신규의 방법이 기술된다. 높은 정수압 (이하에서는 또한, HHP)에 의해서 사멸된 종양 세포는 추가의 자극의 부재 하에서도 수지상 세포에 대한, 특히 미성숙 수지상 세포에 대한 강력한 활성화 자극을 제공한다. 이 방법에 의해서 사멸된 종양 세포는 높은 레벨의 면역원성 세포사 마커를 발현하며, 이들 면역원성 종양 세포가 부하된 수지상 세포는 바람직하지 않은 조절성 T 림프구를 팽창시킴이 없이 다수의 종양 특이적 T 림프구를 유도한다. 본 발명의 실험적 데이터는 높은 정수압의 적용에 의해서 사멸된 종양 세포와 수지상 세포의 조합이 종양 항원의 효율적인 제시 및 식균작용, 및 강력한 항-종양 면역반응의 유도를 야기함을 나타낸다.
종양 세포는 면역원성이 없거나 단지 약하며, 이들은 통상적으로 강력한 보조제의 부재 하에서 사용된다면 종양 특이적 면역반응을 유도하는 능력을 갖지 않는다. 최근의 연구는 보르테조밉 (bortezomib), 옥살리플라틴 (oxaliplatin) 및 안트라사이클린과 같은 일부의 화학요법제에 의해서 사멸된 종양 세포가 종양-특이적 면역반응을 유도할 수 있음을 나타내었다. 이러한 면역원성 세포사는 기술된 모든 화학요법제에 대해서 공유된 분자 사건을 특징으로 한다. 면역원성 세포사의 개시 후 수시간 이내에, 전세포사멸성 종양 세포는 칼레티큘린 (calreticulin) 및 열 쇼크 단백질을 'eat me' 시그날로 작용하는 다른 분자 (포스파티딜세린)와 함께 내형질 세망으로부터 세포 표면으로 전위시킨다.
동시에, 면역원성 종양 세포사를 겪는 종양 세포는 'don't eat me' 시그날 (예를 들어, 표면 CD47)의 발현을 하향조절하여 수지상 세포에 의한 종양-세포 인식 및 포식 (engulfment)을 용이하게 한다. 추가로, 원형질막의 투과화 후에 세포는 세포외 환경 내로 후기 세포사멸 마커 고이동성 그룹 박스 1 (late apoptosis marker high mobility group box 1; HMGB1)을 방출한다. HMGB1은 톨 (Toll)-유사 수용체 2 (TLR2), TLR4 및 진행된 글리코실화 최종 생성물에 대한 수용체 (RAGE)와 같은 몇 가지의 패턴 인식 수용체 (PRRs)를 결합시킬 수 있다. 이 단백질의 방출은 죽는 종양 세포로부터의 항원의 최적 제시, 수지상 세포에 의한 T-세포 프라이밍 (priming) 및 이어서 종양의 T-세포-매개된 제거에 필요한 것으로 보인다.
이들이 면역원성으로 되는 방식으로 사멸된 종양 세포의 사용은 암 면역요법 전략을 디자인하는데 매우 중요하다. 면역원성 종양 세포의 투여는 종양-특이적 면역반응을 유도할 수 있으며, 이것은 다음에 종양 세포의 성장을 제어할 것이다. 이것은 질병의 진행을 늦추거나 안정화까지도 시키고, 암 환자의 예후를 개선시킬 수 있다. 또한, 체내에 순환하는 종양 세포의 분포 및 전이의 형성이 적어도 실질적으로 감소될 수 있는 것으로 추정된다.
본 발명은 인간 종양, 특히 난소 및 전립선 암 세포 및 급성 림프구성 백혈병의 면역원성 세포사를 최근에 기술된 화학요법제보다 훨씬 더 높은 정도까지 유도하는 신규의 방법 및 약제학적 조성물을 기술한다. 이 방법에 의해서 사멸되고, 수지상 세포에 의해서 포획된 (captured) 종양 세포는 높은 레벨의 면역원성 세포사 마커를 발현하며, 항-종양 면역반응을 억제할 수 있는 조절성 T 세포를 유도함이 없이 다수의 종양 특이적 T 림프구를 유도한다. 본 발명에 따라 처리된 종양 세포와 수지상 세포의 조합에 의해서 수득된 항-종양 면역반응의 정도는 면역원성 종양 세포 단독에 의해서 유도된 면역반응보다 약 10-배 더 큰 것으로 확인되었다.
사멸된 종양 세포로 부하된 성숙 수지상 세포 (DCs)의 투여를 기초로 한 바람직한 암 면역요법 프로토콜의 일반적 원리는 도 1에 나타내었다. 최종 약제학적 조성물의 생성의 모든 단계는 GMP 시설에서 우수 제조관행 조건 (Good Manufacturing Practice conditions) 하에서 수행된다.
바람직한 구체예에서, 각각의 환자에 대한 약제학적 조성물의 제조 방법에서의 제1 단계는 말초혈액으로부터 다수의 단핵구를 수집할 목적으로 수행된 백혈구성분채집술 (leukapheresis)이다. 바람직한 구체예에서는, 그 후에 백혈구성분채집 생성물을 PBS+1 mM EDTA (Lonza, Vierviers, Belgium)와 같은 적합한 완충액에 희석하고, 단핵 세포를 프리미엄 피콜 파크 (Premium Ficoll Paque) (GE Healthcare, Little Chalfont, UK) 구배 원심분리에 의해서 분리한다. 그 후, 수집된 단핵 세포 (PBMC)를 세척하고 [예를 들어, PBS+1 mM EDTA (Lonza) 중에서], 셀그로 배지 (Cell Gro medium) 내에 재현탁시키고, 삼중 플라스크 (예를 들어, NUNC, Roskilde, Denmark) 내에 표면적의 ㎠당 1x106 세포로 플레이팅한다. 2 시간 후에, 비-부착 세포를 PBS (Lonza)로 세척한다. 부착 단핵구는 셀그로 배지 내에서 20 ng/㎖의 IL-4 (Gentaur) 및 500 U/㎖의 GM-CSF (Gentaur)와 함께 6일 동안 배양하고, 신선한 사이토카인을 3일째에 첨가한다.
미성숙 DCs를 6일째에 수확하여 사멸된 종양 세포 (예를 들어, 전립선암 세포주, 난소암 세포주, 급성 림프구성 백혈병 세포주)로 부하한다. 신선하게 해동된 미성숙 DCs (3-6일)에 5:1의 고정된 DC: 종양 세포 비로 4시간 동안 종양 세포를 공급한다. 종양 세포로 처리된 수지상 세포의 비는 바람직하게는 1:1 내지 10:1까지, 더욱 바람직하게는 약 4:1 내지 6:1의 범위 이내이다.
본 발명에 따르면, 분화, 성숙 및/또는 활성화의 다양한 단계에 있는 수지상 세포가 사용될 수 있다. 수지상 세포의 성숙 단계는 성숙 인자에 의해서 영향을 받을 수 있다.
그 후, 종양 세포-펄싱된 DCs를 바람직하게는 밤새 배양 중에 25 ㎍/㎖의 폴리 I:C에 의해서 성숙시키고, 액체 질소 중에서 냉동보존하여 저장한다. 투여하기 전에, 종양 세포로 펄싱된 1x107 성숙 DCs를 0.9% NaCl (Baxter)에 재현탁시키고, 12시간 이내에, 바람직하게는 30분 내지 12시간까지에 서혜부 및 팔 영역에 피하로 주사한다. 이러한 형태의 암 면역요법의 투여는 바람직하게는, 면역반응을 지속적으로 고양시키기 위해서 2-6 주일의 규칙적인 간격으로 반복한다. 본 발명에 기술된 방법은 종양-유도된 면역 관용 (immune tolerance)의 재건을 방지하는 것으로 추정된다. 이러한 형태의 면역요법의 치료학적 효능은 뚜렷한 임상 단계의 전립선암, 전립선암의 생화학적 재발 및 거세 저항 전이성 전립선암, 아마도 또한 전이성 호르몬-민감성 단계에 있는 환자들에게서 입증되었다.
그러나, 상술한 바람직한 구체예는 제한적인 것은 아니다. 가장 넓은 범위로, 본 발명은 종양 치료의 특정한 요구에 따라 대체 방식으로 수행될 수 있다. 상기-확인된 바람직한 구체예는 종양 세포가 치료될 환자로부터 또는 종양 세포주 또는 종양 세포주 은행으로부터 수득되는 본 발명을 기술한다. 수지상 세포는 바람직하게는 또한 치료될 환자로부터 수득된다.
그러나, 더욱 일반적인 방법으로 본 발명은 a) 세포사멸이 정수압에 의한 처리에 의해서 야기되는 세포사멸성인 종양 세포, 및 b) 수지상 세포를 포함하는, 종양 세포에 대한 면역반응을 유도하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
약제학적 조성물에서 사용되는 종양 세포가 세포사멸성 세포이며 괴사 세포가 아니라는 것은 본 발명의 중요한 관점이다. 본 기술분야에서 숙련된 전문가는 세포사멸과 괴사 사이의 차이를 알고 있다. 세포사와 괴사로 불리는 후속 사후 변화는 정상적인 발생 및 성숙화 사이클의 필수적인 부분이다. 이 과정의 중요성에도 불구하고, 세포가 죽을 때에 일어나는 기전에 관한 몇 개의 문헌이 있지만 세포사를 기본으로 하는 기전은 여전히 잘 이해되지 않고 있다. 본 발명의 개념에서 세포사멸은 프로그래밍되고 관리된 형태의 세포사로 이해되며, 따라서 괴사는 불규칙적이며 우발적인 형태의 세포 사망이다.
본 발명에서, 세포사멸은 정상적인 생리학적 조건 하에서 일어나는 세포사의 모드로 이해되며, 세포는 그 자신의 죽음의 능동적 참여자이다. 세포사멸을 겪고 있는 세포는 특징적인 형태학적 및 생화학적 특성을 나타낸다. 이들 특성에는 크로마틴 응집, 핵 및 세포질성 응축, 리보좀, 형태학적으로 온전한 미토콘드리아 및 핵 물질을 함유하는 막-결합된 소포체 (세포사멸체)로의 세포질 및 핵의 구분이 포함된다. 이들 세포사멸체는 대식세포 또는 인접한 상피세포에 의해 생체내에서 정상적으로 인식되고 식균되기 때문에, 본 발명의 방법에서 사용된 종양 세포가 가능한 세포사멸성 종양 세포와 가깝게 닮아있다는 것은 중요하다. 세포사멸은 통상적으로 개개 세포로 제한되며, 염증 반응을 야기하지는 않는다.
다른 한편으로, 괴사는 세포가 원형질막에 대한 손상을 야기할 수 있는 극단적인 생리학적 조건에 노출되는 경우에 일어난다. 괴사는 항상성을 유지시키는 세포의 능력의 손상으로 시작하여 물 및 세포외 이온의 유입을 초래한다. 세포내 세포기관, 특히 미토콘드리아 및 전체 세포가 팽윤하고, 파열한다. 원형질막의 궁극적인 붕괴에 기인하여 라이소좀 효소를 포함한 세포질 내용물은 세포외 액 내로 방출된다. 따라서, 생체내 괴사성 세포사는 종종, 격렬한 염증 반응을 야기하는 광범한 조직 손상과 연관된다. 약제학적 조성물에서 사용된 종양 세포가 세포사멸성이고, 괴사성은 아니라는 것은 중요하다.
본 발명에 따르면, 세포사멸성 세포는 높은 정수압으로 처리함으로써 생산된다. 본 발명에서 이해되는 것으로서 고정수압은 100 ㎫ [1 ㎫ = 10 바아 = 9.86923 atm = 145.0377 psi]와 동등하거나 그보다 큰 압력 수두 (pressure head)로 정의된다. 고정수압은 예를 들어, 문헌 [Weiss et al., Journal of Immunotoxicology, 2010, pp 194-209, 특히 Figure 1]에 기술된 장치에 의해서 생산될 수 있다.
종양 세포의 높은 정수압 처리는 바람직하게는 압력 오토클레이브 (pressure autoclave) 내에서 수행된다. 종양 세포를 세포 현탁액으로 완전히 충전되고 단단하게 밀폐되어 기포의 출현이 방지되는 적합한 극저온 바이알 (cryogenic vials) 내에 배치한다. 그 후에, 바이알을 신축성 필름 (예를 들어, 파라필름 (parafilm®))으로 밀봉하고, 준비된 바이알을 압력 전파 매질로 충전된 압력 챔버 내에 배치한다. 그 후에, 고압을 적합한 장치에 의해서 생성시키고, 세포를 이러한 고압 하에서 충분한 시간 동안 유지시킨다.
바람직한 구체예에서, 높은 정수압은 적어도 200 ㎫의 압력으로 적어도 10분 동안 유지시킨다. 더욱 바람직한 구체예에서, 종양 세포는 200-300 ㎫, 바람직하게는 200-250 ㎫의 범위의 압력에서 10분 내지 12시간, 바람직하게는 10분 내지 1시간, 특히 바람직하게는 10 내지 30분의 시간 범위 동안 유지시킨다.
약제학적 조성물에서 사용될 종양 세포는 다양한 공급원으로부터 유도될 수 있다. 한 가지 특정한 구체예에서, 종양 세포는 치료될 환자의 원발성 종양으로부터 또는 전이성 종양으로부터 유도된다. 종양 세포는 조직생검 (biopsy) 또는 수술에 의해서 수득될 수 있다. 조직을 붕해시키고, 분리 및 정제된 종양 세포를 즉시 사용할 수 있다. 또한, 원발성 종양의 세포주를 정립하고, 이렇게 수득된 세포를 종양 백신접종을 위해서 사용하는 것이 바람직하다. 대신으로, 종양 세포는 적합한 종양 세포주로부터 수득될 수도 있다. 이러한 종양 세포주는 자가유래 종양으로부터 제조될 수 있다. 대신으로, 예를 들어, ATCC와 같은 기탁기관으로부터 상업적으로 이용할 수 있는 종양 세포가 사용될 수도 있다.
약제학적 조성물의 다른 성분은 수지상 세포이다. 본 발명에 따르면, 다양한 단계의 수지상 세포가 사용될 수 있다. 혈액으로부터 수지상 세포를 분리시킴으로써 환자로부터 직접적으로 수득할 수 있는 어떤 수지상 세포라도 사용할 수 있다. 그러나, 수지상 세포를 그들의 단계에 따라 더 분류할 수도 있다. 본 발명의 한가지 구체예에서, 말초혈액 단핵구로부터 분화된 미성숙 수지상 세포가 종양 백신의 제조를 위해서 사용된다.
말초 림프양 기관 내에는 T 세포를 활성화시킬 수 있는 3 가지 주된 타입의 항원-제시 세포, 즉 수지상 세포, 대식세포 및 B 세포가 있는 것으로 알려져 있다. 이들 중에서 가장 강력한 것은 그의 공지된 기능이 T 세포에 대해 외래 항원을 제시하는 것인 수지상 세포이다. 미성숙 수지상 세포는 피부, 장 및 호흡기를 포함한 신체 전체의 조직 내에 위치한다. 수지상 세포는 두 가지의 기능적으로 및 표현형적으로 상이한 단계, 즉 미성숙 및 성숙 수지상 세포로 존재한다. 미성숙 수지상 세포는 큰 식작용 활성을 가지며, 항원 포획 및 처리에 전문화되어 있고, 생체내 말초 조직에 존재한다. 미성숙 수지상 세포는 말초 관용의 유도 및 유지에 중요한 역할을 한다. 병원체-유도된 생성물 또는 선천적인 전-염증성 시그날에 노출시키면, 수지상 세포는 그들의 식균 활성을 상실하며, 성숙 수지상 세포로 되면서 배액 림프절 (draining lymph nodes)로 이동한다. 성숙 수지상 세포는 항원-제시, 부착 및 공동-자극 분자뿐만 아니라 CD83 및 DC-LAMP와 같은 다른 수지상 세포-특이적 마커의 높은 레벨의 발현에 기인하여 큰 항원-제시 능력 및 T-세포 자극능을 갖는다.
약제학적 조성물에서 사용될 미성숙 수지상 세포는 다양한 공급원으로부터 수득될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 미성숙 수지상 세포는 치료될 환자의 단핵구로부터 분화된다. 그러나, 대신으로 미성숙 수지상 세포는 혈액 수집 기관으로부터 수득할 수 있는 상업적으로 이용가능한 혈액 생성물과 같은 다른 공급원으로부터 수득될 수도 있다.
본 발명에 따르는 약제학적 조성물의 제조를 위해서는 적합한 미성숙 수지상 세포를 제조한다. 수지상 세포 (DCs)는 다양한 방법으로 제조될 수 있으며, 다양한 특성을 나타낼 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 수지상 세포는 백혈구성분채집술에 의해서 분리된 단핵구로부터 수득된다.
DCs는 1% 미만의 말초혈액 내의 단핵 세포를 포함한다. 백혈구성분채집술을 사용하여 대략 106 내지 107 수지상 세포를 분리시킬 수 있으며, 양성 또는 음성 선택기술과 조합될 수 있다. 말초혈액으로부터 수지상 세포의 직접적인 분리는 수지상 세포의 빠른 제조를 가능하게 하지만, 이것은 다수의 면역화가 프로토콜에서 필요한 경우에는 반복된 백혈구성분채집술을 필요로 할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 단핵구는 플라스틱 물질 상에 부착함으로써 백혈구성분채집술로부터 풍부하게 된다. 수지상 세포는 사이토카인, 바람직하게는 다양한 사이토카인의 칵테일의 존재 하에서 분화되며, 따라서 인터류킨 4와 조합된 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자 (GM-CSF)가 바람직하다.
수지상 세포를 제조하는 특히 바람직한 방법은 이들을 생체외에서 생성시키는 것이다. 단핵구는 백혈구성분채집술 , 플라스틱 부착, 밀도 구배 원심분리, CD14+ 세포의 양성 선택, B- 및 T-세포의 음성 선택 및 이들의 조합과 같은 기술에 의해서 말초혈액 단핵 세포로부터 풍부하게 될 수 있는 수지상 세포 전구체이다. DC는 풍부화된 전구체 세포 집단을 약 3-7일, 바람직하게는 7일 동안 사이토카인으로, 특히 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자 (GM-CSF) + 인터류킨 4 또는 인터류킨 13으로 처리함으로써 배양 및 분화될 수 있다. 이 구체예의 이점은 109 이상의 DC가 단일 백혈구성분채집술 생성물로부터 제조될 수 있고, 이러한 제제는 DCs 제제를 바람직하게는 액체 질소 중에서 냉동보존함으로써 다수의 추가의 백신접종을 위해서 사용할 수 있다는 점이다. DCs가 다양한 배지 내에서 배양될 수 있지만, 무-혈청 배지 또는 자가유래 혈청을 함유하는 배지를 사용하는 것이 바람직하다. 약제학적 조성물의 산업적 제조를 위해서는, 미성숙 수지상 세포를 아나필락시 반응의 출현 (예를 들어, 태자 송아지 혈청에 기인함) 또는 바이러스의 오염을 회피하도록 하는 방식으로 대규모로 제조하는 것이 특히 바람직하다.
약제학적 조성물의 제조의 다음 단계에서는 미성숙 수지상 세포를 높은 정수압으로 처리함으로써 수득된 세포사멸성 종양 세포로 부하한다. 바람직한 구체예에서, 세포사멸성 종양 세포와 접촉하도록 유도된 미성숙 수지상 세포는 종양 괴사 인자 α (TNF-α) 또는 리포폴리사카라이드 또는 폴리 I:C의 첨가와 같은 다양한 자극을 사용함으로써 성숙된다.
수득된 약제학적 조성물은 투여를 위해서, 바람직하게는 냉동보존에 의해 보존될 수 있다. 생물검체 (biospecimen)의 냉동보존은 임상 의학 및 생물의학 연구에서 광범하게 실시된다. 그러나, 세포 생존도 및 특히 기능에 대한 이 방법의 영향은 때때로 경시될 수 있다. 따라서, 암 백신에서 사용하기 전에 세포 제제를 동결시키는 사용된 방법은 주의해서 검토되어야 한다. 냉동보존의 효과는 확실히 사용된 특정 세포에 따라 좌우되며, 약제학적 조성물의 생물학적 활성이 냉동보존에 의해서 변화되는지 여부가 검사되어야 한다. 비-면역원성 폴리사카라이드 또는 DMSO와 같은 보호 성분을 첨가하는 것이 필요할 수도 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 정맥내 (IV), 피내, 피하 또는 림프내로 투여될 수 있으며, 피하가 특히 바람직하다.
약제학적 조성물의 면역화의 최적 용량 및 빈도는 종양의 타입, 환자의 연령 및 상태 및 종양 질병의 진행 단계에 따라 좌우된다. 바람직한 구체예에서는, 우선 약제학적 조성물의 면역화 용량을 적용하고, 이어서 2 내지 8주일 범위의 간격으로 적용되는 보강 주사 (booster injection)를 장기간 투여할 수 있다.
본 발명에 기술된 바와 같은 종양 백신접종은 모든 형태의 종양에 성공적으로 적용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 약제학적 조성물은 암의 후기 단계뿐만 아니라 암의 초기 단계에 있는 암 환자의 치료에 사용하기 위한 것이다. 특히 바람직한 구체예에서, 종양 백신접종은 호르몬 치료 저항성 전이성 전립선암이 있는 전립선암의 후기 단계의 환자에게 적용된다. "암의 초기 단계"란 진단이 가능한 형태의 암으로 이해된다. 흔히, 환자들은 질병의 징후를 나타내지 않는다. "암의 후기 단계"에서, 환자는 흔히 통증 또는 허약과 같은 질병의 심각한 결과를 겪는다.
비록 종양 요법 백신접종에서 보조제를 사용하는 것은 본 기술분야에서 공지되어 있지만, 본 발명의 과정에서는 리포폴리사카라이드, 불완전 프로인트 보조제 (incomplete Freund's adjuvant) 또는 열 쇼크 단백질과 같은 어떤 추가의 보조제도 사용하지 않는 것이 바람직하다.
높은 정수압으로 처리된 종양 세포가, 이들이 환자에게 적용된 후에 성장할 수 없고 전이성 종양을 형성할 수 없는 것과 같은 단계에 있는 것은 본 발명의 중요한 관점이다. 이것은 클론원성 시험 (clonogenic assay)을 포함한 다수의 실험적 접근방법에 의해서 입증되었다.
본 발명에 기술된 바와 같은 약제학적 조성물은 암 면역요법 (백신접종)에 의해 인간을 치료하기 위해서 사용될 수 있다. 치료될 환자로부터 유도될 수 있는 종양 세포를 상술한 높은 정수압 처리에 의해 세포사멸 단계로 유도한다. 대신으로, 적합한 종양 세포주가 사용된다. 미성숙 수지상 세포는 바람직하게는 동일한 환자로부터 백혈구성분채집술에 의해서 수득되며, 세포는 사이토카인으로 처리함으로써 생체외 배양된다. 이러한 미성숙 수지상 세포의 적합한 양 (예를 들어, 107-108 세포)을 세포사멸성 종양 세포로 부하시키는데, 이에 의한 미성숙 수지상 세포 : 세포사멸성 종양 세포의 최적 범위는 10:1 내지 1:1, 바람직하게는 5:1 내지 3:1이다.
수지상 세포의 성숙화 후에, 약제학적 조성물은 환자에게 적용될 수 있다. 높은 정수압에 의해서 사멸된 종양 세포를 포획한 수지상 세포는 종양 백신접종을 위해 직접 사용될 수 있다. 그러나, 예를 들어, 환자에게 투여하기 전에 사이토카인으로 처리함으로써 세포를 더 활성화시키거나 성숙시킬 수도 있다.
본 발명에 따르면, 이하의 물질 및 방법이 바람직하게는 사용된다:
난소 및 전립선 암 세포 및 급성 림프구성 백혈병 세포를 약 21℃에서 고정수압 (200 ㎫)으로 10분까지 처리하는 것은 종양 세포의 면역원성 세포사의 유도를 초래하는 것으로 나타났다. HHP (높은 정수압)에 의해서 사멸된 종양 세포는 면역원성 세포사를 유도하는 것으로 공지된 유일한 세포증식억제제인 안트라사이클린에 의해서, 또는 UV-조사에 의해서 사멸된 종양 세포보다 훨씬 더 큰 정도로 면역원성이다. HHP-사멸된 면역원성 종양 세포는 항원 제시 세포에 의해서 열심으로 식균되며, LPS와 같은 추가의 병원체-유도된 자극의 부재 하에서 조차도 그들의 성숙화를 유도한다. HHP 사멸된 종양 세포로 부하된 항원 제시 세포는 강건한 CD4 및 CD8 매개된 종양 특이적 T 세포 반응을 유도하며, 잠재적으로 해로운 조절성 T 세포를 유도하지 않는다. 따라서, HHP 사멸된 종양 세포는 임상적 암 면역요법 접근방법을 위한 강력한 도구를 나타낸다.
새로운 약물의 지속적인 도입 및 화학요법 프로토콜의 추가의 개선에도 불구하고, 어떤 시점에서 화학요법은 그의 한계에 도달하고, 임상적 효능은 상승이 멈출 것 같다. 더구나, 일부의 악성 종양의 치료에 있어서의 명백한 성공에도 불구하고, 일부의 종양, 특히 고형 종양에서 화학요법은 거의 치유력이 없다. 치료 양식의 조합은 암 치료의 표준 전략이 되었으며, 수술과 화학- 또는 방사선-요법의 조합이 전형적인 예이다. 현대적인 면역요법적 전략을 디자인할 뿐만 아니라 면역요법 접근방법을 현행 화학요법 프로토콜에 통합시키기 위한 노력이 이루어져야 한다. 화학요법 및 면역요법은 앞으로는 치료의 길항적 형태로 생각되지 않아야 하며, 이들의 합리적 조합은 암 환자의 예후를 실질적으로 개선시킬 것으로 생각할 수 있다.
바람직한 세포주: 급성 림프구성 백혈병 세포주 (REH, DSMZ, Braunschweig, Germany), 난소암 세포 (OV90, ATCC, Teddington, UK), 전립선암 세포 (LNCap, ATCC, Teddington, UK)가 사용되었다. 모든 세포주는 RPMI 1640 배지 (Gibco)에서 배양하였다. 모든 배지는 10% 열-불활성화된 태자 소 혈청 (Lonza), 100 U/㎖ 페니실린 및 2 mmol/ℓ L-글루타민이 보충되었다.
원발성 종양 세포의 분리: 원발성 난소 및 전립선암 세포는 수술을 받는 환자로부터 수득하였다. 급성 림프구성 백혈병이 있는 환자로부터의 백혈병 아세포는 피콜 구배 상에서의 구배 원심분리에 의해 (모든) 환자의 골수로부터 수득되었다.
세포사멸 유도 및 검출: 종양 세포사는 높은 정수압으로 10분 처리함으로써 유도되었다. 비교 시험을 위해서, 종양 세포사를 UV 광선 노출에 의해서 유도하였다. 이 경우에, 7.6 J/㎠의 에너지가 10분 동안 적용되었다. 세포사는 아넥신 V 플루오레세인 이소티오시아네이트 염색에 의해서 평가하였다. 간략하면, 샘플당 2x105 세포를 수집하고, PBS 중에서 세척하고, 펠릿화하고, 아넥신 V 플루오레세인 이소티오시아네이트 항체를 함유하는 배양 완충액 중에 재현탁시켰다. 샘플을 암소에서 유지시키고, 15분 동안 배양한 후에, 또 다른 400 ㎕의 0.1% 프로피듐 요오다이드 배양 완충액을 첨가하고, 이어서 플로우조 소프트웨어 (FlowJo software)를 사용하여 아리아 형광-활성화 세포 분류기 (Aria fluorescence-activated cell sorter; BD Bioscience) 상에서 분석하였다.
세포 표면 상의 hsp70, hsp90 및 CRT (칼레티큘린)의 유동 세포분석: 총 105 세포를 12-웰 플레이트에 플레이팅하고, 다음날에 지시된 약제로 처리하거나, 대조군으로서 6, 12 또는 24시간 동안 UV-조사하거나 (7.6 J/㎠), 21℃에서 높은 정수압으로 10분 동안 처리하였다. 세포를 수집하고, PBS로 2 회 세척하였다. 세포를 냉 차단 완충액 (PBS 중의 2% 태자 소 혈청)에 희석된 일차 항체와 함께 30분 동안 배양하고, 이어서 세척하고, 차단 완충액 중의 알렉사 (Alexa) 648-컨주게이트된 모노클로날 이차 항체와 함께 배양하였다. 그 후, 각각의 샘플을 FACScan (BD Bioscience)에 의해서 분석하여 세포 표면 hsp70, hsp90 및 CRT를 확인하였다.
HMGB1 방출의 검출: HMGB1 효소-결합된 면역흡착 시험 II 키트를 SHINO-TEST CORPORATION (Tokyo, Japan)으로부터 수득하였다. REH 세포, OV90 세포, LNCap 세포, 원발성 난소 세포 및 백혈병 아세포 (106)를 세포 타입에 적절한 1 ㎖의 완전 배지 내에 플레이팅하였다. 상등액을 다양한 시점에 수거하고, 죽어 가는 종양 세포를 원심분리에 의해서 제거하고, 상등액을 분리시켜 즉시 동결시켰다. 상등액 내의 HMGB1의 정량화는 제조자의 지침에 따라 효소-결합된 면역흡착 시험에 의해 평가하였다.
형광 현미경검사: 면역형광: CRT의 표면 검출을 위해서, 세포를 얼음 위에 놓고, PBS로 2 회 세척하고, PBS 중의 0.25% 파라포름알데히드 중에서 5분 동안 고정시켰다. 그 후, 세포를 PBS 중에서 2 회 세척하고, 냉 차단 완충액 중에서 희석된 일차 항체를 30분 동안 첨가하였다. 냉 PBS 중에서 2 회 세척한 후에, 세포를 적절한 알렉사 648-컨주게이트된 이차 항체와 함께 30분 동안 배양하였다. 세포를 4% 파라포름알데히드로 20 분 동안 고정시키고, PBS 중에서 20분 동안 세척하고, 슬라이드 상에 마운팅하였다.
식균작용을 위해서, DCs를 바이브란트 (Vybrant®) DiO 세포 라벨링 용액 (Invitrogen)으로 염색하였다. 종양 세포를 바이브란트 (Vybrant®) DiI 세포 라벨링 용액으로 염색하고, 안트라사이클린, UV 광선 노출, 또는 21℃에서 고정수압에 의한 처리의 존재 하에서 배양하였다. 미성숙 DCs (5일)에 종양 세포를 1:5의 DC/종양 세포 비로 공급하였다. 세포를 4% 파라포름알데히드로 20분 동안 고정시키고, PBS 중에서 20 분 동안 세척하고, 프로롱 골드 안티페이드 시약 (ProLong Gold antifade reagent; Invitrogen)과 함께 슬라이드 상에 마운팅하였다.
종양-부하된 DCs의 생성 및 종양 세포사의 유도: DCs를 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF) (Gentaur, Brussels, Belgium) 및 인터류킨-4 (IL-4) (Gentaur, Brussels, Belgium)의 존재 하에서 연막 (buffy coats)으로부터 분리된 정제된 CD14+ 세포의 배양에 의해서 생성시켰다. 종양 세포를 21℃에서 높은 정수압으로 10분 처리하거나, 대조군으로서 UV 조사 또는 안트라사이클린에 의해서 사멸시켰다. 세포사멸의 정도는 아넥신 V/PI 염색에 의해서 모니터링하였다. 세포는 DCs에 공급하기 전에 광범위하게 세척하였다. 미성숙 DCs (5일)에 1:5의 DC/종양 세포 비로 종양 세포를 공급하였다. 일부의 실험에서는, 펄싱된 DCs를 12시간 동안 100 ng/㎖의 리포폴리사카라이드 (LPS) (Sigma)로, 또는 25 ㎍/㎖의 폴리 I:C (Invivogen으로부터 수득함)로 자극하였다.
사멸된 종양 세포와의 상호작용 후에 DC 표현형의 FACS 분석: 종양 세포와 배양된 DCs의 표현형은 유동 세포분석에 의해서 모니터링하였다. 종양 세포를 선택된 세포증식억제제 또는 UV 조사 (비교예), 또는 21℃에서 높은 정수압에 의한 10분 처리 (본 발명에 따름)에 의해서 사멸시키고, 미성숙 DCs와 함께 24시간 동안 공동-배양하였다. 일부의 실험을 위해서는, DCs 및 종양 세포를 염료-라벨링한 후에 공동-배양하여 식균작용을 모니터링하였다. 다음의 분자에 대한 모노클로날 항체 (mAbs)가 사용되었다: CD80-FITC, CD83-FITC, CD86-PE, CD14-PE (Immunotech, Marseille, France), CD11c-PE, HLA-DR (BD Biosciences, San Jose, CA).
DCs를 4℃에서 30분 동안 염색하고, 포스페이트-완충 식염수 (PBS) 중에서 2 회 세척하고, 플로우조 소프트웨어를 사용한 FACS 아리아 (BD Biosciences)를 사용하여 분석하였다. DCs를 FSC 및 SSC 특성에 따라 게이팅하였다 (gated). 적절한 이소타입 대조군이 포함되었으며, 50000 개의 생존 DCs가 각각의 실험에서 획득되었다.
IFN-γ 생산 종양-특이적 T 세포의 평가: 배양의 0일 및 7일째에 펄싱되지 않거나 종양 세포-부하된 DCs를 자가유래 T 세포에 1:10의 비로 첨가하였다. IL-2 (25-50 국제 단위/㎖; PeproTech)를 배양의 2일 및 7일째에 첨가하였다. 배양물을 DCs로 마지막 자극한 지 7 내지 9일 후에 종양-특이적 T 세포의 존재에 대해서 시험하였다. 종양-부하된 DCs에 의한 전립선 특이적 항원 (PSA) 반응성 T 세포의 종양-반응성, 인터페론 (IFN)-γ-생산 T 세포의 유도는 유동 세포분석에 의해서 측정하였다. T 세포를 항-인간 CD8/IFN-γ로 염색하였다. 배양물 내의 조절성 T 림프구의 빈도는 CD4/CD25 및 FoxP3으로 염색함으로써 분석하였다. 조절성 T 세포는 유동 세포분석에 의해서 CD4 양성, CD25 양성 및 FoxP3 양성으로 확인되었다.
본 발명 및 실험에 의해서 수득된 결과는 다음의 도면에 의해서 설명된다:
도 1
이 개략도는 본 발명의 약제학적 조성물이 어떻게 수득될 수 있는지를 나타낸다. 환자로부터 또는 세포주로부터 수득된 종양 세포를 고압으로 처리함으로써 세포는 세포사멸성이 된다.
수지상 세포는 백혈구성분채집술 에 의해서 분리된다. 미성숙 수지상 세포 및 세포사멸성 종양 세포를 조합함으로써 백신으로 사용될 수 있는 성숙 수지상 세포가 생산된다.
도 2
높은 정수압은 인간 종양 세포 상에서 열 쇼크 단백질의 발현을 유도한다. 총 5 개의 실험의 요약을 나타낸다. * 조사된 종양 세포와의 비교를 위한 P 값, P <0.05. 상이한 처리에 의해서 야기된 두 가지 종양 세포주 (OV90 및 LNCap) 상에서의 마커 HSP70, HSP90 및 칼레티큘린의 시간 의존적 발현을 나타낸다.
도 3
높은 정수압은 처리된 종양 세포 (OV90 및 LNCap)로부터 HMGB1 (고-이동성 그룹 단백질 B1)의 방출을 유도한다. HMGB1은 염증의 사이토킨 매개물질이다. 총 5 개의 실험의 요약을 나타낸다. * 조사된 종양 세포와의 비교를 위한 P 값, P <0.05. 도 3은 HMBG1의 시간 의존적 방출에 관해서, HHP 처리가 다른 통상적인 처리보다 훨씬 더 효과적임을 나타낸다.
도 4
미성숙 DCs에 의한 높은 정수압 처리된 종양 세포의 식균작용의 동력학. 5 개의 독립적인 실험의 요약 및 대표적인 결과를 나타낸다. 실험에는 OV90 또는 LNCap 종양 세포가 사용되었다. HHP 처리는 0℃ 및 37℃에서의 UV 처리와 비교한다.
도 5
높은 정수압-사멸된 종양 세포 (OV90 및 LNCap)와의 상호작용 후에 마커 OD86 및 HLA-DR을 기초로 한 수지상 세포의 표현형을 나타낸다. 5일째의 미성숙 DCs를 HHP 또는 조사에 의해서 사멸된 종양 세포와 함께 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후에, DCs 상의 성숙화 회합된 분자의 발현을 유동 세포분석에 의해서 분석하였다. LPS가 대조군으로 사용되었다. 평균 형광 강도 (MFI)를 나타낸다. * 조사된 종양 세포-부하된 DCs와의 비교를 위한 P 값, P < 0.05.
도 6
높은 정수압 사멸된 종양 세포 (LNCap 및 OV90)가 부하된 수지상 세포에 의한 종양-특이적 T 세포의 유도를 UV 조사에 의해서 사멸된 종양 세포가 부하된 수지상 세포와 비교한다. 데이터는 5 개의 독립적인 실험의 요약을 나타낸다. * 조사된 종양 세포와 비교하기 위한 P 값, P <0.05.
도 7
도 7은 UV 조사 (UV irr)에 의해서 사멸된 종양 세포와 비교하여 높은 정수압 (HHP)에 의한 종양 세포의 처리의 우월성을 입증한다. 시험은 전립선암 세포주 (LNCap) 및 난소암 세포주 (OV90)를 사용하여 수행하였다. 대조군은 수지상 세포 단독, 및 폴리 I:C로 자극된 세포를 사용하여 수행하였다.
도 7에 요약된 결과는 높은 정수압 사멸된 종양 세포 (각각 LNCap 및 OV90)가 부하된 수지상 세포에 의한 전립선 특이적 항원 (PSA)-특이적 T 세포의 유도를 나타낸다. 비교는 고정수압 사멸된 종양 세포 단독인 경우와 UV 조사에 의해서 사멸된 종양 세포가 부하된 수지상 세포 사이에서 이루어졌다. 도 7에 제시된 데이터는 5 개의 독립적인 실험의 요약을 나타낸다. * 조사된 종양 세포와의 비교를 위한 P 값, P <0.05. 도 7은 실시예 7에서 수득된 결과를 요약한 것이다.
도 8
높은 정수압 사멸된 종양 세포에 의한 조절성 T 세포의 유도를 UV 조사된 종양 세포에 의한 Tregs의 유도와 비교한다. 데이터는 5 개의 독립적인 실험의 요약을 나타낸다.
도 8에 요약된 실험은 본 발명의 가르침이 다양한 타입의 종양에 적용될 수 있음을 나타낸다. 도 8의 상부 부분은 난소암 세포 (OV90)를 사용하여 수행된 실험을 나타낸다. 하부 부분은 전립선암 세포주 (LNCap)를 사용하여 수행된 실험을 나타낸다. 실험에서, Fox P3 (Forkhead Box P3)의 농도는 조절성 T 세포 (Tregs)를 더 분화시키기 위해서 결정되었다. 실험은 본 발명에 따라 HHP로 처리된 종양 세포가 UV 조사된 종양 세포보다 더 적은 수의 조절성 T 세포를 유도하는 것을 나타낸다.
도 9
환자를 본 발명에 기술된 바와 같은 종양 백신접종으로 처리한 생체내 시험의 결과를 나타낸다. 모든 환자는 근치적 전립선절제술 또는 방사선요법을 받았다. 적절한 파라메터로서 PSA 배가시간 (doubling time)을 측정하였다. 문헌 [Antonarakis et al., BJU Int. 2011, 108(3), p. 378-385]에 따르면, PSA 배가시간은 전립선 특이적 항원 (PSA)-재발성 전립선암이 있는 환자의 전이-부재 생존시간 및 전반적인 생존시간의 가장 강력한 결정인자이다. PSA 배가시간은 PSA 값이 두 배가 되는 시간 차이 (time difference)를 의미한다. PSA 배가시간이 크면 클수록 처리된 환자에 대한 생존 전망은 더 우수한 것이다. 본 발명의 종양 백신접종을 적용함으로써 PSA 배가시간은 실질적으로 연장될 수 있었다.
* 조사된 종양 세포와의 비교를 위한 P 값, P <0.05.
도 10
도 10은 본 발명에 따라 처리된 전립선암의 후기 단계에 있는 환자의 카플란-마이어 생존 곡선 (Kaplan-Meier survival curve)이다.
카플란-마이어 생존 곡선에서, 환자의 각각의 사망은 100%로부터 시작하는 생존율 %의 더 낮은 값으로의 하락을 야기한다. 할라비 노모그램 (Halabi nomogram)은 정상적으로 예상되는 생존자의 감소이며, 이에 의해서 중간 생존 시간은 12개월이다.
본 발명에 기술된 바와 같은 암 백신을 사용한 활성 암 면역요법은 중간 생존 시간을 23개월로 연장시킨다.
도 1
이 개략도는 본 발명의 약제학적 조성물이 어떻게 수득될 수 있는지를 나타낸다. 환자로부터 또는 세포주로부터 수득된 종양 세포를 고압으로 처리함으로써 세포는 세포사멸성이 된다.
수지상 세포는 백혈구성분채집술 에 의해서 분리된다. 미성숙 수지상 세포 및 세포사멸성 종양 세포를 조합함으로써 백신으로 사용될 수 있는 성숙 수지상 세포가 생산된다.
도 2
높은 정수압은 인간 종양 세포 상에서 열 쇼크 단백질의 발현을 유도한다. 총 5 개의 실험의 요약을 나타낸다. * 조사된 종양 세포와의 비교를 위한 P 값, P <0.05. 상이한 처리에 의해서 야기된 두 가지 종양 세포주 (OV90 및 LNCap) 상에서의 마커 HSP70, HSP90 및 칼레티큘린의 시간 의존적 발현을 나타낸다.
도 3
높은 정수압은 처리된 종양 세포 (OV90 및 LNCap)로부터 HMGB1 (고-이동성 그룹 단백질 B1)의 방출을 유도한다. HMGB1은 염증의 사이토킨 매개물질이다. 총 5 개의 실험의 요약을 나타낸다. * 조사된 종양 세포와의 비교를 위한 P 값, P <0.05. 도 3은 HMBG1의 시간 의존적 방출에 관해서, HHP 처리가 다른 통상적인 처리보다 훨씬 더 효과적임을 나타낸다.
도 4
미성숙 DCs에 의한 높은 정수압 처리된 종양 세포의 식균작용의 동력학. 5 개의 독립적인 실험의 요약 및 대표적인 결과를 나타낸다. 실험에는 OV90 또는 LNCap 종양 세포가 사용되었다. HHP 처리는 0℃ 및 37℃에서의 UV 처리와 비교한다.
도 5
높은 정수압-사멸된 종양 세포 (OV90 및 LNCap)와의 상호작용 후에 마커 OD86 및 HLA-DR을 기초로 한 수지상 세포의 표현형을 나타낸다. 5일째의 미성숙 DCs를 HHP 또는 조사에 의해서 사멸된 종양 세포와 함께 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후에, DCs 상의 성숙화 회합된 분자의 발현을 유동 세포분석에 의해서 분석하였다. LPS가 대조군으로 사용되었다. 평균 형광 강도 (MFI)를 나타낸다. * 조사된 종양 세포-부하된 DCs와의 비교를 위한 P 값, P < 0.05.
도 6
높은 정수압 사멸된 종양 세포 (LNCap 및 OV90)가 부하된 수지상 세포에 의한 종양-특이적 T 세포의 유도를 UV 조사에 의해서 사멸된 종양 세포가 부하된 수지상 세포와 비교한다. 데이터는 5 개의 독립적인 실험의 요약을 나타낸다. * 조사된 종양 세포와 비교하기 위한 P 값, P <0.05.
도 7
도 7은 UV 조사 (UV irr)에 의해서 사멸된 종양 세포와 비교하여 높은 정수압 (HHP)에 의한 종양 세포의 처리의 우월성을 입증한다. 시험은 전립선암 세포주 (LNCap) 및 난소암 세포주 (OV90)를 사용하여 수행하였다. 대조군은 수지상 세포 단독, 및 폴리 I:C로 자극된 세포를 사용하여 수행하였다.
도 7에 요약된 결과는 높은 정수압 사멸된 종양 세포 (각각 LNCap 및 OV90)가 부하된 수지상 세포에 의한 전립선 특이적 항원 (PSA)-특이적 T 세포의 유도를 나타낸다. 비교는 고정수압 사멸된 종양 세포 단독인 경우와 UV 조사에 의해서 사멸된 종양 세포가 부하된 수지상 세포 사이에서 이루어졌다. 도 7에 제시된 데이터는 5 개의 독립적인 실험의 요약을 나타낸다. * 조사된 종양 세포와의 비교를 위한 P 값, P <0.05. 도 7은 실시예 7에서 수득된 결과를 요약한 것이다.
도 8
높은 정수압 사멸된 종양 세포에 의한 조절성 T 세포의 유도를 UV 조사된 종양 세포에 의한 Tregs의 유도와 비교한다. 데이터는 5 개의 독립적인 실험의 요약을 나타낸다.
도 8에 요약된 실험은 본 발명의 가르침이 다양한 타입의 종양에 적용될 수 있음을 나타낸다. 도 8의 상부 부분은 난소암 세포 (OV90)를 사용하여 수행된 실험을 나타낸다. 하부 부분은 전립선암 세포주 (LNCap)를 사용하여 수행된 실험을 나타낸다. 실험에서, Fox P3 (Forkhead Box P3)의 농도는 조절성 T 세포 (Tregs)를 더 분화시키기 위해서 결정되었다. 실험은 본 발명에 따라 HHP로 처리된 종양 세포가 UV 조사된 종양 세포보다 더 적은 수의 조절성 T 세포를 유도하는 것을 나타낸다.
도 9
환자를 본 발명에 기술된 바와 같은 종양 백신접종으로 처리한 생체내 시험의 결과를 나타낸다. 모든 환자는 근치적 전립선절제술 또는 방사선요법을 받았다. 적절한 파라메터로서 PSA 배가시간 (doubling time)을 측정하였다. 문헌 [Antonarakis et al., BJU Int. 2011, 108(3), p. 378-385]에 따르면, PSA 배가시간은 전립선 특이적 항원 (PSA)-재발성 전립선암이 있는 환자의 전이-부재 생존시간 및 전반적인 생존시간의 가장 강력한 결정인자이다. PSA 배가시간은 PSA 값이 두 배가 되는 시간 차이 (time difference)를 의미한다. PSA 배가시간이 크면 클수록 처리된 환자에 대한 생존 전망은 더 우수한 것이다. 본 발명의 종양 백신접종을 적용함으로써 PSA 배가시간은 실질적으로 연장될 수 있었다.
* 조사된 종양 세포와의 비교를 위한 P 값, P <0.05.
도 10
도 10은 본 발명에 따라 처리된 전립선암의 후기 단계에 있는 환자의 카플란-마이어 생존 곡선 (Kaplan-Meier survival curve)이다.
카플란-마이어 생존 곡선에서, 환자의 각각의 사망은 100%로부터 시작하는 생존율 %의 더 낮은 값으로의 하락을 야기한다. 할라비 노모그램 (Halabi nomogram)은 정상적으로 예상되는 생존자의 감소이며, 이에 의해서 중간 생존 시간은 12개월이다.
본 발명에 기술된 바와 같은 암 백신을 사용한 활성 암 면역요법은 중간 생존 시간을 23개월로 연장시킨다.
본 발명은 비제한적인 이하의 실시예에 의해서 더 설명된다:
실시예 1
높은 정수압으로 처리한 후에 인간 암 세포주 및 인간 원발성 종양 세포에 의한 면역원성
세포사
마커
hsp70
,
hsp90
및
칼레티큘린의
발현
백혈병, 난소암 및 전립선암 세포주 및 원발성 종양 세포를 21℃에서 높은 정수압 (HHP, 200 ㎫)으로 10분 동안 처리하고, 공지의 면역원성 세포사 마커 hsp70, hsp90 및 칼레티큘린의 발현을 6, 12 및 24시간째에 모니터링하였다. 칼레티큘린, hsp70 및 hsp90의 상당한 발현이 시험한 모든 종양 모델에 대해 HHP 처리한 지 6, 12 및 24 시간 후에 검출되었다. 면역원성 분자의 발현은 면역원성 세포사의 유일하게 공지된 유도제인 안트라사이클린에 의해서 유도된 발현보다 상당히 더 높았다 (도 2). HHP 처리 후의 칼레티큘린 및 열 쇼크 단백질의 증가된 발현은 세포 표면으로의 그들의 전위를 동반하였다. HHP 처리는 또한, 면역원성 세포사의 가용성 마커인 HMGB1의 빠르고 실질적인 방출을 유도하였다. HMGB1의 방출은 UV 조사 또는 안트라사이클린의 경우에 비해서 훨씬 더 컸다 (도 3).
HMGB1 핵 단백질의 최대 방출은 종양 세포사를 유도한 지 48시간 후에 검출되었다.
실시예 2
높은 정수압에 의한 종양 세포의 처리는 항원 제시 세포에 의한 그들의
식균작용을
증가시킨다.
'eat me' 시그날로서의 칼레티큘린의 정립된 역할에 비추어서, 면역반응의 개시에 매우 중요한 가장 효율적인 항원 제시 세포인 수지상 세포 (DCs)에 의한 높은 정수압으로 사멸된 종양 세포의 식균작용의 비율을 조사하였다. 높은 정수압 처리된 종양 세포는 안트라사이클린 또는 UV 조사와 같은 다른 양식에 의해서 사멸된 종양 세포보다 더 빠른 속도 및 더 큰 정도로 식균작용을 하였다. 12 시간 후에, HHP로 처리된 백혈병 세포의 식균작용의 정도는 UV 조사에 의해서 사멸된 세포의 경우보다 4-배 더 컸다 (도 4a 및 4b).
실시예 3
높은 정수압-처리된 종양 세포의
식균작용은
DCs
의
성숙화를
유도한다.
면역반응을 활성화시키는 DCs의 능력은 그들의 활성화 상태 및 공동-자극성 분자의 발현에 따라 좌우된다. 정상적인 환경에서, DCs의 가장 효율적인 성숙화는 그람 음성 박테리아로부터 유래하는 리포폴리사카라이드 (LPS)와 같은 병원체로부터 유도된 분자에 의해서 유도된다. 단지 높은 레벨의 공동-자극성 분자를 발현하는 활성화된 (성숙) DCs만이 면역반응을 개시시킬 수 있다. 본 발명자들은 HHP에 의해서 사멸된 종양 세포를 식균한 DCs의 표현형을 분석하였다. DCs와 HHP-처리된 종양 세포의 상호작용은 LPS에 의한 활성화와 유사한 정도까지 공동-자극성 분자 (CD86, CD83) 및 성숙화 연관된 분자 (HLA-DR)의 상향조절을 유도하였다 (도 5). 따라서, HHP에 의해서 사멸된 종양 세포는 병원체 유도된 LPS와 동등한 DCs 성숙화를 유도할 수 있다.
실시예 4
높은 정수압 처리된 종양 세포를 제시하는
DCs
는 종양-특이적 T 세포를 유도하며, 적은 수의 억제
조절성
T 세포를 유도한다.
HHP로 처리되고, 면역원성 세포사 마커를 발현하는 종양 세포가 항-종양 면역성을 유도하는지 여부를 조사하기 위해서, 본 발명자들은 종양 세포-특이적 T 세포 반응을 활성화시키는 종양 세포-부하된 DCs의 능력을 평가하였다. HHP에 의해서 사멸된 종양 세포를 LPS에 의한 후속 성숙화가 있거나 없이 미성숙 DCs와 함께 공동-배양하였다. 그 후, 이들 DCs를 자가유래 T 세포의 자극인자로 사용하였으며, IFN-γ-생산 T 세포의 빈도를 종양 세포-부하된 DCs에 의한 재자극의 1 주일 후에 분석하였다. HHP 사멸된 종양 세포로 펄싱된 DCs는 추가의 성숙화 자극 (LPS)의 부재 하에서도 조사된 세포로 펄싱된 DCs와 비교하여 더 큰 수의 종양-특이적 IFN-γ-생산 T 세포를 유도하였다.
추가로, DC 및 T 세포 공동-배양에서 유도된 조절성 T 세포 (Tregs)의 빈도를 또한 시험하였다. Tregs는 종양에 대해서 지시된 면역반응을 억제하기 때문에, Tregs의 유도는 종양 면역요법의 경우에 바람직하지 않다. HHP에 의해서 사멸된 종양 세포로 펄싱된 DCs는 미성숙 DCs 및 LPS-활성화된 DCs 둘 다와 비교할 때 조절성 T 세포를 팽창시키는 더 작은 능력을 가졌다 (도 8). FoxP3 표면 마커는 조절성 T 세포에 대해서 특이적이다.
실시예 5
활성 세포 면역요법은 수술 또는 방사선요법에 의한 종양의 일차 치료 후에 최소 잔류 질병이 있는 경우에 단일 치료 양식으로 투여될 수 있다. 전립선암에서, 이것은 생화학적 재발의 징후 (초민감 방법에 의해서 측정된 말초혈액 내의 전립선-특이적-항원 PSA의 증가하는 레벨)를 갖는 환자가 고려될 수 있다.
본 발명의 최상의 결과는 원발성 종양이 수술에 의해서 환자로부터 제거된 경우에 수득될 수 있다. 본 발명에 기술된 바와 같은 약제학적 조성물은 종양 조직으로부터, 또는 종양 세포주로부터 분리된 종양 세포로부터 생산될 수 있다.
전립선암을 앓고 있는 환자 (68세)를 종양 발생의 초기 단계로 진단하였다. 종양을 제거하였지만, 수술한 지 몇 개월 후에 PSA의 상승하는 레벨이 검출되었다. 따라서 환자는 백혈구성분채집술을 시행하였으며, 미성숙 수지상 세포를 분리된 단핵구로부터 구분하였다. 전립선암 세포주로부터의 종양 세포를 본 발명에 기술된 바와 같이 높은 정수압으로 처리하여 세포사멸성이 되도록 하였으며, 백신 조성물을 제조하기 위해서 세포사멸성 종양 세포를 미성숙 수지상 세포와 접촉하도록 유도하였다.
약제학적 조성물을 분취액으로 분할하고, 이것은 사용할 때까지 액체 질소 중에서 동결시켰다. 종양 백신접종의 첫 번째 적용은 전립선암의 생화학적 재발을 검출한 지 4주일 후에 일어났다. 보강 적용은 1년의 기간 동안 매 4주일마다 수행하였다.
백신접종은 적은 수의 생존 종양 세포에 대한 면역반응을 유도하였으며, 이것은 종양 세포의 재성장의 실질적인 저하를 초래하고, 환자의 생존의 연장을 야기하였다.
실시예 6
진행된 암 환자에게서, 활성 세포 면역요법은 화학-면역요법의 개념에 따라서 화학요법 (즉, 전립선암에서는 도세탁셀)과 조합되어야 한다.
진행된 전립선암을 앓고 있는 환자 (76세)를 본 발명에 따라 치료하였다. 통상적인 화학요법을 본 발명에 기술된 바와 같은 활성 세포 면역요법과 조합하였다. 환자는 전립선 종양을 갖는 65세에서 치료하였다. 수술 및 호르몬 치료에 의해서 종양을 제거한 후에, PSA (전립선 특이적 항원)의 레벨은 전립선암 세포가 성장하지 않음을 나타내는 낮은 레벨에서 유지되었다. 호르몬 요법의 12개월 후에, 전이성 전립선암이 신체 내의 여려 위치에서 (특히 뼈에서) 발생하였으며, 종양은 호르몬 불응성이 되었다. 환자는 수지상 세포를 기본으로 하는 활성 세포 면역요법과 함께 도세탁셀에 의한 호르몬 불응성 전립선암의 치료에 대해서 승인되었다.
화학요법을 시작하기 전에, 미성숙 수지상 세포를 백혈구성분채집술 중에 수득된 단핵구로부터 생성시켰다. 전립선암 세포주로부터의 종양 세포를 21℃에서 30 분 동안 210 ㎫의 정수압으로 처리하였다. 본 발명에 따라 처리된 109 종양 세포를 사용하여 109 미성숙 수지상 세포를 펄싱하였으며, 이들 종양 세포로 펄싱하기 전의 성숙 수지상 세포의 분취액을 액체 질소 중에서 급속-냉동 (deep-frozen)하고, 추후의 적용에 사용하였다.
활성 암 면역요법은 1년의 기간 동안, 도세탁셀에 의한 표준 화학요법과의 교대 사이클 (alternate cycles)로, 및 단독으로 (도세탁셀 치료가 끝난 후) 매 4-6주일 마다 투여하였다. 조합된 화학면역요법은 질병의 안정화, 골수 전이의 강도의 감소 및 예상보다 더 긴 생존을 초래하였다. 환자는 현재, 치료의 시작 시에 6개월의 예상 생존과 비교하여 3년 이상 동안 생존하고 있다.
실시예 7
UV 사멸된 종양 세포에 대비한 HHP 사멸된 종양 세포의 우월성을 나타내는 시험관내 실험
시험관내 실험에서, 미성숙 수지상 세포, 폴리 I:C 활성화된 성숙 수지상 세포, 및 HHP 처리되거나 UV 조사된 종양 세포가 부하된 수지상 세포의 능력을 종양 특이적 면역성을 유도하는 그들의 능력에 관해서 체크하였다. 종양 특이적 면역성은 종양 특이적 T 세포 림프구 퍼센트로서 측정하였다.
HHP 사멸된 종양 세포와 수지상 세포를 HHP 사멸된 종양 세포 단독, 및 UV 조사에 의해서 사멸된 종양 세포가 부하된 수지상 세포와 직접적으로 비교하였다. 실험의 결과는 도 7에 나타내었다.
종양 세포로 펄싱되지 않거나 부하된 종양-특이적 T 세포를 유도하는 능력을 시험하기 위해서, 수지상 세포를 배양의 0 및 7일에 1:10의 비로 자가유래 T 세포에 첨가하였다. 25-50 국제 단위/㎖의 IL2 (PeproTech)를 배양액에 2 및 7일에 첨가하였다. 배양액을 DCs로 최종 자극한 지 7-9일 후에 종양 특이적 T 세포의 존재에 대해서 시험하였다. 종양-부하된 DCs에 의한 전립선 특이적 항원 (PSA) 반응성 T 세포의 종양-반응성, 인터페론 (IFN)-γ-생산 T 세포의 유도는 유동 세포분석에 의해서 결정하였다. T 세포를 항-인간 CD8/IFN-γ로 염색하였다.
높은 정수압 사멸된 종양 세포 (LNCap)로 부하된 수지상 세포에 의한 전립선 특이적 항원 (PSA)-특이적 T 세포의 유도를 높은 정수압 사멸된 종양 세포 단독인 경우, 및 UV 조사에 의해서 사멸된 종양 세포가 부하된 수지상 세포와 비교한다.
실험의 결과는 도 7에 나타낸다. 도 7의 상부 부분은 HHP 사멸된 종양 세포가 부하된 DCs가 성숙화 시그날의 부재 하에서 조차도 종양 특이적 T 세포를 유도할 수 있음을 나타낸다. UV 처리에 의해서 사멸된 종양 세포가 부하된 DCs 또는 HHP 사멸된 종양 세포 단독은 종양 면역성을 유도하지 않는다. 단지 HHP 처리된 종양 세포 (본 발명에 따름) 및 미성숙 수지상 세포만이 종양 특이적 면역반응을 유도할 수 있는 반면에, 이 결과는 UV 처리된 종양 세포와 미성숙 수지상 세포에 의해서는 수득될 수 없다는 것은 놀라운 일이다. 이론적으로 구속되는 것을 원하지는 않지만, HHP 처리된 종양 세포만이 미성숙 수지상 세포와 함께 종양 특이적 T 세포 면역반응을 유도할 수 있는 것으로 보인다. HHP 처리된 종양 세포는 미성숙 수지상 세포의 활성화제의 일종으로 작용하는 것으로 보이는 반면에, UV 처리된 종양 세포는 이러한 효과를 갖지 않는다.
도 7의 하부 부분은 폴리 I:C 처리를 적용하면, 처리된 HHP 종양 세포는 UV로 조사된 종양 세포보다 특이적 T 세포 림프구를 더 잘 유도할 수 있음을 나타낸다.
실시예 8
본 발명에 따르는 종양 백신접종에 의해서 수득된 생체내 데이터
수지상 세포를 상술한 것과 유사한 환자의 코호트 (cohort)로부터 수득하였다. 수지상 세포를 상술한 바와 같이 사멸된 종양 세포로 펄싱하고, 종양 백신접종은 근치적 전립선절제술 또는 방사선요법 후에 전립선암의 생화학적 재발이 있는 환자에게 4-6주일 간격으로 12 용량까지 반복해서 투여하였다. 각각의 단일 환자에게서 질병의 진행은 PSA 배가시간에 의해서 평가되었다. PSA 배가시간이란 PSA 값이 2 배가 되는데 필요한 시간으로 이해된다. PSA 배가시간은 전립선암이 있는 남자에게서 전반적인 생존 및 무-전이 생존의 가장 강력하고 가장 신뢰할 수 있는 결정인자로 제시되었다. 짧은 PSA 배가시간은 단축된 생존, 및 전이 출현의 단축된 시간과 상관관계가 있다 [Antonarakis et al., BJU Int., 2012, 108(3); pp 378-385].
도 9에 나타낸 바와 같이, 근치적 전립선절제술 또는 방사선요법 후에 전립선암의 생화학적 재발이 있는 환자에게서 본 발명에 따르는 종양 백신접종의 연속 투여는 PSA 배가시간의 상당한 연장을 초래한다. 본 발명에 기술된 바와 같은 종양 백신접종을 사용함으로써, 평균 PSA 배가시간은 암 면역요법의 개시 전에 5 개월로부터 면역요법의 12개월 후에 30개월까지 증가하는 것으로 확인되었다. 이것은 전립선암의 생화학적 재발이 있는 환자에 대한 상당한 이득을 나타낸다.
실시예 9
전립선암의 후기 단계에 있는 환자에 대한 임상 실험
본 임상 실험에서는, 수지상 세포를 본 발명에 기술된 바와 같이 사멸된 종양 세포로 펄싱하였다. 종양 백신접종은 전립선암의 후기 단계에 있는 환자에게 반복적으로 투여하였다. 상기의 환자는 거세 저항성 전이성 전립선암을 앓고 있었다. 이들 환자에게서, 암 면역요법은 도세탁셀 화학요법과 교대 투약 스케줄로 투여하였다.
치료된 코호트의 생존을 역사적 코호트 (historical cohort)와, 또는 할라비 노모그램에 의해서 추정된 생존과 비교하였다. 활성 암 면역요법의 연속 투여는 할라비 노모그램에 의해서 계산된 예상 생존 (13개월)에 기초한 역사적 대조군의 코호트와 비교하여 치료된 환자의 생존 시간 (23개월의 중간 생존)을 상당히 연장시키는 것으로 나타났다.
본 실험은, 본 발명의 종양 백신접종이 전립선암의 후기 단계에 있는 환자의 생존 시간을 실질적으로 연장시키는 것을 입증한다. 이러한 환자의 평균 생존 예상은, 본 발명에 따르는 종양 백신접종으로 치료한 후에 23개월인 것과 비교하여, 치료가 없이 13개월이다. 이것은 성공적으로 치료하기가 매우 어려운 이러한 환자에 대한 상당한 개선을 나타낸다.
Claims (17)
10분 내지 2시간 동안 100 ㎫ 이상의 높은 정수압으로의 처리에 의해 야기된 세포사멸성(apoptotic)인 종양 세포가 세포외 부하된 수지상 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는, 종양 세포에 대한 면역반응을 유도하기 위한 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 세포사멸성 종양 세포가 UV 조사 또는 안트라사이클린에 의해 세포사멸이 유도된 종양 세포에 비해 세포 표면에서 면역원성 세포사 마커 HSP70, HSP90, 칼레티큘린, 또는 이들의 조합의 증가된 레벨을 발현하는 것인, 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 종양 세포가 10분 내지 2시간 동안 200 ㎫ 이상의 압력에서 정수압으로 처리되었던 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 종양 세포가 200-300 ㎫의 압력에서 정수압으로 처리되었던 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 세포사멸성 종양 세포가 괴사성은 아닌 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 종양 세포가 종양 세포주로부터 유래하였던 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 종양 세포가 자가유래인 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 세포사멸성 종양 세포가 부하될 때 수지상 세포가 미성숙 수지상 세포였던 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 수지상 세포가 성숙된 수지상 세포인 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
제8항에 있어서, 미성숙 수지상 세포가 백혈구성분채집술(leukapheresis)에 의해서 수득되었던 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
제10항에 있어서, 미성숙 수지상 세포가 백혈구성분채집술 및 사이토카인의 존재 하에서의 시험관내 배양에 의해서 수득되었던 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 초기뿐만 아니라 후기 단계의 암을 앓고 있는 환자에 사용하기 위한, 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 전립선암 또는 난소암을 앓고 있는 환자에 사용하기 위한, 약제학적 조성물.
제12항에 있어서, 암의 후기 단계가 호르몬 치료 저항성 전이성 전립선암을 갖는 전립선암인 환자에 사용하기 위한, 약제학적 조성물.
미성숙 수지상 세포가 100 ㎫ 이상의 정수압으로 처리한 세포사멸성 종양 세포로 부하되고, 이어서 수지상 세포를 성숙화시키는 것을 특징으로 하는, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따르는 약제학적 조성물의 제조 방법.
환자로부터 분리된 미성숙 수지상 세포 및 환자로부터 분리된 종양 세포를 포함하는 암 백신 조성물로서, 상기 종양 세포가 10분 내지 2시간 동안 100 ㎫ 이상의 높은 정수압으로의 처리에 의해 세포사멸 단계로 전환되고 미성숙 수지상 세포 상에 부하되며, 상기 미성숙 수지상 세포가 환자에의 적용 전에 성숙화되는 것인, 암 백신 조성물.
환자로부터 분리된 미성숙 수지상 세포 및 10분 내지 2시간 동안 100 ㎫ 이상의 높은 정수압으로의 처리에 의해 세포사멸 단계로 전환된 종양 세포주부터 분리된 종양 세포를 포함하는 암 백신 조성물로서, 상기 종양 세포가 미성숙 수지상 세포 상에 부하되고, 상기 미성숙 수지상 세포가 환자에의 적용 전에 선택적으로 성숙화되는 것인, 암 백신 조성물.
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201161504387P | 2011-07-05 | 2011-07-05 | |
| EP11172622A EP2543386A1 (en) | 2011-07-05 | 2011-07-05 | Means and methods for active cellular immunotherapy of cancer by using tumor cells killed by high hydrostatic pressure |
| US61/504,387 | 2011-07-05 | ||
| EP11172622.0 | 2011-07-05 | ||
| PCT/EP2012/062950 WO2013004708A1 (en) | 2011-07-05 | 2012-07-04 | Means and methods for active cellular immunotherapy of cancer by using tumor cells killed by high hydrostatic pressure and dendritic cells |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20140040734A KR20140040734A (ko) | 2014-04-03 |
| KR102035873B1 true KR102035873B1 (ko) | 2019-10-23 |
Family
ID=44359435
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020137032259A KR102035873B1 (ko) | 2011-07-05 | 2012-07-04 | 높은 정수압에 의해서 사멸된 종양 세포 및 수지상 세포를 사용하는 암의 활성 세포 면역요법의 수단 및 방법 |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20140086957A1 (ko) |
| EP (2) | EP2543386A1 (ko) |
| JP (1) | JP5986196B2 (ko) |
| KR (1) | KR102035873B1 (ko) |
| CN (3) | CN109125347A (ko) |
| AU (2) | AU2012280322B2 (ko) |
| BR (2) | BR112013031084B1 (ko) |
| CA (1) | CA2833946A1 (ko) |
| DK (1) | DK2691110T3 (ko) |
| EA (1) | EA030061B1 (ko) |
| ES (1) | ES2525759T3 (ko) |
| PL (1) | PL2691110T3 (ko) |
| PT (1) | PT2691110E (ko) |
| RS (1) | RS53713B1 (ko) |
| RU (1) | RU2012127685A (ko) |
| SG (1) | SG194201A1 (ko) |
| SI (1) | SI2691110T1 (ko) |
| SM (1) | SMT201400188B (ko) |
| UA (1) | UA111738C2 (ko) |
| WO (1) | WO2013004708A1 (ko) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20130011438A1 (en) | 2011-07-05 | 2013-01-10 | SOTIO a.s. | Means And Methods For Active Cellular Immunotherapy Of Cancer By Using Tumor Cells Killed By High Hydrostatic Pressure and Dendritic Cells |
| US9562219B2 (en) | 2013-12-27 | 2017-02-07 | SOTIO a.s. | Cryopreservation of apoptotic cancer cells for use in immunotherapy against cancer |
| CN104258384B (zh) * | 2014-09-29 | 2017-05-03 | 北京时合生物科技有限公司 | 一种基于树突状细胞的特异性肿瘤疫苗的制备方法 |
| MX2018000052A (es) * | 2015-07-02 | 2018-05-11 | Primevax Immuno Oncology Inc | Composiciones y métodos para la terapia combinada con virus del dengue y celulas dendríticas. |
| CN106244543A (zh) * | 2016-07-29 | 2016-12-21 | 北京时合生物科技有限公司 | 一种pbmc体外诱导分化成为树突状细胞的方法 |
| IL268744B2 (en) * | 2017-02-17 | 2024-08-01 | Aivita Biomedical Inc | Methods for increasing the immunogenicity of tumors and preparations for autologous immunotherapeutic products against cancer using tumor cells and adapted dendritic cells |
| CN109810946B (zh) * | 2017-11-21 | 2023-11-21 | 中国科学院上海药物研究所 | 天花粉蛋白用于致敏和/激活树突状细胞中的应用 |
| KR20200116113A (ko) | 2018-01-25 | 2020-10-08 | 소티오 에이.에스. | 화학요법과 병행하는 수지상 세포 백신접종 |
| KR20200116112A (ko) | 2018-01-25 | 2020-10-08 | 소티오 에이.에스. | 화학요법에 순차적인 수지상 세포 백신접종 |
| WO2020187975A1 (en) | 2019-03-19 | 2020-09-24 | SOTIO a.s. | Patient selection for treatment with dendritic cell vaccination |
| JP7340240B2 (ja) * | 2019-08-26 | 2023-09-07 | 学校法人関西医科大学 | 細胞又は組織にアポトーシスを誘導する方法 |
| WO2022171792A1 (en) | 2021-02-12 | 2022-08-18 | Sctbio A.S. | Patient selection for treatment with dendritic cell vaccination |
| JP2024528917A (ja) | 2021-08-13 | 2024-08-01 | サイチューン ファーマ | 癌を治療するための抗体－薬物コンジュゲートとのＩＬ－２／ＩＬ－１５Ｒβγアゴニストの組み合わせ |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006095330A2 (en) | 2005-03-10 | 2006-09-14 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Methods and immunogenic cell preparations for treating antigen-associated diseases |
| KR100647847B1 (ko) | 2005-05-27 | 2006-11-23 | 크레아젠 주식회사 | 인간 전립선암 동물모델 및 이를 이용한 수지상세포-유래전립선암 면역치료제의 예방 및 치료 효능을 분석하는 방법 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2321093A1 (en) * | 1998-02-20 | 1999-08-26 | The Rockefeller University | Apoptotic cell-mediated antigen presentation to dendritic cells |
| US20060216269A1 (en) * | 2004-09-17 | 2006-09-28 | Kenichiro Hasumi | Dendritic cell tumor injection (DCTI) therapy |
| JP5623004B2 (ja) | 2004-10-25 | 2014-11-12 | ベイラー リサーチ インスティテュートＢａｙｌｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ | 熱ショックをかけたメラノーマ細胞体が装填された樹状細胞 |
-
2011
- 2011-07-05 EP EP11172622A patent/EP2543386A1/en not_active Withdrawn
-
2012
- 2012-04-07 UA UAA201312611A patent/UA111738C2/uk unknown
- 2012-07-03 RU RU2012127685/15A patent/RU2012127685A/ru unknown
- 2012-07-04 DK DK12734884.5T patent/DK2691110T3/en active
- 2012-07-04 RS RS20140685A patent/RS53713B1/en unknown
- 2012-07-04 WO PCT/EP2012/062950 patent/WO2013004708A1/en active Application Filing
- 2012-07-04 BR BR112013031084-7A patent/BR112013031084B1/pt active IP Right Grant
- 2012-07-04 CN CN201810985605.9A patent/CN109125347A/zh active Pending
- 2012-07-04 PL PL12734884T patent/PL2691110T3/pl unknown
- 2012-07-04 CN CN201280032974.7A patent/CN103648524B/zh active Active
- 2012-07-04 PT PT127348845T patent/PT2691110E/pt unknown
- 2012-07-04 AU AU2012280322A patent/AU2012280322B2/en active Active
- 2012-07-04 BR BR122019026627-1A patent/BR122019026627B1/pt active IP Right Grant
- 2012-07-04 SI SI201230120T patent/SI2691110T1/sl unknown
- 2012-07-04 SG SG2013077128A patent/SG194201A1/en unknown
- 2012-07-04 KR KR1020137032259A patent/KR102035873B1/ko active IP Right Grant
- 2012-07-04 US US14/113,337 patent/US20140086957A1/en not_active Abandoned
- 2012-07-04 EA EA201301089A patent/EA030061B1/ru unknown
- 2012-07-04 CN CN2012102924999A patent/CN102861103A/zh active Pending
- 2012-07-04 CA CA2833946A patent/CA2833946A1/en active Pending
- 2012-07-04 EP EP12734884.5A patent/EP2691110B1/en active Active
- 2012-07-04 JP JP2014517778A patent/JP5986196B2/ja active Active
- 2012-07-04 ES ES12734884.5T patent/ES2525759T3/es active Active
-
2014
- 2014-12-17 SM SM201400188T patent/SMT201400188B/xx unknown
-
2016
- 2016-09-28 AU AU2016234915A patent/AU2016234915B2/en active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006095330A2 (en) | 2005-03-10 | 2006-09-14 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Methods and immunogenic cell preparations for treating antigen-associated diseases |
| KR100647847B1 (ko) | 2005-05-27 | 2006-11-23 | 크레아젠 주식회사 | 인간 전립선암 동물모델 및 이를 이용한 수지상세포-유래전립선암 면역치료제의 예방 및 치료 효능을 분석하는 방법 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102861103A (zh) | 2013-01-09 |
| CN103648524A (zh) | 2014-03-19 |
| DK2691110T3 (en) | 2014-11-17 |
| JP5986196B2 (ja) | 2016-09-06 |
| US20140086957A1 (en) | 2014-03-27 |
| EA201301089A1 (ru) | 2014-05-30 |
| WO2013004708A1 (en) | 2013-01-10 |
| PL2691110T3 (pl) | 2015-03-31 |
| SG194201A1 (en) | 2013-11-29 |
| JP2014520780A (ja) | 2014-08-25 |
| CA2833946A1 (en) | 2013-01-10 |
| EA030061B1 (ru) | 2018-06-29 |
| SI2691110T1 (sl) | 2015-01-30 |
| EP2691110A1 (en) | 2014-02-05 |
| BR122019026627B1 (pt) | 2021-01-12 |
| KR20140040734A (ko) | 2014-04-03 |
| BR112013031084A2 (pt) | 2016-11-29 |
| NZ618000A (en) | 2014-12-24 |
| BR112013031084B1 (pt) | 2021-01-12 |
| AU2016234915B2 (en) | 2017-08-31 |
| ES2525759T3 (es) | 2014-12-30 |
| CN103648524B (zh) | 2016-08-17 |
| AU2016234915A1 (en) | 2016-10-20 |
| CN109125347A (zh) | 2019-01-04 |
| PT2691110E (pt) | 2014-12-22 |
| SMT201400188B (it) | 2015-03-05 |
| RU2012127685A (ru) | 2014-01-20 |
| EP2691110B1 (en) | 2014-10-29 |
| AU2012280322B2 (en) | 2016-07-21 |
| UA111738C2 (uk) | 2016-06-10 |
| EP2543386A1 (en) | 2013-01-09 |
| RS53713B1 (en) | 2015-04-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102035873B1 (ko) | 높은 정수압에 의해서 사멸된 종양 세포 및 수지상 세포를 사용하는 암의 활성 세포 면역요법의 수단 및 방법 | |
| JP6235085B2 (ja) | 高静水圧によって死滅させた腫瘍細胞および樹状細胞を用いた活性細胞癌免疫療法のための手段および方法 | |
| US10918704B2 (en) | Means and methods for active cellular immunotherapy of cancer by using tumor cells killed by high hydrostatic pressure and dendritic cells | |
| AU2012280322A1 (en) | Means and methods for active cellular immunotherapy of cancer by using tumor cells killed by high hydrostatic pressure and dendritic cells | |
| Van Driessche et al. | Clinical-grade manufacturing of autologous mature mRNA-electroporated dendritic cells and safety testing in acute myeloid leukemia patients in a phase I dose-escalation clinical trial | |
| US10155033B2 (en) | Cryopreservation of apoptotic cancer cells for use in immunotherapy against cancer | |
| EP2787005A1 (en) | Targeted cancer immune therapy | |
| CN108379569B (zh) | 高效荷载肿瘤抗原的dc疫苗及其诱导扩增肿瘤抗原特异性ctl的方法 | |
| Radej et al. | Immunomodelling characteristics of mature dendritic cells stimulated by colon cancer cells lysates | |
| US10716810B2 (en) | Canine autologous immunotherapy using dendritic cell induced cancer killing immunocytes | |
| NZ618000B2 (en) | Means and methods for active cellular immunotherapy of cancer by using tumor cells killed by high hydrostatic pressure and dendritic cells | |
| EP1712634A1 (en) | Selection of highly efficient antigen presenting cells for regulating immunity and uses thereof | |
| Sweere | The Use of Human Dendritic Cell Subsets in Cancer Vaccines |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |