BR122019026627B1 - uso de ce´lulas dendri´ticas imaturas carregadas com ce´lulas tumorais apopto´ticas para a preparac¸a~o de uma vacina tumoral - Google Patents
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Abstract
A presente invenção refere-se a composições para induzir uma resposta imune contra células tumorais compreendendo células tumorais que são transformadas em apoptóticas por tratamento com alta pressão hidrostática e células dendríticas, e métodos para produzir tais composições.
Description
[001] Doenças causadas por diferentes tumores ainda constituem problemas importantes na medicina e na saúde do ser humano. A combinação de cirurgia, quimioterapia e radioterapia melhorou bastante o prognóstico de pacientes com câncer. Apesar disso essa abordagem frequentemente resulta em uma significativa redução da massa tumoral, uma pequena população de células tumorais precursoras ou células tronco cancerosas geralmente sobrevive dando subsequentemente origem a uma nova população de células tumorais que leva a uma recidiva. Mesmo que o tumor principal seja removido por cirurgia e/ou outros tratamentos, quantidades mínimas de células tumorais circulantes podem causar tumores metastáticos em diferentes áreas do corpo. Por conseguinte, existe uma permanente necessidade de medicamentos alternativos e métodos de tratamento que possam ser usados isolados ou de preferência que possam ser combinados com outros métodos de tratamento de tumores.
[002] O documento WO 2006/095330 descreve métodos para inibir o crescimento de populações de células lesionando-se termicamente, mecanicamente e/ou quimicamente células carregando antígeno e introduzindo-se as referidas células como agregados com células apresentadoras de antígeno nos pacientes.
[003] Frank et al. "Harnessing Naturally Occurring Tumor Immunity; A Clinical Vaccine Trial in Prostate Cancer", PLOS ONE, vol. 5, n°. 9, 1 Janeiro 2010 (2010-01-01), página E12367, descrevem uma vacina de células tumorais compreendendo células dendríticas autólogas e células LNCaP apoptóticas irradiadas com UV.
[004] Minarik et al. "Phase I/II of Clinical Study of Prostate Cancer Immunotherapy Using Dendritic Cell Vaccination Strategy - First Results", European Urology Supplements, vol. 9, n°. 6, 1 Setembro 2010, página 629, descrevem os resultados preliminares de um estudo clínico fase I/II de imunoterapia de câncer de próstata usando células dendríticas pulsadas com células LNCaP apoptóticas mortas por radiação UVA.
[005] Weiss et al. "Ex vivo- and in vivo-induced dead tumor cells as modulators of antitumor responses", Annals of the New York Academy of Sciences, vol. 1209, n°. 1, 1 Outubro 2010 (2010-10-01), páginas 109-117, descrevem o tratamento com alta pressão hidrostática de células tumorais. As células tumorais mortas são diretamente usadas como vacinas contra o câncer em modelos animais.
[006] Weiss et al. "High hydrostatic pressure treatment generates inactivated mammalian tumor cells with immunogeneic features", Journal of Immunotoxicology, vol. 7, n°. 3, 1 Setembro 2010, páginas 194-204, descrevem que o tratamento com alta pressão hidrostática induz a apoptose onde células tumorais são inativas e imunogênicas. Anticorpos direcionados contra células tumorais já foram produzidos e identificados em um modelo de camundongo.
[007] O documento US 2008/0286314 descreve vacinas contra o câncer compreendendo células apresentadoras de antígeno carregadas com células cancerosas que levaram choque térmico que não são apoptóticas que podem ser usadas para o tratamento de pacientes com câncer.
[008] A presente invenção refere-se a composições farmacêuticas que podem ser usadas para a indução de resposta imune antitumoral, em particular em vacinas de células tumorais fazendo com que o corpo produza uma reação imunogênica contra células tumorais.
[009] Células tumorais mortas por modalidades tradicionais tais como radiação normalmente são não imunogênicas. Se usadas para a geração de produtos para imunoterapia de câncer, as células tumorais irradiadas precisam ser administradas em combinação com um adjuvante potente. Quando usadas para pulsar células apresentadoras de antígeno, tais como células dendríticas, as células tumorais mortas irradiadas não fornecem um sinal de ativação. As células dendríticas precisam, portanto, ser ativadas por uma outra substância, tais como moléculas derivadas de patógenos.
[010] Um novo processo que induz uma morte imunogenética de células tumorais humanas, em particular células de câncer de ovário e de próstata e células de leucemia linfoblástica aguda de origem humana, é descrito. Células tumorais mortas por alta pressão hidrostática (doravante também: HHP) proporcionam um potente estímulo de ativação para células dendríticas, em particular para células dendríticas imaturas, mesmo na ausência de estímulos adicionais. As células tumorais mortas por este método expressam níveis altos de marcadores de morte celular imunogenética e células dendríticas carregadas com essas células tumorais imunogênicas induzem números elevados de linfócitos T específicos para tumores sem expandir linfóticos T reguladores indesejáveis. Os dados experimentais da presente invenção mostram que a combinação de células tumorais mortas pela aplicação de alta pressão hidrostática e células dendríticas resulta na fagocitose e apresentação eficiente de antígenos tumorais e na indução de fortes respostas imunes antitumorais.
[011] Células tumorais não são ou são apenas fracamente imunogênicas e elas usualmente não têm capacidade para induzir uma resposta imune específica de tumores se usadas na ausência de um adjuvante potente. Estudos recentes mostraram que células tumorais mortas por alguns quimioterápicos, tais como bortezomib, oxaliplatina e antraciclinas, podem induzir uma resposta imune específica de tumores. Esta morte celular imunogenética caracteriza-se por eventos moleculares compartilhados para todos os quimioterápicos descritos. Horas depois do início da morte celular imunogenética, células tumorais pré-apoptóticas translocam calreticulina e proteínas de choque térmico do retículo endoplasmático para a superfície celular junto com outras moléculas que servem como sinais de ‘coma-me’ (fosfatidilserina).
[012] Ao mesmo tempo, células tumorais que sofrem morte celular tumoral imunogenética infra-regulam a expressão de sinais ‘não me coma’ (tais como CD47 superficial) para facilitar o reconhecimento e o engolfamento de células tumorais pelas células dendríticas. Adicionalmente, subsequente à permeabilização da membrana plasmática, as células liberam a caixa do grupo de alta mobilidade 1 (HMGB1) de marcadores de apoptose tardia no meio extracelular. A HMGB1 pode se ligar a diversos receptores de reconhecimento de padrão (PRRs), tais como o receptor Toll-like 2 (TLR2), TLR4 e o receptor para produtos finais de glicosilação avançada (RAGE). A liberação desta proteína parece ser necessária para a apresentação ideal de antígenos provenientes de células tumorais moribundas, incorporação de células T pelas células dendríticas e subsequente eliminação mediada por células T do tumor.
[013] O uso de células tumorais mortas de tal maneira que elas fiquem imunogênicas é extremamente importante para o desenho de estratégias imunoterapêuticas contra o câncer. A administração de células tumorais imunogênicas pode induzir uma resposta imune específica de tumores que vai então controlar o crescimento de células tumorais. Isto vai desacelerar ou mesmo estabilizar a evolução da doença e melhorar o prognóstico de pacientes com câncer. Também é presumido que a distribuição de células tumorais circulando no corpo e a formação de metástases pode ser pelo menos substancialmente reduzida.
[014] Encontram-se descritos um novo método e composições que induzem uma morte celular imunogenética de tumores no homem, em particular células de câncer de ovário e de próstata e células de leucemia linfoblástica aguda em uma extensão muito maior que os quimioterápicos recentemente descritos. As células tumorais mortas por este método e capturadas por células dendríticas expressam altos níveis de marcadores de morte celular imunogenética e induzem grandes números de linfócitos T específicos para tumores sem induzir células T reguladoras que poderiam inibir a resposta imune antitumoral. Foi constatado que o grau de resposta imune antitumoral obtido pela combinação de células tumorais tratadas de acordo com a presente invenção e células dendríticas é cerca de 10 vezes maior que a resposta imune induzida por células tumorais imunogênicas sozinhas.
[015] O princípio geral de um protocolo de imunoterapia contra o câncer preferido baseado na administração de células dendríticas maduras (DCs) carregadas com células tumorais mortas está mostrado na Figura 1. Todas as etapas da criação da composição farmacêutica final são efetuadas segundo as condições da Boa Prática de Fabricação ("Good Manufacturing Practice") nas instalações da GMP.
[016] Em uma modalidade preferida a primeira etapa no processo de criação da composição farmacêutica para cada paciente é uma leucaferese realizada com a finalidade de coletar grandes números de monócitos do sangue periférico. Em uma modalidade preferida o produto leucaferético é então diluído em um tampão adequado, tal como PBS+1mM EDTA (Lonza, Vierviers, Bélgica) e as células mononucleares são separadas por centrifugação por gradiente Premium Ficoll Paque (GE Healthcare, Little Chalfont, UK). As células mononucleares coletadas (PBMC) são então lavadas [por exemplo em PBS+1mM EDTA (Lonza)], ressuspendidas no meio Cell Gro e plaqueadas em balões triplos (por exemplo NUNC, Roskilde, Dinamarca) a 1x106 células por cm2 de área superficiais. Depois de duas horas as células não aderentes são lavadas com PBS (Lonza). Os monócitos aderentes são cultivados por 6 dias no meio Cell Gro com 20 ng/ml de IL-4 (Gentaur) e 500 U/ml de GM-CSF (Gentaur), e citocinas frescas são acrescentadas no dia 3.
[017] DCs imaturas são coletadas no dia 6 e carregadas com células tumorais mortas (por exemplo, linhagem de células de câncer de próstata, linhagem de células de câncer de ovário, linhagem de células de leucemia linfoblástica aguda). DCs imaturas recém- descongeladas (dias 3-6) são alimentadas com células tumorais a uma proporção fixa de DC: células tumorais por 4 horas. A proporção de células dendríticas para células tumorais tratadas varia de preferência em uma faixa de 1:1 a 10:1, mais preferivelmente entre cerca de 4:1 e 6:1.
[018] De acordo com a presente invenção podem ser usadas células dendríticas que se encontram vários estágios de diferenciação, maturação e/ou ativação. O estágio de maturação das células dendríticas pode ser influenciado por fatores de maturação.
[019] As DCs pulsadas com células tumorais são então de preferência maturadas por 25 μg/ml de Poli I:C durante incubação por uma noite e criopreservadas e armazenadas em nitrogênio líquido. Antes da administração, 1x107 de DCs maduras pulsadas com células tumorais são ressuspendidas em NaCl a 0,9% (Baxter) e injetadas por via subcutânea na área inguinal e braquial dentro de 12 horas de preferência de 30 minutos a 12 horas. A administração desta forma de imunoterapia contra o câncer é de preferência repetida em intervalos regulares de 2-6 semanas a fim de reforçar continuamente a resposta imune. É presumido que o método descrito nesta invenção previne o restabelecimento de tolerância imune induzida por tumor. A eficácia terapêutica desta forma de imunoterapia já foi documentada em pacientes com câncer de próstata em estágios clínicos distintos, recidiva bioquímica de câncer de próstata e câncer de próstata metastático resistente à castração, presumivelmente também no estágio metastático sensível a hormônios.
[020] A modalidade preferida descrita acima, no entanto, não é de forma alguma limitativa. Em seu escopo mais amplo a invenção pode ser realizada de maneiras alternativas dependendo das necessidades específicas do tratamento do tumor. A modalidade preferida identificada acima descreve a invenção por meio da qual as células tumorais ou são obtidas do paciente a ser tratado ou de linhagens de células tumorais de bancos de linhagens de células tumorais. As células dendríticas são de preferência obtidas do paciente a ser tratado.
[021] De um modo mais geral, no entanto, a presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica para induzir uma resposta imune contra células tumorais compreendendo: a) células tumorais que são apoptóticas, onde a apoptose é causada por tratamento com pressão hidrostática e b) células dendríticas.
[022] Um aspecto importante da presente invenção é que as células tumorais que são usadas na composição farmacêutica são células apoptóticas e não células necróticas. O especialista na técnica conhece as diferenças entre apoptose versus necrose. A morte celular e subsequentes alterações post-mortem, chamadas necrose, são partes integrantes do ciclo normal de desenvolvimento e maturação. Apesar da importância deste processo, os mecanismos subjacentes à morte celular ainda são muito pouco compreendidos embora existam diversas publicações referentes aos mecanismos que ocorrem quando uma célula está morrendo. Apoptose no sentido da presente invenção é tida como uma forma programada e controlada de morte celular ao passo que necrose é uma forma acidental e desordenada de morte celular.
[023] Na presente invenção entende-se por apoptose um modo de morte celular que ocorre em condições fisiológicas normais e a célula é um participante ativo de sua própria morte. As células que sofrem apoptose apresentam aspectos morfológicos e bioquímicos característicos. Estes aspectos incluem agregação de cromatina, condensação nuclear e citoplasmática, divisão do citoplasma e núcleo em vesículas ligadas a membranas (corpos apoptóticos) que contêm ribossomos, mitocôndria morfologicamente intacta e material nuclear. Como estes corpos apoptócios são normalmente reconhecidos in vivo e fagocitosados por macrófagos ou células epiteliais adjacentes é importtante que as células tumorais usadas no presente método se pareçam o máximo possível com células tumorais apoptóticas. A apoptose geralmente limita-se a células individuais e não causa respostas inflamatórias.
[024] A necrose por outro lado ocorre quando as células são expostas a condições fisiológicas extremas que podem resultar em danos à membrana plasmática. A necrose começa com um enfraquecimento da capacidade das células para manter a hemostasia, levando a um influxo de água e íons extracelulares. Organelas intracelulares, principalmente a mitocôndria e a célula inteira incham e se rompem. Devido ao rompimento definitivo da membrana plasmática, o conteúdo citoplasmático, incluindo enzimas lisossômicas, é liberado no fluido extracelular. Por conseguinte, a morte celular necrótica in vivo frequentemente está associada a danos teciduais extensos resultando em uma resposta inflamatória intensa. É importante que as células tumorais usadas nas composições farmacêuticas sejam apoptóticas e não necróticas.
[025] De acordo com a presente invenção, as células apoptóticas são produzidas por um tratamento com alta pressão hidrostática. Por alta pressão hidrostática entende-se na presente invenção aquela que é definida como uma altura de carga maior ou igual a 100 Mpa [1 MPa = 10 bar = 9.86923 atm = 145,0377 psi]. Alta pressão hidrostática pode ser produzida por um equipamento que está descrito, por exemplo, em Weiss et al., Journal of Immunotoxicology, 2010, páginas 194-209, em particular na Figura 1.
[026] O tratamento com alta pressão hidrostática das células tumorais é de preferência efetuado em uma autoclave de pressão. As células tumorais são colocadas em frascos criogênicos adequados que são completamente preenchidos com uma suspensão de células e fechados hermeticamente uma vez que o aparecimento de bolhas de ar tem que ser evitado. Depois disso, os frascos são vedados com um filme flexível (por exemplo, parafilm®) e os frascos preparados são colocados na câmara de pressão que é preenchida com um meio transmissor de pressão. Em seguida a pressão alta é produzida por um dispositivo adequado e as células são mantidas por um tempo suficiente sob tal pressão alta.
[027] Em uma modalidade preferida, a alta pressão hidrostática é mantida por pelo menos 10 minutos a uma pressão de pelo menos 200 MPa. Em uma modalidade mais preferida as células tumorais são mantidas por um período de tempo de 10 minutos a 12 horas, de preferência de 10 minutos a 1 hora e especialmente de preferência de 10 a 30 minutos a uma pressão na faixa de 200-300 MPa, de preferência 200-250 MPa.
[028] As células tumorais a serem usadas na composição farmacêutica podem ser derivadas de diferentes fontes. Em uma modalidade particular as células tumorais são derivadas de um tumor primário ou de um tumor metastático do paciente a ser tratado. As células tumorais podem ser obtidas por biópsia ou cirurgia. O tecido é desintegrado e as células tumorais separadas e purificadas podem ser usadas imediatamente. Também é preferido estabelecer uma linhagem celular do tumor primário e usar as células assim obtidas para vacina de células tumorais. Alternativamente, as células tumorais podem ser obtidas de linhagens de células tumorais adequadas. Tais linhagens de células tumorais podem ser preparadas a partir do tumor autólogo. Alternativamente, podem ser usadas células tumorais que se encontram comercialmente disponíveis em instituições depositárias tais como, por exemplo, ATCC.
[029] O outro componente da composição farmacêutica são células dendríticas. De acordo com a presente invenção é possível usar células dendríticas em vários estágios. É possível usar células dendríticas obteníveis diretamente do paciente separando as células dendríticas do sangue. No entanto, também é possível ainda classificar as células dendríticas dependendo do seu estágio. Em uma modalidade da presente invenção células dendríticas imaturas diferenciadas dos monócitos do sangue periférico são usadas para a preparação da vacina de células tumorais.
[030] É sabido que existem três tipos principais de células apresentadoras de antígeno nos órgãos linfoides periféricos que podem ativar as células T, a saber, células dendríticas, macrófagos e células B. As mais potentes destas células são as células dendríticas cuja função conhecida é apresentar antígenos estranhos a células T. As células dendríticas imaturas ficam localizadas em tecidos em todo o corpo, incluindo a pele, o intestino e o trato respiratório. As células dendríticas existem em dois estágios funcionalmente e fenotipicamente distintos, células dendríticas imaturas e maduras. As células dendríticas imaturas possuem elevada atividade endocítica, são especializadas na captura e processamento de antígenos e residem em tecidos periféricos in vivo. As células dendríticas imaturas desempenham um papel crucial na indução e manutenção da tolerância periférica. Ao serem expostas a produtos derivados de patógenos ou a sinais pró-inflamatórios inatos, as células dendríticas perdem sua atividade fagocítica e migram para nodos linfáticos drenantes e vão se tornando células dendríticas maduras. As células dendríticas maduras possuem uma elevada capacidade apresentadora de antígeno e capacidade estimuladora de células T devido à expressão de altos níveis de células apresentadoras de antígeno, adesão e coestimuladoras assim como outros marcadores específicos para células dendríticas tais como CD83 e DC-LAMP.
[031] As células dendríticas imaturas a serem usadas na composição podem ser obtidas de diferentes fontes. Em uma modalidade preferida as células dendríticas imaturas são diferenciadas dos monócitos do paciente a ser tratado. Alternativamente, no entanto, as células dendríticas imaturas podem ser obtidas de outras fontes tais como produtos sanguíneos comercialmente disponíveis que podem ser adquiridos em laboratórios de coleta de sangue.
[032] Para a preparação de uma composição farmacêutica de acordo com a presente invenção células dendríticas imaturas adequadas são preparadas. As células dendríticas (DCs) podem ser preparadas por diferentes métodos e podem apresentar propriedades diferentes. Em uma modalidade preferida da presente invenção as células dendríticas são obtidas de monócitos isolados por leucaferese.
[033] As DCs compreendem menos de 1% de células mononucleares no sangue periférico. Leucaferese pode ser usada para isolar aproximadamente 106 a 107 células dendríticas e pode ser combinada com técnicas de seleção positiva ou negativa. Embora o isolamento direto de células dendríticas do sangue periférico possibilite uma preparação rápida de células dendríticas, podem ser necessárias várias leucafereses se forem requeridas múltiplas imunizações em um protocolo.
[034] Em uma modalidade preferida da presente invenção monócitos são enriquecidos a partir de leucaferese por aderência em material plástico. As células dendríticas são diferenciadas na presença de citocinas, de preferência um coquetel de várias citocinas, embora um fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) combinado com interleucina 4 seja preferido.
[035] Um método particularmente preferido para preparar células dendríticas é gerá-las ex vivo. Monócitos são precursores de células dendríticas que podem ser enriquecidos a partir de células mononucleares do sangue periférico por técnicas tais como leucaferese, aderência a plástico, centrifugação com gradiente de densidade, seleção positiva de células CD14+, seleção negativa de células B e T e combinações das mesmas. A DC pode ser cultivada e diferenciada por tratamento de uma população de células precursoras enriquecidas por aproximadamente 3-7, de preferência 7 dias com citocinas, em particular com fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) + interleucina 4 ou interleucina 13. Uma vantagem desta modalidade é que é possível preparar mais de 109 DC a partir de um único produto de leucaferese e tal preparação pode ser usada para muitas outras vacinações criopreservando-se a preparação de DCs de preferência em nitrogênio líquido. Embora DCs possam ser cultivadas em uma variedade de meios, é preferido o uso de meios sem soro ou de meios contendo soro autólogo. Para a preparação industrial da composição farmacêutica é particularmente preferível preparar as células dendríticas imaturas em grande escala para que a ocorrência de reações anafiláticas (por exemplo, devido a soro de bezerro fetal) ou a contaminação de vírus seja evitada.
[036] Na etapa seguinte da preparação da composição farmacêutica, as células dendríticas imaturas são carregadas com as células tumorais apoptóticas que são obtidas por tratamento com alta pressão hidrostática. Em uma modalidade preferida, as células dendríticas imaturas que foram colocadas em contato com as células tumorais apoptóticas são maturadas pelo uso de uma variedade de estímulos tais como a adição de fator de necrose tumoral α (TNF-α) ou lipopolissacarídeo ou Poli I:C.
[037] A composição farmacêutica obtida pode ser preservada para administração, de preferência por criopreservação. A criopreservação de bioespécimes é largamente praticada em medicina clínica e pesquisa biomédica. No entanto, o impacto deste processo na viabilidade celular e particularmente na função celular às vezes pode ser subestimado. Por conseguinte, o método usado para congelamento da preparação celular antes de ser usada em vacina contra o câncer deve ser visto com cautela. O efeito da criopreservação depende certamente das células específicas usadas e é preciso examinar se a atividade biológica da composição farmacêutica é alterada pela criopreservação. Pode ser necessário acrescentar componentes protetores como polissacarídeos não imunogênicos ou DMSO.
[038] A composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada por via intravenosa (IV), intradérmica, subcutânea ou intralinfática embora a via subcutânea seja particularmente preferida.
[039] A dose ideal e a frequência de imunização da composição farmacêutica depende do tipo de tumor, da idade e condição do paciente e do estágio de evolução da doença tumoral. Em uma modalidade preferida aplica-se primeiro uma dose imunizante da composição farmacêutica que pode ser seguida pela administração de longo prazo de injeções de reforço aplicados em intervalos variando de 2 a 8 semanas.
[040] A vacina de células tumorais descrita nesta invenção pode ser aplicada com sucesso a todas as formas de tumores. Em modalidades preferidas as composições farmacêuticas são usadas no tratamento de pacientes com câncer que estão em um estágio avançado do câncer, mas também no estágio inicial do câncer. Em uma modalidade especialmente preferida a vacina de células tumorais é aplicada a pacientes em um estágio avançado de câncer de próstata com câncer de próstata metastático resistente a hormônios. Por "estágio inicial de câncer" entende-se aquelas formas de câncer cujo diagnóstico é possível. Frequentemente os pacientes não apresentam sinais da doença. Em "estágios avançados de câncer" o paciente frequentemente sofre de severas consequências da doença com dor ou fraqueza.
[041] Embora seja conhecido na técnica o uso de agentes adjuvantes em vacinas para terapia contra tumores, é preferível no curso da presente invenção não usar qualquer adjuvante adicional tal como lipopolissacarídeo, adjuvante de Freund incompleto ou proteínas de choque térmico.
[042] Um aspecto importante da presente invenção é que as células tumorais tratadas com alta pressão hidrostática se encontram em um estágio tal que elas não podem crescer e formar um tumor metastático depois de aplicadas ao paciente. Isto foi comprovado por inúmeras abordagens experimentais, incluindo os ensaios clonogênicos.
[043] A composição farmacêutica descrita neste relatório pode ser usada para o tratamento de um ser humano por imunoterapia (vacinação) contra o câncer. As células tumorais que podem ser derivadas do paciente a ser tratado são colocadas em um estágio apoptótico por tratamento com alta pressão hidrostática já descrito acima. Alternativamente são usadas linhagens de células tumorais adequadas. Células dendríticas imaturas são de preferência obtidas por leucaferese a partir do mesmo paciente e as células são cultivadas ex vivo por tratamento com citocinas. Uma quantidade adequada dessas células dendríticas imaturas (por exemplo, 107-108 células) é carregada com as células tumorais apoptóticas embora a faixa ideal de células dendríticas imaturas : células tumorais apoptóticas seja de 10:1 a 1:1, de preferência de 5:1 a 3:1.
[044] Depois da maturação das células dendríticas a composição farmacêutica pode ser aplicada ao paciente. Células dendríticas que capturaram células tumorais mortas por alta pressão hidrostática podem ser usadas diretamente para vacinação contra tumores. No entanto, é possível ativar ou maturar ainda as células, por exemplo, por tratamento com citocinas antes da administração ao paciente.
[045] De acordo com a presente invenção os seguintes materiais e métodos são de preferência usados:
[046] Foi mostrado que um tratamento de células de câncer de ovário e de próstata e células de leucemia linfoblástica aguda por 10 minutos com alta pressão hidrostática (200MPa) a cerca de 21°C leva à indução de uma morte celular imunogenética de células tumorais. Células tumorais mortas por HHP (alta pressão hidrostática) são muito mais imunogênicas que células tumorais mortas por antraciclinas, os únicos citostáticos conhecidos para induzir morte celular imunogenética, ou por radiação UV. Células tumorais imunogênicas mortas por HHP são avidamente fagocitosadas por células apresentadoras de antígeno e induzem sua maturação mesmo na ausência de estímulos adicionais derivados de patógenos, tais como LPS. Células apresentadoras de antígeno carregadas com HHP células tumorais mortas induzem respostas de células T específicas de tumores CD4 e CD8 robustas e não induzem células T reguladoras potencialmente nocivas. Células tumorais mortas por HHP representam, portanto, uma poderosa ferramenta para abordagens clínicas de imunoterapia contra o câncer.
[047] Apesar da constante introdução de novas drogas e adicionais aprimoramentos dos protocolos de quimioterapia, é bem provável que, em algum momento, a quimioterapia vai atingir seus limites, e a eficácia clínica vai atingir seu plateau. Além disso, apesar do inegável sucesso no tratamento de algumas malignidades, em alguns tumores, particularmente em tumores sólidos, a quimioterapia raramente é curativa. Uma combinação de modalidades de tratamento tem sido uma estratégica tradicional para o tratamento de câncer, a combinação de cirurgia com quimioterapia ou radioterapia sendo um exemplo clássico. Devem ser feitos esforços não apenas para desenhar estratégias imunoterapêuticas modernas, mas também para incorporar abordagens imunoterapêuticas nos atuais protocolos de quimioterapia. Quimioterapia e imunoterapia não devem doravante der consideradas formas antagonistas de terapia, e é concebível que sua combinação racional vai melhorar significativamente o prognóstico de pacientes com câncer.
[048] Linhagens celulares preferidas: linhagens de células de leucemia linfoblástica aguda (REH, DSMZ, Braunschweig, Alemanha), linhagens de células de câncer de ovário (OV90, ATCC, Teddington, UK), linhagens de células de câncer de próstata (LNCap, ATCC, Teddington, UK) foram usadas. Todas as linhagens celulares foram cultivadas no meio RPMI 1640 (Gibco). Todos os meios foram suplementados com 10% de soro bovino fetal inativado com calor (Lonza), 100 U/ml de penicilina e 2 mmol/L de L-glutamina.
[049] Isolamento de células tumorais primárias: Células de câncer de ovário e de próstata primário foram obtidas de pacientes passando por cirurgia. Blastos leucêmicos de pacientes com leucemia linfoblástica aguda foram obtidos da medula óssea pacientes com (ALL) por centrifugação por gradiente em gradiente Ficoll.
[050] Indução e detecção de apoptose: A morte de células tumorais foi induzida por um tratamento de 10 minutos com alta pressão hidrostática. Para testes comparativos, a morte de células tumorais foi induzida por exposição à luz UV. Neste caso uma energia de 7,6 J/cm2 foi aplicada por 10 minutos. A morte celular foi avaliada por coloração com anexina V conjugada ao isotiocianato de fluoresceína. Em resumo, 2x105 células por amostra foram coletadas, lavadas em PBS, pelotizadas, e ressuspendidas em um tampão de incubação contendo anticorpo para anexina V conjugada ao isotiocianato de fluoresceína. As amostras foram mantidas no escuro e incubadas por 15 minutos antes da adição de mais 400 μl do tampão de incubação à base de iodeto de propídio a 0,1% e subsequente análise em classificador de células ativado por Aria fluorescência (BD Bioscience) usando o software FlowJo.
[051] Análise por citometria de fluxo de hsp70, hsp90 e CRT (calreticulina) na superfície celular: Um total de 105 células foram plaqueadas em placas de 12 poços e tratadas no dia seguinte com os agentes indicados ou foram - como controle - irradiadas com UV (7,6 J/cm2) por 6, 12 ou 24 horas ou foram tratadas por 10 minutos com alta pressão hidrostática a 21 graus centígrados. As células foram coletadas e lavadas duas vezes com PBS. As células foram incubadas por 30 minutos com anticorpo primário em tampão de bloqueio frio (2% de soro bovino fetal em PBS), seguido por lavagem e incubação com o anticorpo secundário monoclonal conjugado a Alexa 648 em uma solução de bloqueio. Cada amostra foi então analisada por FACScan (BD Bioscience) para identificar hsp70, hsp90 e CRT na superfície celular.
[052] Detecção da liberação de HMGB1: kits de ensaio imunoabsorvente ligado à enzima HMGB1 II foram adquiridos na SHINO-TEST CORPORATION (Tóquio, Japão). Células REH, células OV90, células LNCap, células de ovário primárias e blastos leucêmicos (106) foram plaqueados em 1 ml de meio completo apropriado para tipo de célula. Os sobrenadantes foram coletados em diferentes momentos no tempo, as células tumorais moribundas foram removidas por centrifugação, e os sobrenadantes foram isolados e imediatamente congelados. A quantificação de HMGB1 nos sobrenadantes foi avaliada pelo ensaio imunoabsorvente ligado à enzima de acordo com as instruções do fabricante.
[053] Microscopia fluorescente: Imunofluorescência: Para detecção superficial de CRT, as células foram colocadas sobre gelo, lavadas duas vezes com PBS e fixadas em 0,25% de paraformaldeído em PBS por 5 minutos. As células foram então lavadas duas vezes com PBS, e um anticorpo primário diluído em tampão de bloqueio frio foi acrescentado por 30 minutos. Depois de duas lavagens em PBS frio, as células foram incubadas por 30 minutos com o anticorpo secundário conjugado a Alexa 648 apropriado. As células foram fixadas com 4% de paraformaldeído por 20 minutos, lavadas em PBS por 20 minutos e colocadas sobre lâminas.
[054] Para fagocitose, as DCs foram coloridas com a solução marcadora de células Vybrant® DiO (Invitrogen). As células tumorais foram coloridas com a solução marcadora de células Vybrant® DiI (Invitrogen) e cultivadas na presença de antraciclinas, exposição à luz UV ou 10 minutos de tratamento com alta pressão hidrostática a 21 graus centígrados. As DCs imaturas (dia 5) foram carregadas em células tumorais a uma proporção de DC/célula tumoral de 1:5. As células foram fixadas com 4% de paraformaldeído por 20 minutos, lavadas em PBS por 20 minutos e colocadas sobre lâminas com o reagente antidesvanecimento ProLong Gold (Invitrogen).
[055] Geração de DCs carregadas com tumor e indução da morte de células tumorais: DCs foram geradas por cultura de células CD14+ purificadas isoladas de camadas leucocitárias na presença do fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) (Gentaur, Bruxelas, Bélgica) e interleucina-4 (IL-4) (Gentaur, Bruxelas, Bélgica). As células tumorais foram mortas por 10 minutos de tratamento com alta pressão hidrostática a 21 graus centígrados, ou - como controles - por radiação UV ou por antraciclinas. A extensão da apoptose foi monitorada por coloração com anexina V/PI. As células foram abundantemente lavadas antes de serem carregadas nas DCs. DCs imaturas (dia 5) foram carregadas nas células tumorais a uma proporção de DC/célula tumoral de 1:5. Em algumas experiências, DCs pulsadas foram estimuladas com 100 ng/ml de lipopolissacarídeo (LPS) (Sigma) por 12 horas ou 25 μg/ml de Poli I:C (adquirido na Invivogen).
[056] Análise por FACS do fenótipo de DC depois de interação com células tumorais mortas: O fenótipo das DCs cultivadas com células tumorais foi monitorado por citometria de fluxo. As células tumorais foram mortas por um agente citostático selecionado ou por radiação UV (exemplos comparativos) ou por 10 minutos de tratamento com alta pressão hidrostática a 21 graus centígrado (de acordo com a presente invenção) e foram cocultivadas por 24 horas com DCs imaturas. Para algumas experiências, as DCs e as células tumorais foram marcadas com corante antes da cocultura para monitorar a fagocitose. Anticorpos monoclonais (mAbs) contra as seguintes moléculas foram usados: CD80-FITC, CD83-FITC, CD86-PE, CD14-PE (Immunotech, Marseille, França), CD11c-PE, HLA-DR (BD Biosciences, San Jose, CA).
[057] As DCs foram coloridas por 30 minutos a 4°C, lavadas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e analisadas usando FACS Aria (BD Biosciences) usando o software FlowJo. As DCs separadas segundo as propriedades de FSC e SSC. Controles de isótipos apropriados foram incluídos, e 50000 DCs viáveis foram adquiridas para cada experiência.
[058] Avaliação de células T específicas de tumores produtores de IFN-Y: DCs não pulsadas ou carregadas com células tumorais foram adicionadas a células T autólogas a uma proporção de 1:10 nos dias 0 e 7 de cultura. IL-2 (25-50 unidades internationais/mL; PeproTech) foi adicionada nos dias 2 e 7 de cultura. As culturas foram testadas quanto à presença de células T específicas de tumores 7 a 9 dias depois da última estimulação com DCs. A indução de células T produtoras de interferon (IFN)-Y e reativas com tumores de células T reativas com antígeno específico para próstata (PSA) por DCs carregadas com células tumorais por determinada por citometria de fluxo. As células T foram coloridas com CD8/IFN-Y anti-humano. A frequência de linfócitos T reguladores na cultura foi analisada por coloração com CD4/CD25 e FoxP3. As células T reguladoras foram identificadas por citometria de fluxo como CD4 positivas, CD25 positivas e FoxP3 positivas.
[059] A invenção e os resultados obtidos com as experiências estão ilustrados pelas Figuras: Figura 1
[060] O desenho esquemático mostra como uma composição farmacêutica da presente invenção pode ser obtida. Células tumorais obtidas seja do paciente ou de linhagens celulares são tratadas com alta pressão e com isso as células ficam apoptóticas.
[061] As células dendríticas são isoladas via leucaferese. As células dendríticas imaturas e células tumorais apoptóticas são combinadas e com isso são produzidas células dendríticas maduras que podem ser usadas como vacina. Figura 2
[062] Pressão hidrostática alta induz a expressão de proteínas de choque térmico em células tumorais humanas. O resumo de um total de 5 experiências está mostrado. * Valor de P para comparação com células tumorais irradiadas, P <0,05. A expressão tempo-dependente dos marcadores HSP70, HSP90 e calreticulina em duas linhagens de células tumorais (OV90 e LNCap) causada por diferentes tratamentos está mostrada. Figura 3
[063] Pressão hidrostática alta induz a liberação de HMGB1 (proteína do grupo de alta mobilidade B1) de células tumorais tratadas (OV90 e LNCap). HMGB1 é uma citocina mediadora de inflamação. O resumo de um total de 5 experiências está mostrado. * Valor de P para comparação com células tumorais irradiadas, P <0,05. A Figura 3 mostra que no diz respeito à liberação tempo-dependente de HMBG1 o tratamento com HHP é muito mais eficaz que outros tratamentos convencionais. Figura 4
[064] A cinética da fagocitose de células tumorais tratadas com alta pressão hidrostática por DCs imaturas. O resumo de 5 experiências independentes e os resultados representativos estão mostrados. Na experiência foram usadas seja células tumorais OV90 ou LNCap. O tratamento com HHP é comparado com o tratamento com UV a 0°C e 37°C. Figura 5
[065] O fenótipo de células dendríticas baseado nos marcadores OD86 e HLA-DR depois de interação com células tumorais mortas com alta pressão hidrostática (OV90 e LNCap) está mostrado. DCs imaturas de 5 dias foram cultivadas por 24 horas com células tumorais mortas por HHP ou radiação. Depois de 24 horas, a expressão de moléculas associadas à maturação nas DCs foi analisada por citrometria de fluxo. LPS foi usado como controle. A intensidade de fluorescência média (MFI) está mostrada. *Valor de P para comparação com DCs carregadas com células tumorais irradiadas, P < 0,05. Figura 6
[066] A indução de células T específicas de tumores por células dendríticas carregadas com células tumorais mortas por pressão hidrostática (LNCap e OV90) é comparada com células dendríticas carregadas com células tumorais mortas por radiação UV. Os dados mostram um resumo de cinco experiências independentes. *Valor de P para comparação com células tumorais irradiadas, P <0,05. Figura 7
[067] A Figura 7 demonstra a superioridade do tratamento das células tumorais com alta pressão hidrostática (HHP) em comparação com células tumorais mortas por radiação UV (UV irr). Os testes foram realizados com uma linhagem de células de câncer de próstata (LNCap) e com uma linhagem de células de câncer de ovário (OV90). Controles foram realizados com células dendríticas sozinhas e células estimuladas com Poli I:C.
[068] Os resultados resumidos na Figura 7 mostram a indução de células T específicas do antígeno específico de próstata (PSA) por células dendríticas carregadas com células tumorais mortas com alta pressão hidrostática (LNCap e OV90, respectivamente). Foi feita uma comparação entre células tumorais mortas por alta pressão hidrostática sozinhas e células dendríticas carregadas com células tumorais mortas por radiação UV. Os dados apresentados na Figura 7 mostram um resumo de cinco experiências independentes. * Valor de P para comparação com células tumorais irradiadas, P <0,05. A Figura 7 resume os resultados obtidos no exemplo 7. Figura 8
[069] A indução de células T reguladoras por células tumorais mortas por alta pressão hidrostática é comparada com a indução de Tregs por células tumorais irradiadas com UV. Os dados mostram um resumo de cinco experiências independentes.
[070] As experiências resumidas na Figura 8 mostram que o ensinamento da presente invenção pode ser aplicado a diferentes tipos de tumores. A parte superior da Figura 8 mostra as experiências realizadas com células de câncer de ovário (OV90). A parte inferior mostra as experiências realizadas com uma linhagem de células de câncer de próstata (LNCap). Nas experiências foi determinada a concentração de Fox P3 (Forkhead Box P3) com a finalidade de diferenciar ainda as células T reguladores (Tregs). As experiências mostram que as células tumorais tratadas de acordo com a invenção com HHP realmente induzem números mais baixos de células T reguladoras do que células tumorais irradiadas com UV. Figura 9
[071] Encontram-se mostrados os resultados de um estudo in vivo onde pacientes foram tratados com uma vacina de células tumorais de acordo com esta invenção. Todos os pacientes haviam passado por prostatectomia radical ou radioterapia. Como parâmetro relevante o tempo de duplicação de PSA foi determinado. Segundo Antonarakis et al., BJU Int. 2011, 108(3), páginas 378-385, o tempo de duplicação de PSA é o determinante mais forte do tempo de sobrevida sem metástase e do tempo de sobrevida total de pacientes com câncer de próstata recorrente associado ao antígeno específico de próstata (PSA). Tempo de duplicação de PSA significa a diferença de tempo em que o valor de PSA é duplicado. Quanto maior o tempo de duplicação de PSA, maior a expectativa de vida do paciente tratado. Com a aplicação da vacina de células tumorais da presente invenção o tempo de duplicação de PSA pode ser significativamente aumentado.
[072] * Valor de P para comparação com células tumorais irradiadas, P <0,05. Figura 10
[073] A Figura 10 é uma curva de sobrevida de Kaplan-Meier de pacientes em um estágio avançado de câncer de próstata que foram tratados de acordo com a presente invenção.
[074] Na curva de sobrevida de Kaplan-Meier a morte de um paciente provoca uma queda da percentagem de sobrevida partindo de 100% para valores mais baixos. O nomograma de Halabi é a redução normalmente esperada de sobreviventes por meio do qual o tempo de sobrevida médio é de 12 meses.
[075] A ativa imunoterapia de câncer usando a vacina contra o câncer descrita nesta invenção resulta em um prolongamento do meio de sobrevida médio para 23 meses.
[076] A presente invenção será ainda ilustrada pelos exemplos que se segue que, contudo, não são limitativos: Exemplo 1 Expressão dos marcadores de morte celular imunogenética hsp70, hsp90 e calreticulina por linhagens de células cancerígenas humanas e células tumorais primárias humanas depois do tratamento com alta pressão hidrostática
[077] Linhagens de células de leucemia, câncer de ovário e câncer de próstata e células tumorais primárias foram tratadas com 10 minutos com alta pressão hidrostática (HHP, 200 MPa) a 21 graus centígrados e a expressão dos marcadores de morte celular imunogenética conhecidos hsp70, hsp90 e calreticulina foi monitorada em 6, 12 e 24 horas. Expressão significativa de calreticulina, hsp70 e hsp90 foi detectada 6, 12 e 24 horas depois de tratamento com HHP para todos os modelos de tumor testados. A expressão de moléculas imunogenéticas foi significativamente mais alta que a expressão induzida por antraciclinas, os únicos indutores conhecidos de morte celular imunogenética (Figura 2). A expressão aumentada de calreticulina e proteínas de choque térmico depois de tratamento com HHP foi acompanhada por sua translocação para a superfície celular. O tratamento com HHP também induziu uma liberação rápida e substancial de HMGB1, um marcador solúvel de morte celular imunogenética. A liberação de HMGB1 foi muito mais alta que no caso de radiação UV ou antraciclinas. (Figura 3).
[078] A liberação máxima da proteína nuclear HMGB1 foi detectada 48 horas depois da indução da morte das células tumorais. Exemplo 2 Tratamento de células tumorais com alta pressão hidrostática aumenta sua fagocitose por células apresentadoras de antígeno
[079] Tendo em vista o papel estabelecido da calreticulina como um sinal de ‘coma-me’, foi investigada a taxa de fagocitose de células tumorais mortas por alta pressão hidrostática por células dendríticas (DCs), as células apresentadoras de antígeno mais eficientes que são cruciais para o início de uma resposta imune. Células tumorais tratadas com alta pressão hidrostática foram fagocitosadas a uma velocidade mais rápida e em maior grau que as células tumorais mortas por outras modalidades, tais como antraciclinas ou radiação UV. Depois de 12 horas, o grau de fagocitose de células leucêmicas tratadas com HHP foi 4 vezes maior que o das células mortas por radiação UV (Figuras 4a e 4b). Exemplo 3 Fagocitose de células tumorais tratadas com alta pressão hidrostática induz a maturação de DCs
[080] A capacidade das DCs para ativar a resposta imune depende de seu estado de ativação e da expressão de moléculas coestimuladoras. Em circunstâncias normais a maturação mais eficiente de DCs é induzida por moléculas derivadas de patógenos, tais como lipopolissacarídeo (LPS) de bactérias Gram-negativas. Somente DCs ativadas (maduras) que expressam altos níveis de moléculas coestimuladoras podem iniciar a resposta imune. É analisado o fenótipo de DCs que fagocitosaram células tumorais mortas por HHP. A interação de DCs com células tumorais tratadas com HHP induziu a suprarregulação de moléculas coestimuladoras (CD86, CD83) e de moléculas associadas à maturação (HLA-DR) em um nível similar àquele da ativação com LPS (Figura 5). Portanto células tumorais mortas por HHP podem induzir a maturação de DCs de forma equiparável ao LPS derivado de patógeno. Exemplo 4 Células tumorais apresentadoras de DCs tratadas com alta pressão hidrostática induzem células T específicas de tumores e induzem números baixos de células T reguladoras inibitórias
[081] Para investigar se células tumorais tratadas com HHP e expressando marcadores de morte celular imunogenética induzem imunidade antitumoral, é avaliada a capacidade de DCs carregadas com células tumorosas para atividade respostas de células T específicas de células tumorais. Células tumorais mortas por HHP foram cocultivadas com DCs imaturas com ou sem subsequente maturação com LPS. Estas DCs foram então usadas como estimuladores de células T autólogas, e a frequência de células T produtoras de IFN-Y foi analisada uma semanas depois de re- estimulação com DCs carregadas com células tumorais. DCs pulsadas com células tumorais mortas com HHP induziu um maior número de células T produtoras de IFN-Y específicas de tumores em comparação com DCs pulsadas com células irradiadas, mesmo na ausência de estímulo de maturação (LPS) adicional.
[082] Adicionalmente, a frequência de células T reguladoras (Tregs) induzidas em coculturas de DC e células T também foi testada. A indução de Tregs é indesejável no caso de imunoterapia contra tumores uma vez que as Tregs inibem a resposta imune direcionada contra o tumor. DCs pulsadas com células tumorais mortas por HHP apresentaram uma capacidade mais baixa para expandir células T reguladoras quando comparadas tanto com DCs imaturas quanto com DCs ativadas por LPS (Figura 8). O marcador superficial FoxP3 é específico para células T reguladoras. Exemplo 5
[083] A imunoterapia celular ativa pode ser administrada como uma única modalidade de tratamento no caso de doença residual mínima depois do tratamento primário do tumor por cirurgia ou radioterapia. No câncer de próstata ele pode ser de interesse para pacientes com sinais de recidiva bioquímica (níveis crescentes do antígeno PSA específico de próstata no sangue periférico medidos por um método ultrassensível).
[084] Os melhores resultados da presente invenção podem ser obtidos quando o tumor primário é removido do paciente por cirurgia. A composição farmacêutica descrita no presente pedido pode ser produzida a partir das células tumorais que foram isoladas do tecido tumoral ou de linhagens de células de tumor.
[085] Um paciente (68 anos de idade) sofrendo de câncer de próstata foi diagnosticado em um estágio inicial do desenvolvimento do tumor. O tumor foi removido, mas alguns meses depois da cirurgia níveis crescentes de PSA foram detectados. O paciente passou por leucaferese e células dendríticas imaturas foram diferenciadas de monócitos isolados. As células tumorais da linhagem de células de câncer de próstata foram transformadas em apoptóticas por tratamento com alta pressão hidrostática como descrito neste relatório e as células tumorais apoptóticas foram colocadas em contato com as células dendríticas imaturas a fim de preparar a composição de vacina.
[086] A composição farmacêutica foi dividida em alíquotas que foram congeladas em nitrogênio líquido até serem usadas. A primeira aplicação da vacina de células tumorais ocorreu 4 semanas depois da detecção da recidiva bioquímica do câncer de próstata. Seguiram-se aplicações de reforço a cada quatro semanas por um período de um ano.
[087] A vacinação induziu uma resposta imune contra o pequeno número de células tumorais sobreviventes que levou a uma redução substancial de novo crescimento de células tumorais e resultou no prolongamento da sobrevida do paciente. Exemplo 6
[088] Em pacientes com câncer avançado, a imunoterapia celular ativa deve ser combinada com quimioterapia (isto é, docetaxel em câncer de próstata) de acordo com o conceito de quimioimunoterapia.
[089] Um paciente (76 anos de idade) sofrendo de câncer de próstata avançado foi tratado de acordo com a presente invenção. A quimioterapia usual foi combinada com a imunoterapia celular ativa descrita nesta invenção. O paciente foi tratado aos 65 anos de idade com tumor de próstata. Depois da remoção do tumor por cirurgia e tratamento hormonal o nível de PSA (antígeno específico de próstata) foi mantido em um nível baixo mostrando as células de câncer de próstata não cresceram. Depois de 12 meses de terapia hormonal câncer de próstata metastático desenvolveu-se em várias partes do corpo (em particular nos ossos) e o tumor ficou refratário a hormônios. O paciente foi aprovado para o tratamento de câncer de próstata refratária a hormônios com docetaxel em combinação com imunoterapia celular ativa à base de células dendríticas.
[090] Antes de dar início à quimioterapia, células dendríticas imaturas foram geradas a partir de monócitos obtidos durante a leucaferese. Células tumorais oriundas de linhagens de células de câncer de próstata foram tratadas com pressão hidrostática por 30 minutos a uma pressão de 210 MPa a 21°C. 109 células tumorais tratadas de acordo com a presente invenção foram usadas para pulsar 109 células dendríticas imaturas e alíquotas das células dendríticas maduras que foram previamente pulsadas com essas células tumorais foram ultracongeladas em nitrogênio líquido e foram usadas em aplicações posteriores.
[091] A imunoterapia celular ativa foi administrada a cada 4-6 semanas em ciclos alternados com quimioterapia tradicional com docetaxel e isolada (depois do final do tratamento com docetaxel) por um período de um ano. A quimioimunoterapia combinada levou à estabilização da doença, à redução na intensidade de metástases na medula óssea e a uma sobrevida maior que a esperada. O paciente hoje continua vivo há mais de três anos, em comparação com a sobrevida esperada de 6 meses no início da terapia. Exemplo 7 Experiência in vitro mostrando a superioridade de células tumorais mortas por HHP versus células tumorais mortas por UV
[092] Nas experiências in vitro a capacidade de células dendríticas imaturas, células dendríticas maduras ativadas com poli I:C, e células dendríticas carregadas com células tumorais que ou foram tratadas com HHP ou foram irradiadas com UV foi verificada em termos de sua capacidade para induzir imunidade específica para tumor. A imunidade específica para tumor foi medida como a percentagem de linfócitos de células T específicas de tumores.
[093] Células dendríticas com células tumorais mortas por HHP foram diretamente comparadas com células tumorais mortas por HHP isoladas e células dendríticas carregadas com células tumorais mortas por radiação UV. Os resultados das experiências estão mostrados na Figura 7.
[094] Para testar a capacidade para induzir células T específicas de tumores não pulsadas ou carregadas com células tumorais células dendríticas foram adicionadas as células T autólogas a uma proporção de 1:10 nos dias 0 e 7 de cultura. 25-50 unidades internationais/mL de IL2 (PeproTech) foram adicionados à cultura nos dias 2 e 7. As culturas foram testadas quanto à presença de células T específicas de tumores 7-9 dias depois da última estimulação com DCs. A indução de células T produtoras de (IFN)-Y e reativas com o tumor de células T reativas com o antígeno específico de próstata (PSA) por DCs carregadas com tumor foi determinada por citometria de fluxo. As células T foram coloridas com CD8/IFN-Y anti-humano.
[095] A indução de células T específicas de antígeno específico de próstata (PSA) por células dendríticas carregadas com células tumorais mortas por alta pressão hidrostática (LNCap) é comparada com células tumorais mortas por alta pressão hidrostática isoladas e com células dendríticas carregadas com células tumorais mortas por radiação UV.
[096] Os resultados das experiências estão mostrados na Figura 7. A parte superior da Figura 7 mostra que DCs carregadas células tumorais mortas com HHP podem induzir células T específicas de tumores mesmo na ausência de um sinal de maturação. DCs carregadas com células tumorais mortas por tratamento com UV ou células tumorais mortas com HHP isoladas não induzem imunidade a tumor. É surpreendente o fato de que apenas células tumorais tratadas com HHP (de acordo com a invenção) e células dendríticas imaturas podem induzir resposta imune específica para tumor ao passo que este resultado não pode ser obtido com células tumorais tratadas com UV e com células dendríticas imaturas. Sem ater a alguma teoria parece que somente as células tumorais tratadas com HHP podem junto com células dendríticas imaturas induzir a resposta imune de células T específicas de tumores. As células tumorais tratadas com HHP parecem agir como um tipo de ativador das células dendríticas imaturas ao passo que as células tumorais tratadas com UV não apresentam este efeito.
[097] A parte inferior da Figura 7 mostra quando tratamento com Poli I:C é aplicado as células tumorais tratadas com HHP podem induzir linfócitos de células T específicas melhor que células tumorais irradiadas com UV. Exemplo 8 Dados in vivo obtidos com a vacina de células tumorais de acordo com a presente invenção
[098] Células dendríticas foram adquiridas de uma coorte de pacientes similares àqueles descritos acima. As células dendríticas foram pulsadas com células tumorais mortas como descrito acima e a vacina de células tumorais foi administrada várias vezes em até 12 doses em intervalos de 4-6 semanas a pacientes com uma recidiva bioquímica de câncer de próstata depois de prostatectomia radical ou radioterapia. A evolução da doença em cada paciente individual foi avaliada pelo tempo de duplicação de PSA. Por tempo de duplicação de PSA entende-se o período de tempo que é necessário para o valor de PSA duplicar. Já foi mostrado que o tempo de duplicação de PSA é o determinante mais forte e mais confiável da sobrevida em geral e da sobrevida sem metástase em homens com câncer de próstata. Um tempo de duplicação de PSA curto está correlacionado com uma sobrevida encurtada e com um tempo encurtado para o aparecimento de metástase (Antonarakis et al., BJU Int., 2012, 108(3); páginas 378385).
[099] Como mostrado na Figura 9 a administração contínua da vacina de células tumorais de acordo com a presente invenção em pacientes com recidiva bioquímica de câncer de próstata depois de prostatectomia radical ou radioterapia leva a um significativo aumento do tempo de duplicação de PSA. Foi constatado que o uso da vacina de células tumorais divulgada nesta invenção significa aumentos da vacina de células tumorais de 5 meses antes do início da imunoterapia contra o câncer para 30 meses depois de 12 meses de imunoterapia. Isto representa um benefício significativo para pacientes com recidiva bioquímica de câncer de próstata. Exemplo 9 Ensaio clínico com pacientes no estágio avançado de câncer de próstata
[0100] Neste ensaio clínico células dendríticas foram pulsadas com células tumorais mortas como descrito neste relatório. A vacina de células tumorais foi administrada várias vezes a pacientes em um estágio avançado de câncer de próstata. Os referidos pacientes sofriam de câncer de próstata metastático resistente à castração. Nesses pacientes, a imunoterapia contra o câncer foi administrada em um programa de dosagem alternada com quimioterapia com docetaxel.
[0101] A sobrevida da coorte tratada foi comparada com a coorte histórica ou com a sobrevida estimada pelo nomograma de Halabi. Ficou demonstrado que a administração contínua de imunoterapia ativa contra o câncer prolonga significativamente o tempo de sobrevida dos pacientes tratados (sobrevida média de 23 meses) em comparação com a coorte dos controles históricos baseados na sobrevida esperada calculada pelo nomograma de Halabi (13 meses).
[0102] Esta experiência prova que a vacina de células tumorais da presente invenção aumenta substancialmente o tempo de sobrevida de pacientes que estão em um estágio avançado do câncer de próstata. A expectativa de sobrevida média de tais pacientes é de 13 meses sem o tratamento em comparação com 23 meses depois de tratamento com a vacina de células tumorais de acordo com a presente invenção. Isto representa um aprimoramento substancial para aqueles pacientes que são extremamente difíceis de serem medicados com sucesso.
Claims (2)
1. Uso de células dendríticas imaturas carregadas com células tumorais apoptóticas, caracterizado por ser para a preparação de uma vacina tumoral, em que as referidas células dendríticas imaturas e células tumorais são isoladas do paciente, em que as referidas células tumorais são convertidas para um estágio apoptótico por tratamento por 10 minutos a 2 horas com alta pressão hidrostática igual ou superior a 100 MPa, e em que as células dendríticas são amadurecidas.
2. Uso de células dendríticas imaturas carregadas com células tumorais apoptóticas, caracterizado por ser para a preparação de uma vacina tumoral, em que as referidas células dendríticas imaturas são do paciente, em que as referidas células tumorais são de uma linhagem celular tumoral e são convertidas em um estágio apoptótico por tratamento por 10 minutos a 2 horas com alta pressão hidrostática igual ou superior a 100 MPa, e em que as células dendríticas são opcionalmente amadurecidas.
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