BRPI0803471A2 - vacina de células hìbridas dendrìticas-tumorais para o tratamento de melanoma - Google Patents

Abstract

Idealizada a fim de ser usada no combate ao melanoma recidivado ou metastático, caracterizada por ser constituída por uma composição compreendendo células apresentadoras de antígeno dendríticas, obtidas de frações concentradas de leucócitos mononucleares que são coletadas de doadores saudáveis, onde as células mononucleares são separadas, sendo lavadas e ressuspensas, onde as células não aderidas (linfócitos) são removidas e as células aderidas (monócitos) são adicionadas a citocinas que induzem a diferenciação de células mononucleares periféricas em células dendríticas, sendo estas pulsadas in vitro e fundidas a células tumorais, cujas células, produto desta fusão, são irradiadas e utilizadas como vacina para aplicação via intradérmica em pacientes com melanoma, com objetivo de indução anti-tumoral do sistema imune.

Description

"VACINA DE CÉLULAS HÍBRIDAS DENDRÍTICAS-TUMORAIS PARA OTRATAMENTO DE MELANOMA"

O presente relatório descritivo referente a um pedido dePrivilégio de Invenção para "VACINA DE CÉLULAS HÍBRIDASDENDRÍTICAS-TUMORAIS PARA O TRATAMENTO DE MELANOMA"inédita e revolucionária, a qual tem por finalidade ser usada no combate aomelanoma recidivado ou metastático, tratando-se de uma vacina a ser usadapor via intradérmica, visando a recuperação da atividade do sistema imune, ouseja, com objetivo de indução anti-tumoral do sistema imune, agregado aausência de reações adversas significativas, atendendo assim as atuaisnecessidades e exigências.

Como é sabido, o melanoma é um tipo de câncer de pele debaixa incidência, porém de elevada letalidade. Segundo o INCA (2007) estãoprevistos 5.920 novos casos em 2008, somente no Brasil. O prognóstico dessetipo de câncer pode ser considerado bom, se detectado nos estádios iniciais.Nos países desenvolvidos, a sobrevida média estimada em cinco anos é de73% enquanto que para os países desenvolvimiento, a sobrevida media e de 56%. A média mundial estimada é de 69%. A cirurgia é o tratamento maisindicado, mas a radioterapia e a quimioterapia também podem ser utilizadasdependendo do estágio do câncer. Quando há metástase, o melanoma éincurável na maioria dos casos.

Protocolos clínicos utilizando células dendríticas (DC) têm sidoamplamente explorados para tratamento de diversos tipos de câncer (Mosca etal., 2007; Osada et al., 2006; Gilboa, 2007). Células dendríticas (DC) sãopotentes apresentadoras de antígeno capazes de induzir resposta imuneprimária. Têm capacidade de atração e estimulação de células efetoras daimunidade, incluindo células T, B, NKT e NK. Derivam de várias célulasprogenitoras mielóides e linfóides. DC imaturas situam-se no sistema não-linfóide periférico onde capturam e processam antígenos que serãoapresentados por moléculas do sistema HLA de classe II. A captura deantígenos associada aos sinais de ativação induz a maturação das DC quesofrem alterações morfológicas e funcionais, regulando moléculas de adesãoco-estimulatórias como CD80, CD86, CD54, CD58 e CD40. Depois decarregadas, migram pelos vasos linfáticos aferentes aos linfonodos, ondeinteragem com as células T. O primeiro passo é a interação entre o receptor T eo peptídeo apresentado no contexto HLA. O segundo é a expressão e liberaçãode fatores co-estimulatórios pelas DC que interagem com os receptoresespecíficos das células T. Este processo desencadeia a ativação, expansão ediferenciação de células T (Fujii S et al. 2004).

As estratégias de vacinação são múltiplas, desde a fusão de DCcom extratos tumorais totais até a introdução de RNA específicos expressospelo tumor. Esta abordagem mais específica tem a desvantagem de permitir umescape de populações tumorais que regulem negativamente o antígeno queestá servindo como alvo. O uso de extratos totais tem como desvantagem anecessidade de obtenção de células tumorais dos pacientes individuais,limitando as indicações do tratamento. Existem ainda variações nas fontes deDC, grau de maturação, antígenos utilizados, via de administração, número dedoses, intervalo entre-as mesmas e uso de adjuvantesT Como resultadoscomuns relatam a indução de resposta imune antígeno-específica e pequenastaxas de resposta.

O melanoma é considerado um modelo para desenvolvimentode vacinas anti-tumorais devido a sua conhecida imunogenicidade. Diversosprotocolos clínicos utilizando células dendríticas para tratamento do melanomaforam concluídos ou estão em andamento. Grande parte das estratégias utilizouantígenos expressos neste tipo de neoplasia incluindo MART-1, gplOO, gp75,MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE, tirosinase, GM2 and GD2 (Hemmila et al.,1999). Dentre eles, um estudo fase I administrou, via intravenosa, DCsderivadas de pacientes com melanoma pulsadas com os peptídeos tirosinase egplOO (Lau et al., 2001). Dos 16 pacientes vacinados, um apresentou remissãocompleta da doença metastática, dois tiveram estabilização da doença e doisapresentaram resposta mista. Em outro estudo, DCs obtidas de precursoresCD34+ foram pulsadas com peptídeos derivados de Melan-A/MART-1,tirosinase, MAGE-3 e gplOO, bem como antígenos controle (influenza matrixpeptide, Flu-MP, e keyhole limpet hemocyanin, KLH), e administradas viasubcutânea em 18 pacientes (Banchereau et al., 2001). Uma resposta imunefoi gerada contra os antígenos controle em 16/18 pacientes. Dez dentre essespacientes exibiram respostas a mais de dois antígenos de melanoma, e 7tiveram regressão da doença metastática. A sobrevida livre de doença foi emmedia 7 meses. Acompanhamento dos pacientes realizado em 2005 (Fay et al.,2006), constatou que 4 pacientes ainda estavam vivos, 3 deles sem nenhumaterapia adicional desde o término do estudo. Dois pacientes desenvolverammetástase solitária em linfonodo e um no fígado. A análise mostrou que ospacientes com sobrevida mais longa foram os que desenvolveram imunidadepeptídeo-específica a pelo menos dois peptídeos. Mais recentemente, outraestratégia de vacinação utilizando DC e células tumorais autólogas acarretouem resposta clínica objetiva em pacientes com melanoma metastático (estágioIV). Dentre os 46 pacientes analisados, 3 tiveram remissão completa e 3tiveram resposta clínica parcial (0'Rourke et al, 2007). Adicionalmente, umestudo fase -I/H utilizou DCs transfectadas com mRNA tumoral para tratamentode pacientes com melanoma metastático. A vacina se mostrou segura epromoveu resposta de células T em aproximadamente 50% (9/19) dospacientes avaliados. Nenhum efeito colateral grave foi observado e ospercentuais de resposta foram maiores nos pacientes que receberam vacinaçãointradérmica comparado com a injeção intranodal (Kyte and Gaudernack,2006).

Os precursores mais comumente utilizados na diferenciação decélulas dendríticas in vitro são as células mononucleares periféricas. Em geralsão isolados monócitos aderentes CD14+ e se transformam em DC, através daadição de fator estimulador de formação de colônias de macrófagos egranulócitos (GM-CSF) e IL-4. Para maturação das DCs se faz necessário aadição de estímulos inflamatórios tais como: lipopolissacarídeo (LPS), fator denecrose tumoral (TNF) e alguns coquetéis mais completos que combinam TNF-a com prostaglandina E2, IL-1(3 e IL-6 (Nestlé FO et al. 2005). As diferenças nostatus de maturação têm grande impacto na indução de resposta. Acredita-seque a DC imatura é inferior na indução da resposta imune, principalmente nacapacidade estimulatoria de células T além da DC madura ter maior capacidadede migração aos órgãos linfóides.

Diversos expedientes alternativos foram desenvolvidosbuscando contornar tais problemas específicos, sendo todos amplamenteutilizados no estado da técnica.

Foi pensando em atender esses requisitos, que após inúmeraspesquisas e resultados de diversos e repetidos estudos, desenvolveu-se oobjeto da presente patente, buscando sanar tais problemas e proporcionar umasolução tecnicamente correta e funcional, que em linhas gerais e de forma bemresumida, a "VACINA DE CÉLULAS HÍBRIDAS DENDRÍTICAS-TUMORAISPARA O TRATAMENTO DE MELANOMA" objeto desta invenção, consisteessencialmente em uma composição compreendendo células dendriticasapresentadoras de antígeno, fundidas a células tumorais para aplicação empacientes com melanoma recidivado ou metastático, com objetivo de induçãoanti-tumoral do sistema imune, a ser aplicada por via intradérmica,desenvolvidade forma prática e com baixo custo de exeqüibilidade industrial, porém aliadosaos requisitos segurança e praticidade utilitária.

Um dos principais objetivos do desenvolvimento da presenteinvenção é obter uma vacina eficaz visando a recuperação da atividade dosistema imune do paciente portador de melanoma, seja ele recidivado oumetastático, com ausência de reações adversas significativas.

Um outro objetivo da presente invenção é a obtenção de umavacina para o tratamento de melanoma que promova em sua grade maioria dospacientes por ela tratados, a melhora ou a estabilização da doença.

Constitui-se, portanto, a presente Patente de Invenção"VACINA DE CÉLULAS HÍBRIDAS DENDRÍTICAS-TUMORAIS PARA OTRATAMENTO DE MELANOMA", no intuito de atingir os objetivos acimamencionados e de oferecer grande confiabilidade, visando deste modo aobtenção de uma vacina de características funcionais verdadeiramenteinovadoras e de grande desempenho, proporcionando grandes melhorias,promovendo-se e personalizando-se por ser totalmente distinta do estado datécnica.

Contudo para melhor entender e elucidar segue uma descriçãodetalhada da presente Patente de Invenção "VACINA DE CÉLULASHÍBRIDAS DENDRÍTICAS-TUMORAIS PARA O TRATAMENTO DEMELANOMA", sendo que:

O nosso grupo tratou 13 pacientes portadores melanomametastático em fase de progressão. Doses de vacinas híbridas de célulastumorais totais-células dendríticas foram aplicadas a cada seis semanas, por viaintradérmica. De 11 pacientes que receberam duas doses ou mais,demonstramos 72,7% de estabilização de doença (8/11) com mediana de 5,6meses de tempo livre de progressão. Três pacientes apresentaram progressãoda doença e nenhum apresentou resposta objetiva. A recuperação da atividadedo sistema imune, apesar de variável, aconteceu em todos os pacientes, comausência de reações adversas significativas.

"VACINA DE CÉLULAS HÍBRIDAS DENDRÍTICAS-TUMORAIS PARA O TRATAMENTO DE MELANOMA", ora pleiteada,constitui-se através das seguintes etapas e metodologias usadas:

1 - Cultura de células dendríticas.

Frações concentradas de leucócitos mononucleares foramcoletadas de doadores saudáveis por aférese realizada no Cobe Spectra BloodCell Separator 7.0 (Cobe, Lakewood, CO, USA), após consentimento informadodo doador. As células mononucleares foram separadas por centrifugação emgradiente de densidade (Ficoll-Paque 1,077 g/dl), lavadas três vezes com meioRPMI 1640 (mistura de sais enriquecidos com aminoácidos, vitaminas e outrocomponentes essenciais para o crescimento celular) e ressuspensas em AIM-V(reagente para extração de DNA genômico)numa densidade de l,3xl07 cel/mL.Após 2 h de incubação a 37°C numa atmosfera úmida contendo 5% de CCb, ascélulas não aderidas (linfócitos) foram removidas. As células aderidas(monócitos) foram adicionadas as citocinas GM-CSF(fator estimulador decolônia granulócito macrófago) e IL-4, na concentração final de 50 ng/mL, ououtra citocina qualquer que induza a diferenciação de células mononuclearesperiféricas em células dendríticas. Após 5 dias de cultivo a 37°C foi adicionadoTNF-a (50ng/ml_) para maturação das DC. Após o 7o dia de cultivo as célulasforam recuperadas e utilizadas para preparação da vacina.

2 - Testes de hipersensibilidade tardia

Os pacientes submetidos a este protocolo de vacinação foramavaliados imunologicamente, quanto à sua resposta imune celular antes edurante o tratamento. Testes cutâneos de hipersensibilidade tardia a umabateria de antígenos padrão (PPD, candidina, histoplasmina, tricofitina) foramrealizados antes do tratamento, e após 12 semanas da primeira dose. Osdiâmetros de eritema e induração foram registrados.

3 - Resposta linfocitáría ao tumor in vitro

Para avaliação da resposta proliferativa ao tumor, sangue foicoletado dos pacientes antes de cada vacinação. As PBMC foram separadas emgradiente de densidade de Ficol e utilizados em reações mistas de linfócitoscontra DCs, células tumorais autólogas, misturas contendo DC e tumor e célulashíbridas dendríticas-tumorais. Células foram cultivadas por 5 dias em meioRPMI-1640 enriquecido com 10% de SFB, em estufa controlada a 37°C e 5% deCO2. A resposta proliferativa foi avaliada através da redução de MTT.

4 - Preparação da suspensão de células tumoraisFragmentos tumorais foram obtidos em condições estéreis logoapós a ressecção tumoral. Estes fragmentos foram colocados imediatamenteem meio de cultura estéril (RPMI-1640), contendo antibióticos e antimicóticos,e transportados ao laboratório. No laboratório os espécimes tumorais foramfragmentados, com uso de bisturi, em fragmentos de, no máximo, 1 mm3. Eestes, então, submetidos à digestão por colagenase (tipo VIII, 0,56 mg/mL) eDNase (tipo IV, 0,026 mg/mL) em 10 ml_ de meio RPMI-1640 por grama detecido (a 37° C). As suspensões celulares, assim obtidas, foram filtradas emgaze para remoção dos restos teciduais e lavadas com RPMI-1640 porcentrifugação (150g/10 min/4°C). As células viáveis foram quantificadas porexclusão em azul de tripan, ressuspensas em meio de congelamento (60% deRPMI 1640, 30% de SFB e 10% de DMSO) e armazenadas em nitrogêniolíquido até a hora do uso.

5 -Avaliação da eficiência de geração de PC

Para avaliação fenotípica das DCs, as células foram marcadascom anticorpos monoclonais comerciais contra os seguintes marcadores: HLA-ABC, HLA-DR, CDla, CD14, CD80, CD86 e CD83, e analisadas em citômetro defluxo FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). No mínimo 10.000eventos por anticorpo foram adquiridos e analisados com o software CelIQuest(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA).

6 - Preparação de células híbridas para vacinação

Células tumorais e dendríticas, obtidas como acima descrito,foram lavadas e ressuspendidas numa solução de glicose 5% paraconcentração de lX107/ml_. Volumes iguais das duas suspensões celularesforam misturados e transferidos para cubeta de eletroporação, previamente,preparada pela aplicação, em uma de suas faces de uma gota de ceradielétrica. A seguir, as células foram submetidas a um pulso elétrico de 1.000V/cm, gerados por um eletroporador Gene-Pulser II (Biorad, Richmond, CA,USA), a partir de um capacitor de 25 uF. As células, produto desta fusão, foramirradiadas (200 Gy) e utilizadas como vacina, sem outros procedimentos depurificação.

A eficácia da fusão variou entre 15-30% conforme testes pilotosutilizando marcadores fluorescentes para tumor e DC (CellTracker green andred; Molecular Probes, Invitrogen). Os híbridos apresentando dupla marcaçãoforam quantificados em citômetro de fluxo.

7 - Protocolo de vacinação

Os pacientes receberam as doses por via intradérmica noantebraço. O intervalo entre as vacinações foi de 6 semanas. Paraacompanhamento dos pacientes, exames clínicos e de imagem foram realizadosantes do inicio do tratamento e no 6o após a Ia dose da vacina. Dentre eles,ressonância magnética do cérebro, tomografia de tórax, abdômen, pelve, entreoutros foram utilizados para buscar recidiva ou metastases. Após estas duasprimeiras avaliações, os pacientes foram clinicamente monitoradosmensalmente e os exames de imagem repetidos semestralmente.

8 -Avaliação da resposta e toxicidade

Progressão da doença foi definida como 25% de aumento daslesões mensuráveis e/ou aparecimento de novas lesões, doença estávelconsiderou lesões mensuráveis com redução menor que 50% ou menos que25% de aumento das suas dimensões. Decréscimo de 50% foi classificadocomo resposta parcial e desaparecimento completo da lesão como, respostaclínica completa. A toxicidade ao tratamento foi avaliada conforme os critériosdo Instituto de Câncer dos Estados Unidos (National Câncer Institute ToxicityCriteria).

Resultados obtidos

As vacinas foram usadas inicialmente no tratamento de 13pacientes portadores de melanoma. Os resultados mostraram ausência dereações adversas significativas após aplicação da vacina (cada paciente recebeuum número médio de 4,7 doses). Observou-se também que 72,7% (8/11) dospacientes apresentaram estabilização da doença igual ou superior a 3 meses,após duas doses da vacina. O tempo médio de estabilização da doença foi de 5,6 meses.

Segue tabela referente a avaliação da resposta clínica apósvacinação com células híbridas dendríticas-tumorais.

<table>table see original document page 9</column></row><table>

A resposta imunológica dos pacientes tratados com a vacina foiestudada antes e durante o tratamento através de testes cutâneos dehipersensibilidade tardia a uma bateria de antígenos padrão (PPD, candidina,histoplasmina, tricofitina) e avaliação da resposta proliferativa de linfócitosestimulada pelo tumor antes de cada vacinação.Contudo para melhor entender e elucidar a descrição detalhadasão apresentados em anexo os gráficos ilustrativos, de modo que:

-A Figurai: Evolução da resposta linfocitária ao longo davacinação.

- A Figura 2: Relação da presença de hipersensibilidade tardia(DTH) com o tempo de progressão da doença(TPD).

Conforme apresentado na Figura 1, células mononuclearesforam isoladas do sangue periférico e coletadas antes de cada vacinação. Aestimulação dos linfócitos em resposta a incubação com o tumor foi calculadacom base na redução de MTT. A vacina promoveu uma recuperaçãoimunológica dos pacientes uma vez que o reconhecimento do tumor peloslinfócitos aumentou com o número de doses recebidas.

Conforme apresentado na Figura 2, pacientes foramsubmetidos a um teste contendo três antígenos (PPD, candidina e tricofitina)antes e após duas doses da vacina com células híbridas. Pacientes positivos aao menos um antígeno antes da vacinação apresentaram tempos paraprogressão da doença mais longos.

Em continuação ao estudo avaliamos 18 pacientes commelanoma através de questionários de qualidade de vida durante o tratamentocom a vacina. Análise dos dados mostrou que 6,6% dos pacientesapresentaram progressão da doença e deterioração clínica, 6,6% melhoraram e86.6% tiveram estabilização da doença.

Tratou-se no presente relatório descritivo de uma novaconcepção em "VACINA DE CÉLULAS HÍBRIDAS DENDRÍTICAS-TUMORAIS PARA O TRATAMENTO DE MELANOMA", apresentandoconforme podemos evidenciar, pela análise realizada e pelas figuras mostradas,inúmeras vantagens em função das diferenças sobre os métodos convencionaisexistentes e utilizados, além de características técnicas construtivas e funcionaiscompletamente novas perante o estado da técnica.

Tendo, portanto, sido descrita e ilustrada a melhor forma derealização atualmente contemplada para a concretização da presente invenção,inúmeras modificações e variações em sua forma de realização, poderão serprontamente introduzidas por aqueles versados na técnica. No entanto, é paraser compreendido que, a presente invenção não está limitada aos aspectospráticos da realização atualmente preferida ilustrada e descrita, e que todas etais modificações e variações devem ser consideradas como estandoenglobadas dentro do espírito e escopo da invenção.

Pelas vantagens que oferece e ainda por revestir-se decaracterísticas técnicas verdadeiramente inovadoras, preenchem todos osrequisitos de originalidade e novidade no gênero, reunindo assim condiçõesnecessárias para merecer o Privilégio de Invenção.

Claims (8)

1."VACINA DE CÉLULAS HÍBRIDAS DENDRÍTICAS-TUMORAIS PARAO TRATAMENTO DE MELANOMA", caracterizada por ser constituída poruma composição compreendendo células apresentadoras de antígeno,fundidas a células tumorais para aplicação em pacientes com melanomarecidivado ou metastático, com objetivo de indução anti-tumoral do sistemaimune, a ser aplicada por via intradérmica.

2."VACINA DE CÉLULAS HÍBRIDAS DENDRÍTICAS-TUMORAIS PARAO TRATAMENTO DE MELANOMA", de acordo com a reivindicação 1,caracterizada por ser constituída por células apresentadoras de antígeno asquais são células dendríticas.

3."VACINA DE CÉLULAS HÍBRIDAS DENDRÍTICAS-TUMORAIS PARAO TRATAMENTO DE MELANOMA", de acordo com a reivindicação 1,caracterizada por ser constituída por células apresentadoras de antígenoque foram pulsadas in vitro com células tumorais e fundidas as mesmas,cujas células obtidas são irradiadas e utilizadas como vacina para aplicaçãovia intradérmica em pacientes com melanoma.

4."VACINA DE CÉLULAS HÍBRIDAS DENDRÍTICAS-TUMORAIS PARAO TRATAMENTO DE MELANOMA", de acordo com a reivindicação 1,caracterizada por ser constituída pela cultura de células dendríticas, em quefrações concentradas de leucócitos mononucleares são coletadas dedoadores saudáveis por aférese, onde as células mononucleares sãoseparadas por centrifugação em gradiente de densidade, sendo lavadascom meio RPMI 1640 (mistura de sais enriquecidos com aminoácidos,vitaminas e outro componentes essenciais para o crescimento celular) eressuspensas em AIM-V (reagente para extração de DNA genômico), ondeas células não aderidas (linfócitos) foram removidas e as célulasaderidas(monócitos) foram adicionadas as citocinas GM-CSF(fatorestimulador de colônia granulócito macrófago) e IL-4, ou outra citocinaqualquer que induza a diferenciação de células mononucleares periféricasem células dendríticas.

5. - "VACINA DE CÉLULAS HÍBRIDAS DENDRÍTICAS-TUMORAIS PARAO TRATAMENTO DE MELANOMA", de acordo com a reivindicação 1,caracterizada por ser constituída por uma composição onde a respostaimunológica compreenda células T, TRT-anticorpo específica e TRT-citotóxica específica.

6. - "VACINA DE CÉLULAS HÍBRIDAS DENDRÍTICAS-TUMORAIS PARAO TRATAMENTO DE MELANOMA" de acordo com a reivindicação 1,caracterizada por ser constituída uma composição que promove aimunidade T em um indivíduo contra alvos tumorais específicos.

7. - "VACINA DE CÉLULAS HÍBRIDAS DENDRÍTICAS-TUMORAIS PARAO TRATAMENTO DE MELANOMA", de acordo com as reivindicações 1 e 4, caracterizada por ser constituída por uma composição onde seu métodode preparação compreenda o isolamento de leucócitos mononucleares dosangue periférico, posteriormente submetidos a cultura e citocinas paradiferenciação.

8. - "VACINA DE CÉLULAS HÍBRIDAS DENDRÍTICAS-TUMORAIS PARAO TRATAMENTO DE MELANOMA", de acordo com as reivindicações 1, 4e 6, caracterizada por ser constituída por uma composição cuja célulaapresentadora de antígeno é dendrítica e é pulsada ex-vivo com célulastumorais.