JP2015516374A - 活性化された免疫刺激細胞組成物およびその使用 - Google Patents
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Abstract
活性化された免疫刺激細胞組成物を作製する方法、活性化された免疫刺激細胞組成物、および腫瘍に対する治療上免疫応答を刺激するために、これらの組成物を使用する方法が記載される。【選択図】 図1
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2012年3月15日に出願した米国仮特許出願第61/611,202号の利益を主張するものであり、これは参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、2012年3月15日に出願した米国仮特許出願第61/611,202号の利益を主張するものであり、これは参照により本明細書に組み込まれる。
発明の説明
本発明は、活性化された免疫刺激細胞組成物、これらの組成物を調製する方法、および癌等の免疫刺激から恩恵を受け得る状態を治療するためのこれらの組成物の使用に関する。
本発明は、活性化された免疫刺激細胞組成物、これらの組成物を調製する方法、および癌等の免疫刺激から恩恵を受け得る状態を治療するためのこれらの組成物の使用に関する。
多くの腫瘍は、腫瘍特異性および腫瘍関連抗原を有する。腫瘍特異性抗原(TSA)は、腫瘍上に独自に発現するが、正常細胞上には存在せず、一方、腫瘍関連抗原(TAA)は、正常細胞上よりも腫瘍上でより高いレベルで発現する(Wang,RF 2002)。腫瘍抗原は、腫瘍細胞内で小さなペプチドに切断され、ヒト白血球抗原(HLAクラスI、例えばHLA A、B、またはC)とも呼ばれるクラスIの主要組織適合性分子(MHCクラスI)を有する複合体として免疫細胞に提示される。MHCクラスI−腫瘍ペプチド複合体は、CD8+T細胞である、細胞毒性Tリンパ球(CTL)のT細胞受容体(TCR)複合体によって認識される。TCRとMHC I−腫瘍ペプチド複合体との相互作用は、腫瘍細胞を破壊するCTLからの物質(パーフォリン、グランザイム、およびグラニュリシン)の放出を生じる(Mami−Chouaib F,2002)。CTLはまた、(FAS受容体を通じて)死シグナルまたはアポトーシスシグナルを腫瘍細胞に送信する(Wu JY 2006)。
初期CTL応答は、存続時間が短く、継続するために、CD4+Tヘルパー(Th)リンパ球からの増幅支持を必要とする。Th細胞の分化および増殖は、マクロファージまたは間質樹状細胞(DC)等のプロフェッショナル抗原提示細胞(APC)との相互作用を通して生じる(Wang RF.2002)。APCは、腫瘍抗原またはアポトーシス腫瘍細胞を取り込み、それらを小さなペプチドに切断することによって、これらの抗原を処理し、次いで、ナイーブT細胞に対してペプチドを提示する。この処理は、MHCクラスI+ペプチドによるCTLの刺激と同様であるが、CD4+T細胞は、MHCクラスII(例えば、HLA−DR)に関連して提示されるペプチドを認識する。TCRによるMHCクラスII−ペプチド複合体を認識すると、T細胞は、Th機能を得、持続した免疫のために、CTL応答を増幅し、T記憶細胞の成長を次に誘発するサイトカインのIL−2を産生する(Keene JA,1982、Fujiwara,H,1986)。
T細胞の刺激は、少なくとも2つのステップで生じると考えられる(Marelli−Berg FM,2007、Chambers CA 2001)。第1のステップ(シグナル1)では、MHC/ペプチド複合体が、TCRと相互作用する。このステップは、T細胞を完全に刺激するのに十分ではない。それどころか、APCが発現している共刺激分子(CD86、CD83、CD80、およびCD40等)のうちの1つとT細胞上の対応するリガンド(シグナル2)との第2の相互作用が必要とされる。シグナル2の不在下で、シグナル1を受容するT細胞は、ヘルパー機能を得ることができない(Chappert & Schwartz,2010)。
ナイーブTヘルパー細胞とDC等のAPCとの相互作用は、Th細胞をTh1およびTh2サブセットに分極し、これらのサブセットは、それらが生成するサイトカインのパターンによって異なる。Th1細胞は、CTLの増殖を活性化し、腫瘍拒絶を引き起こすインターフェロンおよびIL−2等のサイトカインを産生する。Th2細胞は、サイトカインであるIL−4、IL−6、IL−10、およびIL−13を産生する。Th2サイトカインのレベルの増加は、不良な臨床予後を有する癌患者の血清中に見出される。
Th細胞と同様に、単球/マクロファージの表現型は、Th1/Th2サイトカイン間の平衡によって異なるプロセスにおいて分極する。これらの分極した細胞に対する術語は、Th1およびTh2の術語によく似ており、Th1およびTh2 T細胞と同様に、M1およびM2マクロファージは、異なるパターンのサイトカインを産生する。M1マクロファージは、主に、IL−12、IL−23、TNFα、IL−1、IL−6を産生し、一方、M2マクロファージは、高いレベルのIL−10およびIL−13を産生する(Cassetta L,2011)。M1マクロファージはまた、高いレベルのHLA−DRを発現し、一方、M2マクロファージは、高いレベルのCD163抗原を発現する。完全に分極したM1およびM2マクロファージは、一連の機能的状態の両極端である。とりわけ、腫瘍組織を浸潤させるマクロファージは、腫瘍環境によって引き起こされ、腫瘍成長および進行を促進するために、適応免疫および炎症性回路の破壊において重要な役割を担う分極したM2表現型を得る。対照的に、M1マクロファージは、抗腫瘍効果を引き起こす。
末梢血単球から分化するとも考えられる別のAPCが、骨髄樹状細胞(DC)である。成熟した活性化されたDCは、非常に効力の強いAPCである。DCの成熟は、MHC分子、共刺激分子(CD86、CD83 CD80、CD40)(Tuyaerts S,2007)、CD11b、CD11c、およびCD54等の接着分子、ならびにケモカイン受容体CCR7(Alvarez D,2008)の上方調節と関連がある。後者は、血管壁を通って末梢組織からT細胞領域にDCを移動させることができる(Forster R,2008)。DCの成熟は、T細胞の刺激に関連する分子の発現を確実にするだけでなく、DCがナイーブT細胞に対して抗原を提示することができるように、二次リンパ器官中の適切な解剖学的なコンパートメントに達することが可能である。T細胞からの同族シグナルは、DCをさらに活性化する(Cavanagh LL,2002)。
成熟骨髄DCは、IL−12を作製するそれらの能力を特徴とする(Mariotti S,2008)。IL−12がTh1分極を促進するため、IL−12を産生するDCが癌ワクチン開発に使用される(Trinchieri G:2003)。
上記の適応できる抗原特異的な免疫応答を刺激することに加えて、DCはまた、いくつかの抗腫瘍細胞型を刺激することを含む、先天性(MHC無制限の)免疫を刺激することにも関与する。これらの細胞は、TCR(CD3−/CD56+細胞)およびサイトカインで誘発されたキラーT細胞(CD3+/CD56+)を発現しない、古典的なナチュラルキラー細胞(NK細胞)を含む。NK細胞は、パーフォリン−グランザイム経路を介して、またはFasリガンド等の死受容体リガンドを発現することによって、腫瘍細胞のアポトーシスを直接誘発することができる(Bryceson YT,2011)。IL−12を産生するDCは、NK細胞の増殖を誘発させることができる(Walzer T,2005)。NK細胞はまた、DCの分化を促進するサイトカインを放出する(Ferlazzo G,2009)。
それ故に、成熟DCは、有効な適応できる(T細胞)および先天性(NK、NKT細胞)の両方の抗腫瘍の免疫応答を生じるのに重要な細胞型である。実際には、多くの研究が、様々な腫瘍型のための治療法としてDC系ワクチンの適用に着目し、一部の臨床試験が、進行中である。活性化されたサイトカイン、抗原パルスDCを使用した転移性黒色腫のためのDC系ワクチンは、特に、期待できる結果を示している(例えば、Cornforth,Lee & Dillman,2011)。それにもかかわらず、免疫系の複雑性により、細胞療法が腫瘍細胞溶解をもたらす機能的特性を有することを確認することが重要になる。例えば、未成熟DCは、インビボで腫瘍免疫を刺激するというよりむしろ阻害する可能性がある。したがって、癌療法等の免疫刺激から恩恵を受け得る状態の治療のために、完全に成熟した樹状細胞および他の活性化された免疫細胞を含む組成物の大いなる必要性がある。
ある特定の実施形態の概要
本発明は、活性化された免疫刺激細胞組成物、これらの組成物を調製する方法、および癌等の免疫刺激から恩恵を受け得る状態を治療するためのこれらの組成物の使用に関する。
本発明は、活性化された免疫刺激細胞組成物、これらの組成物を調製する方法、および癌等の免疫刺激から恩恵を受け得る状態を治療するためのこれらの組成物の使用に関する。
したがって、一態様において、本発明は、活性化された免疫刺激細胞組成物を作製するための方法に関し、本方法は、(a)ヒト白血球を活性化する時間および温度の条件下で、この白血球をインキュベートすることと、(b)活性化された白血球を低浸透圧ショックに供することと、(c)等張を回復させるのに有効な量で塩溶液を白血球に添加することと、(d)白血球を支持媒体と混合することと、(e)樹状細胞の成熟を少なくとも誘発する時間、支持媒体中で白血球をインキュベートし、それにより、活性化された免疫刺激組成物を作製することと、を含む。
さらに別の態様において、本発明は、活性化された免疫刺激細胞組成物を作製する方法に関し、本方法は、樹状細胞の成熟を誘発する時間および温度の条件下、支持媒体中で非休止状態の(すなわち、少なくとも部分的に活性化された)白血球をインキュベートし、それによって、活性化された免疫刺激組成物を作製することを含む。
なお別の態様において、本発明は、成熟樹状細胞(DC)を含む組成物を作製するための方法に関し、本方法は、(a)白血球を提供することと、(b)白血球を室温で約8〜20時間維持することによって、白血球を休止状態から活性状態に遷移させることと、(c)白血球を低浸透圧ショックに供することと、(d)支持媒体中でショックさせた白血球を36時間〜14日間インキュベートし、それによって、成熟DCを含む組成物を作製することと、を含む。
本発明のこれらの態様のいくつかの実施形態において、白血球は、支持媒体中で約36〜84時間インキュベートされる。
本発明のこれらの態様のいくつかの実施形態において、白血球は、支持媒体中で約48〜72時間インキュベートされる。
本発明のこれらの態様のいくつかの実施形態において、組成物では、成熟樹状細胞が濃縮されている。
本発明のこれらの態様のいくつかの実施形態において、組成物は、活性化されたリンパ球をさらに含む。
本発明のこれらの態様のいくつかの実施形態において、組成物は、Th1表現型が濃縮されたTヘルパー細胞をさらに含む。
本発明のこれらの態様のいくつかの実施形態において、組成物では、Th1サイトカインが濃縮されている。
本発明のこれらの態様のいくつかの実施形態において、組成物は、M1表現型が濃縮された活性マクロファージをさらに含む。
本発明のこれらの態様のいくつかの実施形態において、組成物では、M1サイトカインが濃縮されている。
本発明のこれらの態様のいくつかの実施形態において、白血球は、末梢血、胎盤血、臍帯血、骨髄、またはリンパ系組織から単離される。
本発明のこれらの態様のいくつかの実施形態において、支持媒体は、血清または血漿である。
本発明のこれらの態様のいくつかの実施形態において、支持媒体は、外因的に添加されたサイトカインまたはインターフェロンを含まない血清または血漿である。
本発明のこれらの態様のいくつかの実施形態において、本方法は、少なくとも1つの腫瘍抗原を支持媒体に添加することをさらに含む。
本発明のこれらの態様のいくつかの実施形態において、成熟DCは、単球上でのレベルよりも高いレベルで、HLA−DR、CD86、CD54、CD40、CD80、CD83、またはCCR7のうちの少なくとも1つを発現する。
本発明のこれらの態様のいくつかの実施形態において、本方法は、支持媒体を除去することと、白血球を生理的に許容される担体中に再懸濁させることと、をさらに含む。
別の態様において、本発明は、無細胞組成物を作製する方法に関し、本方法は、白血球のインキュベーション後に、活性化された免疫刺激組成物を生成するために様々な態様のうちのいずれかに使用される支持媒体を回収し、細胞を除去するステップ、をさらに含む。
別の態様において、本発明は、活性化された免疫刺激組成物を調製する方法のうちのいずれかによって生成された組成物に関し、これには、免疫刺激組成物の無細胞部分が含まれる。
さらに別の態様において、本発明は、成熟樹状細胞、活性化ヘルパーT細胞、細胞溶解性T細胞、および少なくとも1つの他の白血球細胞型を含む、組成物に関する。
本発明のこれらの態様のいくつかの実施形態において、樹状細胞のうちの少なくとも50%は、HLA−DR、CD86、またはCD54のうちの少なくとも1つを発現する。
本発明のこれらの態様のいくつかの実施形態において、樹状細胞のうちの少なくとも5%は、CCR7、CD40、CD80、またはCD83のうちの少なくとも1つを発現する。
本発明のこれらの態様のいくつかの実施形態において、樹状細胞のうちの少なくとも5%は、CD8を発現する。
本発明のこれらの態様のいくつかの実施形態において、本組成物は、少なくとも約5pg/mLのIL−12を含む。
本発明のこれらの態様のいくつかの実施形態において、本組成物は、少なくとも約1500pg/mLのIL−2を含む。
本発明のこれらの態様のいくつかの実施形態において、本組成物は、少なくとも約100pg/mLのIFN−ガンマを含む。
本発明のこれらの態様のいくつかの実施形態において、本組成物では、細胞が枯渇している。
本発明のこれらの態様のいくつかの実施形態において、本組成物(無細胞組成物を含む)は、少なくとも約5pg/mLのIL−12、少なくとも約1500pg/mLのIL−2、少なくとも約100pg/mLのIFN−ガンマ、またはこれらのサイトカインのいずれか2つまたは3つの組み合わせを含む。
一態様において、本発明は、腫瘍を有する対象において、腫瘍細胞の数を減少させる方法に関し、本方法は、この対象に、本発明の組成物を投与することを含み、本組成物は、腫瘍の少なくとも1つの抗原をさらに含む。
同様の態様において、本発明は、腫瘍を有する対象において、腫瘍細胞の数を減少させるために使用する医薬の調製において、本発明の組成物のうちのいずれかの使用に関し、この組成物は、腫瘍の少なくとも1つの抗原をさらに含む。
同様の態様において、本発明は、腫瘍を有する対象において、腫瘍細胞の数を減少させるための本発明の組成物に関し、この組成物は、腫瘍の少なくとも1つの抗原をさらに含む。
別の態様において、本発明は、患者において、腫瘍を安定化または退行させる方法に関し、本方法は、(a)腫瘍に罹患している患者から白血球を回収することと、(b)患者の腫瘍からの抗原を含むが、外因的に添加されたサイトカインまたは成長因子を欠く支持媒体中で、約37℃で白血球を培養して、成熟樹状細胞および活性化されたリンパ球を形成することと、(c)この患者に、治療上有効量の組成物を投与することと、を含む。
同様の態様において、本発明は、患者において、腫瘍を安定化または退行させるための医薬の調製において、本発明の組成物のうちのいずれかの使用に関する。
別の同様の態様において、本発明は、患者において、腫瘍を安定化または退行させるための本発明の組成物のうちのいずれかに関する。
本発明のこれらの態様のいくつかの実施形態において、投与は、全身注射、腫瘍内注射、または腫瘍のリンパを集めるリンパ節への局所注射によるものである。
本発明のこれらの態様のいくつかの実施形態において、腫瘍は、黒色腫、転移性黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌、メルケル細胞癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、子宮頸癌、口腔癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、肉腫、頭頚部癌、食道癌、膀胱癌、前立腺癌、または腹膜内膜の癌(中皮腫)である。
本発明のこれらの態様のいくつかの実施形態において、腫瘍は、黒色腫である。
さらに別の態様において、本発明は、本発明の組成物、腫瘍抗原、およびアジュバントを含む、腫瘍ワクチンに関する。
本出願の実施形態の追加の目的および利点は、部分的には以下の説明で述べられ、部分的にはその説明から明らかになるか、またはそれらは実践によって学習することができる。本実施形態の目的および利点は、添付の特許請求の範囲において特に指摘される要素および組み合わせを用いて明らかになるであろう。
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、本発明が属する当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または同等の方法および材料が、本発明の実践または試験で使用することができるが、好適な方法および材料が以下に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、特許明細書が優先する。加えて、材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
本明細書では、本発明は、単に例示し添付の図面を参照して説明する。ここで特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示としてであり、例示考察することだけを目的としていることを強調するものである。この点について、本発明の基本的理解に必要である以上に本発明の構造的な詳細を示す試みはなされておらず、図面とともに行われる説明は、本発明の様々な形態が実際にどのように具現化され得るかを当業者に対して明らかにするものである。
以下に更に詳細に記載されるように、本発明は、活性化された免疫刺激細胞組成物(AICC)、AICCを調製する方法、およびAICCを使用する方法に関する。
本発明のAICCは、成熟DCに分化される機能的に活性な単球を含み、これはそれらの細胞表面マーカーのプロファイル、T細胞への超抗原等の抗原を提示するそれらの能力、および優先的なTh1極性を促進する主な要因であるIL−12の放出によって示される。AICC中のT細胞もまた、活性化される。抗原の存在下で、AICC中で成熟DCとT細胞の相互作用は、T細胞のIL−2受容体の上方調節ならびにIL−2およびIFN−gの放出を生じる。AICC中でDCが抗原に曝露されるとき、IL−12の産生が急激に増加する。したがって、本発明のAICCは、免疫刺激のための強力なツールである。例えば、インビボで投与されるとき、AICCは、腫瘍環境において、CTLの増殖を活性化し、腫瘍拒絶を引き起こす、Th1サイトカイン(例えば、インターフェロン、IL−2)を好むようにサイトカイン平衡を変化させることができる。
理論により拘束されることなく、本発明のAICCは、単球/マクロファージをM1表現型に分極する。実施例に示されるように、AICC中の単球/マクロファージの大部分は、高レベルのHLA−DRを発現し、IL−12およびその他のM1サイトカインを産生する。M1サイトカインは、細胞性免疫に対する腫瘍環境の阻害作用を克服し、腫瘍拒絶を促進することが知られている。したがって、AICC中のサイトカインはまた、腫瘍治療に有用である。
本発明の原理および実施は、図面および添付の説明を参照して、よりよく理解され得る。本発明の少なくとも1つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用が、以下の説明に記載されているか、または実施例によって例示されている詳細に限定されないことを理解すべきである。本発明は、他の実施形態も可能であるし、または様々な方法で実践または実施することができる。
本明細書に採用されている表現および用語は、説明を目的としており、限定的なものと見なすべきでないことも理解すべきである。さらに、任意およびすべての値(数値範囲の下限および上限を含む)に関連して使用される「約」という用語は、+/−0.5%〜+/−20%(ならびにそれらの間の値、例えば、±1%、±1.5%、±2%、±2.5%、±3%、±3.5%、±4%、±4.5%、±5%、±5.5%、±6%、±6.5%、±7%、±7.5%、±8%、±8.5%、±9%、±9.5%、±10%、±10.5%、±11%、±11.5%、±12%、±12.5%、±13、±13.5%、±14%、±14.5%、±15%、±15.5%、±16%、±16.5%、±17%、±17.5%、±18%、±18.5%、±19%、±19.5%、および±20%)の様々な範囲の偏差を含む。
I.活性化された免疫刺激細胞組成物を作製する方法
白血球は、免疫応答を介在するために活性化を必要とする。ここで使用される、活性化された免疫刺激細胞組成物とは、少なくとも1つの型の活性化された白血球を含む組成物を指す。この文脈において、「活性化された」とは、細胞が活性化された細胞の1つ以上の機能的または表現型の特性を得ていることを意味する。活性化された(または「成熟した」)樹状細胞の特性の例としては、IL−12の産生;IL−10の不在または低レベルの産生、共刺激分子CD80、CD86、CD83、CD40、またはCD1c(BDCA1)のうちの1つ以上の、CD56、CD11b、CD11c、もしくはIGSF4(SynCamおよびネクチン様2)等の1つ以上の接着分子の、CLEC9A(DNGR−1)等の1つ以上のレクチン受容体の、CCR7等の1つ以上のケモカイン受容体の、TLR1、TLR3、もしくはTLR6等の1つ以上のトール受容体の、DC−LAMP等の1つ以上のendocomalタンパク質の、またはId2、IRF8、もしくはICSBP等の1つ以上の転写因子の、発現;抗原提示を介してナイーブT細胞を活性化する能力;ならびに抗体分泌(血漿)細胞へのB細胞の分化を誘発する能力が挙げられるが、これらに限定されない。活性化されたT細胞の特性の例としては、IL−2、IFN−ガンマ、IFN−アルファ、またはIFN−ベータのうちの1つ以上の産生;IL−2Rの発現;CD69、CD71(トランスフェリン受容体1)、CD28、またはCD40Lのうちの1つ以上等のT細胞活性化マーカーの上方調節;ならびに抗原、細胞毒性機能、またはヘルパー機能への曝露後の増殖が挙げられるが、これらに限定されない。
白血球は、免疫応答を介在するために活性化を必要とする。ここで使用される、活性化された免疫刺激細胞組成物とは、少なくとも1つの型の活性化された白血球を含む組成物を指す。この文脈において、「活性化された」とは、細胞が活性化された細胞の1つ以上の機能的または表現型の特性を得ていることを意味する。活性化された(または「成熟した」)樹状細胞の特性の例としては、IL−12の産生;IL−10の不在または低レベルの産生、共刺激分子CD80、CD86、CD83、CD40、またはCD1c(BDCA1)のうちの1つ以上の、CD56、CD11b、CD11c、もしくはIGSF4(SynCamおよびネクチン様2)等の1つ以上の接着分子の、CLEC9A(DNGR−1)等の1つ以上のレクチン受容体の、CCR7等の1つ以上のケモカイン受容体の、TLR1、TLR3、もしくはTLR6等の1つ以上のトール受容体の、DC−LAMP等の1つ以上のendocomalタンパク質の、またはId2、IRF8、もしくはICSBP等の1つ以上の転写因子の、発現;抗原提示を介してナイーブT細胞を活性化する能力;ならびに抗体分泌(血漿)細胞へのB細胞の分化を誘発する能力が挙げられるが、これらに限定されない。活性化されたT細胞の特性の例としては、IL−2、IFN−ガンマ、IFN−アルファ、またはIFN−ベータのうちの1つ以上の産生;IL−2Rの発現;CD69、CD71(トランスフェリン受容体1)、CD28、またはCD40Lのうちの1つ以上等のT細胞活性化マーカーの上方調節;ならびに抗原、細胞毒性機能、またはヘルパー機能への曝露後の増殖が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態において、AICCは、末梢血から調製される。末梢血には、一般に、赤血球(RBC)および血小板だけでなく、白血球も含有する。「白血球細胞」としても知られている白血球には、単球(様々な組織および樹状細胞のマクロファージに分化する「前駆」細胞)、リンパ球(T細胞、B細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、およびナチュラルキラーT細胞(NKT細胞)を含む)、ならびに顆粒球(好中球、好塩基球、および好酸球を含む)が含まれる。
代替の実施形態において、全末梢血が、便利な白血球の供給源であるが、AICCは、中心線からの血液から単離された白血球、臍帯血、胎盤血、リンパ液、骨髄、またはリンパ節もしくは膵臓等のリンパ系組織から単離された白血球を用いて調製される。白血球は、白血球除去によって調製され得る。したがって、白血球の供給源は、重要であるとは考えられない。
全血が使用されるとき、白血球は、異なる細胞型の密度勾配分離法を使用して、「軟膜」を調製することによって、赤血球および血小板から部分的に分離することができる。したがって、いくつかの実施形態において、AICC中に存在する血小板および赤血球の量は、全血中のものよりも低い。
AICCを産生するための出発材料は、自家供給源または同種異系供給源から得られ得る。一実施形態において、AICCは、AICCにより最終的に治療されるであろう患者から調製される、すなわち、この供給源は、自家である。他の実施形態において、AICCは、意図されたAICC受容者以外の個人から調製される。この場合は、この供給源は、同種異系である。
同種出発材料を含む、これらの実施形態において、これらは、血液銀行から好都合に得られ得る。試料は、血液型(ABO、Rh)、またはA2、B12、およびC3等であるが、これらに限定されない、特定のヒト白血球抗原の対立遺伝子、赤血球抗原に対する不規則な抗体、ならびに輸血感染症について、血液バンクによってスクリーニングされ得る。より具体的には、スクリーニングは、Abbott PRISM機器を用いて、抗体でB型肝炎、C型肝炎、HIV1/2、HTLV、および梅毒(−HCV;HbsAg;抗HIV 1/2 O+;および抗HTLV I/II)について実行することができる。試料はまた、分子方法(NAT−核酸試験)によってHIV、HCV、およびHBVに対してもスクリーニングすることができる。分子スクリーニングは、市販の機器、例えば、ChironのTIGRISシステムを用いて、またはこのような疾患について試験する好適な形態であり得る任意の他の方法を用いて達成することができる。
同種異系の供給源に関与する一実施形態において、試料は、意図されたAICC受容者と同じ血液型を有するドナーから得られる。一実施形態において、ドナー(複数可)および受容者である患者は、1つ以上のHLA対立遺伝子型に基づいて、適合させることができる。代替として、血漿試料は、AB+血液型を有するドナーから得ることができ、白血球は、O−血液型を有するドナーから得ることができる。AB+血液型を有するドナーは、血漿の万能ドナーであり、O−血液型を有するドナーは、白血球の万能ドナーである。この血漿は、新鮮な、保存された(例えば、24時間未満1〜6℃で)、乾燥させたか、またはそうでなければ前処理された(例えば、病原体減少血漿および溶媒/浄化剤(SD)処理された血漿)状態であり得る。供給源に関わらず、試料(複数可)の必要な処理はすべて、高度に特殊な装置を必要とせずに実行することができる。
いくつかの実施形態において、活性化された免疫刺激細胞の組成物は、すべての溶液の体積を同量減らし、より小さなバッグまたは他のインキュベーション容器を使用して、低体積の血液試料から調製し得る。さらに、これらの異なるサイズのインキュベーション容器の使用により、同様の組成物を有するAICCが得られる。低体積の使用により、臨床医に、外部の血液銀行を用いずに自己に血液採血を行う能力を提供する。これは、他の点では健常な免疫系を有するが、ある型の小さな癌の病変に罹患している患者を治療するとき、有用であり得る。
いくつかの実施形態において、AICCを調製する方法は、a)ヒト白血球を活性化することと、b)樹状細胞(DC)の分化および成熟を誘発する時間および温度の条件下、インキュベーション組成物中の活性化された白血球をインキュベートし、それにより、AICCを産生することと、を含む。一実施形態において、ステップ(b)はまた、リンパ球の活性化を誘発する。
一実施形態において、本方法は、DCを抗原または抗原ペプチドと接触させることをさらに含む。一実施形態において、抗原または抗原ペプチドが、インキュベーション組成物中で分化および成熟するとき、DCと接触させる。つまり、抗原または抗原ペプチドは、ステップ(b)のインキュベーションの一部またはすべての期間添加される。一実施形態において、インキュベーション組成物中でインキュベーションが完了した後、抗原または抗原ペプチドを、DCと接触させる。つまり、本方法は、抗原または抗原ペプチドを、抗原ペプチドを用いてDCを負荷するのに十分な期間にわたってAICCに添加するステップ(c)をさらに含む。
一実施形態において、国際公開第2010/100570号の方法を使用して産生された活性化白血球組成物は、AICCを調製する際に使用される。この実施形態において、活性化白血球組成物は、上記の実施形態の方法のステップ(a)に相当する。
いくつかの実施形態において、AICCを調製する方法は、a)ヒト白血球を単離することと、b)任意に、白血球を低浸透圧ショックに供することと、c)樹状細胞(DC)の分化および成熟を誘発する時間および温度の条件下で、インキュベーション組成物中のショックさせた白血球をインキュベートし、それにより、AICCを産生することと、を含む。一実施形態において、ステップ(c)はまた、リンパ球の活性化を誘発する。
一実施形態において、本方法は、DCを抗原または抗原ペプチドと接触させることをさらに含む。一実施形態において、抗原または抗原ペプチドが、インキュベーション組成物中で分化および成熟するとき、DCと接触させる。つまり、抗原または抗原ペプチドは、ステップ(c)のインキュベーションの一部またはすべての期間添加される。一実施形態において、インキュベーション組成物中のインキュベーションが完了した後、抗原または抗原ペプチドを、DCと接触させる。つまり、本方法は、抗原または抗原ペプチドを、抗原ペプチドを用いてDCを負荷するのに十分な期間にわたってAICCに添加するステップ(d)をさらに含む。
一実施形態において、国際公開第2010/100570号の方法を使用して産生された活性化白血球組成物は、AICCを調製する際に使用される。この実施形態において、活性化白血球組成物は、上記の実施形態の方法のステップ(a)および(b)に相当する。
いくつかの実施形態において、本方法は、a)白血球を活性化する時間および温度の条件下で、ヒト白血球をインキュベートすることと、b)任意に、白血球を低浸透圧ショックに供することと、c)等張を回復させるのに有効な量で生理学的に許容される塩溶液をステップbの白血球に添加することと、d)ステップcの白血球を媒体と混合して、第2のインキュベーション組成物を形成することと、e)樹状細胞(DC)の分化および成熟を誘発する時間および温度の条件下、第2のインキュベーション組成物をインキュベートし、それにより、AICCを産生することと、を含む。一実施形態において、ステップ(e)はまた、リンパ球のさらなる活性化を誘発する。
一実施形態において、本方法は、ステップ(e)の樹状細胞(DC)を抗原または抗原ペプチドと接触させることをさらに含む。一実施形態において、抗原または抗原ペプチドが、インキュベーション組成物中で分化および成熟するとき、DCと接触させる。つまり、抗原または抗原ペプチドは、ステップ(e)のインキュベーションの一部またはすべての期間添加される。一実施形態において、インキュベーション組成物中のインキュベーションが完了した後、抗原または抗原ペプチドを、DCと接触させる。つまり、本方法は、抗原または抗原ペプチドを、抗原ペプチドを用いてDCを負荷するのに十分な期間にわたってAICCに添加するステップ(f)をさらに含む。
一実施形態において、国際公開第2010/100570号の方法を使用して産生された活性化白血球組成物は、AICCを調製する際に使用される。この実施形態において、活性化白血球組成物は、上記の実施形態の方法のステップ(a)〜(d)に相当する。
いくつかの実施形態において、本方法は、a)白血球を活性化するために、室温で最長約20時間ヒト白血球をインキュベートすることと、b)白血球を低浸透圧ショックに供することと、c)等張を回復させるのに有効な量で生理学的に許容される塩溶液をステップbの白血球に添加することと、d)ステップcの白血球を媒体と混合して、第2のインキュベーション組成物を形成することと、e)樹状細胞(DC)の分化および成熟を誘発する時間および温度の条件下、第2のインキュベーション組成物をインキュベートし、それにより、AICCを産生することと、を含む。一実施形態において、ステップ(e)はまた、リンパ球のさらなる活性化を誘発する。
一実施形態において、本方法は、ステップ(e)の樹状細胞(DC)を抗原または抗原ペプチドと接触させることをさらに含む。一実施形態において、抗原または抗原ペプチドが、インキュベーション組成物中で分化および成熟するとき、DCと接触させる。つまり、抗原または抗原ペプチドは、ステップ(e)のインキュベーションの一部またはすべての期間添加される。一実施形態において、インキュベーション組成物中でインキュベーションが完了した後、抗原または抗原ペプチドを、DCと接触させる。つまり、本方法は、抗原または抗原ペプチドを、抗原ペプチドを用いてDCを負荷するのに十分な期間にわたってAICCに添加するステップ(f)をさらに含む。
一実施形態において、国際公開第2010/100570号の方法を使用して産生された活性化白血球組成物は、AICCを調製する際に使用される。この実施形態において、活性化白血球組成物は、上記の実施形態の方法のステップ(a)〜(d)に相当する。
いくつかの実施形態において、本方法は、a)ヒト白血球を活性化することと、b)ステップaの白血球を媒体と混合して、第2のインキュベーション組成物を形成することと、c)樹状細胞(DC)の分化および成熟を誘発する時間および温度の条件下、第2のインキュベーション組成物をインキュベートし、それにより、AICCを産生することと、を含む。白血球の活性化は、CD11bおよび/またはCD62L等の白血球の活性化マーカーを表す白血球の発現レベルまたはその数の変化によって示される。したがって、一実施形態において、白血球の活性化は、白血球集団におけるCD11bの発現の増加によって示される。CD11bの発現の増加は、例えば、フローサイトメトリーによって検出することができる。CD11bの発現の増加は、白血球におけるCD11bに対する平均蛍光強度の増加を包含し、例えば、平均蛍光強度は、少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、または90%増加し得る。CD11bの発現の増加はまた、CD11bを発現する白血球のパーセンテージの増加を包含する(例えば、アイソタイプ対照を使用して、背景染色に対して補正された後)。例えば、CD11bを発現する白血球のパーセンテージは、軟膜中の白血球におけるCD11b発現の発現と比較して、少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、または90%増加し得る。一実施形態において、白血球の活性化は、白血球集団におけるCD62Lの発現の減少によって示される。CD62Lの発現の減少は、例えば、フローサイトメトリーによって検出することができる。CD62Lの発現の減少は、白血球におけるCD62Lに対する平均蛍光強度の減少を包含し、例えば、平均蛍光強度は、少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、または90%減少し得る。CD62Lの発現の減少はまた、CD62Lを発現する白血球のパーセンテージの減少を包含する(例えば、アイソタイプ対照を使用して、背景染色に対して補正された後)。例えば、CD62Lを発現する白血球のパーセンテージは、軟膜中の白血球におけるCD62L発現の発現と比較して、少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、または90%減少し得る。一実施形態において、CD62Lおよび/またはCD11bは、顆粒球である白血球において測定される。一実施形態において、CD62Lおよび/またはCD11bは、単球である白血球において測定される。一実施形態において、ステップ(c)はまた、リンパ球のさらなる活性化を誘発する。
加えて、白血球の活性化に関与する他の実施形態のいずれかでは、上で論じられる、CD11bおよび/またはCD62Lの発現の変化は、白血球の活性化の指標として、単独で、一緒に、または本出願中の他の箇所で論じられる、さらなるマーカーおよびアッセイと組み合わせて、使用され得る。
一実施形態において、本方法は、ステップ(c)の樹状細胞(DC)を抗原または抗原ペプチドと接触させることをさらに含む。一実施形態において、抗原または抗原ペプチドが、インキュベーション組成物中で分化および成熟するとき、DCと接触させる。つまり、抗原または抗原ペプチドは、ステップ(c)のインキュベーションの一部またはすべての期間添加される。一実施形態において、インキュベーション組成物中のインキュベーションが完了した後、抗原または抗原ペプチドを、DCと接触させる。つまり、本方法は、抗原または抗原ペプチドを、抗原ペプチドを用いてDCを負荷するのに十分な期間にわたってAICCに添加するステップ(d)をさらに含む。
一実施形態において、国際公開第2010/100570号の方法を使用して産生された活性化白血球組成物は、AICCを調製する際に使用される。この実施形態において、活性化白血球組成物は、上記の実施形態の方法のステップ(a)および(b)に相当する。
一般に、AICCを調製する方法のうちのいずれかでは、白血球が休止状態から機能的に活性な状態に遷移した任意の組成物は、低浸透圧ショックステップのために使用され得る。例えば、国際公開第2010/100570号に記載されるように、白血球は、それらを室温で最長約20時間インキュベートすることによって、休止状態から機能的に活性な状態に遷移させることができる。一実施形態において、この遷移は、白血球を室温で約90分間〜約20時間インキュベートすることによって生じる。一実施形態において、この遷移は、白血球を室温で約8時間〜約20時間インキュベートすることによって生じる。一実施形態において、この遷移は、白血球を室温で一晩インキュベートすることによって生じる。他の実施形態において、温度は、約37℃であり得る。上述のように、この「遷移する」ステップの詳細は、不可欠なものではなく、白血球は、AICCを調製するために使用される任意の方法によって得られ得る。
さらに、低浸透圧ショックは、一種の応力であるため、低浸透圧ショックのステップを含む方法のこれらの実施形態において、他の方法が、細胞に応力を与えるために採用され得る。つまり、様々な種類の応力が、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ(MAPK)の活性化をもたらすタンパク質キナーゼカスケードからなる同じ高度に保存されたシグナル伝達経路を通って細胞応答を引き起こすため、低浸透圧ショックを言及する実施形態のいずれかにおいて、低浸透圧ショックの代わりに、他のストレス要因が使用され得る。例えば、いくつかの実施形態において、AICCを調製する方法は、熱ショック、低酸素症、クロルプロマジン、カフェイン、バナジウム酸塩、ザイモリアーゼ(zymolyse)、コンゴレッド、カルコフロール、ラパマイシン、もしくは接合フェロモンのうちのいずれかの1つ以上による処理から選択されるストレス要因に、白血球を曝露する、あるいはアクチン脱重合の誘発による、任意のステップを(低浸透圧ショックの代わりに、またはそれに加えて)含む。白血球の活性化はまた、細胞内のカルシウムの増加を生じ、この応答を模倣する多くの作動薬が存在する。したがって、さらに他の実施形態において、AICCを調製する方法は、低浸透圧ショックの代わりに、またはそれに加えて、FMLPまたはPMA等のカルシウムイオノフォアに、白血球を曝露する任意のステップを含む。
AICCを産生する様々な方法の実施形態のいずれかにおいて、「樹状細胞(DC)の分化および成熟を誘発する時間および温度の条件」下でのインキュベーション(任意に、リンパ球および他の細胞を活性化し得る)は、一般に、ほぼ室温〜約37℃で約24時間〜約14日間のインキュベーションである。
いくつかの実施形態において、樹状細胞(DC)の分化および成熟を誘発するインキュベーションは、ほぼ室温の温度で、すなわち、約12℃〜約28℃の範囲内である。一実施形態において、インキュベーションは、約16℃〜約25℃の温度である。一実施形態において、インキュベーションは、約18〜25℃の温度である。なお別の実施形態において、インキュベーションは、約20〜25℃の温度である。
いくつかの実施形態において、樹状細胞(DC)の分化および成熟を誘発するインキュベーションは、約37℃の温度である。一実施形態において、インキュベーションは、約35℃〜約38℃である。一実施形態において、インキュベーションは、37℃+/−0.5℃である。
いくつかの実施形態において、樹状細胞(DC)の分化および成熟を誘発するためのインキュベーション期間は、約24時間〜14日間である。したがって、いくつかの実施形態において、インキュベーションは、約24、30、36、42、48、54、60、66、72、84、96、108、120、132、144、156、168、192、216、240、264、288、312、または約336時間、あるいは、これらの値の間でほぼ任意の時間範囲内である。
いくつかの実施形態において、樹状細胞(DC)の分化および成熟を誘発するためのインキュベーション期間は、約48〜約72時間の範囲である。一実施形態において、インキュベーションは、約37℃で約48〜約72時間の範囲である。一実施形態において、インキュベーションは、約37℃で約48時間行う。一実施形態において、インキュベーションは、約37℃で約72時間行う。一実施形態において、インキュベーションは、室温で約24〜約72時間行う。
いくつかの実施形態において、インキュベーションは、5% CO2を含有する雰囲気中、100%の湿度で、細胞インキュベーター中である。いくつかの実施形態において、インキュベーションは、ガス透過性バッグ中で行われ、これらのバッグは、5% CO2を含有する雰囲気中、100%の湿度で、細胞インキュベーター中に入れる。他の実施形態において、組織培養フラスコまたは皿が、本方法で使用される。さらに他の実施形態において、バッグシステムおよび培養皿またはフラスコの組み合わせが、本方法で使用される。バッグシステム中でのインキュベーションを含むこれらの実施形態において、このバッグシステムは、国際公開第2010/100570号に記載されるもののうちの1つであり得るか、あるいは、フッ素化エチレンプロピレン(FEP)またはエチルビニルアセテート(EVA)等であるが、これらに限定されない異なる材料から作製されるバッグであり得るか、または組織培養容器もしくは任意の容器内であり得る。
インキュベーションに使用される任意の容器はまた、白血球に付着するように、処理され得るか、またはそうでなければ改質され得、このことは、白血球の活性化、単球の分化、およびリンパ球の活性化/プライミングに対して有益であり得る。一実施形態において、AICCを調製する方法に使用される培養容器のうちの1つ以上は、樹状細胞に対して非付着性である。別の実施形態において、AICCを調製する方法で使用される培養容器は、細胞付着を軽減するように処理される。さらに別の実施形態において、AICCを調製する方法で使用される1つ以上の培養容器は、細胞の付着を増大させるように処理される。
インキュベーションに使用される任意の容器はまた、足場を含有し得る。足場は、異なる形状であり得、特に、これらは、例えば、コラーゲンで作られている、またはPLA、PGA(ポリ乳酸、ポリグリコール酸)、もしくは同様の合成ポリマーで作られている、マイクロビーズ、生分解性、または非生分解性であり得るか、ゼラチン、ヒアルロン酸、アルギン酸、フィブリン接着剤で作られているヒドロゲル足場であり得る。足場またはバッグは、付着受容体、フィブロネクチンもしくはラミニン等の細胞外マトリックスタンパク質、またはRGD等の細胞外マトリックスからの活性結合ペプチドでコーティングされ得る。足場またはマイクロビーズはまた、CD3、CD28、もしくはCD40に対する活性化抗体等であるが、これらに限定されない、活性化刺激物または刺激抗体でコーティングされ得る。しかしながら、少なくとも1つの実施形態において、本方法は、1つ以上の活性化刺激物で、またはCD3、CD28、もしくはCD40に対する1つ以上の抗体でコーティングされたマイクロビーズまたは足場を含まない。
いくつかの実施形態において、AICCを産生するためにインキュベーションに使用される媒体は、血漿または血清である。血清を利用するこれらの実施形態において、血清は、血漿試料から得ることができ、これは、約37℃で凝固剤と接触させた白血球と同一または異なる全血試料から(すなわち、同一または異なるヒトから)得ることができる。いくつかの実施形態において、血清または血漿は、商業的または非営利の供給源から得られ、新鮮な、または冷凍等の保存に適合した形態のいずれかであり得る。
加えて、血清(特に、ヒト血清)がしばしば、支持的媒体としてインキュベーション組成物に使用されるが、サイトカインの放出、成長因子、および/または活性化白血球からの他の可溶性構成要素を支持する生理的媒体である限り、他の支持的媒体も、使用され得る。例えば、血漿は、血清の代わりに使用され得る。支持媒体としても使用され得る他のインキュベーション媒体には、培養培地、生理食塩水、またはアミノ酸等の細胞の生存および機能に不可欠である糖および他の構成要素の任意の添加を有する緩衝生理食塩溶液(例えば、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、ハンクス平衡塩溶液(HBSS)、アール平衡塩溶液(EBSS)、標準クエン酸生理食塩水液(SSC)、HEPES緩衝生理食塩水(HBS)、ゲイ平衡塩溶液(GBSS))が含まれる。生理食塩溶液および培養培地はまた、ヒト血清または臨床的グレードの動物血清、または血清代替物が補充され得る。インキュベーション組成物は、代替的にまたは加えて、血清タンパク質、例えば、ヒトまたはウシアルブミン、ガンマ−グロブリン、トランスフェリン、または異なる組織由来のタンパク質、植物性タンパク質、もしくは植物エキスを含有し得る。
ある特定の実施形態において、補体タンパク質、ケモカイン、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ガンマ、サイトカイン、例えば、インターロイキン−4、顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激因子(GM−CSF)、またはインターロイキン−12等の白血球作動薬をインキュベーションに添加する。インビトロでのDCへの単球分化は、特定のサイトカインカクテルを用いて誘発され得る(Jensen SS,Gad M.2010)。したがって、一実施形態において、インキュベーションは、インターロイキン−4またはGM−CSF等のサイトカインの存在下で行われ得る。他の実施形態において、インキュベーションは、樹状細胞の分化および成熟ならびにリンパ球およびNK細胞の活性化を増大する他の物質を用いて行われ得る。例えば、単球上のCD40共刺激受容体は、サイトカインの不在下で、CD40への抗体によって、またはCD40リガンド(CD54)によって連結され得る(Brossart P,1998)。DCの成熟に対するCD40の独立した活性化は、活性化されたCD8陽性T細胞との相互作用によって誘発され得る(Ruedl C.,1999、Wirths,2002)。したがって、一実施形態において、外因性の活性化されたCD8陽性T細胞を、インキュベーションに加えてもよい。インビトロでの単球からのDCの分化はまた、NKT細胞とのDCの相互作用によって誘発され得る。DCの分化は、単球による活性化の際に、NKT細胞により産生されたサイトカインであるGM−CSFおよびIL−13のNKT細胞分泌によって生じる(Hegde,2007)。したがって、一実施形態において、外因性の活性化されたNKT細胞を、インキュベーションに加えてもよい。他の実施形態において、DCの分化および成熟は、GM−CSF、IL−4、IFN−ガンマ、IL−2、IFN−アルファ、およびTNF−アルファのうちの1つ以上の添加によって、ならびに/またはリポ多糖類(LPS)、ペプチドグリカン(ムレイン)、二本鎖RNAもしくはその合成類似体のポリイノシン酸:ポリシチジル酸(ポリI:C)、レジキモド(R−848)、およびピシバニル(OK−432)等であるが、これらに限定されない、DC上のトール受容体と相互作用する1つ以上の細菌産物の添加によって促進され得る。
また、本方法の1つ以上の実施形態において、DCの成熟に関与する、上記の外因的に添加された因子(複数可)のうちの1つ以上の不在下で、インキュベーションが生じることも明確に企図される。一実施形態において、DCの成熟に必要とされる構成要素のすべては、内因的に提供され、さらなる刺激をインキュベーション組成物に加えない。それにもかかわらず、様々なサイトカインが、インキュベーション中、白血球の活性化の際に放出されるため、それらは、インキュベーション組成物中に存在し得る。例えば、CD40リガンドは、血清中、およびインキュベーション組成物の一部である血小板上に見出され得る。同様に、インキュベーション組成物中に内因的に存在する活性化されたCD8+T細胞およびNKT細胞は、単球と相互作用して、樹状細胞の分化および成熟を支持し得る。
したがって、一実施形態において、(GM−CSF、IL−4、TNF、またはインターフェロンのうちの1つ以上が、インキュベーション中に内因的に産生され得るが)AICCを産生するためのインキュベーション組成物は、外因性GM−CSF、外因性IL−4、外因性TNF、または外因性インターフェロンを含まない。それ故に、一実施形態において、AICCを調製する方法は、1つ以上の外因性サイトカインもしくはインターフェロンの添加、CD3および/もしくはCD28を架橋する試薬(複数可)の添加、CD40を架橋する試薬(複数可)の添加、ならびに/またはAICCの産生中、樹状細胞の成熟を促進する他の外因性薬剤の添加を除外する。本方法の実践から除外され得る外因的に添加されたサイトカインおよび外因的に添加されたインターフェロンの例には、GM−CSF、IL−4、IFN−ガンマ、IL−2、IFN−アルファ、またはIL−2のうちのいずれかの1つ以上が含まれる。本方法の実践から除外され得る外因的に添加された細菌産物の例には、リポ多糖類(LPS)、ペプチドグリカン(ムレイン)、二本鎖RNAもしくはその合成類似体のポリイノシン酸:ポリシチジル酸(ポリI:C)、レジキモド(R−848)、およびピシバニル(OK−432)等であるが、これらに限定されない、DC上のトール受容体と相互作用することが知られているものが含まれる。
いくつかの実施形態において、VEGFシグナル伝達を標的とする血管新生阻害剤を、インキュベーション組成物に添加する。これらには、抗VEGF抗体(例えば、ベバシズマブ、ラニビズマブ)、VEGF受容体に対する抗体(例えば、VEGFR−2およびFGFRを標的とするブリバニブ)、VEGF受容体のチロシンキナーゼ活性の阻害剤(例えば、ソラフェニブ、セジラニブ、スニチニブ)、可溶性受容体デコイ(例えば、アフリベルセプトとも呼ばれる、VEGFトラップ)、または血管破壊剤(例えば、ZD6126)が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、アジュバントを、インキュベーション組成物に添加する。アジュバントの例には、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、およびリン酸カルシウム、油乳剤系のアジュバント(フロイント乳化油アジュバント(完全および不完全)、Arlacel A、鉱油、乳化落花生油アジュバント(アジュバント65)、細菌(それらの合成誘導体、ならびにリポソーム)またはグラム陰性細菌からの生成物、エンドトキシン、コレステロール、脂肪酸、脂肪族アミン、パラフィン系オイルおよび植物油、モノホスホリルリピドA、Quil−A付きISCOM、およびシンテックスアジュバント製剤(SAF)が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、他の部分で論じられるように、本方法のいずれかには、1つ以上の抗原または抗原ペプチドを導入する接触ステップをさらに含み得る。抗原の例には、腫瘍特異性および腫瘍関連抗原、幹細胞/癌幹細胞抗原、ならびに超抗原(例えば、ブドウ球菌エンテロトキシン)が含まれる。一般的に言えば、抗原または抗原ペプチドは、樹状細胞への単球、およびその抗原に特異的な主なリンパ球の分化を増強するであろう。さらに、細胞レベル上の抗原提示は、クラスIまたはクラスII分子に関連して提示される抗原ペプチドを含み、「抗原」、「抗原ペプチド(antigen peptide)」、および「抗原ペプチド(antigenic peptide)」という用語は、無傷抗原または特定のペプチドとの接触を必要とするものとして解釈されるべきではない。その代わり、これらの用語は、抗原提示細胞が、直接またはさらなる処理後のいずれかで、クラスIまたはクラスII分子に関連して存在し得る、抗原材料と接触させることを示すために、広範に使用される。
細胞溶解物から調製されるか、またはタンパク質もしくはペプチドの組み換え発現によって調製されるかにかかわらず、抗原および抗原ペプチドは、AICCを用いて、または様々な濃度でAICCの産生中、室温〜約37℃で約1時間〜約24時間インキュベートされる。抗原/ペプチドの例には、以下に記載されるものおよび実施例の項で使用される任意の抗原/ペプチドが含まれる。
近年、ハイスループット技術により、癌において、突然変異遺伝子の特定が可能になっている。これらの遺伝子の数は多く、以前考えられていたよりも広範囲に機能的な異種性を有する(Stratton et al.,Nature 458:719−24(2009)、Pleasance et al.,Nature 463:191−96(2010))。これらの研究は、乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、および肺癌、ならびに膠芽腫において行われており、全部で約400の候補癌遺伝子(CAN遺伝子)を特定している。
通常、精巣、胎盤、および卵巣の精母細胞または精原細胞と関連する共通抗原のいくつかの例には、癌−精巣(CT)抗原であるBAGE、GAGE、MAGE、NY−ESO−1、およびSSXが含まれる。これらの抗原は、黒色腫、リンパ腫、肺、膀胱、結腸、および乳癌に見られる。メラニン細胞、上皮組織、前立腺、および結腸に通常見られる共通抗原はまた、分化抗原Gp100、Melan−A/Mart−1、Tyrosinase、PSA、CEA、およびMammaglobin−Aを含む。これらの抗原は、黒色腫、前立腺癌、結腸、および乳癌に見られる。低いレベルで普遍的に発現する共通抗原は、癌において過剰発現され得る。過剰発現した抗原の例には、食道、肝臓、膵臓、結腸、乳房、卵巣、膀胱、および前立腺癌に見られる、p53、HER−2/neu、リビン、およびスルビビンが含まれる。β−カテニン−m、β−アクチン/4/m、ミオシン/m、HSP70−2/m、およびHLA−A2−R170J等の他の抗原は、独特であり、これらは、黒色腫、非小細胞肺癌、および腎臓癌のうちの1つ以上と関連する。さらに他の抗原は、通常、腎臓、腸、および結腸直腸組織等の上皮組織に通常見られる腫瘍関連糖鎖抗原である。これらの抗原には、GM2、GD2、GD3、MUC−1、sTn、abd globo−Hが含まれ、これらは、黒色腫、神経芽細胞腫、結腸直腸、肺、乳房、卵巣、および前立腺癌に見られ得る。
本発明の様々な態様において使用され得るいくつかのさらなる例示的な抗原/ペプチドには、MART−1、MAGE−1、MAGE−3、TYR、および、転移性黒色腫と関連するgp100抗原/ペプチド(例えば、Butterfield et al.,J.Immunotherapy 2008;31:294−309、Markowicz et al.,J Clin Oncol 27:15s,2009(別冊;要約9039)に記載される);TADG−12、CA125、ヘプシン、および卵巣癌と関連する他の抗原/ペプチド(例えば、米国特許第8,097,242号および同第7,935,531号に記載される);結腸直腸、胃、および膵臓癌、いくつかの乳癌、および多くの非小細胞肺癌と関連する癌胎児性抗原(CEA)(例えば、米国特許第8,012,468号に記載される);神経系癌(例えば、多形性膠芽腫および星状細胞腫)と関連する抗原、例えば、米国特許第8,097,256号に記載される抗原チロシン関連タンパク質(TRP)、黒色腫関連抗原−1(MAGE−1)、HER−2、AIM−2、IL−13受容体アルファ2等、またはgp100抗原およびそれらのペプチドエピトープ;米国特許第8,003,773号に記載されるペプチドを含むhTERT(ヒトテロメラーゼ逆転写酵素;前立腺癌と関連する、前立腺特異抗原(PSA)、前立腺特異膜抗原(PSMA)、および前立腺酸性フォスファターゼ(PAP)抗原(例えば、Tartour et al.,Immunol Lett 2000;74(1):1−3);HPV(ヒトパピローマウイルス)抗原(子宮頸癌と関連する);米国特許第7,906,620号に前立腺および結腸癌と関連すると記載される前立腺特異Gタンパク質結合受容体(PSGR)および前立腺STEAPの6回膜貫通型上皮抗原;ならびに/または例えば、前立腺、子宮、および精巣癌等の生殖癌と関連するPAGE4(米国特許第7,910,692号に記載される)が含まれる。いくつかの実施形態において、無傷抗原が使用され、一方、他の実施形態において、(タンパク質分解または組換えのいずれかによって調製された)抗原のペプチドエピトープが使用される。
いくつかの実施形態において、AICC中の樹状細胞は、例えば、指数衰減波または方形波エレクトロポレーターまたは他のRNAパルス装置を用いる、エレクトロポレーションによって、腫瘍特異性抗原に対して既知のRNA配列を有する腫瘍または幹細胞から単離されたmRNAによりトランスフェクトされる。別の実施形態において、1つ以上の抗原または抗原ペプチドは、例えば、米国特許第8,097,243号に記載される、微小粒子に基づいたトランスフェクションを使用して、AICC中の樹状細胞等の抗原提示細胞に導入される。さらに他の実施形態において、1つ以上の抗原または抗原ペプチドは、例えば、米国特許第8,012,468号、およびButterfield et al.,J.Immunotherapy 2008;31:294−309に記載される、アデノウイルスに基づいた変換を使用して、あるいは、米国特許第8,003,773号に記載される、レトロウイルスベクターを使用して導入される。
実施形態のいずれかにおいて、本方法は、成熟DCへの単球の分化、リンパ球の活性化、NK細胞の活性化および/もしくは増殖、またはNKT細胞の活性化および/もしくは増殖のうちの1つ以上をもたらし得る。
一実施形態において、AICCが、抗原の存在下で、ナイーブT細胞の活性化(プライミング)を刺激し(T細胞活性化マーカーCD69、IL−2R、CD28、CD71、CD49d、CD40Lのうちの1つ以上の発現によって、および/またはIL−2、IFN−アルファ、IFN−ベータ、もしくはIFN−ガンマの産生によって示される)、Tヘルパーおよび細胞毒性T細胞を分化および増殖することができる細胞を含む場合、AICCは、「成熟」DCを含む。別の実施形態において、IL−12の産生の増加がある場合、AICCは、成熟DCを含む。別の実施形態において、AICC中の単球上のマーカーCD80、CD86、CD83、CD40、CD1c、CD56、CD11b、CD11c、IGSF4、CLEC9A、CCR7、TLR1、TLR3、TLR6、DC−LAMP、Id2、IRF8、またはICSBPのうちの1つ以上の発現の増加がある場合、AICCは、成熟DCを含む。一実施形態において、発現の増加は、AICC中のDCの表面上の1つ以上の分子の数の増加(例えば、フローサイトメトリーによって決定される、平均蛍光強度(MFI)の増加)である。分子の数の増加は、成熟していると考えられるAICC中のDC上の特定のマーカーについてMFIを比較することによって決定される。一実施形態において、マーカーのうちの1つ以上を発現する単球のパーセンテージの増加がある場合、AICCは、「成熟」DCを含む。一実施形態において、単球は、特徴的な側方散乱光[SSC]、およびフローサイトメトリーによる汎白血球マーカーであるCD45に対するポジティブ染色法、または単球に特異的CD14染色法によって特定される。一実施形態において、本方法は、MFIならびに細胞表面マーカーHLA−DR、CD54、CD86、CD83、CD80、CD40、およびCCR7のうちの少なくとも1つを発現する、単球のパーセンテージがともに増加するAICCをもたらす。一実施形態において、本方法は、MFIならびに細胞表面マーカーHLA−DR、CD54、CD86、CD83、CD80、CD40、およびCCR7のいずれかの組み合わせまたはすべてを発現する、単球のパーセンテージがともに増加するAICCをもたらす。一実施形態において、増加は、AICCを産生するために使用される開始の白血球組成物(例えば、軟膜中の白血球)と比較して評価される。一実施形態において、増加は、DCの分化および成熟を誘発する時間および温度の条件下でのインキュベーションに使用される細胞組成物と比較して評価される。
一実施形態において、AICCは、ナイーブT細胞に対する抗原を提示し、これによりナイーブT細胞がCD4陽性およびCD8陽性細胞に分化し、増殖し、IL−2を産生し、IL−2受容体を発現し、インターフェロンおよび他のTh1サイトカインを産生するであろう。
別の態様において、本方法は、1つ以上の細胞集団に関して本発明のAICCを濃縮することをさらに含み得る。樹状細胞、T細胞、NK細胞、NKT細胞、または他の細胞型に関して濃縮される組成物は、既知の方法に従って、陽性または陰性マーカー選択のいずれかを使用して、細胞分類、パニング、MACS等によって調製され得る。
さらなる実施形態において、本方法は、液体部分からAICCの細胞部分を分離することをさらに含み得る。一実施形態において、細胞および液体(上清)部分の両方が、回収される。これは、例えば、AICCを遠心分離し、上清を別の容器に移すことによって達成され得る。実施例に記載される、上清は、それが含有するサイトカインおよび他の可溶性因子のため、細胞の不在下でさえ、療法に有用である。次いで、遠心分離後形成するペレット中の細胞は、任意の所望の担体中で再懸濁され得る。他の実施形態において、細胞は、例えば、濾過によって、細胞を回収することなく、液体部分から除去される。さらに他の実施形態において、細胞は、例えば、細胞をペレット化し、上清を吸引することによって、上清を回収することなく回収される。
実施形態のいずれかにおいて、AICCが産生されると、AICC中の細胞は、さらなる濃縮を伴うかまたは伴わずに単離され、(受容者に対して自家であっても、同種異系であってもよい)血清等の担体、または細胞の保存および投与に好適な一部の他の生理学的に許容される等張の正常な液体中で再懸濁され得る。このような溶液の例が以下に記載され、これには、等張を回復させるために使用される溶液、細胞培養培地、緩衝食塩水、または任意の他の生体適合性流体、あるいは特別に製剤化された臨床的に許容される細胞保存もしくは細胞低温保存培地が含まれる。
II. 活性化された免疫刺激細胞組成物
別の態様において、本発明は、活性化された免疫刺激細胞組成物(AICC)に関し、これは、上記のAICCを作製する方法によって生成された組成物のいずれかを指す。したがって、「AICC」はしばしば、上記のインキュベーションに使用される同じ担体中の細胞組成物を指すが、AICCはまた、任意の担体または賦形剤、ならびに細胞成分から分離された液体成分中の細胞成分も包含する。
別の態様において、本発明は、活性化された免疫刺激細胞組成物(AICC)に関し、これは、上記のAICCを作製する方法によって生成された組成物のいずれかを指す。したがって、「AICC」はしばしば、上記のインキュベーションに使用される同じ担体中の細胞組成物を指すが、AICCはまた、任意の担体または賦形剤、ならびに細胞成分から分離された液体成分中の細胞成分も包含する。
AICC中の白血球は、概して、個々の白血球細胞型または組成物を区別するために使用され得るある特定の特徴を有する。例えば、AICC中の単球は、新鮮分離した単球と比較して、より高いレベルのCD54、HLA−DR、および/またはCD86を発現し得る。さらに、AICC中の単球は、新鮮分離した単球と比較して、例えば、CD8−アルファ、CD83、CD80、CCR7、および/またはCD40のうちの1つ以上のさらなる活性化マーカーを発現し得る。AICC組成物は、例えば、末梢血白血球の新鮮に調製された試料中よりもDCに分化され、および成熟した単球のより高いパーセンテージまたは数を含み得る。同様に、AICCは、例えば、末梢血白血球の新鮮に調製された試料中よりもナイーブリンパ球を活性化/プライミングすることができるより多くの数またはパーセンテージの細胞を含み得る。AICC中のリンパ球は、例えば、CD69、CD25、CD28、CD154、CD107a、および/またはCD42dのうちの1つ以上の新鮮分離したリンパ球と比較して、より高い表面レベルのさらなるマーカーを発現し得る。加えて、AICC中の白血球は、新鮮分離した白血球と比較して、例えば、IL−2、IFNガンマ、IFNアルファ、IFNベータ、TNFアルファ、TNFベータ、および/またはIL−12のうちの1つ以上のサイトカインを産生する増加した能力を示し得る。
上述のように、本方法のいくつかの実施形態において、国際公開第2010/100570号の方法を使用して生成された活性化白血球組成物(ALC)は、活性化された免疫刺激細胞組成物(AICC)を調製する方法で使用される。実施例に記載されるように、ALC中の白血球が、少なくとも部分的に活性化され得るが、AICC中の白血球が、ALC中よりも高いレベルの活性化を達成し得る。ALC中の白血球と比較して、AICC中の白血球のより高いレベルの活性化は、比較としてALCを使用して、AICCに関する上述の特性のうちのいずれか1つ以上によって示され得る。
実施例に示されるように、AICCはまた、例えば、単球上のHLA−DR、CD86、CD83、CD80、CD40、CD54、およびCCR7の表面発現によって示される、DCの最小活性化レベル;例えば、CD69、CD25(IL−2R)、CD28、CD154/CD40L、およびCD49dの表面発現によって示される、リンパ球の最小活性化レベル;ならびに、例えば、CD56、CD57、およびCD107aの表面発現によって示される、NKおよびNKT細胞の最小活性化レベル、の観点から特徴付けられ、既知の組成物と区別され得る。マーカーの表面発現は、マーカーを発現する細胞のパーセンテージとして、または1つの細胞当たりのマーカーのレベルとして評価され得る。
いくつかの実施形態において、活性化された免疫刺激細胞組成物(AICC)の最終含有物には、存在する白血球の集団に関して、顆粒球、単球、およびリンパ球が含まれる。細胞の特定の量および相対的パーセンテージは、採用される分析技術および試料間の変動に基づいて異なり得る。例えば、分析がCell Dyn分析器を使用して行われるとき、AICCは、一般に、約45%〜約72%の顆粒球(好中球、好酸球、および好塩基球を含む)、約3%〜約10%の単球、および約25%〜約50%のリンパ球を含む。分析がFACSを使用して(例えば、側方散乱対前方散乱ドットプロット分析または対CD45および/またはCD14蛍光を使用して)行われるとき、AICCは、一般に、約50%〜約70%の顆粒球、約5%〜約15%の単球、および約15%〜約35%のリンパ球を含む。
顆粒球には、好中球、好酸球、および好塩基球が含まれる。いくつかの実施形態において、AICCは、AICC中の白血球の総数に基づき、約25%〜約85%の好中球、約0〜約9%の好酸球、約1.5〜約4%の好塩基球、約2%〜約40%の単球(樹状細胞を含む)、および約4%〜約70%のリンパ球を含む。
実施形態のいずれかにおいて、AICCは、一般に、約0.05〜約0.2×106/マイクロリットルの量で残存レベルの赤血球を、および/または一般に、約1〜約100×103/マイクロリットルの量で残存レベルの血小板をさらに含み得る。
いくつかの実施形態において、AICC中のリンパ球の亜集団は、以下の一般的な範囲内である:約20%〜約80%のT細胞(CD3+)、約5%〜約40%のB細胞(CD19+)、約5%〜約35%のNK細胞(CD3−/CD56+)、および/または約0.1%〜約35%のNKT細胞(CD3+/CD56+)。いくつかの実施形態において、T細胞中では、約5%〜約65%のTヘルパー細胞(CD4+/CD3+)および約5%〜約75%の細胞毒性Tリンパ球(CTL、CD8+/CD3+)が存在する。
他の実施形態において、約40%〜約60%のT細胞(CD3+)、約15%〜約30%のB細胞(CD19+)、約15%〜約30%のNK細胞(CD3−/CD56+)、約2%〜約20%のNKT細胞(CD3+/CD56+)が存在する。いくつかの実施形態において、T細胞では、約15%〜約40%のTヘルパー細胞(CD4+/CD3+)および約25%〜約50%のCTL(CD8+/CD3+)が存在する。
Th細胞とCTLの比率は、通常、約0.5〜1.5である。
実施形態のいずれかにおいて、DC、リンパ球、NK、およびNKT細胞マーカーのレベル、ならびにこれらのマーカーを発現する細胞のパーセンテージが、AICCを調製する方法に記載される、または実施例に記載されるように決定され得る。
一実施形態において、AICCは、DCを含み、アイソタイプ対照と比較して、フローサイトメトリーによって検出される、DCの少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、または30%は、CD8を発現する。
一実施形態において、アイソタイプ対照と比較して、フローサイトメトリーによって検出される、AICC中の単球の少なくとも約1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、または60%は、マーカーCCR7に対して陽性である。
一実施形態において、アイソタイプ対照と比較して、フローサイトメトリーによって検出される、AICC中の単球の少なくとも約1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、または60%は、マーカーCD40に対して陽性である。
一実施形態において、アイソタイプ対照と比較して、フローサイトメトリーによって検出される、AICC中の単球の少なくとも約1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、または60%の単球は、マーカーCD80に対して陽性である。
一実施形態において、アイソタイプ対照と比較して、フローサイトメトリーによって検出される、AICC中の単球の少なくとも約1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、または60%は、マーカーCD83に対して陽性である。
一実施形態において、マーカーCD86に対する総単球の平均蛍光強度(MFI)は、末梢血単球上よりも、少なくとも約0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、または10倍高く新鮮である。一実施形態において、マーカーCD86に対する単球の平均蛍光強度(MFI)は、国際公開第2010/100570号に従って調製されるALC中の単球上よりも少なくとも約0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、または10倍高い。これらの実施形態において、総単球は、汎白血球マーカーに対するSSCおよび染色によって決定される。
一実施形態において、マーカーCD83に対する総単球の平均蛍光強度(MFI)は、末梢血単球上よりも少なくとも約0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、または10倍高く新鮮である。一実施形態において、マーカーCD83に対する単球の平均蛍光強度(MFI)は、国際公開第2010/100570号に従って調製されるALC中の単球上よりも少なくとも約0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、または10倍高い。これらの実施形態において、総単球は、汎白血球マーカーに対するSSCおよび染色によって決定される。
一実施形態において、マーカーCD80に対する総単球の平均蛍光強度(MFI)は、末梢血単球上よりも少なくとも約0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、または10倍高く新鮮である。一実施形態において、マーカーCD80に対する単球の平均蛍光強度(MFI)は、国際公開第2010/100570号に従って調製されるALC中の単球上よりも少なくとも約0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、または10倍高い。これらの実施形態において、総単球は、汎白血球マーカーに対するSSCおよび染色によって決定される。
一実施形態において、マーカーCD40に対する総単球の平均蛍光強度(MFI)は、末梢血単球上よりも少なくとも約0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、または10倍高く新鮮である。一実施形態において、マーカーCD40に対する単球の平均蛍光強度(MFI)は、国際公開第2010/100570号に従って調製されるALC中の単球上よりも少なくとも約0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、または10倍高い。これらの実施形態において、総単球は、汎白血球マーカーに対するSSCおよび染色によって決定される。
一実施形態において、マーカーCCR7に対する総単球の平均蛍光強度(MFI)は、末梢血単球上よりも少なくとも約0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、または10倍高く新鮮である。一実施形態において、マーカーCCR7に対する単球の平均蛍光強度(MFI)は、国際公開第2010/100570号に従って調製されるALC中の単球上よりも少なくとも約0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、または10倍高い。これらの実施形態において、総単球は、汎白血球マーカーに対するSSCおよび染色によって決定される。
一実施形態において、マーカーCD54に対する総単球の平均蛍光強度(MFI)は、末梢血単球上よりも少なくとも約0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、または10倍高く新鮮である。一実施形態において、マーカーCD54に対する単球の平均蛍光強度(MFI)は、国際公開第2010/100570号に従って調製されるALC中の単球上よりも少なくとも約0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、または10倍高い。これらの実施形態において、総単球は、汎白血球マーカーに対するSSCおよび染色によって決定される。
一実施形態において、マーカーCD8に対する総単球の平均蛍光強度(MFI)は、末梢血単球上よりも少なくとも約0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、または10倍高く新鮮である。一実施形態において、マーカーCD8に対する単球の平均蛍光強度(MFI)は、国際公開第2010/100570号に従って調製されるALC中の単球上よりも少なくとも約0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、または10倍高い。これらの実施形態において、総単球は、汎白血球マーカーに対するSSCおよび染色によって決定される。
一実施形態において、AICCが超抗原の存在下で調製されるとき、アイソタイプ対照と比較して、フローサイトメトリーによって検出される、AICC中のCD3陽性リンパ球の少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、または35%は、マーカーCD69に対して陽性である。一実施形態において、超抗原は、100ng/mLでブドウ球菌エンテロトキシンB(SEB)である。
一実施形態において、AICCがT細胞−APCの相互作用を媒介する超抗原の存在下で調製されるとき、マーカーCD69に対してCD3陽性リンパ球の平均蛍光強度(MFI)は、少なくとも約0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、または5.0倍高い。一実施形態において、超抗原は、100ng/mLでブドウ球菌エンテロトキシンB(SEB)である。
一実施形態において、AICCが超抗原の存在下で調製されるとき、アイソタイプ対照と比較して、フローサイトメトリーによって検出される、AICC中のCD3陰性リンパ球の少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、または45%は、マーカーCD69に対して陽性である。一実施形態において、超抗原は、100ng/mLでブドウ球菌エンテロトキシンB(SEB)である。
一実施形態において、AICCがT細胞−APCの相互作用を媒介する超抗原の存在下で調製されるとき、マーカーCD69に対してCD3陰性リンパ球の平均蛍光強度(MFI)は、少なくとも約0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、または5.0倍高い。一実施形態において、超抗原は、100ng/mLでブドウ球菌エンテロトキシンB(SEB)である。
一実施形態において、AICCが超抗原の存在下で調製されるとき、アイソタイプ対照と比較して、フローサイトメトリーによって検出される、AICC中のCD3陽性リンパ球の少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、または35%は、マーカーCD25に対して陽性である。一実施形態において、超抗原は、100ng/mLでブドウ球菌エンテロトキシンB(SEB)である。
一実施形態において、AICCがT細胞−APCの相互作用を媒介する超抗原の存在下で調製されるとき、マーカーCD25に対してCD3陽性リンパ球の平均蛍光強度(MFI)は、プレインキュベーション組成物中または超抗原を用いずにインキュベートされたAICC中よりも少なくとも約0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、または6.0倍高い。一実施形態において、超抗原は、100ng/mLでブドウ球菌エンテロトキシンB(SEB)である。
一実施形態において、AICCが超抗原の存在下で調製されるとき、アイソタイプ対照と比較して、フローサイトメトリーによって検出される、CD3陰性リンパ球の少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、または35%は、マーカーCD25に対して陽性である。一実施形態において、超抗原は、100ng/mLでブドウ球菌エンテロトキシンB(SEB)である。
一実施形態において、AICCが超抗原の存在下で調製されるとき、マーカーCD25に対してCD3陰性リンパ球の平均蛍光強度(MFI)は、プレインキュベーション組成物中またはAICCが超抗原の不在下で調製されるときよりも少なくとも約0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、または5.0倍高い。一実施形態において、超抗原は、100ng/mLでブドウ球菌エンテロトキシンB(SEB)である。
一実施形態において、AICCが超抗原の存在下で調製されるとき、アイソタイプ対照と比較して、フローサイトメトリーによって検出される、超抗原でインキュベートされたAICC中の単球の少なくとも約30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、または80%は、マーカーCD40に対して陽性である。一実施形態において、超抗原は、100ng/mLでブドウ球菌エンテロトキシンB(SEB)である。
一実施形態において、マーカーCD40に対する単球の平均蛍光強度(MFI)は、プレインキュベーション組成物中またはAICCが超抗原の不在下で調製されるときよりも少なくとも約1.0、2.0、3.0、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、または10倍高い。一実施形態において、T細胞−APC超抗原は、100ng/mLでブドウ球菌エンテロトキシンB(SEB)である。
一実施形態において、ELISAによって決定される、AICC中のIL−12の濃度は、少なくとも約4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20ピコグラム/ミリリットルである。一実施形態において、AICCがT細胞−APCの相互作用を媒介する超抗原の存在下で調製されるとき、超抗原でインキュベートされたAICC中のIL−12の濃度は、AICCが超抗原の不在下で調製されるときよりも少なくとも約0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、または5.0倍高い。一実施形態において、超抗原は、100ng/mLでブドウ球菌エンテロトキシンB(SEB)である。
一実施形態において、ELISAによって決定される、AICC中のIL−2の濃度は、少なくとも約100、500、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、またはそれ以上のピコグラム/ミリリットルである。一実施形態において、IL−2の濃度は、T細胞−APCの相互作用を媒介する超抗原でインキュベートされたAICC中で決定される。一実施形態において、超抗原は、100ng/mLでブドウ球菌エンテロトキシンB(SEB)である。一実施形態において、超抗原が、AICCを生成するために使用される37℃で48時間のインキュベーション中に存在する。
一実施形態において、ELISAによって決定される、AICC中のIFN−ガンマ(IFN−g)の濃度は、少なくとも約80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、または300ピコグラム/ミリリットルである。一実施形態において、AICCがT細胞−APCの相互作用を媒介する超抗原の存在下で調製されるとき、超抗原でインキュベートされたAICC中のIFN−gの濃度は、AICCが超抗原の不在下で調製されるときよりも少なくとも約2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、または7.0倍高い。一実施形態において、超抗原は、100ng/mLでブドウ球菌エンテロトキシンB(SEB)である。
一実施形態において、AICCは、ナイーブCD4 T細胞に対する抗原提示を支持し、これは抗原の存在下、AICCで共培養されるとき、T細胞の増殖によって示される。一実施形態において、AICCは、Th1表現型によるT細胞の生成を支持し、これはAICCによる共培養後、T細胞によるIL−2およびIFN−ガンマの分泌によって示される。
いくつかの実施形態において、AICCは、末梢血中のこれらの同一のT細胞サブセットの比と比較して改変される比でT細胞サブセットを含む。一実施形態において、AICCは、約1:1未満のCD4 T細胞対CD8 T細胞の比(CD4/CD8の比)を含む。
一実施形態において、AICCは、1つ以上の細胞表面マーカーおよび/またはサイトカインに関して実施例に記載されるAICCの特徴を有する。一実施形態において、AICCは、表中に示される「平均」AICCの特徴のうちの1つ以上を有する(つまり、特徴は、表中に示された平均+/−任意の標準偏差を反映する)。一実施形態において、AICCは、図中の任意の数がその数の「約」として解釈されるべきであるが、図中に示される、代表的なAICCの1つ以上の特徴を有する。一実施形態において、AICCは、AICCが超抗原により刺激された後、実施例に記載される特徴を有する。
いくつかの実施形態において、本発明のAICCは、1つ以上の細胞集団に関して濃縮され得る。一実施形態において、AICCは、例えば、抗CD3抗体および抗CD19抗体を使用して、リンパ球の陰性選択によって樹状細胞に関して濃縮される。一実施形態において、AICCは、例えば、細胞付着を用いて、または抗HLA−DR抗体もしくは抗CD40抗体もしくは抗CD14抗体、またはこれらの組み合わせを用いて、単球および樹状細胞の陰性選択によってリンパ球に関して濃縮される。一実施形態において、AICCは、例えば、MACS中のコーティングされたビーズ上の抗CD3抗体またはFACS中の抗CD2抗体を用いて、陽性選択によってT細胞に関して濃縮される。
AICCのいずれかは、本発明の方法で治療上使用され得る。しかし、他の箇所で詳細に記載されるように、いくつかの実施形態において、AICCは、患者の腫瘍組織または腫瘍細胞株から産生される、あるいは組み換え方法または腫瘍から抗原または抗原ペプチドを抽出するまたは単離する任意の他の手段によって、例えば、腫瘍細胞からペプチドを溶出することによって産生される、腫瘍細胞からの抗原でインキュベートされる。いくつかの実施形態において、AICCまたはAICC内のDCは、癌幹細胞には一般的な抗原でインキュベートされる。いくつかの実施形態において、AICCまたはAICC内のDCは、細菌産物等の超抗原でインキュベートされる。抗原/ペプチドの添加は、単球からのDCのさらなる成熟、より具体的には、AICC中に存在するT細胞のより特定の活性化/プライミングをもたらすであろう。
AICCは、細胞成分および液体成分に分離され得る。したがって、一実施形態において、AICCは、本方法のいずれかから直接得られる細胞成分および液体成分を含む。一実施形態において、細胞成分が1つ以上の担体または賦形剤中に(再)製剤化され得るが、AICCは、液体成分から分離された細胞成分を含む。一実施形態において、AICCは、細胞成分から分離された液体成分を含む。細胞成分および液体成分はともに、治療上有益な特性を有すると考えられる。例えば、細胞成分は、成熟したDCおよび他の細胞型を含み、液体成分は、IL−2およびIL−12等の様々なサイトカインを含む。
いくつかの実施形態において、アジュバントを、AICCに添加して、腫瘍ワクチンを作製する。一実施形態において、ワクチンは、少なくとも1つの腫瘍抗原/ペプチドをさらに含む。アジュバントの例としては、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、Arlacel A、鉱油、乳化落花生油アジュバント(アジュバント65)、リポ多糖類(LPS)、リポソーム、エンドトキシン、コレステロール、脂肪酸、脂肪族アミン、パラフィン系オイルおよび植物油、モノホスホリルリピドA、Quil−A付きISCOM、およびシンテックスアジュバント製剤(SAF)が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、ワクチンは、血管形成阻害剤をさらに含み得る。これらには、抗VEGF抗体(例えば、ベバシズマブ、ラニビズマブ)、VEGF受容体に対する抗体(例えば、VEGFR−2およびFGFRを標的とするブリバニブ)、VEGF受容体のチロシンキナーゼ活性の阻害剤(例えば、ソラフェニブ、セジラニブ、スニチニブ)、可溶性受容体デコイ(例えば、アフリベルセプトとも呼ばれる、VEGFトラップ)、または血管破壊剤(例えば、ZD6126)が含まれるが、これらに限定されない。
AICC組成物は、必要に応じて、FDAで認可されたキット等のパックまたはディスペンサー装置中で提供され得、活性成分を含有する1つ以上の単位剤形を含み得る。例えば、このパックは、ブリスターパック等の金属またはプラスチック箔を含むことができる。このパックまたはディスペンサー装置には、投与のための説明書を添付することができる。また、それは、医薬品の製造、使用、または販売を規制する政府機関によって処方される形式で、容器に関連する通知を伴い、この組成物の形態またはヒトもしくは獣医学的投与に関して政府機関による承認を反映し得る。このような通知は、例えば、処方薬のための米国食品医薬品局によって承認されたラベル、または承認された製品挿入物のものであり得る。
さらなる態様において、本発明は、腫瘍を治療するためのワクチンとして製剤化されたAICCを提供する。一実施形態において、ワクチンは、上記の少なくとも1つのアジュバントをさらに含む。一実施形態において、ワクチンは、上記の腫瘍抗原のうちの少なくとも1つを用いて製剤化されたAICCを含む。一実施形態において、ワクチンは、成熟樹状細胞、活性化されたリンパ球、少なくとも5pg/mLのIL−12、少なくとも1500pg/mLのIL−2、および少なくとも100pg/mLのIFN−ガンマを含むAICCを含む。
別の態様において、本発明は、免疫応答を刺激するためのAICCを提供する。この態様の実施形態は、AICC自体に関して記載されたものと、AICCの治療上の使用に関して記載されたものと、を含む。例えば、この態様はまた、腫瘍を治療する、あるいは腫瘍に対して免疫応答を刺激するためのAICCに関する。
さらなる態様において、本発明は、免疫応答を刺激するための医薬の調製において、任意のAICCの使用を提供する。この態様の実施形態は、AICC自体に関して記載されたものと、AICCの治療上の使用に関して記載されたものと、を含む。例えば、この態様はまた、腫瘍を治療する、あるいは腫瘍に対して免疫応答を刺激するための医薬を調製するためのAICCの使用に関する。
III.治療上の使用
別の態様において、本発明は、AICCが免疫刺激組成物として使用される方法を提供する。したがって、本発明は少なくとも1つの腫瘍抗原に対して免疫応答を刺激する方法を包含し、本法は、対象に、本発明のAICCを投与することを含む。対象には、ヒトおよび獣医学的対象の両方が含まれる。
別の態様において、本発明は、AICCが免疫刺激組成物として使用される方法を提供する。したがって、本発明は少なくとも1つの腫瘍抗原に対して免疫応答を刺激する方法を包含し、本法は、対象に、本発明のAICCを投与することを含む。対象には、ヒトおよび獣医学的対象の両方が含まれる。
一態様において、本発明は、腫瘍に対する免疫応答を刺激することに関する。「腫瘍」とは、悪性または良性に関わらず、すべての新生細胞成長および増殖、ならびにすべての前癌性および癌性の細胞および組織を指す。
AICCは、あらゆる種類の腫瘍を治療するために投与され得る。治療可能である悪性腫瘍の例としては、黒色腫等の皮膚癌、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌、メルケル細胞癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、子宮頸癌、口腔癌、肝臓癌、膵臓癌、ホジキンリンパ腫および様々な種類の非ホジキンリンパ腫等の限局性リンパ腫、肉腫、頭頚部癌、食道癌、膀胱癌、前立腺癌、胃癌、上咽頭癌、S状結腸癌、直腸癌、乳癌、骨盤内癌、子宮内膜癌、および腹膜内膜の癌(中皮腫)が挙げられるが、これらに限定されない。治療される腫瘍は、それぞれ、TNM(対癌米国合同委員会(AJCC)病期分類システム)および組織学的分類に従って、様々な病期(第I〜IV期)およびグレード(グレード1〜4)であり得る。例えば、皮膚癌は、局所リンパ節への転移の有無に関わらず、表皮、真皮、または皮下組織を貫通し得る。それは、高分化型、中分化型、低分化型、および未分化型(高グレード)であり得る。
AICCは、原発腫瘍、腫瘍転移、ならびにカポジ肉腫と関連する良性皮膚病変等の様々な悪性病状で発生する潰瘍/病変を治療するために使用され得る。一実施形態において、AICCは、腫瘍摘出術後の残留する悪性細胞を阻害する。
いくつかの実施形態において、AICCは、さらなる操作を行わずに、腫瘍への免疫応答を刺激する方法に直接使用される。他の実施形態において、投与前に、AICCは、患者の腫瘍組織から生成された腫瘍細胞からまたは関連腫瘍細胞株からの抗原、CD166、CD133、ネスチン、CD44、CD24、およびALDH1等の癌幹細胞には一般的な抗原、または患者の腫瘍型と関連することが知られているペプチド抗原を用いて、インキュベートされる(パルスされる)。特定の腫瘍型の腫瘍抗原およびペプチド抗原の他の例は、AICCを調製する方法において記載される。さらに他の実施形態において、AICCは、投与前に、細菌産物等の1つ以上の「超抗原」でインキュベートされる。投与前に、AICCと抗原または超抗原との接触は、AICC中に存在するT細胞のさらなるおよびより特定の活性化/プライミングをもたらす。
抗原および抗原ペプチドの添加に関するさらなる実施例および詳細は、AICCを調製する方法の説明に示される。
いくつかの実施形態において、投与前に、アジュバントをAICCに添加する。アジュバントの例としては、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、Arlacel A、鉱油、乳化落花生油アジュバント(アジュバント65)、リポ多糖類(LPS)、リポソーム、エンドトキシン、コレステロール、脂肪酸、脂肪族アミン、パラフィン系オイルおよび植物油、モノホスホリルリピドA、Quil−A付きISCOM、およびシンテックスアジュバント製剤(SAF)が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、血管形成阻害剤を、投与前に、AICCに添加する。これらには、抗VEGF抗体(例えば、ベバシズマブ、ラニビズマブ)、VEGF受容体に対する抗体(例えば、VEGFR−2およびFGFRを標的とするブリバニブ)、VEGF受容体のチロシンキナーゼ活性の阻害剤(例えば、ソラフェニブ、セジラニブ、スニチニブ)、可溶性受容体デコイ(例えば、アフリベルセプトとも呼ばれる、VEGFトラップ)、または血管破壊剤(例えば、ZD6126)が含まれるが、これらに限定されない。
一般に、活性化された免疫刺激細胞組成物の適用は、AICCの1つ以上の投与によって達成される。一実施形態において、AICCは、全身投与される。全身投与の例には、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、および皮内注射が含まれる。一実施形態において、AICCは、局部的に、例えば、腫瘍またはリンパ節周辺に、腫瘍内、経皮、または皮下に投与される。一実施形態において、AICCは、結節内に投与される、すなわち、AICCは、腫瘍(例えば、このリンパを集めること)と関連する1つ以上のリンパ節に注入される。
いくつかの実施形態において、AICCは、単一部位で投与される。他の実施形態において、AICCは、複数の部位で投与される。
いくつかの実施形態において、AICCは、好適な注射器および針(例えば、18Gまたは25Gの針を装着した2mLの注射器)を用いた注射によって投与される。AICCを腫瘍および/または腫瘍周辺の組織および/または局所的にリンパを集めるリンパ節に直接注射するこれらの実施形態において、AICCの投与は、超音波、X線、および他の同様の技術の監視下、カテーテルまたは内視鏡装置を通して行われ得る。いくつかの実施形態において、注射は、腫瘍の全長に対してほぼ1センチメートルからほぼ3センチメートル間隔で行われる。別の実施形態において、注射は、腫瘍周辺の健常な組織、例えば、腫瘍のリンパを集めるリンパ節と関連する組織に行われる。一実施形態において、注射は、腫瘍のリンパを集めるリンパ節と関連する健常な組織領域でほぼ1センチメートルからほぼ3センチメートル間隔で行われる。
注射のために、AICCは直接使用され得る。この実施形態において、腫瘍致死免疫応答を刺激するのに役立ち得るサイトカインを含有し得るインキュベーション組成物は、AICCの細胞部分とともに投与される。代替の実施形態において、AICCの液体部分は、例えば、遠心分離によって除去され得、次いで、AICCの細胞部分は、水溶液中(任意に、AICCよりも更に濃縮された)、例えば、ハンクス溶液、リンガー溶液、または他の生理的食塩緩衝液等の生理的に相溶性のある緩衝液中、あるいは患者からの血清または血漿を含む血清または血漿中で製剤化され得る。
別の実施形態において、AICCは、生理的に不活性および/または吸収性マトリックスもしくは足場(例えば、コラーゲン)に吸収され、この損傷への圧入によって挿入される。これにより、細胞がより長い期間を原位置で有するという点において、患者のためになる部位へのAICCの持続送達を可能にする。
治療されるべき状態の重篤度および応答性に応じて、数日から数週間続く治療過程で、あるいは病状の減退が達成されるまで、投薬は、単回または複数回の投与であり得る。したがって、一実施形態において、AICCは、1回だけ投与される。別の実施形態において、AICCは、少なくとも2回、3回、4回、5回、または最高10回、もしくはそれ以上投与される。投与が、少なくとも2回の投与を含むとき、それぞれの投与は、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30日あけて行われ得る。代替として、それぞれの投与は、約1、2、3、4、5、または6ヶ月あけて行われ得る。
AICCは、臨床医が別の投入が必要であると判断する場合、1回以上投与され得る。考慮され得る要因には、腫瘍の大きさ、周辺組織または流入領域リンパ節への腫瘍の広がり、潰瘍化、化膿、発熱、または感染を示す任意の他の兆候もしくは症状、または再治療するのが当然であることを示唆する任意の臨床試験(複数可)が含まれる。再治療に加えて、外科治療のための照会は、臨床医が適切であると考える任意の時点で示され得る。
複数回の投与の場合、個々の投与はすべて、同じ経路を介して行われ得るか、または治療過程中、異なる投与に対して異なる投与経路が利用され得る。
投与されるAICCの量は、もちろん、治療される個人、苦痛の重症度、投与様式、処方する医師の判断等に応じて異なる。投与の用量およびタイミングは、個人の変化する状態の慎重かつ継続的なモニタリングに応答するであろう。さらに、治療アルゴリズムは、AICCが進行期および低分化の癌を有することを示す患者において、より有効であり得るため、悪性腫瘍の重症度または種類によって限定されるべきではない。
一実施形態において、AICCは、単回の治療法として使用されるが、1回または1回より多く投与され得る。しかしながら、他の実施形態において、AICCは、併用治療アプローチの一部として投与される。併用療法を含むこれらの実施形態において、AICCは、他の治療法前、その後、またはそれと組み合わせて投与される。AICCは、単独で、または特定の種類の癌に対して任意の他の従来の治療と組み合わせて使用され得る。従来の治療の例としては、放射線、化学療法、外科的腫瘍摘出術、レーザー療法および光線力学的療法等の電気生理学的方法による腫瘍焼灼法(tumor oblation)、局部、局在的、および全身温熱療法、 HYPERLINK "http://www.cancer.gov/cancertopics/factsheet/Therapy/angiogenesis-inhibitors" 血管形成阻害剤(抗VEGF抗体(例えば、ベバシズマブ、ラニビズマブ)、VEGF受容体に対する抗体(例えば、VEGFR−2およびFGFRを標的とするブリバニブ)、VEGF受容体のチロシンキナーゼ活性の阻害剤(例えば、ソラフェニブ、セジラニブ、スニチニブ)、可溶性受容体デコイ(例えば、アフリベルセプトとも呼ばれる、VEGFトラップ)、または血管破壊剤(例えば、ZD6126)等)による治療法、IL−2およびインターフェロンアルファ等のサイトカインによる治療法、BCG等のアジュバントによる治療法、リツキサン(非ホジキンリンパ腫の治療用)またはトラスツズマブ(乳癌の治療用)等の抗体による治療法、白血球、赤血球、および血小板の細胞計数をそれぞれ増加させるためのG−CSF(Neupogen)、エリスロポエチン(Epogen)、およびIL−11による治療法、骨髄もしくは造血幹細胞移植、遺伝子治療法、ならびに分子標的薬物による治療法が挙げられるが、これらに限定されない。
AICCによる腫瘍に対する免疫応答の刺激は、様々な方法で実証され得る。例えば、一実施形態において、対象へのAICCの投与は、腫瘍の大きさの低下を生じる。腫瘍は、長さ、幅、および高さの測定に対して評価され得、測定する生成物の合計の10%、20%、30%、40%、50%、60%、またはそれ以上の減少は腫瘍の大きさの減少を示す。代替的にまたはさらに、一実施形態において、対象へのAICCの投与は、腫瘍が局所的に残留しているか、または転移することなくカプセル化されるよう、任意の既存の病変の進行を阻害する。さらに他の実施形態において、X線、CTスキャン、MRI、PET、およびPET/CT、超音波、LDH試験、光音響検出、または腫瘍バイオマーカーレベル(前立腺癌についてのPSA等)等の、特定の腫瘍の状態および/または進行をモニタリングするために通常使用される臨床試験が、改善または回復を示す場合、AICCは、腫瘍への免疫応答を刺激する。
腫瘍治療に関連する実施形態のいずれかにおいて、腫瘍治療に対する応答性は、腫瘍に特異的なマーカーの血清濃度の低下によって測定される。ある特定の実施形態において、腫瘍治療に対する応答性は、全生存時間の増加、無進行生存率の増加、腫瘍の大きさの減少、骨代謝回転の転移マーカーの減少、最小限の残存疾患に対する影響の増加、増殖不能の状態になった癌細胞に対する抗体応答の誘発の増加、自己腫瘍の注射に対する遅延型過敏症(DTH)の応答の誘発の増加、または自己腫瘍もしくは候補の腫瘍関連抗原に対するT細胞応答の誘発の増加のうちの1つ以上によって測定される。
治療の性質に関係なく、AICCは、患者における疾患の転帰を改善するのに有用であり得る。加えて、AICCはまた、鎮痛効果を提供し得る。
次に、下記の実施例が参照されるが、下記の実施例は、上記の説明と一緒に、本発明を非限定様式で例示する。
別途記載されない限り、使用される術語と、利用される実験方法には、標準的な技術が含まれる。例えば、“Current Protocols in Molecular Biology” Volumes I−III Ausubel,R.M.,ed.(1994)、“Cell Biology: A Laboratory Handbook”,Volumes I−III Cellis,J.E.,ed.(1994)、“Current Protocols in Immunology” Volumes I−III Coligan J.E.,ed.(1994)、Stites et al.(eds),“Basic and Clinical Immunology”(8th Edition),Appleton & Lange,Norwalk,CT(1994)、“Animal Cell Culture” Freshney,R.L,ed.(1986)、“Methods in Enzymology” Vol.1−317,Academic Press、およびMarshak et al.,“Strategies for Protein Purification and Characterization−A Laboratory Course Manual” CSHL Press(1996)を参照のこと。
[実施例1:例示的な活性化された免疫刺激細胞組成物(AICC)の調製]
例示的なAICCが、以下の通りに調製された。
例示的なAICCが、以下の通りに調製された。
最初のステップとして、活性化された白血球組成物が、国際公開第2010/100570号に記載される方法に従って調製された。簡潔に述べると、単一単位の血液から得られる軟膜を、室温で8〜12時間インキュベートした。次いで、細胞を40〜45秒間水を添加することによって低浸透圧ショック(「HOS」)に供し、NaCl溶液を添加することによって等張を回復させた。遠心分離によって、細胞をペレット化し、細胞ペレットを、同一の血液単位から得られた血漿分画から得られた50mLの血清中に再懸濁させた。次いで、血清中の白血球懸濁液を、37℃で90分間インキュベートした。次いで、血清を廃棄し、新鮮血清を白血球に添加して、3〜4×106/mLの最終濃度を作製した。この初期組成物は、本実施例では、「プレインキュベーション組成物」(PC)と称される。
本実施例は、血清中で、37℃で90分間インキュベートしたPCを使用するが、低浸透圧ショック後、ペレット化された白血球もまた、例えば、血清中に再懸濁させ、一定期間、例えば、48時間直接インキュベートして、AICCを形成し得ることが明確に企図される。
本実施例において、穏やかな遠心分離、過剰な血清の除去、および白血球濃度が約10×106/mLであるように、多量の血清中での白血球ペレットの穏やかな再懸濁によって、PCを濃縮した。次いで、この組成物を、37℃、5% CO2および100%の湿度で、細胞インキュベーター中で、48または72時間(特定の実施例において示される)インキュベートした。このインキュベーションは、ガス透過性FEPバッグ中で行われた。
本実施例は、得られたAICCもまた、濃縮されるように、濃縮されたPCを使用して調製されたAICCの結果を示す。細胞が濃縮されるほど、十分な量の細胞を投与するのに必要とされる注入量が少なくなるため、濃縮されたAICCが、臨床的応用によく適し得る。しかし、非濃縮PCを使用する比較は、細胞型のパーセンテージまたは特定のマーカーの発現レベルのいずれかによって評価されるように、白血球濃度がAICC中の白血球組成物に影響を及ぼさなかったことを示した。したがって、非濃縮PCを使用することも可能であり、本実施例は、濃縮PCを使用して調製されたAICCに限定されるものとしていかようにも読み取られるべきではない。
続く実施例において、別途実施例に明示されない限り、プレインキュベートした組成物(PC)中の白血球は、濃縮PCから調製されたAICC中の白血球と比較された。
[実施例2:活性化された免疫刺激細胞組成物(AICC)の細胞集団分析]
AICCの細胞組成物は、2つの異なる細胞を計数する方法:Cell−Dyn Ruby Hematology Analyzer(Abbott Diagnostics)上の示差細胞計数およびFACSCalibur(商標)(BD Biosciences)上のフローサイトメトリー分析を使用して、PCの細胞組成物と比較された。Cell Dyn計数は、PC(「インキュベーション前」)中および37℃で48時間のインキュベーション後のAICC中に存在する細胞集団を比較する。表中では、WBCは、白血球(white blood cell)または白血球(leukocyte)を意味する。WBC総数およびWBC中の白血球型のパーセンテージの両方が、決定された。試料中の赤血球(RBC)および血小板の数もまた、決定された。Cell Dyn計数の結果を表1中に要約する。
AICCの細胞組成物は、2つの異なる細胞を計数する方法:Cell−Dyn Ruby Hematology Analyzer(Abbott Diagnostics)上の示差細胞計数およびFACSCalibur(商標)(BD Biosciences)上のフローサイトメトリー分析を使用して、PCの細胞組成物と比較された。Cell Dyn計数は、PC(「インキュベーション前」)中および37℃で48時間のインキュベーション後のAICC中に存在する細胞集団を比較する。表中では、WBCは、白血球(white blood cell)または白血球(leukocyte)を意味する。WBC総数およびWBC中の白血球型のパーセンテージの両方が、決定された。試料中の赤血球(RBC)および血小板の数もまた、決定された。Cell Dyn計数の結果を表1中に要約する。
提示されたデータは、異なる献血からの血液試料を用いて行われた5つの実験のそれぞれの平均±標準偏差である。それぞれのCell Dyn Hematology Analyzer測定を、三重で行い、平均計数を計算した。
PC(「インキュベーション前」)中、および37℃で48時間のインキュベーション後のAICC中に存在する白血球のサブタイプのパーセンテージもまた、フローサイトメトリーによって決定した。ペリジニンクロロフィルタンパク質(PerCP)に共役された汎白血球抗原CD45を用いて、標本細胞を染色した。CD45染色により、白血球集団の良好な解像が可能となった。FACSCalibur(商標)(BD Biosciences)を使用してフローサイトメトリーを行い、FACSDiva(商標)ソフトウェア(BD Biosciences)を使用して集団およびマーカー分析を行った。SSCおよびFL3(CD45−PerCP)シグナルに基づいて、白血球集団を、ゲートにかけた。
次いで、白血球集団における顆粒球、リンパ球、および単球のパーセンテージを決定した。白血球集団のフローサイトメトリー分析の結果を、5つの実験の平均+標準偏差として、表2中に示す。
2つの計数方法は、若干異なる結果を生じる。それにもかかわらず、それぞれの方法は、白血球サブセットの許容される尺度を提供する。Cell−Dynシステムは、しばしば、臨床的応用で使用される。しかし、下記に記載されるように、フローサイトメトリーは、個々の細胞の表面上の個々の分子の発現レベルを決定するために、有利に使用され得る。一般に、AICCは、白血球サブセットのパーセンテージの観点からPCとあまり変わらない。しかしながら、Cell−Dyn計数は、AICCを調製するためのインキュベーション中、白血球の総数が減少することを示す。
SSCおよびCD45−PerCP蛍光に基づいて、上記のゲートにかけられた白血球サブセットを、フローサイトメトリーによってさらに分析した。Tリンパ球およびBリンパ球を分離するために、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)に共役された抗CD3抗体およびアロフィコシアニン(APC)に共役された抗CD19抗体を用いて、試料を染色した。CD3+/CD19-であるリンパ球を、T細胞として計数し、一方、CD3-/CD19+である細胞をB細胞として計数した。抗CD4−APC、抗CD8−フィコエリトリン(PE)、および抗CD3−FITC抗体を用いて、試料を三重に染色した。次いで、CD3+リンパ球を、CD4+Tヘルパー細胞およびCD8+細胞毒性T細胞(CTL)に分離した。抗CD3−FITC、ならびにPE((CD56+CD16)−PE抗体)に共役された抗CD56抗体および抗CD16抗体の混合物を用いて、二重染色によって、NKおよびNKT細胞を、特定した。NK細胞を、CD3-/(CD56+CD16)+細胞として特定し、NKT細胞を、CD3+/(CD56+CD16)+細胞として特定した。異なる献血から生成されたAICCで行われた4〜7つの実験の結果を、表3中に要約し、平均±標準偏差として示す。
これらの結果は、出発組成物中のT細胞のパーセンテージと比較して、AICC中のT細胞(CD3陽性)のパーセンテージで38.8%から48.4%(p=0.18)の統計的に有意な増加を示す。
[実施例3:単球における樹状細胞マーカーの樹状細胞(DC)の活性化および分化の分析]
活性化および分化の分析
樹状細胞(DC)への単球の分化を、単球上のDC特異的マーカーHLA−DR、CD54、CD86、CD83、CD80、CD40、およびCCR7の発現のフローサイトメトリー分析によって評価した。まず、プレインキュベートした組成物(PC)中の単球を分析し、次いで、ガス透過性FEPバッグ中で48または72時間のインキュベーションを用いて生成したAICC中の単球を分析した。DC特異的マーカーのそれぞれに対する抗体を用いて、およびペリジニンクロロフィルタンパク質(PerCP)に共役された汎白血球抗原CD45に対する抗体を用いて、標本細胞を、二重染色した。後者は、白血球集団のより良好な解像のために使用された。抗HLA−DRおよび抗CCR7抗体を、アロフィコシアニン(APC)に共役した。DC特異的抗体の残りを、フィコエリトリン(PE)に共役した。
活性化および分化の分析
樹状細胞(DC)への単球の分化を、単球上のDC特異的マーカーHLA−DR、CD54、CD86、CD83、CD80、CD40、およびCCR7の発現のフローサイトメトリー分析によって評価した。まず、プレインキュベートした組成物(PC)中の単球を分析し、次いで、ガス透過性FEPバッグ中で48または72時間のインキュベーションを用いて生成したAICC中の単球を分析した。DC特異的マーカーのそれぞれに対する抗体を用いて、およびペリジニンクロロフィルタンパク質(PerCP)に共役された汎白血球抗原CD45に対する抗体を用いて、標本細胞を、二重染色した。後者は、白血球集団のより良好な解像のために使用された。抗HLA−DRおよび抗CCR7抗体を、アロフィコシアニン(APC)に共役した。DC特異的抗体の残りを、フィコエリトリン(PE)に共役した。
それぞれの時点からの細胞を、FACS染色溶液(PBS、2% 正常マウス血清、0.02% アジ化ナトリウム)で洗浄し、0.5×106/管でアリコートし、暗室で、4℃で30分間適切なモノクローナル抗体でインキュベートした。二次抗体(抗CD45−PerCP)を、暗室で、4℃で15分間添加した。インキュベーション後、細胞を洗浄し、PBS中で再懸濁し、FACSCalibur(商標)フローサイトメーター(BD Biosciences)上で分析した。同一条件下、無関係であるが、アイソタイプが一致した抗体を用いて染色された細胞を、陰性対照として使用した。これらの結果を、FACSDiva(商標)ソフトウェア(BD Biosciences)によって分析した。SSCおよびFL3(CD45陽性、赤色蛍光)シグナルに基づいて、白血球集団を、区別した。
単球上のDCマーカーのフローサイトメトリー分析の結果を表4中に要約し、代表的な実験を、図1中に示す。
マーカー発現を特徴付けるために使用され得る2つのパラメーター:1)マーカーを発現する細胞のパーセンテージ(陽性細胞の%)、および2)1個の細胞当たりのマーカー分子の数によって異なるマーカーの平均蛍光強度(MFI)がある。表4中のデータは、7〜8つの実験の平均+標準偏差として示されるそれぞれのマーカーに対するすべての単球のMFIを示す。それぞれの実験におけるそれぞれのマーカーに対して倍率の増加を計算し、次いで、平均+標準偏差を計算した。標準偏差によって示されるように、実験間で変動がある。それでもなお、MFIは、DCの分化および成熟と関連したマーカーのほとんどにおいて、PCと比較して、(48時間インキュベートされるか、または72時間インキュベートされるにかかわらず)AICC中で数倍高く、これにより、37℃で48時間のPCのインキュベーション中、DCへの単球を確認する。
図1は、代表的な実験における、PCを出発する組成物と比較して、48時間のインキュベーションを使用して調製されたAICCに対する倍率の増加を示す。倍率の増加を、それぞれのマーカーにおける3つのパラメーター:1)ある特定のマーカーを発現する細胞の数(陽性細胞の%、第1の棒)、2)すべての単球のMFI(中間の棒)、および3)「陽性」単球のMFI(第3の棒)において示す。MFIは、単球集団中の蛍光分布を表す。総単球のごく一部である細胞の一集団中のMFIの任意の増加を、なおも検出することができるように、陽性単球に対するある程度のMFIが含まれる。AICCを調製するために使用されたプレインキュベーション組成物(PC)中のHLA−DR発現は、すでに高かった。PC中では、94+3%の単球がHLA−DR陽性であり、MFIも高かった。HLA−DRの発現は、AICC中でさらに増加しなかった。マーカーCD86、CD83、CD40、およびCD54については、「陽性細胞の%」は、インキュベーション時のCD83の場合とほぼ同一であるか、またはさらに低下した(約0.2〜1倍の増加)が、陽性細胞のMFIが多くの倍率を増加したため、すべての単球のMFIは、主に、2〜5倍増加した。マーカーCD80およびCCR7については、陽性細胞の%およびMFIはともに、数倍増加した。
これらの結果は、AICCが、出発組成物と比較して、成熟DCに関して濃縮されることを示す。
細胞付着を促進する条件下、細胞をインキュベートする効果も研究された。AICCは、1つの種類は、普通の表面を有するものであり、他方の種類は、細胞付着を促進するように処理された表面を有するものの2つの異なる種類のバッグを用いて調製された。次いで、DC特異的マーカーの発現は、粘着性および非粘着性バッグを使用して調製されたAICCと比較された。この実験の結果を図2中に示す。驚いたことには、非粘着性バッグ中のインキュベーションは、粘着性バッグ中のインキュベーションと比較して、DCマーカーに対して高いMFIをもたらした。この効果は、特に、CD83、CD40、およびCCR7に対して著しかった。この効果は、特に、CD83、CD40、およびCCR7に対して著しい。
単球上のCD8−アルファ発現の分析
単球が低レベルのCD8−アルファを発現する一方、分化したDCの亜集団は、高いレベルのこのマーカーを発現する(Merad M,2000)。CD8α(+)樹状細胞(DC)は、高いレベルのIL−12を分泌し(Mashayekhi M,2011)、Tヘルパー細胞のTh1表現型を促進する(Maldonado−Lopez R,1999、Maldonado−Lopez R,2001)ため、細胞内病原体および腫瘍由来の抗原の交差提示においては、インビボで重要である。
単球が低レベルのCD8−アルファを発現する一方、分化したDCの亜集団は、高いレベルのこのマーカーを発現する(Merad M,2000)。CD8α(+)樹状細胞(DC)は、高いレベルのIL−12を分泌し(Mashayekhi M,2011)、Tヘルパー細胞のTh1表現型を促進する(Maldonado−Lopez R,1999、Maldonado−Lopez R,2001)ため、細胞内病原体および腫瘍由来の抗原の交差提示においては、インビボで重要である。
単球上のCD8発現は、フローサイトメトリーによって測定された。プレインキュベートした組成物(PC)中で、およびガス透過性FEPバッグ中で48時間のインキュベーションを用いて生成したAICC中で単球を分析した。PEに共役されたCD8に対する抗体を用いて、およびPerCPに共役された汎白血球抗原CD45に対する抗体を用いて、標本細胞を、二重染色した。単球集団中のCD8発現が分析され得るように、SSCおよびFL3(CD45)シグナルに基づいて、白血球集団を、区別した。
表5は、3つの実験の結果を要約する。図3は、代表的な実験を表す。
37℃で48時間のプレインキュベーション組成物(PC)のインキュベーションによって調製されたAICCは、PC中のCD8+細胞のパーセンテージと比較して、CD8を発現する単球のパーセンテージが増加した(表5および図3A)。CD8のMFIもまた、増加した(表5および図3B)。
[実施例4:AICC中のT細胞に対するDCによる超抗原提示の効果]
AICCを生成するための、PCのインキュベーション中、単球から産生されるDCの機能性を確認するために、超抗原(SA)であるブドウ球菌エンテロトキシンBを、インキュベーション混合物に添加した。超抗原(SA)も、抗原提示細胞上のMHCクラスII分子およびTリンパ球上のT細胞受容体に結合するため、処理された抗原ペプチドに類似する。しかしながら、SAは、他の抗原と異なり、細胞内処理を必要としないため、有利である。加えて、SAは、ある特定のファミリーのT細胞受容体を持つ約20%のT細胞を刺激し、その一方、ほとんどの抗原ペプチドは、抗原に特異的なT細胞のみを刺激するため、約0.001%のT細胞のみを刺激する(Bhardwaj N,1993)。それ故に、SAは、T細胞を刺激する、DC等の抗原提示細胞の能力を試験するためのペプチド抗原に対する代替物として使用することができる。
AICCを生成するための、PCのインキュベーション中、単球から産生されるDCの機能性を確認するために、超抗原(SA)であるブドウ球菌エンテロトキシンBを、インキュベーション混合物に添加した。超抗原(SA)も、抗原提示細胞上のMHCクラスII分子およびTリンパ球上のT細胞受容体に結合するため、処理された抗原ペプチドに類似する。しかしながら、SAは、他の抗原と異なり、細胞内処理を必要としないため、有利である。加えて、SAは、ある特定のファミリーのT細胞受容体を持つ約20%のT細胞を刺激し、その一方、ほとんどの抗原ペプチドは、抗原に特異的なT細胞のみを刺激するため、約0.001%のT細胞のみを刺激する(Bhardwaj N,1993)。それ故に、SAは、T細胞を刺激する、DC等の抗原提示細胞の能力を試験するためのペプチド抗原に対する代替物として使用することができる。
T細胞活性化マーカーCD69およびCD25(IL−2R)の分析
SAの存在下、AICC中のリンパ球の活性化を、公知のリンパ球活性化マーカーCD69の発現のフローサイトメトリー分析によって評価した。CD69の発現は、活性化されたT細胞上で急速に増加し、刺激してから18〜48時間後にピーク発現が生じる。(Simms & Ellis 1996)。まず、プレインキュベートした組成物(PC)中のリンパ球を分析し、次いで、異なる用量のSAブドウ球菌エンテロトキシンB(SEB)(Sigma Aldrich)の不在または存在下、細胞インキュベーター(37℃、5% CO2、および100% 湿度で)中で血清中の48または72時間のインキュベーション後のAICC中のリンパ球を分析した。実施例1で記載されたようにPCを産生し、濃縮した。DC等の抗原提示細胞との相互作用を必要としないポリクローナルT細胞刺激剤であるフィトヘムアグルチニン(PHA)を、対照として使用した。
SAの存在下、AICC中のリンパ球の活性化を、公知のリンパ球活性化マーカーCD69の発現のフローサイトメトリー分析によって評価した。CD69の発現は、活性化されたT細胞上で急速に増加し、刺激してから18〜48時間後にピーク発現が生じる。(Simms & Ellis 1996)。まず、プレインキュベートした組成物(PC)中のリンパ球を分析し、次いで、異なる用量のSAブドウ球菌エンテロトキシンB(SEB)(Sigma Aldrich)の不在または存在下、細胞インキュベーター(37℃、5% CO2、および100% 湿度で)中で血清中の48または72時間のインキュベーション後のAICC中のリンパ球を分析した。実施例1で記載されたようにPCを産生し、濃縮した。DC等の抗原提示細胞との相互作用を必要としないポリクローナルT細胞刺激剤であるフィトヘムアグルチニン(PHA)を、対照として使用した。
まず、リンパ球が、抗CD69−FITC抗体および抗CD3−APC抗体(ともに、eBioscienceからの)を用いて二重染色され、次に、抗CD45−PerCP抗体を用いて二重染色された。細胞は、フローサイトメトリーによって分析された。4つの実験の平均+標準偏差を、表6中に示す。図4は、代表的な実験を表す。
48時間でAICCは、SAの不在下、数が減少したCD69陽性T細胞(CD3+)および非T細胞(CD3-)を含んだ。SAの添加により、リンパ球の両方のサブセットを刺激し、CD69陽性細胞のパーセンテージ(表6および図4A)ならびにこれらの細胞の平均蛍光強度(MFI)(表6および図4B)の用量依存的な増加を引き起こした。MFIの増加は、それぞれの活性化された細胞上のCD69分子数の増加に反映する。DCによる抗原提示とは独立して作用するリンパ球の活性剤のフィトヘムアグルチニン(PHA)が同様の効果を生じることができなかったため、SAの効果は、DC依存性機構によるものであり、これは、DC依存性機構によるSAの特異的効果を示唆した(表6)。
IL−2受容体(CD25)の発現におけるSAの効果もまた、研究された。抗原提示は、リンパ球からのIL−2の放出およびそれらの表面上にIL−2受容体の上方調節を生じ、これにより免疫応答の増幅をもたらす。プレインキュベーション組成物は、100ng/mLのSAの存在下、血清中で、37℃で48時間インキュベートされた。得られたAICCが、抗CD25−PE抗体および抗CD3−FITC抗体(ともに、eBioscienceからの)を用いて二重染色され、次に、抗CD45−PerCP抗体を用いて二重染色された。4つの実験の結果を、表7中に要約し、代表的な実験を図5中に示す。
リンパ球へのDCによるSAの提示は、IL−2Rを発現するリンパ球のパーセンテージ(表7、図5A)およびそれぞれの細胞上のIL−2Rの数(MFI)(表7、図5B)を増加する。この効果は、T細胞およびCD3陰性細胞の両方に見られた。
単球分化マーカーCD40の分析
AICCを作製するために使用された48時間のインキュベーション中、超抗原(SA)の添加は、リンパ球の活性化を促進するだけでなく、DCのさらなる成熟をも刺激した。CD40は、T細胞上のCD40Lと相互作用するDC上の重要な共刺激分子であり、DCからのIL−12の産生を誘発する。したがって、CD40の発現は、DCが機能的に成熟していることの指標である。DCの成熟状態を評価するために、プレインキュベーション組成物中、および異なる量の超抗原の不在または存在下のいずれかで調製されたAICC中の単球上で、このマーカーのレベルを測定した。表8および図6は、異なる献血からのAICCで行われた3つの独立した実験の結果を要約する。
AICCを作製するために使用された48時間のインキュベーション中、超抗原(SA)の添加は、リンパ球の活性化を促進するだけでなく、DCのさらなる成熟をも刺激した。CD40は、T細胞上のCD40Lと相互作用するDC上の重要な共刺激分子であり、DCからのIL−12の産生を誘発する。したがって、CD40の発現は、DCが機能的に成熟していることの指標である。DCの成熟状態を評価するために、プレインキュベーション組成物中、および異なる量の超抗原の不在または存在下のいずれかで調製されたAICC中の単球上で、このマーカーのレベルを測定した。表8および図6は、異なる献血からのAICCで行われた3つの独立した実験の結果を要約する。
AICC中のCD40陽性細胞のパーセンテージは、増加する量のSAに伴って増加した(表8および図6A)。CD40の発現レベル(MFI)はまた、用量依存的な様式で、SAの添加によって増強された(表8および図6B)。MFIの結果に示されるように、CD40のレベルが、プレインキュベーション組成物と比較して、AICCにおいて高かったが、SAの存在により、細胞上のCD40レベルのさらに大きな増強をもたらした(表8、「MFI」および図6C)。DCによる抗原提示とは独立して作用するリンパ球の活性剤であるフィトヘムアグルチニン(PHA)は、この効果を生じることができなかった。
AICC中のIL−12含量の分析
完全に成熟したDCがT細胞と相互作用するとき、DCは、IL−12を産生する。したがって、IL−12のレベルもまた、決定された。
完全に成熟したDCがT細胞と相互作用するとき、DCは、IL−12を産生する。したがって、IL−12のレベルもまた、決定された。
第1の実験において、IL−12濃度は、PC中、およびFEPバッグ中で、37℃で48時間のインキュベーションを用いて調製されたAICC中で測定された。10mLの濃縮PCをバッグに入れて、AICCを調製するために、細胞を48時間インキュベートした。PCおよびAICC組成物を、3,500xgで、15℃で30分間遠心分離し、製造業者の取扱説明書に従って、IL12p70に対してDiaclone(商標)−ELISA(Gen−Probe,Inc)を用いて、上清中で、IL−12濃度を測定した。PCを産生した日に得られたか、または37℃で48時間AICCを用いて同時にインキュベートされた血清は、細胞を添加することなく、同じ方法で遠心分離した。血清のOD値を、バックグラウンドとして使用し、PCおよびAICC試料のそれぞれのOD値から減算した。
図7Aに示されるように、IL−12濃度は、AICC中で増加した。したがって、これらの結果は、DCに分化された単球が、AICC中でIL−12を産生することが可能であることのさらなる証拠を提供する。単球がAICC中で白血球全体のわずか約10%から成ることを考えると、これらの結果は、極めて有意である。
第2の実験(図7B)では、PCを、100ng/mLのSAの不在および存在下、37℃で48時間インキュベートし、AICCを生成した。平行培地を、室温(RT)でインキュベートした。再度、IL−12含量は、37℃で48時間のインキュベーション中、増加した。しかしながら、SAの存在下、IL−12濃度は、2倍超増加した。これらの結果は、DCのさらなる成熟が、SAの存在下で生じることを示唆している。インキュベーションが室温で行われたとき、SAの効果は見られず、これにより、IL−12放出が細胞機能に依存する生物学的過程であったことを確認した(図7B)。
AICCリンパ球によるIL−2産生の分析
抗原提示を介してDCにより活性化されたナイーブT細胞は、CD4陽性Th1表現型を得、多量のT細胞マイトジェンサイトカインIL−2を産生する。したがって、AICCが活性化されたT細胞を含んだ場合、それらのT細胞は、AICCが成熟DCを含有するため、抗原の存在下、IL−2を放出すべきである。
抗原提示を介してDCにより活性化されたナイーブT細胞は、CD4陽性Th1表現型を得、多量のT細胞マイトジェンサイトカインIL−2を産生する。したがって、AICCが活性化されたT細胞を含んだ場合、それらのT細胞は、AICCが成熟DCを含有するため、抗原の存在下、IL−2を放出すべきである。
IL−2の放出を検出するために、IL−2濃度を、プレインキュベーション組成物(PC)中、および100ng/mLのSAの存在および不在下、37℃で48時間のインキュベーションの終了時、AICC中で測定した。試料は、IL−12について記載されるように、調製された。細胞をペレット化した後、IL−2濃度を、IL−2ELISAキット(eBioscience)を用いて、上清中で測定した。上記のように、プレインキュベートされたおよびインキュベートされた血清試料を対照として使用した。加えて、インキュベートされた細胞(+/−SA)を、ペレット化し、培養培地で洗浄し、5×106/mLで添加剤を含まない新鮮血清中に再懸濁させて、3時間インキュベーター中に入れた。次いで、新鮮血清へのIL−2の放出を測定した。出発組成物として異なるバッチのPCを使用した3つの実験の結果を表9中に要約する。
表9中のデータは、AICC中のDCが機能的に活性であり、T細胞へのSAを提示し、IL−2の強固な放出を生じることを示す。表9中の結果はまた、活性化されたリンパ球がSA後にIL−2放出を継続し、AICC中の他の生物学的に活性な薬剤が洗い落とされたことも示す。図8に示されるように、SAの存在下で生成されたAICC中のIL−2濃度は、異なる対象から得られた3つすべての試料において高かった。インキュベートされた試料中でのIL−2濃度と、新鮮血清にIL−2を放出するリンパ球の能力との間に相関関係があった。SAをインキュベーション媒体に添加しなかった場合(すなわち、抗原提示の不在下)、ごく少量のIL−2を産生した。
AICCリンパ球によるIFN−ガンマ産生の分析
抗原提示を介してDCによって活性化されたCD4 Tヘルパー細胞およびCD8 細胞毒性Tリンパ球(CTL)エフェクターT細胞は、多量のインターフェロンガンマ(IFN−g)を産生する。IFN−gは、先天性および適応免疫、ならびに腫瘍制御に重要なサイトカインである。したがって、AICCが活性化されたT細胞を含んだ場合、AICCは、IFN−gを含有するはずである。
抗原提示を介してDCによって活性化されたCD4 Tヘルパー細胞およびCD8 細胞毒性Tリンパ球(CTL)エフェクターT細胞は、多量のインターフェロンガンマ(IFN−g)を産生する。IFN−gは、先天性および適応免疫、ならびに腫瘍制御に重要なサイトカインである。したがって、AICCが活性化されたT細胞を含んだ場合、AICCは、IFN−gを含有するはずである。
SAの存在下、48時間のインキュベーション中、IFN−g放出は、プレインキュベーション組成物(PC)中、および100ng/mLのSAの存在および不在下、37°Cで48時間のインキュベーションの終了時にAICC中で測定された。試料は、IL−12について記載されるように、調製された。IFN−gの濃度を、IFN−g ELISAキット(eBioscience)を用いて、細胞をペレット化した後の上清中で測定した。プレインキュベートされたおよびインキュベートされた血清試料を対照として使用した。血清中に自然に存在するIFN−gの量は、1.5〜5pg/mLの範囲であった。これらのバックグラウンドの血清濃度を、実験試料に対して得られた値から減算した。加えて、インキュベートした細胞(+/−SA)を、ペレット化し、培養培地で洗浄し、5×106/mLで添加剤を含まない新鮮血清中に再懸濁させた。細胞を3時間インキュベートし、新鮮血清へのIFN−gの放出を測定した。異なるバッチのPCを用いた4つの実験の結果を、表10に要約する。
表10中のデータは、AICC中のDCが機能的に活性であり、T細胞へのSAを提示し、IFN−gの強固な放出を生じることを示す。表10中の結果はまた、活性化されたリンパ球がSA後にIFN−gの放出を継続し、AICC中の他の生物学的に活性な薬剤が洗い落とされたことも示す。図9に示されるように、インキュベートされた試料中のIFN−gの濃度と、新鮮血清にIFN−gを放出するリンパ球の能力との間に相関関係があった。SAをインキュベーション媒体に添加しない場合には、ごく少量のIFN−gを産生し、抗原提示を生じない。
[実施例5:NK細胞に特異的な活性化マーカーの発現]
2つの公知のNK細胞活性化マーカー、CD57およびCD107aの発現はまた、プレインキュベーション組成物中、およびSAの不在および存在下、37℃で48時間インキュベートすることによって調製されたAICC中で評価された。白血球を、APCに共役されたCD57に対する抗体およびPEに共役されたCD107aに対する抗体で染色した。FITCまたはAPCのそれぞれ共役された単球上のCD14マーカーに対する第2の抗体を、白血球集団間のより良好な解像を達成するために添加した。リンパ球ゲート内の細胞を分析した。2つの実験の結果を表11に示す。
2つの公知のNK細胞活性化マーカー、CD57およびCD107aの発現はまた、プレインキュベーション組成物中、およびSAの不在および存在下、37℃で48時間インキュベートすることによって調製されたAICC中で評価された。白血球を、APCに共役されたCD57に対する抗体およびPEに共役されたCD107aに対する抗体で染色した。FITCまたはAPCのそれぞれ共役された単球上のCD14マーカーに対する第2の抗体を、白血球集団間のより良好な解像を達成するために添加した。リンパ球ゲート内の細胞を分析した。2つの実験の結果を表11に示す。
いずれのマーカーに対するMFIにおいて有意な差異は認められなかった。インキュベーションがSAの存在下で行われたとき、CD107a陽性細胞のパーセンテージは増加した(66.4%対47.5%)。
[実施例6:動物モデルにおける固形腫瘍に対する免疫応答の刺激]
AICCは、動物モデルにおいて、AICCの可溶性部分が腫瘍に対する免疫応答を刺激することを示すために、評価され得る。このアッセイで使用する動物モデルには、同系腫瘍細胞が移植された無傷免疫系を有する健常なマウスが含まれる。あるモデルは、C57BL/6(H−2b)マウス株と同系であるマウスB16黒色腫細胞株を使用する。使用され得る別のモデルは、4T1細胞の同所または異所移植であり、これらは、元来、BALB/cマウスの自然発生乳腺腫瘍に由来した。
AICCは、動物モデルにおいて、AICCの可溶性部分が腫瘍に対する免疫応答を刺激することを示すために、評価され得る。このアッセイで使用する動物モデルには、同系腫瘍細胞が移植された無傷免疫系を有する健常なマウスが含まれる。あるモデルは、C57BL/6(H−2b)マウス株と同系であるマウスB16黒色腫細胞株を使用する。使用され得る別のモデルは、4T1細胞の同所または異所移植であり、これらは、元来、BALB/cマウスの自然発生乳腺腫瘍に由来した。
簡潔に言えば、AICCは、例えば、健常なヒト対象の献血から上述のように調製される。AICCは、100ng/mLの黄色ブドウ球菌エンテロトキシンB(Staphylococcus Entertoxin B)等の超抗原の存在下、37℃で約48〜72時間のインキュベーションによって生成される。インキュベーションの終了時、AICC中の細胞を、例えば、遠心分離によって除去し、上清(すなわち、AICCの無細胞画分)を、同系腫瘍を保持するマウスへの注射のために使用する。移植後、無細胞AICCを1回以上動物に投与する。マウスのある群において、投与は、全身投与であるが、一方、別の群において、投与は、腫瘍周辺の領域への注射によるものである。腫瘍を保持するマウスのさらなる群には、超抗原を用いずに生成されたAICCを投与する。さらなる群には、AICCの生成中、活性化された白血球のインキュベーションのために使用されたヒト血清を投与する。未治療群は、対照群としての役割を果たす。
腫瘍の大きさおよび動物生存率を測定する。体重の変化および他の細胞毒性効果もモニタリングする。マウス活性化T細胞を産生するIFN−ガンマの頻度を、マウスIFN−ガンマ酵素連結免疫スポット(ELISPOT)アッセイによって測定する。生存が長期に及ぶ場合、腫瘍成長が阻害される場合、またはAICCを投与した動物が、腫瘍を移植したがAICCを投与しなかった、もしくはヒト血清を単独で投与した動物と比較して免疫応答の増加を示す場合、無細胞AICCは、腫瘍に対して免疫応答を刺激することが実証される。
[実施例7:悪性黒色腫の治療]
活性化された免疫刺激細胞組成物は、特に、皮膚癌、具体的には、黒色腫の治療に対して有用である。黒色腫は、メラニン細胞の悪性腫瘍である。メラニン細胞は、皮膚の色に関与する濃い色素であるメラニンを生成する細胞である。それらは、主に、皮膚で発生するが、腸および眼を含む体の他の部分にも見出される。黒色腫は皮膚癌の症例のうちの5%未満を占めるが、皮膚癌による死亡のうちの75%が黒色腫によるものである。黒色腫の発生率は、過去30年間、着実に増加している(American Cancer Society.2009 Cancer Facts and Figures)。2010年には、114,900例の黒色腫の新しい症例が、米国内で診断された(American Academy of Dermatology.Melanoma Fact Sheet.Accessed November 1,2010)。
活性化された免疫刺激細胞組成物は、特に、皮膚癌、具体的には、黒色腫の治療に対して有用である。黒色腫は、メラニン細胞の悪性腫瘍である。メラニン細胞は、皮膚の色に関与する濃い色素であるメラニンを生成する細胞である。それらは、主に、皮膚で発生するが、腸および眼を含む体の他の部分にも見出される。黒色腫は皮膚癌の症例のうちの5%未満を占めるが、皮膚癌による死亡のうちの75%が黒色腫によるものである。黒色腫の発生率は、過去30年間、着実に増加している(American Cancer Society.2009 Cancer Facts and Figures)。2010年には、114,900例の黒色腫の新しい症例が、米国内で診断された(American Academy of Dermatology.Melanoma Fact Sheet.Accessed November 1,2010)。
黒色腫を治療するために、AICCは、黒色腫であると診断された患者から調製される。代替として、AICCは、血液型(ABO、Rh)、ならびにHLA−A2、HLA−B12、およびHLA−Cw7等の特定のヒト白血球抗原(HLA)対立遺伝子が適合する健常な同種ドナーの末梢血から調製される。これらは、黒色腫患者の中で最も頻度の高い対立遺伝子である(Fensterle et al.,BMC Med.2006,13;4:5)。
AICCは、患者の黒色腫生検または腫瘍の外科的切除術から得られた組織からの腫瘍抗原で刺激される(調製中またはその後の別々のインキュベーション中のいずれかで)。腫瘍細胞溶解物が調製される。代替として、生検材料から得られた原発性黒色腫細胞株を、Naumann et al.,Br J Cancer.2009 Jan 27;100(2):322−33に記載されるプロトコルに従って、ダカルバジンおよびテモゾロミド等の黒色腫の化学療法剤に供する。処理細胞のアポトーシスを、例えば、He et al.,J Immunol Methods.2005 Sep;304(1−2):43−59)に記載されるアッセイを使用して、カスパーゼ3活性に対するフローサイトメトリーによって確認する。次いで、黒色腫溶解物またはアポトーシス細胞を、AICC中のDCに負荷する。
AICCはまた、公知の黒色腫抗原で刺激され得る。例示的な黒色腫抗原には、MART−1、MAGE−1、MAGE−3、TYR、およびgp100抗原が含まれる。
黒色腫抗原で負荷されたAICC中の細胞毒性T細胞の機能的活性は、生体外細胞毒性アッセイ中で評価される。このアッセイのために、原発性黒色腫細胞株が、同じ生検または外科的材料から構築される。細胞は、コラゲナーゼおよびDNaseによる酵素解離によって単離され、細胞懸濁液は、ダルベッコ変法イーグル培地10%のウシ胎仔血清(Gibco−BRL)、HEPES(1:500)、ペニシリン−ストレプトマイシン(1:100)、およびグルタミン(1:100)中で培養される。付着培養された黒色腫細胞は、様々な比率のAICCで、37℃で6時間インキュベートする。次いで、黒色腫細胞を洗浄し、アポトーシスの証拠についてカスパーゼ3活性を使用して、フローサイトメトリーによって分析される。
次いで、AICC組成物を、18ゲージ(18G)の針を使用して、任意のサイズの滅菌注射器に吸引する。細胞に対する損傷を最小限に抑えるように、ゆっくりと吸引を行う。注射器および針のサイズは、決して限定されるものではないが、大きいゲージの針が吸引には好ましい。これは、移動を促進し、細胞損傷を低減する。
AICCは、組成物を腫瘍中におよび/または腫瘍周辺の皮内的に注射することによって投与される。AICCはまた、全身的な効果のために局所リンパ節に注射され得る。代替的に、全注射器が、腫瘍内の単一部位に一度で注射され得る。臨床医は、AICCが臨床的パラメーターに基づいて必要であると判断される場合、さらなるAICCを投与することを選択し得る。
患者は、モニタリングされ、腫瘍の大きさ、転移の数、無進行生存率、腫瘍抗原に対する免疫応答等のパラメーターへのAICCの効果が判定される。患者の末梢血中の黒色腫特異的なCD8+T細胞の頻度を、例えば、IFN−ガンマ酵素連結免疫スポット(ELISPOT)アッセイを用いてモニタリングされる。
[実施例8:癌患者における抗腫瘍免疫応答を刺激するためのペプチドパルスしたAICCの調製]
末梢血の試料とともに、腫瘍生検は、腫瘍に罹患している患者から得られる。代替として、末梢血は、特に、ドナーが患者と1つ以上のHLA抗原が適合する場合、患者以外のドナーから得られ得る。末梢血は、白血球除去を含む標準的な静脈切開術/血液貯蔵技術によって得られ得る。同種の出発材料を含むこれらの実施形態において、これらは、便宜上血液銀行から得られ得る。試料は、血液型(ABO、Rh)、またはA2、B12、およびC3等であるが、これらに限定されない、特定のヒト白血球抗原対立遺伝子に関して血液銀行によってスクリーニングされ得る。
末梢血の試料とともに、腫瘍生検は、腫瘍に罹患している患者から得られる。代替として、末梢血は、特に、ドナーが患者と1つ以上のHLA抗原が適合する場合、患者以外のドナーから得られ得る。末梢血は、白血球除去を含む標準的な静脈切開術/血液貯蔵技術によって得られ得る。同種の出発材料を含むこれらの実施形態において、これらは、便宜上血液銀行から得られ得る。試料は、血液型(ABO、Rh)、またはA2、B12、およびC3等であるが、これらに限定されない、特定のヒト白血球抗原対立遺伝子に関して血液銀行によってスクリーニングされ得る。
腫瘍組織は、無菌処理条件下、腫瘍細胞を得るために、破壊される。次いで、腫瘍細胞は、腫瘍抗原を調製するために直ちに使用されるか、培養(継代培養)されるか、あるいは後で使用するために凍結保存される。所望されるならば、特定の腫瘍型と関連する1つ以上の腫瘍抗原の発現は、フローサイトメトリー、PCR、または他の標準技術によって確認することができる。
AICCは、上述のように、患者の末梢血試料から調製される。抗原は、AICCを調製するためのインキュベーションの一部の間、またはAICCの調製後に添加される。AICCは、患者の腫瘍細胞から調製された腫瘍細胞抗原を用いて、少なくとも1時間パルスされる。腫瘍細胞抗原がAICCの調製中添加される場合、パルスは、AICCのインキュベーション期間継続する。腫瘍細胞抗原の代替物として、特定の腫瘍型と関連する1つ以上のペプチド抗原が、例えば、約10マイクログラム/mL(1ペプチド抗原当たり)の濃度で使用され得る。腫瘍抗原調製物または1つ以上のペプチド抗原がAICCの生成後に添加される場合、AICCは、一般に、抗原またはペプチド抗原で、37℃で約16〜20時間パルスされるべきである。AICCが樹状細胞だけでなく、活性化されたTリンパ球等の他の細胞型、ならびにサイトカインおよび他の成長因子を含むため、AICCは、37℃でインキュベートされ、DCがAICC中のT細胞に対して腫瘍抗原(複数可)または腫瘍ペプチド抗原(複数可)を提示し、サイトカインが細胞の活性化をさらに促進するように作用することを可能にし得る。
インキュベーション後、AICCが患者に投与される。抗原パルスしたAICCが注入され得るか、またはそれは腫瘍への局所部位で注射することによって投与され得る。抗原パルスしたAICCが注射される場合、AICCが約107〜108のDCを含有するように、AICCを、任意に濃縮して、体積を減少させ得る。AICCの体積が、注射のために減少される場合、別々の注射または注入によって、AICC上清を投与することが望ましくあり得る。
AICCの投与後、患者は、腫瘍応答についてモニタリングされる。
特許公開および非特許刊行物を含む、本出願で言及されるすべての刊行物は、本発明が属する技術の当業者のスキルレベルを指標する。これらの刊行物のすべては、あたかも各個々の刊行物が参照により組み込まれるように具体的におよび個別に示されるのと同じ程度に参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の他の実施形態は、本明細書の考慮および本明細書に開示される実践から、当業者に明らかとなろう。本明細書および実施例は、例示的なものにすぎないと見なされることが意図され、本発明の真の範囲および精神は、次の特許請求の範囲によって示される。
Claims (33)
- 活性化された免疫刺激細胞組成物を作製するための方法であって、
a)ヒト白血球を活性化する時間および温度の条件下で、前記白血球をインキュベートすることと、
b)前記活性化された白血球を低浸透圧ショックに供することと、
c)等張を回復させるのに有効な量で塩溶液を前記白血球に添加することと、
d)前記白血球を支持媒体と混合することと、
e)樹状細胞の成熟を少なくとも誘発する時間、前記支持媒体中で前記白血球をインキュベートし、それにより、活性化された免疫刺激組成物を作製することと、を含む、方法。 - 活性化された免疫刺激細胞組成物を作製する方法であって、樹状細胞の成熟を誘発する時間および温度の条件下、支持媒体中で非休止状態の白血球をインキュベートし、それによって、活性化された免疫刺激組成物を作製することを含む、方法。
- 成熟樹状細胞(DC)を含む組成物を作製するための方法であって、
a)白血球を提供することと、
b)前記白血球を室温で約8〜20時間維持することによって、前記白血球を休止状態から活性状態に遷移させることと、
c)前記白血球を低浸透圧ショックに供することと、
d)支持媒体中で前記ショックさせた白血球を36時間〜14日間インキュベートし、それによって、成熟DCを含む組成物を作製することと、を含む、方法。 - 前記白血球が、前記支持媒体中で約36〜84時間インキュベートされる、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記白血球が、前記支持媒体中で約48〜72時間インキュベートされる、請求項4に記載の方法。
- 前記組成物では、成熟樹状細胞が濃縮されている、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組成物が、活性化されたリンパ球をさらに含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組成物が、Th1表現型が濃縮されたTヘルパー細胞をさらに含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組成物では、Th1サイトカインが濃縮されている、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組成物が、M1表現型が濃縮された活性マクロファージをさらに含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組成物では、M1サイトカインが濃縮されている、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記白血球が、末梢血、胎盤血、臍帯血、骨髄、またはリンパ系組織から単離される、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記支持媒体が、血清または血漿である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記支持媒体が、外因的に添加されたサイトカインまたはインターフェロンを含まない血清または血漿である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも1つの腫瘍抗原を前記支持媒体に添加することをさらに含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記成熟DCが、単球上でのレベルよりも高いレベルで、HLA−DR、CD86、CD54、CD40、CD80、CD83、またはCCR7のうちの少なくとも1つを発現する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法が、前記支持媒体を除去することと、前記白血球を生理的に許容される担体中に再懸濁させることと、をさらに含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 無細胞組成物を作製する方法であって、前記白血球のインキュベーション後に、請求項1〜5のいずれか一項に記載の支持媒体を回収することと、前記細胞を除去することと、を含む、方法。
- 請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法によって生成された、組成物。
- 成熟樹状細胞、活性化ヘルパーT細胞、細胞溶解性T細胞、および少なくとも1つの他の白血球細胞型を含む、組成物。
- 前記樹状細胞のうちの少なくとも50%が、HLA−DR、CD86、またはCD54のうちの少なくとも1つを発現する、請求項19または20に記載の組成物。
- 前記樹状細胞のうちの少なくとも5%が、CCR7、CD40、CD80、またはCD83のうちの少なくとも1つを発現する、請求項19〜21のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記樹状細胞のうちの少なくとも5%が、CD8を発現する、請求項19〜22のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が、少なくとも約5pg/mLのIL−12を含む、請求項19〜23のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が、少なくとも約1500pg/mLのIL−2を含む、請求項19〜24のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が、少なくとも約100pg/mLのIFN−ガンマを含む、請求項19〜25のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物では、細胞が枯渇している、請求項19または24〜26のいずれか一項に記載の組成物。
- 腫瘍を有する対象において、腫瘍細胞の数を減少させる方法であって、前記対象に、請求項19〜27のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含み、前記組成物が、前記腫瘍の少なくとも1つの抗原をさらに含む、方法。
- 患者において、腫瘍を安定化または退行させる方法であって、
a)前記腫瘍に罹患している患者から白血球を回収することと、
b)前記患者の腫瘍からの抗原を含むが、外因的に添加されたサイトカインまたは成長因子を欠く支持媒体中で、約37℃で前記白血球を培養して、成熟樹状細胞および活性化されたリンパ球を形成することと、
c)前記患者に、治療上有効量の前記組成物を投与することと、を含む、方法。 - 前記投与が、全身注射、腫瘍内注射、または前記腫瘍のリンパを集めるリンパ節への局所注射によるものである、請求項28または29に記載の方法。
- 前記腫瘍が、黒色腫、転移性黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌、メルケル細胞癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、子宮頸癌、口腔癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、肉腫、頭頚部癌、食道癌、膀胱癌、前立腺癌、または腹膜内膜の癌(中皮腫)である、請求項28〜30のいずれか一項に記載の方法。
- 前記腫瘍が、黒色腫である、請求項28〜31のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項19〜27のいずれか一項に記載の組成物、腫瘍抗原、およびアジュバントを含む、腫瘍ワクチン。
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