JP2015509974A - 感染治療のための活性化された免疫刺激細胞組成物 - Google Patents

Abstract

活性化された免疫刺激細胞の組成物を作製する方法、活性化された免疫刺激細胞の組成物、および感染性微生物に対する治療上免疫応答を刺激するためにこれらの組成物を使用する方法が記載される。【選択図】 図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年３月１５日に出願した米国仮特許出願第６１／６１１，１８０号の利益を主張するものであり、これは参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、活性化された免疫刺激細胞組成物、これらの組成物を調製する方法、および感染等の免疫刺激から恩恵を受け得る状態を治療するためのこれらの組成物の使用に関する。

ウイルスまたは細胞抗原は、感染細胞内で小さなペプチドに切断され、ヒト白血球抗原（ＨＬＡクラスＩ、例えばＨＬＡ Ａ、Ｂ、またはＣ）とも呼ばれるクラスＩの主要組織適合性分子（ＭＨＣクラスＩ）を有する複合体として免疫細胞に提示される。ＭＨＣクラスＩ−ペプチド複合体は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である、細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体によって認識される。ＴＣＲとＭＨＣ Ｉ−ペプチド複合体との相互作用は、感染細胞を破壊するＣＴＬからの物質（パーフォリン、グランザイム、およびグラニュリシン）の放出を生じる（Ｍｕｌｌｂａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９９；９６：１３９５０）。

初期ＣＴＬ応答は、存続時間が短く、継続するために、ＣＤ４＋Ｔヘルパー（Ｔｈ）リンパ球からの増幅支持を必要とする。Ｔｈ細胞の分化および増殖は、マクロファージまたは間質樹状細胞（ＤＣ）等のプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）との相互作用を通して生じる（Ｈｅａｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９；１０：１２３７−１２４４）。ＤＣは、トール様受容体（例えば、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８）およびＣ型レクチン（例えば、ＤＥＣ−２０５、ＤＣＩＲ、ＣＬＥＣ９Ａ）（Ａｌｔｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，２０１１）等のウイルスを認識するためのいくつかの受容体を発現する（Ａｌｔｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１１ Ｍａｒ；１１（３）：１７６−８６）。

ＡＰＣは、ウイルス、細菌、およびアポトーシスに感染した細胞を取り込み、それらのタンパク質を小さなペプチドに切断することによって、取り込まれた材料から抗原を処理し、次いで、ナイーブＴ細胞に対してペプチドを提示する。この処理は、ＭＨＣクラスＩ＋ペプチドによるＣＴＬの刺激と同様であるが、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ（例えば、ＨＬＡ−ＤＲ）に関連して提示されるペプチドを認識する。ＴＣＲによるＭＨＣクラスＩＩ−ペプチド複合体を認識すると、Ｔ細胞は、Ｔｈ機能を得、持続した免疫のために、ＣＴＬ応答を増幅し、Ｔ記憶細胞の成長を次に誘発するサイトカインのＩＬ−２を産生する（Ｋｅｅｎｅ ＪＡ，１９８２）。

Ｔ細胞の刺激は、少なくとも２つのステップで生じると考えられる（Ｍａｒｅｌｌｉ−Ｂｅｒｇ ＦＭ，２００７、Ｃｈａｍｂｅｒｓ ＣＡ ２００１）。第１のステップ（シグナル１）では、ＭＨＣ／ペプチド複合体が、ＴＣＲと相互作用する。このステップは、Ｔ細胞を完全に刺激するのに十分ではない。それどころか、ＡＰＣが発現している共刺激分子（ＣＤ８６、ＣＤ８３、ＣＤ８０、およびＣＤ４０等）のうちの１つとＴ細胞上の対応するリガンド（シグナル２）との第２の相互作用が必要とされる。シグナル２の不在下で、シグナル１を受容するＴ細胞は、ヘルパー機能を得ることができない（Ｃｈａｐｐｅｒｔ ＆ Ｓｃｈｗａｒｔｚ，２０１０）。

ナイーブＴヘルパー細胞とＤＣ等のＡＰＣとの相互作用は、Ｔｈ細胞をＴｈ１およびＴｈ２サブセットに分極し、これらのサブセットは、それらが生成するサイトカインのパターンによって異なる。Ｔｈ１細胞は、ＣＴＬの増殖を活性化するインターフェロンガンマおよびＩＬ−２等のサイトカインを産生する。Ｔｈ２細胞は、サイトカインであるＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３を産生する。Ｔｈ１サイトカインは、一般に、感染を排除するのにより有益である。例えば、ＩＮＦ−ガンマは、細胞内病原体（Ｓｃｈｏｅｎｂｏｒｎ ＆ Ｗｉｌｓｏｎ，２００７）に対する免疫には不可欠である（Ｓｃｈｏｅｎｂｏｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７，９６：４１−１０１）。偏ったＴｈ２サイトカインのプロファイルをもたらす炎症性Ｔｈ１応答の障害は、感染の結果に対して悪影響をもたらす（Ｎｅｔｅａ ｅｔ ａｌ，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２００５；４９（１０）：３９９１−９６（２００５）、Ｐａｌｕｃｋａ ＆ Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２，１４（４）：４２０−３１）。

Ｔｈ細胞と同様に、単球／マクロファージの表現型は、Ｔｈ１／Ｔｈ２サイトカイン間の平衡によって異なるプロセスにおいて分極する。これらの分極した細胞に対する術語は、Ｔｈ１およびＴｈ２の術語によく似ており、Ｔｈ１およびＴｈ２ Ｔ細胞と同様に、Ｍ１およびＭ２マクロファージは、異なるパターンのサイトカインを産生する。Ｍ１マクロファージは、主に、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＴＮＦα、ＩＬ−１、ＩＬ−６を産生し、一方、Ｍ２マクロファージは、高いレベルのＩＬ−１０およびＩＬ−１３を産生する（Ｃａｓｓｅｔｔａ Ｌ，２０１１、Ｂｅｎｏｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８．１８１（６）：３７３３−９）。Ｍ１マクロファージはまた、高いレベルのＨＬＡ−ＤＲを発現し、一方、Ｍ２マクロファージは、高いレベルのＣＤ１６３抗原を発現する。完全に分極したＭ１およびＭ２マクロファージは、一連の機能的状態の両極端である。

末梢血単球から分化すると考えられる別のＡＰＣは、骨髄樹状細胞（ＤＣ）である。成熟した活性化されたＤＣは、非常に効力の強いＡＰＣである。ＤＣの成熟は、ＭＨＣ分子、共刺激分子（ＣＤ８６、ＣＤ８３ ＣＤ８０、ＣＤ４０）、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、およびＣＤ５４等の接着分子、ならびにケモカイン受容体ＣＣＲ７の上方調節と関連がある（Ａｌｖａｒｅｚ Ｄ，２００８、Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００；１８：７６７−８１１）。

後者は、血管壁を通って末梢組織からＴ細胞領域にＤＣを移動させることができる（Ｆｏｒｓｔｅｒ Ｒ，２００８）。ＤＣの成熟は、Ｔ細胞の刺激に関連する分子の発現を確実にするだけでなく、ＤＣがナイーブＴ細胞に対して抗原を提示することができるように、二次リンパ器官中の適切な解剖学的なコンパートメントに達することが可能である。Ｔ細胞からの同族シグナルは、ＤＣをさらに活性化する（Ｃａｖａｎａｇｈ ＬＬ，２００２）。

成熟骨髄ＤＣは、ＩＬ−１２を作製するそれらの能力を特徴とする（Ｍａｒｉｏｔｔｉ Ｓ，２００８）。ＩＬ−１２がＴｈ１分極を促進するため、ＩＬ−１２を産生するＤＣがワクチン開発に使用される（Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ Ｇ：２００３）。

上記の適応できる抗原特異的な免疫応答を刺激することに加えて、ＤＣはまた、先天性（ＭＨＣ無制限の）免疫を刺激することにも関与する。これらの細胞は、ＴＣＲ（ＣＤ３−／ＣＤ５６＋細胞）およびサイトカインで誘発されたキラーＴ細胞（ＣＤ３＋／ＣＤ５６＋）を発現しない、古典的なナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）を含む。ＮＫ細胞は、パーフォリン−グランザイム経路を介して、またはＦａｓリガンド等の死受容体リガンドを発現することによって、感染細胞のアポトーシスを直接誘発することができる（Ｂｒｙｃｅｓｏｎ ＹＴ，２０１１）。ＩＬ−１２を産生するＤＣは、ＮＫ細胞の増殖を誘発させることができる（Ｗａｌｚｅｒ Ｔ，２００５）。ＮＫ細胞はまた、ＤＣの分化を促進するサイトカインを放出する（Ｆｅｒｌａｚｚｏ Ｇ，２００９）。形質細胞様ＤＣは、ＨＩＶ感染を含むウイルス感染に応答して多量のＩ型インターフェロン（ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β）を産生する。Ｉ型インターフェロンは、ウイルス感染細胞の死滅を媒介するバイスタンダー様式で骨髄ＤＣおよびＮＫ細胞を刺激する（Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ Ｇ，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．２０１０；２０７（１０）：２０５３−６３）。

それ故に、成熟ＤＣは、有効な適応できる（Ｔ細胞）および先天性（ＮＫ、ＮＫＴ細胞）の両方の免疫応答を生じるのに重要な細胞型である。実際には、多くの研究が、感染、特に、慢性感染のための治療法としてＤＣ系ワクチンの適用に着目し、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染した患者における樹状細胞の使用についていくつかの臨床試験が進行中である（Ｐａｔｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．２０１１．；１８（２６）：３９８７−９４）。したがって、感染中の治療法等の免疫刺激が有効であり得る状態の治療のために、完全に成熟した樹状細胞および他の活性化された免疫細胞を含む組成物の大いなる必要性がある。

ある特定の実施形態の概要
本発明は、活性化された免疫刺激細胞組成物、これらの組成物を調製する方法、および感染等の免疫刺激から恩恵を受け得る状態を治療するためのこれらの組成物の使用に関する。

したがって、一態様において、本発明は、ウイルス感染を治療する方法に関し、本方法は、感染対象に、組成物成熟樹状細胞、活性化ヘルパーＴ細胞、細胞溶解性Ｔ細胞、および少なくとも１つの他の白血球細胞型を投与することを含む。

別の態様において、本発明は、ウイルス感染を治療する方法に関し、本方法は、（ａ）白血球を活性化する時間および温度の条件下で、白血球をインキュベートすることと、（ｂ）組成物中の樹状細胞の成熟を誘発する時間および温度の条件下、支持媒体中で活性化された白血球を培養することと、（ｃ）樹状細胞を含む組成物をこの対象に導入し、それによって、ウイルス感染を治療することと、を含む。

なお別の態様において、本発明は、ウイルス感染を治療する方法に関し、本方法は、（ａ）組成物中の樹状細胞の成熟を誘発する時間および温度の条件下、支持媒体中で非休止状態の白血球をインキュベートすることと、（ｂ）樹状細胞を含む組成物を対象に導入し、それによって、ウイルス感染を治療することと、を含む。

さらに別の態様において、本発明は、ウイルス感染を治療する方法に関し、本方法は、（ａ）ｉ）白血球を提供することと、ｉｉ）白血球を室温で約８〜２０時間維持することによって、白血球を休止状態から活性状態に遷移させることと、ｉｉｉ）白血球を低浸透圧ショックに供することと、ｉｖ）支持媒体中でショックさせた白血球を３６時間〜１４日間インキュベートし、それによって、成熟ＤＣを含む組成物を作製することと、によって成熟樹状細胞を含む組成物を調製することと、（ｂ）樹状細胞を含む組成物を対象に導入し、それによってウイルス感染を治療することと、を含む。

同様の態様において、本発明は、ウイルス感染を治療するために医薬の調製における本発明の組成物のうちのいずれかの使用に関する。

他の同様の態様において、本発明は、ウイルス感染を治療するために本発明の組成物のうちのいずれかに関する。

本発明のこれらの態様のいくつかの実施形態において、樹状細胞を含む組成物は、ウイルスから少なくとも１つのペプチドエピトープに曝露される。

本発明のこれらの態様のいくつかの実施形態において、ウイルス感染は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ１）、単純ヘルペスウイルス２（ＨＳＶ２）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、またはヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）によるウイルス感染である。

本発明のこれらの態様のいくつかの実施形態において、ウイルス感染は、ＨＩＶによる感染である。

本発明のこれらの態様のいくつかの実施形態において、ウイルス感染は、慢性である。

別の態様において、本発明は、感染性微生物による感染を治療する方法に関し、本方法は、感染対象に、組成物成熟樹状細胞、活性化ヘルパーＴ細胞、細胞溶解性Ｔ細胞、および少なくとも１つの他の白血球細胞型を投与することを含む。

別の態様において、本発明は、感染性微生物による感染を治療する方法に関し、本方法は、（ａ）白血球を活性化する時間および温度の条件下で、白血球をインキュベートすることと、（ｂ）組成物中の樹状細胞の成熟を誘発する時間および温度の条件下、支持媒体中で活性化された白血球を培養することと、（ｄ）樹状細胞を含む組成物を対象に導入し、それによって、ウイルス感染を治療することと、を含む。

さらに別の態様において、本発明は、感染を治療する方法に関し、本方法は、（ａ）組成物中の樹状細胞の成熟を誘発する時間および温度の条件下、支持媒体中で非休止状態の白血球をインキュベートすることと、（ｂ）樹状細胞を含む組成物を対象に導入し、それによって、感染を治療することと、を含む。

なお別の態様において、本発明は、感染性微生物による感染を治療する方法に関し、本方法は、（ａ）ｉ）白血球を提供することと、ｉｉ）白血球を室温で約８〜２０時間維持することによって、白血球を休止状態から活性状態に遷移させることと、ｉｉｉ）白血球を低浸透圧ショックに供することと、ｉｖ）支持媒体中でショックさせた白血球を３６時間〜１４日間インキュベートし、それによって、成熟ＤＣを含む組成物を作製することと、によって成熟樹状細胞を含む組成物を調製することと、（ｂ）樹状細胞を含む組成物を対象に導入し、それによって感染を治療することと、を含む。

同様の態様において、本発明は、感染性微生物による感染を治療するための医薬の調製における本発明の組成物のうちのいずれかの使用に関する。

その他の同様の態様において、本発明は、感染性微生物による感染を治療するための本発明の組成物のうちのいずれかに関する。

本発明のこれらの態様のうちのいくつかの実施形態において、樹状細胞を含む組成物は、感染性微生物から少なくとも１つのペプチドエピトープに曝露される。

本発明のこれらの態様のうちのいくつかの実施形態において、感染は、細菌感染である。

本発明のこれらの態様のうちのいくつかの実施形態において、感染は、真菌感染である。

本発明のこれらの態様のうちのいくつかの実施形態において、感染は、原虫感染である。

本発明のこれらの態様のうちのいくつかの実施形態において、感染は、プリオンタンパク質によるものである。

本出願の実施形態の追加の目的および利点は、部分的には以下の説明で述べられ、部分的にはその説明から明らかになるか、またはそれらは実践によって学習することができる。本実施形態の目的および利点は、添付の特許請求の範囲において特に指摘される要素および組み合わせを用いて明らかになるであろう。

別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、本発明が属する当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または同等の方法および材料が、本発明の実践または試験で使用することができるが、好適な方法および材料が以下に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、特許明細書が優先する。加えて、材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。

本明細書では、本発明は、単に例示し添付の図面を参照して説明する。ここで特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示としてであり、例示考察することだけを目的としていることを強調するものである。この点について、本発明の基本的理解に必要である以上に本発明の構造的な詳細を示す試みはなされておらず、図面とともに行われる説明は、本発明の様々な形態が実際にどのように具現化され得るかを当業者に対して明らかにするものである。
３７℃で４８時間のインキュベーション後の倍率の増加として表される単球上の樹状細胞（ＤＣ）マーカーを示す。 付着性および非付着性培養条件での、３７℃で４８時間のインキュベーション前およびその後のＤＣマーカーの発現を比較する。 ３７℃で４８時間のインキュベーション前およびその後の単球上のＣＤ８の発現を比較する。図３Ａは、ＣＤ８陽性細胞％を表す。図３Ｂは、ＣＤ８の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を表す。 超抗原である黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＢの存在または不在下での、３７℃で４８時間のインキュベーション前およびその後のリンパ球サブセットにおける活性化マーカーＣＤ６９の発現を示す。図４Ａは、すべてのリンパ球、Ｔ細胞、またはＣＤ３陰性細胞の中の陽性細胞％を表す。図４Ｂは、それぞれの集団における陽性細胞におけるＣＤ６９の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を表す。 超抗原である黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＢの不在（４８時間）および存在（４８時間ＳＡ）下での、３７℃で４８時間のインキュベーション前およびその後のリンパ球サブセットにおけるＩＬ−２受容体（ＣＤ２５）の発現を示す。 超抗原である黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＢの不在および存在下での、３７℃で４８時間のインキュベーション前およびその後の単球上のＣＤ４０の発現を示す。図６Ａは、ＣＤ４０陽性細胞％を表す。図６Ｂは、平均蛍光強度を表す。図６Ｃは、４８時間のインキュベーション後の倍率の増加を示す。 図７Ａは、３７℃で４８時間のインキュベーション前およびその後のＩＬ−１２産生を示す。図７Ｂは、超抗原である黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＢの不在および存在下での、室温（ＲＴ）でまたは３７℃で４８時間のインキュベーション前およびその後のＩＬ−１２産生を示す。 超抗原である黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＢの不在および存在下での、３７℃で４８時間のインキュベーション後の、ＡＩＣＣ中のＩＬ−２内容物、および新鮮血清中で再懸濁されたＡＩＣＣの洗浄細胞によるＩＬ−２産生を示す。 超抗原である黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＢの存在下での、３７℃で４８時間のインキュベーション後のＩＦＮ−ガンマ産生、およびエンテロトキシンＢの存在下での、３７℃で４８時間のインキュベーション後の新鮮血清中で再懸濁された洗浄細胞によるＩＦＮ−ガンマ産生を示す。

以下に更に詳細に記載されるように、本発明は、活性化された免疫刺激細胞の組成物（ＡＩＣＣ）、ＡＩＣＣを調製する方法、およびＡＩＣＣを使用する方法に関する。

本発明のＡＩＣＣは、成熟ＤＣに分化される機能的に活性な単球を含み、これはそれらの細胞表面マーカーのプロファイル、Ｔ細胞への超抗原等の抗原を提示するそれらの能力、および優先的なＴｈ１極性を促進する主な要因であるＩＬ−１２の放出によって示される。ＡＩＣＣ中のＴ細胞もまた、活性化される。抗原の存在下で、ＡＩＣＣ中で成熟ＤＣとＴ細胞の相互作用は、Ｔ細胞のＩＬ−２受容体の上方調節ならびにＩＬ−２およびＩＦＮ−ｇの放出を生じる。ＡＩＣＣ中でＤＣが抗原に曝露されるとき、ＩＬ−１２の産生が急激に増加する。したがって、本発明のＡＩＣＣは、免疫刺激のための強力なツールである。例えば、インビボで投与されるとき、ＡＩＣＣは、ＣＴＬの増殖を活性化し、ウイルスおよび細菌等の感染性微生物の除去ならびにこれらの感染性微生物により感染した細胞の除去を促進する、Ｔｈ１サイトカイン（例えば、インターフェロン、ＩＬ−２）を好むようにサイトカイン平衡を変化させることができる。

理論により拘束されることなく、本発明のＡＩＣＣは、単球／マクロファージをＭ１表現型に分極する。実施例に示されるように、ＡＩＣＣ中の単球／マクロファージの大部分は、高レベルのＨＬＡ−ＤＲを発現し、ＩＬ−１２およびその他のＭ１サイトカインを産生する。Ｍ１サイトカインは、腫瘍環境という状況で、細胞性免疫に対する阻害作用を克服することが知られている。したがって、ＡＩＣＣ中のサイトカインはまた、様々な感染性微生物によって発揮され得る阻害剤作用を克服するのに有用である。

本発明の原理および実施は、図面および添付の説明を参照して、よりよく理解され得る。本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用が、以下の説明に記載されているか、または実施例によって例示されている詳細に限定されないことを理解すべきである。本発明は、他の実施形態も可能であるし、または様々な方法で実践または実施することができる。

本明細書に採用されている表現および用語は、説明を目的としており、限定的なものと見なすべきでないことも理解すべきである。さらに、任意およびすべての値（数値範囲の下限および上限を含む）に関連して使用される「約」という用語は、＋／−０．５％〜＋／−２０％（ならびにそれらの間の値、例えば、±１％、±１．５％、±２％、±２．５％、±３％、±３．５％、±４％、±４．５％、±５％、±５．５％、±６％、±６．５％、±７％、±７．５％、±８％、±８．５％、±９％、±９．５％、±１０％、±１０．５％、±１１％、±１１．５％、±１２％、±１２．５％、±１３、±１３．５％、±１４％、±１４．５％、±１５％、±１５．５％、±１６％、±１６．５％、±１７％、±１７．５％、±１８％、±１８．５％、±１９％、±１９．５％、および±２０％）の範囲の偏差を含む。

Ｉ 活性化された免疫刺激細胞の組成物を作製する方法
白血球は、免疫応答を介在するために活性化を必要とする。ここで使用される、活性化された免疫刺激細胞組成物とは、少なくとも１つの型の活性化された白血球を含む組成物を指す。この文脈において、「活性化された」とは、細胞が活性化された細胞の１つ以上の機能的または表現型の特性を得ていることを意味する。活性化された（または「成熟した」）樹状細胞の特性の例としては、ＩＬ−１２の産生；ＩＬ−１０の不在または低レベルの産生、共刺激分子ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３、ＣＤ４０、またはＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ１）のうちの１つ以上の、ＣＤ５６、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、もしくはＩＧＳＦ４（ＳｙｎＣａｍおよびネクチン様２）等の１つ以上の接着分子の、ＣＬＥＣ９Ａ（ＤＮＧＲ−１）等の１つ以上のレクチン受容体の、ＣＣＲ７等の１つ以上のケモカイン受容体の、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、もしくはＴＬＲ７、もしくはＴＬＲ８等の１つ以上のトール受容体の、ＤＣ−ＬＡＭＰ等の１つ以上のｅｎｄｏｃｏｍａｌタンパク質の、またはＩｄ２、ＩＲＦ８、もしくはＩＣＳＢＰ等の１つ以上の転写因子の、発現；抗原提示を介してナイーブＴ細胞を活性化する能力；ならびに抗体分泌（血漿）細胞へのＢ細胞の分化を誘発する能力が挙げられるが、これらに限定されない。活性化されたＴ細胞の特性の例としては、ＩＬ−２、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＦＮ−アルファ、またはＩＦＮ−ベータのうちの１つ以上の産生；ＩＬ−２Ｒの発現；ＣＤ６９、ＣＤ７１（トランスフェリン受容体１）、ＣＤ２８、またはＣＤ４０Ｌのうちの１つ以上等のＴ細胞活性化マーカーの上方調節；ならびに抗原、細胞毒性機能、またはヘルパー機能への曝露後の増殖が挙げられるが、これらに限定されない。

一実施形態において、ＡＩＣＣは、末梢血から調製される。末梢血には、一般に、赤血球（ＲＢＣ）および血小板だけでなく、白血球も含有する。「白血球細胞」としても知られている白血球には、単球（様々な組織および樹状細胞のマクロファージに分化する「前駆」細胞）、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、およびナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）を含む）、ならびに顆粒球（好中球、好塩基球、および好酸球を含む）が含まれる。

代替の実施形態において、全末梢血が、便利な白血球の供給源であるが、ＡＩＣＣは、中心線からの血液、臍帯血、胎盤血、リンパ液、骨髄、またはリンパ節もしくは膵臓等のリンパ系組織から単離された白血球を用いて調製される。白血球は、白血球除去によって調製され得る。したがって、白血球の供給源は、重要であるとは考えられない。

全血が使用されるとき、白血球は、異なる細胞型の密度勾配分離法を使用して、「軟膜」を調製することによって、赤血球および血小板から部分的に分離することができる。したがって、いくつかの実施形態において、ＡＩＣＣ中に存在する血小板および赤血球の量は、全血中のものよりも低い。

ＡＩＣＣを産生するための出発材料は、自家供給源または同種異系供給源から得られ得る。一実施形態において、ＡＩＣＣは、ＡＩＣＣにより最終的に治療されるであろう患者から調製される、すなわち、この供給源は、自家である。他の実施形態において、ＡＩＣＣは、意図されたＡＩＣＣ受容者以外の個人から調製される。この場合は、この供給源は、同種異系である。

同種出発材料を含む、これらの実施形態において、これらは、血液銀行から好都合に得られ得る。試料は、血液型（ＡＢＯ、Ｒｈ）、またはＡ２、Ｂ１２、およびＣ３等であるが、これらに限定されない、特定のヒト白血球抗原の対立遺伝子、赤血球抗原に対する不規則な抗体、ならびに輸血感染症について、血液バンクによってスクリーニングされ得る。より具体的には、スクリーニングは、Ａｂｂｏｔｔ ＰＲＩＳＭ機器を用いて、抗体でＢ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＨＩＶ１／２、ＨＴＬＶ、および梅毒（−ＨＣＶ；ＨｂｓＡｇ；抗ＨＩＶ １／２ Ｏ＋；および抗ＨＴＬＶ Ｉ／ＩＩ）について実行することができる。試料はまた、分子方法（ＮＡＴ−核酸試験）によってＨＩＶ、ＨＣＶ、およびＨＢＶに対してもスクリーニングすることができる。分子スクリーニングは、市販の機器、例えば、ＣｈｉｒｏｎのＴＩＧＲＩＳシステムを用いて、またはこのような疾患について試験する好適な形態であり得る任意の他の方法を用いて達成することができる。

同種異系の供給源に関与する一実施形態において、試料は、意図されたＡＩＣＣ受容者と同じ血液型を有するドナーから得られる。一実施形態において、ドナー（複数可）および受容者である患者は、１つ以上のＨＬＡ対立遺伝子型に基づいて、適合させることができる。代替として、血漿試料は、ＡＢ＋血液型を有するドナーから得ることができ、白血球は、Ｏ−血液型を有するドナーから得ることができる。ＡＢ＋血液型を有するドナーは、血漿の万能ドナーであり、Ｏ−血液型を有するドナーは、白血球の万能ドナーである。この血漿は、新鮮な、保存された（例えば、２４時間未満１〜６℃で）、乾燥させたか、またはそうでなければ前処理された（例えば、病原体減少血漿および溶媒／浄化剤（ＳＤ）処理された血漿）状態であり得る。供給源に関わらず、試料（複数可）の必要な処理はすべて、高度に特殊な装置を必要とせずに実行することができる。

いくつかの実施形態において、活性化された免疫刺激細胞の組成物は、すべての溶液の体積を同量減らし、より小さなバッグまたは他のインキュベーション容器を使用して、低体積の血液試料から調製し得る。さらに、これらの異なるサイズのインキュベーション容器の使用により、同様の組成物を有するＡＩＣＣが得られる。低体積の使用により、臨床医に、外部の血液銀行を用いずに自己に血液採血を行う能力を提供する。これは、他の点では健常な免疫系を有する患者を治療するとき、有用であり得る。

いくつかの実施形態において、ＡＩＣＣを調製する方法は、ａ）ヒト白血球を活性化することと、ｂ）樹状細胞（ＤＣ）の分化および成熟を誘発する時間および温度の条件下、インキュベーション組成物中の活性化された白血球をインキュベートし、それにより、ＡＩＣＣを産生することと、を含む。一実施形態において、ステップ（ｂ）はまた、リンパ球の活性化を誘発する。

一実施形態において、本方法は、ＤＣを抗原または抗原ペプチドと接触させることをさらに含む。一実施形態において、抗原または抗原ペプチドが、インキュベーション組成物中で分化および成熟するとき、ＤＣと接触させる。つまり、抗原または抗原ペプチドは、ステップ（ｂ）のインキュベーションの一部またはすべての期間添加される。一実施形態において、インキュベーション組成物中でインキュベーションが完了した後、抗原または抗原ペプチドを、ＤＣと接触させる。つまり、本方法は、抗原または抗原ペプチドを、抗原ペプチドを用いてＤＣを負荷するのに十分な期間にわたってＡＩＣＣに添加するステップ（ｃ）をさらに含む。

一実施形態において、国際公開第２０１０／１００５７０号の方法を使用して産生された活性化白血球組成物は、ＡＩＣＣを調製する際に使用される。この実施形態において、活性化白血球組成物は、上記の実施形態の方法のステップ（ａ）に相当する。

いくつかの実施形態において、ＡＩＣＣを調製する方法は、ａ）ヒト白血球を単離することと、ｂ）任意に、白血球を低浸透圧ショックに供することと、ｃ）樹状細胞（ＤＣ）の分化および成熟を誘発する時間および温度の条件下で、インキュベーション組成物中のショックさせた白血球をインキュベートし、それにより、ＡＩＣＣを産生することと、を含む。一実施形態において、ステップ（ｃ）はまた、リンパ球の活性化を誘発する。

一実施形態において、本方法は、ＤＣを抗原または抗原ペプチドと接触させることをさらに含む。一実施形態において、抗原または抗原ペプチドが、インキュベーション組成物中で分化および成熟するとき、ＤＣと接触させる。つまり、抗原または抗原ペプチドは、ステップ（ｃ）のインキュベーションの一部またはすべての期間添加される。一実施形態において、インキュベーション組成物中のインキュベーションが完了した後、抗原または抗原ペプチドを、ＤＣと接触させる。つまり、本方法は、抗原または抗原ペプチドを、抗原ペプチドを用いてＤＣを負荷するのに十分な期間にわたってＡＩＣＣに添加するステップ（ｄ）をさらに含む。

一実施形態において、国際公開第２０１０／１００５７０号の方法を使用して産生された活性化白血球組成物は、ＡＩＣＣを調製する際に使用される。この実施形態において、活性化白血球組成物は、上記の実施形態の方法のステップ（ａ）および（ｂ）に相当する。

いくつかの実施形態において、本方法は、ａ）白血球を活性化する時間および温度の条件下で、ヒト白血球をインキュベートすることと、ｂ）任意に、白血球を低浸透圧ショックに供することと、ｃ）等張を回復させるのに有効な量で生理学的に許容される塩溶液をステップｂの白血球に添加することと、ｄ）ステップｃの白血球を媒体と混合して、第２のインキュベーション組成物を形成することと、ｅ）樹状細胞（ＤＣ）の分化および成熟を誘発する時間および温度の条件下、第２のインキュベーション組成物をインキュベートし、それにより、ＡＩＣＣを産生することと、を含む。一実施形態において、ステップ（ｅ）はまた、リンパ球のさらなる活性化を誘発する。

一実施形態において、本方法は、ステップ（ｅ）の樹状細胞（ＤＣ）を抗原または抗原ペプチドと接触させることをさらに含む。一実施形態において、抗原または抗原ペプチドが、インキュベーション組成物中で分化および成熟するとき、ＤＣと接触させる。つまり、抗原または抗原ペプチドは、ステップ（ｅ）のインキュベーションの一部またはすべての期間添加される。一実施形態において、インキュベーション組成物中のインキュベーションが完了した後、抗原または抗原ペプチドを、ＤＣと接触させる。つまり、本方法は、抗原または抗原ペプチドを、抗原ペプチドを用いてＤＣを負荷するのに十分な期間にわたってＡＩＣＣに添加するステップ（ｆ）をさらに含む。

一実施形態において、国際公開第２０１０／１００５７０号の方法を使用して産生された活性化白血球組成物は、ＡＩＣＣを調製する際に使用される。この実施形態において、活性化白血球組成物は、上記の実施形態の方法のステップ（ａ）〜（ｄ）に相当する。

いくつかの実施形態において、本方法は、ａ）白血球を活性化するために、室温で最長約２０時間ヒト白血球をインキュベートすることと、ｂ）白血球を低浸透圧ショックに供することと、ｃ）等張を回復させるのに有効な量で生理学的に許容される塩溶液をステップｂの白血球に添加することと、ｄ）ステップｃの白血球を媒体と混合して、第２のインキュベーション組成物を形成することと、ｅ）樹状細胞（ＤＣ）の分化および成熟を誘発する時間および温度の条件下、第２のインキュベーション組成物をインキュベートし、それにより、ＡＩＣＣを産生することと、を含む。一実施形態において、ステップ（ｅ）はまた、リンパ球のさらなる活性化を誘発する。

一実施形態において、本方法は、ステップ（ｅ）の樹状細胞（ＤＣ）を抗原または抗原ペプチドと接触させることをさらに含む。一実施形態において、抗原または抗原ペプチドが、インキュベーション組成物中で分化および成熟するとき、ＤＣと接触させる。つまり、抗原または抗原ペプチドは、ステップ（ｅ）のインキュベーションの一部またはすべての期間添加される。一実施形態において、インキュベーション組成物中のインキュベーションが完了した後、抗原または抗原ペプチドを、ＤＣと接触させる。つまり、本方法は、抗原または抗原ペプチドを、抗原ペプチドを用いてＤＣを負荷するのに十分な期間にわたってＡＩＣＣに添加するステップ（ｆ）をさらに含む。

一実施形態において、国際公開第２０１０／１００５７０号の方法を使用して産生された活性化白血球組成物は、ＡＩＣＣを調製する際に使用される。この実施形態において、活性化白血球組成物は、上記の実施形態の方法のステップ（ａ）〜（ｄ）に相当する。

いくつかの実施形態において、本方法は、ａ）ヒト白血球を活性化することと、ｂ）ステップａの白血球を媒体と混合して、第２のインキュベーション組成物を形成することと、ｃ）樹状細胞（ＤＣ）の分化および成熟を誘発する時間および温度の条件下、第２のインキュベーション組成物をインキュベートし、それにより、ＡＩＣＣを産生することと、を含む。白血球の活性化は、ＣＤ１１ｂおよび／またはＣＤ６２Ｌ等の白血球の活性化マーカーを表す白血球の発現レベルまたはその数の変化によって示される。したがって、一実施形態において、白血球の活性化は、白血球集団におけるＣＤ１１ｂの発現の増加によって示される。ＣＤ１１ｂの発現の増加は、例えば、フローサイトメトリーによって検出することができる。ＣＤ１１ｂの発現の増加は、白血球におけるＣＤ１１ｂに対する平均蛍光強度の増加を包含し、例えば、平均蛍光強度は、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％増加し得る。ＣＤ１１ｂの発現の増加はまた、ＣＤ１１ｂを発現する白血球のパーセンテージの増加を包含する（例えば、アイソタイプ対照を使用して、背景染色に対して補正された後）。例えば、ＣＤ１１ｂを発現する白血球のパーセンテージは、軟膜中の白血球におけるＣＤ１１ｂ発現の発現と比較して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％増加し得る。一実施形態において、白血球の活性化は、白血球集団におけるＣＤ６２Ｌの発現の減少によって示される。ＣＤ６２Ｌの発現の減少は、例えば、フローサイトメトリーによって検出することができる。ＣＤ６２Ｌの発現の減少は、白血球におけるＣＤ６２Ｌに対する平均蛍光強度の減少を包含し、例えば、平均蛍光強度は、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％減少し得る。ＣＤ６２Ｌの発現の減少はまた、ＣＤ６２Ｌを発現する白血球のパーセンテージの減少を包含する（例えば、アイソタイプ対照を使用して、背景染色に対して補正された後）。例えば、ＣＤ６２Ｌを発現する白血球のパーセンテージは、軟膜中の白血球におけるＣＤ６２Ｌ発現の発現と比較して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％減少し得る。一実施形態において、ＣＤ６２Ｌおよび／またはＣＤ１１ｂは、顆粒球である白血球において測定される。一実施形態において、ＣＤ６２Ｌおよび／またはＣＤ１１ｂは、単球である白血球において測定される。一実施形態において、ステップ（ｃ）はまた、リンパ球のさらなる活性化を誘発する。

加えて、白血球の活性化に関与する他の実施形態のいずれかでは、上で論じられる、ＣＤ１１ｂおよび／またはＣＤ６２Ｌの発現の変化は、白血球の活性化の指標として、単独で、一緒に、または本出願中の他の箇所で論じられる、さらなるマーカーおよびアッセイと組み合わせて、使用され得る。

一実施形態において、本方法は、ステップ（ｃ）の樹状細胞（ＤＣ）を抗原または抗原ペプチドと接触させることをさらに含む。一実施形態において、抗原または抗原ペプチドが、インキュベーション組成物中で分化および成熟するとき、ＤＣと接触させる。つまり、抗原または抗原ペプチドは、ステップ（ｃ）のインキュベーションの一部またはすべての期間添加される。一実施形態において、インキュベーション組成物中のインキュベーションが完了した後、抗原または抗原ペプチドを、ＤＣと接触させる。つまり、本方法は、抗原または抗原ペプチドを、抗原ペプチドを用いてＤＣを負荷するのに十分な期間にわたってＡＩＣＣに添加するステップ（ｄ）をさらに含む。

一実施形態において、国際公開第２０１０／１００５７０号の方法を用いて産生された活性化白血球組成物は、ＡＩＣＣを調製する際に使用される。この実施形態において、活性化白血球組成物は、上記の実施形態の方法のステップ（ａ）および（ｂ）に相当する。

一般に、ＡＩＣＣを調製する方法のうちのいずれかでは、白血球が休止状態から機能的に活性な状態に遷移した任意の組成物は、低浸透圧ショックステップのために使用され得る。例えば、国際公開第２０１０／１００５７０号に記載されるように、白血球は、それらを室温で最長約２０時間インキュベートすることによって、休止状態から機能的に活性な状態に遷移させることができる。一実施形態において、この遷移は、白血球を室温で約９０分間〜約２０時間インキュベートすることによって生じる。一実施形態において、この遷移は、白血球を室温で約８時間〜約２０時間インキュベートすることによって生じる。一実施形態において、この遷移は、白血球を室温で一晩インキュベートすることによって生じる。他の実施形態において、温度は、約３７°Ｃであり得る。上述のように、この「遷移する」ステップの詳細は、不可欠なものではなく、白血球は、ＡＩＣＣを調製するために使用される任意の方法によって得られ得る。

さらに、低浸透圧ショックは、一種の応力であるため、低浸透圧ショックのステップを含む方法のこれらの実施形態において、他の方法が、細胞に応力を与えるために採用され得る。つまり、様々な種類の応力が、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性化をもたらすタンパク質キナーゼカスケードからなる同じ高度に保存されたシグナル伝達経路を通って細胞応答を引き起こすため、低浸透圧ショックを言及する実施形態のいずれかにおいて、低浸透圧ショックの代わりに、他のストレス要因が使用され得る。例えば、いくつかの実施形態において、ＡＩＣＣを調製する方法は、熱ショック、低酸素症、クロルプロマジン、カフェイン、バナジウム酸塩、ザイモリアーゼ（ｚｙｍｏｌｙｓｅ）、コンゴレッド、カルコフロール、ラパマイシン、もしくは接合フェロモンのうちのいずれかの１つ以上による処理から選択されるストレス要因に、白血球を曝露する、あるいはアクチン脱重合の誘発による、任意のステップを（低浸透圧ショックの代わりに、またはそれに加えて）含む。白血球の活性化はまた、細胞内のカルシウムの増加を生じ、この応答を模倣する多くの作動薬が存在する。したがって、さらに他の実施形態において、ＡＩＣＣを調製する方法は、低浸透圧ショックの代わりに、またはそれに加えて、ＦＭＬＰまたはＰＭＡ等のカルシウムイオノフォアに、白血球を曝露する任意のステップを含む。

ＡＩＣＣを産生する様々な方法の実施形態のいずれかにおいて、「樹状細胞（ＤＣ）の分化および成熟を誘発する時間および温度の条件」下でのインキュベーション（任意に、リンパ球および他の細胞を活性化し得る）は、一般に、ほぼ室温〜約３７℃で約２４時間〜約１４日間のインキュベーションである。

いくつかの実施形態において、樹状細胞（ＤＣ）の分化および成熟を誘発するインキュベーションは、ほぼ室温の温度で、すなわち、約１２℃〜約２８℃の範囲内である。一実施形態において、インキュベーションは、約１６℃〜約２５℃の温度である。一実施形態において、インキュベーションは、約１８〜２５℃の温度である。なお別の実施形態において、インキュベーションは、約２０〜２５℃の温度である。

いくつかの実施形態において、樹状細胞（ＤＣ）の分化および成熟を誘発するインキュベーションは、約３７℃の温度である。一実施形態において、インキュベーションは、約３５℃〜約３８℃である。一実施形態において、インキュベーションは、３７℃＋／−０．５℃である。

いくつかの実施形態において、樹状細胞（ＤＣ）の分化および成熟を誘発するためのインキュベーション期間は、約２４時間〜１４日間である。したがって、いくつかの実施形態において、インキュベーションは、約２４、３０、３６、４２、４８、５４、６０、６６、７２、８４、９６、１０８、１２０、１３２、１４４、１５６、１６８、１９２、２１６、２４０、２６４、２８８、３１２、または約３３６時間、あるいは、これらの値の間でほぼ任意の時間範囲内である。

いくつかの実施形態において、樹状細胞（ＤＣ）の分化および成熟を誘発するためのインキュベーション期間は、約４８〜約７２時間の範囲である。一実施形態において、インキュベーションは、約３７℃で約４８〜約７２時間の範囲である。一実施形態において、インキュベーションは、約３７℃で約４８時間行う。一実施形態において、インキュベーションは、約３７℃で約７２時間行う。一実施形態において、インキュベーションは、室温で約２４〜約７２時間行う。

いくつかの実施形態において、インキュベーションは、５％ ＣＯ２を含有する雰囲気中、１００％の湿度で、細胞インキュベーター中である。いくつかの実施形態において、インキュベーションは、ガス透過性バッグ中で行われ、これらのバッグは、５％ ＣＯ₂を含有する雰囲気中、１００％の湿度で、細胞インキュベーター中に入れる。他の実施形態において、組織培養フラスコまたは皿が、本方法で使用される。さらに他の実施形態において、バッグシステムおよび培養皿またはフラスコの組み合わせが、本方法で使用される。バッグシステム中でのインキュベーションを含むこれらの実施形態において、このバッグシステムは、国際公開第２０１０／１００５７０号に記載されるもののうちの１つであり得るか、あるいは、フッ素化エチレンプロピレン（ＦＥＰ）またはエチルビニルアセテート（ＥＶＡ）等であるが、これらに限定されない異なる材料から作製されるバッグであり得るか、または組織培養容器もしくは任意の容器内であり得る。

インキュベーションに使用される任意の容器はまた、白血球に付着するように、処理され得るか、またはそうでなければ改質され得、このことは、白血球の活性化、単球の分化、およびリンパ球の活性化／プライミングに対して有益であり得る。一実施形態において、ＡＩＣＣを調製する方法に使用される培養容器のうちの１つ以上は、樹状細胞に対して非付着性である。別の実施形態において、ＡＩＣＣを調製する方法で使用される培養容器は、細胞付着を軽減するように処理される。さらに別の実施形態において、ＡＩＣＣを調製する方法で使用される１つ以上の培養容器は、細胞の付着を増大させるように処理される。

インキュベーションに使用される任意の容器はまた、足場を含有し得る。足場は、異なる形状であり得、特に、これらは、例えば、コラーゲンで作られている、またはＰＬＡ、ＰＧＡ（ポリ乳酸、ポリグリコール酸）、もしくは同様の合成ポリマーで作られている、マイクロビーズ、生分解性、または非生分解性であり得るか、ゼラチン、ヒアルロン酸、アルギン酸、フィブリン接着剤で作られているヒドロゲル足場であり得る。足場またはバッグは、付着受容体、フィブロネクチンもしくはラミニン等の細胞外マトリックスタンパク質、またはＲＧＤ等の細胞外マトリックスからの活性結合ペプチドでコーティングされ得る。足場またはマイクロビーズはまた、ＣＤ３、ＣＤ２８、もしくはＣＤ４０に対する活性化抗体等であるが、これらに限定されない、活性化刺激物または刺激抗体でコーティングされ得る。しかしながら、少なくとも１つの実施形態において、本方法は、１つ以上の活性化刺激物で、またはＣＤ３、ＣＤ２８、もしくはＣＤ４０に対する１つ以上の抗体でコーティングされたマイクロビーズまたは足場を含まない。

いくつかの実施形態において、ＡＩＣＣを産生するためにインキュベーションに使用される媒体は、血漿または血清である。血清を利用するこれらの実施形態において、血清は、血漿試料から得ることができ、これは、約３７℃で凝固剤と接触させた白血球と同一または異なる全血試料から（すなわち、同一または異なるヒトから）得ることができる。いくつかの実施形態において、血清または血漿は、商業的または非営利の供給源から得られ、新鮮な、または冷凍等の保存に適合した形態のいずれかであり得る。

加えて、血清（特に、ヒト血清）がしばしば、支持的媒体としてインキュベーション組成物に使用されるが、サイトカインの放出、成長因子、および／または活性化白血球からの他の可溶性構成要素を支持する生理的媒体である限り、他の支持的媒体も、使用され得る。例えば、血漿は、血清の代わりに使用され得る。支持媒体としても使用され得る他のインキュベーション媒体には、培養培地、生理食塩水、またはアミノ酸等の細胞の生存および機能に不可欠である糖および他の構成要素の任意の添加を有する緩衝生理食塩溶液（例えば、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）、アール平衡塩溶液（ＥＢＳＳ）、標準クエン酸生理食塩水液（ＳＳＣ）、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ）、ゲイ平衡塩溶液（ＧＢＳＳ））が含まれる。生理食塩溶液および培養培地はまた、ヒト血清または臨床的グレードの動物血清、または血清代替物が補充され得る。インキュベーション組成物は、代替的にまたは加えて、血清タンパク質、例えば、ヒトまたはウシアルブミン、ガンマ−グロブリン、トランスフェリン、または異なる組織由来のタンパク質、植物性タンパク質、もしくは植物エキスを含有し得る。

ある特定の実施形態において、補体タンパク質、ケモカイン、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ガンマ、サイトカイン、例えば、インターロイキン−４、顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、またはインターロイキン−１２等の白血球作動薬をインキュベーションに添加する。インビトロでのＤＣへの単球分化は、特定のサイトカインを用いて誘発され得る（Ｊｅｎｓｅｎ ＳＳ，Ｇａｄ Ｍ．２０１０）。したがって、一実施形態において、インキュベーションは、インターロイキン−４またはＧＭ−ＣＳＦ等のサイトカインの存在下で行われ得る。他の実施形態において、インキュベーションは、樹状細胞の分化および成熟ならびにリンパ球およびＮＫ細胞の活性化を増大する他の物質を用いて行われ得る。例えば、単球上のＣＤ４０共刺激受容体は、サイトカインの不在下で、ＣＤ４０への抗体によって、またはＣＤ４０リガンド（ＣＤ５４）によって連結され得る（Ｂｒｏｓｓａｒｔ Ｐ，１９９８）。ＤＣの成熟に対するＣＤ４０の独立した活性化は、活性化されたＣＤ８陽性Ｔ細胞との相互作用によって誘発され得る（Ｒｕｅｄｌ Ｃ．，１９９９、Ｗｉｒｔｈｓ，２００２）。したがって、一実施形態において、外因性の活性化されたＣＤ８陽性Ｔ細胞を、インキュベーションに加えてもよい。インビトロでの単球からのＤＣの分化はまた、ＮＫＴ細胞とのＤＣの相互作用によって誘発され得る。ＤＣの分化は、単球による活性化の際に、ＮＫＴ細胞により産生されたサイトカインであるＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−１３のＮＫＴ細胞分泌によって生じる（Ｈｅｇｄｅ，２００７）。したがって、一実施形態において、外因性の活性化されたＮＫＴ細胞を、インキュベーションに加えてもよい。他の実施形態において、ＤＣの分化および成熟は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−２、ＩＦＮ−アルファ、およびＴＮＦ−アルファのうちの１つ以上の添加によって、ならびに／またはリポ多糖類（ＬＰＳ）、ペプチドグリカン（ムレイン）、二本鎖ＲＮＡもしくはその合成類似体のポリイノシン酸：ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）、レジキモド（Ｒ−８４８）、およびピシバニル（ＯＫ−４３２）等であるが、これらに限定されない、ＤＣ上のトール受容体と相互作用する１つ以上の細菌産物の添加によって促進され得る。

また、本方法の１つ以上の実施形態において、ＤＣの成熟に関与する、上記の外因的に添加された因子（複数可）のうちの１つ以上の不在下で、インキュベーションが生じることも明確に企図される。一実施形態において、ＤＣの成熟に必要とされる構成要素のすべては、内因的に提供され、さらなる刺激をインキュベーション組成物に加えない。それにもかかわらず、様々なサイトカインが、インキュベーション中、白血球の活性化の際に放出されるため、それらは、インキュベーション組成物中に存在し得る。例えば、ＣＤ４０リガンドは、血清中、およびインキュベーション組成物の一部である血小板上に見出され得る。同様に、インキュベーション組成物中に内因的に存在する活性化されたＣＤ８⁺Ｔ細胞およびＮＫＴ細胞は、単球と相互作用して、樹状細胞の分化および成熟を支持し得る。

したがって、一実施形態において、（ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦ、またはインターフェロンのうちの１つ以上が、インキュベーション中に内因的に産生され得るが）ＡＩＣＣを産生するためのインキュベーション組成物は、外因性ＧＭ−ＣＳＦ、外因性ＩＬ−４、外因性ＴＮＦ、または外因性インターフェロンを含まない。それ故に、一実施形態において、ＡＩＣＣを調製する方法は、１つ以上の外因性サイトカインもしくはインターフェロンの添加、ＣＤ３および／もしくはＣＤ２８を架橋する試薬（複数可）の添加、ＣＤ４０を架橋する試薬（複数可）の添加、ならびに／またはＡＩＣＣの産生中、樹状細胞の成熟を促進する他の外因性薬剤の添加を除外する。本方法の実践から除外され得る外因的に添加されたサイトカインおよび外因的に添加されたインターフェロンの例には、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−２、ＩＦＮ−アルファ、またはＩＬ−２のうちのいずれかの１つ以上が含まれる。本方法の実践から除外され得る外因的に添加された細菌産物の例には、リポ多糖類（ＬＰＳ）、ペプチドグリカン（ムレイン）、二本鎖ＲＮＡもしくはその合成類似体のポリイノシン酸：ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）、レジキモド（Ｒ−８４８）、およびピシバニル（ＯＫ−４３２）等であるが、これらに限定されない、ＤＣ上のトール受容体と相互作用することが知られているものが含まれる。

いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦシグナル伝達を標的とする血管新生阻害剤を、インキュベーション組成物に添加する。これらには、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ベバシズマブ、ラニビズマブ）、ＶＥＧＦ受容体に対する抗体（例えば、ＶＥＧＦＲ−２およびＦＧＦＲを標的とするブリバニブ）、ＶＥＧＦ受容体のチロシンキナーゼ活性の阻害剤（例えば、ソラフェニブ、セジラニブ、スニチニブ）、可溶性受容体デコイ（例えば、アフリベルセプトとも呼ばれる、ＶＥＧＦトラップ）、または血管破壊剤（例えば、ＺＤ６１２６）が含まれるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態において、アジュバントを、インキュベーション組成物に添加する。アジュバントの例には、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、およびリン酸カルシウム、油乳剤系のアジュバント（フロイント乳化油アジュバント（完全および不完全）、Ａｒｌａｃｅｌ Ａ、鉱油、乳化落花生油アジュバント（アジュバント６５）、細菌（それらの合成誘導体、ならびにリポソーム）またはグラム陰性細菌からの生成物、エンドトキシン、コレステロール、脂肪酸、脂肪族アミン、パラフィン系オイルおよび植物油、モノホスホリルリピドＡ、Ｑｕｉｌ−Ａ付きＩＳＣＯＭ、およびシンテックスアジュバント製剤（ＳＡＦ）が含まれるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態において、他の部分で論じられるように、本方法のいずれかには、１つ以上の抗原または抗原ペプチドを導入する接触ステップをさらに含み得る。抗原の例には、ウイルス、細菌、原虫、および真菌抗原、ならびに超抗原（例えば、ブドウ球菌エンテロトキシン）およびプリオン抗原が含まれる。一般的に言えば、抗原または抗原ペプチドは、樹状細胞への単球、およびその抗原に特異的な主なリンパ球の分化を増強するであろう。さらに、細胞レベル上の抗原提示は、クラスＩまたはクラスＩＩ分子に関連して提示される抗原ペプチドを含み、「抗原」、「抗原ペプチド（ａｎｔｉｇｅｎ ｐｅｐｔｉｄｅ）」、および「抗原ペプチド（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ）」という用語は、無傷抗原または特定のペプチドとの接触を必要とするものとして解釈されるべきではない。その代わり、これらの用語は、抗原提示細胞が、直接またはさらなる処理後のいずれかで、クラスＩまたはクラスＩＩ分子に関連して存在し得る、抗原材料と接触させることを示すために、広範に使用される。

細胞溶解物から調製されるか、またはタンパク質もしくはペプチドの組み換え発現によって調製されるかにかかわらず、抗原および抗原ペプチドは、ＡＩＣＣを用いて、または様々な濃度でＡＩＣＣの産生中、室温〜約３７℃で約１時間〜約２４時間インキュベートされる。抗原／ペプチドの例には、以下に記載されるものおよび実施例の項で使用される任意の抗原／ペプチドが含まれる。

いくつかの実施形態において、無傷抗原が使用される。無傷抗原の例には、ヒトに感染するウイルス、細菌、真菌、および原虫由来のタンパク質、ならびにプリオンタンパク質が含まれる。

ウイルス抗原を提供するために使用され得る例示的なウイルスとしては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、インフルエンザウイルス、デング熱、日本脳炎、黄熱病、肝炎ウイルス（Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、非Ａ、非Ｂ型肝炎）、ＲＳＶ（呼吸器合胞体ウイルス）、ＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ３、アデノウイルス、ライノウイルス、ＥＢＶ、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２）、ＢＫ、ＨＨＶ６、パラインフルエンザ、ボカウイルス、コロナウイルス、ＬＣＭＶ、おたふく風邪、はしか、メタ肺炎ウイルス、パルボウイルスＢ、ロタウイルス、ウエストナイルウイルス、ならびに、エボラ出血熱ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。

例示的な細菌抗原としては、百日咳毒素、線維状赤血球凝集素、ペルタクチン、ＦＩＭ２、ＦＩＭ３、アデニル酸シクラーゼ、ジフテリア毒素、破傷風毒素、連鎖球菌Ｍタンパク質、リポ多糖類、ミコール酸、熱ショックタンパク質６５（ＨＳＰ６５）、３０ｋＤａ主要分泌タンパク質、抗原８５Ａ、および他のマイコバクテリア抗原構成要素等の細菌抗原；ヘリコバクターピロリ菌細菌抗原構成要素；肺炎球菌溶血素、肺炎球菌莢膜多糖類、および他の肺炎球菌細菌抗原構成要素等の肺炎球菌細菌抗原；莢膜多糖類、および他のインフルエンザ菌細菌抗原構成要素等のインフルエンザ菌細菌抗原；炭疽菌細菌抗原、例えば、炭疽菌防御抗原、および他の炭疽菌細菌抗原構成要素；ｒｏｍｐＡおよび他のリケッチア細菌抗原構成要素等のリケッチア細菌抗原が挙げられるが、これらに限定されない。任意の他の細菌、マイコバクテリア、マイコプラズマ、リケッチア、またはクラミジア抗原もまた、本明細書に記載される細菌抗原とともに含まれる。

例示的な真菌抗原としては、例えば、カンジダ真菌抗原構成要素、熱ショックタンパク質６０（ＨＳＰ６０）および他のヒストプラスマ真菌抗原構成要素等のヒストプラスマ真菌抗原、莢膜多糖類および他のクリプトコッカス真菌抗原構成要素等のクリプトコッカス真菌抗原、小球抗原および他のコクシジオイデス真菌抗原構成要素等のコクシジオイデス真菌抗原、ならびにトリコフィチンおよび他のコクシジオイデス真菌抗原構成要素等の白癬真菌抗原が挙げられるが、これらに限定されない。

他の実施形態において、（タンパク質分解または組換えのいずれかによって調製された）抗原のペプチドエピトープが使用される。

いくつかの実施形態において、ペプチド抗原は、ＨＩＶのペプチド抗原である。例示的なペプチドには、Ｔａｔペプチド、Ｎｅｆペプチド、Ｒｅｖペプチド、Ｇａｇペプチド、Ｅｎｖペプチド、Ｐｏｌペプチド、Ｖｐｕペプチド、Ｖｉｆペプチド、およびパドレのうちの１つ、その組み合わせ、またはすべてが含まれる。Ｇａｇペプチドの例には、Ｇａｇ１５０、Ｇａｇ４３３、Ｇａｇ２９８、またはこれらの組み合わせが含まれる。Ｅｎｖペプチドの例には、Ｅｎｖ６７が含まれる。Ｐｏｌペプチドの例には、Ｐｏｌ６０６が含まれる。Ｖｐｕペプチドの例には、Ｖｐｕ６６が含まれる。Ｖｉｆペプチドの例には、Ｖｉｆ２３およびＶｉｆ１０１が含まれる。

いくつかの実施形態において、このペプチド抗原は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のペプチド抗原である。

いくつかの実施形態において、この抗原は、慢性ウイルス感染と関連する抗原である。一実施形態において、慢性ウイルス感染は、ＨＩＶ、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ１）、単純ヘルペスウイルス２（ＨＳＶ２）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、またはヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）である。

いくつかの実施形態において、ＡＩＣＣ中の樹状細胞は、例えば、指数衰減波または方形波エレクトロポレーターまたは他のＲＮＡパルス装置を用いる、エレクトロポレーションによって、感染性微生物から１つ以上の抗原に対するｍＲＮＡによりトランスフェクトされる。別の実施形態において、１つ以上の抗原または抗原ペプチドは、例えば、米国特許第８，０９７，２４３号に記載される、微小粒子に基づいたトランスフェクションを使用して、ＡＩＣＣ中の樹状細胞等の抗原提示細胞に導入される。さらに他の実施形態において、１つ以上の抗原または抗原ペプチドは、例えば、米国特許第８，０１２，４６８号、およびＢｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ２００８；３１：２９４−３０９に記載される、アデノウイルスに基づいた変換を使用して、あるいは、米国特許第８，００３，７７３号に記載される、レトロウイルスベクターを使用して導入される。

実施形態のいずれかにおいて、本方法は、成熟ＤＣへの単球の分化、リンパ球の活性化、ＮＫ細胞の活性化および／もしくは増殖、またはＮＫＴ細胞の活性化および／もしくは増殖のうちの１つ以上をもたらし得る。

一実施形態において、ＡＩＣＣが、抗原の存在下で、ナイーブＴ細胞の活性化（プライミング）を刺激し（Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ６９、ＩＬ−２Ｒ、ＣＤ２８、ＣＤ７１、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４０Ｌのうちの１つ以上の発現によって、および／またはＩＬ−２、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、もしくはＩＦＮ−ガンマの産生によって示される）、Ｔヘルパーおよび細胞毒性Ｔ細胞を分化および増殖することができる細胞を含む場合、ＡＩＣＣは、「成熟」ＤＣを含む。別の実施形態において、ＩＬ−１２の産生の増加がある場合、ＡＩＣＣは、成熟ＤＣを含む。別の実施形態において、ＡＩＣＣ中の単球上のマーカーＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３、ＣＤ４０、ＣＤ１ｃ、ＣＤ５６、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＩＧＳＦ４、ＣＬＥＣ９Ａ、ＣＣＲ７、ＴＬＲ１、ＴＬＲ３、ＴＬＲ６、ＤＣ−ＬＡＭＰ、Ｉｄ２、ＩＲＦ８、またはＩＣＳＢＰのうちの１つ以上の発現の増加がある場合、ＡＩＣＣは、成熟ＤＣを含む。一実施形態において、発現の増加は、ＡＩＣＣ中のＤＣの表面上の１つ以上の分子の数の増加（例えば、フローサイトメトリーによって決定される、平均蛍光強度（ＭＦＩ）の増加）である。分子の数の増加は、成熟していると考えられるＡＩＣＣ中のＤＣ上の特定のマーカーについてＭＦＩを比較することによって決定される。一実施形態において、マーカーのうちの１つ以上を発現する単球のパーセンテージの増加がある場合、ＡＩＣＣは、「成熟」ＤＣを含む。一実施形態において、単球は、特徴的な側方散乱光［ＳＳＣ］、およびフローサイトメトリーによる汎白血球マーカーであるＣＤ４５に対するポジティブ染色法、または単球に特異的ＣＤ１４染色法によって特定される。一実施形態において、本方法は、ＭＦＩならびに細胞表面マーカーＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ５４、ＣＤ８６、ＣＤ８３、ＣＤ８０、ＣＤ４０、およびＣＣＲ７のうちの少なくとも１つを発現する単球のパーセンテージがともに増加するＡＩＣＣをもたらす。一実施形態において、本方法は、ＭＦＩならびに細胞表面マーカーＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ５４、ＣＤ８６、ＣＤ８３、ＣＤ８０、ＣＤ４０、およびＣＣＲ７のいずれかの組み合わせまたはすべてを発現する、単球の割合がともに増加するＡＩＣＣをもたらす。一実施形態において、増加は、ＡＩＣＣを産生するために使用される開始の白血球組成物（例えば、軟膜中の白血球）と比較して評価される。一実施形態において、増加は、ＤＣの分化および成熟を誘発する時間および温度の条件下でのインキュベーションに使用される細胞組成物と比較して評価される。

一実施形態において、ＡＩＣＣは、ナイーブＴ細胞に対する抗原を提示し、これによりナイーブＴ細胞がＣＤ４陽性およびＣＤ８陽性細胞に分化し、増殖し、ＩＬ−２を産生し、ＩＬ−２受容体を発現し、インターフェロンおよび他のＴｈ１サイトカインを産生するであろう。

別の態様において、本方法は、１つ以上の細胞集団に関して本発明のＡＩＣＣを濃縮することをさらに含み得る。樹状細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、または他の細胞型に関して濃縮される組成物は、既知の方法に従って、陽性または陰性マーカー選択のいずれかを使用して、細胞分類、パニング、ＭＡＣＳ等によって調製され得る。

さらなる実施形態において、本方法は、液体部分からＡＩＣＣの細胞部分を分離することをさらに含み得る。一実施形態において、細胞および液体（上清）部分の両方が、回収される。これは、例えば、ＡＩＣＣを遠心分離し、上清を別の容器に移すことによって達成され得る。実施例に記載される、上清は、それが含有するサイトカインおよび他の可溶性因子のため、細胞の不在下でさえ、療法に有用である。次いで、遠心分離後形成するペレット中の細胞は、任意の所望の担体中で再懸濁され得る。他の実施形態において、細胞は、例えば、濾過によって、細胞を回収することなく、液体部分から除去される。さらに他の実施形態において、細胞は、例えば、細胞をペレット化し、上清を吸引することによって、上清を回収することなく回収される。

実施形態のいずれかにおいて、ＡＩＣＣが産生されると、ＡＩＣＣ中の細胞は、さらなる濃縮を伴うかまたは伴わずに単離され、（受容者に対して自家であっても、同種異系であってもよい）血清等の担体、または細胞の保存および投与に好適な一部の他の生理学的に許容される等張の正常な液体中で再懸濁され得る。このような溶液の例が以下に記載され、これには、等張を回復させるために使用される溶液、細胞培養培地、緩衝食塩水、または任意の他の生体適合性流体、あるいは特別に製剤化された臨床的に許容される細胞保存もしくは細胞低温保存培地が含まれる。

ＩＩ． 活性化された免疫刺激細胞組成物
別の態様において、本発明は、活性化された免疫刺激細胞組成物（ＡＩＣＣ）に関し、これは、上記のＡＩＣＣを作製する方法によって生成された組成物のいずれかを指す。したがって、「ＡＩＣＣ」はしばしば、上記のインキュベーションに使用される同じ担体中の細胞組成物を指すが、ＡＩＣＣはまた、任意の担体または賦形剤、ならびに細胞部分から分離された液体部分中の細胞成分も包含する。

ＡＩＣＣ中の白血球は、概して、個々の白血球細胞型または組成物を区別するために使用され得るある特定の特徴を有する。例えば、ＡＩＣＣ中の単球は、新鮮分離した単球と比較して、より高いレベルのＣＤ５４、ＨＬＡ−ＤＲ、および／またはＣＤ８６を発現し得る。さらに、ＡＩＣＣ中の単球は、新鮮分離した単球と比較して、例えば、ＣＤ８−アルファ、ＣＤ８３、ＣＤ８０、ＣＣＲ７、および／またはＣＤ４０のうちの１つ以上のさらなる活性化マーカーを発現し得る。ＡＩＣＣ組成物は、例えば、末梢血白血球の新鮮に調製された試料中よりもＤＣに分化され、および成熟した単球のより高いパーセンテージまたは数を含み得る。同様に、ＡＩＣＣは、例えば、末梢血白血球の新鮮に調製された試料中よりもナイーブリンパ球を活性化／プライミングすることができるより多くの数またはパーセンテージの細胞を含み得る。ＡＩＣＣ中のリンパ球は、例えば、ＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ１５４、ＣＤ１０７ａ、および／またはＣＤ４２ｄのうちの１つ以上の新鮮分離したリンパ球と比較して、より高い表面レベルのさらなるマーカーを発現し得る。加えて、ＡＩＣＣ中の白血球は、新鮮分離した白血球と比較して、例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮガンマ、ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ、ＴＮＦアルファ、ＴＮＦベータ、および／またはＩＬ−１２のうちの１つ以上のサイトカインを産生する増加した能力を示し得る。

上述のように、本方法のいくつかの実施形態において、国際公開第２０１０／１００５７０号の方法を使用して生成された活性化白血球組成物（ＡＬＣ）は、活性化された免疫刺激細胞組成物（ＡＩＣＣ）を調製する方法で使用される。実施例に記載されるように、ＡＬＣ中の白血球が、少なくとも部分的に活性化され得るが、ＡＩＣＣ中の白血球が、ＡＬＣ中よりも高いレベルの活性化を達成し得る。ＡＬＣ中の白血球と比較して、ＡＩＣＣ中の白血球のより高いレベルの活性化は、比較としてＡＬＣを使用して、ＡＩＣＣに関する上述の特性のうちのいずれか１つ以上によって示され得る。

実施例に示されるように、ＡＩＣＣはまた、例えば、単球上のＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６、ＣＤ８３、ＣＤ８０、ＣＤ４０、ＣＤ５４、およびＣＣＲ７の表面発現によって示される、ＤＣの最小活性化レベル；例えば、ＣＤ６９、ＣＤ２５（ＩＬ−２Ｒ）、ＣＤ２８、ＣＤ１５４／ＣＤ４０Ｌ、およびＣＤ４９ｄの表面発現によって示される、リンパ球の最小活性化レベル；ならびに、例えば、ＣＤ５６、ＣＤ５７、およびＣＤ１０７ａの表面発現によって示される、ＮＫおよびＮＫＴ細胞の最小活性化レベル、の観点から特徴付けられ、既知の組成物と区別され得る。マーカーの表面発現は、マーカーを発現する細胞のパーセンテージとして、または１つの細胞当たりのマーカーのレベルとして評価され得る。

いくつかの実施形態において、活性化された免疫刺激細胞組成物（ＡＩＣＣ）の最終含有物には、存在する白血球の集団に関して、顆粒球、単球、およびリンパ球が含まれる。細胞の特定の量および相対的パーセンテージは、採用される分析技術および試料間の変動に基づいて異なり得る。例えば、分析がＣｅｌｌ Ｄｙｎ分析器を使用して行われるとき、ＡＩＣＣは、一般に、約４５％〜約７２％の顆粒球（好中球、好酸球、および好塩基球を含む）、約３％〜約１０％の単球、および約２５％〜約５０％のリンパ球を含む。分析がＦＡＣＳを使用して（例えば、側方散乱対前方散乱ドットプロット分析または対ＣＤ４５および／またはＣＤ１４蛍光を使用して）行われるとき、ＡＩＣＣは、一般に、約５０％〜約７０％の顆粒球、約５％〜約１５％の単球、および約１５％〜約３５％のリンパ球を含む。

顆粒球には、好中球、好酸球、および好塩基球が含まれる。いくつかの実施形態において、ＡＩＣＣは、ＡＩＣＣ中の白血球の総数に基づき、約２５％〜約８５％の好中球、約０〜約９％の好酸球、約１．５〜約４％の好塩基球、約２％〜約４０％の単球（樹状細胞を含む）、および約４％〜約７０％のリンパ球を含む。

実施形態のいずれかにおいて、ＡＩＣＣは、一般に、約０．０５〜約０．２×１０⁶／マイクロリットルの量で残存レベルの赤血球を、および／または約１〜約１００×１０³／マイクロリットルの量で残存レベルの血小板をさらに含み得る。

いくつかの実施形態において、ＡＩＣＣ中のリンパ球の亜集団は、以下の一般的な範囲内である：約２０％〜約８０％のＴ細胞（ＣＤ３＋）、約５％〜約４０％のＢ細胞（ＣＤ１９＋）、約５％〜約３５％のＮＫ細胞（ＣＤ３−／ＣＤ５６＋）、および／または約０．１％〜約３５％のＮＫＴ細胞（ＣＤ３＋／ＣＤ５６＋）。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞中では、約５％〜約６５％のＴヘルパー細胞（ＣＤ４＋／ＣＤ３＋）および約５％〜約７５％の細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ、ＣＤ８＋／ＣＤ３＋）が存在する。

他の実施形態において、約４０％〜約６０％のＴ細胞（ＣＤ３＋）、約１５％〜約３０％のＢ細胞（ＣＤ１９＋）、約１５％〜約３０％のＮＫ細胞（ＣＤ３−／ＣＤ５６＋）、約２％〜約２０％のＮＫＴ細胞（ＣＤ３＋／ＣＤ５６＋）が存在する。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞では、約１５％〜約４０％のＴヘルパー細胞（ＣＤ４＋／ＣＤ３＋）および約２５％〜約５０％のＣＴＬ（ＣＤ８＋／ＣＤ３＋）が存在する。

Ｔｈ細胞とＣＴＬの比率は、通常、約０．５〜１．５である。

実施形態のいずれかにおいて、ＤＣ、リンパ球、ＮＫ、およびＮＫＴ細胞マーカーのレベル、ならびにこれらのマーカーを発現する細胞のパーセンテージが、ＡＩＣＣを調製する方法に記載される、または実施例に記載されるように決定され得る。

一実施形態において、ＡＩＣＣは、ＤＣを含み、アイソタイプ対照と比較して、フローサイトメトリーによって検出される、ＤＣの少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、または３０％は、ＣＤ８を発現する。

一実施形態において、アイソタイプ対照と比較して、フローサイトメトリーによって検出される、ＡＩＣＣ中の単球の少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、または６０％は、マーカーＣＣＲ７に対して陽性である。

一実施形態において、アイソタイプ対照と比較して、フローサイトメトリーによって検出される、ＡＩＣＣ中の単球の少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、または６０％は、マーカーＣＤ４０に対して陽性である。

一実施形態において、アイソタイプ対照と比較して、フローサイトメトリーによって検出される、ＡＩＣＣ中の単球の少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、または６０％の単球は、マーカーＣＤ８０に対して陽性である。

一実施形態において、アイソタイプ対照と比較して、フローサイトメトリーによって検出される、ＡＩＣＣ中の単球の少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、または６０％は、マーカーＣＤ８３に対して陽性である。

一実施形態において、マーカーＣＤ８６に対する総単球の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、末梢血単球上よりも、少なくとも約０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、または１０倍高く新鮮である。一実施形態において、マーカーＣＤ８６に対する単球の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、国際公開第２０１０／１００５７０号に従って調製されるＡＬＣ中の単球上よりも少なくとも約０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、または１０倍高い。これらの実施形態において、総単球は、汎白血球マーカーに対するＳＳＣおよび染色によって決定される。

一実施形態において、マーカーＣＤ８３に対する総単球の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、末梢血単球上よりも少なくとも約０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、または１０倍高く新鮮である。一実施形態において、マーカーＣＤ８３に対する単球の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、国際公開第２０１０／１００５７０号に従って調製されるＡＬＣ中の単球上よりも少なくとも約０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、または１０倍高い。これらの実施形態において、総単球は、汎白血球マーカーに対するＳＳＣおよび染色によって決定される。

一実施形態において、マーカーＣＤ８０に対する総単球の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、末梢血単球上よりも少なくとも約０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、または１０倍高く新鮮である。一実施形態において、マーカーＣＤ８０に対する単球の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、国際公開第２０１０／１００５７０号に従って調製されるＡＬＣ中の単球上よりも少なくとも約０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、または１０倍高い。これらの実施形態において、総単球は、汎白血球マーカーに対するＳＳＣおよび染色によって決定される。

一実施形態において、マーカーＣＤ４０に対する総単球の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、末梢血単球上よりも少なくとも約０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、または１０倍高く新鮮である。一実施形態において、マーカーＣＤ４０に対する単球の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、国際公開第２０１０／１００５７０号に従って調製されるＡＬＣ中の単球上よりも少なくとも約０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、または１０倍高い。これらの実施形態において、総単球は、汎白血球マーカーに対するＳＳＣおよび染色によって決定される。

一実施形態において、マーカーＣＣＲ７に対する総単球の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、末梢血単球上よりも少なくとも約０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、または１０倍高く新鮮である。一実施形態において、マーカーＣＣＲ７に対する単球の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、国際公開第２０１０／１００５７０号に従って調製されるＡＬＣ中の単球上よりも少なくとも約０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、または１０倍高い。これらの実施形態において、総単球は、汎白血球マーカーに対するＳＳＣおよび染色によって決定される。

一実施形態において、マーカーＣＤ５４に対する総単球の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、末梢血単球上よりも少なくとも約０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、または１０倍高く新鮮である。一実施形態において、マーカーＣＤ５４に対する単球の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、国際公開第２０１０／１００５７０号に従って調製されるＡＬＣ中の単球上よりも少なくとも約０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、または１０倍高い。これらの実施形態において、総単球は、汎白血球マーカーに対するＳＳＣおよび染色によって決定される。

一実施形態において、マーカーＣＤ８に対する総単球の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、末梢血単球上よりも少なくとも約０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、または１０倍高く新鮮である。一実施形態において、マーカーＣＤ８に対する単球の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、国際公開第２０１０／１００５７０号に従って調製されるＡＬＣ中の単球上よりも少なくとも約０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、または１０倍高い。これらの実施形態において、総単球は、汎白血球マーカーに対するＳＳＣおよび染色によって決定される。

一実施形態において、ＡＩＣＣが超抗原の存在下で調製されるとき、アイソタイプ対照と比較して、フローサイトメトリーによって検出される、ＡＩＣＣ中のＣＤ３陽性リンパ球の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、または３５％は、マーカーＣＤ６９に対して陽性である。一実施形態において、超抗原は、１００ｎｇ／ｍＬでブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）である。

一実施形態において、ＡＩＣＣがＴ細胞−ＡＰＣの相互作用を媒介する超抗原の存在下で調製されるとき、マーカーＣＤ６９に対してＣＤ３陽性リンパ球の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、少なくとも約０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、または５．０倍高い。一実施形態において、超抗原は、１００ｎｇ／ｍＬでブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）である。

一実施形態において、ＡＩＣＣが超抗原の存在下で調製されるとき、アイソタイプ対照と比較して、フローサイトメトリーによって検出される、ＡＩＣＣ中のＣＤ３陰性リンパ球の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、または４５％は、マーカーＣＤ６９に対して陽性である。一実施形態において、超抗原は、１００ｎｇ／ｍＬでブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）である。

一実施形態において、ＡＩＣＣがＴ細胞−ＡＰＣの相互作用を媒介する超抗原の存在下で調製されるとき、マーカーＣＤ６９に対してＣＤ３陰性リンパ球の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、少なくとも約０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、または５．０倍高い。一実施形態において、超抗原は、１００ｎｇ／ｍＬでブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）である。

一実施形態において、ＡＩＣＣが超抗原の存在下で調製されるとき、アイソタイプ対照と比較して、フローサイトメトリーによって検出される、ＡＩＣＣ中のＣＤ３陽性リンパ球の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、または３５％は、マーカーＣＤ２５に対して陽性である。一実施形態において、超抗原は、１００ｎｇ／ｍＬでブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）である。

一実施形態において、ＡＩＣＣがＴ細胞−ＡＰＣの相互作用を媒介する超抗原の存在下で調製されるとき、マーカーＣＤ２５に対してＣＤ３陽性リンパ球の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、プレインキュベーション組成物中または超抗原を用いずにインキュベートされたＡＩＣＣ中よりも少なくとも約０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、または６．０倍高い。一実施形態において、超抗原は、１００ｎｇ／ｍＬでブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）である。

一実施形態において、ＡＩＣＣが超抗原の存在下で調製されるとき、アイソタイプ対照と比較して、フローサイトメトリーによって検出される、ＣＤ３陰性リンパ球の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、または３５％は、マーカーＣＤ２５に対して陽性である。一実施形態において、超抗原は、１００ｎｇ／ｍＬでブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）である。

一実施形態において、ＡＩＣＣが超抗原の存在下で調製されるとき、マーカーＣＤ２５に対してＣＤ３陰性リンパ球の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、プレインキュベーション組成物中またはＡＩＣＣが超抗原の不在下で調製されるときよりも少なくとも約０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、または５．０倍高い。一実施形態において、超抗原は、１００ｎｇ／ｍＬでブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）である。

一実施形態において、ＡＩＣＣが超抗原の存在下で調製されるとき、アイソタイプ対照と比較して、フローサイトメトリーによって検出される、超抗原でインキュベートされたＡＩＣＣ中の単球の少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％は、マーカーＣＤ４０に対して陽性である。一実施形態において、超抗原は、１００ｎｇ／ｍＬでブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）である。

一実施形態において、マーカーＣＤ４０に対する単球の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、プレインキュベーション組成物中またはＡＩＣＣが超抗原の不在下で調製されるときよりも少なくとも約１．０、２．０、３．０、４．０、４．５、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、または１０倍高い。一実施形態において、Ｔ細胞−ＡＰＣ超抗原は、１００ｎｇ／ｍＬでブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）である。

一実施形態において、ＥＬＩＳＡによって決定される、ＡＩＣＣ中のＩＬ−１２の濃度は、少なくとも約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ピコグラム／ミリリットルである。一実施形態において、ＡＩＣＣがＴ細胞−ＡＰＣの相互作用を媒介する超抗原の存在下で調製されるとき、超抗原でインキュベートされたＡＩＣＣ中のＩＬ−１２の濃度は、ＡＩＣＣが超抗原の不在下で調製されるときよりも少なくとも約０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、または５．０倍高い。一実施形態において、超抗原は、１００ｎｇ／ｍＬでブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）である。

一実施形態において、ＥＬＩＳＡによって決定される、ＡＩＣＣ中のＩＬ−２の濃度は、少なくとも約１００、５００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、またはそれ以上のピコグラム／ミリリットルである。一実施形態において、ＩＬ−２の濃度は、Ｔ細胞−ＡＰＣの相互作用を媒介する超抗原でインキュベートされたＡＩＣＣ中で決定される。一実施形態において、超抗原は、１００ｎｇ／ｍＬでブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）である。一実施形態において、超抗原が、ＡＩＣＣを生成するために使用される３７℃で４８時間のインキュベーション中に存在する。

一実施形態において、ＥＬＩＳＡによって決定される、ＡＩＣＣ中のＩＦＮ−ガンマ（ＩＦＮ−ｇ）の濃度は、少なくとも約８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、または３００ピコグラム／ミリリットルである。一実施形態において、ＡＩＣＣがＴ細胞−ＡＰＣの相互作用を媒介する超抗原の存在下で調製されるとき、超抗原でインキュベートされたＡＩＣＣ中のＩＦＮ−ｇの濃度は、ＡＩＣＣが超抗原の不在下で調製されるときよりも少なくとも約２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、または７．０倍高い。一実施形態において、超抗原は、１００ｎｇ／ｍＬでブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）である。

一実施形態において、ＡＩＣＣは、ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞に対する抗原提示を支持し、これは抗原の存在下、ＡＩＣＣで共培養されるとき、Ｔ細胞の増殖によって示される。一実施形態において、ＡＩＣＣは、Ｔｈ１表現型によるＴ細胞の生成を支持し、これはＡＩＣＣによる共培養後、Ｔ細胞によるＩＬ−２およびＩＦＮ−ガンマの分泌によって示される。

いくつかの実施形態において、ＡＩＣＣは、末梢血中のこれらの同一のＴ細胞サブセットの比と比較して改変される比でＴ細胞サブセットを含む。一実施形態において、ＡＩＣＣは、約１：１未満のＣＤ４ Ｔ細胞対ＣＤ８ Ｔ細胞の比（ＣＤ４／ＣＤ８の比）を含む。

一実施形態において、ＡＩＣＣは、１つ以上の細胞表面マーカーおよび／またはサイトカインに関して実施例に記載されるＡＩＣＣの特徴を有する。一実施形態において、ＡＩＣＣは、表中に示される「平均」ＡＩＣＣの特徴のうちの１つ以上を有する（つまり、特徴は、表中に示された平均＋／−任意の標準偏差を反映する）。一実施形態において、ＡＩＣＣは、図中の任意の数がその数の「約」として解釈されるべきであるが、図中に示される、代表的なＡＩＣＣの１つ以上の特徴を有する。一実施形態において、ＡＩＣＣは、ＡＩＣＣが超抗原により刺激された後、実施例に記載される特徴を有する。

いくつかの実施形態において、本発明のＡＩＣＣは、１つ以上の細胞集団に関して濃縮され得る。一実施形態において、ＡＩＣＣは、例えば、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ１９抗体を使用して、リンパ球の陰性選択によって樹状細胞に関して濃縮される。一実施形態において、ＡＩＣＣは、例えば、細胞付着を用いて、または抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体もしくは抗ＣＤ４０抗体もしくは抗ＣＤ１４抗体、またはこれらの組み合わせを用いて、単球および樹状細胞の陰性選択によってリンパ球に関して濃縮される。一実施形態において、ＡＩＣＣは、例えば、ＭＡＣＳ中のコーティングされたビーズ上の抗ＣＤ３抗体またはＦＡＣＳ中の抗ＣＤ２抗体を用いて、陽性選択によつてＴ細胞に関して濃縮される。

ＡＩＣＣのいずれかは、本発明の方法で治療上使用され得る。しかし、他の箇所で詳細に記載されるように、いくつかの実施形態において、ＡＩＣＣは、感染性微生物に対して単離される、あるいは組み換え方法または感染性微生物から抗原または抗原ペプチドを抽出するまたは単離する任意の他の手段によって、例えば、感染した細胞からペプチドを溶出することによって産生される、抗原でインキュベートされる。いくつかの実施形態において、ＡＩＣＣまたはＡＩＣＣ内のＤＣは、１つ以上のウイルス、細菌、真菌、または原虫抗原でインキュベートされる。いくつかの実施形態において、ＡＩＣＣまたはＡＩＣＣ内のＤＣは、細菌産物等の超抗原でインキュベートされる。抗原／ペプチドの添加は、単球からのＤＣのさらなる成熟、より具体的には、ＡＩＣＣ中に存在するＴ細胞のより特定の活性化／プライミングをもたらすであろう。

ＡＩＣＣは、細胞および液体の構成要素に分離され得る。したがって、一実施形態において、ＡＩＣＣは、本方法のいずれかから直接得られる細胞部分および液体部分を含む。一実施形態において、細胞の構成要素が１つ以上の担体または賦形剤中に（再）製剤化され得るが、ＡＩＣＣは、液体部分から分離された細胞部分を含む。一実施形態において、ＡＩＣＣは、細胞部分から分離された液体部分を含む。細胞構成要素および細胞を含まない液体部分はともに、治療上有益な特性を有すると考えられる。例えば、細胞構成要素は、成熟したＤＣおよび他の細胞型を含み、（細胞を含まない）液体部分／構成要素は、ＩＬ−２およびＩＬ−１２等の様々なサイトカインを含む。

いくつかの実施形態において、アジュバントを、ＡＩＣＣに添加する。一実施形態において、ワクチンは、１つ以上の感染性微生物からの少なくとも１つの抗原／ペプチドをさらに含む。アジュバントの例としては、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、Ａｒｌａｃｅｌ Ａ、鉱油、乳化落花生油アジュバント（アジュバント６５）、リポ多糖類（ＬＰＳ）、リポソーム、エンドトキシン、コレステロール、脂肪酸、脂肪族アミン、パラフィン系オイルおよび植物油、モノホスホリルリピドＡ、Ｑｕｉｌ−Ａ付きＩＳＣＯＭ、およびシンテックスアジュバント製剤（ＳＡＦ）が挙げられるが、これらに限定されない。

ＡＩＣＣ組成物は、必要に応じて、ＦＤＡで認可されたキット等のパックまたはディスペンサー装置中で提供され得、活性成分を含有する１つ以上の単位剤形を含み得る。例えば、このパックは、ブリスターパック等の金属またはプラスチック箔を含むことができる。このパックまたはディスペンサー装置には、投与のための説明書を添付することができる。また、それは、医薬品の製造、使用、または販売を規制する政府機関によって処方される形式で、容器に関連する通知を伴い、この組成物の形態またはヒトもしくは獣医学的投与に関して政府機関による承認を反映し得る。このような通知は、例えば、処方薬のための米国食品医薬品局によって承認されたラベル、または承認された製品挿入物であり得る。

さらなる態様において、本発明は、感染を治療するためのワクチンとして製剤化されたＡＩＣＣを提供する。一実施形態において、ワクチンは、上記の少なくとも１つのアジュバントをさらに含む。一実施形態において、ワクチンは、上記の抗原のうちの少なくとも１つを用いて製剤化されたＡＩＣＣを含む。一実施形態において、ワクチンは、成熟樹状細胞、活性化されたリンパ球、少なくとも５ｐｇ／ｍＬのＩＬ−１２、少なくとも１５００ｐｇ／ｍＬのＩＬ−２、および少なくとも１００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ−ガンマを含むＡＩＣＣを含む。

別の態様において、本発明は、免疫応答を刺激するためのＡＩＣＣを提供する。この態様の実施形態は、ＡＩＣＣ自体に関して記載されたものと、ＡＩＣＣの治療上の使用に関して記載されたものと、を含む。例えば、この態様はまた、感染を治療する、あるいは感染性微生物または感染性微生物により感染した細胞に対して免疫応答を刺激するためのＡＩＣＣに関する。

さらなる態様において、本発明は、免疫応答を刺激するための医薬の調製において、任意のＡＩＣＣの使用を提供する。この態様の実施形態は、ＡＩＣＣ自体に関して記載されたものと、ＡＩＣＣの治療上の使用に関して記載されたものと、を含む。例えば、この態様はまた、感染を治療する、あるいは感染性微生物または感染性微生物により感染した細胞に対して免疫応答を刺激するための医薬を調製するためのＡＩＣＣの使用に関する。

ＩＩＩ． 治療上の使用
別の態様において、本発明は、ＡＩＣＣが免疫刺激組成物として使用される方法を提供する。したがって、本発明は、感染性微生物からの少なくとも１つの抗原に対して免疫応答を刺激する方法を包含し、本法は、対象に、本発明のＡＩＣＣを投与することを含む。対象には、ヒトおよび獣医学的対象の両方が含まれる。

ＡＩＣＣは、あらゆる種類の感染を治療するために投与され得る。無傷抗原の例には、ヒトに感染するウイルス、細菌、真菌、および原虫由来のタンパク質、ならびにプリオンタンパク質抗原が含まれる。

任意の感染ウイルスは、ウイルス抗原の源として作用し得る。ウイルス抗原を提供するために使用され得る例示的なウイルスとしては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、インフルエンザウイルス、デング熱、日本脳炎、黄熱病、肝炎ウイルス（Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、非Ａ、非Ｂ型肝炎）、ＲＳＶ（呼吸器合胞体ウイルス）、ＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ３、アデノウイルス、ライノウイルス、ＥＢＶ、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２）、ＢＫ、ＨＨＶ６、パラインフルエンザ、ボカウイルス、コロナウイルス、ＬＣＭＶ、おたふく風邪、はしか、メタ肺炎ウイルス、パルボウイルスＢ、ロタウイルス、ウエストナイルウイルス、ならびに、エボラ出血熱ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。

任意の細菌種は、細菌抗原の源として作用し得る。例示的な細菌抗原としては、百日咳毒素、線維状赤血球凝集素、ペルタクチン、ＦＩＭ２、ＦＩＭ３、アデニル酸シクラーゼ、ジフテリア毒素、破傷風毒素、連鎖球菌Ｍタンパク質、リポ多糖類、ミコール酸、熱ショックタンパク質６５（ＨＳＰ６５）、３０ｋＤａ主要分泌タンパク質、抗原８５Ａ、および他のマイコバクテリア抗原構成要素等の細菌抗原；ヘリコバクターピロリ菌細菌抗原構成要素；肺炎球菌溶血素、肺炎球菌莢膜多糖類、および他の肺炎球菌細菌抗原構成要素等の肺炎球菌細菌抗原；莢膜多糖類、および他のインフルエンザ菌細菌抗原構成要素等のインフルエンザ菌細菌抗原；炭疽菌細菌抗原、例えば、炭疽菌防御抗原、および他の炭疽菌細菌抗原構成要素；ｒｏｍｐＡおよび他のリケッチア細菌抗原構成要素等のリケッチア細菌抗原が挙げられるが、これらに限定されない。任意の他の細菌、マイコバクテリア、マイコプラズマ、またはクラミジア抗原もまた、細菌抗原とともに含まれる。

任意の真菌種は、真菌抗原の源として作用し得る。例示的な真菌抗原としては、例えば、カンジダ真菌抗原構成要素；熱ショックタンパク質６０（ＨＳＰ６０）および他のヒストプラスマ真菌抗原構成要素等のヒストプラスマ真菌抗原；莢膜多糖類および他のクリプトコッカス真菌抗原構成要素等のクリプトコッカス真菌抗原；小球抗原および他のコクシジオイデス真菌抗原構成要素等のコクシジオイデス真菌抗原；ならびにトリコフィチンおよび他のコクシジオイデス真菌抗原構成要素等の白癬真菌抗原が挙げられるが、これらに限定されない。

他の実施形態において、（タンパク質分解または組み換え技術のいずれかによって調製された）抗原のペプチドエピトープが使用される。

いくつかの実施形態において、ペプチド抗原は、ＨＩＶのペプチド抗原である。例示的なペプチドには、Ｔａｔペプチド、Ｎｅｆペプチド、Ｒｅｖペプチド、Ｇａｇペプチド、Ｅｎｖペプチド、Ｐｏｌペプチド、Ｖｐｕペプチド、Ｖｉｆペプチド、およびパドレのうちの１つ、その組み合わせ、またはすべてが含まれる。Ｇａｇペプチドの例には、Ｇａｇ１５０、Ｇａｇ４３３、Ｇａｇ２９８、またはこれらの組み合わせが含まれる。Ｅｎｖペプチドの例には、Ｅｎｖ６７が含まれる。Ｐｏｌペプチドの例には、Ｐｏｌ６０６が含まれる。Ｖｐｕペプチドの例には、Ｖｐｕ６６が含まれる。Ｖｉｆペプチドの例には、Ｖｉｆ２３およびＶｉｆ１０１が含まれる。

いくつかの実施形態において、このペプチド抗原は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のペプチド抗原である。

いくつかの実施形態において、この抗原は、慢性ウイルス感染と関連する抗原である。一実施形態において、慢性ウイルス感染は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ１）、単純ヘルペスウイルス２（ＨＳＶ２）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、またはヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）である。

いくつかの実施形態において、ＡＩＣＣは、さらなる操作を行わずに、感染性微生物への免疫応答を刺激する方法に直接使用される。他の実施形態において、投与前に、ＡＩＣＣは、感染性微生物からの１つ以上の抗原でインキュベートされる（パルスされる）。抗原は、組換え技術によって調製されても、感染性微生物から部分的に精製されても、感染性微生物により感染した細胞から調製されてもよく、あるいは、これらの技術の組み合わせを使用して、１つ以上抗原を提供してもよい。さらに他の実施形態において、ＡＩＣＣは、投与前に、細菌産物等の１つ以上の「超抗原」でインキュベートされる。投与前に、ＡＩＣＣと抗原または超抗原との接触は、ＡＩＣＣ中に存在するＴ細胞のさらなるおよびより特定の活性化／プライミングをもたらす。

抗原および抗原ペプチドの添加に関するさらなる実施例および詳細は、ＡＩＣＣを調製する方法の説明に示される。

いくつかの実施形態において、投与前に、アジュバントをＡＩＣＣに添加する。アジュバントの例としては、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、Ａｒｌａｃｅｌ Ａ、鉱油、乳化落花生油アジュバント（アジュバント６５）、リポ多糖類（ＬＰＳ）、リポソーム、エンドトキシン、コレステロール、脂肪酸、脂肪族アミン、パラフィン系オイルおよび植物油、モノホスホリルリピドＡ、Ｑｕｉｌ−Ａ付きＩＳＣＯＭ、およびシンテックスアジュバント製剤（ＳＡＦ）が挙げられるが、これらに限定されない。

一般に、活性化された免疫刺激細胞組成物の適用は、ＡＩＣＣの１つ以上の投与によって達成される。一実施形態において、ＡＩＣＣは、全身投与される。全身投与の例には、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、および皮内注射が含まれる。一実施形態において、ＡＩＣＣは、局部的に、例えば、感染部位周辺の局所、経皮、または皮下に投与される。一実施形態において、ＡＩＣＣは、結節内に投与される、つまり、ＡＩＣＣは、感染部位（例えば、流入すること）と関連する１つ以上のリンパ節に注入される。

いくつかの実施形態において、ＡＩＣＣは、単一部位で投与される。他の実施形態において、ＡＩＣＣは、複数の部位で投与される。

いくつかの実施形態において、ＡＩＣＣは、好適な注射器および針（例えば、１８Ｇまたは２５Ｇの針を装着した２ｍＬの注射器）を用いた注射によって投与される。ＡＩＣＣを局所的に流入するリンパ節に直接注射するこれらの実施形態において、ＡＩＣＣの投与は、超音波、Ｘ線、および他の同様の技術の監視下、カテーテルまたは内視鏡装置を通して行われ得る。いくつかの実施形態において、注射は、局部感染の部位全体にわたってほぼ１センチメートルからほぼ３センチメートル間隔で行われる。別の実施形態において、注射は、感染部位に流入するリンパ節と関連する組織に行われる。一実施形態において、注射は、感染部位に流入するリンパ節と関連する健常な組織領域でほぼ１センチメートルからほぼ３センチメートル間隔で行われる。

注射のために、ＡＩＣＣは直接使用され得る。この実施形態において、微生物を死滅させるために、または感染性微生物により感染した細胞を死滅させるために直接刺激するのに役立ち得るサイトカインを含有し得るインキュベーション組成物は、ＡＩＣＣの細胞部分とともに投与される。代替の実施形態において、ＡＩＣＣの液体部分は、例えば、遠心分離によって除去され得、次いで、ＡＩＣＣの細胞部分は、水溶液中（任意に、ＡＩＣＣよりも更に濃縮された）、例えば、ハンクス溶液、リンガー溶液、または他の生理的食塩緩衝液等の生理的に相溶性のある緩衝液中、あるいは患者からの血清または血漿を含む血清または血漿中で製剤化され得る。

別の実施形態において、ＡＩＣＣは、生理的に不活性および／または吸収性マトリックスもしくは足場（例えば、コラーゲン）に吸収され、この損傷への圧入によって挿入される。これにより、細胞がより長い期間を原位置で有するという点において、患者のためになる部位へのＡＩＣＣの持続送達を可能にする。

治療されるべき状態の重篤度および応答性に応じて、数日から数週間続く治療過程で、あるいは病状の減退が達成されるまで、投薬は、単回または複数回の投与であり得る。したがって、一実施形態において、ＡＩＣＣは、１回だけ投与される。別の実施形態において、ＡＩＣＣは、少なくとも２回、３回、４回、５回、または最高１０回、もしくはそれ以上投与される。投与が、少なくとも２回の投与を含むとき、それぞれの投与は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０日あけて行われ得る。代替として、それぞれの投与は、約１、２、３、４、５、または６ヶ月あけて行われ得る。

ＡＩＣＣは、臨床医が別の投入が必要であると判断する場合、１回以上投与され得る。

複数回の投与の場合、個々の投与はすべて、同じ経路を介して行われ得るか、または治療過程中、異なる投与に対して異なる投与経路が利用され得る。

投与されるＡＩＣＣの量は、もちろん、治療される個人、苦痛の重症度、投与様式、処方する医師の判断等に応じて異なる。投与の用量およびタイミングは、個人の変化する状態の慎重かつ継続的なモニタリングに応答するであろう。さらに、治療アルゴリズムは、ＡＩＣＣが播種性または慢性感染に罹患していることを示す患者において、より有効であり得るため、感染の重症度または種類によって限定されるべきではない。

一実施形態において、ＡＩＣＣは、単回の治療法として使用されるが、１回または１回より多く投与され得る。しかしながら、他の実施形態において、ＡＩＣＣは、併用治療アプローチの一部として投与される。併用療法を含むこれらの実施形態において、ＡＩＣＣは、他の治療法前、その後、またはそれと組み合わせて投与される。ＡＩＣＣは、単独で、または特定の種類の感染に対して任意の他の従来の治療と組み合わせて使用され得る。

ＡＩＣＣによる感染性微生物に対する免疫応答の刺激は、様々な方法で実証され得る。例えば、一実施形態において、対象へのＡＩＣＣの投与は、熱または感染の他の全身症状の低下を生じる。さらに他の実施形態において、ＡＩＣＣは、感染性微生物の抗原に対する免疫応答を刺激する。

実施形態のいずれかにおいて、療法に対する応答性は、感染性微生物に対する抗体等の感染マーカーの血清濃度の低下によって測定することができる。ある特定の実施形態において、療法への応答性は、増加した全生存時間のうちの１つ以上によって測定される。

治療の性質に関係なく、ＡＩＣＣは、患者における疾患の転帰を改善するのに有用であり得る。加えて、ＡＩＣＣはまた、鎮痛効果を提供し得る。

実施例
次に、下記の実施例が参照されるが、下記の実施例は、上記の説明と一緒に、本発明を非限定様式で例示する。

別途記載されない限り、使用される術語と、利用される実験方法には、標準的な技術が含まれる。例えば、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ” Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＩＩ Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．（１９９４）、“Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ”，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＩＩ Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ” Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＩＩ Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）、Ｓｔｉｔｅｓ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），“Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）、“Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ” Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｌ，ｅｄ．（１９８６）、“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ” Ｖｏｌ．１−３１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、およびＭａｒｓｈａｋ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ” ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）を参照のこと。

例示的な活性化された免疫刺激細胞組成物（ＡＩＣＣ）の調製

例示的なＡＩＣＣが、以下の通りに調製された。

最初のステップとして、活性化された白血球組成物が、国際公開第２０１０／１００５７０号に記載される方法に従って調製された。簡潔に述べると、単一単位の血液から得られる軟膜を、室温で８〜１２時間インキュベートした。次いで、細胞を４０〜４５秒間水を添加することによって低浸透圧ショック（「ＨＯＳ」）に供し、ＮａＣｌ溶液を添加することによって等張を回復させた。遠心分離によって、細胞をペレット化し、細胞ペレットを、同一の血液単位から得られた血漿分画から得られた５０ｍＬの血清中で再懸濁させた。次いで、血清中の白血球懸濁液を、３７℃で９０分間インキュベートした。次いで、血清を廃棄し、新鮮血清を白血球に添加して、３〜４×１０⁶／ｍＬの最終濃度を作製した。この初期組成物は、本実施例では、「プレインキュベーション組成物」（ＰＣ）と称される。

本実施例は、血清中で、３７℃で９０分間インキュベートしたＰＣを使用するが、低浸透圧ショック後、ペレット化された白血球もまた、例えば、血清中で再懸濁させ、一定期間、例えば、４８時間直接インキュベートして、ＡＩＣＣを形成し得ることが明確に企図される。

本実施例において、穏やかな遠心分離、過剰な血清の除去、および白血球濃度が約１０×１０⁶／ｍＬであるように、多量の血清中での白血球ペレットの穏やかな懸濁によって、ＰＣを濃縮した。次いで、この組成物を、３７°Ｃ、５％ ＣＯ₂および１００％の湿度で、細胞インキュベーター中で、４８または７２時間（特定の実施例において示される）インキュベートした。このインキュベーションは、ガス透過性ＦＥＰバッグ中で行われた。

本実施例は、得られたＡＩＣＣもまた、濃縮されるように、濃縮されたＰＣを使用して調製されたＡＩＣＣの結果を示す。細胞が濃縮されるほど、十分な量の細胞を投与するのに必要とされる注入量が少なくなるため、濃縮されたＡＩＣＣが、臨床的応用によく適し得る。しかし、非濃縮ＰＣを使用する比較は、細胞型のパーセンテージまたは特定のマーカーの発現レベルのいずれかによって評価されるように、白血球濃度がＡＩＣＣ中の白血球組成物に影響を及ぼさなかったことを示した。したがって、非濃縮ＰＣを使用することも可能であり、本実施例は、濃縮ＰＣを使用して調製されたＡＩＣＣに限定されるものとしていかようにも読み取られるべきではない。

続く実施例において、別途実施例に明示されない限り、プレインキュベートした組成物（ＰＣ）中の白血球は、濃縮ＰＣから調製されたＡＩＣＣ中の白血球と比較された。

活性化された免疫刺激細胞組成物（ＡＩＣＣ）の細胞集団分析

ＡＩＣＣの細胞組成物は、２つの異なる細胞を計数する方法：Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ Ｒｕｂｙ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｂｂｏｔｔ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）上の示差細胞計数およびＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上のフローサイトメトリー分析を使用して、ＰＣの細胞組成物と比較された。Ｃｅｌｌ Ｄｙｎ計数は、ＰＣ（「インキュベーション前」）中および３７℃で４８時間のインキュベーション後のＡＩＣＣ中に存在する細胞集団を比較する。表中では、ＷＢＣは、白血球（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）または白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）を意味する。ＷＢＣ総数およびＷＢＣ中の白血球型のパーセンテージの両方が、決定された。試料中の赤血球（ＲＢＣ）および血小板の数もまた、決定された。Ｃｅｌｌ Ｄｙｎ計数の結果を表１中に要約する。

提示されたデータは、異なる献血からの血液試料を用いて行われた５つの実験のそれぞれの平均±標準偏差である。それぞれのＣｅｌｌ Ｄｙｎ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ａｎａｌｙｚｅｒ測定を、三重で行い、平均計数を計算した。

ＰＣ（「インキュベーション前」）中、および３７℃で４８時間のインキュベーション後のＡＩＣＣ中に存在する白血球のサブタイプのパーセンテージもまた、フローサイトメトリーによって決定した。ペリジニンクロロフィルタンパク質（ＰｅｒＣＰ）に共役された汎白血球抗原ＣＤ４５を用いて、標本細胞を染色した。ＣＤ４５染色により、白血球集団の良好な解像が可能となった。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してフローサイトメトリーを行い、ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して集団およびマーカー分析を行った。ＳＳＣおよびＦＬ３（ＣＤ４５−ＰｅｒＣＰ）シグナルに基づいて、白血球集団を、ゲートにかけた。

次いで、白血球集団における顆粒球、リンパ球、および単球のパーセンテージを決定した。白血球集団のフローサイトメトリー分析の結果を、５つの実験の平均＋標準偏差として、表２中に示す。

２つの計数方法は、若干異なる結果を生じる。それにもかかわらず、それぞれの方法は、白血球サブセットの許容される尺度を提供する。Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎシステムは、しばしば、臨床的応用で使用される。しかし、下記に記載されるように、フローサイトメトリーは、個々の細胞の表面上の個々の分子の発現レベルを決定するために、有利に使用され得る。一般に、ＡＩＣＣは、白血球サブセットのパーセンテージの観点からＰＣとあまり変わらない。しかしながら、Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ計数は、ＡＩＣＣを調製するためのインキュベーション中、白血球の総数が減少することを示す。

ＳＳＣおよびＣＤ４５−ＰｅｒＣＰ蛍光に基づいて、上記のゲートにかけられた白血球サブセットを、フローサイトメトリーによってさらに分析した。Ｔリンパ球およびＢリンパ球を分離するために、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）に共役された抗ＣＤ３抗体およびアロフィコシアニン（ＡＰＣ）に共役された抗ＣＤ１９抗体を用いて、試料を染色した。ＣＤ３⁺／ＣＤ１９^-であるリンパ球を、Ｔ細胞として計数し、一方、ＣＤ３^-／ＣＤ１９⁺である細胞をＢ細胞として計数した。抗ＣＤ４−ＡＰＣ、抗ＣＤ８−フィコエリトリン（ＰＥ）、および抗ＣＤ３−ＦＩＴＣ抗体を用いて、試料を三重に染色した。次いで、ＣＤ３⁺リンパ球を、ＣＤ４⁺Ｔヘルパー細胞およびＣＤ８⁺細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）に分離した。抗ＣＤ３−ＦＩＴＣ、ならびにＰＥ（（ＣＤ５６＋ＣＤ１６）−ＰＥ抗体）に共役された抗ＣＤ５６抗体および抗ＣＤ１６抗体の混合物を用いて、二重染色によって、ＮＫおよびＮＫＴ細胞を、特定した。ＮＫ細胞を、ＣＤ３^-／（ＣＤ５６＋ＣＤ１６）⁺細胞として特定し、ＮＫＴ細胞を、ＣＤ３⁺／（ＣＤ５６＋ＣＤ１６）⁺細胞として特定した。異なる献血から生成されたＡＩＣＣで行われた４〜７つの実験の結果を、表３中に要約し、平均±標準偏差として示す。

これらの結果は、出発組成物中のＴ細胞のパーセンテージと比較して、ＡＩＣＣ中のＴ細胞（ＣＤ３陽性）のパーセンテージで３８．８％から４８．４％（ｐ＝０．１８）の統計的に有意な増加を示す。

単球における樹状細胞マーカーの樹状細胞（ＤＣ）の活性化および分化の分析

樹状細胞（ＤＣ）への単球の分化を、単球上のＤＣ特異的マーカーＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ５４、ＣＤ８６、ＣＤ８３、ＣＤ８０、ＣＤ４０、およびＣＣＲ７の発現のフローサイトメトリー分析によって評価した。まず、プレインキュベートした組成物（ＰＣ）中の単球を分析し、次いで、ガス透過性ＦＥＰバッグ中で４８または７２時間のインキュベーションを用いて生成したＡＩＣＣ中の単球を分析した。ＤＣ特異的マーカーのそれぞれに対する抗体を用いて、およびペリジニンクロロフィルタンパク質（ＰｅｒＣＰ）に共役された汎白血球抗原ＣＤ４５に対する抗体を用いて、標本細胞を、二重染色した。後者は、白血球集団のより良好な解像のために使用された。抗ＨＬＡ−ＤＲおよび抗ＣＣＲ７抗体を、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）に共役した。ＤＣ特異的抗体の残りを、フィコエリトリン（ＰＥ）に共役した。

それぞれの時点からの細胞を、ＦＡＣＳ染色溶液（ＰＢＳ、２％ 正常マウス血清、０．０２％ アジ化ナトリウム）で洗浄し、０．５×１０⁶／管でアリコートし、暗室で、４℃で３０分間適切なモノクローナル抗体でインキュベートした。二次抗体（抗ＣＤ４５−ＰｅｒＣＰ）を、暗室で、４℃で１５分間添加した。インキュベーション後、細胞を洗浄し、ＰＢＳ中で再懸濁し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で分析した。同一条件下、無関係であるが、アイソタイプが一致した抗体を用いて染色された細胞を、陰性対照として使用した。これらの結果を、ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって分析した。ＳＳＣおよびＦＬ３（ＣＤ４５陽性、赤色蛍光）シグナルに基づいて、白血球集団を、区別した。

単球上のＤＣマーカーのフローサイトメトリー分析の結果を表４中に要約し、代表的な実験を、図１中に示す。

マーカー発現を特徴付けるために使用され得る２つのパラメーター：１）マーカーを発現する細胞のパーセンテージ（陽性細胞の％）、および２）１個の細胞当たりのマーカー分子の数によって異なるマーカーの平均蛍光強度（ＭＦＩ）がある。表４中のデータは、７〜８つの実験の平均＋標準偏差として示されるそれぞれのマーカーに対するすべての単球のＭＦＩを示す。それぞれの実験におけるそれぞれのマーカーに対して倍率の増加を計算し、次いで、平均＋標準偏差を計算した。標準偏差によって示されるように、実験間で変動がある。それでもなお、ＭＦＩは、ＤＣの分化および成熟と関連したマーカーのほとんどにおいて、ＰＣと比較して、（４８時間インキュベートされるか、または７２時間インキュベートされるにかかわらず）ＡＩＣＣ中で数倍高く、これにより、３７℃で４８時間のＰＣのインキュベーション中、ＤＣへの単球を確認する。

図１は、代表的な実験における、ＰＣを出発する組成物と比較して、４８時間のインキュベーションを使用して調製されたＡＩＣＣに対する倍率の増加を示す。倍率の増加を、それぞれのマーカーにおける３つのパラメーター：１）ある特定のマーカーを発現する細胞の数（陽性細胞の％、第１の棒）、２）すべての単球のＭＦＩ（中間の棒）、および３）「陽性」単球のＭＦＩ（第３の棒）において示す。ＭＦＩは、単球集団中の蛍光分布を表す。総単球のごく一部である細胞の一集団中のＭＦＩの任意の増加を、なおも検出することができるように、陽性単球に対するある程度のＭＦＩが含まれる。ＡＩＣＣを調製するために使用されたプレインキュベーション組成物（ＰＣ）中のＨＬＡ−ＤＲ発現は、すでに高かった。ＰＣ中では、９４＋３％の単球がＨＬＡ−ＤＲ陽性であり、ＭＦＩも高かった。ＨＬＡ−ＤＲの発現は、ＡＩＣＣ中でさらに増加しなかった。マーカーＣＤ８６、ＣＤ８３、ＣＤ４０、およびＣＤ５４については、「陽性細胞の％」は、インキュベーション時のＣＤ８３の場合とほぼ同一であるか、またはさらに低下した（約０．２〜１倍の増加）が、陽性細胞のＭＦＩが多くの倍率を増加したため、すべての単球のＭＦＩは、主に、２〜５倍増加した。マーカーＣＤ８０およびＣＣＲ７については、陽性細胞の％およびＭＦＩはともに、数倍増加した。

これらの結果は、ＡＩＣＣが、出発組成物と比較して、成熟ＤＣに関して濃縮されることを示す。

細胞付着を促進する条件下、細胞をインキュベートする効果も研究された。ＡＩＣＣは、１つの種類は、普通の表面を有するものであり、他方の種類は、細胞付着を促進するように処理された表面を有するものの２つの異なる種類のバッグを用いて調製された。次いで、ＤＣ特異的マーカーの発現は、粘着性および非粘着性バッグを使用して調製されたＡＩＣＣと比較された。この実験の結果を図２中に示す。驚いたことには、非粘着性バッグ中のインキュベーションは、粘着性バッグ中のインキュベーションと比較して、ＤＣマーカーに対して高いＭＦＩをもたらした。この効果は、特に、ＣＤ８３、ＣＤ４０、およびＣＣＲ７に対して著しかった。

単球上のＣＤ８−アルファ発現の分析
単球が低レベルのＣＤ８−アルファを発現する一方、分化したＤＣの亜集団は、高いレベルのこのマーカーを発現する（Ｍｅｒａｄ Ｍ，２０００）。ＣＤ８α（＋）樹状細胞（ＤＣ）は、高いレベルのＩＬ−１２を分泌し（Ｍａｓｈａｙｅｋｈｉ Ｍ，２０１１）、Ｔヘルパー細胞のＴｈ１表現型を促進する（Ｍａｌｄｏｎａｄｏ−Ｌoｐｅｚ Ｒ，１９９９、Ｍａｌｄｏｎａｄｏ−Ｌoｐｅｚ Ｒ，２００１）ため、細胞内病原体および腫瘍由来の抗原の交差提示においては、インビボで重要である。

単球上のＣＤ８発現は、フローサイトメトリーによって測定された。プレインキュベートした組成物（ＰＣ）中で、およびガス透過性ＦＥＰバッグ中で４８時間のインキュベーションを用いて生成したＡＩＣＣ中で単球を分析した。ＰＥに共役されたＣＤ８に対する抗体を用いて、およびＰｅｒＣＰに共役された汎白血球抗原ＣＤ４５に対する抗体を用いて、標本細胞を、二重染色した。単球集団中のＣＤ８発現が分析され得るように、ＳＳＣおよびＦＬ３（ＣＤ４５）シグナルに基づいて、白血球集団を、区別した。

表５は、３つの実験の結果を要約する。図３は、代表的な実験を表す。

３７℃で４８時間のプレインキュベーション組成物（ＰＣ）のインキュベーションによって調製されたＡＩＣＣは、ＰＣ中のＣＤ８⁺細胞のパーセンテージと比較して、ＣＤ８を発現する単球のパーセンテージが増加した（表５および図３Ａ）。ＣＤ８のＭＦＩもまた、増加した（表５および図３Ｂ）。

ＡＩＣＣ中のＴ細胞に対するＤＣによる超抗原提示の効果

ＡＩＣＣを生成するための、ＰＣのインキュベーション中、単球から産生されるＤＣの機能性を確認するために、超抗原（ＳＡ）であるブドウ球菌エンテロトキシンＢを、インキュベーション混合物に添加した。超抗原（ＳＡ）も、抗原提示細胞上のＭＨＣクラスＩＩ分子およびＴリンパ球上のＴ細胞受容体に結合するため、処理された抗原ペプチドに類似する。しかしながら、ＳＡは、他の抗原と異なり、細胞内処理を必要としないため、有利である。加えて、ＳＡは、ある特定のファミリーのＴ細胞受容体を持つ約２０％のＴ細胞を刺激し、その一方、ほとんどの抗原ペプチドは、抗原に特異的なＴ細胞のみを刺激するため、約０．００１％のＴ細胞のみを刺激する（Ｂｈａｒｄｗａｊ Ｎ，１９９３）。それ故に、ＳＡは、Ｔ細胞を刺激する、ＤＣ等の抗原提示細胞の能力を試験するためのペプチド抗原に対する代替物として使用することができる。

Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ６９およびＣＤ２５（ＩＬ−２Ｒ）の分析
ＳＡの存在下、ＡＩＣＣ中のリンパ球の活性化を、公知のリンパ球活性化マーカーＣＤ６９の発現のフローサイトメトリー分析によって評価した。ＣＤ６９の発現は、活性化されたＴ細胞上で急速に増加し、刺激してから１８〜４８時間後にピーク発現が生じる（Ｓｉｍｍｓ ＆ Ｅｌｌｉｓ １９９６）。まず、プレインキュベートした組成物（ＰＣ）中のリンパ球を分析し、次いで、異なる用量のＳＡブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）の不在または存在下、細胞インキュベーター（３７℃、５％ ＣＯ２、および１００％ 湿度で）中で血清中の４８または７２時間のインキュベーション後のＡＩＣＣ中のリンパ球を分析した。実施例１で記載されたようにＰＣを産生し、濃縮した。ＤＣ等の抗原提示細胞との相互作用を必要としないポリクローナルＴ細胞刺激剤であるフィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）を、対照として使用した。

まず、リンパ球が、抗ＣＤ６９−ＦＩＴＣ抗体および抗ＣＤ３−ＡＰＣ抗体（ともに、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅからの）を用いて二重染色され、次に、抗ＣＤ４５−ＰｅｒＣＰ抗体を用いて二重染色された。細胞は、フローサイトメトリーによって分析された。４つの実験の平均＋標準偏差を、表６中に示す。図４は、代表的な実験を表す。

４８時間でＡＩＣＣは、ＳＡの不在下、数が減少したＣＤ６９陽性Ｔ細胞（ＣＤ３⁺）および非Ｔ細胞（ＣＤ３^-）を含んだ。ＳＡの添加により、リンパ球の両方のサブセットを刺激し、ＣＤ６９陽性細胞のパーセンテージ（表６および図４Ａ）ならびにこれらの細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）（表６および図４Ｂ）の用量依存的な増加を引き起こした。ＭＦＩの増加は、それぞれの活性化された細胞上のＣＤ６９分子数の増加に反映する。ＤＣによる抗原提示とは独立して作用するリンパ球の活性剤のフィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）が同様の効果を生じることができなかったため、ＳＡの効果は、ＤＣ依存性機構によるものであり、これは、ＤＣ依存性機構によるＳＡの特異的効果を示唆した（表６）。

ＩＬ−２受容体（ＣＤ２５）の発現におけるＳＡの効果もまた、研究された。抗原提示は、リンパ球からのＩＬ−２の放出およびそれらの表面上にＩＬ−２受容体の上方調節を生じ、これにより免疫応答の増幅をもたらす。プレインキュベーション組成物は、１００ｎｇ／ｍＬのＳＡの存在下、血清中で、３７℃で４８時間インキュベートされた。得られたＡＩＣＣが、抗ＣＤ２５−ＰＥ抗体および抗ＣＤ３−ＦＩＴＣ抗体（ともに、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅからの）を用いて二重染色され、次に、抗ＣＤ４５−ＰｅｒＣＰ抗体を用いて二重染色された。４つの実験の結果を、表７中に要約し、代表的な実験を図５中に示す。

リンパ球へのＤＣによるＳＡの提示は、ＩＬ−２Ｒを発現するリンパ球のパーセンテージ（表７、図５Ａ）およびそれぞれの細胞上のＩＬ−２Ｒの数（ＭＦＩ）（表７、図５Ｂ）を増加する。この効果は、Ｔ細胞およびＣＤ３陰性細胞の両方に見られた。

単球分化マーカーＣＤ４０の分析
驚くことには、ＡＩＣＣを作製するために使用された４８時間のインキュベーション中、超抗原（ＳＡ）の添加は、リンパ球の活性化を促進するだけでなく、ＤＣのさらなる成熟をも刺激した。ＣＤ４０は、Ｔ細胞上のＣＤ４０Ｌと相互作用するＤＣ上の重要な共刺激分子であり、ＤＣからのＩＬ−１２の産生を誘発する。したがって、ＣＤ４０の発現は、ＤＣが機能的に成熟していることの指標である。ＤＣの成熟状態を評価するために、プレインキュベーション組成物中、および異なる量の超抗原の不在または存在下のいずれかで調製されたＡＩＣＣ中の単球上で、このマーカーのレベルを測定した。表８および図６は、異なる献血からのＡＩＣＣで行われた３つの独立した実験の結果を要約する。

ＡＩＣＣ中のＣＤ４０陽性細胞のパーセンテージは、増加する量のＳＡに伴って増加した（表８および図６Ａ）。ＣＤ４０の発現レベル（ＭＦＩ）はまた、用量依存的な様式で、ＳＡの添加によって増強された（表８および図６Ｂ）。ＭＦＩの結果に示されるように、ＣＤ４０のレベルが、プレインキュベーション組成物と比較して、ＡＩＣＣにおいて高かったが、ＳＡの存在により、細胞上のＣＤ４０レベルのさらに大きな増強をもたらした（表８、「ＭＦＩ」および図６Ｃ）。ＤＣによる抗原提示とは独立して作用するリンパ球の活性剤であるフィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）は、この効果を生じることができなかった。

ＡＩＣＣ中のＩＬ−１２含量の分析
完全に成熟したＤＣがＴ細胞と相互作用するとき、ＤＣは、ＩＬ−１２を産生する。したがって、ＩＬ−１２のレベルもまた、決定された。

第１の実験において、ＩＬ−１２濃度は、ＰＣ中、およびＦＥＰバッグ中で、３７℃で４８時間のインキュベーションを用いて調製されたＡＩＣＣ中で測定された。１０ｍＬの濃縮ＰＣをバッグに入れて、ＡＩＣＣを調製するために、細胞を４８時間インキュベートした。ＰＣおよびＡＩＣＣ組成物を、３，５００ｘｇで、１５℃で３０分間遠心分離し、製造業者の取扱説明書に従って、ＩＬ１２ｐ７０（活性ヘテロ二量体）に対してＤｉａｃｌｏｎｅ（商標）−ＥＬＩＳＡ（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ，Ｉｎｃ）を用いて、上清中で、ＩＬ−１２濃度を測定した。ＰＣを産生した日に得られたか、または３７℃で４８時間ＡＩＣＣを用いて同時にインキュベートされた血清は、細胞を添加することなく、同じ方法で遠心分離した。血清のＯＤ値を、バックグラウンドとして使用し、ＰＣおよびＡＩＣＣ試料のそれぞれのＯＤ値から減算した。

図７Ａに示されるように、ＩＬ−１２濃度は、ＡＩＣＣ中で増加した。したがって、これらの結果は、ＤＣに分化された単球が、ＡＩＣＣ中でＩＬ−１２を産生することが可能であることのさらなる証拠を提供する。単球がＡＩＣＣ中で白血球全体のわずか約１０％から成ることを考えると、これらの結果は、極めて有意である。

第２の実験（図７Ｂ）では、ＰＣを、１００ｎｇ／ｍＬのＳＡの不在および存在下、３７℃で４８時間インキュベートし、ＡＩＣＣを生成した。平行培地を、室温（ＲＴ）でインキュベートした。再度、ＩＬ−１２含量は、３７℃で４８時間のインキュベーション中、増加した。しかしながら、ＳＡの存在下、ＩＬ−１２濃度は、２倍超増加した。これらの結果は、ＤＣのさらなる成熟が、ＳＡの存在下で生じることを示唆している。インキュベーションが室温で行われたとき、ＳＡの効果は見られず、これにより、ＩＬ−１２放出が細胞機能に依存する生物学的過程であったことを確認した（図７Ｂ）。

ＡＩＣＣリンパ球によるＩＬ−２産生の分析
抗原提示を介してＤＣにより活性化されたナイーブＴ細胞は、ＣＤ４陽性Ｔｈ１表現型を得、多量のＴ細胞マイトジェンサイトカインＩＬ−２を産生する。したがって、ＡＩＣＣが活性化されたＴ細胞を含んだ場合、それらのＴ細胞は、ＡＩＣＣが成熟ＤＣを含有するため、抗原の存在下、ＩＬ−２を放出すべきである。

ＩＬ−２の放出を検出するために、ＩＬ−２濃度を、プレインキュベーション組成物（ＰＣ）中、および１００ｎｇ／ｍＬのＳＡの存在および不在下、３７℃で４８時間のインキュベーションの終了時、ＡＩＣＣ中で測定した。試料は、ＩＬ−１２について記載されるように、調製された。細胞をペレット化した後、ＩＬ−２濃度を、ＩＬ−２ＥＬＩＳＡキット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、上清中で測定した。上記のように、プレインキュベートされたおよびインキュベートされた血清試料を対照として使用した。加えて、インキュベートされた細胞（＋／−ＳＡ）を、ペレット化し、培養培地で洗浄し、５×１０⁶／ｍＬで添加剤を含まない新鮮血清中で再懸濁させて、３時間インキュベーター中に入れた。次いで、新鮮血清へのＩＬ−２の放出を測定した。出発組成物として異なるバッチのＰＣを使用した３つの実験の結果を表９中に要約する。

表９中のデータは、ＡＩＣＣ中のＤＣが機能的に活性であり、Ｔ細胞へのＳＡを提示し、ＩＬ−２の強固な放出を生じることを示す。表９中の結果はまた、活性化されたリンパ球がＳＡ後にＩＬ−２放出を継続し、ＡＩＣＣ中の他の生物学的に活性な薬剤が洗い落とされたことも示す。図８に示されるように、ＳＡの存在下で生成されたＡＩＣＣ中のＩＬ−２濃度は、異なる対象から得られた３つすべての試料において高かった。インキュベートされた試料中でのＩＬ−２濃度と、新鮮血清にＩＬ−２を放出するリンパ球の能力との間に相関関係があった。ＳＡをインキュベーション媒体に添加しなかった場合（すなわち、抗原提示の不在下）、ごく少量のＩＬ−２を産生した。

ＡＩＣＣリンパ球によるＩＦＮ−ガンマ産生の分析
抗原提示を介してＤＣによって活性化されたＣＤ４ Ｔヘルパー細胞およびＣＤ８ 細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エフェクターＴ細胞は、多量のインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−ｇ）を産生する。ＩＦＮ−ｇは、先天性および適応免疫、ならびに腫瘍制御に重要なサイトカインである。したがって、ＡＩＣＣが活性化されたＴ細胞を含んだ場合、ＡＩＣＣは、ＩＦＮ−ｇを含有するはずである。

ＳＡの存在下、４８時間のインキュベーション中、ＩＦＮ−ｇ放出は、プレインキュベーション組成物（ＰＣ）中、および１００ｎｇ／ｍＬのＳＡの存在および不在下、３７°Ｃで４８時間のインキュベーションの終了時にＡＩＣＣ中で測定された。試料は、ＩＬ−１２について記載されるように、調製された。ＩＦＮ−ｇの濃度を、ＩＦＮ−ｇ ＥＬＩＳＡキット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、細胞をペレット化した後の上清中で測定した。プレインキュベートされたおよびインキュベートされた血清試料を対照として使用した。血清中に自然に存在するＩＦＮ−ｇの量は、１．５〜５ｐｇ／ｍＬの範囲であった。これらのバックグラウンドの血清濃度を、実験試料に対して得られた値から減算した。加えて、インキュベートした細胞（＋／−ＳＡ）を、ペレット化し、培養培地で洗浄し、５×１０⁶／ｍＬで添加剤を含まない新鮮血清中で再懸濁させた。細胞を３時間インキュベートし、新鮮血清へのＩＦＮ−ｇの放出を測定した。異なるバッチのＰＣを用いた４つの実験の結果を、表１０に要約する。

表１０中のデータは、ＡＩＣＣ中のＤＣが機能的に活性であり、Ｔ細胞へのＳＡを提示し、ＩＦＮ−ｇの強固な放出を生じることを示す。表１０中の結果はまた、活性化されたリンパ球がＳＡ後にＩＦＮ−ｇの放出を継続し、ＡＩＣＣ中の他の生物学的に活性な薬剤が洗い落とされたことも示す。図９に示されるように、インキュベートされた試料中のＩＦＮ−ｇの濃度と、新鮮血清にＩＦＮ−ｇを放出するリンパ球の能力との間に相関関係があった。ＳＡをインキュベーション媒体に添加しない場合には、ごく少量のＩＦＮ−ｇを産生し、抗原提示を生じない。

ＮＫ細胞に特異的な活性化マーカーの発現

２つの公知のＮＫ細胞活性化マーカー、ＣＤ５７およびＣＤ１０７ａの発現はまた、プレインキュベーション組成物中、およびＳＡの不在および存在下、３７℃で４８時間インキュベートすることによって調製されたＡＩＣＣ中で評価された。白血球を、ＡＰＣに共役されたＣＤ５７に対する抗体およびＰＥに共役されたＣＤ１０７ａに対する抗体で染色した。ＦＩＴＣまたはＡＰＣのそれぞれ共役された単球上のＣＤ１４マーカーに対する第２の抗体を、白血球集団間のより良好な解像を達成するために添加した。リンパ球ゲート内の細胞を分析した。２つの実験の結果を表１１に示す。

いずれのマーカーに対するＭＦＩにおいて有意な差異は認められなかった。インキュベーションがＳＡの存在下で行われたとき、ＣＤ１０７ａ陽性細胞のパーセンテージは増加した（６６．４％対４７．５％）。

ＨＩＶ感染の治療

活性化された免疫刺激細胞組成物は、ＨＩＶへの免疫応答を刺激するのに特に有用である。

ＨＩＶへの免疫応答を刺激するために、ＡＩＣＣを、ＨＩＶに感染した個人から調製する。１μＭのジドブジン（Ｒｅｔｒｏｖｉｒ）を、ＡＩＣＣに添加して、ＨＩＶ感染を回避することができる。ＡＩＣＣを、ＨＩＶからの１つ以上の抗原または抗原ペプチドで刺激する（調製中またはその後の別々のインキュベーション中のいずれかで）。例示的なＨＩＶ抗原には、Ｔａｔペプチド、Ｎｅｆペプチド、Ｒｅｖペプチド、Ｇａｇペプチド、Ｅｎｖペプチド、Ｐｏｌペプチド、Ｖｐｕペプチド、Ｖｉｆペプチド、およびパドレのうちの１つ、その組み合わせ、またはすべてが含まれる。代替的に、ウイルスタンパク質の発現カセットで構成されたポックスウイルスベクター（例えば、アビポックスウイルスまたは弱毒化されたポックスウイルス株を改変したワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ））等の組み換え生ベクターを、ＡＩＣＣでインキュベートし、ウイルス遺伝子でＤＣをトランスフェクトする。トランスフェクションの有効性は、組成物中のＣＤ８６陽性細胞中のウイルスタンパク質の細胞内発現のフローサイトメトリー分析によって確認される（ＣＤ８６がＤＣ表面マーカーとして使用される）。死亡およびアポトーシス細胞の指標（それぞれ、７−ＡＡＤおよびアネキシンＶ）で染色されたＡＩＣＣ細胞のフローサイトメトリー分析は、抗原で負荷されたＤＣの生存率を確認する。ウイルス性ペプチドで負荷されたＤＣの機能活性を、エクスビボおよび臨床試験で推定する。

エクスビボ研究については、ＤＣによるＨＩＶに感染した患者からのＣＤ４⁺およびＣＤ８⁺Ｔ細胞の増殖の誘発を試験する。患者の末梢血リンパ球（プラスチックへの付着後の単球を枯渇させた単核細胞）を、Ｔ細胞の源として使用する。単球を枯渇させたリンパ球を、ＣｅｌｌＴｒａｃｅＣＦＳＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で標識化し、ウイルス抗原で負荷された自己ＡＩＣＣで６〜７日間共培養する。ＣＦＳＥで標識した細胞を、フローサイトメトリーによって分析する。共培養後に急速に増殖する細胞は、対照と比較して、より低い強度のＣＦＳＥを有する。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を特定するために、細胞を、抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、および抗ＣＤ８抗体（例えば、ＮＨＰ Ｔリンパ球カクテル、ＢＤ）で標識する。

ＨＩＶに感染した患者から得られ、ウイルス抗原でインキュベートされたＡＩＣＣ中のＴ細胞の活性化は、リンパ球上でＣＤ６９およびＩＬ−２Ｒ（ＣＤ２５）の発現によって、ならびに実施例４に記載されるＩＬ−２およびＩＮＦｇの産生を測定することによって確認される。

臨床試験については、ウイルス抗原でインキュベートされたＡＩＣＣ組成物を、１８ゲージ（１８Ｇ）の針を使用して、任意のサイズの滅菌注射器に吸引する。細胞に対する損傷を最小限に抑えるように、ゆっくりと吸引を行う。注射器および針のサイズは、決して限定されるものではないが、大きいゲージの針が吸引には好ましい。これは、移動を促進し、細胞損傷を低減する。

ＡＩＣＣは、全身的に組成物を注射することによって、例えば、静脈内または皮下投与によって投与される。ＡＩＣＣはまた、局所リンパ節に注射され得る。臨床医は、ＡＩＣＣが臨床的パラメーターに基づいて必要であると判断される場合、ＡＩＣＣの反復投与を施すことを選択し得る。

患者は、モニタリングされ、血漿ウイルス負荷およびＣＤ４ Ｔ細胞計数等のパラメーターにおけるＡＩＣＣの効果を判定する。患者の末梢血リンパ球（プラスチックへの付着後の単球を枯渇させた単核細胞）を、ベースラインおよびワクチン接種後の様々な時点で回収し、凍結させる。それらは、プールしたＨＩＶ−１ペプチドまたはＡＩＣＣ負荷のために使用されたＲＮＡ配列に向けられる特異的な免疫応答を評価するために使用される。例えば、ある試験では、患者のリンパ球中でインターフェロン（ＩＦＮ）−γを産生するＴ細胞クローンの数が、ＥＬＩＳＰＯＴを使用して推定される。他の試験は、上記のＨＩＶ−１ペプチドでパルスされたＡＩＣＣからのＤＣを用いた共培養で増殖する、および／または対応するペプチドでパルスされたウイルス感染した標的細胞の細胞毒性溶解をもたらす、患者からのＴ細胞の能力を推定する。標的細胞アポトーシスは、アネキシンＶおよびカスパーゼ３染色法を使用して、フローサイトメトリーによって分析する。

特許公開および非特許刊行物を含む、本出願で言及されるすべての刊行物は、本発明が属する技術の当業者のスキルレベルを指標する。これらの刊行物のすべては、あたかも各個々の刊行物が参照により組み込まれるように具体的におよび個別に示されるのと同じ程度に参照により本明細書に組み込まれる。

本発明の他の実施形態は、本明細書の考慮および本明細書に開示される実践から、当業者に明らかとなろう。本明細書および実施例は、例示的なものにすぎないと見なされることが意図され、本発明の真の範囲および精神は、次の特許請求の範囲によって示される。

Claims (16)

1. ウイルス感染を治療する方法であって、感染対象に、組成物成熟樹状細胞、活性化ヘルパーＴ細胞、細胞溶解性Ｔ細胞、および少なくとも１つの他の白血球細胞型を投与することを含む、方法。
2. ウイルス感染を治療する方法であって、（ａ）白血球を活性化する時間および温度の条件下で、前記白血球をインキュベートすることと、（ｂ）前記組成物中の樹状細胞の成熟を誘発する時間および温度の条件下、支持媒体中で前記活性化された白血球を培養することと、（ｃ）樹状細胞を含む前記組成物を前記対象に導入し、それによって、前記ウイルス感染を治療することと、を含む、方法。
3. ウイルス感染を治療する方法であって、（ａ）前記組成物中の樹状細胞の成熟を誘発する時間および温度の条件下、支持媒体中で非休止状態の白血球をインキュベートすることと、（ｂ）樹状細胞を含む前記組成物を前記対象に導入し、それによって、前記ウイルス感染を治療することと、を含む、方法。
4. ウイルス感染を治療する方法であって、
   （ａ）
   ｉ）白血球を提供することと、
   ｉｉ）前記白血球を室温で約８〜２０時間維持することによって、前記白血球を休止状態から活性状態に遷移させることと、
   ｉｉｉ）前記白血球を低浸透圧ショックに供することと、
   ｉｖ）支持媒体中で前記ショックさせた白血球を３６時間〜１４日間インキュベートし、それによって、成熟ＤＣを含む組成物を作製することと、によって成熟樹状細胞を含む組成物を調製することと、
   （ｂ）樹状細胞を含む前記組成物を前記対象に導入し、それによって前記ウイルス感染を治療することと、を含む、方法。
5. 樹状細胞を含む前記組成物が、前記ウイルスからの少なくとも１つのペプチドエピトープに曝露される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記ウイルス感染が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ１）、単純ヘルペスウイルス２（ＨＳＶ２）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、またはパピローマウイルス（ＨＰＶ）によるウイルス感染である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記ウイルス感染が、ＨＩＶによる感染である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記ウイルス感染が慢性である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 感染性微生物による感染を治療する方法であって、感染対象に、組成物成熟樹状細胞、活性化ヘルパーＴ細胞、細胞溶解性Ｔ細胞、および少なくとも１つの他の白血球細胞型を投与することを含む、方法。
10. 感染性微生物による感染を治療する方法であって、（ａ）白血球を活性化する時間および温度の条件下で、前記白血球をインキュベートすることと、（ｂ）前記組成物中の樹状細胞の成熟を誘発する時間および温度の条件下、支持媒体中で前記活性化された白血球を培養することと、（ｄ）樹状細胞を含む前記組成物を前記対象に導入し、それによって、前記ウイルス感染を治療することと、を含む、方法。
11. 感染を治療する方法であって、（ａ）前記組成物中の樹状細胞の成熟を誘発する時間および温度の条件下、支持媒体中で非休止状態の白血球をインキュベートすることと、（ｂ）樹状細胞を含む前記組成物を前記対象に導入し、それによって、前記感染を治療することと、を含む、方法。
12. 感染性微生物による感染を治療する方法であって、
    （ａ）
    ｉ）白血球を提供することと、
    ｉｉ）前記白血球を室温で約８〜２０時間維持することによって、前記白血球を休止状態から活性状態に遷移させることと、
    ｉｉｉ）前記白血球を低浸透圧ショックに供することと、
    ｉｖ）支持媒体中で前記ショックさせた白血球を３６時間〜１４日間インキュベートし、それによって、成熟ＤＣを含む組成物を作製することと、によって成熟樹状細胞を含む組成物を調製することと、
    （ｂ）樹状細胞を含む前記組成物を前記対象に導入し、それによって前記感染を治療することと、を含む、方法。
13. 樹状細胞を含む前記組成物が、前記感染性微生物からの少なくとも１つのペプチドエピトープに曝露される、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記感染が、細菌感染である、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記感染が、真菌感染である、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記感染が、原虫感染である、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の方法。