CN111065400A - 抗流感药物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供用于预防或治疗流感的药物，其包含重组痘苗病毒或灭活的流感病毒，所述重组痘苗病毒在痘苗病毒DIs株的基因组中包含表达启动子和编码来自流感病毒的蛋白质的DNA的全部或一部分。
Description
技术领域
本发明涉及对作为流感发病原因的流感病毒感染的发病的预防及治疗药。
背景技术
季节性流感每年冬季流行，报告了会产生10～20％人口的患者。其病原体为A/H1N1、A/H3N2、或B型流感病毒，但其抗原性每年稍有改变，因此需要制造符合其流行预测株的疫苗。另一方面，作为新型流感，有H5N1高致病性禽流感、H7N9禽流感。特别是H5N1高致病性禽流感病毒(H5N1HPAIV)在1997年报告了最初的感染患者，2003年以后，以中国、东南亚、中近东地区为中心感染者增多。目前，报告了800人以上的感染病例和相当于其约50％的450人以上的死亡病例。现在，作为H5N1 HPAIV用疫苗，对于4个进化枝(Clade 1、2.1、2.2、2.3)，以使用孵化鸡卵进行感染、增殖而成的病毒的全颗粒灭活病毒疫苗的形式储备了预测其流行株而制备的大流行前(pre-pandemic)疫苗。
但是，H5N1 HPAIV对孵化鸡卵的感染的致死性高、病毒产量低，因此存在难以大量制备等问题。实际上，对于日本制造、储备的H5N1 HPAIV用大流行前疫苗，从2008年至2009年进行了以下3个临床试验：以6000人规模实施的“安全性试验”、以200人为对象的“初次接种试验”、以及已经完成首期的以200人为对象的“加强接种试验”。对于安全性，得到了在预测范围内的见解。另一方面，在对于已经在“越南株”的H5N1疫苗中完成首期的受试者用作为不同疫苗株的印度尼西亚株或安徽株进行了接种的“加强接种试验”中，尽管确认了交叉反应性，但在以3周间隔利用同一疫苗进行了2次接种的“初次接种试验”中，报告了对不同病毒株的中和抗体诱导不足。另外，在使用了小鼠模型的防御感染实验中，报告了在实验室水平利用同样的方法制备的这4种疫苗种，特别是Clade 2.2及2.3的亚型之间的交叉反应性低，无法完全抑制致死性(非专利文献1)。因此，只是对流行株进行预测而制备的疫苗，因此在对实际上流行的毒株能否发挥疫苗效果方面仍存在诸多不明确的地方。
现在，作为流感治疗药，虽然有抑制对流感病毒出芽很重要的神经氨糖酸苷酶(NA)作用的达菲及瑞乐砂，但由于在发病后48小时以内给药是非常重要的等原因，其效果受到限制。此外，已经开发了NA抑制剂的静注剂。另外，虽然作为流感病毒聚合酶抑制剂的Avigan(法匹拉韦)于2014年3月在日本国内获准制造销售，但应厚生劳动大臣的要求进行制造及供给，附带有不能向普通消费者销售等条件。
基于这样的现状，对于难以进行流行预测的流感病毒，强烈希望确立能够广泛且长期发挥效果的预防药及治疗药。
在各种疫苗当中，活疫苗是最有效的疫苗之一，通常已知新病毒的减毒疫苗开发需要非常长的时间。目前为止，本发明人等开发的狂犬病病毒用或牛瘟用的重组痘苗病毒(RVV)已经在野外试验等中证实了可发挥优异的感染发病预防效果(非专利文献2)。另外，对于严重急性呼吸综合征(SARS)，已经成功地制备了具有已知作为其病原体的SARS-CoV的cDNA的重组痘苗病毒，确认了是具有优异的预防效果和能够再次给药的制剂(非专利文献3)。另外，对于H5N1 HPAIV，也成功地制备了具有H5N1 HPAIV的HA的cDNA的重组痘苗病毒，确认了是显示出优异的预防效果的制剂(非专利文献4)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2006/038742号
非专利文献
非专利文献1：Muarakami S.et al.,Cross-clade protective immunity ofH5N1 influenza vaccines in a mouse model.,Vaccine,vol.26(50),p.6398-6404,2008.
非专利文献2：Tsukiyama K.et al.,Development of heat-stable recombinantrinderpest vaccine.Arch.Virol.,1989,vol.107,p.225-235
非专利文献3：Kitabatake M.et al.,SARS-CoV spike protein-expressingrecombinant vaccinia virus efficiently induces neutralizing antibodies inrabbits pre-immunized with vaccinia virus.Vaccine,2007,vol.25,p.630-637
非专利文献4：Yasui F.et al.,Sensitization with vaccinia virus encodingH5N1 hemagglutinin restore immune potential against H5N1 influenzavirus.Sci.Rep.,2016,vol.6,p.37915
发明内容
发明要解决的课题
本发明要解决的课题在于提供对于阻止由包括H5N1 HPAIV在内的流感病毒感染导致的发病有效的抗流感药。
解决课题的方法
本发明人等基于目前的关于新型流感病毒感染的分析及研究结果进一步进行了深入研究，认为使用重组痘苗疫苗引起免疫的强活性化会得到有力的流感病毒感染预防方法。因此发现，使用痘苗病毒DIs株作为制备重组痘苗病毒所用的病毒株时，可以通过单次接种来防御不同进化枝的毒株的攻击感染的发病等，从而解决上述课题。另一方面，发现该防御作用与以往的灭活疫苗中认为的由中和抗体带来的作用不同，通过不依赖于中和抗体效价的机理发挥了防御效果等，可以解决上述课题，从而完成了本发明。
即，本发明如下所述。
(1)一种用于预防或治疗流感的药物，其包含重组痘苗病毒或灭活的流感病毒，所述重组痘苗病毒在痘苗病毒DIs株的基因组中包含表达启动子和编码来自流感病毒的蛋白质的DNA的全部或一部分。
(2)根据(1)所述的药物，其中，对流感的预防或治疗基于活化的CD4阳性细胞和/或活化的CD8阳性细胞的作用。
(3)根据(1)或(2)所述的药物，其还包含针对来自流感病毒的蛋白质的抗体。
(4)根据(3)所述的药物，其中，抗体为结合抗体。
(5)根据(1)～(4)中任一项所述的药物，其中，来自流感病毒的蛋白质是来自H5N1高致病性禽流感病毒的血凝素蛋白。
(6)一种用于预防或治疗流感的药物，其包含以下(a)～(c)中的任意成分：
(a)选自活化的CD4阳性细胞、CD4阳性细胞的活化剂、以及CD4阳性细胞与CD4阳性细胞的活化剂的组合中的至少1种成分，
(b)选自活化的CD8阳性细胞、CD8阳性细胞的活化剂、以及CD8阳性细胞与CD8阳性细胞的活化剂的组合中的至少1种成分，
(c)上述(a)及(b)成分的组合的成分。
(7)根据(6)所述的药物，其还包含重组痘苗病毒或灭活的流感病毒，所述重组痘苗病毒在痘苗病毒DIs株的基因组中包含表达启动子和编码来自流感病毒的蛋白质的DNA的全部或一部分。
(8)根据(6)或(7)所述的药物，其还包含针对来自流感病毒的蛋白质的抗体。
(9)根据(8)所述的药物，其中，抗体为结合抗体。
(10)根据(7)～(9)中任一项所述的医药，其中，来自流感病毒的蛋白质是来自H5N1高致病性禽流感病毒的血凝素蛋白。
(11)一种预防或治疗流感的试剂盒，其包含重组痘苗病毒或灭活的流感病毒，所述重组痘苗病毒在痘苗病毒DIs株的基因组中包含表达启动子和编码来自流感病毒的蛋白质的DNA的全部或一部分。
(12)根据(11)所述的试剂盒，其中，对流感的预防或治疗基于活化的CD4阳性细胞和/或活化的CD8阳性细胞的作用。
(13)根据(11)或(12)所述的试剂盒，其还包含针对来自流感病毒的蛋白质的抗体。
(14)根据(13)所述的试剂盒，其中，抗体为结合抗体。
(15)根据(11)～(14)中任一项所述的试剂盒，其中，来自流感病毒的蛋白质是来自H5N1高致病性禽流感病毒的血凝素蛋白。
(16)一种预防或治疗流感的试剂盒，其包含以下(a)～(c)中的任意成分：
(a)选自活化的CD4阳性细胞、CD4阳性细胞的活化剂、以及CD4阳性细胞与CD4阳性细胞的活化剂的组合中的至少1种成分，
(b)选自活化的CD8阳性细胞、CD8阳性细胞的活化剂、以及CD8阳性细胞与CD8阳性细胞的活化剂的组合中的至少1种成分，
(c)上述(a)及(b)成分的组合的成分。
(17)根据(16)所述的试剂盒，其还包含重组痘苗病毒或灭活的流感病毒，所述重组痘苗病毒在痘苗病毒DIs株的基因组中包含表达启动子和编码来自流感病毒的蛋白质的DNA的全部或一部分。
(18)根据(16)或(17)所述的试剂盒，其还包含针对来自流感病毒的蛋白质的抗体。
(19)根据(18)所述的试剂盒，其中，抗体为结合抗体。
(20)根据(17)～(19)中任一项所述的试剂盒，其中，来自流感病毒的蛋白质是来自H5N1高致病性禽流感病毒的血凝素蛋白。
发明的效果
根据本发明，可以提供对于流感的预防或治疗有效的、且安全性高的新型流感用预防药或治疗药(流感的预防或治疗用疫苗)。
附图说明
图1是示出用于制备具有新型流感病毒(H5N1 HPAIV)的HA蛋白基因的重组痘苗病毒(RVV)(具体为rDIs/mCl1、rDIs/mCl2.1、rDIs/mCl2.2及rDIs/mCl2.3)的、质粒载体的基因结构的图。图中，“Influenza HA”表示各流感病毒的HA蛋白基因(cDNA)，另外，“H5亚型”表示H5N1 HPAIV(其它图中也同样)。
图2是示出单次接种具有H5N1 HPAIV来源的HA蛋白基因的来自DIs株的RVV(H5N1HPAIV用疫苗：rDIs/mCl2.2)对于H5N1 HPAIV对BALB/c小鼠的攻击感染的感染防御效果的研究结果的图。
图3是示出单次接种了H5N1 HPAIV用疫苗(rDIs/mCl2.2)的BALB/c小鼠从H5N1HPAIV攻击感染至9天后的肺组织中病毒量的图。
图4是示出单次接种了H5N1 HPAIV用疫苗(rDIs/mCl2.2)的BALB/c小鼠从H5N1HPAIV攻击感染至6天后的中和抗体效价的图。
图5是示出给药了对HA蛋白的结合抗体的BALB/c小鼠在病毒感染1天后及6天后的病毒量的图。
图6是示出对野生型小鼠或Fc受体gamma缺失小鼠接种H5N1 HPAIV用疫苗(rDIs/mCl2.2)从H5N1 HPAIV攻击感染至9天后的体重变化、和病毒感染1天后及3天后为止的肺组织中病毒量的图。
图7是示出单次接种了H5N1 HPAIV用疫苗(rDIs/mCl2.2)的BALB/c小鼠中的CD4阳性细胞耗尽对于从H5N1 HPAIV攻击感染至6天后的肺组织中病毒量的影响的图。
图8是示出疫苗接种组中的CD8阳性细胞耗尽、或CD4阳性及CD8阳性这两种细胞耗尽对肺组织中病毒量的影响的图。
图9是示出疫苗接种组中的CD4阳性及CD8阳性这两种细胞耗尽对体重及生存率的影响的图。
具体实施方式
以下，对本发明详细地进行说明。
本发明的范围并不限于这些说明，除以下的示例以外，还可以在不损害本发明主旨的范围适当变更来实施。需要说明的是，本说明书中引用的专利文献、非专利文献、其它出版物以参照的形式引入本说明书中。
1.本发明的内容
现有的对H5N1 HPAIV的大流行前疫苗是使用反向遗传技术制备具有使多碱基部位缺失的H5N1 HA的流感病毒、并利用福尔马林进行了灭活的全颗粒疫苗。为了诱导有效的免疫应答，需要以3周间隔进行2次接种，并且对于与接种疫苗不同进化枝的病毒株，预防效果明显减弱。
另一方面，已知制备重组痘苗病毒(RVV)作为活疫苗的基因工程方法。作为成为RVV制备中使用的重组母体的痘苗病毒，需要已确立了安全性的疫苗株，作为这样的疫苗株，有痘苗病毒DIs株、LC16m8株。痘苗病毒DIs株是通过在鸡卵胚中对痘苗病毒大连株(DEI株)进行传代培养而分离出的高度减毒的痘苗病毒株(Tagaya I,et al.,A new mutant ofdermovaccinia virus.Nature,1961,vol.192,p.1187-1188)，虽然在鸡胚成纤维细胞(CEF)中可以增殖，但在其它哺乳动物细胞内是非增殖性的，安全性高。另一方面，痘苗病毒LC16m8株在1975年被当时的厚生省批准为天然痘疫苗，是具有对5万人以上的婴幼儿进行了接种的实际成绩的安全且有效的减毒疫苗株。LC16m8株的减毒性是由于通过使被认为与粘附/感染细胞相关的LC16mO株的B5R蛋白基因缺失了1个碱基，从而不表达全部长度的B5R蛋白(Morikawa S.,et al.An attenuated LC16m8 smallpox vaccine：analysis offull-genome sequence and induction of immune protection.J.Virol.,2005,vol.79(18),p.11873-1189)。
因此，即使在对免疫缺陷或免疫抑制者进行接种的情况下，也能够开发出确保安全性的可能性高、且具有不留接种痕迹等优点的重组流感活疫苗。本发明人建立了使用该DIs株作为母体的重组新型流感疫苗，单次接种对H5N1 HPAIV感染显示出有效性。由此，对于表达流感病毒HA蛋白基因的DIs株来源的RVV而言，通过单次接种1×107PFU量的RVV作为H5N1 HPAIV用疫苗(rDIs/mCl2.2)，对致死性的H5N1 HAPIV攻击感染也显示出快速的体重恢复和100％生存率。因此，来自DIs株的RVV作为H5N1 HPAIV用疫苗是具有足够的效果的。
另外，发现了即使在H5N1 HPAIV用疫苗(rDIs/mCl2.2)接种个体中没有诱导对H5N1 HPAIV的中和抗体，也可发挥良好的预防效果(图3、图4)。
因此，在本发明中，其目标在于阐明不依赖于中和抗体的防御效果。
其结果是，明确了在接种了H5N1 HPAIV用疫苗(rDIs/mCl2.2)的个体中，随着感染后天数的经过，各种细胞群、因子涉及感染防御，所述H5N1 HPAIV用疫苗是将编码H5N1高致病性禽流感病毒(H5N1 HPAIV)的血凝素(HA)蛋白的基因和表达启动子一起导入痘苗病毒DIs株而成的。具体而言，在接种了H5N1 HPAIV用疫苗(rDIs/mCl2.2)的个体中，通常病毒在H5N1 HPAIV感染6天后被清除至检测限以下。在该接种疫苗个体中，对于疫苗接种后产生的结合抗体而言，在H5N1 HPAIV感染1天后为止的感染防御中，具有结合抗体和Fc gamma受体的细胞群有助于防御病毒感染，很有可能进行了通过FcRg介导的ADCC。但是，抗体的病毒清除贡献率不高，显示出并没有达到接种了H5N1 HPAIV用疫苗(rDIs/mCl2.2)的个体(图3)中观察到的病毒清除(图5、6)。
另一方面，CD4阳性细胞的耗尽实验的结果表明，在H5N1 HPAIV用疫苗(rDIs/mCl2.2)接种个体从感染1天后至3天后的病毒感染防御中，CD4阳性细胞是必须的(图7)。
另外可知，从感染3天后至6天的病毒清除中，CD8阳性细胞起到重要的作用(图8)。此外，通过将CD4阳性细胞及CD8阳性细胞这两者耗尽，在接种疫苗个体中，即使感染10天后也无法清除病毒，体重明显减轻，开始发生死亡(图9)。
这些结果表明，HPAIV用疫苗(rDIs/mCl2.2)与被认为对于现有的全颗粒灭活疫苗接种所带来的预防作用是很重要的抗原特异性抗体(特别是中和抗体)不同，通过CD4阳性细胞和/或CD8阳性细胞介导的强力的抗流感病毒作用机制而发挥了对H5N1 HPAIV感染的防御效果。
根据以上的结果，痘苗病毒DIs株的基因组中包含表达启动子和编码来自流感病毒的蛋白质的DNA的全部或一部分的重组痘苗病毒、或灭活的流感病毒可以作为用于预防或治疗流感的药物、或用于预防或治疗流感的疫苗来使用。在本发明中，可以通过活化的CD4阳性细胞、活化的CD8阳性细胞、或这些细胞的组合发生作用来发挥对流感的预防或治疗效果。
另外，可知对流感病毒HA蛋白活化的CD4阳性细胞和/或活化的CD8阳性细胞是对于显示出急剧流行的流感病毒安全且有效的预防药或治疗药。
2.CD4/CD8阳性细胞的活化剂及活化的CD4/CD8阳性细胞
在本发明的一个方式中，使用活化的CD4阳性细胞、CD4阳性细胞的活化剂、或CD4阳性细胞的活化剂与CD4阳性细胞的组合作为对流感的预防或治疗用药物(预防或治疗用药物组合物)。
另外，在本发明的一个方式中，使用活化的CD8阳性细胞、CD8阳性细胞的活化剂、或CD8阳性细胞与CD8阳性细胞的活化剂的组合作为对流感的预防药或治疗用药物(预防或治疗用药物组合物)。
以下，将CD4阳性细胞或CD8阳性细胞、或者CD4阳性细胞及CD8阳性细胞这两者称为“CD4/CD8阳性细胞”。
另外，在本发明的一个方式中，可以将来自DIs株的RVV·H5N1 HPAIV(rDIs/mCl2.2)等灭活的流感病毒和上述活化的CD4/CD8阳性细胞、CD4/CD8阳性细胞的活化剂、或CD4/CD8阳性细胞与CD4/CD8阳性细胞的活化剂的组合一起使用作为灭活疫苗。
CD4阳性细胞有辅助性T细胞(分类为Th1、Th2或Th17)及调节性T细胞。CD4阳性细胞所具有的T细胞受体(TCR)与巨噬细胞、B细胞所具有的II类的MHC分子结合。辅助性T细胞通过MHC II类分子从巨噬细胞等接受抗原提呈，将B细胞、细胞毒性T细胞激活。另一方面，调节性T细胞与免疫应答的终止相关。
CD8细胞是对提呈至MHC I类分子的抗原显示出反应性的T细胞，作为识别该抗原并破坏病毒感染细胞的细胞毒性T细胞而发挥作用。另外，通过产生干扰素γ(IFN-g)而作用于病毒感染细胞，非细胞毒性地促进细胞内抗原的分解。
灭活的流感病毒是指，将疫苗制造用的流感病毒接种于孵化鸡卵并使其增殖，用醚将从绒膜尿囊液纯化/浓缩的病毒部分分解，进一步用福尔马林进行了灭活的病毒。但是，在本发明中，也可以使用将病毒粒子本身灭活而得到的病毒。
CD4/CD8阳性细胞是从受试者的血液、骨髓等采集并利用细胞分选仪等获得的。或者，可以从iPS等干细胞诱导。
采集到的细胞为CD4/CD8阳性细胞的确认可以通过流式细胞法来进行。
作为CD4阳性细胞的活化剂，可以列举：白介素(IL)-2、IL-4、CD86、OX40配体、作为抗原的HA蛋白或其一部分等。通过将CD4阳性细胞和上述活化剂一起培养而使其活化。
作为CD8阳性细胞的活化剂，可以列举：IL-2、IL-12、IFN-g、CD86、CD137配体、OX40配体、作为抗原的HA蛋白或其一部分等。通过将CD8阳性细胞和上述活化剂一起培养而使其活化。
CD4/CD8阳性细胞被活化的确认可以通过基于流式细胞法、ELISpot法确认细胞因子的产生、活性标志物的表达增加来进行。
另一方面，在本发明中，对受试者(健康受试者或患者)给药CD4/CD8阳性细胞活化剂时，在被给药的受试者的体内，来自受试者的CD4/CD8阳性细胞被活化。体内的CD4/CD8阳性细胞的活化机制是，给药IL-2、IL-4、CD86、OX40配体、作为抗原的HA蛋白或其一部分等CD4阳性细胞活化剂时，CD40L、CD44及CD69等的表面分子表达亢进，其结果是，CD4阳性细胞被活化。另外，给药IL-2、IL-12、IFN-g、CD86、CD137配体、OX40配体、作为抗原的HA蛋白或其一部分等CD8阳性细胞活化剂时，CD44、CD69等的表面分子表达亢进，其结果是，CD8阳性细胞被活化。
另外，在使用CD4/CD8阳性细胞与CD4/CD8阳性细胞的活化剂的组合时，通过对受试者给药该组合，给药所使用的CD4/CD8阳性细胞被活化，并且在被给药的受试者的体内，来自受试者的内在的CD4/CD8阳性细胞也被活化。这些CD4/CD8阳性细胞被活化的确认可以通过基于流式细胞法、ELISpot法确认细胞因子的产生、活性标志物的表达增加来进行。
3.针对来自流感病毒的蛋白质的抗体
作为本发明的其它方式，将对来自流感病毒的蛋白质的抗体和本发明的重组痘苗病毒、或灭活的流感病毒一起用作流感的预防或治疗用药物。
另外，在本发明的其它方式中，将针对来自流感病毒的蛋白质的抗体和CD4/CD8阳性细胞的活化剂和/或活化的CD4/CD8阳性细胞一起用作流感的预防或治疗用药物。
作为本发明中使用的来自流感病毒的蛋白质，可以列举例如：H1N1、H3N2、B型流感病毒，没有特别限定。在本发明中，可以主要使用来自H5N1 HPAIV的血凝素(HA)蛋白质。
另外，使用上述针对来自流感病毒的蛋白质的抗体或其抗原结合片段作为流感的预防或治疗用药物。
抗体可以是针对来自流感病毒的蛋白质的结合抗体、以及针对来自流感病毒的蛋白质的中和抗体中的任一种。另外，这些抗体可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体，还可以是它们的片段。在使用来自H5N1 HPAIV的HA蛋白作为抗原时，针对该蛋白质的抗体(称为“抗HA抗体”)可以识别生物体内的环境中所具有的HA蛋白(处于完整的立体结构的状态的HA蛋白)。
“结合抗体”是指以来自流感病毒的蛋白质(例如，H5N1病毒的HA蛋白)作为抗原的抗体，作为功能，具有调理作用或与调理作用类似的作用。结合抗体具有与抗原结合的功能，但是是对流感病毒(例如，H5N1 HPAIV)不具有中和活性的抗体。
“中和抗体”是指以来自流感病毒的蛋白质(例如，H5N1病毒的HA蛋白)作为抗原的抗体，是由后述的DIs疫苗接种后的个体产生的抗体。中和抗体的中和活性是指抑制病毒粘附和/或感染靶细胞的功能。即，中和抗体的功能是指如下功能：无论与来自流感病毒的蛋白质的哪个部分结合，通过与该蛋白质结合来抑制病毒的蛋白质粘附于位于靶细胞表面的受体并进行感染。
本发明的抗体具有对多肽的结合活性，所述多肽具有后述的表1中记载的登录号所示的氨基酸序列，除此以外，还可以是识别以下突变型多肽的抗体：这些氨基酸序列中的1个或多个(例如2、3、4或5个)氨基酸进行了取代、缺失或插入的突变型多肽、与该序列号所示的氨基酸序列具有80％以上、优选为90％以上、95％以上、98％以上、或99％以上的同一性的突变型多肽。
另外，在本发明的另一个方式中，本发明的抗体包括识别以下多肽的抗体：由表1中记载的登录号所示的碱基序列构成的多核苷酸所编码的多肽、或者由与该碱基序列具有80％以上、90％以上、95％以上、98％以上、或99％以上同一性的多核苷酸编码的突变型多肽。
另外，在本发明的另一个方式中，本发明的抗体可以是识别由如下多核苷酸编码的突变型多肽的抗体，所述多核苷酸包含与表1中记载的登录号所示的碱基序列在高严格条件下进行杂交的碱基序列。
＜中和抗体＞
如上所述，本发明的中和抗体是由DIs疫苗接种后的个体产生的抗体。
通过将DIs疫苗以其自身、或与载体、稀释剂一起施用于例如兔、犬、豚鼠、小鼠、大鼠、山羊、马、绵羊等非人哺乳动物来进行免疫。免疫方法是公知的。
血清中的抗体的中和抗体效价的测定可以利用微量中和抗体测定法等来进行。在确认到中和抗体效价充分上升后，采集全部血液，可以利用通常进行的方法将抗体分离纯化。分离纯化可以通过适当选择硫酸铵盐析法、离子交换色谱、凝胶过滤色谱、亲和色谱等公知的方法、或者将它们组合来进行纯化。
＜结合抗体＞
本发明的结合抗体是针对来自流感病毒的蛋白质(例如，H5N1病毒的HA蛋白)的抗体，因此，可以使用该蛋白质或其部分肽作为抗原，与通常的制备多克隆抗体或单克隆抗体的方法同样地进行制备。
4.抗体的制备
(1)多克隆抗体的制备
通过将来自流感病毒的蛋白质或部分肽以其自身、或与载体、稀释剂一起施用于例如兔、犬、豚鼠、小鼠、大鼠、山羊等非人哺乳动物来进行免疫。抗原对每1只动物的给药量、使用佐剂时的给药量、佐剂的种类、免疫部位、免疫的间隔等是公知的。
血清中的抗体效价的测定也是公知的，可以通过ELISA、EIA、RIA等进行。在确认了抗体效价充分上升后，采集全部血液，可以利用通常进行的方法将抗体分离纯化。分离纯化可以通过适当选择硫酸铵盐析法、离子交换色谱、凝胶过滤色谱、亲和色谱等公知的方法、或者将它们组合来进行纯化。
(2)单克隆抗体的制备
单克隆抗体的制备方法也是公知的。例如，抗体产生细胞的采集、用于得到杂交瘤的抗体产生细胞与骨髓瘤细胞的细胞融合、杂交瘤的筛选及克隆、单克隆抗体的采集等可以通过本领域技术人员公知的方法来进行。
另外，在本发明中，抗体的表位(抗原决定簇)只要是作为抗原的来自流感病毒的蛋白质的至少一部分即可，没有特别限定。本发明的抗体包括与该抗体结合的部位(例如表位)进行结合的抗体，例如，与本发明的杂交瘤所产生的抗体结合的部位进行结合的抗体。
(3)基因重组抗体的制备
作为本发明的抗体的优选方式之一，可以举出基因重组抗体。作为基因重组抗体，没有限定，可以列举例如：嵌合抗体、改型抗体(人型化抗体)及全人源化抗体等。
嵌合抗体(即，人型嵌合抗体)是将来自小鼠的抗体的可变区与来自人的恒定区连接(接合)而成的抗体(参照Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81,6851-6855,(1984)等)，在制备嵌合时，为了得到这样连接而成的抗体，可以利用基因重组技术而容易地构建。
在制备改型抗体时，可以采用所谓的CDR接枝(CDR移植)的方法。这样的改型抗体的制备方法在本领域是公知的(参照Nature,321,522-525(1986)；J.Mol.Biol.,196,901-917(1987)；Queen C et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:10029-10033(1989)；日本专利第2828340号公报等)。
对于全人源化抗体(完全人源抗体)而言，通常，作为可变区(V区)的抗原结合部位的超可变区(hyper variable region)、V区的其它部分及恒定区的结构具有与人的抗体相同的结构。制备人源抗体的技术也是公知的，对于与人共通的基因序列，已经确立了通过基因工程方法进行制备的方法。人源抗体可以通过以下方法获得，例如：使用了人源抗体产生小鼠的方法，所述人源抗体产生小鼠具有包含人源抗体的重链(H链)及轻链(L链)的基因的人染色体片段(参照Tomizuka,K.et al.,Nature Genetics,(1977)16,133-143；Kuroiwa,Y.et.al.,Nuc.Acids Res.,(1998)26,3447-3448；Yoshida,H.et.al.,Animal CellTechnology:Basic and Applied Aspects,(1999)10,69-73(Kitagawa,Y.,Matuda,T.andIijima,S.eds.),Kluwer Academic Publishers；Tomizuka,K.et.al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,(2000)97,722-727等)；获得通过人源抗体库筛选出的噬菌体展示技术来源的人源抗体的方法(参照Wormstone,I.M.et.al,InvestigativeOphthalmology&Visual Science.,(2002)43(7),2301-8；Carmen,S.et.al.,Briefings inFunctional Genomics and Proteomics,(2002)1(2),189-203；Siriwardena,D.et.al.,Opthalmology,(2002)109(3),427-431等)。
(4)抗体片段的制备
作为本发明中使用的针对来自流感病毒的蛋白质的抗体的片段，可以列举例如：Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、diabody(dibodies)、dsFv、scFv(single chain Fv)等。上述抗体片段可以通过根据目的用各种蛋白质分解酶将本发明的抗体切断而得到。
例如，Fab通过用木瓜蛋白酶处理抗体分子而得到，F(ab’)2通过用胃蛋白酶处理抗体分子而得到。Fab’通过将上述F(ab’)2的铰链区的二硫键切断而得到。scFv的情况下，获得编码抗体的重链可变区(H链V区)及轻链可变区(L链V区)的cDNA，构建编码scFv的DNA。通过将该DNA插入表达载体，并将该表达载体导入宿主生物使其表达，从而制造scFv。
在diabody的情况下，获得编码抗体的H链V区及L链V区的cDNA，以肽接头的氨基酸序列长度为8残基以下的方式构建编码scFv的DNA。通过将该DNA插入表达载体，并将该表达载体导入宿主生物使其表达，从而制造diabody。在dsFv的情况下，获得编码抗体的H链V区及L链V区的cDNA，构建编码dsFv的DNA。通过将该DNA插入表达载体，并将该表达载体导入宿主生物使其表达，从而制造dsFv。
5.H5N1 HPAIV用疫苗(rDIs-H5 HA)或灭活疫苗
H5N1 HPAIV用疫苗的制备方法是公知的(日本第5884100号专利)，可以按照该公知方法来制备。制备方法的概要如下所示。
H5N1 HPAIV的HA蛋白基因已经在美国国立生物技术信息中心(NCBI；NationalCenter for Biotechnology Information)提供的GenBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中以给定的登录号(Accession No.)注册。
例如，如下述表1所示，按照GenBank登录号注册了编码来自H5N1 HPAIV的各进化枝的HA蛋白的基因、或者使编码来自H5N1 HPAIV的各进化枝的HA蛋白的DNA的一部分缺失而成的基因。
[表1]
这些HA蛋白基因(也包括使一部分发生了缺失/突变的基因)已被克隆并插入质粒。因此，本发明的重组痘苗病毒中包含的基因的全部(也包含突变序列)或其一部分可以通过通常的基因工程方法得到。
上述方法可以使用“Molecular Cloning,A Laboratory Manual(4th edition)”(Cold Spring Harbor Laboratory Press(2012))、“Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons(1987-1997)”等中记载的部位特异性诱变法、或者利用了Kunkel法、Gapped duplex法等的突变导入用试剂盒来制备。
本发明的重组痘苗病毒中包含的表达启动子只要是可插入痘苗病毒DIs株的基因缺失区域即可，没有限定，可以举出例如痘苗病毒启动子mH5等(Virology.vol.351,p.368-380)。另外，作为该表达启动子，例如，也可以使用杂交启动子，所述杂交启动子由痘病毒A型封入体(ATI)启动子及多次重复的痘苗病毒7.5kDa蛋白质(p7.5)早期表达启动子构成。该启动子可以连接于适当的质粒，例如，已知有pUC/DIs(参照Arch.Virol.vol.138,p.315-330,1994；日本特开平6-237773号公报)。
通过将插入上述表达启动子及编码HA蛋白的DNA而得到的质粒载体导入作为宿主的痘苗病毒，制备重组痘苗病毒。质粒载体对宿主的导入可以采用公知的任意方法，例如，可以通过将感染了减毒痘苗病毒DIs株的鸡成纤维细胞中得到的质粒载体进行导入来制备重组痘苗病毒(rDIs/mCl1、rDIs/mCl2.1、rDIs/mCl2.2及rDIs/mCl2.3)。
灭活疫苗的制造方法是公知的。如上所述，将疫苗制造用的流感病毒接种于孵化鸡卵并使其增殖，用醚将从绒膜尿囊液纯化/浓缩的病毒部分分解，进一步用福尔马林进行灭活。
6.新型流感的预防用及治疗用药物和防御感染的作用机理
本发明提供一种流感的预防或治疗用药物，其包含(i)来自DIs株的上述重组痘苗病毒或灭活病毒、或者(ii)该重组痘苗病毒或灭活病毒与针对来自流感病毒的蛋白质的抗体的组合。
另外，本发明提供一种用于预防或治疗流感的药物组合物，其包含选自以下(a)～(d)中的至少1种。
(a)活化的CD4/CD8阳性细胞
(b)CD4/CD8阳性细胞的活化剂
(c)CD4阳性细胞与CD4阳性细胞的活化剂的组合
(d)CD8阳性细胞与CD8阳性细胞的活化剂的组合
另外，本发明的药物除了上述(a)～(d)中的任一种或它们的组合以外，还可以进一步包含(e)针对来自流感病毒的蛋白质的抗体、(f)来自DIs株的上述重组痘苗病毒或灭活病毒、或者(g)该重组痘苗病毒或灭活病毒与抗体的组合。
另外，本发明还提供包括对患者(受试者)给药上述药物或上述药物组合物预防及治疗流感的方法、上述药物用于流感的预防及治疗的用途、上述药物用于制造上述新型流感的预防药及治疗药的用途等。
本发明的医药组合物可以通过公知的方法、例如肌肉、腹腔内、皮内或皮下等注射、或者由鼻腔、口腔或肺吸入、口服给药而导入生物体。
另外，本发明的医药组合物中包含的抗体、CD4/CD8阳性细胞、CD4/CD8阳性细胞的活化剂、或它们的组合也可以与上述重组痘苗病毒或灭活病毒组合使用。
组合使用的方式没有特别限定，可以将本发明的药物和本发明的重组痘苗病毒或灭活病毒同时给药，另外，也可以利用给药一者后、经过一定时间后再给药另一者的方法来导入生物体。
在本发明中，在将抗体、CD4/CD8阳性细胞、CD4/CD8阳性细胞的活化剂、或它们的组合作为医药组合物使用时，可以与赋形剂、增量剂、粘合剂、润滑剂等公知的药学上可接受的载体、缓冲剂、等张剂(tonicity agent)、螯合剂、着色剂、防腐剂、香料、调味剂、甜味剂等混合。
本发明的医药组合物可以根据片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、丸剂、液剂、糖浆剂等口服给药剂、注射剂、外用制剂、栓剂、滴眼剂等非口服给药剂等形式进行口服给药或非口服给药。可以优选示例出对皮内、肌肉、腹腔等的局部注射等。
给药量可以根据有效成分的种类、给药途径、给药对象、患者的年龄、体重、性别、症状等其它条件而适当选择。
抗体：静脉
活化的CD4/CD8阳性细胞：静脉
CD4/CD8阳性细胞的活化剂：口服、静脉
作为病毒的一天给药量，口服的情况下为1000～1000000000PFU(plaque formingunits)左右，优选为100000～100000000PFU左右，非口服的情况下为100～1000000000PFU左右，优选为1000～100000000PFU左右。病毒可以1天给药1次，也可以分成数次给药。
本发明的重组痘苗病毒或灭活病毒可以用作流感预防用及治疗用疫苗。另外，目前为止，在针对H5N1 HPAIV的疫苗的开发中，对于H5N1 HPAIV的中和抗体效价被认为是很重要的。另一方面，本发明的重组痘苗病毒在基本上没有诱导中和抗体效价的情况下也能够发挥有效的防御效果，表明随着H5N1 HPAIV感染后的时间经过，发挥作用的细胞群、因子是不同的。
具体而言，在接种了H5N1 HPAIV用疫苗(rDIs/mCl2.2)的个体中，通常到H5N1HPAIV感染6天后为止，病毒被清除至检测限以下。在该接种疫苗个体中，H5N1 HPAIV感染1天后为止的感染防御中，具有结合抗体和Fc gamma受体的细胞群对于防御病毒感染是很重要的。
另一方面，根据CD4阳性细胞的耗尽实验的结果可知，在感染1天后至3天后为止的病毒感染防御中，CD4阳性细胞是必须的。另外可知，从感染3天后至6天为止的病毒感染防御中，CD8阳性细胞是必要的。
如上所述，本发明人等制备的重组痘苗病毒(总称为“Flu HA-RVVs”)可以通过与抗原特异性抗体(特别是中和抗体)不同的作用机理来发挥对H5N1 HPAIV感染的防御效果，而所述抗原特异性抗体被认为对于现有的全颗粒灭活疫苗接种所带来的预防作用是很重要的。
7.试剂盒
本发明的试剂盒可以包含RVV(rDIs)或灭活病毒、针对来自流感病毒的蛋白质的抗体、或它们的组合。
另外，本发明的试剂盒可以包含以下(a)～(d)中的任一种、或它们的组合。
(a)活化的CD4/CD8阳性细胞
(b)CD4/CD8阳性细胞的活化剂
(c)CD4阳性细胞与CD4阳性细胞的活化剂的组合
(d)CD8阳性细胞与CD8阳性细胞的活化剂的组合
另外，本发明的试剂盒除了上述(a)～(d)以外，还可以进一步包含(e)针对来自流感病毒的蛋白质的抗体、(f)RVV(rDIs)或灭活病毒、或者(g)该重组痘苗病毒或灭活病毒与抗体的组合。
本发明的试剂盒可以用于对H5N1高致病性禽流感的预防用途或治疗用途。
以下，列举实施例对本发明更具体地进行说明。这些实施例用于说明而不限定本发明的范围。
实施例1
＜方法＞
1)来自导入了流感病毒血凝素蛋白基因的DIs株的重组痘苗病毒的制备
在痘苗病毒启动子mH5序列的下游连接人工合成的作为H5N1 HPAIV抗原的血凝素蛋白(HA)基因，插入同源重组用质粒载体(图1)。此时，在插入H5N1亚型HA序列的情况下，使用了Hind III位点作为限制酶位点。通过将同源重组用质粒载体(利用限制酶切断一个部位，使其线状化)基因导入预先感染了DIs株的CEF，制作了在DIs株的基因缺失部位的邻接区域发生同源重组而在痘苗病毒的基因组中插入了mH5启动子及流感病毒HA蛋白基因的重组痘苗病毒(RVV)，具体而言，制作了rDIs/mCl1、rDIs/mCl2.1、rDIs/mCl2.2及rDIs/mCl2.3的各种RVV。来自流感病毒的HA蛋白对豚鼠红血球显示出凝集反应，但来自痘苗病毒的HA蛋白对豚鼠红血球不发生凝集反应。因此，使上述重组病毒感染CEF，以豚鼠红血球对由此形成的噬菌斑的凝集反应作为指标，进行了RVV的筛查。目标的重组病毒筛选出了具有红血球凝集活性的形成红色噬菌斑的病毒。
2)单次接种来自DIs株的重组痘苗病毒的小鼠对H5N1 HPAIV感染的防御效果
以1×107PFU将重组痘苗病毒(rDIs/mCl2.2)接种于小鼠的背部皮内。从接种至4周后进行H5N1 HPAIV的攻击感染，每天进行体重测定，求出了生存率。另外，在1、3、6、9天后进行采血和肺组织样本采集，进行了肺组织中病毒量的测定。
3)中和抗体效价测定
使用采集到的血清，使用与对小鼠的感染所用的H5N1 HPAIV相同的病毒株，测定了血清中包含的中和抗体效价。
4)H5N1 HPAIV对于导入了针对H5N1 HPAIV的结合抗体的小鼠的感染
对导入了针对H5N1 HPAIV的结合抗体的小鼠攻击感染H5N1 HPAIV，在感染1天后和6天后采集肺组织样本，测定了肺组织中的病毒滴度。
5)H5N1 HPAIV对单次接种疫苗的FcR gamma缺失小鼠及野生型小鼠的攻击感染
以1×107PFU将重组痘苗病毒(rDIs/mCl2.2)接种于FcR gamma缺失小鼠和野生型小鼠的背部皮内。从接种至4周后进行H5N1 HPAIV的攻击感染，每天进行体重测定，求出了生存率。另外，在1、3天后进行肺组织样本采集，进行了肺组织中病毒量的测定。
6)单次接种来自DIs株的重组痘苗病毒带来的感染防护效果中CD4阳性细胞的作
用
以1×107PFU将重组痘苗病毒(rDIs/mCl2.2)接种于BALB/c小鼠的背部皮内。从接种至4周后进行了H5N1 HPAIV的攻击感染。在攻击感染之前，从感染2天前起每隔一天静脉给药CD4阳性细胞耗尽用抗体。每天进行体重测定，求出了生存率。另外，在1、3、6天后进行肺组织样本采集，进行了肺组织中病毒量的测定。
7)单次接种来自DIs株的重组痘苗病毒带来的感染防护效果中CD8阳性细胞、或
CD4阳性细胞及CD8阳性细胞的作用
以1×107PFU将重组痘苗病毒(rDIs/mCl2.2)接种于BALB/c小鼠的背部皮内。从接种至4周后进行H5N1 HPAIV的攻击感染。在攻击感染之前，从感染2天前起每隔一天静脉给药CD8阳性细胞耗尽用抗体、或CD4阳性细胞及CD8阳性细胞耗尽用抗体这两种抗体。在1、3、6天后进行肺组织样本采集，进行了肺组织中病毒量的测定。
8)单次接种来自DIs株的重组痘苗病毒带来的感染防护效果中CD4阳性及CD8阳性
这两种细胞的耗尽对体重及生存率的影响
以1×107PFU将重组痘苗病毒(rDIs/mCl2.2)接种于BALB/c小鼠的背部皮内。从接种至4周后进行H5N1 HPAIV的攻击感染。在攻击感染之前，从感染2天前起每隔一天静脉给药CD4阳性细胞及CD8阳性细胞耗尽用这两种抗体。每天进行体重测定，求出了生存率。
＜结果＞
在单次接种制备的RVV(rDIs/mCl2.2)的小鼠中，在H5N1 HPAIV的攻击感染后显示出暂时性的体重减少，但随后迅速恢复，显示出100％的生存率。另一方面，在未接种疫苗的对照组中，显示出急剧的体重减少，全部死亡(图2)。此时，测定了对照组及疫苗接种组的肺组织中病毒滴度，其结果是，在对照组中，在感染9天后为止显示出了很高的病毒滴度，但在疫苗接种组中，在感染6天后为止大多数个体中病毒滴度降低至检测限以下(图3)。
另一方面，在肺组织中病毒被迅速清除的接种疫苗个体中，与对照组同样地未检测出针对攻击感染病毒株的中和抗体效价(图4)。
因此，为了详细地分析接种疫苗个体中的防御作用机理，将从接种疫苗个体中回收的抗血清中包含的IgG纯化，对首次接受试验的小鼠(naive mouse)静脉给药后，进行了H5N1 HPAIV的攻击感染。其结果是，对于感染1天后的肺组织中病毒滴度而言，与H5N1HPAIV对接种疫苗个体感染时同样地，与未接种疫苗个体相比，降低至1/5～1/10(图5)。接着，为了探讨具有与抗原特异性IgG结合的FcR的细胞群是否与该感染初期的病毒滴度降低相关，在对FcR gamma缺失小鼠进行了疫苗接种后，攻击感染了H5N1 HPAIV。
将感染1天后的肺组织中病毒滴度与野生型小鼠进行比较，其结果是，FcR gamma缺失小鼠的肺组织中病毒滴度显示出比野生型小鼠更高的值(图6)。根据抗原特异性IgG的导入实验和FcR gamma缺失小鼠中的实验结果表明，接种疫苗个体在感染1天后的肺组织中的病毒滴度的降低是具有结合抗体和FcR的细胞群的效果。另外，对于接种疫苗个体，从H5N1 HPAIV攻击感染的2天前至感染期间中，通过每隔一天静脉给药抗CD4抗体，将CD4阳性细胞群耗尽。
在CD4阳性细胞耗尽组中，H5N1 HPAIV感染3天后的肺组织中病毒滴度显示出高值。根据该结果可知，从感染1天后至3天后，CD4阳性细胞对于病毒清除起到了重要的作用。另外，在以CD4阳性细胞作为个体的组中，在感染6天后，虽然检测到了感染病毒，但与未接种疫苗个体相比为较低的值，由此可知，在感染3天后至6天后的病毒清除中，除了CD4阳性细胞群以外，还需要其它细胞群或因子(图7)。
因此，接下来，从接种疫苗个体中使CD8阳性细胞、或CD4阳性细胞和CD8阳性细胞这两者同时耗尽。其结果表明，在CD8细胞耗尽组及CD4/CD8细胞耗尽组这两组中，在感染6天后，无法清除病毒(图8)。另外，在CD4/CD8细胞耗尽组中，尽管接种了疫苗，但体重逐渐减少，也观察到了死亡的个体(图9)。
＜考察＞
对于来自表达流感病毒HA蛋白基因的DIs株的RVV而言，通过单次接种1×107PFU量的RVV作为H5N1 HPAIV用疫苗(rDIs/mCl2.2)，对于致死性的H5N1 HPAIV攻击感染，也显示出迅速的体重恢复和100％的生存率。因此，来自DIs株的RVV作为H5N1 HPAIV用疫苗，具有充分的效果。通常，在接种H5N1 HPAIV用疫苗(rDIs/mCl2.2)的个体中，在H5N1 HPAIV感染6天后，病毒被清除至检测限以下。已知，在该接种疫苗个体中，H5N1 HPAIV感染1天后为止的感染防御中，具有结合抗体和Fc gamma受体的细胞群对于防御病毒感染是很重要的。另一方面，根据CD4阳性细胞的耗尽实验的结果可知，在从感染1天后至3天后的防御病毒感染中，CD4阳性细胞是必须的。
另外，考虑了从感染3天后至6天的防御病毒感染中，CD4阳性细胞、CD8阳性细胞主要有助于病毒清除的可能性。在耗尽了CD4/CD8阳性细胞的个体中，尽管接种了疫苗，但观察到了死亡的个体。这些结果表明，通过与被认为对于现有的全颗粒灭活疫苗接种所带来的预防作用是很重要的中和抗体不同的作用机理，即，通过CD4阳性细胞及CD8阳性细胞多阶段起作用，发挥了对H5N1 HPAIV感染的防御效果。
根据以上的结果可知，本发明的来自表达流感病毒HA蛋白基因的DIs株的RVV是对显示出急剧流行的流感病毒安全且有效的疫苗。另外还可知，作为其防御机理，CD4阳性细胞及CD8阳性细胞多阶段地发挥作用。
Claims (20)
1.一种用于预防或治疗流感的药物，其包含重组痘苗病毒或灭活的流感病毒，
所述重组痘苗病毒在痘苗病毒DIs株的基因组中包含表达启动子和编码来自流感病毒的蛋白质的DNA的全部或一部分。
2.根据权利要求1所述的药物，其中，对流感的预防或治疗基于活化的CD4阳性细胞和/或活化的CD8阳性细胞的作用。
3.根据权利要求1或2所述的药物，其还包含针对来自流感病毒的蛋白质的抗体。
4.根据权利要求3所述的药物，其中，抗体为结合抗体。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的药物，其中，来自流感病毒的蛋白质是来自H5N1高致病性禽流感病毒的血凝素蛋白。
6.一种用于预防或治疗流感的药物，其包含以下(a)～(c)中的任意成分：
(a)选自活化的CD4阳性细胞、CD4阳性细胞的活化剂、以及CD4阳性细胞与CD4阳性细胞的活化剂的组合中的至少1种成分，
(b)选自活化的CD8阳性细胞、CD8阳性细胞的活化剂、以及CD8阳性细胞与CD8阳性细胞的活化剂的组合中的至少1种成分，
(c)所述(a)及(b)成分的组合的成分。
7.根据权利要求6所述的药物，其还包含重组痘苗病毒或灭活的流感病毒，所述重组痘苗病毒在痘苗病毒DIs株的基因组中包含表达启动子和编码来自流感病毒的蛋白质的DNA的全部或一部分。
8.根据权利要求6或7所述的药物，其还包含针对来自流感病毒的蛋白质的抗体。
9.根据权利要求8所述的药物，其中，抗体为结合抗体。
10.根据权利要求7～9中任一项所述的药物，其中，来自流感病毒的蛋白质是来自H5N1高致病性禽流感病毒的血凝素蛋白。
11.一种预防或治疗流感的试剂盒，其包含重组痘苗病毒或灭活的流感病毒，所述重组痘苗病毒在痘苗病毒DIs株的基因组中包含表达启动子和编码来自流感病毒的蛋白质的DNA的全部或一部分。
12.根据权利要求11所述的试剂盒，其中，对流感的预防或治疗基于活化的CD4阳性细胞和/或活化的CD8阳性细胞的作用。
13.根据权利要求11或12所述的试剂盒，其还包含针对来自流感病毒的蛋白质的抗体。
14.根据权利要求13所述的试剂盒，其中，抗体为结合抗体。
15.根据权利要求11～14中任一项所述的试剂盒，其中，来自流感病毒的蛋白质是来自H5N1高致病性禽流感病毒的血凝素蛋白。
16.一种预防或治疗流感的试剂盒，其包含以下(a)～(c)中的任意成分：
(a)选自活化的CD4阳性细胞、CD4阳性细胞的活化剂、以及CD4阳性细胞与CD4阳性细胞的活化剂的组合中的至少1种成分，
(b)选自活化的CD8阳性细胞、CD8阳性细胞的活化剂、以及CD8阳性细胞与CD8阳性细胞的活化剂的组合中的至少1种成分，
(c)所述(a)及(b)成分的组合的成分。
17.根据权利要求16所述的试剂盒，其还包含重组痘苗病毒或灭活的流感病毒，所述重组痘苗病毒在痘苗病毒DIs株的基因组中包含表达启动子和编码来自流感病毒的蛋白质的DNA的全部或一部分。
18.根据权利要求16或17所述的试剂盒，其还包含针对来自流感病毒的蛋白质的抗体。
19.根据权利要求18所述的试剂盒，其中，抗体为结合抗体。
20.根据权利要求17～19中任一项所述的试剂盒，其中，来自流感病毒的蛋白质是来自H5N1高致病性禽流感病毒的血凝素蛋白。
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