KR102401682B1

KR102401682B1 - SARS-CoV-2 항원을 발현하는 재조합 마이코박테리움 균주 및 이를 포함하는 백신 조성물

Info

Publication number: KR102401682B1
Application number: KR1020210044888A
Authority: KR
Inventors: 김범준; 김병준; 정도현; 신주엽; 진주영; 이문수
Original assignee: 주식회사 라파스; 서울대학교산학협력단
Priority date: 2021-04-06
Filing date: 2021-04-06
Publication date: 2022-05-25
Also published as: WO2022216025A1

Abstract

본 발명은 본 발명은 SARS-CoV-2 항원을 발현하는 재조합 마이코박테리움 파라고르도네(Mycobacterium paragordonae, Mpg) 균주 및 이를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 SARS-CoV-2 항원을 발현하는 재조합 마이코박테리움 파라고르도네 균주는 마우스에서 SARS-CoV-2에 대해 중화항체능을 비롯하여 현저한 면역 반응을 생성할 수 있다. 따라서, 본 발명의 재조합 마이코박테리움 파라고르도네 균주는 SARS-CoV-2 감염을 예방하거나 치료하기 위한 백신으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

SARS-CoV-2 항원을 발현하는 재조합 마이코박테리움 균주 및 이를 포함하는 백신 조성물{RECOMBINANT MYCOBACTERIUM STRAIN EXPRESSING SARS-COV-2 ANTIGEN AND VACCINE COMPOSITION COMPRISING SAME}

본 발명은 SARS-CoV-2 항원을 발현하는 재조합 마이코박테리움 균주 및 이를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.

2019년 중국 우한에서 처음 보고된 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2, SARS-CoV-2)에 의한 감염이 전 세계적으로 확산되고 있어 보건, 사회, 경제적인 큰 위기에 직면하고 있다.

SARS-CoV-2는 기존의 코로나 바이러스나 독감 바이러스에 비해 높은 감염력을 지니고 있으며, 무증상부터 경증 호흡기 증상, 급성 호흡곤란 증후군, 그리고 사망에 이르는 다양한 증상을 보인다고 알려져 있다. 이러한 SARS-CoV-2의 전 세계적인 확산으로 인해 세계보건기구(WHO)는 2020년 3월 11일에 pandemic을 선언하였다.

2021년 1월 17일 기준으로, 전 세계 누적 확진 건수는 93,217,287건이며, 누적 사망 건수는 2,014,957건이다. 특히, 미국과 유럽 등에서는 확진자와 사망자가 급격하게 증가하고 있는 추세이다(World Health Organization. (https://covid19.who.int/)).

현재 국내 누적 확진자 수는 74,262명, 사망자 수는 1,328명으로 알려져 있다(2021년 1월 22일 기준)(코로나바이러스감염증-19(COVID-19) 발생 현황. (http://ncov.mohw.go.kr/)).

이러한 SARS-CoV-2 바이러스는 세포 표면에 ACE2(angiotensin-converting enzyme 2) 및 TMPRSS2를 발현하는 세포에 감염될 수 있다. 특히 숙주세포의 ACE2와 결합하는 바이러스 부위는 스파이크 단백 중 RBD(receptor binding domain)인데, 기존의 SARS-CoV-1 바이러스의 RBD보다 SARS-CoV-2 바이러스의 RBD가 ACE2와 높은 친화성을 나타내어, 전염력을 높이는 것으로 알려져 있다 (문헌[Cannalire R, et al. SARS-CoV-2 Entry Inhibitors: Small Molecules and Peptides Targeting Virus or Host Cells. Int J Mol Sci. 2020; 21(16): 5707]; 문헌[Tay MZ, et al. The trinity of COVID-19: immunity, inflammation and intervention, Nat Rev Immunol. 2020; 20(6):363-374]; 및 문헌[Saha RP, et al. Repurposing Drugs, Ongoing Vaccine, and New Therapeutic Development Initiatives Against COVID-19. Front Pharmacol. 2020;11:1258]).

이러한 SARS-CoV-2 바이러스를 극복하기 위해, 전 세계적으로 백신 및 치료제 개발 연구를 진행하고 있다. 대부분의 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 백신 개발 연구는 스파이크 단백을 타겟으로 진행되고 있다. 스파이크 단백은 바이러스의 진입과 면역 반응에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 또한, 스파이크 단백의 RBD에 중화항체 형성을 유도할 수 있는 주요 항원결정인자(antigenic determinant)가 포함되어 있다고 알려져 있으므로, RBD를 포함하는 단백이나 이에 대한 유전자 또는 이들을 전달하는 벡터가 효과적인 백신 개발에 활용될 수 있을 것으로 전망되고 있으며, 실제로 이들을 타겟으로 한 백신이 개발되고 있다. 다양한 연구진에서 COVID-19를 제어할 수 있는 백신을 개발 중이고 일부는 접종 중에 있지만, 아직 안전성과 효용성이 확보된 백신은 검증되지 않은 상황이다.

한편, 재조합 BCG와 같은 재조합 마이코박테리움 균주는 사람 면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus-1, HIV-1) 백신 개발을 위해 주목받아 왔으며, 마이코박테리움 파라고르도네 균주(Mycobacterium paragordonae, Mpg)는 온도 민감성 균주로서 체내 접종 시 피부 및 피하에서는 증식을 하여 면역 반응을 자극시키지만 체내 중심부에서는 체온보다 낮은 온도에서만 자랄 수 있는 특징으로 인해 증식이 억제되어 감염의 가능성이 낮아 결핵균을 포함한 마이코박테리아 감염증 등에 대한 예방 백신 및 면역 치료에 이용될 수 있다고 알려져 있다(한국 공개특허공보 제2018-0080999호 및 제2016-0021933호).

또한, Mpg 균주는 HIV-1의 항원인 p24를 발현시킨 재조합 Mpg 균주(rMpg_p24)가 같은 항원을 발현시킨 재조합 BCG 균주보다 p24 특이적인 면역을 증가시킨 연구도 보고된 바 있다(문헌[Kim BJ et al. Potential of recombinant Mycobacterium paragordonae expressing HIV-1 Gag as a prime vaccine for HIV-1 infection. Sci Rep. 2019 Oct 29;9(1):15515]).

한국 공개특허공보 제2018-0080999호(2018.7.13) 한국 공개특허공보 제2016-0021933호(2016.2.29)

Kim BJ et al. Potential of recombinant Mycobacterium paragordonae expressing HIV-1 Gag as a prime vaccine for HIV-1 infection. Sci Rep. 2019 Oct 29;9(1):15515.

이에 본 발명자들은 새로운 COVID-19에 대한 백신을 개발하기 위해 연구한 결과, SARS-CoV-2 항원을 발현하는 벡터로 형질전환된 재조합 마이코박테리움 파라고르도네 균주를 사용하여 마우스를 면역화시킨 경우 마우스에서 SARS-CoV-2에 대해 중화항체능을 비롯하여 현저한 면역 반응이 생성됨을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은, SARS-CoV-2 항원을 발현하는 재조합 마이코박테리움 파라고르도네 균주를 제공한다.

본 발명의 다른 측면은, 상기 재조합 마이코박테리움 파라고르도네 균주를 유효성분으로 포함하는 SARS-CoV-2 감염의 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물, 상기 재조합 마이코박테리움 파라고르도네 균주의 SARS-CoV-2 감염 치료 또는 예방을 위한 용도, 또는 상기 재조합 마이코박테리움 파라고르도네 균주를 이용한 SARS-CoV-2 감염의 치료 또는 예방을 위한 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은, 상기 재조합 마이코박테리움 파라고르도네 균주를 유효성분으로 포함하는 제 1 조성물; 및 SARS-CoV-2의 수용체 결합 도메인 또는 이의 단편, 알룸(alum), 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 제 2 조성물을 포함하는, SARS-CoV-2 감염의 치료 또는 예방용 키트, 또는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은, SARS-CoV-2의 수용체 결합 도메인 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 hsp 유전자 프로모터에 작동 가능하게 연결된 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은, 상기 벡터를 포함하는 단리된 세포를 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은, 상기 벡터로 마이코박테리움 파라고르도네 균주를 형질전환 시키는 것을 포함하는, SARS-CoV-2 항원을 발현하는 재조합 마이코박테리움 파라고르도네 균주의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 SARS-CoV-2 항원을 발현하는 재조합 마이코박테리움 파라고르도네 균주는 마우스에서 SARS-CoV-2에 대해 중화항체능을 비롯하여 현저한 면역 반응을 유도할 수 있다. 따라서, 본 발명의 재조합 마이코박테리움 파라고르도네 균주는 SARS-CoV-2 감염을 예방하거나 치료하기 위한 백신으로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 SARS-CoV-2의 RBD 부분을 활용한 삽입서열 제작 모식도를 나타낸다.
도 2는 SARS-CoV-2의 NP(nucleocapside phosphoprotein) 부분을 활용한 삽입서열 제작 모식도를 나타낸다.
도 3a 및 도 3b는 각각 pMV306 셔틀 벡터에 각각 Phsp:RBD 염기서열(pMV306-Phsp:RBD) 및 Phsp:NP 염기서열(pMV306-Phsp:NP)을 클로닝한 벡터 맵을 나타낸다.
도 4a 및 도 4b는 각각 pMV306-Phsp:RBD 벡터 및 pMV306-Phsp:NP 벡터를 형질전환시킨 대장균 콜로니에서 삽입 서열의 유무를 콜로니 PCR을 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 5a 및 도 5b는 pMV306-Phsp:RBD 벡터를 Mpg에 전기 천공한 후, 7H10 고체 배지(100 μg/ml의 카나마이신) 상에 형성된 콜로니 양상(도 5a)과 콜로니 PCR 결과(도 5b)를 나타낸다.
도 6a 및 도 6b는 pMV306-Phsp:NP 벡터를 Mpg에 전기 천공한 후, 7H10 고체 배지(100 μg/ml의 카나마이신) 상 형성된 콜로니 양상(도 6a)과 콜로니 PCR 결과(도 6b)를 나타낸다.
도 7은 야생형 Mpg 균주와 3개 rMpg_RBD 균주의 단백을 추출하여 SARS-CoV-2 스파이크 단백에 대한 항체(Sino Biological, 40591-T62)를 붙였을 때, 확인된 밴드 양상을 나타낸다. 여기서, 양성 대조군으로는 SARS-CoV 스파이크 S1 단백질(Sino Biological, 40159-V08B1)을 사용하였다.
도 8은 야생형 Mpg와 2개 rMpg_NP 균주의 단백을 추출하여 SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 항체(Thermo Fisher, MA5-29981)를 붙였을 때, 확인된 밴드 양상을 나타낸다. 여기서, 양성 대조군으로는 NP 단백질(Sino Biological, 40588-V08B)을 사용하였다.
도 9는 수지상 세포에 야생형 Mpg 균주(10 M.O.I.) 및 rMpg_RBD 균주(1 또는 10 M.O.I.)를 감염시키고, 세포에서 RNA를 추출하여 RBD 유전자 특이적인 프라이머로 real-time PCR을 수행한 후, 발현 양상을 비교한 그래프를 나타낸다. 여기서, 통계적 유의성은 Student's t-test로 검정되었다(**, p < 0.01).
도 10은 야생형 Mpg 균주와 rMpg_RBD 균주(P1, 1세대; P3, 3세대; P5, 5세대)의 단백을 추출하여 SARS-CoV-2 스파이크 단백에 대한 항체(Sino Biological, 40591-T62)를 붙였을 때, 확인된 밴드 양상을 나타낸다. 여기서, 양성 대조군으로는 RBD 단백질(Sino Biological, 40592-V08B)을 사용하였다.
도 11a 내지 도 11d는, Mpg와 rMpg_RBD 감염 시 수지상 세포의 성숙 마커를 FACS로 분석하여, MHCII+(도 11a), CD40+(도 11b), CD80+(도 11c), CD86+(도 11d) 세포 집단의 비율 (%)을 비교한 결과를 나타낸다. 여기서, 통계적 유의성은 Student’s t-test로 검정되었다(*, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001).
도 12a 및 도 12b는 Mpg와 rMpg_RBD 감염 시 수지상 세포 배양액에서 사이토카인 IL-10(도 12a) 및 IL-12(도 12b)의 발현량을 ELISA로 측정, 비교한 결과를 나타낸다. 여기서, 통계적 유의성은 Student’s t-test로 검정되었다(*, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001).
도 13a 및 도 13b는, 야생형 Mpg 균주 및 세대별 rMpg_RBD 균주(1, 5, 10 세대)에서 추출한 단백 및 mRNA를 사용하여, RBD의 발현을 RBD ELISA kit(도 13a) 및 real-time PCR(도 13b)로 확인한 결과를 나타낸다. 여기서, 통계적 유의성은 Student's t-test로 검정하였다(**, p < 0.01; ***, p < 0.001).
도 14는 마우스에 대한 Mpg 및 rMpg_RBD 균주 접종 스케줄 모식도를 나타낸다.
도 15a 및 도 15b는 Mpg 및 rMpg_RBD(#5, #6, #7) 균주를 SC로 면역화한 마우스 비장세포를 사용하여 IFN-γ ELISPOT 어세이를 진행한 결과 그래프로서, 각 rMpg_RBD 균주에 의한 IFN-γ ELISPOT 결과(도 15a) 및 모든 rMpg_RBD 균주에 의한 IFN-γ ELISPOT 결과(도 15b)를 나타낸다. 도 15a의 하단에는 대표적인 멤브레인의 사진을 도시한다. 여기서, 통계적 유의성은 Student's t-test로 검정하였다(*, p < 0.05; ***, p < 0.001).
도 16a 및 도 16b는 Mpg 및 rMpg_RBD 균주(#5, #6, #7)를 SC로 면역화한 마우스의 비장세포를 S1 단백으로 자극한 후, 발현된 사이토카인인 IL-12(도 16a) 및 IFN-γ(도 16b) 수준을 ELISA로 측정, 비교한 결과를 나타낸다.
도 17a 내지 도 17c은 Mpg 및 rMpg_RBD 균주(#5, #6, #7)를 SC로 면역화한 마우스의 혈청 샘플을 RBD 단백으로 자극시킨 후 IgG2(도 17a), IgG1(도 17b) 및 총 IgG(도 17c) 항체의 발현량을 흡광도로 측정하여 비교한 결과를 나타낸다. 여기서, 통계적 유의성은 Student’s t-test로 검정되었다(**, p < 0.01).
도 18은 야생형 Mpg 야생형과 3개 rMpg_RBD 균주를 면역화한 마우스 혈청의 SARS-CoV-2 pseudovirus 중화항체능을 나타낸다. 여기서, rMpg-RBD 1은 #5를 의미하고; rMpg-RBD 2는 #6을 의미하고; rMpg-RBD 3은 #7을 의미한다.
도 19는 마우스에 대해 Mpg, rMpg_RBD 및 RBD 단백으로 면역화를 수행한 후, RBD 특이적인 면역 유도능을 평가하기 위한 동물 실험 스케줄을 나타낸다.
도 20은 Mpg, rMpg_RBD 및 RBD 단백 등을 SC로 면역화한 마우스 비장세포를 사용하여 IFN-γ ELISPOT 어세이를 진행한 결과 그래프를 나타낸다. 하단에는 대표적인 멤브레인의 사진을 도시한다. 여기서, 통계적 유의성은 Student's t-test로 검정되었다(**, p < 0.01).
도 21a 내지 도 21d는, Mpg, rMpg_RBD 및 RBD 단백 등을 SC로 면역화한 마우스 비장세포를 RBD 단백으로 자극한 후, CD3+ CD4+ IFN-γ+(도 21a), CD3+ CD4+ TNF-α+(도 21b), CD3+ CD8+ IFN-γ+(도 21c), 및 CD3+ CD8+ TNF-α+(도 21a) T 세포 집단을 FACS로 분석한 결과를 나타낸다. 여기서, 통계적 유의성은 Student's t-test로 검정되었다(*, p < 0.05; **, p < 0.01; *** p < 0.001).
도 22a 내지 도 22e는, Mpg, rMpg_RBD 및 RBD 단백 등을 SC로 면역화한 마우스의 비장세포를 RBD 단백으로 자극한 후, 발현된 사이토카인인 IFN-γ(도 22a), TNF-α(도 22b), IL-2(도 22c), IL-10(도 22d), 및 IL-12(도 22e) 수준을 ELISA로 측정, 비교한 결과를 나타낸다. 여기서, 통계적 유의성은 Student’s t-test로 검정되었다(*, p < 0.05; **, p < 0.01; *** p <0.001).
도 23a 내지 도 23c는, Mpg, rMpg_RBD 및 RBD 단백 등을 SC로 면역화한 마우스의 혈청 샘플을 RBD 단백으로 자극한 후, IgG2(도 23a), IgG1(도 23b), 및 총 IgG(도 23c) 항체의 발현량을 흡광도로 측정하여 비교한 결과를 나타낸다. 통계적 유의성은 Student’s t-test로 검정되었다(*, p < 0.05; **, p < 0.01; *** p <0.001).
도 24는 rMpg_RBD 균주 혹은 RBD 단백을 면역화한 마우스 혈청의 생 SARS-CoV-2에 대한 중화항체능을 나타낸다.
도 25는 rMpg_RBD 균주 혹은 RBD 단백을 면역화한 마우스 혈청의 SARS-CoV-2 pseudovirus에 대한 중화 항체능을 나타낸다.
도 26a 및 도 26b는 PBS, Mpg 및 rMpg_RBD를 면역시킨 마우스 혈청이 ACE2와 RBD의 결합에 미치는 영향을 평가하기 위한 ACE2-RBD 결합 어세이 결과를 나타낸다. 구체적으로, 도 26a는 ACE2와 결합된 RBD 단백의 Fc tag에 결합하는 HRP-IgG의 양을 흡광도로 측정, 분석한 결과를 나타내고, 도 26b는 흡광도 결과를 정규화(가장 높은 값을 100%, 가장 낮은 값을 0%로 변환)하여, ACE2-RBD 결합을 %로 변환한 그래프를 나타낸다. p 값은 PBS 및 Mpg의 결과와 rMpg_RBD 결과를 Student’s t-test로 분석하여 나타내었다(***, p < 0.001).
도 27은 Mpg, rMpg_RBD 및 RBD 단백 등을 SC로 면역화한 마우스의 BALF 샘플을 RBD 단백으로 자극한 후 IgA 항체의 발현량을 흡광도로 측정하여 비교한 결과를 나타낸다. 여기서, 통계적 유의성은 Student’s t-test로 검정되었다(*, p < 0.05; **, p < 0.01; *** p < 0.001).
도 28은 SARS-CoV-2 바이러스가 숙주세포로 감염될 때 사용되는 숙주세포 분자와 그의 모식도를 나타낸다.
도 29는 rMpg_RBD 균주(#7 strain)를 생균 형태로 1×10⁶ CFU로 마우스에 피하 주사하여 2주째 및 2주 5일째에 마우스로부터 얻은 혈청의 SARS-CoV-2 Vero p2 중화항체능을 나타낸다. 여기서, 대조 항체(control antibody)는 항-SARS-CoV-2 스파이크 항체(Cat#: 40150-T62-COV2)이다.
도 30은 rMpg_RBD 균주(#7 strain)를 생균 형태로 1×10⁷ CFU로 마우스에 피하 주사하여 2주째 및 2주 5일째에 마우스로부터 얻은 혈청의 SARS-CoV-2 Vero p2 중화항체능을 나타낸다. 여기서, 대조 항체는 항-SARS-CoV-2 스파이크 항체(Cat#: 40150-T62-COV2)이다.
도 31은 rMpg_RBD 균주(#7 strain)를 불활성화 형태로 1×10⁷ CFU로 마우스에 피하 주사하여 2주째 및 2주 5일째에 마우스로부터 얻은 혈청의 SARS-CoV-2 Vero p2 중화항체능을 나타낸다. 여기서, 대조 항체는 항-SARS-CoV-2 스파이크 항체(Cat#: 40150-T62-COV2)이다.
도 32는 도 29 내지 도 31에 도시된 결과 중 rMpg_RBD 균주에 대한 결과를 접종 후 채혈 시기에 따른 변화로 표현한 그래프를 나타낸다.
도 33은 도 29 내지 도 31에 도시된 결과 중 rMpg_RBD 균주에 대한 결과를 접종량에 따른 중화항체능으로 비교한 그래프를 나타낸다. 여기서, Live ^6, Live ^7 및 Inactivation ^7은 각각 rMpg_RBD 균주(#7 strain)를 1×10⁶ CFU의 생균 형태, 1×10⁷ CFU의 생균 형태 및 1×10⁶ CFU의 불활성화 형태로 마우스에 피하 주사하여 얻은 혈청을 의미한다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명의 일 측면은, SARS-CoV-2 항원을 발현하는 재조합 마이코박테리움 파라고르도네 균주를 제공한다.

본 명세서에서 사용된 용어, "SARS-CoV-2 항원"은 대상에서 SARS-CoV-2에 대해 면역 반응, 예컨대, 체액성 및/또는 세포성 매개 면역 반응을 유도할 수 있는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 단편을 의미한다. 상기 항원은 대상에서 SARS-CoV-2에 대해 면역 반응을 유도할 수 있거나 보호 면역 효과를 나타낼 수 있는 SARS-CoV-2의 단백, 이들의 단편 또는 에피토프, 또는 여러 SARS-CoV-2 단백 또는 이들의 일부의 조합일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 SARS-CoV-2 항원은 SARS-CoV-2의 표면에 돌출 스파이크를 형성하는 스파이크(S) 단백 또는 이의 단편일 수 있다. 구체적으로, 상기 SARS-CoV-2 항원은 숙주 세포의 ACE2(angiotensin-converting enzyme 2)와 결합하는 스파이크 단백의 수용체 결합 도메인(Receptor Binding Domain, RBD)을 포함하는 S1 서브유닛 또는 이의 단편일 수 있다. 또한, 상기 SARS-CoV-2 항원은 수용체 결합 도메인 또는 이의 단편일 수 있다. 상기 수용체 결합 도메인 또는 이의 단편은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가질 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 SARS-CoV-2 항원은 프로모터에 작동가능하게 연결된 SARS-CoV-2 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로부터 발현될 수 있다. 구체적으로, SARS-CoV-2 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 또한, 프로모터는 hsp(heat shock protein) 프로모터일 수 있다. 더 구체적으로, 프로모터는 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis) BCG 유래의 hsp65(heat shock protein 65) 유전자 프로모터일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 재조합 마이코박테리움 파라고르도네 균주는 야생형 마이코박테리움 파라고르도네 균주가 SARS-CoV-2 항원을 발현하도록 형질전환된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 재조합 마이코박테리움 파라고르도네 균주는 SARS-CoV-2 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis) BCG 유래의 hsp65(heat shock protein 65) 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결된 핵산 분자로 형질전환된 것일 수 있다. 상기 SARS-CoV-2 항원은 SARS-CoV-2의 표면 항원인 스파이크(S) 단백일 수 있으며, 보다 구체적으로 S1 서브유닛일 수 있다. 또한, 상기 SARS-CoV-2 항원은 수용체 결합 도메인일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 재조합 마이코박테리움 파라고르도네 균주는 도 3a에 도시된 구조를 갖는 pMV306-Pshp:RBD 벡터로 형질전환된 것일 수 있다.

본 발명의 구현예에서 사용된 (야생형) 마이코박테리움 파라고르도네(Mpg) 균주는 자연발생적 균주로, 형태학적으로 마이코박테리움 고르도네(Mycobacterium gordonae)와 유사하나, 최적 성장 온도가 25 내지 30℃이며, 일반적인 세균이 잘 자라는 온도인 37℃에서는 자라지 않는 온도 민감성 균주이다. 이러한 특징으로 인해 인체에 적용 시 안전성이 확보될 수 있다. Mpg 균주에 대해서는 한국 공개특허공보 제2016-0021933호 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주된다. 구체적으로 Mpg 균주는 기탁번호 KCTC 12628BP로 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 기탁된 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른, SARS-CoV-2 항원 중 스파이크 단백을 구성하는 수용체 결합 도메인(RBD) 유전자가 도입된 재조합 Mpg 균주(rMpg_RBD)는 형질전환시 많은 콜로니가 확보되었고, 그 중 상당 수가 RBD를 가지고 있는 것으로 확인되었으며, 실제로 RBD 항체에 특이적인 밴드가 웨스턴블랏에서 검출되었다(도 5 및 도 7 참조). 또한, 수지상 세포 감염 시, 세포 내 RNA에서도 RBD가 검출됨이 확인되었다(도 9 참조). 나아가, rMpg_RBD로 마우스를 면역화한 경우에, rMpg_RBD은 SARS-CoV-2 pseudovirus에 대해 우수한 면역원성을 나타내는 것을 확인되었다(도 15 내지 18 참조).

본 발명의 다른 측면은, 재조합 마이코박테리움 파라고르도네 균주를 유효성분으로 포함하는, SARS-CoV-2 감염의 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 약학 조성물은 백신일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 약학 조성물은 단회 투여 또는 다회 투여될 수 있다. 상기 다회 투여는 2회 투여일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에서, 상기 약학 조성물은 프라임-부스팅 접종법에서 프라이밍 백신으로 사용될 수 있다. 상기 부스팅 접종으로 SARS-CoV-2의 수용체 결합 도메인, 알룸(alum), 또는 이들의 조합과 함께 사용될 수 있다.

상기 약학 조성물은 마이크로니들 또는 마이크로어레이 제제, 산제, 캡슐, 정제, 과립, 수성 현탁액, 흡입제, 좌제, 주사제, 연고제, 패치, 분말 또는 음료 형태일 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물은 인간을 대상으로 하는 것일 수 있다.

또한, 상기 약학 조성물에 사용되는 약학적으로 허용되는 부형제로서, 경구 투여의 경우에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있고, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있고, 국소 투여의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 부형제와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물은 경구 투여의 경우에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조될 수 있고, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다회 투약 형태로 제조될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 용액, 서방형 제제, 환제, 당의정, 액제, 겔 또는 슬러리로도 제형화될 수 있다. 패치의 경우에는 마이크로니들 또는 마이크로어레이 형태로 제형화될 수 있다.

한편, 제형화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

상기 약학 조성물의 투여 경로에는 이들로 한정되는 것은 아니지만 피하, 경구, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장 경로가 포함되며, 피하 또는 경피 경로가 바람직할 수 있다.

상기 약학 조성물의 투여량은 대상체의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 다이어트(diet), 투여 빈도, 투여 기간, 투여 경로, 배출율, 및 치료 또는 예방하려는 특정 질환의 중증도를 포함한 여러 요인에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 통상적으로, 투여량은 1일 0.0001 내지 50 mg/kg 또는 0.001 내지 50 mg/kg일 수 있다. 투여는 1일 1회 또는 수회로 나누어 이루어질 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 백신은 통상 프라임-부스트 형태로 2회 이상 투여될 수 있다. 이때, 동일한 백신이 수회 투여되거나, 동일 항원을 포함하는 서로 다른 종류의 백신이 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 백신이 프라이밍 백신으로 사용되고, SARS-CoV-2의 수용체 결합 도메인 또는 이의 단편, 알룸(alum), 또는 이들의 조합이 부스팅 접종에서 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 재조합 마이코박테리움 파라고르도네 균주는 생균, 약독화 또는 불활화 형태로 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은, 상술한 재조합 마이코박테리움 파라고르도네 균주를 유효성분으로 포함하는 제 1 조성물; 및 SARS-CoV-2의 수용체 결합 도메인 또는 이의 단편, 알룸(alum), 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 제 2 조성물을 포함하는, SARS-CoV-2 감염의 치료 또는 예방용 키트를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 키트는 프라임-부스트 접종을 위한 것일 수 있다. 프라임-부스트 접종 시에, 제 1 조성물은 프라임 투여되고 제 2 조성물은 부스트 투여되는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, rMpg_RBD로 투여한 후에 RBD 단백을 투여하는 경우에, rMpg_RBD만을 투여한 경우와 비교하여 마우스 혈청의 live SARS-CoV-2에 대한 항체 생성이 증가하고 중화항체능이 우수하였음을 확인하였다(도 24 및 도 25 참조).

본 발명의 또 다른 측면은, SARS-CoV-2의 수용체 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 hsp 유전자 프로모터에 작동 가능하게 연결된 재조합 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 hsp 유전자 프로모터는 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis) BCG 유래의 hsp65(heat shock protein 65) 유전자 프로모터일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 벡터는 마이코박테리움 균주 발현용일 수 있으며, 구체적으로 마이코박테리움-대장균 셔틀 벡터일 수 있다. 또한, 상기 벡터는 도 3a에 도시된 구조를 갖는 pMV306-Pshp:RBD일 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은, 상술한 벡터를 포함하는, 단리된 세포를 제공한다. 상기 세포는 마이코박테리움 균주, 구체적으로 마이코박테리움 파라고르도네 균주일 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은, 상술한 벡터를 마이코박테리움 파라고르도네 균주에 형질전환시키는 것을 포함하는, SARS-CoV-2 항원을 발현하는 재조합 마이코박테리움 파라고르도네 균주의 제조 방법을 제공한다.

상기 형질전환은 당업계에 알려진 다양한 방법, 예를 들어, 미세주입, 칼슘포스페이트 침전, 전기 천공, 리포좀-매개 트랜스펙션, 아그로박테리움-매개 트랜스펙션, DEAE-덱스트란 처리, 및 유전자 밤바드먼트 등을 이용하여 수행될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 전기 천공법을 사용하여 형질전환을 수행하였다.

실시예

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

I. 온도 민감성 마이코박테리움 파라고르도네 ( Mycobacterium paragordonae , Mpg) 균주를 이용한 SARS-CoV-2 항원 발현 재조합 균주의 제작 및 그의 면역원성 평가

실시예 1. SARS-CoV-2 항원 발현을 위한 마이코박테리아-대장균 셔틀 벡터의 제작

SARS-CoV-2 항원 중 스파이크(spike) 단백을 구성하는 수용체 결합 도메인(receptor binding domain, RBD)과 뉴클레오캡시드 인단백(nucleocapsid phosphoprotein, NP)의 염기서열을 토대로 결핵균의 코돈에 최적화된 서열(코돈 최적화 웹툴 사용: http://www.jcat.de/)을 유전자 합성(바이오닉스: http://www.bionicsro.co.kr/)을 통해 확보하였다. RBD 염기서열은 675개 뉴클레오타이드(서열번호 2)로 이루어지고 전체 스파이크 단백 중 319번 내지 541번 아미노산 영역에 해당하는 224개 아미노산(서열번호 1)을 코딩한다(도 1). NP 염기서열은 654개 뉴클레오타이드(서열번호 4)로 이루어지고 전체 뉴클레오캡시드 인단백 중 138번 내지 353번 아미노산 영역에 해당하는 217개 아미노산(서열번호 3)을 코딩한다(도 2).

마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis) BCG(결핵연구원)의 지놈 DNA로부터 hsp65(heat shock protein 65) 유전자 프로모터(Phsp) 부분(375 bp)(서열번호 5)을 PCR을 통해 증폭하고, 상기 합성된 각각의 유전자 서열과 오버랩핑(overlapping) PCR을 통해 연결하여 Phsp:RBD(1,050 bp) 및 Phsp:NP(1,029 bp) 서열을 각각 제작하였다. 상기 오버랩핑 PCR에 사용한 프라이머 세트 및 온도 조건을 표 1에 나타내었다.

[표 1] Phsp:RBD 및 Phsp:NP 서열 증폭에 사용된 프라이머 세트(서열번호 6 내지 9) 및 온도 조건

이어서, Phsp:RBD 및 Phsp:NP 서열을 NotI과 XbaI 또는 EcoRV와 XbaI의 제한 효소 조합을 사용하여 마이코박테리아-대장균 셔틀 벡터인 pMV306에 클로닝하여 벡터를 제작하고(도 3a 및 도 3b), 상기 벡터로 대장균을 형질전환시켰다. 그 후, 카나마이신 선별을 통해 형성된 콜로니 중 일부에 PCR을 수행하여 삽입 서열이 강하게 증폭되는 콜로니를 다시 선별하였다(도 4a 및 도 4b).

이렇게 삽입 서열(RBD 및 NP)의 증폭이 확인된 콜로니에서 플라스미드 DNA를 뽑아, 시퀀싱을 통해 삽입 서열과 동일한 플라스미드 DNA를 확보하였다.

실시예 2. SARS-CoV-2 RBD 발현 Mpg 및 NP 발현 Mpg의 제작

실시예 1에서 확보한 각각의 플라스미드 DNA(pMV306-Phsp:RBD 및 -Phsp:NP)를 인하우스(in-house) 제작된 competent Mpg에 전기 천공(electroporation; Gene Pulser Xcell^TM, Bio-RAD)을 통해 표 2에 기재된 조건으로 형질전환시켰다.

[표 2] Mpg 형질전환 조건

전기 천공 후 생성된 Mpg를 항생제가 없는 7H9 액체 배지(Becton Dickinson)에 접종하여 30℃에서 24시간 동안 배양한 후에 1/10 내지 1/2 희석액을 카나마이신(100 μg/ml)이 포함된 7H10 고체 배지(Becton Dickinson)에 도말하였다. 그 후, 14일 내지 21일간 30℃에서 배양하고, 콜로니 형성 여부를 확인하였다.

pMV306-Phsp:RBD로 형질전환시킨 경우, 상당한 수의 콜로니가 확보되었다(도 5a). 이렇게 확보된 콜로니 중 일부를 PCR로 확인한 결과, 대부분의 콜로니에서 양성 반응(RBD 발현: 형질전환시킨 RBD 유전자의 증폭이 확인됨)이 나타남을 확인하였다(도 5b).

반면, pMV306-Phsp:NP의 경우, 2회의 형질전환 시도를 하였는데, 첫 회에는 콜로니가 형성되지 않았고, 2회 째에 적은 수의 콜로니가 형성되었다(플레이트 당 6 내지 10개 콜로니 수준)(도 6a). 콜로니 PCR 결과, 8개 콜로니 중 2개 콜로니에서만 양성 결과가 확인되었다(도 6b).

각 제작된 재조합 Mpg 균주(rMpg_RBD 및 rMpg_NP)에 대해 콜로니를 선별 (여러 콜로니 중 #5, #6, 및 #7에 해당하는 콜로니를 선별한 것으로, 해당 콜로니는 RBD를 타겟으로 하는 콜로니 PCR을 진행하여, 양성 반응이 확인된 콜로니로, 양성 반응이 확인된 콜로니 중 무작위로 선별됨)하여, 7H9 액체 배지(100 μg/ml의 카나마이신 함유)에 접종하여 21일가량 30℃에서 배양한 후, 일부는 스탁(stock)으로 제조하고(20% 글리세롤, -70℃ 보관), 일부는 계대배양을 진행하였으며, 남은 배양액은 균주 내 RBD 및 NP의 발현 양상을 확인하기 위한 분석에 사용하였다.

실험예 1. 재조합 Mpg의 RBD 및 NP 발현 확인

각 재조합 Mpg(rMpg_RBD 및 rMpg_NP) 균주 배양액을 원심분리(2,500 rpm, 10 min)하여 펠릿(pellet)을 취한 후, B-PER 버퍼(Thermo Scientific; 100 μg/ml의 라이소자임, 5 U/ml의 DNase, 및 프로테이나제 억제제가 보충됨)에 균일하게 섞어 얼음 상에서 초음파 처리하였다(2회 반응으로 5분; 펄스: 0.3초, 정지: 0.7초). 분쇄액을 원심분리(13,000 rpm, 15 min, 4℃)하여 상층액을 취해 웨스턴블랏(western blot)을 수행하였다.

각 재조합 균주에서 추출한 단백(60 μg)을 SDS-PAGE 겔에 로딩한 후, 항 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 항체(Sino Biological, 40591-T62; 1:2,000) 및 항 SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드 단백질 항체(Thermo Fisher, MA5-29981; 1:1,000)를 붙여, RBD 및 NP가 제대로 발현되는지 여부를 확인하였다. 또한, 내부 대조군(internal control)으로 Mycobacterium tuberculosis의 hsp65(heat shock protein 65) 단백과 결합할 수 있는 항체(Santa Cruz, sc-57842; 1:200)를 사용하였다. 이때, 양성 대조군으로, SARS-CoV-2 스파이크 S1-His 재조합 단백질(Sino Biological, 40159-V08B1)과 SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드-His 재조합 단백질(Sino Biological, 40588-V08B)을 사용하였다.

그 결과, rMpg_RBD 균주에서는 RBD 특이적인 밴드가 검출되었다(도 7). 반면, rMpg_NP 균주에서는 동일한 실험을 반복했을 때에도 NP 특이적인 밴드가 전혀 관찰되지 않았다(도 8).

실험예 2. 수지상 세포 감염 시 rMpg_RBD에 의한 RBD 발현량 측정

수지상 세포(Huiying Bio. Tech)를 24 웰 플레이트에 시딩하고(5 x 10⁵ 세포/웰) 24시간이 지난 후에 rMpg_RBD 균주를 1 또는 10 M.O.I.(multiplicity of infection)로 감염시켰다. 4시간 후, 감염된 세포를 PBS로 세척하여 세포 외부(extracellular)의 균을 제거하고, 아미카신(10 μM)이 포함된 배지로 교체하여 24시간 동안 37℃에서 배양을 진행하였다. 감염시키지 않은 수지상 세포 및 Mpg 야생형 균주로 감염시킨 세포를 대조군으로 동일한 방법으로 준비하였다.

얻어진 세포 배양액을 면역 사이토카인 분석을 위해 -20℃에 보관하였다. 세포를 PBS로 세척한 후, 1 ml Trizol(TRIzol® Reagent, ThermoFisher Scientific, REF: 15596018)과 혼합하였다. 그 후, 클로로포름을 넣어 잘 혼합하고 상온에서 3분 간 배양하였다. 원심 분리(12,000 x g, 15 min, 4℃)하여 상층액을 취하고, 동량의 이소프로판올과 혼합하여 다시 한번 원심 분리하였다. 75% EtOH로 세척한 후, 원심 분리하여 펠릿을 공기 중 건조시켰다. 그 후, 적절한 부피의 DEPC 처리수로 용해시켜, 총 RNA를 확보하였다.

확보된 RNA에서 DNA 오염을 배제하기 위해, DNaseI(Promega, Cat: M6101)을 처리하여 37℃에서 30분 간 반응시킨 후, 일반적인 EtOH 침전법에 의해 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA를 SYBR kit(SensiFASTTM SYBR® Lo-ROX One-Step kit, Bioline)로 real-time PCR(CFX ConnectTM Real-Time System, Bio-RAD)을 수행하고, 확보된 Cq 값을 토대로, 세포 내 RBD의 발현량을 상대적으로 정량하였다. RBD 검출을 위해 사용된 real-time PCR용 프라이머 세트 및 온도 조건을 표 3에 나타내었다.

[표 3] RBD 검출을 위해 사용된 프라이머 세트(서열번호 10 및 11) 및 온도 조건

그 결과, 감염시키지 않은 세포 및 Mpg 야생형 균주를 감염시킨 세포와 비교하여, rMpg_RBD를 감염(10 M.O.I.)시킨 세포에서 상대적으로 3배 정도 높은 RBD의 발현이 mRNA 수준에서 확인되었다. 1 M.O.I. 감염 시에도 RBD 발현이 검출되긴 하였으나 그 정도는 미미하였다(도 9).

실험예 3. 재조합 Mpg 균주의 면역원성 평가

실시예 2에서 제작된 재조합 Mpg 균주(rMpg_RBD)의 면역 유도능이 야생형 Mpg 균주와 유사한지 확인하기 위해, 재조합 Mpg 균주 및 야생형 Mpg 균주를 각각 수지상 세포에 감염시킨 후, 수지상 세포의 성숙 마커의 발현 양상을 확인하고, 세포 배양액으로부터 IL-10 및 IL-12 사이토카인의 발현 양상을 확인하였다. 아무것도 처리하지 않은 그룹과 LPS를 처리한 그룹을 각각 음성 대조군 및 양성 대조군으로 하였다.

먼저, 수지상 세포를 24웰 플레이트에 시딩하고(5 x 10⁵ 세포/웰) 24시간이 지난 후, Mpg(10 M.O.I.) 및 rMpg_RBD 균주(1 또는 10 M.O.I.)로 감염시켰다. 4시간 후, 감염된 세포를 PBS로 세척하여 세포 외부(extracellular)의 균을 제거하였다. 이어서, 배지를 아미카신(10 μM)이 포함된 배지로 교체하여 37℃에서 24시간 배양하였다.

얻어진 세포 배양액은 사이토카인 분석을 위해 -20℃에 보관하였다. PBS로 세척하고 세포를 떼어내어 CD16/32 항체(Biolegend, Cat: 101301)로 30분 간 블록킹(blocking)하고, BV605 접합 항-CD86, PE 접합 항-CD40, FITC 접합 항-MHCII, APC 접합 항-CD80 항체(BD Biosciences)로 빛이 차단된 조건에서 30분 간 4℃에서 염색하였다. 이어서, 수지상 세포의 성숙 마커 발현 양상을 FACS(BD LSRFortessa)로 확인하였다.

[표 4] 수지상 세포의 성숙 마커 발현량 비교 결과

그 결과, Mpg를 감염시킨 경우에 수지상 세포의 성숙 마커(MHCII, CD40, CD80, CD86) 발현 비율이 상대적으로 가장 높은 양상을 보였으며, rMpg_RBD 균주 감염(10 M.O.I.)의 경우에도, Mpg 감염 시와 비슷한 수준으로 성숙 마커 발현 양상이 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 11a 내지 도 11d, 표 4). 다만, rMpg_RBD 1 M.O.I. 감염 시, 아무것도 처리하지 않은 그룹과 같이 성숙 마커가 거의 증가하지 않았다(도 11a 내지 도 11d, 표 4).

또한, 세포 배양액에서 사이토카인 IL-10 및 IL-12의 발현 양상을 ELISA로 분석하였다. 각 사이토카인에 특이적인 항체를 96웰 플레이트에 코팅한 후(4℃, O/N), 각 웰을 세척 버퍼로 3회 세척하여 상온에서 1시간 동안 어세이 버퍼로 블록킹하였다. 각 웰을 다시 세척한 후, 확보한 배양액을 넣어 상온에서 2시간 반응시켰다. 각 웰을 세척한 후, 각 사이토카인에 대한 검출 항체를 붙여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후, 발색 시약을 통해 각 웰을 발색시킨 후, OD 450 nm에서 ELISA reader 기기(Tecan Sunrise)로 흡광도를 측정하고, 표준 값을 토대로, IL-10 및 IL-12 사이토카인의 발현량을 측정하였다.

[표 5] 사이토카인 발현량 비교 결과

그 결과, 수지상 세포 성숙 양상과 비슷하게, Mpg로 감염시킨 경우에 가장 높은 수준의 사이토카인을 발현하였고, rMpg_RBD로 감염시킨 경우에도 비교적 높은 수준의 사이토카인 발현량을 나타내었다(도 12a 및 도 12b, 표 5). rMpg_RBD 1 M.O.I. 감염 시, 아무것도 처리하지 않은 그룹에 비해 통계적으로 유의하게 IL-10 및 IL-12의 발현이 증가되는 양상을 보였으나, 다른 그룹에 비해서는 상당히 낮은 발현량을 보였다.

즉, 실시예 2에서 제조한 rMpg_RBD 균주를 10 M.O.I.로 수지상 세포에 감염시킨 경우에, Mpg를 감염시킨 경우와 유사한 수준으로 수지상 세포의 성숙 마커(MHCII, CD40, CD80, CD86)의 발현을 증가시키고, IL-10 및 IL-12와 같은 사이토카인의 발현도 증가시키는 것을 확인하였다.

다만, 감염 용량을 비교해 봤을 때, 1 M.O.I. 감염 시에는 수지상 세포 내 면역 유도능이 미미하였다.

실시예 3. 재조합 Mpg 균주의 계대 배양

실시예 2에서 제조된 rMpg_RBD 균주를 7H9 액체 배지(100 μg/ml의 카나마이신 함유)에서 계대배양하여, 5세대 배양된 균주의 단백을 추출해 RBD western blot을 수행하여 RBD 발현 여부를 확인하였다(도 10).

상기 균주의 배양을 10세대까지 완료하였고, 각 배양 균주를 20% 글리세롤에 현탁하여 -70℃에 보관하였다.

실험예 4. 계대배양된 rMpg_RBD 균주에서의 RBD 발현 확인

계대배양된 rMpg_RBD 균주(#7 균주)의 배양액을 원심분리(2,500 rpm, 10 min)하여 펠릿을 취한 후, B-PER 버퍼(Thermo Scientific; 100 μg/ml의 라이소자임, 5 U/ml의 DNase, 및 프로테이나제 억제제가 보충됨)에 균일하게 섞어 얼음 상에서 초음파 처리(2회 반응으로 5분; 펄스: 0.3초, 정지: 0.7초)를 수행하였다. 분쇄액을 원심분리(13,000 rpm, 15 min, 4℃)하여 상층액을 취해 단백을 확보하였다.

확보된 단백(100 μg)을 사용하여 RayBiotech에서 제공하는 S1RBD ELISA kit(ELV-COVID19S1-1)로 단백 내 RBD의 발현을 확인하였다. 먼저, 추출한 단백을 S1 RBD 특이적인 항체가 코팅되어 있는 96웰 플레이트에 넣어 2.5시간 동안 상온에서 반응시켰다. 그 후, kit에서 제공하는 세척 버퍼로 3회 내지 4회 각 웰을 세척하고, S1 RBD 검출 항체를 각 웰에 넣어 상온에서 1시간 반응시켰다. 다시 한번 각 웰을 세척한 후, 각 웰에 HRP-streptavidin을 넣어 45분간 상온에서 반응시켰다. 이어서, 발색하여 OD 450 nm에서 ELISA reader 기기(Tecan Sunrise)로 흡광도를 측정하고 및 표준(standard)을 기반으로 단백 발현량을 정량하였다. 그 결과, Mpg 야생형(17.2 pg/ml)에 비해, 각 세대의 재조합 rMpg_RBD 균주(1, 5, 10 세대는 각각 73.4, 82.9, 65.3 pg/ml임)에서 RBD가 높게 발현되어 있음을 확인할 수 있었다(도 13a).

또한, 상기 rMpg_RBD 균주 배양액 펠릿을 Trizol(TRIzol® Reagent, ThermoFisher Scientific, REF: 15596018)과 혼합한 후, glass bead가 담긴 튜브에 옮겨 담아, Mini BeadBeater 기기(BioSpec)로 30초씩 3회 분쇄하였다. 그 후, 클로로포름/이소아밀 알코올(29:1)을 넣어 잘 혼합하였다. 이어서, 원심분리(16,000 x g, 5 min)하고, 얻어진 상층액에 이소프로판올과 3 M 아세트산나트륨을 처리하고, -20℃에서 침전시켰다. 침전된 RNA를 75% EtOH로 세척한 후, 공기 중에서 건조시켰다. 얻어진 펠릿을 DEPC-처리수로 녹여 RNA를 확보하였다. 확보된 RNA에서 DNA 오염을 배제하기 위해, DNaseI(Promega, Cat: M6101)을 처리하여 37℃에서 30분 간 반응시켰다. 이어서, 일반적인 EtOH 침전법을 통해 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA를 SYBR kit(SensiFASTTM SYBR® Lo-ROX One-Step kit, Bioline)로 real-time PCR(CFX ConnectTM Real-Time System, Bio-RAD)을 수행하고, 확보된 Cq 값을 토대로, 균주 내 RBD의 발현량을 상대적으로 정량하였다. 이때, hsp65에 대한 Cq 값으로 각 RBD Cq 값을 보정하여 상대적인 발현량을 계산하였다.

RBD 검출을 위해 사용된 real-time PCR 용 프라이머 세트 및 온도 조건을 표 6에 나타내었다.

[표 6] RBD 검출을 위해 사용된 프라이머 세트(서열번호 12 내지 15) 및 온도 조건

그 결과, RBD ELISA 결과와 마찬가지로, Mpg 야생형에 비해, 각 세대의 rMpg_RBD 균주(1, 5, 10세대)에서 RBD의 발현이 mRNA 수준에서 증가한 것을 확인할 수 있었다(도 13b).

이와 같이, 실시예 2에서 제조된 rMpg_RBD 균주(#7 균주)를 계대배양하였을 때, 10 세대 배양에서도 RBD 발현이 단백 및 mRNA 수준에서 비슷한 수준으로 유지되는 것을 확인할 수 있었다.

II. 마우스 모델에서 재조합 Mpg 균주(rMpg_RBD)에 의한 RBD 특이적인 면역 반응 유도능 평가

실험예 5. rMpg_RBD 균주의 면역 반응 유도능 평가

실시예 2에서 제조한 rMpg_RBD 균주(#5, #6, #7 균주)의 면역 반응 유도능을 평가하기 위해, 도 14에 도시된 접종 스케줄에 따라 in vivo 실험을 아래와 같이 진행하였다.

8주령 BALB/c 암컷 마우스를 3 마리씩 각 그룹으로 구성하여 rMpg_RBD 균주(#5, #6, #7 균주)를 각 그룹에 피하(S.C.) 경로로 접종하였고, 접종 용량은 1 x 10⁶ 였다.

면역화된 마우스를 희생시켜 비장세포를 확보하였다. 확보된 비장세포를 S1 단백으로 자극한 후, i) IFN-γ ELISPOT 및 ii) IFN-γ, IL-12 면역 사이토카인을 ELISA로 분석하였다. 또한, 혈청 샘플에서 iii) S1 특이적인 IgG(IgG1, 2 및 총(total) IgG)의 발현과 iv) SARS-CoV-2 pseudovirus에 대한 중화항체능을 분석하였다.

실험예 5.1. IFN-γ ELISPOT 어세이

면역화된 마우스에서 분리된 비장세포를 대상으로 IFN-γ에 대한 ELISPOT 어세이를 수행하였다. 먼저, IFN-γ 항체(항-마우스 IFN-γ, clone: AN-18, 3 μg/ml)를 코팅한 PVDF 멤브레인 플레이트에 각 그룹의 비장세포를 1 x 10⁶ 세포/웰로 시딩하고, SARS-CoV-2 스파이크(S1) 단백을 5 μg/ml로 처리하여 24시간 동안 비장세포를 자극시켰다. 그 후, 각 웰을 PBST와 PBS로 각각 3회씩 세척하였다. 이어서, 검출 항체(항-마우스-IFN-γ 바이오틴, clone: XMG1.2, 3 μg/ml)를 처리한 후, 4℃에서 24시간 동안 반응시켰다. 다시 각 웰을 세척한 후, streptavidin-HRP를 상온에서 2시간 동안 처리하였다. 그 후, AEC 기질 kit를 사용하여 발색시키고(10분 이내), ELISPOT reader 기기(AID EliSpot Reader)로 각 멤브레인의 spot을 카운팅하였다.

[표 7] 면역화 후 S1 단백에 대한 IFN-γ의 발현 양상을 ELISPOT으로 확인한 결과

그 결과, Mpg로 면역화한 그룹에서는 spot이 거의 확인되지 않았으나, rMpg_RBD를 면역화한 그룹에서 상대적으로 많은 spot이 확인되었으며, 특히 다른 rMpg_RBD 균주들에 비해, rMpg_RBD #7 균주로 면역화된 비장세포에서 S1 단백에 특이적인 IFN-γ가 가장 높게 발현된 것으로 확인되었다(도 15, 표 7).

실험예 5.2. 사이토카인 발현량 측정

면역화된 마우스에서 분리된 비장세포를 S1 단백(5 μg/ml)과 함께 in vitro에서 3일 간 배양한 후에 배양액을 모아 -70℃에 보관하였다. 그 후, IFN-γ 및 IL-12 사이토카인에 대한 ELISA를 수행하여 그 발현 양상을 비교, 분석하였다. ELISA는 마우스 IFN-γ 및 IL-12 ELISA kit(Invitrogen)를 사용하여 수행하였다.

먼저, IFN-γ 및 IL-12에 특이적인 항체를 96웰 플레이트에 코팅하였다(4℃, O/N). 그 후, 각 웰을 세척 버퍼로 3회 세척하고, 상온에서 1시간 동안 어세이 버퍼로 블록킹하였다. 각 웰을 다시 세척한 후, 확보한 배양액을 넣어 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 각 웰을 세척한 후, 각 사이토카인에 대한 검출 항체를 붙여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후, 발색 시약을 통해 각 웰을 발색시킨 후, OD 450 nm에서 ELISA reader 기기(Tecan Sunrise)로 흡광도를 측정하고, 표준 값을 토대로, IFN-γ 및 IL-12 사이토카인의 발현량을 측정하였다.

[표 8] Mpg 및 rMpg_RBD 균주(#5, #6, #7)로 면역화한 후, S1 단백에 대한 사이토카인 수준 비교 결과

그 결과, rMpg_RBD 균주로 면역화된 비장세포에서 S1 단백에 특이적인 IL-12 및 IFN-γ 사이토카인 발현이 Mpg 균주로 면역화한 경우에 비해 증가되는 양상을 보였고, 특히 rMpg_RBD #7 균주의 경우 가장 높은 IL-12 및 IFN-γ 사이토카인 발현량이 확인되었다(도 16, 표 8).

실험예 5.3. 혈청 내 IgG 수준 확인

본 실험예에서는 면역화된 마우스에서 분리된 혈청을 사용하여 혈청 내 RBD에 의한 IgG 발현 양상을 분석 및 평가하고자 하였다.

이를 위해, RBD 단백(Sino Biological)을 ELISA 플레이트에 코팅(5 μg/ml)하여 24시간 동안 4℃에서 반응시켰다. 그 후, 세척 버퍼(0.05% Tween 20)로 각 웰을 세척한 후, 5% BSA로 각 웰을 블록킹하였다. 마우스에서 분리한 혈청 샘플을 희석(1:10)하고, 각 웰에 넣어 2시간 상온에서 반응시켰다. 그 후, HRP가 달린 IgG1(염소 항-마우스 IgG1, HRP 접합됨; ThermoFisher Scientific), IgG2a(염소 항-마우스 IgG2, HRP 접합됨; Invitrogen) 및 총 IgG(항 마우스 IgG, 바이오틴화됨; eBioScinece)에 대한 항체를 넣어 1시간 상온에서 반응시킨 후, 발색시켰다. 그 후, ELISA reader 기기(Tecan Sunrise)로 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하여, 각 항체 아이소타입에 대한 OD 값을 평가하였다.

[표 9] Mpg 및 rMpg_RBD 균주(#5, #6, #7)를 SC로 면역 시, RBD에 대한 IgG 생성 양상을 흡광도로 측정한 결과

그 결과, Mpg 균주에 의한 면역화에 비해, rMpg_RBD 균주에 의한 면역화가 RBD 특이적인 IgG2, IgG1 및 총 IgG의 생성을 증가시킴을 확인할 수 있었다. 또한, rMpg_RBD #7 균주에 의해 가장 높은 수준의 IgG가 생성됨을 확인할 수 있었다(도 17, 표 9).

실험예 5.4. 중화항체능 확인

재조합 rMpg_RBD 균주의 pseudovirus 중화항체능 실험을 진행하였다.

먼저, SARS-CoV-2 pseudovirus 펠릿을 얻기 위해 pNL4-3.luc.RE와 SARS-CoV-2 스파이크 당단백질 S 서열이 포함된 pCAGGS(NR-52310, BEI Resources)를 인간 배아 신장 293T 세포에 co-transfection시켰다. 72시간 이후, 상층액을 5X PEG-it(LV810A-1-SBI)를 넣고 원심분리(1,500 g, 30 min)하여 렌티바이러스(lentivirus) 펠릿을 확보하였다.

한편, BALB/c 마우스에 세 가지 재조합 rMpg_RBD 균주(rMpg_RBD 1, #5; rMpg_RBD 2, #6; rMpg_RBD 3, #7)와 야생형 Mpg 균주를 2주 간격으로 총 2번 피하 주입하였다. 마지막 주입 후 2주가 지났을 때 안락사시키고, 각 마우스에서 혈청을 얻었다. 각 혈청은 96 웰 플레이트에서 1:10, 1:20, 1:50, 1:100, 1:1000, 1:10000, 1:100000, 1:1000000의 배수로 RPMI 1640 배지에 희석하여 100 μl씩 준비하였다. 희석된 혈청과 바이러스를 반응시키기 위해 SARS-CoV-2 pseudovirus 펠릿을 PRMI 1640에 희석하여 100 μl씩 준비하고 혈청과 피펫팅하여 혼합하였다. 그 후, 37℃ 인큐베이터에서 2시간 동안 배양하였다. 2시간 반응 후 배양액을 모두 인간 간암 세포주인 Huh7 세포(96 웰 플레이트, 5×104 세포/웰)에 처리하여 37℃ 인큐베이터에서 48시간 동안 배양하였다. 이후 상층액을 제거하여 세포 용해 버퍼(Promega, USA)로 세포를 용해시켰다. 이어서, 루시퍼라제 기질(Promega, USA)과 반응시킨 직후, Luminometer(Tecan)로 루시퍼라제 발색을 확인하였다(도 18).

동일한 SARS-Cov-2 pseudovirus 중화항체능 실험을 인간 폐암 세포주인 Calu-3 세포(한국세포주은행)에서도 진행하였으며, 이때 배지는 DMEM을 사용하였다(도 18).

그 결과, Mpg 야생형과 세 가지 rMpg-RBD 균주를 면역화한 마우스 혈청 모두 희석 배수가 증가함에 따라 세포에 감염된 SARS-CoV-2 pseudovirus가 줄어드는 것으로부터 SARS-CoV-2 pseudovirus에 대한 중화항체능이 있음을 확인하였다(도 18). 여기서, 상대 루시퍼라제 단위(RLU)는 SARS-CoV-2 pseudovirus가 세포에 감염하여 발현하는 루시퍼라제의 양으로 값이 작을수록 감염이 저해되었다고 할 수 있다.

또한, 세 가지 rMpg_RBD 균주 모두 야생형 Mpg보다 높은 NT50 값을 나타내어 SARS-CoV-2 pseudovirus에 대한 중화항체능이 뛰어난 것으로 확인되었다(도 18a 내지 도 18d). 여기서, NT50 값은 혈청을 섞어주지 않은 pseudovirus 감염을 기준으로 루시퍼라제 발색이 50% 줄었을 때의 혈청 희석 배수로서, 중화 항체 역가 50을 의미한다.

상기 세 가지 균주의 NT50 값 사이의 통계적인 유의성을 확인하지는 못하였으나, rMpg_RBD 3번 균주의 경우 NT50 값이 가장 높은 것으로 보아 세 가지 재조합 rMpg_RBD 균주 가운데 rMpg_RBD 3번 균주(#7 strain)가 마우스 면역 시 가장 SARS-CoV-2에 대한 중화항체능이 가장 뛰어날 것으로 예상된다. 동일한 중화항체능 실험을 Calu-3 세포에서 진행한 경우에도, rMpg_RBD 3번(#7) 균주를 면역화한 마우스 혈청의 중화항체능이 가장 뛰어난 것으로 확인되었다.

실험예 6. 마우스에서 rMpg_RBD 균주의 SARS-CoV-2 RBD 단백 특이적인 면역 반응 확인

실험예 5의 결과를 토대로 선별된 rMpg_RBD 균주(#7 strain)를 사용하여 마우스에서 SARS-CoV-2 RBD 단백 특이적인 면역 반응이 유도되는지를 평가하는 실험을 도 19에 도시된 투여 스케줄에 따라 수행하였다.

모든 균주를 피하 경로(S.C.)로 접종하였고, 접종 용량은 1 x 10⁶였다.

실험군: i) PBS(2회 접종, S.C.); ii) Mpg(2회 접종, S.C.); iii) rMpg_RBD(1회 접종, S.C.); iv) rMpg_RBD(2회 접종, S.C.); v) rMpg_RBD(1회 접종, S.C.) + RBD 단백과 알룸(alum)(1회 접종, S.C.); vi) RBD 단백과 알룸(2회 접종, S.C.). 여기서, RBD 단백과 알룸을 사용하는 경우, RBD 단백은 10 μg/ml의 농도로 맞추고, 알룸은 100 μg/ml의 농도로 맞춰 같이 혼합한 후 면역을 수행하였다. 모든 접종 볼륨은 100 μl로 맞춰 진행하였다.

8주령 BALB/c 암컷 마우스를 각 균주로 면역화시켰으며, 5 마리씩 각 그룹을 구성하였다. 면역화된 마우스를 희생시켜, 비장세포를 확보하고, 확보된 비장세포를 SARS-CoV-2 RBD 단백으로 자극시켰다. 그 후, 다음과 같이 i) IFN-γ ELISPOT 어세이를 수행하고, ii) FACS를 통해 IFN-γ 또는 TNF-α를 발현하는 CD4, CD8 T 세포 집단을 분석하고, iii) 면역 사이토카인(IFN-γ, TNF-α, IL-2, IL-10 및 IL-12)을 ELISA로 분석하고, iv) 혈청 샘플에서 RBD 특이적인 IgG(IgG1, IgG2 및 총 IgG)의 발현을 분석하고, v) 생(live) SARS-CoV-2 virus에 대한 중화항체능을 비교하고, vi) SARS-CoV-2 pseudovirus에 대한 중화항체능을 비교하고, vii) 혈청을 사용한 ACE2-RBD 결합 어세이를 수행하고, viii) 마우스의 기관지 폐포 세척액(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)에서 SARS-CoV-2 RBD에 특이적인 IgA의 발현을 확인하였다.

실험예 6.1. IFN-γ ELISPOT 어세이

면역화된 마우스에서 분리된 비장세포를 대상으로 IFN-γ에 대한 ELISPOT을 수행하였다.

먼저, IFN-γ(항-마우스 IFN-γ, clone: AN-18, 3 μg/ml)를 코팅한 PVDF 멤브레인 플레이트에 각 그룹의 비장세포를 1 x 10⁶ 세포/웰로 시딩하고, SARS-CoV-2 RBD 단백을 5 μg/ml로 처리하여 24시간 동안 비장세포를 자극시켰다. 그 후, 각 웰을 PBST와 PBS로 각각 3회씩 세척한 후, 검출 항체(항-마우스-IFN-γ 바이오틴, clone: XMG1.2, 3 μg/ml)를 처리하였다. 이어서, 4℃에서 24시간 반응시켰다. 다시 각 웰을 세척한 후, streptavidin-HRP를 상온에서 2시간 동안 처리하였다. 그 후, AEC 기질 kit를 사용하여 발색시키고(10분 이내), ELISPOT reader 기기(AID EliSpot Reader)로 각 멤브레인의 spot을 카운팅하였다.

[표 10] 면역화후 RBD 단백에 대한 IFN-γ의 발현 양상을 ELISPOT으로 확인한 결과

그 결과, rMpg_RBD 균주를 면역화한 그룹(1회, 2회 및 rMpg_RBD + RBD 단백 면역)에서 PBS 및 Mpg 균주 면역 그룹에 비해 상대적으로 많은 IFN-γ spot을 확인할 수 있었다. 하지만, rMpg_RBD 균주를 1회 면역화한 그룹과, rMpg_RBD로 prime한 후 RBD 단백을 boosting 면역화한 그룹만이 PBS 및 Mpg 면역 그룹과 유의하게 차이를 보였다. 그 중에서, rMpg_RBD 균주를 1회 면역화한 그룹에서 가장 많은 IFN-γ spot을 확인할 수 있었다(도 20, 표 10).

실험예 6.2. FACS 분석

각각의 면역화된 마우스의 비장세포를 RBD 단백으로 18시간 동안 자극한 후, brefeldin A(eBioscience^TM BrefeldinA, Invitrogen)를 4 내지 6시간 동안 처리하여 세포 내 사이토카인을 잡아두었다. 그 후, FITC 접합 항-CD3, V500 접합 항-CD4, PE 접합 항-CD8 항체(BD BioSciences)를 사용하여 표면 분자 염색(4℃, 30분)을 먼저 진행하였다. 이어서, 1% 파라포름알데하이드(PFA)로 상온에서 20분 세포를 고정하고, (FACS 버퍼 중의) 0.1% Triton X-100를 처리하여(RT, 30분) 세포 투과성(permeabilization)을 높였다. 그 후, 세포내 염색을 통해 IFN-γ 또는 TNF-α(APC 접합 항-IFN-γ, APC_Cy7 접합 항-TNF-α 항체를 사용)(BD BioSciences)를 발현하는 CD4 및 CD8 T 세포 집단의 차이를 FACS(FACS LSRFortessa)로 분석하였다.

[표 11] 면역화후 RBD에 특이적인 IFN-γ 및 TNF-α를 발현하는 CD4, CD8 T 세포 집단을 FACS로 분석한 결과

그 결과, rMpg_RBD를 면역화한 그룹에서 IFN-γ를 분비하는 CD4, CD8 T 세포 집단이 다른 면역 그룹에 비해 통계적 유의성을 보이며 증가하는 양상을 나타냈다(도 21, 표 11). 특히, CD4+ IFN-γ+ T 세포의 경우, rMpg_RBD를 1회 면역화한 그룹에서 가장 높은 양상을 보였으며, 이는 IFN-γ ELISPOT 결과와 상관성을 보인다고 판단되었다(도 20, 도 21, 표 10, 표 11).

TNF-α를 분비하는 CD4, CD8 T 세포 집단의 경우에도, rMpg_RBD를 면역화한 그룹(1회 또는 2회 면역)에서 높은 양상을 보였고, rMpg_RBD를 2회 면역화한 그룹에서는 1회 면역화한 그룹보다 TNF-α를 분비하는 CD4, CD8 T 세포 집단이 증가하는 경향을 보였다. 특히, rMpg_RBD prime-RBD 단백 boosting으로 면역화한 그룹에서 TNF-α를 분비하는 T 세포 집단이 가장 높은 양상을 보였다(도 21, 표 11).

하지만, RBD 단백만 면역화한 그룹에서는 IFN-γ 및 TNF-α를 발현하는 T 세포 집단이 낮은 양상을 보였다(도 21, 표 11).

실험예 6.3. 사이토카인 발현량 측정

면역화된 마우스에서 분리된 비장세포를 SARS-CoV-2 RBD 단백(5 μg/ml)과 함께 in vitro에서 3일 간 배양시킨 후 배양액을 모아 -70℃에서 보관하였다. 그 후, IFN-γ, TNF-α, IL-2, IL-10 및 IL-12 사이토카인에 대한 ELISA를 수행하여 그 발현 양상을 비교, 분석하였다. ELISA는 마우스 IFN-γ, TNF-α, IL-2. IL-10 및 IL-12 ELISA kit(Invitrogen)를 사용하여 수행하였다.

먼저, 각 사이토카인에 특이적인 항체를 96웰 플레이트에 코팅한 후(4℃, O/N), 각 웰을 세척 버퍼로 3회 세척하여 상온에서 1시간 동안 어세이 버퍼로 블록킹하였다. 각 웰을 다시 세척한 후, 확보한 배양액을 넣어 상온에서 2시간 반응시켰다. 각 웰을 세척한 후, 각 사이토카인에 대한 검출 항체를 붙여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후, 발색 시약을 통해 각 웰을 발색시킨 후, OD 450 nm에서 ELISA reader 기기(Tecan Sunrise)로 흡광도를 측정하고, 표준 값을 토대로, IFN-γ, TNF-α, IL-2. IL-10 및 IL-12 사이토카인의 발현량을 측정하였다.

[표 12] 면역화후 RBD에 특이적인 사이토카인 발현 수준의 비교 결과

그 결과, 앞선 IFN-γ ELISPOT 및 FACS 결과와 마찬가지로(도 20, 도 21; 표 10, 표 11), rMpg_RBD 균주를 1회 면역화한 그룹에서 가장 높은 IFN-γ의 발현을 확인할 수 있었다(도 22a, 표 12). rMpg_RBD 균주를 2회 면역화한 그룹도 다른 나머지 면역 그룹에 비해 통계적으로 유의하게 IFN-γ의 발현을 증가시켰다(도 22a, 표 12). 하지만, rMpg_RBD로 prime한 후 RBD 단백을 boosting하여 면역시킨 그룹과 RBD 단백만 면역시킨 그룹에서는 IFN-γ의 발현량이 낮게 확인되었다.

IL-2, IL-12 및 TNF-α의 경우, rMpg_RBD 균주를 면역화한 그룹이 Mpg 야생형을 면역화한 그룹보다 높은 사이토카인 발현량을 보였으며, 특히, rMpg_RBD 균주를 2회 면역화한 그룹이 가장 높은 발현량을 보였다. TNF-α의 경우, FACS 분석 결과(도 21, 표 11)와 상관성을 보이는 양상으로, rMpg_RBD 균주를 2회 면역화한 그룹이 가장 높은 발현량을 보였다(도 22b, 도 22c, 도 22e, 표 12).

RBD 단백을 면역화한 그룹의 경우, Th1 세포 매개 면역 반응에 중요한 사이토카인들(TNF-α, IFN-γ, IL-12 등)의 발현량이 다른 면역 그룹에 비해 크게 낮은 양상을 보였으나, Th2 면역 반응과 연관된 IL-10의 발현량이 다른 면역 그룹에 비해 월등히 높은 것으로 확인되었다(도 22d, 표 11).

실험예 6.4. 혈청 내 IgG 분석

선별한 재조합 균주에 기초한 비처리(No treat), 야생형 Mpg, rMpg_RBD(1), rMpg_RBD(2), rMpg_RBD + RBD, RBD의 총 6개의 그룹, 총 30마리의 마우스로 실험을 진행하였다. 균주 혹은 단백의 마지막 주입 후 2주가 지났을 때 마우스에서 혈청을 확보하였고, 확보된 혈청은 -20℃에 보관하였다.

면역화된 마우스에서 분리된 혈청을 사용하여, 혈청 내 SARS-CoV-2 RBD에 의한 IgG 발현 양상을 분석, 평가하고자 하였다. 이를 위해, RBD 단백을 ELISA 플레이트에 코팅(5 μg/ml)하여 24시간 동안 4℃에 반응시켰다. 그 후, 세척 버퍼(0.05% Tween 20)로 각 웰을 세척한 후, 5% BSA로 각 웰을 블록킹하였다. 각 마우스에서 분리한 혈청 샘플을 희석하고(1:10), 각 웰에 넣어 2시간 동안 상온에서 반응시켰다. 그 후, HRP가 달린 IgG1(염소 항-마우스 IgG1, HRP 접합됨; ThermoFisher Scientific), IgG2a(염소 항-마우스 IgG2, HRP 접합됨; Invitrogen) 및 총 IgG(항 마우스 IgG, 바이오틴화됨; eBioScinece)에 대한 항체를 넣어 1시간 상온에서 반응시킨 후, 발색시켰다. ELISA reader 기기(Tecan Sunrise)로 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하여, 각 항체 아이소타입에 대한 OD 값을 평가하였다.

[표 13] 면역화 후 RBD에 특이적인 IgG 생성 양상을 흡광도로 측정한 결과

그 결과, rMpg_RBD를 2회 접종한 그룹에서 세포 매개성 Th1 면역에 관여한다고 알려져 있는 IgG2의 발현이 가장 높은 것으로 확인되었다(도 23a, 표 13). rMpg_RBD를 1회 접종한 그룹은 Mpg 야생형 및 RBD 단백 면역 그룹과 비슷한 수준의 IgG2 발현 양상을 보였다. IgG1의 경우에도, rMpg_RBD를 2회 접종한 그룹에서 높은 발현을 보였으나, Mpg 균주를 면역화한 그룹에서도 그와 비슷한 수준으로 IgG1의 발현이 증가됨이 확인되었다(도 23b, 표 13).

RBD 특이적인 세포 매개성 면역 반응 결과와 달리, rMpg_RBD를 1회 면역화한 그룹은 rMpg_RBD prime-RBD boosting 및 RBD 단백 면역 그룹과 비슷한 수준의 IgG1 발현 양상을 보였다. 총 IgG의 발현은 높은 IgG1 발현을 반영하는 듯, Mpg 균주가 면역화된 그룹과 rMpg_RBD 균주를 2회 면역화한 그룹에서 가장 높은 양상을 보였다(도 23c, 표 13).

실험예 6.5. rMpg_RBD로 면역화한 마우스 혈청의 생 SARS-CoV-2에 대한 중화항체능 평가

각 그룹에서 얻은 마우스 혈청의 생 SARS-CoV-2에 대한 중화항체능을 평가하기 위해 Biosafety Level 3 연구실에서 실험을 진행하였다.

먼저, SARS-CoV-2를 배양하기 위해, 원숭이 신장세포주 Vero E6를 T75 플라스크에서(5×10⁶을 DMEM(10% FBS가 보충됨)에서) 24시간 배양한 다음, 37℃ 워터 배스(water bath)에서 녹인 SARS-CoV-2 스탁을 20 ml DMEM(10% FBS가 보충됨)에 풀어 Vero E6에 대한 배지를 교체하였다. 이렇게 1시간 동안 37℃ 인큐베이터에서 감염시키며 10분 간격으로 바이러스가 균일하게 감염될 수 있도록 플라스크를 좌우로 가볍게 흔들어주었다. 1 시간 후 상층액을 제거하여 바이러스가 없는 배지로 교체하며 37℃에서 3일간 배양하였다. 그 후, 상층액을 수득하여 분취하고, -80℃ 딥프리저(deepfreezer)에 보관하였다.

한편, 마우스 혈청을 1:2, 1:10, 1:20, 1:50, 1:100, 1:1000, 1:10000의 희석 농도로 DMEM 배지에 희석하여 150 μl를 준비하였다. 그 후, 100 내지 150 pfu의 SARS-CoV-2 150 μl와 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 전날 준비한 Vero E6 세포(24 웰 플레이트, 5×10⁵ 세포/웰)의 각 웰에 반응시킨 혈청-바이러스 혼합물을 감염시킨 후 37℃에서 1시간 반응시켰다. 이때, 바이러스가 균일하게 감염될 수 있도록 10분 간격으로 플레이트를 가볍게 흔들어주었다. 1시간 감염 후 배지를 제거하고, PBS로 세척하였다. 그 후, DMEM(10% FBS 및 0.8% 메틸셀룰로스가 보충됨) 500 μl/웰로 교체하고 37℃ 인큐베이터에서 2일간 배양하였다.

3일 후, 플라크(plaque) 발색을 위해, 100% 메탄올 1 ml(1:2 부피)/웰을 처리하여 15분간 상온에서 반응시키면서 0.8% 메틸셀룰로스를 녹였다. 메틸셀룰로스를 제거하고, PBS로 세척한 후 4% 파라포름알데하이드 500 μl/웰 처리하여 상온에서 15분간 세포를 고정하였다. 이후 플레이트 덮개를 연 상태로 UV를 1시간 조사하여 샘플을 불활성화시켰다. 1시간 후, 용액을 제거하고, 100% 메탄올을 500 μl/웰 처리하여 15분간 고정/투과를 진행하였다. PBS로 세척한 후, SARS-CoV2의 뉴클레오캡시드(NP)에 대한 1차 항체를 (PBS 중의) 2% BSA에 1:1000 희석하여 200 μl/웰 처리하고, 4℃에서 밤새 반응시켰다. 이후 1차 항체를 제거하고, PBS로 세척을 세 번 진행하였다. 이어서, 알칼리 포스파타제(AP)가 부착된 2차 항체를 (PBS 중의) 2% BSA에 1:5000 희석하여 200 μl/ml 처리한 후 상온에서 2시간 반응시켰다. 2차 항체를 제거하고, PBS로 세척한 다음, 기질 NBT/BCIP를 (PBS 중의) 2% BSA에 1:10000 희석하여 200 μl/웰 처리하여 반응시켰다. 플라크 발색이 진행되면, 기질 용액을 제거한 후 DW로 세척하고 물기를 제거하였다.

그 결과, 아무 처리하지 않은 마우스의 혈청의 경우를 제외하고 나머지 모든 그룹에서 혈청의 희석 배수가 증가함에 따라 SARS-CoV-2의 플라크 형성이 줄어드는 것으로 보아 생 SARS-CoV-2에 대한 중화항체능이 확인되었다. 이때, 혈청과 반응시키지 않는 바이러스 감염을 기준으로 플라크 개수의 감소를 중화율(%)로 계산하였다.

또한, 플라크 감소 중화 테스트 50(PRNT50) 역가는 바이러스 플라크 형성이 아무 처리하지 않은 경우에 대비하여 50% 감소할 때의 혈청 희석 배수를 말하며, PRNT50 값이 클수록 혈청의 중화항체능 효율이 뛰어나다고 할 수 있다(도 24). PRNT50 값을 비교할 때, 마우스에 아무 처리하지 않은 경우에 대비하여 균주 혹은 단백을 주입한 마우스의 경우 혈청은 SARS-CoV-2에 대해 통계적으로 유의한 수준으로 뛰어난 중화항체능을 보였다. 또한, 야생형 Mpg를 처리한 경우에 대비하여 재조합 균주를 처리하거나 재조합 균주와 단백과의 조합으로 처리한 경우의 혈청이 뛰어난 중화항체능을 가짐을 확인하였다.

재조합 rMpg_RBD를 한 번 마우스에 면역화한 경우와 2주 간격으로 두 번 면역화한 경우를 비교할 때 혈청의 SARS-CoV-2 중화항체능 차이는 없는 것으로 확인되었다. 하지만, rMpg_RBD를 한 번 면역화한 경우에 대비하여 rMpg_RBD를 한 번 면역화한 후 RBD 단백을 주입한 경우에 마우스 혈청의 중화항체능이 통계적으로 유의한 수준에서 뛰어나다는 것을 확인할 수 있었다.

이 결과를 통해, 재조합 rMpg_RBD를 한 번 주입한 경우보다 rMpg_RBD를 한 번 주입한 이후 RBD 단백을 주입하는 경우 마우스 혈청의 생 SARS-CoV-2에 대한 항체 생성이 증가한다는 것을 알 수 있었다.

실험예 6.6. rMpg_RBD로 면역화한 마우스 혈청의 SARS-CoV-2 pseudovirus에 대한 중화항체능 비교

재조합 rMpg_RBD 혹은 RBD 단백을 주입한 마우스 혈청의 SARS-CoV-2 pseudovirus에 대한 중화항체능을 확인하기 위해 실험예 5.4의 중화항체능 확인 실험과 동일한 방식으로 진행하였다.

먼저, 마우스 혈청을 1:10, 1:20, 1:50, 1:100, 1:1000, 1:10000, 1:100000, 1:1000000의 배수로 희석하여 SARS-CoV-2와 37℃에서 반응시켰다. 그 후, 혈청-바이러스 배양액을 Calu-3와 Huh7 세포에 감염시켰다. 감염 후 48시간째에, 루시퍼라제 발색을 통해 세포 내 pseudovirus 감염 저해를 확인하였다(도 25).

그 결과, 마우스에 아무 처리를 하지 않은 경우를 제외하고 균주 혹은 단백을 면역화한 마우스 혈청의 경우 모두에서 혈청의 희석배수가 증가함에 따라 Calu-3 세포 내 pseudovirus 감염이 줄어드는 것으로 보아 SARS-CoV-2 pseudovirus에 대한 중화항체능이 있음을 알 수 있었다. 여기서, 상대 루시퍼라제 단위(RLU)는 SARS-CoV-2 pseudovirus가 세포에 감염하여 발현하는 루시퍼라제의 양으로 값이 작을수록 감염이 저해되었다고 할 수 있다.

또한, NT50 값을 비교할 때, 마우스에 아무 처리하지 않은 경우에 대비하여 나머지 균주 혹은 단백을 주입한 마우스의 경우 혈청은 Calu-3와 Huh7 실험 모두에서 SARS-CoV-2 pseudovirus에 대해 통계적으로 유의한 수준으로 뛰어난 중화항체능을 보였다. 여기서, NT50 값은 혈청을 섞어주지 않은 pseudovirus 감염을 기준으로 루시퍼라제 발색이 50% 줄었을 때의 혈청 희석 배수로서, 중화 항체 역가 50을 의미한다.

한편, 야생형 Mpg를 마우스에 주입한 경우에 대비하여 rMpg_RBD를 두 번 주입한 경우, rMpg_RBD 한 번과 RBD 단백을 주입한 경우, RBD만 주입한 경우 Calu-3 세포 실험에서 혈청의 NT50 값이 통계적으로 유의한 수준으로 높은 것으로 보아 SARS-CoV-2 pseudovirus에 대한 중화항체능이 뛰어나다는 것이 확인되었다. 이와 같은 차이가 Calu-3 뿐만 아니라 Huh7에서도 확인되었으며 Huh 세포 실험에서는 야생형 Mpg를 주입한 경우 보다 rMpg_RBD를 한 번 주입한 경우에서 혈청의 SARS-CoV-2 pseudovirus 중화항체능 효율이 뛰어난 것이 확인되었다.

또한, rMpg_RBD를 한 번 주입한 경우에 대비하여 rMpg_RBD를 두 번 주입 또는 rMpg_RBD 한 번과 RBD 단백을 주입한 경우 Calu-3와 Huh7 실험 모두에서 NT50 값이 높은 것으로 보아 마우스 혈청의 SARS-CoV-2 pseudovirus 중화항체능이 통계적으로 유의한 수준으로 뛰어나다는 것이 확인되었다. 뿐만 아니라, rMpg_RBD를 두 번 주입한 경우에 대비하여 rMpg_RBD를 한 번 주입한 후 RBD 단백을 주입하였을 때 마우스 혈청의 NT50 값이 통계적으로 유의한 수준으로 높은 것으로 보아 마우스 혈청의 pseudovirus 중화항체능이 뛰어나다는 것이 확인되었다.

이 결과를 바탕으로, 재조합 rMpg_RBD를 한 번 주입한 경우 보다 두 번 마우스에 주입하였을 때 혈청에서 SARS-CoV-2 pseudovirus에 대한 항체 생성이 증가한다는 것을 알 수 있었다. 또한, rMpg_RBD를 두 번 주입하는 경우보다 rMpg_RBD를 한 번 주입한 후 RBD 단백을 마우스에 주입할 때 혈청에서 SARS-CoV-2 pseudovirus에 대한 항체 생성이 증가한다는 것을 알 수 있었다.

실험예 6.7. rMpg_RBD로 면역화한 마우스 혈청이 ACE2-RBD 결합에 미치는 영향 평가

실험예 6.5 및 6.6을 통해 rMpg_RBD를 면역화한 마우스 혈청에서 생 SARS-CoV-2 및 SARS-CoV-2 pseudovirus에 대한 중화항체능이 있다는 것이 실험적으로 확인되었다. 이에, 면역화한 마우스 혈청 내 항체들이 RBD가 인지하여 결합하는 분자인 ACE2와의 결합을 실제로 방해하는지를 확인하기 위해, ACE2-RBD 결합 어세이를 수행하였다.

구체적으로, RayBiotech에서 제공하는 COVID-19 스파이크-ACE2 결합 어세이 Kit(CoV-ACE2S2-1)를 사용하여, rMpg_RBD로 면역화한 마우스 혈청 내 항체가 ACE2와 RBD의 결합에 영향을 미치는지를 평가하였다. 먼저, PBS, Mpg, rMpg_RBD(1회 또는 2회)로 면역화한 마우스의 혈청을 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000으로 희석하여 RBD 단백과 섞어주었다. 그 후, ACE2 단백이 코팅되어 있는 96웰 플레이트에 넣어 3시간 동안 상온에서 반응시켰다. Kit에서 제공하는 세척 버퍼로 각 웰을 4회 세척한 후, 각 웰에 HRP-접합 IgG를 붙여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 다시 각 웰을 세척한 후, 발색 시약을 넣고 최대 30분까지 발색시켰다. 그 후, 반응을 중지시켜, ELISA reader 기기(Tecan Sunrise)로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 때, 흡광도가 낮을수록 ACE2와 RBD의 결합을 방해한다고 판단할 수 있다.

[표 14] PBS, Mpg 및 rMpg_RB로 면역화한 마우스의 혈청이 ACE2와 RBD의 결합에 미치는 영향을 평가하기 위한 ACE2-RBD 결합 어세이 흡광도 결과

그 결과, PBS와 Mpg를 면역화한 그룹의 혈청을 RBD 단백과 섞어 ACE2와 반응시켰을 때, 희석 배수에 상관없이 흡광도가 비슷한 수준을 유지되는 것을 확인할 수 있었다. 하지만, rMpg_RBD를 면역시킨 마우스 혈청 샘플의 경우, 1회 또는 2회 면역 그룹 간의 차이는 없었지만, PBS 및 Mpg 면역 그룹에 비해, ACE2와 RBD의 결합을 방해하는 양상을 보였다. 이러한 경향은 혈청을 희석하여도 PBS 및 Mpg 면역 그룹에 비해 통계적으로 유의한 수준으로 흡광도가 낮은 양상을 보였다(도 26, 표 14). 하지만, 혈청을 1:10000가량 희석했을 때는, 흡광도가 상당히 증가하는 양상을 보였다.

또한, rMpg_RBD 면역 혈청에 의한 ACE2-RBD 결합 저해 농도(inhibitory concentration 50, IC50)는 rMpg_RBD(1회 면역)가 1:762.2, rMpg_RBD(2회 면역)가 1:6008로, 이는 rMpg_RBD를 2회 면역화한 혈청이 낮은 농도에서도 ACE2-RBD 간 결합을 저해하는 데 탁월한 영향을 미친다는 것을 의미한다.

실험예 6.8. BALF에서 IgA의 발현 확인

rMpg_RBD로 면역화된 마우스의 기관지 폐포 세척액(BALF)에서 SARS-CoV-2 RBD에 특이적으로 반응하는 IgA의 발현량을 확인하기 위해, IgA ELISA를 수행하였다.

우선, 면역화된 마우스를 해부하여 기관지를 노출시켰다. 그 후, 22 게이지의 카테터(BD BioSciences)를 기관지에 삽관시킨 후, 800 μl의 PBS가 담긴 1 ml 시린지(syringe)로 교체하여 주입시켰다. 이때, 주입하거나 빼낼 때, 폐가 부풀어 오르고 다시 가라앉는지 육안으로 확인하며 진행하였다. 시린지로 PBS를 넣었다 빼는 작업을 3회 내지 4회 반복하여, 최종적으로 약 500 내지 600 μl의 BALF를 확보하고, 실험에 사용될 때까지 -20℃에 보관하였다.

면역화된 마우스에서 분리된 BALF를 사용하여, BALF 내 SARS-CoV-2 RBD에 의한 IgA 발현 양상을 ELISA로 확인하였다. 이를 위해, RBD 단백을 ELISA 플레이트에 코팅(5 μg/ml)하여 24시간 동안 4℃에서 반응시킨 후, 세척 버퍼 (0.05% Tween 20)로 각 웰을 세척하였다. 그 후, 5% BSA로 각 웰을 블록킹하였다. 각 웰을 다시 한번 세척한 후, 마우스에서 분리한 BALF 샘플을 각 웰에 넣어 2시간 동안 상온에서 반응시켰다. 그 후, HRP가 달린 IgA에 대한 항체(염소 항-마우스 IgA 2차 항체, HRP 접합됨; Invitrogen)를 넣어 1시간 상온에서 반응시킨 후, 발색시켰다. ELISA reader 기기(Tecan Sunrise)로 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하여, IgA에 대한 OD 값을 측정하였다.

[표 15] Mpg, rMpg_RBD 및 RBD 단백 등을 SC로 면역화한 마우스의 BALF 샘플을 RBD 단백으로 자극시킨 후 IgA 항체의 발현량을 흡광도로 측정하여 비교한 결과.

그 결과, Mpg 면역 시에도 BALF 내 IgA의 발현이 일정 수준 확인되긴 하였으나, rMpg_RBD를 면역시킨 그룹의 BALF 내 IgA 발현 양상이 Mpg를 비롯한 rMpg_RBD prime-RBD boosting 및 RBD 면역 그룹에 비해 통계적으로 유의한 수준으로 증가되는 경향을 확인할 수 있었다. 또한, rMpg_RBD를 2회 면역화한 그룹에서 가장 높은 IgA의 발현 양상을 보였으며, 이는 rMpg_RBD를 1회 면역화한 그룹보다 높은 양상이었다(도 27, 표 15).

실험예 6.1 내지 6.8의 결과 요약 및 고찰

본 발명의 실시예에 따른 rMpg_RBD #7 균주로 마우스를 도 19의 투여 스케줄에 따라 면역화하여 SARS-CoV-2 RBD 특이적인 면역 유도능의 형성을 여러 면역 조합[i) PBS(2회 접종, S.C.); ii) Mpg(2회 접종, S.C.); iii) rMpg_RBD(1회 접종, S.C.); iv) rMpg_RBD(2회 접종, S.C.); v) rMpg_RBD(1회 접종, S.C.) + RBD 단백과 알룸(1회 접종, S.C.); vi) RBD 단백과 알룸(2회 접종, S.C.)]을 통해 비교, 평가한 결과를 요약하면 다음과 같다.

우선, RBD 단백으로 자극시킨 비장 세포를 사용하여 IFN-γ ELISPOT을 수행한 결과, rMpg_RBD 균주로 면역화한 그룹(1회, 2회 면역 또는 rMpg_RBD prime-RBD boosting 면역 그룹)에서 PBS 및 Mpg 균주 면역 그룹에 비해 높은 IFN-γ spot을 확인할 수 있었다. 그 중에서, rMpg_RBD 균주로 1회 면역화한 그룹에서 가장 높은 IFN-γ spot을 확인할 수 있었다(도 20, 표 10).

또한, IFN-γ 및 TNF-α를 분비하는 T 세포 집단을 FACS로 분석한 결과, rMpg_RBD로 면역화한 그룹(1회 또는 2회)에서 IFN-γ를 분비하는 CD4, CD8 T 세포 집단이 다른 면역화 그룹에 비해 통계적으로 유의하게 증가하는 양상을 보였다(도 21, 표 11). 특히, rMpg_RBD 균주로 1회 면역화한 그룹에서 IFN-γ를 발현하는 CD4 T 세포 집단이 가장 많이 유도되는 경향을 보였다. 또한, TNF-α를 분비하는 CD4, CD8 T 세포 집단의 경우도, rMpg_RBD로 면역화한 그룹(1회 또는 2회 면역)에서 높은 양상을 보였지만, rMpg_RBD prime-RBD 단백 boosting으로 면역화한 그룹에서 TNF-α를 분비하는 T 세포 집단이 가장 높은 양상을 보였다(도 21, 표 11).

또한, 각 면역화된 마우스 비장 세포를 RBD 단백으로 자극시킨 후, 세포 배양액에서 면역 사이토카인 발현을 평가하였다. 그 결과, IFN-γ의 발현은 ELISPOT 및 FACS 분석 결과와 유사하게, rMpg_RBD 균주를 1회 면역화한 그룹에서 가장 높았지만(도 20, 도 21, 도 22a; 표 10, 표 11, 표 12), 나머지 Th1 면역 반응에 중요한 사이토카인들(TNF-α, IL-2, 및 IL-12)의 발현은 rMpg_RBD 균주를 2회 면역화한 그룹에서 가장 높은 양상을 보였다(도 22b, 도 22c, 도 22e, 표 12). rMpg_RBD prime-RBD boosting 면역 그룹의 면역 사이토카인 발현 양상은 rMpg_RBD 1회 또는 2회 면역 그룹보다 낮은 경향을 보였다. RBD 단독 면역 그룹에서는 항염증 사이토카인인 IL-10의 발현만 나머지 면역 그룹에 비해 월등히 높은 수준을 보였고, 나머지 백신 면역에 중요한 면역 사이토카인의 발현은 다른 그룹에 비해 낮은 경향을 보였다.

또한, 각 면역화된 마우스 혈청에서 세포 매개성 Th1 면역에 관여한다고 알려져 있는 IgG2의 발현은 rMpg_RBD를 2회 접종한 그룹에서 가장 높은 것으로 확인되었고, rMpg_RBD를 1회 면역화하거나 rMpg_RBD prime-RBD boosting 면역화한 그룹에서는 Mpg 면역 그룹과 비슷하거나 낮은 IgG2 발현 양상을 보였다. 특이적으로, Mpg 균을 접종한 그룹에서 IgG1 및 총 IgG1의 발현이 rMpg_RBD 2회 면역 그룹과 큰 차이 없이 높은 것으로 확인되었는데, 이는 추후 더 면밀한 확인이 필요하겠지만 Mpg 면역에 의한 항원 비특이적인 항체 형성능도 고려되어야 할 것으로 생각된다(도 23, 표 13).

또한, 각 면역화된 마우스의 혈청을 사용하여 생 SARS-CoV-2 및 SARS-CoV-2 pseudovirus에 대한 중화 항체능을 평가하였다. 그 결과, rMpg_RBD 균주를 1회 또는 2회 면역하거나, rMpg_RBD prime-RBD boosting 면역 시, PBS, Mpg 및 RBD 단독 면역 그룹에 비해 상대적으로 높은 중화항체능을 보였다(도 24, 도 25). 하지만, 재조합 균주를 1회 면역화한 후 RBD 단백을 면역화한 혈청에서 가장 높은 중화항체능을 보였다(도 24, 도 25). rMpg_RBD prime-RBD boosting 면역이 RBD 특이적인 세포 매개성 면역 반응(IFN-γ ELISPOT, IFN-γ 또는 TN F-α 발현 T 세포 분석 및 면역 사이토카인 측정)에서는 큰 영향을 미치지 않았고, RBD 특이적인 항체 생성에서도 큰 영향을 미치지 않았다.

또한, rMpg_RBD가 면역화된 마우스 혈청을 사용하여, ACE2-RBD 결합 어세이를 수행하였을 때, rMpg_RBD로 면역화한 마우스 혈청 샘플의 경우, 1회 또는 2회 면역 그룹 간의 차이는 없었지만, PBS 및 Mpg 면역 그룹에 비해, ACE2와 RBD의 결합을 방해하는 양상을 보였다(도 26, 표 14). 또한, rMpg_RBD 면역 혈청에 의한 ACE2-RBD 결합 저해 농도(IC50)는 rMpg_RBD(1회 면역)가 1:762.2, rMpg_RBD(2회 면역)가 1:6008로, 이는 rMpg_RBD를 2회 면역화한 혈청이 낮은 농도에서도 ACE2-RBD 간 결합을 저해하는 데 탁월한 영향을 미친다는 것을 의미한다.

또한, rMpg_RBD로 면역화한 그룹의 BALF 내 IgA 발현 양상이 Mpg를 비롯한 rMpg_RBD prime-RBD boosting 및 RBD 면역 그룹에 비해 통계적으로 유의한 수준으로 증가되는 경향을 확인할 수 있었고 rMpg_RBD를 2회 면역화한 그룹에서 가장 높은 IgA의 발현 양상을 보였다(도 27, 표 15).

또한, rMpg_RBD 균주의 면역을 통해, RBD에 특이적인 세포 매개성 면역 반응과 SARS-CoV-2에 대한 중화항체능, 혈청 내 형성된 항체가 ACE2와 RBD의 결합의 저해를 유도하며, BALF에서 RBD 특이적인 IgA의 발현을 유도시킴을 확인할 수 있었다. rMpg_RBD prime-RBD boosting 면역의 경우, RBD 특이적인 면역 사이토카인 발현과 IFN-γ 및 TNF-α 발현 T 세포의 유도, RBD 특이적인 IgG 및 IgA의 발현 유도에서는 rMpg_RBD 균주 면역 그룹(1회 또는 2회 면역 그룹)에 비해 큰 영향을 미치지 않았으나, 생 SARS-CoV-2 및 SARS-CoV-2 pseudovirus에 대한 중화항체 유도에 있어서는 rMpg_RBD 면역 그룹에 비해 가장 큰 영향을 보였다.

마지막으로, rMpg_RBD 균주의 단독 면역이 RBD 특이적인 면역을 잘 유도했지만, rMpg_RBD prime-RBD boosting 면역의 경우 중화항체 형성을 잘 유도시켰기 때문에, rMpg_RBD 균주를 SARS-CoV-2 감염에 대한 새로운 백신 개발에 활용할 수 있을 것으로 사료된다.

아래 표 16에 실험예 6.1 내지 6.8의 결과를 평가하고자 하는 물질 측면에서 정성적으로 나타내었다.

[표 16]

실험예 7. rMpg_RBD 균주에 의해 면역화된 마우스 혈청의 중화항체능 추가 확인

실험예 5의 결과를 토대로 선별된 rMpg_RBD 균주(#7 strain)를 사용하여 마우스에서 SARS-CoV-2 RBD 단백 특이적인 면역 반응이 유도되는지를 평가하는 실험을 추가로 진행하였다. BALB/c 마우스를 세 그룹으로 나누어 rMpg_RBD 균주를 생균 형태로 각각 1×10⁶ CFU 및 1×10⁷ CFU, 불활화 형태로 1×10⁷ CFU로 피하 주사하고, 2주째 및 2주 5일째에 마우스로부터 혈청을 얻었다.

이렇게 얻은 마우스 혈청을 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640, 1:1280, 1:2560, 1:5120, 1:10240의 희석 농도로 희석하여 준비하였고, 항-SARS-CoV-2 스파이크 항체(Cat#: 40150-T62-COV2)(1 mg/ml)를 동일한 희석 농도로 희석하여 대조군 항체로 준비하였다.

한국질병관리청에서 분양 받은 바이러스인 SARS-CoV-2 Vero p2(CoV/Korea/KCDC/2020 NCCP43326)를 100 TCID ₅₀의 농도로 상기 희석된 혈청 및 대조군 항체와 동일한 용량으로 혼합하고, 37°C에서 30분 간 인큐베이션시켰다. 그 후, 실험 24시간 전에 시딩한 원숭이 신장세포주 Vero E6(96 웰 플레이트, 1.5x10^6 세포/웰)에 감염시켜 중화 정도를 측정하였다. 판독은 조직 배양 감염 용량(TCID ₅₀)방식으로 확인하였다. 일반적으로 TCID ₅₀ 방법은 바이러스 부유액을 세포에 접종하여 50%를 감염시키는 바이러스 희석배수를 역가(titer)로 나타내는데, 본 시험에서는 동일한 100 TCID ₅₀의 바이러스 농도에 실험군 및 대조군을 희색배수 별로 혼합하여, 실험군 및 대조군이 바이러스의 감염력을 떨어뜨리는 방식으로 중화 정도를 확인하였다. 그 결과를 도 29 내지 도 33에 도시하였다.

그 결과, 생균 형태로 1×10⁶ CFU를 피하주사한 군에서는 1/320까지 희석한 혈청에서 TCID ₅₀ 이상의 값을 나타내는 것을 확인하였으며(도 29, 도 32 및 도 33), 생균 형태로 1×10⁷ CFU를 피하주사한 군에서는 1/640으로 희석한 혈청에서도 TCID ₅₀ 이상의 값을 나타내는 것을 확인하였다(도 30, 도 32 및 도 33). 이는 생균 형태로 접종하였을 때 용량 의존적으로 중화항체능이 상승할 수 있음을 의미한다. 또한 불활화 형태로 1×10⁷ CFU를 피하주사한 군 역시 1/160 희석 배수에서 TCID ₅₀ 이상의 값을 나타내는 것을 확인하여, 불활화 상태에서도 중화능을 확인하였다(도 31, 도 32 및 도 33). 이러한 실시예는 재조합 마이코박테리움 파라고르도네 균주가 생균 및 불활화 상태와 관계없이 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 중화항체능을 갖는 것을 의미한다.

<110> RAPHAS Co., Ltd.
Seoul National University R&DB Foundation
<120> RECOMBINANT MYCOBACTERIUM STRAIN EXPRESSING SARS-COV-2 ANTIGEN
AND VACCINE COMPOSITION COMPRISING SAME
<130> MI21016
<160> 15
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 224
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> TB_codon_optimized_SARS_CoV_2_RBD region in the total spike
protein
<400> 1
Met Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr
1 5 10 15
Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser
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Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly
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Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly
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Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe
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<212> DNA
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<220>
<223> TB_codon_optimized_SARS_CoV_2_RBD region in the total spike
protein
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Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser
85 90 95
Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys
100 105 110
Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala
115 120 125
Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu
130 135 140
Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr
145 150 155 160
Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser
165 170 175
Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly
180 185 190
Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro
195 200 205
Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu Leu
210 215
<210> 4
<211> 654
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> TB_codon_optimized_SARS_CoV_2_NP region in the total nucleocapsid
phosphoprotein
<400> 4
atggccttga acaccccgaa ggatcacatc ggcacccgca acccggcaaa caacgcagca 60
atcgtgttgc agttgccgca gggtaccacc ttgccgaagg gtttctacgc agaaggttcg 120
cgcggtggtt cgcaggcctc gtcgcgctcg tcgtcgcgct cgcgcaactc gtcgcgcaac 180
tcgaccccgg gttcgtcgcg cggtacctcg ccggcacgca tggcaggcaa cggcggtgat 240
gcagcattgg cattgctgct gttggaccgc ttgaaccagt tggagtcgaa gatgtcgggt 300
aagggccagc agcagcaggg ccagaccgtg accaagaagt cggcagcaga ggcatcgaag 360
aagccgcgcc agaagcgcac cgccaccaag gcatacaacg tgacccaggc cttcggtcgc 420
cgcggtccgg aacagaccca gggcaacttc ggcgaccagg aactgatccg ccagggtacc 480
gactacaagc actggccgca gatcgcacag ttcgccccgt cggcctcggc cttcttcggc 540
atgtcgcgca tcggcatgga agtgaccccg tcgggtacct ggctgaccta caccggcgcc 600
atcaagttgg atgacaagga tccgaacttc aaggatcagg tgatcttgct gtaa 654
<210> 5
<211> 375
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> promoter
<400> 5
ggtgaccaca acgacgcgcc cgctttgatc ggggacgtct gcggccgacc atttacgggt 60
cttgttgtcg ttggcggtca tgggccgaac atactcaccc ggatcggagg gccgaggaca 120
aggtcgaacg aggggcatga cccggtgcgg ggcttcttgc actcggcata ggcgagtgct 180
aagaataacg ttggcactcg cgaccggtga gtcgtaggtc gggacggtga ggccaggccc 240
gtcgtcgcag cgagtggcag cgaggacaac ttgagccgtc cgtcgcgggc actgcgcccg 300
gccagcgtaa gtagcggggt tgccgtcacc cggtgacccc cggtttcatc cccgatccgg 360
aggaatcact tcgca 375
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer NotI_Phsp_F
<400> 6
aaagcggccg cggtgaccac aacgacgc 28
<210> 7
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer RBD_TB_XbaI_R
<400> 7
aaatctagat tagaagttca cgcacttgtt cttc 34
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer Phsp_EcoRV_F
<400> 8
tttgatatcg gtgaccacaa cgacgcgc 28
<210> 9
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer NP_XbaI_R
<400> 9
aaatctagat taggcctgag ttgagtcagc actg 34
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer RBD_RT_F1
<400> 10
accgagtcga tcgtgcgctt c 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer RBD_RT_R1
<400> 11
gaagcacagg tcgttcagct t 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer RBD_RT_F1
<400> 12
accgagtcga tcgtgcgctt c 21
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer RBD_RT_R1
<400> 13
gaagcacagg tcgttcagct t 21
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer Mpg_hsp_RT_F
<400> 14
gtcgaggagt ccaacacctt 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer Mpg_hsp_RT_R
<400> 15
ctggagacca gcaggatgta 20

Claims

SARS-CoV-2 항원을 발현하는 재조합 마이코박테리움 파라고르도네(Mycobacterium paragordonae) 균주로서,
상기 SARS-CoV-2 항원은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 스파이크 단백의 수용체 결합 도메인인, 균주.
삭제
삭제
삭제
제 1 항에 있어서,
상기 균주는 상기 스파이크 단백의 수용체 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis) BCG 유래의 hsp65(heat shock protein 65) 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결된 핵산 분자로 형질전환된 것인, 재조합 마이코박테리움 파라고르도네 균주.
제 1 항에 있어서,
상기 균주는 도 3a에 도시된 구조를 갖는 pMV306-Pshp:RBD 벡터로 형질전환된 것인, 재조합 마이코박테리움 파라고르도네 균주.
제 1 항, 제 5 항 및 제 6 항 중 어느 한 항의 균주를 유효성분으로 포함하는, SARS-CoV-2 감염의 예방을 위한 백신 조성물.
삭제
제 7 항에 있어서,
상기 백신 조성물은 단회 투여 또는 2회 투여되는 것인, 조성물.
제 7 항에 있어서,
상기 백신 조성물은 프라임-부스팅 접종법에서 프라이밍 백신으로 사용되는, 조성물.
제 10 항에 있어서,
상기 부스팅 접종 시 SARS-CoV-2의 수용체 결합 도메인, 알룸(alum), 또는 이들의 조합이 사용되고,
상기 SARS-CoV-2의 수용체 결합 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드인, 조성물.
제 7 항에 있어서,
상기 균주는 생균인, 조성물.
제 7 항에 있어서,
상기 균주는 약독화 또는 불활화된 것인, 조성물.
제 1 항, 제 5 항 및 제 6 항 중 어느 한 항의 균주를 유효성분으로 포함하는 제1 조성물; 및 SARS-CoV-2의 수용체 결합 도메인, 알룸(alum), 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 제2 조성물을 포함하는, SARS-CoV-2 감염의 예방용 키트로서,
상기 SARS-CoV-2의 수용체 결합 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드인, 키트.
제 14 항에 있어서,
상기 키트가 프라임-부스트 접종을 위한 것인, 키트.
제 15 항에 있어서,
제 1 조성물이 프라임 투여되고 제 2 조성물이 부스트 투여되는 것인, 키트.
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