KR20160021933A

KR20160021933A - 신규한 온도 민감성 마이코박테리아 균주 및 이를 포함하는 마이코박테리아 감염증에 대한 백신 조성물

Info

Publication number: KR20160021933A
Application number: KR1020140106951A
Authority: KR
Inventors: 김범준; 김병준
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2014-08-18
Filing date: 2014-08-18
Publication date: 2016-02-29
Also published as: CN106794201A; KR101696514B1; JP2017524661A; JP6229080B2; CN106794201B; WO2016028028A1

Abstract

본원은 온도 민감성 미코박테리아인 M. paragordonae (strain 49061) 균주 및 이를 포함하는 백신 조성물을 개시한다. 본원에 따른 백신은 접종시 피부 및 피하에서는 증식을 하여 면역을 자극시키지만 체내 중심부에서는 체온 보다 낮은 온도에서만 자랄 수 있는 특징으로 인해 증식이 억제되어 감염의 가능성이 낮아, 마이코박테리아로 인한 질환의 예방 백신 및 면역 치료에 안전하고 유용하게 사용될 수 있다.

Description

신규한 온도 민감성 마이코박테리아 균주 및 이를 포함하는 마이코박테리아 감염증에 대한 백신 조성물 {Temperature Sensitive Mycobacterial strain and its use as vaccine against mycobacterial infection disease}

본원은 온도민감성 마이코박테리아 균주를 이용한 마이코박테리아 감염증에 대한 백신과 관련된 기술분야이다.

미코박테리아 (Mycobacterium)는 결핵균, 우형 결핵균 및 나균, 조류결핵균군 (M. avium complex) 및 거북결핵균 (M. abscessus-chelonae complex)를 포함한 약 150 주의 종으로 구성되어 있다. 이들 중 결핵균과 우형결핵균, 나균은 절대병원성균, 나머지 미코박테리아를 비결핵항산성균 (nontuberculous mycobacteria 이하 NTM)으로 통칭하여 구분하고 있고. 사람에 결핵 나병을 일으키는등 그외에도 조류, 가축 등에 다양한 질환을 유발하고 있다.

이중, 결핵 (Tuberculosis, TB)은 여전히 전세계적으로 상위를 차지하는 사망원인이며, 다중 약물 저항성 (MDR) 결핵균의 등장으로 인해 상황이 더욱 악화되고 있는 실정이다.

결핵은 일반적으로 장기간의 항생제 치료를 통해 조절될 수 있으나, 항생제에 대한 내성 발생, 그리고 환자가 치료 절차를 준수하는지에 대한 철저한 모니터링이 어려울뿐더러, 보균자는 증상이 없더라도 다른 사람을 감염시킬 수가 있어, 균의 전파를 막기에는 역부족이다.

따라서, 효과적인 백신을 이용한 예방이 결핵이 전파를 막는데 보다 효과적인 방법이다.

또한, 결핵을 제외한 비결핵항산성균종 중 조류형결핵균군 (M. avium complex)을 제외하고 국내에서 가장 높은 빈도로 분리되는 균은 거북결핵균 (M. abscessus-M. chelonae) 그룹 균이다 (Ryoo SW, Shin S, Shim MS et al., Spread of nontuberculous mycobacteria from 1993 to 2006 in Koreans. J Clin Lab Anal. 2008; 22(6): 415-20). 최근 보고에 의하면 이 중 M. massiliense (M. abscessus subsp. bolletii) 균종이 국내 분리 거북결핵균 그룹 (M. abscessus-M. chelonae complex) 중 약 절반 가량을 (46.5 %) 차지한다고 알려져 있다 (Kim HY, Kook Y, Yun YJ et al., Proportions of Mycobacterium massiliense and Mycobacterium bolletii strains among Korean Mycobacterium chelonae-Mycobacterium abscessus group isolates. J Clin Microbiol. 2008; 46(10): 3384-90). 이러한 M. abscessus에 속하는 균종들의 감염은 항생제에 대한 선천 내성등으로 인해 치료 실패율 및 사망률이 현저하게 높은 것으로 알려져 있다. 따라서, M. abscessus 균종에 대한 새로운 백신의 개발이 필요한 실정이다.

종래 결핵에 대한 예방 백신으로 가장 널리 사용되는 것은 BCG (Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guerin) 이다. BCG의 경우 일부 유아기에서 발생하는 결핵에는 효과적이지만 성인에서 발견되는 강한 전염성을 갖는 결핵에는 그 효과가 제한 적이다. 또한 BCG는 임파선염, 국소 골조직 감염, 및 전신 감염의 부작용이 보고된 바가 있다.

최근 온도 민감성 균주 및 약독화 생균이 특정 박테리아에 대한 백신으로 개발되고 있는 추세이다. 특히 온도 민감성 균주의 백신 개발화는 더 큰 관심을 받고 있는데 이유는 사람 뿐 아니라 동물의 체외 (피부 등)에서 체내 (장기 등)로의 온도 구배가 존재하기 때문이다. 피부 등과 같이 상대적으로 낮은 온도에서는 자랄 수 있어 국소 면역을 자극시킬 수 있는 능력을 지녔지만, 장기 등 체내 안에서는 자랄 수 없는 온도 민감성 균주의 개발이 이루어지고 있다 (Barry et al., Temperature-sensitive bacterial pathogens generated by the substitution of essential genes from cold-loving bacteria: potential use as live vaccines. J Mol Med. 2011; 89: 437-444). 이들 중 가장 잘 알려져 있는 것으로 Sabin polio 백신과 FluMist iinfluenza 백신이 있다 (Maassab HF and Bryant ML, The development of live attenuated cold-adapted influenza virus vaccine for humans. Rev Med Virol. 1999; 9:237-244). 또한 수의학적인 목적으로 온도 민감성 균주가 개발, 연구되고 있는 추세이다 (Chalmers et al., Vet Rec. 1997; 141: 63-67, Jackwood and Saif, Avian Dis. 1985; 29: 1130-1139, Morrow et al., Avian Dis. 1998; 42: 667-670). 하지만 인위적인 유전자 변형을 통한 온도 민감성 균주는 안정성이 낮고 유지 하는데 어려움이 있다.

WO 1998-056931는 약독화된 재조합 마이코박테리아를 이용한 면역원성 또는 백신 조성물에 관한 것으로, 퓨린 및 피리미딘 생?성과 관련된 유전자가 불활성화된 M. tuberculosis 재조합 균주를 이용한 백신 조성물을 개시하고 있다.

미국 공개특허 2013-0101623호는 신규한 마이코박테리아 균주 및 결핵 백신 조성물에 관한 것으로, 약독화된 M. tuberculosis를 포함하는 백신 조성물을 개시하고 있다.

종래 기술과는 다른 새로운 균주에 기반한 새로운 백신 조성물에 대한 개발이 요구된다.

본원은 새로운 균주에 기반한 거북결핵균 군을 포함하는 결핵균 및 우결핵균을 포함하는 마이코박테리아 감염증에 대한 백신을 제공하고자 한다.

한 양태에서 본원은 기탁번호 KCTC 12628BP의 마이코박테리아 파라고르도네 (Mycobacterium paragordonae , strain 49061) 균주를 제공한다.

다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 온도민감성 균주 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 마이코박테리아 감염에 대한 백신 조성물을 제공한다.

본원에 따른 백신 조성물은 마이코박테리아 감염증 예를 들면 폐질환, 림프절염, 피부연조직, 골감염증 또는 파종성 질환에 대한 백신 조성물로 사용될 수 있다. 이러한 질환을 일으키는 마이코박테리아는 NTM (nontuberculous mycobacteria), 신속성장 NTM, 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis) 또는 우결핵균(Mycobacterium bovis)을 포함하며, 상기 NTM은 거북결핵균 군 (Mycobacterium chelonei complex), 마이코박테리움 아비움 컴플렉스 (M. avium complex) (MAC), 마이코박테리움 아비움 (M. avium), 마이코박테리움 인트라셀룰라레 (M. intracellulrare), 마이코박테리움 칸사시(M. kansasii), 마이코박테리움 앱세수스 (M. abscessus), 또는 마이코박테리움 매실리엔스 (M. massiliense)이나 이로 제한하는 것은 아니다.

본원에 따른 온도 민감성 미코박테리아인 M. paragordonae (strain 49061) 균주 및 이를 포함하는 백신 조성물은 거북결핵균군 및 결핵균, 우결핵균을 포함한 마이코박테리아 감염증의 예방에 효과적으로 사용될 수 있다. 체내 온도는 피부에서 체내 장기까지 온도가 증가하는 구배 성향을 띄고 있는데, 본원에 따른 백신은 접종시 피부 및 피하에서는 증식을 하여 면역을 자극시키지만 체내 중심부에서는 체온 보다 낮은 온도에서만 자랄 수 있는 특징으로 인해 증식이 억제되어 감염의 가능성이 낮아, 결핵균을 포함한 모든 마이코박테리아 감염증에 대한 예방 백신 및 면역 치료에 안전하고 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본원에 따른 균주가 신규한 것임을 나타내는 결과로, 도 1a는 16sRNA, rpoB 및 hsp65의 계통분석 결과이고, 도 1b 내지 도 1d는 각각 본원에 따른 균주의 16sRNA, rpoB 및 hsp65의 서열이다.
도 2a 및 2b는 M. paragordonae의 특징을 규명한 것으로, 각각 30℃ 및 37℃에서 7H9 액체배지에서의 성장 속도를 M. asiaticum, M. gordonae, 및 M. marinum 와 비교, 측정한 그래프이다.
도 3은 본원의 일 구현예에 따라 M. gordonae, M. marinum 및 M. paragordonae의 J774 뮤린 대식세포주에 대한 인비트로 감염 테스트를 수행한 결과이다. 감염을 30℃와 37℃에서 수행한 후 1일, 3일, 5일 후에 세포를 용해시켜 7H10 고체배지에 적절 희석 배수로 도말하여 30℃에서 배양하였다. 그 후 자란 콜로니 수를 세어 비교한 그래프이다. 좌측 그래프는 M. paragordonae, M. gordonae 및 M. marinum의 결과를 포함하여 비교한 그래프이고 우측 그래프는 M. paragordonae와 M. gordonae간 차이를 비교한 그래프이다.
도 4는 본원의 일 구현예에 따라 M. gordonae, M. marinum 및 M. paragordonae를 마우스에 감염시킨 후 간 및 비장을 적출, 균질화하여 7H10 고체배지에 적절 희석 배수로 도말하여 30℃에서 배양한 결과이다.
도 5는 M. paragordonae를 이용한 백신 테스트의 결과이다. 도 4a는 백신 접종 절차를 도식적으로 나타낸 것이며, 도 5b는 도 4a에 따라 M. paragordonae를 마우스 (BALB/c, 7주령, n=4) 꼬리 기저 부분에 피하주사로 2회 접종한 후 M. abscessus 연관 균주 (M. abscessus subsp. bolletii 50594)로 공격 (꼬리 정맥 주사), 각 일자별로 장기를 적출하여 장기 내 M. abscessus subsp. bolletii 50594 균의 CFU를 측정한 결과이다. 도 5c/4d는 M. abscessus subsp. bolletii 50594균 공격 후 3일, 14일째에 IFN-감마 ELISPOT을 수행한 결과이다.

본원은 느리게 자라는 암발색균인 신규한 마이코박테리아 균주 발견에 근거한 것이다.

본원에 따른 균주는 폐감염 환자에서 분리된 것으로, 16sRNA 분석, 항산성 (acid fastness) 분석, 생장 특징 및 계통분석 결과 마이코박테리아 군에 속하는 Mycobacterium gordonae에 가까운 (99.0% 서열 상동성) 균주로 판명되었다.

본원에서 분리된 균주는 형태학적으로는 Mycobacterium gordonae와 유사하나, 이와는 달리 본원의 균주는 최적 성장 온도는 25-30℃이며, 37℃에서는 자라지 않는 온도 민감성 균주인 것으로 나타났다. 또한 지질 분석, hsp65 및 rpoB에 근거한 계통분석 및 DNA-DNA 연관성 분석결과 새로운 균주로 판명되었으며, Mycobacterium paragordonae 로 명명되었으며, 2014년 7월 17일, 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 기탁번호 KCTC 12628BP로 기탁되었다.

본원에 따른 신규한 온도 민감성 마이코박테리아 M. paragordonae (strain 49061)는 마이코박테리아에 대한 감염 예방에 효과적으로 사용될 수 있으며, 따라서 한 양태에서 본원은 신규한 온도 민감성 마이코박테리아 M. paragordonae (strain 49061)를 포함하는 면역원성, 백신 또는 면역치료용 조성물에 관한 것이다.

마이코박테리아는 결핵과 같은 폐질환, 림프절염, 피부 및 연조직 감염, 골감염증 또는 파종성 질환의 원인균으로 알려져 있다. 예를 들면 거북결핵균 군 (Mycobacterium chelonae M. abscessus complex)에 속하는 마이코박테리아는 면역능이 있거나 또는 면역력이 약회된 대상체에서 면역침투성 피부 및 연조직 감염, 결핵, 혈액염증 또는 농양을 일으킨다 (Griffith DE et al., Am Rev Respir Dis. 1993;147:1271?8; Wallace RJ Jr, et al., Rev Infect Dis. 1983;5:657-79).

본원에 따른 백신은 이러한 마이코박테리아 감염증에 대한 질환에 대한 백신으로 사용될 수 있다. 일 구현예에서 NTM (nontuberculous mycobacteria), 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis) 또는 우결핵균(Mycobacterium bovis)을 포함하는 마이코박테리아의 감염에 대한 보호효과를 나타낸다. 다른 구현예에서 NTM은 예를 들면 거북결핵균 군 (Mycobacterium chelonei complex), M. avium complex (MAC), M. avium, M. intracellulrare, M. kansasii, M. abscessus, 또는 M. massiliense을 포함한다. 또한 본원의 백신이 효과가 있는 NTM은 신속발육 NTM을 포함한다.

본원에 따른 일 구현예에서 본원의 백신 조성물은 특히 거북결핵균 군 (Mycobacterium chelonae M. abscessus complex), 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis) 또는 우결핵균(Mycobacterium bovis) 등을 포함하는 마이코박테리아로 인한 질환에 대한 백신으로 사용될 수 있다.

본원에 따른 백신 조성물은 마이코박테리아에 대한 면역반응 예를 들면 항체 생산 및/또는 T-세포 반응을 유도할 수 있으며, 이에 의해 거북결핵균 군 및 결핵균, 우결핵균을 포함하는 마이코박테리아 감염을 예방하거나 또는 감염으로 인한 증상을 경감, 완화 및/또는 치료할 수 있다.

본원에 따른 조성물에 사용되는 마이코박테리아 M. paragordonae (strain 49061)는 앞서 설명한 바와 같으며, 살아있는 생균, 또는 화학적 또는 열로 사멸된 사균이 사용될 수 있다. 생균의 경우 약독화 과정을 거친 것이 사용될 수 있다. 약독화는 공지의 방법에 따라 수행될 수 있으며, 이를 통해 박테리아의 병원성을 감소시키거나 없앨 수 있다.

본원에 따른 백신 조성물은 전신 또는 국소 투여용으로 제형화 될 수 있으며, 약학적으로 가능한 부형제, 담체 및/또는 매체 예를 들면 인산완충 식염수 용액, 증류수, 수/유 에멀젼, 습윤제, 에멀젼화제, pH 조절제 등을 포함할 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

본원에 따른 백신 조성물은 또한 아주번트, 특히 T-세포 매개 반응을 촉진 또는 증가시킬 수 있는 임의의 물질 또는 화합물을 포함할 수 있다. 일 구현예에서 아주번트는 화학적 또는 열에 의해 사멸된 균이 조성물에 포함되는 경우에 사용될 수 있다. 아주번트는 당업계에 공지되어있으며, 예를 들면 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 포타슘 설페이트, 가교 폴리아크릴산 중합체, DDA (dimethyldioctadecyl-ammonium bromide), 면역 조절물질, 락토페린, 또는 IFN-gamma 유도제 등이 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 가교 폴리아크릴산 중합체는 Carbopol® 단일중합체 또는 공중합체를 포함하고, 상기 림포카인은 IFN-gamma, IL-1, IL-2 또는 IL-12를 포함하며, 상기 IFN-gamma 유도제는 poly I:C를 포함할 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다. 일 구현예에서, 합성된 당 폴리머인 상기 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스페이트, 또는 알루미늄 포타슘 설페이트는 약 0.05 내지 0.1 중량 %로 포함되고, 상기 가교 폴리아크릴산 중합체는 0.25 중량%로 포함될 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다.

본원에 따른 조성물은 국소 또는 전신 투여될 수 있으며, 일회 또는 다회 투여될 수 있으며,다양한 경로, 예를 들면 피하, 피내, 근육내 또는 정맥으로 투여되거나, 또는 경구, 비강 또는 흡입 경로로 투여될 수 있다. 본원에 따른 일 구현예에서는 근육내 주사로 일회 투여된다.

본원에 따른 백신 조성물은 투여 경로에 적합한 액상 용액 또는 현탁제로 제조되거나 또는 주사하기 전에 용액에 용해 또는 현탁되는 고형의 형태로 제형화될 수 있다.

백신의 투여량은 투여경로는 물론 환자의 연령, 체중 및/또는 건강상태에 따라 달라질 것이다. 예를 들면 적절한 투여량은 예를 들면 1 내지 10 cfu일 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1 균주 분리 및 동정

증상이 있는 폐감염 환자 유래의 가래 시료로부터 종전에 기술된 바와 같이 (Mun et al., (2008). Mycobacterium senuense sp. nov., a slowlygrowing, non-chromogenic species closely related to the Mycobacterium terrae complex. Int J Syst Evol Microbiol 58, 641-646.)와 같이 균주를 분리하였다.

분리된 균주는 연관된 균주인 Mycobacterium asiaticum ATCC 25276T 및 M. gordonae ATCC 14470T에 대하여 종전에 기술된 바와 같이 생화학분석을 수행하였다 (Kent & Kubica, (1985). Public Health Mycobacteriology: a Guide for the Level III Laboratory. Atlanta: Centers for Disease Control and Prevention.1985; Pfyffer, Mycobacterium: General characteristics,laboratory detection, and staining procedures. In Manual of Clinical C Microbiology, 9th edn, vol. 1, p. 559, 573-578. Edited by P. R.Murray, E. J. Baron, J. H. Jorgensen, M. L. Landry & M. A. Pfaller. Washington: American EX Society for Microbiology.).

요약하면 콜로니 형태, 암환경에서 색소침착, 광유도 및 다양한 온도에서의 성장여부, 니아신 축적, 나이트레이트 리덕타제, Tween 80 가수분해, 우레아제 및 피라진아미다제, TCH (thiophene-2-carboxylic acid hydrazide) 내성, PNB (p-nitrobenzoate), 5% 염화나트륨, 에탐부톨 및 피크르산 분석을 OADC (Oleic Albumin Dextrose Catalase) 로 보충된 Middlebrook 7H10 아가 플레이트에서 6주동안 배양하여 수행하였다.

결과는 표 1에 기재되어 있다.

[표 1]

표 1에서 1, 2, 3은 사용된 균주를 나타내며 다음과 같다 : 1, 본원 균주 M. paragordonae (strain 49061); 2, M. asiaticum ATCC 25276^T; 3, M. gordonae ATCC 14470^T. 부호 설명은 다음과 같다: Strong growth; ++, good growth, +, positive growth; 2, negative/no growth; ±, variable. 모든 균주는 활면 집락을 나타냈으며, 45℃에서 성장하지 않았다.

형태학적으로 구부러진 모양이 많은 막대 모양의 항산성을 나타내는 균주로 현미경적으로는 포자나 필라멘트는 관찰되지 않았다. 최적의 성장 온도는 25-30℃이며, 37℃또는 45℃에서는 성장하지 않았다. Middlebrook 7H10 아가 플레이트에서 오렌지 색의 활면 집락을 나타냈다. 피크르산을 포함하는 배지에서는 성장하지 않았으며, 우레아제 활성은 양성이었다. DNA-DNA 관련도 분석에서 가장 관련성 있는 종은 70% 미만이었다. MALDI-TOF MS를 이용한 지질 분석에서 다른 종과 상이한 것으로 나타났으며, 16S rRNA (1393 bp), rpoB (306 bp) 및 hsp65 (603 bp) 유전자에서 유니크한 서열을 갖는 것으로 나타났다 (도 1b, 1c 및 1d 참조). 또한 계통분석을 통해 분리된 균주는 느리게 자라는 마이코박테리아인 것으로 나타났다. 16sRNA는 속을 구분하며, hsp65, RPOb는 종간을 구분할 수 있는 유전자로, 16S rRNA, hsp65 유전자 염기서열은 M. gordonae와 가까웠지만 각각의 염기서열 상동성은 99%, 95.9%로 M. gordonae와는 특이적인 서열을 지니고 있었으며, rpoB 유전자 염기서열은 M. asiaticum과 가까웠지만 염기서열 상동성 95.4%로 이 또한 특이적인 염기서열을 지니고 있음을 확인할 수 있었다. (도 1a). 이러한 결과는 본원에 따른 균주가 신규한 것임을 나타내는 것이다.

본 박테리아는 Mycobacterium paragordonae로 명명되었으며 2014년 7월 17일, 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 기탁번호 KCTC 12628BP로 기탁되었다.

실시예 2 Mycobacterium paragordonae 균주의 온도 민감성 특징 확인 및 안전성 분석

생백신으로 접종할 경우의 안전성을 증명하기 위하여 다음의 실험을 수행하였다.

우선, 실제로 온도 민감성 미코박테리아 균주 (Mycobacterium paragordonae, strain 49061)가 37℃에서 자라지 않는지를 확인하기 위해 다른 비교 균주들 (M. gordonae, M. asiaticum 및 M. marinum)과 초기 접종 양을 흡광도로 동일하게 맞춘 다음, 액체 배지 (Middlebrook 7H9) 에서 30℃, 37℃ 온도에 따라 생장 여부를 시간 별로 (1, 3, 5, 7일) 흡광도(OD₆₀₀)로 측정하였다. 결과는 도 2에 기재되어 있다. 이에 나타난 바와 같이 온도 민감성 미코박테리아 M. paragordonae (strain 49061)는 정상 체온 (37℃)에 해당하는 온도에서 자라지 않았지만 그보다 낮은 온도 (30 ℃)에서는 잘 자라는 것을 확인할 수 있다.

다음으로는 감염 분석을 수행하였다. 감염 분석은 액체 배지 및 고체 배지 배양 시, M. paragordonae 균주가 37℃에서 자라지 않는 특징을 지니고 있었기 때문에, 실제 큰포식세포에 감염시켰을 때에도 온도에 따른 차이를 나타내는 지 여부를 확인하고자 한 것이다. 이를 위해 30℃와 37℃에서 대식세포 (J774 세포주, ATCC TIB-67^TM)에 균을 감염 (~1 × 10⁷, 10 M.O.I.) 시킨 후 세포를 융해한 후 (0.5% Triton X-100이 포함된 PBS를 첨가하여 파이펫팅으로 세포를 떼어냄), 7H10 고체 배지에 도말 후 30℃에서 배양한 후 생성된 콜로니 수를 계측하였다.

결과는 도 3에 기재되어 있다. 이에 나타난 바와 같이, 비교 균주와는 달리 37℃에서 감염 시켰던 M. paragordonae는 거의 자라지 않는 것으로 나타났다.

또한 인비보 실험으로 BALB/c 마우스 (7주령, n=3)에 M. paragordonae 및 비교 균주 (10⁶ CFU)를 정맥 주사하여 감염 시킨 후 간과 비장을 1, 4, 7일째에 적출, 균질화하여 인산완충용액으로 희석한 후 7H10 고체 배지에 플레이팅 후 30℃에서 배양하여 CFU를 측정하였다.

결과는 도 4a에 기재되어 있으며, 이에 나타난 바와 같이, 간 또는 비장에서 M. paragordonae의 생장을 측정한 경우, 다른 균주에 비교하여 거의 자라지 않는 것으로 나타났으며, 이는 본원 균주가 생체에 사용시 안전하다는 것을 나타낸다.

또한 인비보 실험으로 BALB/c 마우스 (7주령, n=3)에 M. paragordonae 및 비교 균주 (M. gordonae, M. marinum or M. bovis BCG)(10⁶ CFU)를 정맥 주사하여 감염 시킨 후 간과 비장을 1, 4, 7일째 (M. gordonae, M. marinum과 비교 시) 또는 1, 7, 14일째 (M. bovis BCG와 비교 시)에 적출, 균질화하여 인산완충용액으로 희석한 후 7H10 고체 배지에 플레이팅 후 30℃에서 배양하여 CFU를 측정하였다.

결과는 도 4b에 기재되어 있으며, 이에 나타난 바와 같이, 간, 폐 또는 비장에서 M. paragordonae의 생장을 측정한 경우, 다른 균주에 비교하여 거의 자라지 않는 것으로 나타났다.

실시예 3 Mycobacterium paragordonae 백신 분석

이어 백신 분석을 다음과 같이 수행하였다. 먼저 도 5a의 절차와 같이 ALB/c mouse (7 주령, n=4)에 10⁶ CFU의 M. paragordonae (strain 49061)을 꼬리에 2회 (0주 및 8주) 정맥 주사하였다. 대조군으로는 PBS와 BCG를 사용하였다. 이어 12주에 M. abscessus 연관 균주 (M. abscessus subsp. bolletii 50594) ~10⁶ CFU를 꼬리 정맥 주사하였다. 이어 3일, 14일 후에 각 장기 (간, 비장, 폐)별 M. abscessus subsp. bolletii 50594의 CFU를 실시예 2에서와 같이 측정하고 14일 후에 비장을 사용, 비장세포내에 M. abscessus subsp. bolletii 50594 균주의 전체 단백을 처리했을 때 IFN-γ를 분비하는 세포 수를 측정하기 ELISPOT을 실시하였다. 구체적으로 PVDF membrane이 있는 96 well plate에 IFN-γ 항체 (eBiosciense, Cat., 16-7313-85, 3 μg/ml)를 넣어 4℃에 하룻동안 배양하였다. 다음 날 각 웰을 세척한 후 완전 배지 (DMEM + 항생제 + 10% FBS)로 채워 37℃에 배양하였다. 각 마우스의 비장을 적출해 70 μm cell strainer로 비장세포를 얻어 각 군의 비장세포를 약 5 × 10⁵ 세포로 맞춘 후 배양시켜 놓은 PVDF가 코팅된 96 웰 플레이트의 각 웰에 추가하였다. 이어 M. abscessus subsp. bolletii 50594 전체 단백 10 μg/ml을 항원 처리 군에 처리하고, 나머지는 완전 배지로 처리하였다. 양성대조군으로 PMA (Phorbol myristate acetate) (5 ng/ml)과 iononmycin (500 ng/ml)을 처리하였다. 그 후 37℃에서 하룻동안 배양하여 다음 날 세척 후 검출 항체 (eBiosciense, Cat., 13-7311-85, 3 μg/ml)를 각 웰에 처리하였다. 이어 4℃에서 하룻동안 배양한 후 각 웰을 세척한 후, streptavidin-HRP를 처리하여 2시간 실온 배양 후 세척하고 AEC substrate 발색 키트 (Dako)를 제조자의 방법대로 사용하여 발색한 후 스폿을 확인하였다.

결과는 도 5b, 4c 내지 4d에 기재되어 있다. 도 5b의 경우, M. paragordonae를 백신 시킨 마우스 장기에서 M. abscessus subsp. bolletii 50594의 CFU가 PBS나 다른 M. gordonae 및 M. bovis BCG를 백신 시킨 마우스 장기에서 보다 낮은 CFU를 보였다. 또한 IFN-γ에 대한 ELISPOT 시행 시 M. paragordonae를 접종한 마우스에서 더 많은 spot이 관찰되었다. 백신 테스트 후 CFU 결과를 통해, M. paragordonae가 M. abscessus subsp. bolletii 50594에 대한 방어능을 부여하였음을 나타낸다.

또한 기존의 M. bovis BCG와 비교하여 M. abscessus 균주의 CFU를 더 감소시킴에 따라 M. abscessus 균주에 대한 방어능이 더 높다고 할 수 있음을 나타내는 것이다. 또한 비장세포 내 M. abscessus subsp. bolletii 50594에 대한 방어 면역 세포의 수가 M. paragordonae을 백신으로 사용한 경우 BCG 보다 많음을 ELISPOT을 통해 확인한 바, M. abscessus subsp. bolletii 50594를 포함하는 거북결핵균 군에 대한 효과적인 방어능을 부여할 수 있음을 나타낸다.

나아가 본원에 따른 백신은 자연적으로 온도에 민감한 특징을 지니기 때문에 안전성 또한 담보되며, 사람 뿐 아니라 동물에도 거북결핵균 군, 결핵 및 우결핵을 포함하는 마이코박테리아 감염증에 대한 백신으로서 효과적으로 사용될 수 있음을 나타내는 것이다.

이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

Claims

기탁번호 KCTC 12628BP의 마이코박테리움 파라고르도네 (Mycobacterium paragordonae, strain 49061) 균주.
기탁번호 KCTC 12628BP의 마이코박테리움 파라고르도네 (Mycobacterium paragordonae, strain 49061) 균주 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 마이코박테리아 감염증에 대한 백신 조성물.
제 2 항에 있어서, 상기 마이코박테리아 감영증은 NTM (nontuberculous mycobacteria), 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis) 또는 우결핵균(Mycobacterium bovis)에 의한 것인, 백신 조성물.
제 3 항에 있어서, 상기 NTM은 거북결핵균 군 (Mycobacterium chelonei complex), 마이코박테리움 아비움 컴플렉스 (M. avium complex) (MAC), 마이코박테리움 아비움 (M. avium), 마이코박테리움 인트라셀룰라레 (M. intracellulrare), 마이코박테리움 칸사시(M. kansasii), 마이코박테리움 앱세수스 (M. abscessus), 또는 마이코박테리움 매실리엔스 (M. massiliense)인, 백신 조성물.
제 2 항에 있어서,
상기 마이코박테리아 감염증은 폐질환, 림프절염, 피부연조직, 골감염증 또는 파종성 질환인, 백신 조성물.
제 2 항에 있어서,
상기 균주는 살아있거나 또는 죽은 것인, 백신 조성물.
제 2 항에 있어서,
상기 조성물은 아주번트를 추가로 포함하는 것인 백신 조성물.
제 2 항에 있어서,
상기 아주번트는 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 포타슘 설페이트, 가교 폴리아크릴산 중합체, DDA (dimethyldioctadecyl-ammonium bromide), 면역 조절물질, 락토페린, 또는 IFN-gamma 유도제 중 하나 이상인, 백신 조성물.
제 8 항에 있어서,
상기 가교 폴리아크릴산 중합체는 Carbopol® 단일중합체 또는 공중합체를 포함하고, 상기 림포카인은 IFN-gamma, IL-1, IL-2 또는 IL-12를 포함하며, 상기 IFN-gamma 유도제는 poly I:C를 포함하는 것인, 백신 조성물.
제 8 항에 있어서,
상기 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스페이트, 또는 알루미늄 포타슘 설페이트는 0.05 내지 0.1 중량 %로 포함되고, 상기 가교 폴리아크릴산 중합체는 0.25 중량%로 포함되는 것인, 백신 조성물.