KR20210146595A - 닭 전염성 코라이자의 예방용 백신 조성물 및 이의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 병원성이 높으며 혈청형이 A인 전염성 코라이자 균주 및 상기 전염성 코라이자 균주를 포함하는 전염성 코라이자의 예방, 경감 또는 치료용 백신 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 닭 전염성 코라이자 균주는 병원성이 높아 백신으로서 이용 가능하고, A형 혈청형에 의해 발생하는 전염성 코라이자에 의한 피해를 사전에 예방할 수 있다.

Description

닭 전염성 코라이자의 예방용 백신 조성물 및 이의 제조 방법{Vaccine composition for preventing against infectious coryza and method for preparation thereof}
본 발명은 닭의 전염성 코라이자 예방용 백신 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 병원성이 높으며 혈청형이 A형인 전염성 코라이자 균주를 포함하는 닭의 전염성 코라이자 예방용 백신 조성물에 관한 것이다.
전염성 코라이자는 전 세계적으로 발생하고 있으며 주로 성계, 특히 산란중인 닭에서 심각한 피해를 유발하는, 양계산업에서 매우 큰 경제적 손실을 야기하는 세균성 질병으로, 원인균은 에이비박테리움 파라갈리나룸이다. 전염성 코라이자 균은 NAD의 필요성에 따라 크게 NAD 의존성(NAD-dependent)과 NAD 비의존성(NAD-independent)으로 나눠질 수 있고, 혈청형은 페이지법(Page scheme)에 따라 세 가지 혈청형(A, B, C형)이 존재한다. 주요 임상증상으로 닭의 상부호흡기관에 감염되어 콧물이 나고 안면과 육수가 붓고 눈물을 흘리며 사료섭취 감소, 성장지연, 산란율 저하, 도태율을 증가시키는 등 심각한 경제적 피해를 일으킨다.
국내에서는 현재까지 NAD 의존형 A형에 의한 피해가 주로 보고되고 있으며 이를 예방하기 위해 표준주(221)로 구성된 사독 백신을 사용하고 있으나, 국내 양계농장에서 피해를 일으키는 전염성 코라이자에 맞는 백신 개발이 필요하다. 따라서 국내 전염성 코라이자 균의 효과적인 예방과 이에 따른 진단용 항원 생산을 위해서는 대표적인 국내 유행 균주를 선발하여 백신주로 이용하는 것이 필요한 실정이다.
등록특허공보 제1981-0002137호 공개특허공보 제10-2014-0041056호
Genotypic divergence of Avibacterium paragallinarum isolates with different growth requirements for nicotinamide adenine dinucleotide (Avian Pathology, 2020, Volume 49, No. 2, 153-160. 환절기에 다발하는 전염성 코라이자(IC)의 진단과 예방, 양계연구(KOREAN POULTRY RESEARCH), 2020년 4월, No. 361, 102-104.
위와 같은 문제점을 해결하기 위해 본 발명의 목적은 병원성이 높은 닭 전염성 코라이자 균주를 제공하는 것이다.
또한, 상기 닭 전염성 코라이자 균주를 포함하는 전염성 코라이자의 예방용 백신 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 상기 백신 조성물을 닭에 접종하여 전염성 코라이자 감염을 예방하거나 증상을 경감, 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 닭 전염성 코라이자 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 닭 전염성 코라이자 균주를 포함하는 닭 전염성 코라이자의 예방용 백신 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 백신 조성물을 닭에 접종하여 닭 전염성 코라이자를 예방하거나 증상을 경감, 치료하는 방법을 제공한다.
상기 균주는 에이비박테리움 파라갈리나룸(Avibacterium paragallinarum)이며, 제한되는 것은 아니나 바람직하게는 NAD 의존형일 수 있고, 병원성이 높은 균주일 수 있다.
또한, 상기 균주의 혈청형은 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 A형일 수 있다.
상기 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열은 서열번호 1의 서열을 포함하고, hagA 유전자 염기서열은 서열번호 2의 서열을 포함한다.
상기 균주는 바람직하게는 수탁번호 KCTC18818P를 갖는 에이비박테리움 파라갈리나룸(Avibacterium paragallinarum) 균주이다.
본 발명의 전염성 코라이자 균주는 단독으로 사용할 수도 있으나, 당 업계에서 제제 시 일반적으로 사용하는 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 면역 증강제(adjuvant), 부형제, 첨가제 등을 추가적으로 더 포함하여 백신 조성물로 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, "닭 전염성 코라이자는 모든 일령의 닭에서 발병하는 양계산업에서 매우 큰 경제적 손실을 일으키는 세균성 전염병으로, 주요 임상증상으로 눈과 코에서 분비물 배출, 안와하동의 종대로 인한 안면부종, 재채기, 성장지연, 산란율 저하 (10∼40%) 등이 있다.
본 발명에 있어서, '백신'은 감염증의 예방으로 사람이나 동물을 자동적으로 면역하기 위하여 쓰이는 항원을 지칭하는 것으로, 본 발명의 백신은 약독화된 생독 백신, 불활화 백신, 사독 백신, 서브유닛 백신, 합성 백신 또는 유전공학 백신일 수 있으나, 불활화 백신인 것이 바람직하다. 생균 백신의 경우 백신 내 균주의 병원성 복귀와 같은 부작용의 염려가 존재하는 바, 불활화 백신을 이용하는 것이 부작용의 염려가 없어 보다 바람직하다.
본 발명에 따른 백신 조성물은 당 업계에서 제제화하는데 통상적으로 사용될 수 있는 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 약학적으로 허용 가능한 부형제는 허용 가능한 또는 편리한 투약 형태를 제조하기 위한 약물, 제제 또는 결합 분자와 같은 활성 분자로 조합되는 불활성 물질을 의미한다. 약학적으로 허용 가능한 부형제는 비독성이거나, 적어도 독성이 사용된 용량 및 농도에서 수용자에게 이의 의도된 용도를 위해 허용될 수 있는 부형제이고, 약물, 제제 또는 결합 분제를 포함하는 제형화의 다른 성분과 양립할 수 있다.
본 발명의 백신 조성물 투여 방식은 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 피하 투여, 근육 내 투여의 방법으로 투여될 수 있다.
또한, 상기 투여 시 각 투여 방식에 절절한 제형으로 제제화되어 투여될 수 있으며, 제제화는 당 업계에서 널리 알려져 있는 방법으로 제제화될 수 있다.
상기 백신 조성물은 제한되지는 않지만 바람직하게는 본 발명에 따른 에이비박테리움 파라갈리나룸 균주가 108 cfu/수 내지 109cfu/수로 포함될 수 있다. 상기 범위 미만이면 백신으로서의 효능이 나타나지 않을 수 있고, 상기 범위를 초과하게 되는 경우 백신 부작용을 일으킬 수 있다.
본 발명의 백신 조성물의 투여량은 제한되지는 않지만 바람직하게는 0.1 내지 1.0 ㎖, 더욱 바람직하게는 개체 당 0.5 ㎖로 투여될 수 있다. 상기 투여량은 본 발명에 따른 에이비박테리움 파라갈리나룸 균주가 개체 당 108 cfu 내지 109cfu 투여될 수 있도록 조절할 수 있다.
상기 백신 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 면역 증강제 (adjuvant)를 포함할 수 있으며, 수의용으로 제형화되어 다양한 경로로 투여될 수 있다. 예를 들어 상기 백신 조성물은 경구형 또는 비경구형 제제로 제조할 수 있고, 바람직하게는 비경구형 제제인 주사제로 제제화되어 투여될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 백신 조성물은 단독으로 닭 전염성 코라이자 백신으로 사용할 수도 있고, 다른 바이러스(예를 들면 뉴캣슬병 바이러스, 조류인플루엔자 바이러스, 닭 전염성 기관지염 바이러스, 전염성 F낭병 바이러스, 닭 뇌척수염 바이러스, 산란 저하 증후군 바이러스), 세균(예를 들면 대장균, 살모넬라 엔테라이티디스, 살모넬라 갈리나룸, 마이코플라스마 갈리셉티쿰, 마이코플라스마 시노비애) 및 원충(예를 들면 류코싸이토준 카울레리, 아이메리아 테네라, 아이메리아 멕시마)에 대한 백신으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 적어도 1 종류의 백신과 조합하는 것에 의해 혼합 백신으로서 사용할 수도 있다.
또한 본 발명은 상기 A 혈청형 코라이자 균주를 유효성분으로 포함하는 전염성 코라이자 예방, 경감 또는 치료용 백신 조성물을 제공할 수 있으며, 상기 백신 조성물을 이용하여 닭 전염성 코라이자 병을 예방, 경감 또는 치료하는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 닭 전염성 코라이자 균주는 병원성이 높아 이를 백신으로서 이용할 수 있고, 특히 NAD 의존형 A 혈청형에 의해 발생하는 전염성 코라이자 균에 의한 피해를 사전에 예방할 수 있다.
도 1a 및 도 1b는 국내 분리 전염성 코라이자 균주 26주의 유전적 상관성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 표준주 및 대표 국내분리주의 ERIC-PCR 패턴을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 코라이자 균주의 16S rRNA 염기서열을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 코라이자 균주의 hagA 유전자 염기서열을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
예비 실험예 1. 국내 닭 전염성 코라이자 균 특성 분석 및 백신 후보주 선발
1-1. 국내 닭 전염성 코라이자 균의 혈청형 동정
국내 닭 전염성 코라이자 균의 혈청형 분포를 분석하기 위하여, 2011년부터 2019년까지 닭에서 분리한 26주의 전염성 코라이자 균주(에이비박테리움 파라갈리나룸)의 특성 분석을 실시하였다(사용된 균주는 표 2 참조). 대부분 균주들은 초콜릿 한천 플레이트에서 배양하였고, 균주 15AQ160은 배양을 위해 표피포도알균(Staphylococcus epidermidis)을 십자형 배양하였다. 접종된 한천 플레이트는 37℃에서 5% CO2 하에서 24-48시간 동안 배양하였다.
페이지 혈청형 분류(Page serotyping)에 따라 혈청형 A에 대한 기준 항혈청 A (0083), B (0222) 및 C (Modesto)를 사용하여 혈구 응집 억제 (HI) 테스트를 수행하여 혈청형을 동정한 결과, 혈청형 A형 균주가 20주(22/26, 약 85%)이고 혈청형 동정이 불가한 균주가 총 4주(14PC, 14Woori, 15AQ160, 15YH)(4/26, 약 15%)임을 확인하였다(표 1).
1-2. 국내 닭 전염성 코라이자 균의 생화학적 특성분석
국내 닭 전염성 코라이자 균의 혈청형 분포를 분석하기 위하여, 2011년부터 2019년까지 닭에서 분리한 26주의 전염성 코라이자 균주의 특성 분석을 실시하였다. 국내 전염성 코라이자 26주는 모두 그램 음성, 카탈라아제(catalase) 음성이었고, MacConkey agar에서 자라지 않았다. 일반적인 코라이자 균의 성장조건에 해당하는 V 인자 (Nicotineamide Adenine Dinucleotide-NAD) 의존성 여부는 23개 분리주가 NAD 의존형인 반면, 3개 분리주(14PC, 14Woori, 15YH)가 NAD에 비의존형으로 나타났으며, NAD 비의존형 균주는 세균집락이 의존형에 비해 크며, 혈액배지에서 자라는 특성을 보였다. 또한 일반적으로 전염성 코라이자 균주는 초콜릿 배지에서 Staphylococcus균주 없이도 잘 크지만, NAD 의존형 분리주 중 한 주(15AQ160)는 보통(serum: 1%, NAD: 0.0025%)보다 높은 영양 요구 조건을 필요로 하여, 초콜릿배지에서도 Staphylococcus균 주위에 집락을 형성하였다. 국내 코라이자 분리주에 대한 탄수화물 발효 반응에서, 모든 균주는 글루코스, 슈크로오스, 만니톨, 소르비톨, 만노스에서 산을 생성한 반면, 갈락토오스, 락토오스, 트레할로스에서는 48시간 내에 산(acid) 생성 반응이 일어나지 않았다. 또한, 변이주에서는 말토스와 자일로스(Xylose)에서 일반적인 NAD 요구하는 균주와 차이를 보였다.
표 1, 2는 국내 분리 전염성 코라이자 균주(n=26)에 대한 혈청형 동정 및 생화학적 특성에 대한 표이다.
전염성 코라이자 국내분리주(n=26)에 대한 혈청형 동정 및 생화학적 특성
혈청형 분리주의 수 NAD
의존성		 호기
증식성		 당 분해능
Maltose Xylose Biochemicala biovar
A 22 +b - + - I
혈청형 동정 불가(Non
-typeable)		 1 + - + + II
3 - + +/- + II, III
a: 앞선 연구에서 정의한 대로 (Blackall 등. 1989)
b: +, 양성 결과; -, 음성 결과; +/-, 양성 또는 음성 결과
1-3. 국내 전염성 코라이자균주의 유전적 상관성 분석
국내 전염성 코라이자 균주 중 백신 후보주를 선발하기 위해, 국내 닭 전염성 코라이자 균 26주의 유전자 2종(16S rRNA, hagA)에 대해 유전적 특성 분석을 실시하였다. 이를 위해 Vector NTI Advance v10.3.1 (Invitrogen), BioEdit v7.2.5, Mega v6.06 프로그램을 이용하여 분리주의 계통분석(phylogenetic analysis)을 실시하였고, 구체적인 방법은 다음과 같다;
상용 키트(DNeasy® Blood & Tissue Kit, QIAGEN, Hilden, Germany)를 사용하여 분리주로부터 DNA를 얻었다. 16S 리보솜 RNA(rRNA) 및 헤마글루티닌 항원(hagA) 유전자의 PCR 증폭은 시판 키트 [Platinum® Taq DNA Polymerase High-Fidelity(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)]를 사용하여 기존의 방법(Lane, 1991과 Hobb 등, 2002)을 약간 변형하여 진행하였다. 즉, 프라이머 27f(5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3', 서열번호 3) 및 1492r (5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3', 서열번호 4)을 사용하여 16S rRNA 유전자를 PCR 증폭시켰고, PCR은 다음과 같이 수행하였다: 95℃에서 5분 동안 초기 변성하고; 이어서 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 68℃에서 90초 조건으로 35회 사이클 진행하였고 68℃에서 10분 동안의 최종 연장하였다. hagA 유전자는 프라이머 HA8 (5’-AAGCTTTTATTTTAGATTTATTG-3’, 서열번호 5) 및 HA11 (5'-CGCACGGCATTGATATTGTG-3', 서열번호 6)을 사용하여 증폭시켰고, PCR 조건은 다음과 같이 수행하였다: 95℃에서 5분 동안 초기 변성; 이어서 95℃에서 30초, 50℃에서 30초, 및 68℃에서 90초 조건으로 30 사이클을 진행하였고 최종 연장은 68℃에서 10분 동안 진행하였다. PCR 생성물은 아가로스 겔 전기영동 후, 겔 추출 키트 [QIAquick®gel extraction kit(QIAGEN, Hilden, Germany)]를 사용하여 추출하였다. 시퀀싱 반응은 PRISM BigDye Terminator v3.1 사이클 시퀀싱 키트 (Applied Biosystems, Foster City, USA)를 사용하여 수행되었고 ABI Prism 3730XL DNA 분석기 (Applied Biosystems)를 사용하여 분석되었다.
또한 유전적 상관성 분석을 위해 기존의 방법(Soriano 등, 2004)을 약간 변형하여 ERIC-PCR(enterobacterial repetitive intergenic consensus polymerase chain reaction)을 실시하였고, 구체적인 과정은 다음과 같다;
DNA 추출을 위해, 초콜릿 배지 플레이트에서 자란 균주를 0.5 ㎖의 뉴클레아제 없는 물 (QIAGEN, Hilden, Germany)로 수확하여, 3 회의 비등(각각 5 분) 및 얼음 냉각 (각각 2 분)을 수행한 후, 샘플을 12,000g에서 5분 동안 원심 분리하고, 상청액을 ERIC-PCR 반응에 사용하였다. 기존의 논문(Versalovic 등, 1991)을 참고로 하여 ERIC-2 (5’-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3’, 서열번호 7) 및 ERIC-1R (5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′, 서열번호 8) 프라이머를 사용하고 AccuPower® PCR PreMix 키트 (Bioneer, 대전, 한국)의 MgCl2 농도를 3 mM로 조정 후 PCR을 실시하였으며, PCR 조건은 다음과 같았다: 94℃에서 5분 동안 초기 변성을 진행하고; 이어서 94℃에서 1분, 52℃에서 1분 및 72℃에서 6분 조건으로 35회 사이클하고; 72℃에서 10분 동안의 최종 연장하였다. 증폭은 아가로스 겔 전기 영동으로 확인하였다.
상기 실험 결과를 도 1a, 도 1b, 도 2 및 표 3에 나타내었다.
구체적으로 도 1a는 전염성 코라이자 16S rRNA에 대한 유전적 상관성 분석결과이며, 도 1b는 전염성 코라이자 hagA 유전자에 대한 유전적 상관성 분석 결과이다. 도 2에서 A는 전염성 코라이자 표준주 11주에 대한 ERIC-PCR 패턴을 보여주는 실험결과이다. 분리주와 차이를 보이고 있으며, 번호는 다음을 표시한다. M, 1kb DNA ladder marker; 1, 0083; 2. 221; 3. 2403; 4. E-3C; 5 HP14 ; 6. 2671; 7. 222; 8. H18 ; 9. SA-3 ; 10. Modesto; 11, HP60. B는 국내 전염성 코라이자 분리주의 6가지 ERIC-PCR 패턴 분석 결과이며, 번호는 다음을 표시한다: M, 1kb DNA ladder marker; 12, 변이주 14PC(패턴 II ); 13, 변이주 14Woori(패턴 III); 14.변이주 15YH (패턴 VI); 15, 변이주 15AQ160 (패턴 IV); 16.Yesan (패턴 I) ; 17. UHS (패턴 I); 18, 13AD001 (패턴 I); 19, 14FM (패턴 I) ; 20, 15R019 (패턴 I); 21, 16AD002 (패턴 I); 22, 음성대조. C는 2015년 전형적인 국내 분리주에서 보이는 2가지 ERIC-PCR 패턴 분석결과이며, 번호는 다음을 표시한다. 23: 15R019(pattern I); 24, 15AQ163(pattern V), 25, 15R022(pattern I); 26, 15SJ(pattern I); 27, 15IM(pattern I).
유전자 분석결과(도1a, 도1b, 표 2), 변이주와 다르게 전형적인 분리주(n=22)는 동일한 계통 발생 클러스터(phylogenetic cluster)를 형성하였으며, 16S rRNA와 hagA 유전자 각각에서 99.9%와 100%의 상동성을 보였다. 또한 도 2에서 보여주듯이 변이주를 제외한 Yesan주 등의 전형적인 코라이자 국내 분리주는 주요 A형 백신주인 221주와 다르게 나타났으며, 국내 분리주끼리는 거의 동일한 ERIC-PCR 패턴을 나타냈다.
전염성 코라이자 국내분리주의 특성 분석
번호 균주명 분리연도 혈청형 NADa 요구도 생화학적 유형 ERIC-PCR 유전형 계통 발생 군
16S rRNA hagA
1 Yesan 2011 A + I I I I
2 UHS 2012 A + I I I I
3 12AD080 2012 A + I I I I
4 12-235 2012 A + I I I I
5 12-242 2012 A + I I I I
6 13AD001 2013 A + I I I I
7 13AQ039 2013 A + I I I I
8 14AD032 2014 A + I I I I
9 14PC b 2014 NT b - II II III III
10 14Woori b 2014 NT b - III III III II
11 14HDS 2014 A + I I I I
12 14Seosin 2014 A + I I I I
13 14FM 2014 A + I I I I
14 15R019 2015 A + I I I I
15 15AQ160 b 2015 NT b ++ II IV II II
16 15AQ163 2015 A + I V I I
17 15R022 2015 A + I I I I
18 15YH b 2015 NT b - III VI II II
19 15SJ 2015 A + I I I I
20 15IM 2015 A + I I I I
21 16AD002c 2016 A + I I I I
22 16CB 2016 A + I I I I
23 16TR 2016 A + I I I I
24 16NE 2016 A + I I I I
25 19KR 2019 A + I I I I
26 19AD037 2019 A + I I I I
a, NAD = nicotinamide adenine dinucleotide; +, NAD 요구; -, NAD 비요구; ++, NAD 일반적인 요구 수준을 초과함
b, 혈청형이 동정되지 않는 변이주는 밑줄로 표기, NT=non-typeable
상기 실험결과를 종합해보면 본 발명의 전염성 코라이자 Yesan 균주는 국내에서 유행하는 전염성 코라이자 균주, 외국에서 유행하는 전염성 코라이자 균주와 본 발명에 따른 코라이자 균주의 16S rRNA 유전자, hagA 유전자 염기서열 분석을 통한 계통분석 및 ERIC-PCR유전형 비교 분석한 결과, 국내에서 유행하는 닭 전염성 코라이자 균주는 및 외국에서 유행하는 전염성 코라이자 균주와 분명한 유전적 차이가 있음을 확인하였다.
따라서, 국내 유행하는 A형 닭 전염성 코라이자 균은 국내발생 변이주와 구분되는 유전적 특징을 가지고 있으며, 동일한 유전적 그룹으로 판단된다.
예비 실험예 2. 전염성 코라이자 백신 후보주 병원성 분석
전염성 코라이자 국내 분리주의 병원성을 직접적으로 비교하기 위하여, 6주령 SPF(specific pathogen free) 닭을 대상으로 닭 전염성 코라이자 균 5주(Yesan, 14PC, 14Woori, 15AQ160, 15YH)를 안와하동으로 공격 접종(108cfu/수)을 수행하여 병원성을 확인하였다. 그 결과를 표 3에 나타내었다.
NAD 의존성이 다른 국내 전염성 코라이자 공격접종 후 임상증상 및 균 분리율 조사
그룹 공격접종주 균주 특성 임상증상*(%) 안와하동에서 균주 재분리율* (%)
1 14PC 혈청형 비동정 변이주 0/8 (0) 0/8 (0)
2 14Woori 혈청형 비동정 변이주 0/8 (0) 1/8 (12.5)
3 15YH 혈청형 비동정 변이주 0/8 (0) 0/8 (0)
4 15AQ160 혈청형 비동정 변이주 0/8 (0) 1/8 (12.5)
5 Yesan A형의 전형적인 균주 8/8 (100) 8/8 (100)
* 양성 수/총 닭의 수
표 3에 나타낸 바와 같이, SPF 닭에서 국내분리 전염성 코라이자 균주(n=5)를 안와하동으로 접종하여 실험기간(7일간) 임상증상을 관찰한 결과, 전형적인 코라이자 균주(Yesan)주에서 100%의 높은 임상증상과 균 분리율을 보였다. 따라서 Yesan 균주가 상대적으로 높은 병원성을 나타냄을 확인하였다.
따라서 국내 분리 닭 전염성 코라이자 균은 혈청형 주로 A형에 의한 병원성이 확인되었고 유전적으로도 병원성이 없는 변이주와 구분됨이 확인되었다. 또한 외국에서 유행하는 전염성 코라이자 균주와 본 발명의 Yesan주에 대한 유전적 상관성 분석을 16S rRNA, hagA 유전자 염기서열로 비교 분석하였다. 분기점 수치는 부트스트랩 값으로 복제 1,000회당 확률(%)이고, 막대자의 길이(0.001)는 1,000 뉴클레오타이드 당 1개 뉴클레오타이드 치환을 의미한다.
도 1a, 1b 및 표 1, 2 에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 전염성 코라이자 균주 Yesan주는 국내에서 유행하는 전형적인 닭 전염성 코라이자 균주와 생화학적 및 유전적으로 유사하며 및 외국에서 유행하는 전염성 코라이자 균주와 분명한 유전적 차이가 있음을 확인하였다.
따라서 상기 예비 실험예 2에서 닭에서 병원성이 확인된 Yesan 균주를 선발하고 상기 균주의 16S rRNA 염기 서열과 hagA 유전자 염기서열을 각각 서열번호 1과 도 3, 서열번호 2과 도 4에 나타내었다. 이후, 상기 균주를 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 2020년 4월 16일자에 기탁한 후, 균주는 수탁번호 KCTC18818P를 부여받았다
따라서, 본 발명의 혈청형 A형 전염성 코라이자 Yesan주는 병원성이 높음을 확인하여 불활화 백신으로 유용할 수 있음을 확인하였다.
실시예 1. 백신의 제조
초코릿 배지(Chocolate agar plate)에 전염성 코라이자 균주 Yesan (혈청형 A)을 37℃ 5% CO2 조건에서 48시간 배양한 후, 하나의 콜로니를 취하여 TM/SN 배지(broth) 100㎖에 12시간 배양하였다. 포름알데히드를 최종 0.25%가 되도록 첨가하여 전염성 코라이자 균주를 불활화시켰다. 불활화 이후 고체배지에 발라 완전히 불활화 되었는지 확인하였다. 수산화 알루미늄겔(Rehydragel® LV)을 이용하여 25% 겔백신을 제조하여 최종 백신 내 불활화균액이 2×109 CFU/㎖ 되도록 백신을 제조하였다.
실험예 1. 백신의 효능 평가
본 발명의 방어능을 평가하기 위해 5주령 SPF 닭을 10수씩 나누어, 한 그룹은 백신을 접종하지 않고, 나머지 두 그룹은 각각 상기 실시예에서 제조한 겔 백신을 109 CFU/수 되도록 10수에 0.5㎖씩 근육 접종하였다. 백신 접종 4주 후, Yesan (108 CFU/수)를 안와하동으로 공격접종하고, 공격접종 후 10일 동안 임상증상(안면부종, 콧물 등)을 매일 관찰하였다. 10일 후 안락사하여 안와하동에서 균분리율을 비교하였고, 결과는 표 4에 나타냈다. 실험 결과, Yesan주를 이용한 불활화 백신 그룹은 대조군보다 낮은 임상증상 및 균 분리율을 확인하였으며, 본 발명의 닭 전염성 코라이자 균주 Yesan(혈청형 A)는 백신 조성물로서 우수함을 확인하였다.
A형 전염성 코라이자 백신후보주의 면역원성조사
그룹 백신그룹 접종 수 공격접종† 임상증상‡(%) 안와하동에서
균주 재분리율‡ (%)
1 14PC 10 Yesan 10/10 (0) 9/10 (90)
2 14Woori 10 Yesan 10/10 (0) 10/10 (100)
3 15YH 10 Yesan 10/10 (0) 9/10 (90)
4 Yesan 10 Yesan 0/10 (0) 0/10 (0)
5 Control 10 Yesan 10/10 (100) 10/10 (100)
† 수당 108CFU의 공격 균주를 안와하동 내에 접종
‡ 양성 수/ 접종 수
한국생명공학연구원 KCTC18818P 20200416
<110> Animal and Plant Quarantine Agency <120> Vaccine composition for preventing against infectious coryza and method for preparation thereof <130> 20-11609 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1466 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S rRNA sequence of Avibacterium paragallinarum <400> 1 agattgaacg ctggtggcag gcttaacaca tgcaagtcga acggtaacgg gttgaaagct 60 tgctttcgac gctgacgagt ggcggacggg tgagtaatgc ttgggaatct ggcttatgga 120 gggggataac cattggaaac gatggctaat accgcataga atcggaagat taaagggtgg 180 gactttttgc cacctgccat aagatgagcc caagtgggat taggtagttg gtggggtaaa 240 ggcctaccaa gcctgcgatc tctagctggt ctgagaggat ggccagccac actgggactg 300 agacacggcc cagactccta cgggaggcag cagtggggaa tattgcgcaa tggggggaac 360 cctgacgcag ccatgccgcg tgaatgaaga aggccttcgg gttgtaaagt tctttcagtg 420 gtgaggaagg ttggtgtgtt aatagcacac tgatttgacg ttagccacag aagaagcacc 480 ggctaactcc gtgccagcag ccgcggtaat acggagggtg cgagcgttaa tcggaataac 540 tgggcgtaaa gggcacgcag gcggtaaatt aagtgagatg tgaaatcccc gagcttaact 600 tgggaattgc atttcagact ggtttactag agtactttag ggaggggtag aattccacgt 660 gtagcggtga aatgcgtaga gatgtggagg aataccgaag gcgaaggcag ccccttggga 720 agctactgac gctcatgtgc gaaagcgtgg ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt 780 ccacgctgta aacgctgtcg atttggggat tgggctttag gcttggtgcc cgtagctaac 840 gtgataaatc gaccgcctgg ggagtacggc cgcaaggtta aaactcaaat gaattgacgg 900 gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgatg caacgcgaag aaccttacct 960 actcttgaca tcctaagaag aactcagaga tgagtttgtg ccttcgggag cttagagaca 1020 ggtgctgcat ggctgtcgtc agctcgtgtt gtgaaatgtt gggttaagtc ccgcaacgag 1080 cgcaaccctt atcctttgtt gccagcactt cgggtgggaa ctcaaaggag actgccagtg 1140 ataaactgga ggaaggtggg gatgacgtca agtcatcatg gcccttacga gtagggctac 1200 acacgtgcta caatggtgca tacagaggga agcgagcctg cgagggggag cgaatctcag 1260 aaagtgcatc taagtccgga ttggagtctg caactcgact ccatgaagtc ggaatcgcta 1320 gtaatcgcaa atcagaatgt tgcggtgaat acgttctcgg gccttgtaca caccgcccgt 1380 cacaccatgg gagtgggttg taccagaagt agatagctta accttcggga gggcgtttac 1440 cacggtataa ttcatgactg gggtga 1466 <210> 2 <211> 1035 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hagA gene sequence of Avibacterium paragallinarum <400> 2 atgaaaaaaa ctgcaatcgc attagtaatc gctggtttaa ctgccgcgtc agtagcacaa 60 gctgcaccac aagcaaatac tttctatgct ggtgcaaaag cgggctgggc atctttccac 120 gatggtttaa accaatttga aaactcacaa aatgcatatg gtacattgcg taattctgta 180 acttatgggg tgtttggtgg ttatcaaatt actgataatt ttgctgttga gctaggttat 240 gatgactttg gacgtgcgaa acttcgtcaa gacggtgaaa ctgttggaaa acatacaaat 300 cacggggctc atttaagctt aaaagcaagt tatccagtgc ttgaaggatt agatgtttat 360 gctcgcgttg gagctgcgtt aattcgttct gattataaac caactaaaag agcagcccct 420 aatgagacgc acgaacatag cttaaaagtt tctccagtgt ttgctggtgg cttagagtat 480 aacttaccat cattaccaga acttgcatta cgtgttgaat atcaatgggt gaataaagta 540 gggcgttggg aaaaagatgg tagccgtgta gattatacac caagcatcgg ttctgtaact 600 gctggtttat cttaccgttt tggccaaagt gcaccagttg ttgaacctaa ggttgttgca 660 aaaacatttg cattaaattc agacgttact ttcgcatttg gtaaagcaaa tttacgtcca 720 gaagcacaaa atgtattaga cggtatttat ggtgaaatcg cacagttaaa atcagtacaa 780 gtagatcttg ctggttatac tgaccgtatt ggtagcgaag cagccaactt aaaattatca 840 caacgtcgtg ctgacactgt ggctaactac ttagtttcta aaggtgttgc tcaagaagtg 900 atttcttcaa caggttatgg tgaagcgaac ccagtaactg gtgcgaaatg tgatgcggtt 960 aaaggtcgca aagcattaat cgcttgttta gcagacgatc gtcgtgtaga aatctcagtt 1020 aaaggtaacg agtaa 1035 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 27f primer <400> 3 agagtttgat cmtggctcag 20 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1492r primer <400> 4 tacggytacc ttgttacgac tt 22 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HA8 primer <400> 5 aagcttttat tttagattta ttg 23 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HA11 primer <400> 6 cgcacggcat tgatattgtg 20 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ERIC-2 primer <400> 7 aagtaagtga ctggggtgag cg 22 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ERIC-1R primer <400> 8 atgtaagctc ctggggattc ac 22

Claims (8)

  1. 서열번호 1의 16S rRNA 염기 서열을 갖는 에이비박테리움 파라갈리나룸(Avibacterium paragallinarum) 균주.
  2. 제1항에 있어서, 상기 균주는 서열번호 2의 hagA 유전자를 갖는 것을 특징으로 하는 에이비박테리움 파라갈리나룸(Avibacterium paragallinarum) 균주.
  3. 제1항에 있어서, 상기 균주는 기탁번호 KCTC18818P를 갖는 것을 특징으로 하는 에이비박테리움 파라갈리나룸(Avibacterium paragallinarum) 균주.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 균주를 유효성분으로 포함하는 전염성 코라이자의 예방용 백신 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 백신 조성물은 상기 균주를 108 cfu/수 내지 109cfu/수 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 전염성 코라이자의 예방용 백신 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 상기 균주는 불활화되어 포함되는 것을 특징으로 하는 전염성 코라이자의 예방용 백신 조성물.
  7. 제4항에 있어서, 상기 백신 조성물은 피하 주사 또는 근육 내 주사로 투여되는 것을 특징으로 하는 전염성 코라이자의 예방용 백신 조성물.
  8. 제4항의 백신 조성물을 닭에 접종하여 전염성 코라이자를 예방하는 방법.
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KR20140041056A (ko) 2012-09-27 2014-04-04 전북대학교산학협력단 유전자 최적화 닭 인터페론 알파 및 닭 인터류킨 １８을 발현하는 약독화 살모넬라 균주의 혼합물을 포함하는 상승적 면역 증강용 조성물

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Genotypic divergence of Avibacterium paragallinarum isolates with different growth requirements for nicotinamide adenine dinucleotide (Avian Pathology, 2020, Volume 49, No. 2, 153-160.
환절기에 다발하는 전염성 코라이자(IC)의 진단과 예방, 양계연구(KOREAN POULTRY RESEARCH), 2020년 4월, No. 361, 102-104.

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