KR20070092290A

KR20070092290A - 파스퇴렐라 멀토시다 백신

Info

Publication number: KR20070092290A
Application number: KR1020077016568A
Authority: KR
Inventors: 유강 루오; 폴 버메이; 안토니어스 아르놀더스 크리스티안 제이콥스
Original assignee: 인터벳 인터내셔널 비.브이.
Priority date: 2004-12-22
Filing date: 2005-12-21
Publication date: 2007-09-12
Also published as: MX2007007570A; AU2005331860A1; EP1831248B1; BRPI0519381A2; JP4981684B2; CN101087803B; ATE491720T1; WO2006122586A1; EP1831248A1; AU2005331860B2; ZA200705087B; DE602005025404D1; CN101087803A; US20100062017A1; RU2415926C2; US8309101B2; CA2591624A1; RU2007128047A; JP2008523840A

Abstract

본 발명은 종 파스퇴렐라 멀토시다 종의 약독화 생 박테리아, 상기 약독화 생 박테리아를 포함하는 약독화 생 백신, 상기 백신의 제조를 위한 상기 박테리아의 용도, 상기 백신의 제조 방법 및 상기 박테리아의 검출을 위한 진단 검사에 관한 것이다.

파스퇴렐라 멀토시다, 약독화, 생 박테리아, 백신

Description

파스퇴렐라 멀토시다 백신{PASTEURELLA MULTOCIDA VACCINE}

본 발명은 파스퇴렐라 멀토시다 종의 약독화 생 박테리아, 상기 약독화 생 박테리아를 포함하는 약독화 생 백신, 상기 백신의 제조를 위한 박테리아의 용도, 상기 백신의 제조 방법 및 상기 박테리아의 검출을 위한 진단 검사에 관한 것이다.

그람-음성 박테리아 파스퇴렐라 멀토시다는 100년 넘는 동안 몇몇 동물 종에서 질병의 유발 요인으로 알려져 왔다. 파스퇴렐라 멀토시다는 가금류의 닭 콜레라, 소의 출혈성 패혈증 및 돼지의 위축성 비염을 유발한다고 알려져 있다. 또한 인간의 병원균으로서 그것의 중요성은 지난 60년간 점점 더 명확해졌다.

오직 1종의 파스퇴렐라 멀토시다가 있다. 아종(subspecies)이 존재하지 않는다. 그럼에도 불구하고, 협막 항원(capsular antigen)과 LPS 항원의 차이점을 기준으로 구분할 수 있다. 5개의 파스퇴렐라 멀토시다 군 A-E는 협막 항원을 기준으로 정의되고, 16개의 균체 혈청형(somatic serotypes)은 LPS 항원을 기반으로 정의된다. 병원성 또는 병독성은 균주(strains)의 LPS 혈청형 또는 협막 항원 군에 의해 영향을 받지 않는다. 상기 협막 항원 군은 단지 어떠한 특정 균주의 숙주 동물을 결정한다.

닭 콜레라를 유발하는 균주는 주로 협막 항원 군 A에 속한다. 두 종류의 질 병: 급성 및 만성 닭 콜레라가 알려져 있다. 급성 닭 콜레라의 증상은 우울증, 주름진 깃털, 열, 식욕감퇴, 점막 배출(muscosal discharge) 및 호흡 증가이다. 점상(petechial) 출혈 및 반상(ecchymotic) 출혈, 전신 수동적 출혈 및 복수 증가 및 심막액 증가와 같은 장애(lesions)가 종종 나타난다. 만성적으로 감염된 새들에게서 나타나는 질병의 증상은 대개 국소 감염과 연관이 있다. 아랫볏(wattles), 구멍(sinuse), 골막 피하 조직(periorbital subcutaneous tissues), 다리 또는 날개 골절의 종창(swelling)이 종종 나타난다. 삼출성 결막염(exudative conjunctivitis) 및 인두염(pharyngitis)도 종종 나타난다. 만성적으로 감염된 새들의 장애는 일반적으로 섬유화농성 삼출액(fibri nosuppurative exudates), 국소적 괴사(focal necrosis) 및 결합 조직 증식으로 특성화된다.

소 및 물소뿐 아니라 돼지, 양, 염소, 사슴 및 낙타에서 출혈성 패혈증을 유발하는 균주는 주로 B 및 E 협막 항원 군에 속한다. 출혈성 패혈증은 빠른 진행, 머리, 목, 가슴 부의의 부종성 종창(edematous swelling), 부은 림프절과 출혈성 림프절 및 다수의 장막하 점상 출혈의 존재에 의해 특성화되는 급성 질병이다.

돼지에서, 파스퇴렐라 멀토시다는 위축성 비염 및 폐렴을 일으킨다. 이러한 증후군들은 주로 협막 A형 및 D형에 의해 유발된다. 또한 급성 패혈증의 경우는 협막 B형에 의해 유발된다고 알려져 있다. 위축성 비염과 연관된 임상 징후들은 재채기, 콧물, 주둥이(snout)의 단축 및 꼬임, 폐렴 및 성장 지연이다. 폐렴은 주로 1차 장애의 심각성이 증가된 2차 감염으로서 나타난다. 임상 징후들은 마른 기침(dry non-productive cough)을 포함하는데, 이는 가래 기침(productive)이 될 수 있고, 심한 경우에 체온 상승을 포함한다.

원칙적으로, 파스퇴렐라 멀토시다에 대하여 백신접종(vaccination)을 할 때 파스퇴렐라 멀토시다 감염을 예방하기 위한 두 가지 접근: 사독(박테린)의 백신접종 및 약독화 생 백신의 백신접종이 있다. 박테린은 제조하는 것이 저렴하기 때문에 경제적 장점이 있다. 하지만 그것들은 주사되어야 하며, 종종 심각한 조직 반응을 유발하고, 또한 높은 챌린지 압력(high challenge pressure)이 박테린 백신접종을 한 동물에서 질병 급증(outbreaks)을 일으킬 수 있고, 최악의 경우 단지 동종의(homologous) 혈청형에 대해서만 예방을 한다. 이와 반대로, 약독화 생 백신의 백신접종은 동종 혈청형에 대해서 뿐 아니라 이종의(heterologous) 혈청형에 대해서도 우수한 교차 예방(cross-protection)을 한다. 그러므로, 이러한 백신들은 선택적인 백신인 것처럼 보이나, 생 백신의 사용과 관련하여 두 가지 심각한 단점이 있다: 첫째, 현재 사용중인 파스퇴렐라 멀토시다 종의 약독화 생 백신 균주는 불명확하다: 그들의 약독화 행동(behavior)의 특성이 알려지지 않았다. 그러므로, 항상 병독성으로 역전(reversion)될 위험이 있다.

그리고 둘째, 사용한 생 백신 균주가 원인일 수 있는 파스퇴렐라증(pasteurellosis)을 발병시킨다. 상기 발병에 대한 가능한 원인은 사용된 백신 균주의 병독성으로 역전 또는 불충분한 수준의 약독화 일 수 있다.

그러므로, 효능 있고 안전한 파스퇴렐라 멀토시다 종의 약독화 생 백신이 확실히 필요하며, 상기 백신은 파스퇴렐라 멀토시다 감염 또는 이의 영향에 대한 예방을 제공해야하는 동시에 병독성으로 쉽게 역전하지 않는 약독화를 해야한다.

본 발명의 목적은 이러한 요구를 달성하는 파스퇴렐라 멀토시다 종의 약독화 생 균주를 제공하는 것이다.

놀랍게도, 균주의 면역 반응성을 손상시키지 않고 결실되는 동시에 박테리아의 병독성을 극적으로 감소시킬 수 있는 Oef-15 유전자로도 불리는 지금까지 알려지지 않은 파스퇴렐라 멀토시다의 신규한 유전자를 발견하였다. 야생형(wild tyle) 파스퇴렐라 멀토시다에서 상기 유전자의 존재는 특정 협막 항원 군 또는 균체 혈청형으로 제한되지 않는다. 상기 유전자는 협막 항원 군 또는 균체 혈청형에 상관없이 파스퇴렐라 멀토시다 균주에 존재한다: 그것은 모두 16개의 균체 혈청형 및 모두 5개의 협막 항원 군에서 발견된다.

그러므로, 상기 유전자는 파스퇴렐라 멀토시다에서 보편적인 약독화 대상이며, 이제 최초로 파스퇴렐라 멀토시다 관련 질병에 대한 안전한 백신의 제조가 가능한 것이다. 그러므로, 이러한 접근법은 예를 들어, 파스퇴렐라 멀토시다 감염 또는 이의 영향에 대하여 인간을 보호하는 백신, 닭 콜레라에 대하여 가금류를 보호하는 백신, 위축성 비염에 대하여 돼지를 보호하는 백신 및 출혈성 패혈증에 대하여 소와 물소를 보호하는 백신의 제조에 동등하게 적합하다.

더욱이, Orf-15 유전자를 소실한(missing) 파스퇴렐라 멀토시다 종의 약독화 생 균주는 그들의 동종의 혈청형에 대한 매우 우수한 예방뿐 아니라 이종의 혈청형에 대한 매우 우수한 교차 예방을 제공한다는 것을 발견하였다.

그러므로, 본 발명의 제1 구체예는 작용성 Orf-15 단백질을 발현할 수 없는 파스퇴렐라 멀토시다 종의 약독화 생 박테리아에 관한 것이다. 신규한 오픈 리딩 프레임(open reading frame) Orf-15 유전자의 서열은 서열 번호 1에 제시하였고, 그것을 암호화한 Orf-15 단백질은 서열 번호 2에 제시하였다.

작용성 Orf-15 단백질은 야생형 파스퇴렐라 멀토시다로서 완전한 병독성을 유발할 수 있는 Orf-15 단백질로 이해해야 한다.

그러므로, 적어도 이 능력이 불완전한 파스퇴렐라 멀토시다 균주는 작용성 Orf-15 단백질을 발현할 수 없는 것으로 간주한다. 야생형 파스퇴렐라 멀토시다 균주와 비교했을 때 병독성의 감소를 초래하는 Orf-15 유전자의 임의의 돌연변이, 예컨대 삽입 대치 또는 결실 돌연변이는 본 발명의 범주 내에 속하는 것으로 간주한다.

본 발명의 목적을 위한 균주의 병독성 감소는 두 가지 방식으로 정의한다. 병독성 감소의 한가지 정의는 치명적 감염에 대한 예방 수준에 관한 것이다: 조절된 조건하에서 파스퇴렐라 멀토시다 야생형 균주에 대한 칠면조의 감염은 50% 이상의 사망률(mortality)을 나타낸다(실시예 부분 참조). 본 발명에 따른 Orf-15 유전자의 돌연변이로 인해 감소된 병독성을 가진 파스퇴렐라 멀토시다 균주는 동일한 조건하에서 10% 이하 수준의 사망률을 나타내는 균주이다.

병독성 감소의 다른 정의는, 야생형 파스퇴렐라 멀토시다로 준치사(sub-lethal) 감염과 비교했을 때 백신접종 후 장애의 정도 및 심각성에 관한 것이다. 따라서, 병독성 감소의 제2 정의에 따르면, 파스퇴렐라 멀토시다 균주가 야생형 파스퇴렐라 멀토시다 균주에 대한 감염에 의해 야기된 장애 수준의 30% 이하인 수준의 장애를 일으키는 경우에 감소된 수준의 병독성을 가진다.

따라서, 파스퇴렐라 멀토시다 균주가, 예컨대 전술한 병독성 감소의 두 가지 정의 중 적어도 하나에 따른 병독성 감소를 유도하는 Orf-15 유전자의 돌연변이 또는 상기 Orf-15 유전자에 의해 암호화된 단백질의 발현에 관여하는 제제(하기 참조)를 갖는다면, 그것은 본 발명의 범주 내에 속하는 것으로 간주한다.

상기의 돌연변이는 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합일 수 있으며, 돌연변이가 작용성 Orf-15의 발현 실패를 초래하도록 제공한다. (침묵 돌연변이, 예컨대 코돈 CTC 내지 CTT의 돌연변이는 Orf-15 단백질에 영향을 주지 않으므로 작용성 Orf-15 단백질 발현 실패를 초래하지 않는다. 따라서, 본 발명의 목적을 위해 그러한 돌연변이는 고려하지 않는다).

일반적으로, 돌연변이는 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 대치 또는 결실일 것이다. 특히 3으로 나눌 수 없는 뉴클레오티드 수의 삽입 또는 결실은 프레임 이동을 초래하고, 번갈아 넌센스 암호를 초래한다. 그 결과, 감소된 작용성을 갖거나 또는 전혀 작용성이 없는 불완전한(truncated) Orf-15 단백질이 합성될 것이다.

오픈 리딩 프레임에서 돌연변이를 도입하는 여러 가지 방법들이 공지되어 있다. 상기 돌연변이를 얻는 한가지 가능한 방법은 염기 유사체와 같은 돌연변이 유발제(mutagenic agents)로 야생형 박테리아 처리, 자외선 처리 및 온도 처리와 같은 고전적인(classical) 방법이다. 하지만, Orf-15 돌연변이체의 선별(selection)은 꽤 시간이 걸리는 작업이다.

더욱이, 고전적인 돌연변이 기술에 의해 야기된 돌연변이의 특성은 알려지지 않았을 것이다. 이것은 결국 야생형으로 복귀될 수 있는 Orf-15 유전자의 점 돌연변이일 수 있다. 이 작은 위험(risk)을 피하기 위해서, 트랜스포존 돌연변이유발(transposon mutagenesis)은 좋은 대안이 될 것이다. 또한, 트랜스포존 돌연변이유발에 의해 돌연변이체를 만드는 것은 당업계에 공지된 기술이다. 이것은 염색체의 국소화된 부위에서 수행된 돌연변이의 일종이다. 따라서, P. 멀토시다의 안정한, 독성이 없는, 면역성의, 트랜스포존 조절된 돌연변이체를 제조할 수 있다. 트랜스포존 조절된 돌연변이체들은 박테리아 게놈(genome) 안으로 삽입된 트랜스포존을 갖는 것들이다.

"트랜스포존"은 광범위한 DNA 서열 상동(homology)을 요구하지 않는 비동종의 재조합 공정, 전위에 의해 DNA 분자 안으로 삽입될 수 있는 DNA 요소(element)이다. 트랜스포존은 대개 트랜스포존의 말단에서 DNA를 자르고 대상 DNA 안으로 트랜스포존을 삽입하는 트랜스포사아제(transposases)라고 불리는 전위 효소를 암호화하는 유전자를 포함한다. 또한, 트랜스포존은 대개 트랜스포존이 삽입된 돌연변이체의 선별에 사용될 수 있는 항생제 내성균주(antibiotic resistance)를 암호화하는 표지(marker) 유전자를 함유한다. 알려진 트랜스포존은 Tn3, Tn5, Tnpho A, Tn7, Tn9, Tn10, 및 이의 작용성 단편들을 포함한다(Mobile DNA, eds. D.E.Berg and M.M.Howe, ASM Press, 1989). 단지 예로서; Tn10 트랜스포존이 당업계에 매우 잘 공지된 것으로서 Lee(Lee, M.D.,Henk, A.D., Veterinary Microbiology, 50, 1996, 143-1480)에 의해 기술된다. 트랜스포존 삽입 돌연변이체는 당업계에 공지된 표준 방법에 의해 제조될 수 있다(Mobile DNA, eds. D.E.Berg and M.M.Howe, ASM Press, 1989). Orf-15 트랜스포존 돌연변이체의 선별은 Orf-15의 3'-말단 및 5'-말단 부분에 위치한 프라이머를 사용하는 PCR이 트랜스포즌 삽입이 Orf-15 유전자 또는 그외에서 위치되는지를 직접 보여주기 때문에 더 용이하고 시간이 덜 소모될 것이다.

신중하기보다는 임의로 선지정된(predetermined) 부위에서 돌연변이를 Orf-15 안으로 도입하는 더 더욱 명쾌한 가능성을 재조합 DNA 기술, 보다 구체적으로는 특정 위치 돌연변이유발(site-directed mutagenesis)에 의해 제공한다. 이러한 돌연변이는 삽입, 결실, 하나의 뉴클레오티드를 다른 하나로 대치 또는 이들의 조합이 또 있을 수 있으며, 이는 돌연변이 유전자가 더 이상 작용성 Orf-15를 암호화하지 않는다는 유일한 조건을 가진다. 예를 들어, 이러한 돌연변이는 다수의 염기쌍의 결실에 의해 제조될 수 있다. 프레임 이동을 초래하는 단일 염기 쌍 결실과 같은 매우 작은 결실조차도 Orf-15 비 작용성을 충분히 부여할 수 있다. 보다 바람직하게는, 더 긴 범위(stretch), 예를 들어 10, 50 이상의 염기 쌍이 제거된다. 더 더욱 바람직하게는, 전체 Orf-15 유전자가 결실된다.

특정 위치 돌연변이유발을 통한 Orf-15 음성 돌연변이체의 구성(construction) 기술은 공지된 표준 기술이다. 예를 들어, 그것들은 특정 위치 돌연변이유발, 제한 효소 절단(restriction enzyme digestion), 재결찰(religation) 또는 PCR 접근에 의해 유전자 서열을 변경하는 Orf-15 유전자의 클로닝 및 돌연변이체 유전자로 야생형 Orf-15 유전자의 연속적인 대치(대체형질 교환 또는 대체형질 대치)를 말한다. 플라스미드에서 Orf-15 유전자의 클로닝, 숙주 균주에서 제한 효소에 의한 유전자의 절단, 엔도뉴클레아제 처리, 재결찰 및 동종의 재조합과 같은 표준 재조합 DNA 기술은 공지된 기술로서, Maniatis/Sambrook(Sambrook, J. et al. Molecular cloning: a labortory manual. ISBN 0-87969-309-6)에 기재되어 있다. 예를 들어, 특정 위치 돌연변이는 Clontech 제품인 Transformer^® 키트를 사용하여 생체 외 특정 위치 돌연변이유발에 의해 제조할 수 있다. PCR 기술은 문헌[Dieffenbach & Dreksler; PCR primer, a laboratory manual. ISBN 0-87969-447-3 및 ISBN 0-87969-447-5]에 광범위하게 기재되어 있다.

전술한 바와 같이, 작용성 Orf-15 단백질을 발현할 수 없는 파스퇴렐라 멀토시다 종의 약독화 생 박테리아의 구성을 위한 가장 일반적인 방법은 Orf-15 유전자의 돌연변이에 의존한다. 하지만 작용성 Orf-15 단백질을 발현할 수 없는 파스퇴렐라 멀토시다 종의 약독화 생 박테리아를 제조하는 대체 방안이 있다. 이 대체 방안은 Orf-15 단백질을 암호화하는 메신저 RNA(messenger RNA)와의 상호작용에 관한 것이다. 단백질의 발현은 두 단계 과정으로서, DNA의 전사를 통한 Orf-15 mRNA를 생성하는 단계 및 이 mRNA를 Orf-15 단백질로 번역하는(translation) 후속 단계를 포함한다. 박테리아에서 예컨대 Orf-15-특이적 dsRNA, Orf-15-특이적 짧은 간섭 RNA 또는 Orf-15-특이적 안티센스 RNA와 같은 특정 유형의 RNA 존재는 Orf-15 mRNA와 간섭하여, Orf-15 mRNA가 야생형의 상당한 Orf-15 단백질로 번역되는 것을 막는다. 이 메카니즘 또는 이러한 메카니즘을 기반으로 하는 RNAs는 일반적으로 RNAi로서 알려진다. 그러므로, 예를 들어 Orf-15-특이적 siRNA, dsRNA 또는 Orf-15-특이적 안티센스 RNA의 존재는 Orf-15 유전자의 돌연변이와 동일한 효과를 가지며; 이러한 박테리아는 작용성 Orf-15 단백질을 발현할 수 없을 것이다.

유전자의 침묵을 위한 안티센스 RNA의 사용은 이미 수십년 동안 알려져 왔고, 현재 약 5년간 통상적으로 사용된 RNAi(예를 들어, dsRNA 또는 siRNA)는 당업계에 공지된 잘-확립된 기술이다. 이 주제에 대한 재고(reviews)는 문헌[Harmon, G.J. in Nature 418: 244 -251 (2002)] 및 문헌[Deni, A.M. and Harmon, GJ. in TRENDS in Biochemical Sciences 28: 196-201 (2003)]에 기재되어 있다. 유전자 침묵에서 siRNA의 사용을 기술하고 있는 다른 논문들은 문헌[Bertrand, J.R. et al., in B.B.R.C.296: 1000-1004 (2002)] 및 문헌[Sorensen, D.R.. et al., in J. MoI. Biol. 327: 761-766 (2003)]이다. 포유동물에서 바이러스의 침묵을 위한 RNAi의 사용이 최근에 제시되었고, Quan-Chu Wang 외(World J. Gastroenterol. 9: 1657 -1661 (2003))에 의해 재고되었다.

일반적으로 말하자면, 당업자는 아마 제1 접근법; Orf-15 유전자에서 돌연변이 제조에 약간의 선호도를 가질 것이다. 이것은 임의의 RNA-간섭계 방법과 반대로 유전자의 돌연변이는 세포 안으로 임의의 첨가 유전 물질을 가져다주지 않는다는 사실때문이다.

그러므로, 본 구체예의 바람직한 형태는 Orf-15 유전자의 돌연변이로 인해 작용성 Orf-15 단백질을 발현할 수 없는 약독화 생 박테리아에 관한 것이다.

결실 또는 삽입, 특히 아웃 오브 프레임(out-of-frame) 돌연변이는 Orf-15 단백질의 작용성에 막대한 영향력을 미칠 것이다.

그러므로, 본 구체예의 보다 바람직한 형태에서 돌연변이는 삽입 및/또는 결실을 포함한다. 가장 바람직한 형태에서, 전체 Orf-15 유전자 또는 적어도 그것의 코딩 유전자가 결실된다.

Orf-15 유전자는 프로모터 영역 및 리보솜 결합 부위뿐 아니라 코딩 서열을 포함한다. 프로모터 부위는 적어도 서열 번호 1의 뉴클레오티드 22-71을 포함하는 영역을 포함하는 한편, 리보솜 결합 부위는 뉴클레오티드 92-96을 회전한다. 그러므로 임의의 돌연변이가 프로모터 또는 리보솜 결합 부위를 비효과적으로 만드는 것은 당연한 것이며, 따라서 그 결과 Orf-15의 감소된 발현 또는 비-발현은 또한 본 발명의 범주에 속하는 것으로 간주한다.

오늘날, 애완동물 및 가축에게 상당량의 백신을 투여해야 한다면, 백신접종 비용의 경감 측면에서라도, 다른 종류의 백신을 혼합 투여하는 것이 바람직할 것이다. 그러므로 약독화 생 박테리아를 다른 병원성 미생물 또는 바이러스로부터 선택되는 항원을 암호화하는 이종의 유전자의 재조합 담체로서 사용하는 것은 매우 바람직하다. 이러한 재조합 담체의 투여는 둘 이상의 질병에 대하여 동시에 면역성을 유도한다는 장점을 가진다. 본 발명에 따른 약독화 생 박테리아는 그들의 약독화 행동으로 인해 이종의 유전자에 매우 적합한 담체를 제공한다.

그러므로, 본 구체예의 더 더욱 바람직한 형태는 인간 및/또는 동물에게 병원성인 미생물 및 바이러스의 군으로부터 선택된 하나 이상의 항원을 암호화하는 이종의 유전자를 보유하는 본 발명에 따른 약독화 생 박테리아에 관한 것이다.

삽입 부위로서 Orf-15 유전자의 사용은 Orf-15 유전자를 불활성화하는 동시에 새롭게 도입된 이종의 유전자를(동종의 박테리아 유전자와 협력하여) 발현시킬 수 있는 부가적인 장점을 가진다.

그러므로, 본 구체예의 또 더 더욱 바람직한 구체예는 Orf-15를 암호화하는 유전자에 이종의 유전자가 삽입되는 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 파스퇴렐라 멀토시다 종의 약독화 생 박테리아에 관한 것이다.

상기 이종의 유전자는 파스퇴렐라 멀토시다 RNA 폴리머라제에 의해 인지된 동종의 프로모터 또는 임의의 다른 프로모터를 보유할 수 있다. 본래의 Orf-15 프로모터 또한 사용할 수 있다. 이것은 ORF-15 코딩 서열을 삭제하고 선택된 이종의 유전자로 그것을 대체함으로써 가장 용이하게 배열할 수 있다.

이러한 재조합 담체의 구성은 전술한 표준 분자 생물학 기법을 사용하여 통상적으로 할 수 있다.

본 구체예의 하나의 가장 바람직한 형태에서, 이종의 유전자는 돼지 생식기 호흡기 증후군(PRRS) 바이러스, 가성광견병 바이러스(Pseudorabies virus), 돼지 인플루엔자 바이러스, 돼지 파르보바이러스(Porcine Parvovirus), 전염성 위장염 바이러스(Transmissible Gastroenteritis virus), 로타바이러스(rotavirus), 돼지 써코바이러스(Porcine Circovirus) 1 또는 2, 에세리키아 콜라이(Escherichia coli), 에리시펠로트릭스 류시오파티애(Erysipelothrix rhusiopathiae), 보르데텔라 브론치셉티카(Bordetella bronchiseptica), 헤모필러스 파라수스(Haemophilus parasuis), 마이코플라즈마 하이오뉴모니애(Mycoplasma hyopneumoniae) 및 스트렙토코커스 수스(Streptococus suis)로 이루어지는 돼지 병원체의 군으로부터 선택된 하나 이상의 항원을 암호화한다.

본 구체예의 다른 가장 바람직한 형태에서, 이종의 유전자는 소 허피스 바이러스(Bovine Herpesvirus), 소 바이러스성 설사병(bovine Viral Diarrhoea) 바이러스, 파라인플루엔자 3형 바이러스(Parainfluenza type 3 virus), 소 파라믹소바이러스(bovine paramyxovirus), 구제역 바이러스(Foot and Mouth Disease virus), 파스퇴렐라 헤몰리티카(Pasteurella haemolytica), 스태필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 에세리키아 콜라이, 스태필로코커스 우베리스(Staphylococcus uberis), 소 합포성 폐렴 바이러스(Bovine Respiratory Syncytial Virus), 테일레리아 파르바(Theileria parva), 테일레리아 안눌라타(Theileria annulata), 쇠바베스열원충(Babesia bovis), 텍사스바베스열원충(Babesia bigemina), 큰바베스열원충(Babesia major), 트리파노소마 종(Trypanosoma species), 아나플라즈마 마지날레(Anaplasma marginale), 아나플라즈마 센트랄레(Anaplasma centrale) 또는 네오스포라 캐니넘(Neospora caninum)으로 이루어지는 소 병원체의 군으로부터 선택된 하나 이상의 항원을 암호화한다.

본 구체예의 또 다른 가장 바람직한 형태에서, 이종의 유전자는 계두 바이러스(Fowlpox virus), 전염성 기관지염 바이러스(Infecious Bronchitis Virus), 전염성 낭병(Infectious Bursal Disease)(Gumboro), 마렉병 바이러스(Marek's Disease Virus), 닭 빈혈성 인자(Chicken Anaemia agent), 조류 레오바이러스(Avian Reovirus), 마이코플라즈마 갈리셉티쿰(Mycoplasma gallisepticum), 칠면조 비기관염 바이러스(Turkey Rhinotracheitis virus), 헤모필루스 파라칼리나룸(Haemophilus paragallinarum), 수두바이러스(Chicken Poxvirus), 닭 뇌척수염 바이러그(Avian Encephalomyelitis virus), 오리 페스트 바이러스(Duck Plague virus), 뉴캐슬 병 바이러스(Newcastle Disease virus), 산란 저하 증후군 바이러스(Egg Drop syndrome virus), 전염성 후두기관지염 바이러스(Infectious Laryngotracheitis virus), 칠면조의 허피스 바이러스(Herpes Virus of Turkeys), 에이메리아 종(Eimeria species), 오르니토박테리움 리노트라키아(Ornithobacterium rhinotracheale), 마이코플라즈마 시노비에(Mycoplasma synoviae), 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens), 살모넬라 종(Salmonella species) 및 E. 콜라이로 이루어지는 가금류 병원체의 군으로부터 선택된 하나 이상의 항원을 암호화한다.

다른 바람직한 가능성은 사이토카인, 인터루킨 또는 인터페론과 같은 면역계의 시작에 관여하는 단백질을 암호화하는 유전자 또는 면역 조절에 관여하는 다른 유전자를 Orf-15 유전자에 삽입하는 것이다.

예상치 못한 생체 내에서의 약독화되었지만 면역원성인 특성으로 인해, 본 발명에 따른 박테리아는 약독화 생 백신의 주성분으로서 매우 적합하다.

따라서, 본 발명의 다른 구체예는 파스퇴렐라 멀토시다 감염 또는 이의 병원성 영향에 대하여 동물 또는 인간의 보호를 위한 약독화 생 백신에 관한 것으로서, 이것은 본 발명에 따른 약독화 생 박테리아 및 약학적 허용 담체를 포함한다.

상기 백신은 본 발명의 따라 면역학적 유효량의 약독화 생 박테리아를 포함한다. 면역학적 유효량이란 백신접종에 투여된 약독화 생 박테리아의 양이 박테리아의 병독성 형태에 대하여 효과적인 면역반응을 숙주 내에 유도하기에 충분한 양을 의미한다.

전술한 면역학적 유효량의 약독화 생 박테리아 외에도, 본 발명에 따른 백신은 또한 약학적 허용 담체를 함유한다. 상기 담체는 단순히 물이거나, 또한 예를 들어 박테리아가 배양된 배양액을 포함할 수 있다. 예를 들어, 다른 적합한 담체는 생리적 염농도의 용액이다.

투여되어야 하는 유효 투여량은 백신접종되는 동물, 연령, 체중, 투여 방식 및 백신접종하고자 하는 병원균의 유형에 따라 다양하다. 하기 실시예는 적합한 투여량의 예를 나타낸다. 당업자는 이러한 수치들을 다른 동물 종에 추정할 수 있다.

백신은 효과적인 면역 반응을 자극하기에 충분한 임의 투여량의 박테리아를 포함할 수 있다. 10² 미만의 약독화 생 박테리아 투여량은 면역계를 충분히 자극하기에 항상 성공적인 것은 아니며, 10¹⁰이상의 약독화 생 박테리아 투여량은 경제적인 관점에서 매우 바람직하지는 않다. 10³ 내지 10⁹ 박테리아 범위의 투여량이 대개는 매우 적합한 양이다.

선택적으로, 면역 보강제 활성을 갖는 하나 이상의 화합물을 백신에 첨가할 수 있다. 본 발명에 따른 파스퇴렐라 멀토시다 종의 약독화 생 박테리아는 효능을 위해 상기의 면역 보강제를 반드시 필요로 하는 것은 아니지만, 특히 본 발명에 따른 파스퇴렐라 멀토시다 종의 약독화 생 박테리아 및 다른 병원성 바이러스 또는 미생물로부터의 항원 물질(하기 참조)을 포함하는 조합 백신에 있어서 면역 보강제를 첨가하는 것은 보람이 있을 수 있다.

면역 보강제는 면역계의 비특정 자극제이다. 그것들은 백신에 대한 숙주의 면역 반응을 강화시킨다. 당업계에 공지된 면역 보강제의 예는 프로이드의 완전 및 불완전 면역 보강제, 비타민 E, 비이온성 블록 중합체(non-ionic block polymers), 뮤라밀 디펩티드(muramyl dipeptides), ISCOMs(면역 자극 복합체, 예를 들어 European Patent EP 1099 42 참고), 사포닌, 미네랄 오일, 식물성 오일, 및 카보폴(Carbopol)이다.

특히 점막 적용에 적합한 면역 보강제는 예컨대 E. 콜라이 열 민감 독소(LT) 또는 콜레라 독소(CT)이다.

다른 적합한 면역 보강제들은 예컨대 수산화 알루미늄, 인산 알루미늄 또는 산화 알루미늄, 오일-에멀젼(예를 들어 BayolF^(R) 또는 Marcol52^(R)), 사포닌 또는 비타민-E 가용체이다. 상기 면역 보강제의 사용은 다른, 바이러스성 또는 하부단위(subunits) 백신을 첨가하는 경우, 예컨대 파스퇴렐라 멀토시다 조합 백신의 경우에 특히 바람직하다.

그러므로, 본 구체예의 바람직한 형태에서, 본 발명에 따른 약독화 생 백신은 면역 보강제를 포함한다. 본 발명에서 유용한 약학적 허용 담체 또는 희석제의 다른 예는 SPGA, 탄수화물(예를 들어, 소르비톨, 만니톨, 전분, 수크로즈, 글루코오스, 덱스트린)과 같은 안정화제, 알부민 또는 카제인과 같은 단백질, 소 혈청 또는 탈지분유와 같은 제제를 함유하는 단백질 및 완충제(예를 들어, 인산염 완충제)를 포함한다.

특히 상기 안정화제를 백신에 첨가하는 경우에, 상기 백신은 동결건조에 매우 적합하다. 동결건조법은 동결건조된 물질이 -20 또는 심지어 -80℃ 이하에서 저장과 같은 특성화된 저장 조건들을 요구하지 않는다는 장점을 가진다.

그러므로, 본 구체예의 더 바람직한 형태에서, 약독화 생 백신은 동결건조 형태이다.

전술한 바와 같이 본 발명에 따른 박테리아를 포함하는 백신에서, 인간 또는 동물에게 병원성인 미생물 또는 바이러스에서 유래된 항원 또는 상기 항원에 대한 항체를 포함하는 것이 바람직하다.

이러한 백신을 얻는 여러 가지 방법들이 있다. 한가지 용이하게 적용가능한 접근법은 다른 인간 또는 동물 병원체의 하나 이상의 항원 및 약학적 허용 담체와 본 발명에 따른 파스퇴렐라 멀토시다 종의 약독화 생 균주를 혼합하는 것이다.

따라서, 본 구체예의 더 더욱 바람직한 형태는 인간 및/또는 동물에게 병원성인 바이러스 및 미생물의 군으로부터 선택된 하나 이상의 항원을 또한 포함하는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 약독화 생 백신에 관한 것이다.

바람직하게는, 상기 항원은 전술한 돼지, 소 또는 가금류 병원체부터 선택된다.

본 발명의 또 다른 구체예는 백신에 사용하기 위한 본 발명에 따른 약독화 생 박테리아에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 구체예는 파스퇴렐라 멀토시다 박테리아에 의한 감염 또는 감염의 병원성 영향에 대하여 인간 또는 동물의 보호용 백신의 제조를 위한 본 발명에 따른 약독화 생 박테리아의 용도에 관한 것이다.

동물 또는 인간에게 투여하기 위해, 본 발명에 따른 백신은 비내 투여, 피내 투여, 경피 투여, 경구 투여, 에어로졸 투여 또는 근육내 투여될 수 있다. 가금류에게 투여하는 경우에, 그러한 투여 경로가 용이하다면 경구(식수), 분무 및 점안 투여가 특히 적합하다.

현재 존재하는 파스퇴렐라 멀토시다 백신, 특히 파스퇴렐라 멀토시다 종의 약독화 생 백신으로 백신접종하기 위해 행하는 방법과 눈에 띄게 다르지 않기 때문에 당업자는 본 발명에 따라 백신을 투여하는 법을 알 것이다. 본 발명에 따른 백신은, 특히 가금류에 대해서 사용될 때 식수를 통한 경구 투여 또는 분무에 의해 투여되는 것이 바람직하다.

본 발명의 또 다른 구체예는 본 발명에 따른 백신의 제조 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 본 발명에 따른 약독화 생 박테리아와 약학적 허용 담체를 혼합하는 단계를 포함한다.

파스퇴렐라 멀토시다에 의해 유발된 질병들은 대체로 매우 전염성이라는 사실을 볼 때, 동물에서 파스퇴렐라 멀토시다 감염의 초기 검출을 위한 빠르고 쉬운 도구, 진단 검사를 갖는 것은 매우 바람직하다.

상기 진단 검사는 초기 검출을 제공해야하고 파스퇴렐라 멀토시다에 특이적이어서 다른 박테리아가 다른 파스퇴렐라 종이거나 파스퇴렐라 종이 아닌 것에 관계없이 다른 박테리아와의 거짓 양성 반응을 하지 않아야 한다는 의미에서 빠르고 선택적이어야 한다.

파스퇴렐라 멀토시다에 대한 항체의 존재 또는 부재를 기준으로 하는 진단 검사는 종종 신뢰할 수 있기는 하나, 박테리아의 초기 검출이 필요한 경우에는 매우 바람직하지는 않다. 이것은 파스퇴렐라 멀토시다에 대해 감염된 동물에서 항체의 발생(development)이 2주 내에 용이하게 시작할 수 있기 때문이다.

그러므로, 본 발명의 다른 목적은 파스퇴렐라 멀토시다의 초기 그리고 특이적 검출을 위해 적합한 진단 도구를 제공하는 것이다.

놀랍게도 Orf-15 유전자 서열이 파스퇴렐라 멀토시다에서 유일하고, 다른 파스퇴렐라씨애(Pasteurellaceae)에 존재하지 않는다는 것을 발견했다.

그러므로, 다른 구체예는 파스퇴렐라 멀토시다의 검출을 위한 RNA- 또는 DNA-계 검사에 관한 것이다.

파스퇴렐라 멀토시다의 검출을 위한 진단 검사는, 예컨대 특이적 프로브(probe)와 시험할 동물로부터 분리한 DNA 또는 RNA와의 반응을 토대로 하거나, 또는 그것은 예컨대 Org-15 유전자 서열을 토대로 하거나 상기 서열에 상보적인 핵산 서열을 토대로 하는 (RT-)PCR 검사이다. 본 발명에 따른 파스퇴렐라 멀토시다 관련 단백질에 특정한 핵산 분자들이 동물에 존재하면, 이것들은 예컨대 특정한 PCR-프라이머에 특이적으로 결합하고 이어서 (RT-)PCR 반응에서 증폭된다. 이후에 PCR-반응 산물은 DNA 겔 전기영동에서 용이하게 검출할 수 있다. (RT-)PCR 반응들은 문헌(하기 참고문헌 참조)에 공지되어 있다. 상기 핵산 분자들은 시험할 동물의 체액의 영향받은 조직으로부터 대부분 용이하게 분리시킬 수 있다.

돼지에서, 영향받은 폐 조직에서 얻은 물질의 코 스웝은 (RT-)PCR 검사에 적합한 물질을 제공한다. 영향받은 간, 폐 또는 심장 조직으로부터 얻은 호흡기(trachea) 스웝은 닭에서 바람직한 공급원이 된다. 물소, 양 및 소에서, 선택되는 기관은 코 및 영향받은 폐 조직이다.

표준 PCR 교본은 본 발명에 따른 Orf-15 유전자에 특이적인 핵산 분자와 선택적인 PCR 반응을 위한 프라이머의 길이를 결정하는 방법을 제공한다. 적어도 12개의 뉴클레오티드의 핵산 서열을 가진 프라이머를 종종 사용하나, 15개 이상, 보다 바람직하게는 18개의 뉴클레오티드가 다소 보다 선택적이다. 특히 적어도 20, 바람직하게는 적어도 30개의 뉴클레오티드 길이를 가진 프라이머가 매우 일반적으로 사용가능하다. PCR 기술들은 문헌[Dieffenbach & Dreksler; PCR primers, a laboratory manual. ISBN 0 -87969-447-5 (1995)]에 광범위하게 기재되어 있다.

Orf-15 유전자의 핵산 분자 또는 적어도 12, 바람직하게는 15, 더욱 바람직하게는 18, 더 더욱 바람직하게는 20, 22, 25, 30, 35 또는 40개의 뉴클레오티드 길이를 가지는 이러한 핵산 분자들의 일부, 또는 그것과 상보적인 핵산 분자들은 또한 본 발명의 일부이다. 상기 핵산 분자들은 예를 들어 본 발명에 따른 단백질을 암호화하는 핵산의 양을 증가시키기 위해서 (RT-)PCR 반응에서 프라이머로 사용할 수 있다. 이것은 예컨대 전술한 바와 같이 조직에서 파스퇴렐라 멀토시다의 검출을 위한 진단 도구로서 사용하기 위해 특정 뉴클레오티드 서열을 빠르게 증폭시킨다.

PCR-반응 및 유전자 교잡 반응(hybridisation)은 둘 다 당업계에 공지된 것이며 Maniatis/Sambrook (Sambrook, J. et al. Molecular cloning: a laboratory manual. ISBN 0 - 87969-309-6)에 잘 기재되어 있다.

따라서, 본 발명의 다른 구체예는 파스퇴렐라 멀토시다 관련 DNA 또는 RNA의 검출을 위한 진단 검사에 관한 것으로서, 상기 검사는 그것이 서열 번호 1에 제시한 핵산 서열을 갖는 핵산 분자 또는 상기 핵산 서열에 상보적인 핵산 분자, 또는 적어도 1, 2, 바람직하게는 적어도 15, 더욱 바람직하게는 적어도 18개의 뉴클레오티드를 갖는 이의 단편을 포함하는 특색있는 성질을 가진다.

실시예 1

P-1059의 자발적인 날리딕스산 저항성 돌연변이체의 선별

Luria-Bertani(LB) 배양액에서 37℃에서 밤새 파스퇴렐라 멀토시다 균주를 배양하였다. 0.2 ㎎/㎖의 배양물을 날리딕스산 10 ㎎/㎖을 함유하는 LB 아가(agar) 평판 상에 펼치고 37℃에서 48시간 동안 배양했다. 한 쌍의 저항성(resistant) 콜로니를 골라 다시 닐리딕스산 함유 LB 아가 평판에 스트리킹하였다. 다른 48시간 배양 후, 한 개의 저항성 콜로니를 골라 20 ㎎/㎖의 날리딕스산을 함유하는 10 ㎖의 LB 배양액에 접종시키고(inoculated) 밤새 배양했다. 상기 배양물을 5 ㎖의 글리세롤과 혼합한 후, 1.8 ㎖ 튜브에 나누고(튜브 당 1 ㎖) -70℃에서 저장하였다. 날리딕스산 저항성 균주를 P-1059NR로 정하였다.

실시예 2

P-1059 NR 의 자발적인 thv A -돌연변이체의 선별.

P-1059NR을 20 ㎎/㎖의 날리딕산 및 10 ㎎/㎖의 티민을 함유하는 LB 배양액에서 37℃에서 밤새 배양하였다. 0.2 ㎖의 배양물을 20 ㎎/㎖의 날리딕스산, 10 ㎎/㎖의 트리메소프림(trimethoprim) 및 50 ㎎/㎖의 티민을 함유하는 LB 평판 상에 펼치고, 37℃에서 24-48시간 동안 배양했다. 10개의 콜로니를 동일한 종류의 평판 및 단지 20 ㎎/㎖의 날리딕스산과 10 ㎎/㎖의 트리메소프림을 함유하는 LB 평판에 접종시켰다. 제2 평판이 아닌 제1 평판 상에서 자란 콜로니는 thyA-돌연변이체였다. 상기 thyA-돌연변이체들 중 하나를 20 ㎎/㎖의 날리딕스산 및 150 ㎎/㎖의 티민을 함유하는 10 ㎖의 LB 배양액에 접종시키고, 37℃에서 밤새 배양했다. 상기 배양물을 5 ㎖의 글리세롤과 혼합한 후, 튜브 당 1 ㎖로 나누고 -70℃에서 저장하였다. 저장시킨 thyA-돌연변이체를 P9818로 정하였다.

실시예 3

Tn 벡터 pYL1 .3의 구성

5'-AAGCTTGGCTGTCTCAGGTTTGTTCC-3' 및 5'-TAGCTTGGCCAGTTTCTATTTCTTCG-3'의 프라이머를 가진 E. 콜라이 K-12의 게놈 DNA로부터 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의해 E. 콜라이 thyA 유전자를 증폭시켰다. PCR 단편을 T4 DNA 중합효소 + dGTP를 가지고 정돈했다. pLOF/Ptt(Herreno, M., de Lorenzo, V. Timmis, K. N., J. Bacteriology, 172, 1990, 6557-6567)은 Ptt 유전자를 제거하기 위해서 Xba I 및 Sf로 절단시키고, Klenow 효소 및 dCTP로 부분적으로 채웠다. 정돈된 PCR 단편(하나의 말단)을 절단된 플라스미드의 부분적으로 채워진 Xba I 말단에 결찰시켰다. PCR 단편의 또 다른 말단 및 절단된 플라스미드의 Sfi 말단을 T4 DNA 중합효소 및 dTNP로 무디게 하였다(blunted). 결찰된 PCR 단편을 가진 처리된 플라스미드를 자가 결찰시키고 E. 콜라이 SM 10에 변형시켰다. 알맞은 크기의 플라스미드를 함유하는 하나의 변형체(transformant)를 정제, 배양, 배분하여 -70℃에서 저장하였다. 이 변형체에 있는 플라스미드를 pYLl.3로 정하였다.

실시예 4

P. 멀토시다 Tn 돌연변이체 라이브러리의 구성.

LB 배양액 + 200 ㎎/㎖의 티민에서 37℃에서 심하게 흔들면서 약 48시간 동안 P9818을 배양하였다. pYLl.3을 함유하는 E. 콜라이 SMlO를 LB 배양액에서 밤새 배양하였다. 0.1 ㎖의 P9818 및 E. 콜라이 SM 10 배양물을 혼합하고, LB + (IPTG 100 ㎎/㎖ + 10 mM MgSO₄ + 티민 200 ㎎/㎖) 상에 펼치고 37℃에서 밤새 배양하였다. 박테리아 잔디(bacterial lawn)를 평판으로부터 세척하여 수거하였다. 수거된 현탁액 0.1 ㎖를 LB 평판 + 날리딕스산 20 ㎎/㎖에 펼치고 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 약 150개의 트랜스접합체(transconjugants)를 골라 정제를 위해 LB 평판 + 날리식스산 20 ㎎/㎖ 상에 다시 스트리킹하였다(restreaked). 이러한 트랜스접합체를 LB 배양액 + 날리딕스산 20 ㎎/㎖에서 배양하고 -70℃에서 저장하였다. 트랜스포존 돌연변이체를 선별하기 위해서, 이러한 트랜스접합체들을 LB 평판 + 날리딕스산 20 ㎎/㎖ 및 LB 평판 + 날리딕스산 20 ㎎/㎖ + 암피실린 25 ㎎/㎖ 상에 동시에 스트리킹하였다. LB 평판 + 날리딕스산 20 ㎎/㎖에서만 자란 트랜스결합체(약 120)를 LB 배양액 + 날리딕스산 20 ㎎/㎖에서 재배양하고, 배분하고 -70℃에서 저장하였다.

실시예 5

트랜스포존 돌연변이체의 특성화(서던 블롯)

다수의 17 Tn 돌연변이체들을 무작위로 골라 LB 배양액 + 날리딕스산 20 ㎎/㎖에서 배양하였다. 상기 돌연변이체들의 게놈 DNA를 QIAmp 키트(미국 캘리포니아 발렌시아의 QIAGEN사 제품)를 사용하여 추출하였다. 상기 DNA를 Hind Ⅲ로 절단하였다. Hind Ⅲ, pGP704(Herreno, M., de Lorenzo, V. Timmis, K.N., J. Bacteriology, 111, 1990, 6557-6567) 및 pYLl.3로 절단된 P-1059 게놈 DNA를 대조군으로서 또한 포함시켰다. 표준 방법(Sambrook, et al., eds., Molecular Cloning, 2^nd Edition, Cold Springs Harbor Laboratory Press, Plainview, NY, 1989)에 의해 서던 블롯을 수행하였다. 프루브 라벨링 및 서던 블롯에 있어서, DIG DNA 라벨링 및 검출 키트(미국 인디아나 인디아나폴리스의 Roche Molecular Biochemicals 제품)를 사용하였다. pGP704 및 PCR 증폭된 E. 콜라이 thyA 유전자를 디곡시제닌(digoxigenin)으로 라벨링하고, 절단된 게놈 DNA를 제조업자의 지시에 따라 탐침하였다. 그 결과는 대부분의 돌연변이체가 한개의 Tn 삽입을 가지는 전위 돌연변이체이고, 몇몇 돌연변이체는 플라스미드 통합 돌연변이체임을 보여주었다.

그렇게 얻어진 트랜스포존 돌연변이체는 표준 동물 검사에서 그들의 약독화 행동을 검사하였다.

약독화를 행하는 그러한 트랜스포존 돌연변이체 중, 트랜스포존의 삽입 부위 를 규명하고 분쇄된 유전자를 연결시켰다.

발견된 트랜스포존 돌연변이체 중 하나는 파스퇴렐라 멀토시다 균주 P15 (줄여서 균주 P15)로 나타냈다. 이 돌연변이체는 Orf-15에 삽입된 트랜스포존을 가진다. 다음 실시예에서 백신접종 실험을 위해 이 균주를 사용했다.

실시예 6

백신접종 실험

이러한 실험에서, 백신접종은 뉴캐슬 병 바이러스에 대한 백신접종과 함께 수행하였다. 파스퇴렐라 멀토시다 백신 및 뉴캐슬 병 백신으로의 백신접종은 수의사 처방에서 바람직하게는 동일한 날, 심지어 동일한 순간에 행하기 때문에 이렇게 하였다. 본 발명에서 기술한 실험적인 접근법의 장점은 그것이 또한 영역 조건(field conditions)하에서 백신의 행동에 대한 기억(impression)을 준다는 것이다.

PM 백신 배양물

TPB 내 파스퇴렐라 멀토시다 균주 P15의 신선한 배양물을 에어로졸 백신접종을 위해 사용하였다. 감염성 titter를 사용 후 즉시 측정했다. 프라이밍(priming)에 사용된 파스퇴렐라 멀토시다 균주 P15 배양물은 1.5x10⁸ CFU/㎖을 포함했고, 부스터(booster)로 사용된 배양물은 1.6x 10⁹ CFU/㎖을 포함했다.

식수로 투여하기 위해서 각 배양물의 500 ㎖를 원심분리하고, 펠렛을 500 ㎖ 탈지분유 용액에 용해시켰다. 프라이밍에 사용된 파스퇴렐라 멀토시다 균주 P15 배 양물은 1.2x10⁸ CFU/㎖을 포함했고, 부스터로 사용된 배양물은 1.3xlO⁹ CFU/㎖를 포함했다.

ND 배양물

ND 백신 배양물은 새(bird)마다 1회분(dose) 당 7.3 EID₅₀(알 감염량)를 함유했다.

칠면조에게 물을 주고 아드 리비튬을 먹였다.

그룹화 및 투여( Grouping and dosing )

치료 계획(treatment scheme)

새의 수	14일 및 28일에 백신접종	42일에 병독성 P. m으로 챌린지한 새의 수
25	P15 에어로졸 + ND 백신	15
25	P15 식수 + ND 백신	16
25	ND 백신	15

백신접종

치료 계획에 대한 표 1을 참고. 모든 새들에게 분무 캔을 사용하여 ND 백신을 분무 백신접종하였다. 균주 P15의 백신접종은 페인트 분무기를 사용하여 에어로졸로(에어 순환 클로즈 d로 10분간 에어로졸에서 새들을 유지) 또는 식수에 의해 하였다. 식수 백신접종을 위해 500 ㎖ 신선한 배양물을 원심분리하고 500 ㎖ 2% 탈지 분유(20g 탈지 분유/리터 물)에서 재현탁시켰다. 백신접종 전에 적어도 6시간 동안 칠면조에게 물을 주지않았다. 물/섭취 타워에 500 ㎖ 백신 배양물을 주었다. 백신접종 후, 평상시와 같이 보통의 식수를 주었다.

파스퇴렐라 멀토시다 챌린지( challenges )

1.5x10⁵ CFU/㎖을 함유하는 혈철형 1의 야생형 파스퇴렐라 멀토시다 균주의 신선한 희석 배양물을 근육내 주사(1.0 ㎖, 가슴)하여 챌린지(Challenge) 하였다. 새로운 5시간 배양물로서 TPB에서 챌린지 배양물을 제조하였다.

사망률은 7일 동안 매일 기록하였다. 7일 후 챌린지에서 죽은 새 및 모든 기타 새들에서, P. 멀토시다를 간으로부터 분리하는 시도를 하였다.

통계적인 분석

피셔 정확성 검사(Statistix for Windows, version 2.0)를 사용하여 사망률을 비교하였다.

백신접종 후 개략적인 결과

백신 군	사망률
P15 에어로졸	2/25
P15 식수	0/25
대조군	0/25

챌린지 후 개략적인 결과.

백신 군	사망률	백신 균주의 재분리
P15 에어로졸	^*0/15	^*0/15
P15 식수	^*3/16	^*3/16
대조군	15/15	15/15

^*: 대조군과 유의적으로 상이함

결과 및 토론.

백신접종 후 관찰사항을 표 2에 요약하였다. 백신접종 후 및 챌린지 전에, P15 에어로졸 군에서 2마리의 새가 죽었고, P15 식수 군에서는 0마리 그리고 대조군에서 0마리였다. 대조군에서 어떠한 사망률도 관찰되지 않았기 때문에 이 사망률은 아마도 백신 균주와 연관이 있다. 백신접종 후 부검(post-mortems)은 식수 군에 비해 에어로졸 경로가 약간 더 많은 이상(백신 균주로 인해 있을 수 있는 가벼운 폐포 장애)을 유도한다는 것을 보여주었다.

챌린지 후 관찰사항을 표 3 및 도 1에서 요약하였다. 치명적인 이종의 챌린지(100OxLD₅₀) 후, 다양한 수준의 예방법을 발견했다. 에어로졸 백신접종 경로가 가장 효과적인 경로(100%)로 보이고, 다음은 식수 경로(81%)였다.

상기 결과들로부터, 본 발명에 따른 파스퇴렐라 멀토시다 Orf-15 돌연변이는 백신에서 약독화 생 균주로서 사용되기에 매우 적합한 균주라는 결론을 내릴 수 있다. 백신접종 후 관찰된 사망률은 가능한 가장 높은 투여량(>10⁹ CFU/㎖)을 가진 때였다. 이 실험에서 사용된 백신접종 투여량 및 챌린지 투여량이 높다는 것을 명심해야 한다. 백신 투여량은 사망률이 없거나 징후가 관찰되지 않을 때까지 강하게 감소시킬 수 있다. 또한 챌린지 투여량(100Ox LD₅₀)도 강하게 감소시킬 수 있다.

결론

상기 결과들로부터, 본 발명에 따른 파스퇴렐라 멀토시다 Orf-15 돌연변이체는 효과적이고 안전한 파스퇴렐라 멀토시다 종의 약독화 생 백신을 위한 매우 우수한 주성분을 제공한다고 결론지을 수 있다.

도 1.

이 도면은 챌린지 후 대조군에 대한 백신접종 동물(식수 및 에어로졸 백신접종을 통해 백신접종)의 누적 사망률의 비교를 나타낸다.

SEQUENCE LISTING <110> AKZO Nobel N.V. <120> Pasteurella multocida vaccine <130> 2004.026 <160> 2 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 476 <212> DNA <213> Pasteurella multocida <220> <221> CDS <222> (102)..(476) <400> 1 caaggcaaag gcggattttt tattttaatc tgaatacaag gtacccattg tatattctct 60 gattatccca gtgggtttcc aatttaatga caggagcgtt t atg cat ata atc aaa 116 Met His Ile Ile Lys 1 5 acc tta atc tct gtt ggc gta gca ttt tca ctc agt gct tgc ctg agt 164 Thr Leu Ile Ser Val Gly Val Ala Phe Ser Leu Ser Ala Cys Leu Ser 10 15 20 ctg gaa ggc gtt gaa ata gcg ggc tta gaa gga aaa tcc tct ggc aca 212 Leu Glu Gly Val Glu Ile Ala Gly Leu Glu Gly Lys Ser Ser Gly Thr 25 30 35 tta acc aaa tat cgt tgt gaa aat ggc tat aaa gcc tct ata aaa caa 260 Leu Thr Lys Tyr Arg Cys Glu Asn Gly Tyr Lys Ala Ser Ile Lys Gln 40 45 50 cgc gat aat ggt gtg gta agt atc gct ttc aat gat ggc aaa gac agc 308 Arg Asp Asn Gly Val Val Ser Ile Ala Phe Asn Asp Gly Lys Asp Ser 55 60 65 tat gtc agc tac tta aat cat gtg cct tcc gct tcg gga acg ctg tat 356 Tyr Val Ser Tyr Leu Asn His Val Pro Ser Ala Ser Gly Thr Leu Tyr 70 75 80 85 gtc aat gat aaa aat act tta aaa tgg cat cag aaa aat aat att gca 404 Val Asn Asp Lys Asn Thr Leu Lys Trp His Gln Lys Asn Asn Ile Ala 90 95 100 gta ttt acc tac cca gat cgc aac tat gca aaa acg ggg caa tta gtg 452 Val Phe Thr Tyr Pro Asp Arg Asn Tyr Ala Lys Thr Gly Gln Leu Val 105 110 115 aca aca aac tgt cat aag tat taa 476 Thr Thr Asn Cys His Lys Tyr 120 <210> 2 <211> 124 <212> PRT <213> Pasteurella multocida <400> 2 Met His Ile Ile Lys Thr Leu Ile Ser Val Gly Val Ala Phe Ser Leu 1 5 10 15 Ser Ala Cys Leu Ser Leu Glu Gly Val Glu Ile Ala Gly Leu Glu Gly 20 25 30 Lys Ser Ser Gly Thr Leu Thr Lys Tyr Arg Cys Glu Asn Gly Tyr Lys 35 40 45 Ala Ser Ile Lys Gln Arg Asp Asn Gly Val Val Ser Ile Ala Phe Asn 50 55 60 Asp Gly Lys Asp Ser Tyr Val Ser Tyr Leu Asn His Val Pro Ser Ala 65 70 75 80 Ser Gly Thr Leu Tyr Val Asn Asp Lys Asn Thr Leu Lys Trp His Gln 85 90 95 Lys Asn Asn Ile Ala Val Phe Thr Tyr Pro Asp Arg Asn Tyr Ala Lys 100 105 110 Thr Gly Gln Leu Val Thr Thr Asn Cys His Lys Tyr 115 120 ?? ?? ?? ?? 1

Claims

작용성 Orf-15 단백질을 발현할 수 없는 파스퇴렐라 멀토시다(Pasteurella multocida) 종의 약독화 생 박테리아.
제1항에 있어서, 상기 박테리아는 Orf-15 유전자의 돌연변이로 인해 작용성 Orf-15 단백질을 발현할 수 없는 것을 특징으로 하는 약독화 생 박테리아.
제2항에 있어서, 상기 돌연변이는 삽입 및/또는 결실을 포함하는 것을 특징으로 하는 약독화 생 박테리아.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아는 인간 및/또는 동물에 대해 병원성인 바이러스 및 미생물의 군으로부터 선택된 1종 이상의 항원을 암호화하는 이종 유전자를 보유하는 것을 특징으로 하는 약독화 생 박테리아.
제4항에 있어서, 상기 이종 유전자는 Orf-15를 암호화하는 유전자에 삽입되는 것을 특징으로 하는 약독화 생 박테리아.
제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 1종 이상의 항원은 돼지 생식기 호흡기 증후군(PRRS) 바이러스, 가성광견병 바이러스(Pseudorabies virus), 돼지 인플루엔자 바이러스, 돼지 파르보바이러스(Porcine Parvovirus), 전염성 위장염 바이러스(Transmissible Gastroenteritis virus), 로타바이러스(rotavirus), 돼지 써코바이러스(Porcine Circovirus) 1 또는 2, 에세리키아 콜라이(Escherichia coli), 에리시펠로트릭스 류시오파티애(Erysipelothrix rhusiopathiae), 보르데텔라 브론치셉티카(Bordetella bronchiseptica), 헤모필러스 파라수스(Haemophilus parasuis), 마이코플라즈마 하이오뉴모니애(Mycoplasma hyopneumoniae) 및 스트렙토코커스 수스(Streptococcus suis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약독화 생 박테리아.
제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 1종 이상의 항원은 소 허피스 바이러스(Bovine Herpesvirus), 소 바이러스성 설사병(bovine Viral Diarrhoea) 바이러스, 파라인플루엔자 3형 바이러스(Parainfluenza type 3 virus), 소 파라믹소바이러스(bovine paramyxovirus), 구제역 바이러스(Foot and Mouth Disease virus), 파스퇴렐라 헤몰리티카(Pasteurella haemolytica), 스태필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스태필로코커스 우베리스(Staphylococcus uberis), 에세리키아 콜라이, 소 합포성 폐렴 바이러스(Bovine Respiratory Syncytial Virus), 테일레리아 파르바(Theileria parva), 테일레리아 안눌라타(Theileria annulata), 쇠바베스열원충(Babesia bovis), 텍사스바베스열원충(Babesia bigemina), 큰바베스열원충(Babesia major), 트리파노소마 종(Trypanosoma species), 아나플라즈마 마지날레(Anaplasma marginale), 아나플라즈마 센트랄레(Anaplasma centrale) 또는 네오스포라 캐니넘(Neospora caninum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약독화 생 박테리아.
제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 1종 이상의 항원은 계두 바이러스(Fowlpox virus), 전염성 기관지염 바이러스(Infecious Bronchitis Virus), 전염성 낭병(Infectious Bursal Disease), 마렉병 바이러스(Marek's Disease Virus), 닭 빈혈성 인자(Chicken Anaemia agent), 조류 레오바이러스(Avian Reovirus), 마이코플라즈마 갈리셉티쿰(Mycoplasma gallisepticum), 칠면조 비기관염 바이러스(Turkey Rhinotracheitis virus), 헤모필루스 파라칼리나룸(Haemophilus paragallinarum), 수두바이러스(Chicken Poxvirus), 닭 뇌척수염 바이러스(Avian Encephalomyelitis virus), 오리 페스트 바이러스(Duck Plague virus), 뉴캐슬 병 바이러스(Newcastle Disease virus), 산란 저하 증후군 바이러스(Egg Drop syndrome virus), 전염성 후두기관지염 바이러스(Infectious Laryngotracheitis virus), 칠면조의 허피스 바이러스(Herpes Virus of Turkeys), 에이메리아 종(Eimeria species), 오르니토박테리움 리노트라키아(Ornithobacterium rhinotracheale), 마이코플라즈마 시노비에(Mycoplasma synoviae), 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens), 살모넬라 종(Salmonella species) 및 E. 콜라이로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징을 하는 약독화 생 박테리아.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 약독화 생 박테리아 및 약학적 허 용 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 파스퇴렐라 멀토시다 감염 또는 이의 병원성 영향에 대하여 동물 또는 인간을 보호하기 위한 약독화 생 백신.
제9항에 있어서, 면역 보강제를 포함하는 것을 특징으로 하는 약독화 생 백신.
제9항 또는 제10항에 있어서, 동결건조 형태인 것을 특징으로 하는 약독화 생 백신.
제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 및/또는 동물에 대해 병원성인 바이러스 및 미생물의 군으로부터 선택된 1종 이상의 항원을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약독화 생 백신.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 백신에 사용하기 위한 것인 약독화 생 박테리아.
파스퇴렐라 멀토시다 박테리아 감염 또는 감염의 병원성 영향에 대하여 인간 또는 동물을 보호하기 위한 백신의 제조에 있어서의 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 약독화 생 박테리아의 용도.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 약독화 생 박테리아와 약학적 허용 담체를 혼합하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 기재된 백신의 제조 방법.
서열 번호 1에 제시된 핵산 분자 또는 상기 핵산 서열에 상보적인 핵산 분자, 또는 적어도 12, 바람직하게는 적어도 15, 더욱 바람직하게는 적어도 18 길이의 뉴클레오티드를 갖는 이의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는, 파스퇴렐라 멀토시다 관련 DNA 또는 RNA의 검출을 위한 진단 검사.