TWI486170B

TWI486170B - 豬放線桿菌（ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｉｓ）抗原

Info

Publication number: TWI486170B
Application number: TW099138542A
Authority: TW
Inventors: Jeremy J Kroll; Philip Utley; Dianna M Jordan
Original assignee: Boehringer Ingelheim Vetmed
Priority date: 2009-11-10
Filing date: 2010-11-09
Publication date: 2015-06-01
Also published as: EA201200723A1; CN102596242A; CO6541561A2; WO2011059950A1; MX2012005366A; AR078955A1; CL2012001203A1; JP2013510798A; EP2498813A1; BR112012011093A2; US20110123570A1; TW201141516A; US20140011210A1; JP2016014050A; KR20120103583A; AU2010319678A1; CA2778252A1; US8563005B2

Description

豬放線桿菌(ACTINOBACILLUS SUIS)抗原

本發明係關於可用於抑制、治療、防禦或預防豬放線桿菌感染之方法及組合物。

在美國，豬放線桿菌近來已成為養豬業之新威脅。先前認為豬放線桿菌與「高健康(high health)」豬群之高死亡率有關，現已認識到其為常見豬群之重要病原體。其對年幼動物尤其有害。感染會引起放線桿菌病，且可導致新出生的豬及斷奶的豬猝死。斷奶豬的症狀包括食欲減退、發熱、發紺、四肢充血、呼吸窘迫、肺炎、壞死性肺炎、持續咳嗽、皮膚損傷及致命性敗血症。已知在肥育豬(finishing pig)中會發生肺炎、關節炎、敗血症病徵、胸膜炎、心包炎及粟粒性膿腫。放線桿菌病亦會造成母豬子宮炎及流產。

放線桿菌病之肉眼可見病變之特徵在於發現於肺、腎、心臟、肝、脾、腸及皮膚中之損傷；出血及壞死；及類似於胸膜肺炎之肺損傷。就組織病理學而言，該疾病之特徵在於在各種組織之血管中存在細菌性血栓栓塞且伴隨纖維素性出血性壞死(fibrinohemorrhagic necrosis)；壞死性枝氣管肺炎；及胸膜炎。感染之原因及促成因素包括大面積發生豬生殖及呼吸綜合症(PRRS)感染、剪牙(teeth clipping)、斷尾(de-tailing)、擦破膝蓋(scrubbed knees)及經由呼吸、切口或擦傷侵入。

豬放線桿菌係寄居於上呼吸道中之機會性、革蘭氏陰性、非運動性的好氧兼性厭氧球桿菌(coccobacillus)。對自北美豬群中之臨床病例獲得之豬放線桿菌分離株實施之基因分型揭示有限之遺傳變異性，在自29個不同豬群獲得之74株分離株中僅鑒定出13種株系。豬放線桿菌基因型之辛普森多樣性指數(Simpson's diversity index)(亦稱為物種多樣性指數，參見Simpson，1949)係0.64，此意味著使用例如BOX-PCR時隨機分離株具有64%的機會被包括於獨特的基因型群組中(Simpson，1949；Versalovic等人，1991；Oliveira等人，2007)。例如，與多樣性指數為0.93之副豬嗜血桿菌(H. parasuis)(Oliveira等人，2007)相比，豬放線桿菌係相對純系的。

豬放線桿菌之表型多樣性亦相對有限。迄今僅闡述兩種血清變型(即O1及O2)(Rullo、Papp-Szabo及Michael，2006)及三種莢膜類型K1-3。病原性研究表明，來自血清群O2之分離株往往比O1分離株更有毒力(Slavic、DeLay及Hayes，2000)。用於自身疫苗製備之豬放線桿菌分離株的血清分型亦證實，與O1分離株相比較高百分比之O2分離株與臨床疾病有關(Slavic、Toffner及Monteiro，2000)。儘管已知豬放線桿菌之一些毒力因子(例如RTX毒素Apx I_{var. suis} 及Apx II_{var. suis} )，但可觸發全身性感染之因子仍有待確定。該等潛在因子中之一些因子包括脂多糖(LPS)及莢膜多糖(CPS)、外膜蛋白A(OmpA)、蛋白酶及鐵獲取。

目前，沒有市售疫苗可用於控制豬放線桿菌，且大多數農場獸醫依賴於自身疫苗及抗微生物治療來控制疾病。期望研發出可防禦農場中之大多數分離株之疫苗；然而，關於與豬放線桿菌感染之發病機制有關之基因型、血清變型、毒素、蛋白質分佈及因子間之聯繫的必要數據仍有待確定。本文提供該等數據以及對抗豬放線桿菌之疫苗及其使用方法。

本發明提供可用於防止個體受到豬放線桿菌感染之新穎免疫原性組合物。該等組合物亦可用於抑制、治療或預防各種株系(strain)或類型之豬放線桿菌的感染。

本發明組合物包含自生長至介於0.650 OD₆₅₀ 與0.850 OD₆₅₀ 之間之一或多種豬放線桿菌培養物收集之上清液；以及佐劑。較佳地，該上清液經滅活，最佳經福馬林(formalin)滅活。該上清液較佳亦經過濾，例如通過45微米過濾器過濾。在給定情形下可視情況在滅活之前或之後實施過濾。上清液(更佳為經過濾上清液)基本上不含豬放線桿菌細胞，但可含有多種細胞組份。

熟習此項技術者應認識到各種佐劑中之任一種佐劑可適宜地包括於本發明組合物中。一種實例性佐劑係Emulsigen-D。佐劑之確定部分取決於擬接受組合物之個體的性質；投予至個體之方法；以及投予組合物之條件。例如，可將佐劑與上清液或經過濾上清液在投予至個體之前混合在一起，同時投予，或者依序投予至個體。

本發明免疫原性組合物之適宜個體包括動物及人類。藉由使用本發明組合物或方法刺激免疫應答之動物包括家畜，例如豬、小牛、雞、山羊及綿羊；以及馴養動物，例如小鼠、兔、狗、貓及馬。較佳之動物包括豬、鼠科動物、馬科動物、兔類動物及牛科動物。最佳地，動物係豬。

本發明亦提供在個體中激發抗放線桿菌屬(Actinobacillus)免疫應答以降低與豬放線桿菌感染有關之臨床病徵的發生率或嚴重程度之方法，其包含向該個體投予本發明免疫原性組合物。個體之與豬放線桿菌有關且可降低發生率或嚴重程度之臨床病徵包括腦脊膜炎、敗血症、子宮炎、肺炎、丹毒樣損傷及流產。相對於未接受免疫原性組合物之個體，其中之任一者均可藉由投予本發明組合物而減輕。較佳之本發明組合物引發使豬放線桿菌感染之至少一種臨床病徵減輕至少10%之保護性免疫應答。

可藉由投予本發明組合物減輕之一種較佳之豬放線桿菌感染係豬放線桿菌ISU-8594。

本發明亦提供製造或製備可用於製造藥劑之本發明免疫原性組合物的方法。該等方法包括以下步驟：使豬放線桿菌培養物生長至介於0.650 OD₆₅₀ 與0.850 OD₆₅₀ 之間；自培養物收集上清液；過濾上清液以獲得濾液；及將濾液與佐劑混合。該等方法亦可包括滅活上清液，此較佳在將上清液與佐劑混合之前實施。可在過濾上清液之前或之後實施滅活。

本發明進一步提供診斷個體豬放線桿菌感染之方法。該等方法包含：a)提供經過濾上清液，該上清液係藉由使豬放線桿菌培養物生長至介於0.650 OD₆₅₀ 與0.850 OD₆₅₀ 之間、自培養物收集上清液並過濾上清液來製備；b)使經過濾上清液與自個體獲得之試樣接觸；及c)若在試樣中檢測到能夠結合經過濾上清液中之組份之抗體，則認為個體患有豬放線桿菌感染。

彼等熟習此項技術者應熟習各種適於確定抗體是否能夠結合組份之技術。例如，可藉由使用能夠結合試樣中之抗體的第二抗體來檢測結合。可藉由比色分析或其他適宜手段來檢測該等第二抗體之結合。

本發明亦提供套組，其包含：a)經過濾上清液，該上清液係藉由使豬放線桿菌培養物生長至介於0.650 OD₆₅₀ 與0.850 OD₆₅₀ 之間、自培養物收集上清液並過濾上清液來製備；b)佐劑；及c)用於包裝上清液及佐劑之容器。經過濾上清液與佐劑可包裝在一起或單獨包裝。

套組可進一步包含該套組之使用說明書。其亦可包含將經過濾上清液及佐劑投予至個體之構件。將上清液與佐劑混合在一起之構件亦可包括於套組中。

本發明組合物可進一步包含獸醫學上可接受之載劑、第二佐劑或其組合。該等組合物可用作疫苗，且包含減毒疫苗、滅活疫苗或其組合。該等疫苗引發對抗至少一種與放線桿菌屬有關之疾病的保護性免疫應答。

用於本發明方法之較佳滅活劑選自由二元氮丙啶(binary ethyleneimine)(BEI)及福馬林組成之群。福馬林係更佳之滅活劑。彼等熟習此項技術者應認識到，其他滅活劑及方法(即加熱、改變pH等)已為業內所習知，且可交替地用於實施本發明，只要該等試劑或滅活方法不會不利地改變所製備組合物之免疫原性特性或安全性即可。

本發明方法亦可包含將本發明組合物與獸醫學上可接受之載劑、佐劑或其組合混合。彼等熟習此項技術者應認識到，載劑、佐劑或組合之選擇應尤其由遞送途徑、個人偏好及動物種類來決定。

較佳之投予途徑包括鼻內、經口、真皮內及肌內。較佳於飲用水中進行投予，最佳以單一劑量投予。熟習此項技術者應認識到，本發明組合物亦可以兩次或更多次劑量以及藉由其他投予途徑來投予。例如，該等其他途徑包括皮下、皮內、靜脈內、血管內、動脈內、腹膜腔內、鞘內、氣管內、皮內、心臟內、肺葉內(intralobally)、髓內、肺內或陰道內。端視治療所期望之持續時間及效力而定，本發明組合物可投予一次或數次，亦可間歇投予，例如以每日計投予數天、數週或數月且以不同劑量。

本發明亦提供用於為個體接種疫苗之套組，其包含一套印刷說明書；能夠將疫苗投予至動物之分配器；及豬放線桿菌培養物之上清液，其具有一或多種可有效地在個體中刺激免疫應答之組份。本發明套組可進一步包含獸醫學上可接受之載劑、佐劑或其組合。

本發明套組中之分配器能夠以小滴形式分配其所含物；且包括於套組中之豬放線桿菌上清液在投予至個體時能夠降低豬放線桿菌感染之至少一種臨床病徵的嚴重程度。較佳地，與未經治療之感染個體相比，臨床病徵之嚴重程度降低至少10%。

「免疫原性或免疫組合物」係指包含至少一種豬放線桿菌上清液或其免疫原性部分之物質組合物，其在個體中引發對該組合物之細胞免疫應答或抗體介導之免疫應答。在本發明之一較佳實施例中，免疫原性組合物誘導免疫應答，且更佳地，賦予對抗放線桿菌屬感染之一或多種臨床病徵的保護性免疫。

「免疫應答(immune response或immunological response)」意指(但不限於)出現對目標組合物或疫苗之細胞及/或抗體介導之免疫應答。通常，免疫應答(immune response或immunological response)包括(但不限於)一或多種下述效應：產生或激活特異性地針對目標組合物或疫苗中所包括之一或多種抗原的抗體、B細胞、輔助性T細胞、抑制性T細胞及/或細胞毒性T細胞。較佳地，接種疫苗之個體會呈現治療性或保護性免疫(記憶)應答以增強對新感染之抵抗及/或降低疾病之臨床嚴重程度。該保護可由以下來證實：與病原體感染有關之症狀數量減少、症狀嚴重程度降低或一或多種症狀消失、臨床症狀發作延遲、病原體持續時間縮短、總病原體載量降低及/或病原體分泌減少。

「對抗豬放線桿菌之保護」、「保護性免疫」、「功能免疫」及類似片語意指由免疫方案產生之抗豬放線桿菌免疫應答，與在先前未暴露於豬放線桿菌之未免疫個體中所預期的相比，該免疫方案產生較少有害效應。即，由於個體之免疫系統抵抗細菌，故在免疫個體中感染之有害效應的嚴重程度減輕。在免疫個體(較佳為豬)中，感染可減輕、減緩或可能完全預防。在本文中，當意指完全預防感染時會明確指出。若未指出為完全預防，則該術語包括部分預防。

在本文中，「臨床病徵之發生率及/或嚴重程度降低」或「臨床症狀減少」意指(但不限於)與野生型感染相比群組中感染個體之數量減少、呈現感染臨床病徵之個體的數量減少或消除、或者存在於個體中之任一臨床病徵的嚴重程度降低。例如，其應指病原體載量之任何降低、病原體脫落、病原體傳播之減少或豬放線桿菌感染之任何症狀性臨床病徵之減輕。較佳地，與未接受本發明組合物且可能被感染之個體相比，在接受本發明組合物之個體中該等臨床病徵減輕至少10%。更佳地，在接受本發明組合物之個體中臨床病徵減輕至少20%、較佳至少30%、更佳至少40%且甚至更佳至少50%。

術語「增加之保護」在本文中意指(但不限於)與未接種疫苗之對照個體群組相比在接種疫苗之個體群組中與豬放線桿菌感染有關之一或多種臨床症狀統計學顯著減輕。術語「臨床症狀之統計學顯著減輕」意指(但不限於)在使用感染性放線桿菌屬細菌攻擊後與未接種疫苗之對照群組相比在接種疫苗之個體群組中至少一種臨床症狀之發生頻率降低至少20%、較佳30%、更佳50%且甚至更佳70%。

彼等熟習此項技術者應瞭解，本文所用組合物可納入已知的可注射之生理學上可接受之無菌溶液。對於製備用於非經腸注射或輸注之即用溶液，水性等滲溶液(例如鹽水或血漿蛋白質溶液)可容易地得到。另外，本發明之免疫原性及疫苗組合物可包括獸醫學上可接受之載劑、稀釋劑、等滲劑、穩定劑或佐劑。

本文所用之「獸醫學上可接受之載劑」包括任何及全部溶劑、分散介質、塗佈劑、佐劑、穩定劑、稀釋劑、防腐劑、抗細菌及抗真菌劑、等滲劑、吸附延遲劑及諸如此類。在一些較佳實施例中，且尤其包括凍乾免疫原性組合物之彼等實施例中，用於本發明之穩定劑包括用於凍乾或冷凍乾燥之穩定劑。

在一些實施例中，本發明之免疫原性組合物含有佐劑。本文所用之「佐劑」可包括氫氧化鋁及磷酸鋁；皂苷，例如Quil A、QS-21(Cambridge Biotech公司，Cambridge MA)、GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals公司，Birmingham,AL)；油包水乳液；水包油乳液；水包油包水乳液。該乳液可尤其基於輕質液體石蠟油(歐洲藥典類型(European Pharmacopea type))；類異戊二烯油，例如角鯊烷或角鯊烯；由烯烴(尤其為異丁烯或癸烯)寡聚產生之油；含有直鏈烷基之酸或醇之酯，更特定言之為植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/癸酸酯)、甘油三-(辛酸酯/癸酸酯)或丙二醇二油酸酯；具支鏈脂肪酸或醇之酯，尤其為異硬脂酸酯。油可與乳化劑組合使用以形成乳液。乳化劑較佳為非離子型表面活性劑，特定言之為山梨醇酐、二縮甘露醇(例如無水甘露醇油酸酯)、二醇、聚甘油、丙二醇與油酸、異硬脂酸、蓖麻油酸或羥基硬脂酸之視情況經乙氧基化之酯，以及聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段，特定言之為普流尼克(Pluronic)產品，尤其L121。參見Hunter等人，The Theory and Practical Application of Adjuvants(Ed. Stewart-Tull,D. E. S.)。John Wiley and Sons,NY，第51-94頁(1995)及Todd等人，Vaccine 15:564-570(1997)。

其他實例性佐劑係闡述於M. Powell及M. Newman編輯(Plenum Press,1995)之「Vaccine Design,The Subunit and Adjuvant Approach」之第147頁上的SPT乳液以及闡述於該同一本書第183頁上之乳液MF59。

佐劑之另一實例係選自丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物及馬來酸酐與烯基衍生物之共聚物之化合物。較佳之佐劑化合物係丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物，其尤其與糖類或多元醇之聚烯基醚交聯。此等化合物被稱為術語聚羧乙烯製劑(carbomer)(Phameuropa，第8卷，第2期，1996年6月)。熟習此項技術者亦可參考美國專利第2,909,462號，其闡述與聚羥基化化合物交聯之該等丙烯酸系聚合物，該聚羥基化化合物具有至少3個(較佳不多於8個)羥基，至少3個羥基之氫原子由具有至少2個碳原子之不飽和脂肪族基團替換。較佳基團係彼等含有2個至4個碳原子者，例如乙烯基、烯丙基及其他乙烯系不飽和基團。不飽和基團自身可含有諸如甲基等其他取代基。以名稱Carbopol(BF Goodrich,Ohio,USA)出售之產品尤其適合。其可與烯丙基蔗糖或與烯丙基異戊四醇交聯。其中可提及者係Carbopol 974P、934P及971P。最佳使用Cabopol 971P。共聚物EMA(Monsanto)屬於馬來酸酐與烯基衍生物之共聚物，其為馬來酸酐與乙烯之共聚物。將該等聚合物溶解於水中會產生酸性溶液，較佳將其中和至生理pH以得到佐劑溶液，將免疫原性、免疫或疫苗組合物本身納入該佐劑溶液中。

其他適宜佐劑尤其包括(但不限於)RIBI佐劑系統(Ribi公司)、嵌段共聚物(CytRx,Atlanta GA)、SAF-M(Chiron,Emeryville CA)、單磷醯脂質A、阿夫立定(Avridine)脂質-胺佐劑、來自大腸桿菌(E. coli)(重組的或其他性質的)之不耐熱腸毒素、霍亂毒素、IMS 1314或胞壁醯二肽、或天然存在或重組之細胞因子或其類似物、或者內源細胞因子釋放之刺激物。

「稀釋劑」可包括水、鹽水、右旋糖、乙醇、甘油及諸如此類。等滲劑可尤其包括氯化鈉、右旋糖、甘露醇、山梨醇及乳糖。穩定劑尤其包括白蛋白及乙二胺四乙酸之鹼金屬鹽。

預期，佐劑可以約100 μg至約10 mg/劑、較佳以約100 μg至約10 mg/劑、更佳以約500 μg至約5 mg/劑、甚至更佳以約750 μg至約2.5 mg/劑且最佳以約1 mg/劑的量添加。或者，以最終產物之體積計，佐劑之濃度可為約0.01至50%，較佳為約2%至30%，更佳為約5%至25%，仍更佳為約7%至22%，且最佳為10%至20%。

在本文中，「有效劑量」意指(但不限於)豬放線桿菌上清液或經過濾上清液引發或能夠引發使投予上清液之個體臨床症狀減輕之免疫應答的量。

「安全性」係指在接種疫苗後接種疫苗之個體中不存在包括但不限於以下在內之不利後果：基於細菌之疫苗可能恢復毒力、臨床上顯著之副作用，例如持續全身性疾病或在疫苗投予部位不可接受之炎症。

本文所用之術語「接種疫苗(vaccination或vaccinating)」或其變化形式意指(但不限於)包括投予本發明組合物之過程，當將本發明組合物投予至個體時，其在個體中引發或能夠引發─直接或間接─抗豬放線桿菌免疫應答。

本發明亦揭示治療或預防由豬放線桿菌引起之感染的方法。該方法包含向個體投予有效量之本發明免疫原性組合物，其中該治療或預防選自由下列組成之群：豬放線桿菌感染之病徵減少、豬放線桿菌感染臨床病徵之嚴重程度或發生率降低、由豬放線桿菌感染引起之個體死亡率降低及其組合。

在本發明上下文中，「死亡率」係指由豬放線桿菌感染引起之死亡，且包括感染如此嚴重以致於將動物無痛致死以防止受苦及提供其生命之人道終結之情形。

「減毒(attenuation)」意指降低病原體之毒力。在本發明中，「減毒」與「無毒力(avirulent)」同義。在本發明中，減毒細菌係毒力已降低從而不會引起豬放線桿菌感染之臨床病徵但能夠在目標個體中誘導免疫應答之細菌，但亦可意指與感染未減毒豬放線桿菌且未接受減毒細菌之個體「對照群組」相比在感染減毒豬放線桿菌之個體中臨床病徵之發生率或嚴重程度降低。在此上下文中，術語「降低(reduce/reduced)」意指與如上文所定義之對照群組相比降低至少10%、較佳25%、甚至更佳50%、仍更佳60%、甚至更佳70%、仍更佳80%、甚至更佳90%且最佳100%。

對本發明而言，「有效量」意指免疫原性組合物能夠在個體中誘導使豬放線桿菌感染發生率降低或嚴重程度減輕之免疫應答的量。有效量係指菌落形成單位(CFU)/劑或logs/劑。

「長期保護」應指「改良之功效」持續至少3週，但更佳至少3個月，仍更佳至少6個月。最佳地，該長期保護應持續到直至豬動物以肉出售之平均年齡。

在本文中，除非上下文另有要求，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。在本申請案中，除非另有說明，否則使用「或」意指「及/或」。

由下列詳細說明可明瞭本發明之其他目標、特徵及益處。然而，應瞭解，當闡述本發明之較佳實施例時，詳細說明及具體實例僅以闡釋方式給出，此乃因彼等熟習此項技術者由該詳細說明可明瞭本發明精神及範圍內之各種變化及修改。

以下圖示構成本說明書之一部分，且包括在內以進一步展示本發明之某些態樣。可參考該等圖示中之一或多者與本文所提供具體實施例之詳細說明更好地理解本發明。

本發明提供可用於抑制、治療、防禦或預防豬放線桿菌感染之方法及組合物。本文闡述豬放線桿菌原型疫苗對抗各種豬放線桿菌血清型或分離株之異源攻擊的效力。已證實該等疫苗可在所治療動物中有效地刺激免疫原性反應。一些疫苗刺激之反應足以防禦豬放線桿菌。

豬放線桿菌疫苗原型由不同培養物部分(例如全細胞、上清液或外膜蛋白(omp))及對抗胸膜肺炎放線桿菌(A. pleuropneumoniae)(APP)之IngelvacAPP-ALC活疫苗組成。全細胞疫苗由對細胞培養物實施離心旋轉產生之沉澱物質製得。培養物上清液由離心旋轉產生之上清液製得，且可包括外毒素、內毒素、分泌或脫落之omp、以及旋轉期間未除去之其他細胞組份(參見實例1)。包括IngelvacAPP-ALC活疫苗係因為APP編碼與豬放線桿菌毒素非常類似之Apx I及II毒素。假設該IngelvacAPP-ALC疫苗可提供對抗豬放線桿菌之一些交叉保護。

此功效研究由含有3週齡±7日齡之斷奶豬的6個治療群組組成。治療群組1(15頭豬)分別在研究第0天及第21天經肌內(IM)接受1×2 mL劑量之福馬林滅活的豬放線桿菌全細胞部分。治療群組2(15頭豬)分別在研究第0天及第21天經IM接受1×2 mL劑量之福馬林滅活的豬放線桿菌培養物上清液部分。治療群組3(15頭豬)分別在第0天及第21天經IM接受1×2 mL劑量之豬放線桿菌外膜蛋白(omp)細胞部分。治療群組4(15頭豬)分別在第0天及第21天經IM接受1×2 mL劑量之IngelvacAPP-ALC。指定為「攻擊對照」之治療群組5(15頭豬)分別在第0天及第21天經IM接受1×2 mL劑量之安慰劑。治療群組6(10頭豬)指定為「嚴格對照」，且未接受疫苗或安慰劑治療。

在攻擊之日(第35天)，群組1至5中之豬，每頭豬經由鼻內(IN)接種接受6 mL劑量之豬放線桿菌菌株ISU-8594(含有1×10^9.0 logs/劑)，每一鼻孔施加3 mL。在整個研究期間(第0天至第41天)監測大體觀察，以記錄豬之總體健康狀況，及注射部位反應性及直腸溫度。在研究第41天，將所有動物無痛致死，且對所有肺切片進行記分，以測定肺病變之百分比。自每隻動物採集肺(若存在，取3個具有損傷的肺葉)、肝、腎、脾、扁桃體、及鼻甲、氣管、枝氣管、腦脊膜以及心臟血液抹片之新鮮及固定(僅對於肺而言)試樣，並進行培養，用於細菌分離及組織病理學(僅對於肺而言)。

豬放線桿菌部分及安慰劑群組以Emulsigen-D作為佐劑，且在該等群組中觀察到數種不利的注射部位反應。在第一次疫苗接種事件期間，觀察到上清液群組(群組2)中之一頭豬在注射部位有輕微反應。總之，在上清液及omp群組中，Emulsigen-D與測試物品之組合未產生任何明顯的注射部位反應。然而，全細胞群組中確實有數隻動物在屍體剖檢時出現膿腫，其可能源於由濃縮之全細胞原液組成之測試物品調配物所致。投予該等疫苗原型(即全細胞、上清液及omp)在投予時間期間似乎耐受良好。APP-ALC群組出現一些注射部位腫脹，此與在11%的接種疫苗動物中觀察到腫脹之產品文獻一致。

在攻擊前階段期間，各治療群組中之豬的一般總體健康狀況良好。僅治療群組4中的一頭豬在該階段期間自研究除去。該豬由於細菌感染而被除去，據認為此感染與投予APP疫苗無關。進一步觀察顯示攻擊對照群組中之一頭豬在研究第7天至第24天右腿跛行。該豬偏移了攻擊前階段期間之臨床觀察結果，且可視為離群值而自研究數據分析除去。此外，全細胞群組中之一頭豬顯示身體狀況較差，且在數天後死亡。在接種疫苗前階段沒有一頭豬顯示呼吸困難病徵。

藉由與嚴格對照群組(治療群組6)相比，攻擊對照群組(治療群組5)中發生之損傷形成顯著(p<0.05)增加，可驗證主要及次要參數之評估。該評估之結果在豬中驗證了有毒力之純淨培養物豬放線桿菌攻擊模型。群組1至4與攻擊對照群組進一步作比較，但不與嚴格對照群組進一步作比較。

在為期6天之攻擊階段期間，全細胞群組中之一頭豬在攻擊後1天由於豬放線桿菌感染而死於急性死亡。基於先前的攻擊研究，鼻內途徑及效能適於在測試動物中引起顯著損傷形成及明顯的致命猝死，此與全細胞群組中該豬之情形一樣。

基於平均肺損傷記分及具有損傷之百分比，攻擊群組中之肉眼可見肺損傷記分似乎最嚴重。比較群組1至5時，統計學分析顯示平均肺損傷記分或存在損傷之百分比無統計學差異(p<0.05)。在數值方面，總體而言，攻擊對照群組具有最高的平均肉眼可見肺損傷記分，全細胞及omp群組次之，該後兩個群組亦具有相對較高之記分。在上清液及APP群組中損傷形成較少，與其他群組相比，其具有較低之數值記分。所有群組1至5中至少50%的豬具有肉眼可見損傷記分，且攻擊及omp群組多達80%的豬具有損傷形成。

此外，顯微鏡可見肺損傷分析係基於豬放線桿菌感染之標誌特徵(即枝氣管肺炎、壞死及胸膜炎)的嚴重程度。在攻擊對照及omp群組中枝氣管肺炎及壞死較嚴重，而顯微鏡可見損傷記分低於上清液及APP群組。基於顯微鏡可見損傷數據，APP群組顯示最佳之防禦豬放線桿菌感染之跡象，群組3(omp)之壞死及胸膜炎與群組5(攻擊)之胸膜炎間具有統計學差異(p<0.05)。所有群組中存在之細菌菌落介於約20%至約46.7%範圍內，其中在全細胞及APP(20.0%)群組中寄居百分比最低。

對於各治療群組，使用所監測之次要參數來支持由疫苗及攻擊而引起之主要功效參數(即，肉眼可見及顯微鏡可見(IHC)損傷)應答。攻擊階段期間所實施之臨床觀察顯示與疫苗治療群組1至4相比攻擊對照具有總體較高記分，表明攻擊對照對攻擊有應答。上清液群組似乎臨床上未受感染。然而，所有群組中均有一些豬具有一些呼吸問題並伴隨咳嗽、身體狀況或行為反應。

在第一次疫苗接種事件後4小時，發現治療群組之平均直腸溫度升高，高於104℉。對於APP及omp群組，溫度峰值在104.9℉或高於104.9℉，104.9℉係接種疫苗後4小時發燒之界限值(cut-off)，且對於omp群組持續約24小時。到第1天或第3天，群組溫度回到正常。對於加強免疫事件，僅在第28天採集溫度，且不與第一次接種疫苗一樣在接種疫苗後4小時或第1、3及5天採集溫度。在加強免疫階段期間，在第28天，APP群組與全細胞及上清液群組相比具有統計學差異(p<0.05)。在攻擊階段期間，攻擊對照在階段開始及結束時均具有總體較高直腸溫度。在第38天及第39天期間全細胞群組具有最高直腸溫度。攻擊對照群組具有最高之總發熱動物百分比(10/15)，其次分別為全細胞(8/15)、OMP(5/15)、上清液(2/15)及APP(1/15)群組。

在肺及扁桃體試樣中細菌分離最高。在攻擊對照群組中豬放線桿菌之回收率最高。除鼻及扁桃體試樣(分別為3/10及1/10)外，嚴格對照群組中豬放線桿菌呈陰性。該等結果記錄為陽性，且未藉由BCA或其他手段進行證實。該等結果之可能原因係疏忽讀錯瓊脂板或在抹片處理期間發生交叉污染事件。此外，三種參數(脾、腦脊膜及心臟血液)具有非常低之豬放線桿菌回收率，且因此未包括在分析中。總之，由於內臟器官及心臟血液中之豬放線桿菌回收率較低，故敗血症率較低。亦有證據表明，在嚴重受感染之三隻動物中此攻擊跨過血腦屏障。檢測到之其他細菌係博德特菌屬(Bordetella)、α及β鏈球菌(streptococci)。

使用西方墨點法程序實施血清學測試以測試對用於為治療群組接種疫苗之測試物品之反應性。西方墨點法顯示在以1:100稀釋時可檢測到全細胞、上清液及omp部分之血清轉化。APP部分具有最佳反應性且可在以1:1000稀釋時檢測到，證實宿主識別用於為各治療群組接種疫苗之各部分的一部分。

總之，在使用APP及上清液原型疫苗接種疫苗之豬中得到最佳保護。相比之下，全細胞及omp疫苗或LPS衍生抗原不能自豬放線桿菌攻擊提供較多保護。攻擊研究之細節提供於下文實例中。

除非另有定義，否則本文所用之所有技術及科學術語皆具有與歸檔時熟習本發明所屬技術領域者通常所瞭解含義相同之含義。若明確定義，則本文提供之定義優先於任何詞典或外來定義。此外，除非上下文另有要求，否則單數術語應包括複數，且複數術語應包括單數。在本文中，除非另有說明，否則使用「或」意指「及/或」。本文所提及之所有專利及出版物皆以引用方式併入本文中。

實例

本發明包括下列實例以展示本發明之較佳實施例。熟習此項技術者應瞭解，下列實例中揭示之技術代表本發明者發現可良好用於實施本發明之技術，且因此可認為該等技術係實施本發明之較佳方式。然而，熟習此項技術者根據本揭示內容應瞭解，可對所揭示具體實施例實施多種改變且仍獲得相同或類似結果，此並不背離本發明之精神及範圍。

實例1：原型疫苗及攻擊治療 A.　疫苗原型之製備

豬放線桿菌(KSU-1)培養物之生長： 在250 ml旋轉器中使用1毫升豬放線桿菌(103007-1KSU)(批號為201-9,10,11)來接種150 ml BHI培養基(批號為195-121)。將接種培養基在37℃下於約72 rpm下放置6小時。然後，將約2.5 ml接種培養基添加至約2500 ml新鮮BHI培養基中。重複該步驟直至製得四份2500 ml批料。將四份批料在37℃下於約72 rpm下培育過夜。使用兩份批料來分離全細胞OMP及上清液部分，使用一份批料來製備濃全細胞部分，且最後一份批料用於LPS提取。

收穫細胞部分： 在接種後15小時讀取批料之光密度。在600 nm下光密度介於0.775至0.815範圍內。使用各培養物在BAP上劃線來證實該等培養物只含豬放線桿菌。

收集OMP及上清液部分時，將兩份培養物批料轉移至500 ml離心管中，放置於JA-10轉頭中，並在10 K下旋轉10分鐘。輕輕倒出上清液，並將沉澱物轉移至250 mL的無菌Corning離心管中。將沉澱物在約5000 rpm下於JA-10轉頭中離心10分鐘，並移除剩餘的上清液。集中沉澱物並放置於-80℃下，直至十二烷基肌胺酸鈉(sarcosyl)提取(見下文)。集中輕輕倒出的上清液，並通過0.45 μm過濾器(Nalgene 0.45 SFCA)過濾至2 L的無菌Pyrex瓶中。將過濾的上清液等分至2×850 cm RB、81×5 mL小瓶及4×250 mL Nalgene瓶中。將過濾的上清液儲存於-20℃下直至使用。

收集濃(10x)全細胞沉澱物部分時，如上文所述收穫一份培養物批料，但是將沉澱物再懸浮於300 mL TSP緩衝液中。將溶液充分混合並等分至50×2 mL小瓶及4×50 mL疫苗瓶中。將再懸浮的全細胞沉澱物儲存於-80℃下直至使用。

製備LPS部分時，如上文所述收穫豬放線桿菌培養物。將沉澱物再懸浮於1x PBS緩衝液中，並在10 K rpm下再離心10分鐘。輕輕倒出上清液，並將沉澱物再懸浮於1 L 1x PBS緩衝液中。約600 nm下讀取之光密度為1.003，其在LPS提取之預期範圍0.8-1.200內。將LPS部分等分至3×250 mL Nalgene瓶中，並儲存於-80℃下直至使用。將剩餘體積之LPS部分儲存於4℃下以用於LPS提取。

KSU-1全細胞福馬林滅活疫苗： 收穫時，在600奈米波長下量測之細胞培養物的光密度(OD)為0.775。在先前研究中，基於按菌落形成單位(cfu)確定logs/mL之對數估計曲線，此光密度與logs/mL之關聯性約為8.7 logs/mL。將全細胞部分濃縮10x並冷凍。隨後將冷凍之原液經福馬林滅活，並稀釋(54 mL培養物至26 mL 1x磷酸鹽緩衝鹽水(pbs)中)至佔總部分之67.5%。隨後將滅活的稀釋疫苗原液儲存於4℃下。

將全細胞福馬林滅活疫苗原液自4℃取出以用於調配。在生物安全櫃(bio-safety hood)中工作，將80 mL物質等分至100 mL的含有磁力攪拌棒之無菌Pyrex瓶中。將瓶放置於攪拌板上，並在持續攪拌下經1分鐘添加20 mL(20% v/v)佐劑(Emulsigen-D)。隨後將加有佐劑之原型再攪拌10分鐘。將物質轉移至100 mL疫苗瓶中，蓋上蓋子並放置於4℃下。全細胞福馬林滅活疫苗原型之批號為N201-110-WC-073108(第7天)及N201-122-WC-082108(第21天)。

藉由分別在第0天及第21天於37℃下好氧培育28 hr及30 hr後5%綿羊血瓊脂板(BAP)上無生長來證實無菌性。在投予至測試動物之前及整個疫苗投予程序期間，將疫苗原型物質保持於冰上。

KSU-1上清液福馬林滅活疫苗： 藉由收集上清液並通過0.45微米過濾器過濾自全細胞部分製備品之10x濃縮步驟(見上文)調配上清液原型。冷凍所得經過濾上清液。隨後將此上清液經福馬林滅活，並儲存於4℃下直至調配。調配步驟與全細胞福馬林滅活疫苗一樣。上清液福馬林滅活疫苗原型之批號為N201-110-Supe-073108(第7天)及N201-122-Supe-082108(第21天)。

證實無菌性，並在投予至測試動物之前及整個疫苗投予程序期間如先前所述來保持疫苗原型物質。

KSU-1 OMP部分疫苗： 藉由利用以下OMP十二烷基肌胺酸鈉提取程序自由KSU-1培養物(分離株BI-103007-1KSU)製備並儲存於-80℃下之沉澱物來產生OMP部分。在試驗臺(benchtop)上解凍沉澱物。使用130 mL 10 mM HEPES平衡鹽溶液將沉澱物再懸浮(22.5 g濕重)，並等分至四個50 mL圓錐形Falcon管(40 mL/管)中。(保留1 mL再懸浮沉澱物試樣以用於蛋白質定量及分析。)將再懸浮沉澱物放置於冰浴中，並使用(大的/微尖端)探針(50 mL分液)超音波處理1分鐘，其中超音波處理脈衝設置為1個脈衝/秒。此超音波處理重複三次。(保留1 mL超音波處理後試樣。)將超音波處理的沉澱物在50 mL管中於17,000×g下離心20 min。然後，輕輕倒出上清液並集中至單獨容器中。將沉澱物儲存於4℃下直至雙金雞寧酸分析(BCA)後，並隨後丟棄。

將集中的上清液在超速離心機中進行處理(約0.0128 kg/管)，離心機設置為124,000×g(30,000 rpm)，1:10小時，4℃，最大加速度，且關閉突然制動功能(no brake)。輕輕倒出上清液，與先前上清液集中，並儲存於4℃下。將約1 mL 10 mM HEPES添加於超速離心管中之各沉澱物上部，並將沉澱物在4℃下培育過夜以使沉澱物自管鬆動。向各管中再添加2 mL 10 mM HEPES以再懸浮沉澱物。將各再懸浮沉澱物溶液使用10 mM HEPES補足至6 mL(總體積)，並向各溶液中添加6 mL 2%十二烷基肌胺酸鈉。將溶液在室溫下培育30分鐘。然後，使用2%十二烷基肌胺酸鈉使管在超速離心桶(約0.0128 kg/管)中平衡，並在超速離心機中進行處理，離心機設置為124,000×g，1:10小時，4℃，最大加速度，且關閉突然制動功能。將上清液收集至容器中，並向各沉澱物中添加1 mL 10 mM HEPES。將OMP沉澱物在4℃下儲存1小時，隨後量測蛋白質濃度或使蛋白質可見。

在還原MOPS 10-12% Bis-Tris SDS PAGE凝膠或NuPAGE 4-12% Bis-Tris凝膠上處理兩份相同的試樣(1:10稀釋)以使蛋白質帶可見。使用BCA來測定最終OMP原液之總蛋白質濃度，並在與佐劑調配之前進行測定。基於藉由BCA獲得之數值，OMP提取原液中所含蛋白質之總質量為1.75 μg/mL。基於該數值，所調配疫苗OMP原型之效能為250μg/劑。將再懸浮之提取OMP部分等分成200 μl試樣，貼上標籤，並冷凍於-70℃下。

將含有0.5 mL提取OMP部分之5個小瓶自-70℃取出。使該等小瓶在室溫下解凍。在生物安全櫃中工作，將23.25 mL 1x磷酸鹽緩衝鹽水(pbs)及2.35 mL OMP物質等分至100 mL的含有磁力攪拌棒之無菌Pyrex瓶中。將瓶放置於攪拌板上，並在持續攪拌下經1分鐘添加6.4 mL(20% v/v)佐劑(Emulsigen-D)。隨後將加有佐劑之OMP原型疫苗再攪拌10分鐘。將OMP原型疫苗轉移至60 mL疫苗瓶中，蓋上蓋子並放置於4℃下。OMP疫苗原型之批號為N201-110-OMP-073108(第7天)及N201-122-OMP-082108(第21天)。

Ingelvac APP-ALC疫苗： 將一個APP-ALC瓶自-70℃取出，並在溫水中解凍。解凍後，使用16號無菌針取出試樣，並放置於疫苗瓶中以用於效能測試。將疫苗瓶放置於4℃下。在第0天及第21天對Ingelvac APP-ALC實施滴定以測定每劑之菌落形成單位(CFU)。將試樣連續稀釋10倍並鋪板至Mueller Hinton巧克力瓊脂板上。重複實施三次，並在37℃下培育24 hr，隨後測定CFU。分別地，第0天之菌落形成單位係9.99 logs/劑，且第21天係10.2 logs/劑。IngelvacAPP-ALC疫苗之批號為N201-110-APP-073108(第0天)及N201-122-APP-082108(第21天)。

在投予至測試動物之前及整個疫苗投予程序期間如先前所述來保持疫苗原型物質。

安慰劑疫苗： 在生物安全櫃中工作，將60 mL 1x磷酸鹽緩衝鹽水(pbs)等分至100 mL的含有磁力攪拌棒之無菌Pyrex瓶中。將瓶放置於攪拌板上，並在持續攪拌下經1分鐘添加15 mL(20% v/v)佐劑(Emulsigen-D)。隨後將加有佐劑之原型再攪拌10分鐘。將物質轉移至100 mL疫苗瓶中，蓋上蓋子並放置於4℃下。安慰劑疫苗之批號為N 201-109。

證實無菌性，並在投予至測試動物之前及整個疫苗投予程序期間如先前所述來保持安慰劑原型物質。

B.　攻擊治療之準備

所用攻擊菌株係豬放線桿菌分離株ISU-8594 p5。藉由使用5 mL ISU-8594 p4來接種含有800 mL豬腦心浸液(Brain Heart Infusion Porcine)(BHI-豬)培養基之1升Belco旋轉燒瓶來產生攻擊物質。將旋轉器放置至約100 rpm下之37℃培育箱中。在接種後約5 hr 30分鐘，培養物生長至光密度(OD600)為0.109。隨後將培養物轉移至6×100 mL疫苗瓶(含有100 mL總體積)中，用塞子塞住並蓋上蓋子。將5個瓶放置至含有冰袋之冷卻器中，並將用以代表其他5個瓶實施滴定之1個瓶放置於含有冰袋之另一個冷卻器中。藉由自將10倍連續稀釋物鋪板至5%綿羊血瓊脂板上產生之CFU計數來測定攻擊物質之效價。獲得之攻擊效價係1.69×10⁸ cfu(s)/mL或9.0 logs/6 mL劑量。攻擊物質之批號為N201-138。

在投予至測試動物之前及整個攻擊程序期間將攻擊物質保持於冰上。

實例2：為豬接種疫苗

市售雜交(cross)且3週±7日齡之雌性與閹割的雄性豬動物混合自Wilson Prairie View農場獲得。動物健康且無臨床呼吸系統疾病跡象，且諸如下述細菌性呼吸系統病原體呈陰性：胸膜肺炎放線桿菌、副豬嗜血桿菌、豬鏈球菌(S. suis)、多殺巴斯德氏菌(P. multocida)、枝氣管炎博德特菌(B. bronchiseptica)、紅斑丹毒絲菌(E. rhusiopathiae)及豬放線桿菌。儘管若及當與接種疫苗或攻擊無關之健康問題變得明顯時允許將動物逐出研究，但沒有動物被排除。

在到達測試地點時，給所有動物注射1 mL Excenel(一種短效抗生素)。將動物圈養在測試地點直至研究結束。到達後在動物耳朵上加上標籤，並針對種類、年齡、體格及狀況適當圈養。將攻擊及嚴格對照豬一起圈養在遠離其他治療群組之單獨建築中之單獨圍欄中。攻擊時，將攻擊對照移到與治療群組相同之建築中。整個研究期間將所有治療群組圈養在單獨圍欄中。定量給動物提供不含抗生素且適於動物種類、年齡、體格及狀況之食物。在研究開始時動物健康及營養狀態良好。在納入研究之前由臨床獸醫按照普遍認可之獸醫規範對每一隻動物實施健康檢查。

使用電腦隨機號碼產生器(Microsoft Office Excel)給每一隻動物指定一個獨特的隨機號碼。隨後將隨機號碼按遞增順序排序。藉由自隨機號碼之最低區段開始對治療群組分配實驗單元並將其指定至治療群組1至6來實施指定。增大隨機號碼，隨後將下一實驗單元區段指定至治療群組，以此類推，直至將所有動物皆指定至治療群組。

此功效研究由含有3週齡±7日齡之斷奶豬的6個治療群組組成。治療群組1(15頭豬)分別在研究第0天及第21天經肌內(IM)接受1×2 mL劑量之福馬林滅活的全細胞豬放線桿菌。治療群組2(15頭豬)分別在研究第0天及第21天經IM接受1×2 mL劑量之福馬林滅活的豬放線桿菌培養物上清液。治療群組3(15頭豬)分別在第0天及第21天經IM接受1×2 mL劑量之豬放線桿菌外膜蛋白(omp)。治療群組4(15頭豬)分別在第0天及第21天經IM接受1×2 mL劑量之IngelvacAPP-ALC。指定為「攻擊對照」之治療群組5(15頭豬)分別在第0天及第21天經IM投予途徑接受1×2 mL劑量之安慰劑。治療群組6(10頭豬)指定為「嚴格對照」，且未接受疫苗或安慰劑治療。所有群組均觀察41天。

在研究第35天，群組1至5之每頭豬經由鼻內(IN)接種接受6 mL劑量(每頭豬每隻鼻孔施加3 mL)之豬放線桿菌菌株ISU-8594(含有1×10^9.0 logs/劑)。群組6為「嚴格對照」群組，未接受任何治療或攻擊。

在第0天治療之前；在接種後4小時；及在接種後1天(DPI)、3、5、7、14、21、28、34、35、36、37、38、39、40及41 DPI採集所有動物之直腸溫度。

在第0天治療之前及每週(第7、14、21、28、34及41天)採集每一隻動物之靜脈全血(6-10 mL)以用於以後的血清學測試。

在治療之前及在接種後4、24、48及72小時檢查群組1至5之所有豬的注射部位。檢查注射部位之腫脹、硬度及大小情況。記錄數據。以下記分系統用於注射部位觀察：腫脹(0=無，1=存在腫脹)、外觀(0=正常，1=硬，2=軟，3=膿腫，4=流出液體(draining))，大小(0=正常，對於所有其他情況，記錄長度乘以寬度尺寸(釐米)(即長度×寬度×直徑))。

在第0天至第41天每天針對任何呼吸窘迫病徵實施臨床觀察，包括用力呼吸、打噴嚏、咳嗽、呼吸運動改變、食欲減退、跛行、關節腫脹、脫水、站立能力、步行、連續兩天或更多天垂死、或者死亡。

將研究期間具有嚴重臨床症狀之動物人道地無痛致死，並進行屍體剖檢以確定死亡原因。在研究第41天，將所有動物無痛致死，且對所有肺切片進行記分以測定肺病變之百分比。自每隻動物採集肺(若存在，取3個具有損傷的肺葉)、肝、腎、脾、扁桃體、及鼻甲、氣管、枝氣管、腦脊膜以及心臟血液抹片之新鮮及固定的(僅對於肺而言)試樣，並進行培養以用於細菌分離及組織病理學(僅對於肺而言)。

實例3：評估原型疫苗之功效 A.　統計學分析

使用SAS 9.1.3版實施統計學分析以進行數據管理及分析。視需要產生所有數據之概括統計表，包括平均值、標準偏差、標準誤差、中值、範圍、95%置信區間、變異係數及頻率分佈。分析包括所有仔豬治療群組之間的所有成對比較。所有顯著性檢驗均為p0.05程度之雙尾檢驗，以測定各治療群組間之差異。

主要功效參數係非正態分佈之顯微鏡可見損傷記分及肉眼可見損傷記分，藉由Wilcoxon雙樣本檢驗及Fisher's確切檢驗(Exact Test)對其進行比較。次要功效參數係(1)使用Wilcoxon雙樣本檢驗比較之臨床病徵；(2)使用Fisher's確切檢驗及ANOVA比較之發燒；及(3)使用Fisher's確切檢驗比較之細菌分離。

B.　垂死的動物

在研究開始後兩隻動物自研究除去。在研究第11天發現動物ID #31(治療群組4)死亡。肉眼檢查顯示該豬狀況較差且纖瘦。其肺具有紅色及紫色污點，且其腹部具有膿性滲出物且患有纖維性腹膜炎。推測診斷為HPS或鏈球菌感染。使用業內認可之標準技術對新鮮組織及抹片試樣實施細菌學培養。對回收之細菌菌落進行分析，且分析發現該豬感染膿隱秘桿菌(Arcanobacterium pyrogenes)、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophilia)及弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)。固定肺試樣之組織病理學顯示無肺炎、壞死、胸膜炎或細菌菌落存在跡象。

在第36天，即攻擊後1天發現動物ID #32(治療群組1)死亡。肉眼檢查顯示該豬的肺嚴重纖維化且胸腔中具有流體。其肺具有固結且較大的出血性區域。推測診斷為由豬放線桿菌攻擊引起之急性死亡。對新鮮組織及抹片試樣實施細菌學培養。回收所有組織及抹片試樣中之豬放線桿菌，脾及氣管除外。固定肺試樣之組織病理學顯示嚴重肺炎、壞死、胸膜炎及細菌菌落存在跡象。

C.　大體觀察

自接種疫苗/安慰劑投予至攻擊(第0天至第35天)針對歸因於使用測試/對照物品進行治療之不利事件或其他非由治療引起之健康異常每天觀察動物。

攻擊對照及嚴格對照群組(群組5及6)中之豬的大體健康觀察結果如下：豬#71(攻擊對照)在第7天開始顯示右前腿跛行病徵，且持續至第24天，隨後症狀消失。該觀察階段期間其餘豬正常。

疫苗治療群組(群組1至4)中之豬的大體健康觀察結果如下：豬ID #51(全細胞，群組1)在第1天顯示身體狀況較差且持續三天。在治療群組4(APP，群組4)中，豬ID #31如上文所述自研究除去。群組1至4中之其餘豬具有正常之健康觀察結果。

經IM接種疫苗之治療群組1、2、3及4之注射部位反應情況如下：豬#35(上清液，群組2)及豬#10(APP，群組4)在研究第1、2及3天記錄有1×1 cm² 區域腫脹。對於第21天之疫苗接種事件未記錄注射部位評估。臨床觀察顯示，在第4天及第5天豬#10(APP，群組4)、在第26天及第29天豬#20(APP，群組4)、在第19天至第35天豬#40(APP，群組4)、在第26天至第35天豬#41(APP，群組4)及在第14天至第35天豬#46(APP，群組4)頸部腫脹。所有其餘動物在該觀察階段期間均具有正常的健康傾向(disposition)。

屍體剖檢時，治療群組1(全細胞)中的豬#69及豬#75二者記錄為在注射部位具有頸部膿腫。屍體剖檢期間沒有報告其他不利的注射部位記錄。

D.　主要功效參數

1.　肉眼可見損傷

屍體剖檢時(研究第41天)，取出每頭豬的肺並針對肉眼可見損傷進行檢查。針對損傷百分比(percent involvement)對各肺葉進行記分，並將總記分指定給各個體豬。表1顯示各治療群組之平均肺損傷記分及每一群組中具有陽性記分(positive score)之動物的數量。

利用每一群組內陽性損傷數量之Wilcoxon雙樣本檢驗及Fishers確切檢驗實施統計學分析，以比較治療群組5與6及群組1至4與5之平均肉眼可見損傷記分的平均值。治療群組6(嚴格對照)在肉眼可見損傷形成(0)及陽性記分百分比數值(0%)方面呈陰性。針對平均肺損傷記分及具有損傷之百分比對群組1至5進行之評估分別介於12.68至28.67(以100分估計)及50.00%至86.67%範圍內。

治療群組5(攻擊)與其他治療群組相比具有最高之平均肉眼可見肺損傷記分(28.67)及具有肺損傷記分之百分比(86.67%)。當比較平均肉眼可見肺損傷記分及具有損傷之百分比時，治療群組5與治療群組6具有顯著差異(p0.05)。治療群組2(上清液)具有最低損傷記分(12.68)，但與具有最低損傷記分百分比(50.00%)之治療群組4(APP)相比，其具有第二最低之損傷記分百分比(60.00%)。比較群組4與5之具有肺損傷記分的百分比，差不多具有統計學差異(p=0.0502)。此外，針對肉眼可見損傷記分對群組4與5及群組2與5進行之治療群組比較無統計學差異，分別為p0.0840及p0.0685。在數值方面，治療群組1(全細胞)具有第二最高之平均肺損傷記分26.73，其次為治療群組3(omp)，其記分為21.69。治療群組3(omp)具有第二最高之損傷存在百分比數值80.00%，其次為治療群組1(全細胞)，其為66.67%。

2.　顯微鏡可見損傷

採集肺切片，固定，並提交給Iowa State Veterinary Diagnostic Laboratory以評估非特異性顯微鏡可見損傷形成(即肺炎、壞死及胸膜炎)及細菌菌落之存在。基於1至3之名義量表(nominal scale)實施記分，其中1為輕微，2為中等，且3為嚴重。基於各組織內存在之平均損傷嚴重程度及細菌菌落(病菌)之存在對各群組進行比較，且各群組之陽性頻率顯示於表2中。

利用Wilcoxon雙樣本檢驗實施統計學分析以比較各治療群組間平均顯微鏡可見肺損傷記分之平均值。亦針對各參數對每一群組內陽性動物百分比之陽性記分數值實施Fisher確切檢驗。針對枝氣管肺炎、壞死及胸膜炎損傷記分、以及陽性百分比來比較治療群組5(攻擊)與6(嚴格對照)時，發現具有統計學差異(p0.05)。對於治療群組6(嚴格對照)，所有參數之記分均為零(表2)。

發現治療群組3(omp)具有最高枝氣管肺炎損傷記分(1.60)，其次為治療群組5(攻擊)(1.27)。群組2(上清液)具有最低記分(0.87)，其次為群組4(APP)(0.93)。枝氣管肺炎之記分介於0.87至1.60範圍內。比較治療群組1至5之壞死損傷記分，介於0.47(在群組4(APP)中發現)至1.47(在群組3(omp)中發現)範圍內。比較治療群組3與4之壞死情況時，發現具有統計學差異(p0.05)。針對胸膜炎參數進一步比較治療群組1至5，顯示介於0.67(群組4(App))至1.93(群組5(攻擊))範圍內之損傷記分。當針對胸膜炎比較治療群組3與4及4與5時，發現具有統計學差異(p0.05)。治療群組1與4之比較非常接近統計學差異(p=.0544)。

陽性百分比之數值比較顯示，當針對枝氣管肺炎、壞死、胸膜炎及細菌菌落與治療群組1、2、4及5進行比較時，治療群組3(omp)具有最高記分，分別為66.67%、60.00%、66.67%及46.67%。對於枝氣管肺炎及胸膜炎參數，與治療群組5(攻擊)一同具有最高記分。此外，陽性百分比之比較顯示，當針對枝氣管肺炎、壞死、胸膜炎及細菌菌落與治療群組1、2、3及5進行比較時，治療群組4(APP)具有最低記分，分別為46.67%、26.67%、46.67%及20.00%。治療群組2(上清液)與群組4具有相同之最低枝氣管肺炎及胸膜炎參數記分，而群組2與群組1(全細胞)具有相同之細菌菌落存在頻率。對於表2中所列示參數之陽性百分比未發現統計學差異。

E.　次要功效參數

在該研究中使用次要參數來支持主要功效參數。對以下次要參數實施統計學分析。

1.　臨床觀察

在整個研究期間(第0天至第41天)自接種疫苗之日起實施臨床病徵觀察。對四個主要參數進行記分：身體狀況(憔悴)，按照1至3之量表，其中1為正常且3為死亡；行為(萎靡不振)；移動能力；及呼吸，分別按照1至4之量表，其中1為正常且4為死亡。使用所有4個參數之平均臨床記分，其中正常的健康動物記分為1，而嚴重受侵襲之動物(死亡)具有最大記分3.75。表3顯示各治療群組之平均記分。僅利用Wilcoxon雙樣本檢驗實施統計學分析以比較群組1至5之平均臨床觀察記分。

攻擊前階段期間治療群組1至5之比較顯示，在該時間段期間與治療群組1至4相比未治療之攻擊對照具有最高臨床記分1.013。治療群組4(APP)具有第二最高之平均臨床記分1.011，其次為群組1、2及3，記分分別為1.001、1.000及1.000。對於攻擊前階段，比較治療群組1至3與群組5之總平均記分時，發現具有統計學差異(p0.05)。另外，比較群組1至3與群組4時發現具有統計學差異(p0.05)。比較群組4與群組5時，未發現統計學差異。

攻擊階段期間，觀察到治療群組5(攻擊)具有最高總記分1.148，其次為群組1、3、4及2，記分分別為1.068、1.058、1.036及1.017。對於總平均臨床記分，比較群組1至4與群組5時，發現具有統計學差異(p0.05)。攻擊階段期間，治療群組5(攻擊)在第37天至第41天具有最高記分。治療群組1(全細胞)在第36天具有最高記分。此外，治療群組1(全細胞)記分在第36天後在數值上自峰值1.25跌落至介於1.00至1.07範圍內。治療群組2(上清液)具有最低總記分，且在第39、40及41天，與群組5(攻擊)相比具有統計學差異(p0.05)。群組4(APP)之進一步比較顯示，在第36天(即攻擊後1天)與群組5(攻擊)相比具有統計學差異(p0.05)。此外，在第36天，群組1及3與群組4(APP)相比具有統計學差異(p0.05)。

2.　直腸溫度

為檢測接種疫苗及攻擊之效果，在整個研究之不同時間點採集直腸溫度(第0天、第0天+4 hr、第1、3、5、7、14、21、28、34、35、36、37、38、39、40及41天)。溫度峰值高於104.9℉視為有意義。溫度超過此界限值之動物的數量列示於表4中。僅利用Fisher's確切檢驗及ANOVA實施統計學分析以比較群組1至5之發燒記分。

對於第一次接種疫苗時間段(第0天至第21天)，參考圖1及表4，所有治療群組之直腸溫度均具有大體峰值，其中治療群組3(omp)及4(APP)在接種疫苗後4小時具有較大峰值，104.9℉，且群組3(omp)之此峰值溫度持續至第1天。在群組1(全細胞)中，在第7天溫度降低至102℉，且當天比較群組1與群組2至5時觀察到統計學差異(p0.05)。此外，在第7天群組1至4之治療動物溫度在數值上低於未治療群組4至5。在研究第21天，治療動物比未治療動物之溫度數值低，且比較群組1至4與群組5時發現具有統計學差異(p0.05)。

對於加強免疫階段(第22天至第35天)，參考圖1及表5，觀察到在研究第28天治療群組4(APP)具有最高數值直腸溫度。在第28天比較治療群組1及2與群組4時觀察到統計學差異(p0.05)。

對於攻擊階段(第36天至第41天)，參考圖1及表6，觀察到在第36、37、40及41天治療群組5(攻擊)具有最高數值直腸溫度；然而，在第38天及第39天治療群組1(全細胞)具有最高直腸溫度。此外，在第36、37、38及41天治療群組4(APP)具有最低總直腸溫度。另外，在第38天治療群組5(攻擊)與治療群組4具有相同之最低溫度，且群組2及3分別在第39天及第40天具有最低溫度。群組3及5最初在攻擊後1天溫度升高，隨後群組3之溫度降低；然而，群組5之溫度在第40天再次升高。

攻擊階段之進一步評估顯示，攻擊群組5具有最高之發熱陽性動物百分比，其數值為66.67%，與群組2及4相比具有統計學差異(p0.05)。治療群組1具有第二最高記分，記分為53.33%，與群組2及4相比亦具有統計學差異(p0.05)。群組4(APP)及2(上清液)具有最低記分，分別為7.14%及13.33%。治療群組3(omp)具有33.33%之記分。

3.　細菌分離

屍體剖檢時，採集鼻腔、氣管、枝氣管、腦脊膜及心臟血液之抹片以用於細菌分離。使用各種抹片接種綿羊血瓊脂板(含有5% TSA)及MacConkey瓊脂板，劃線以用於分離，並在37℃下培育過夜。將血瓊脂板放置於厭氧及好氧條件下，並將MacConkey瓊脂板僅放置於好氧條件下。另外，巧克力瓊脂板僅用於培養肺試樣，並在37℃下於好氧條件下進行培育。獲得肺(3個含有損傷之肺葉切片)、肝、腎及扁桃體之新鮮組織試樣。使用各種組織之抹片來接種瓊脂板以用於細菌分離。將各板與上文提及之抹片試樣一起培育，並在培育後24小時觀察各板之豬放線桿菌存在情況。對各治療群組中之隨機試樣實施生物化學分析以證實豬放線桿菌之存在。僅利用Fisher's確切檢驗實施統計學分析以比較群組1至5之細菌分離記分。未對脾、腦脊膜及心臟血液實施統計學分析。表7a及7b提供細菌學結果之概述。

與其他群組(1-4)相比，治療群組5(攻擊)之各目標區域之豬放線桿菌回收率最高。發現扁桃體中豬放線桿菌之回收率百分比最高，其次為肺。在脾、腦脊膜及心臟血液參數中，豬放線桿菌回收率較低，其中治療群組中最大回收產率僅為6.67%。嚴格對照群組6之10頭豬中，有3頭豬之鼻組織呈豬放線桿菌陽性，且一頭豬之氣管組織呈豬放線桿菌陽性。比較群組3(omp)及4(APP)與群組5(攻擊)時，發現鼻組織中具有統計學差異(p0.05)。

在培養過程期間分離到其他常見的呼吸系統及細菌生物體。在所有群組中，博德特菌屬以及α及β鏈球菌細菌及多殺巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)數量較高。以非常低的數量分離到之其他生物體係膿隱秘桿菌(Arcanobacterium pyrogenes)、大腸桿菌(E. coli)、葡萄球菌屬(Staphylococcus sp)、腸球菌屬(Enterococcous sp)、變形桿菌屬(Proteus)、藍色真菌(blue fungii)及(Pastunella sp)。

4.　血清學

在研究第0、7、14、21、28、34及41天抽取血液。在研究第0天及第34天對收集自治療群組1、2、3及4之血清實施西方墨點法，以測定對各部分之免疫反應性。各治療群組由三個集中的群組組成，每一集中的群組由該治療群組之5頭豬組成。西方墨點法顯示，以1:100稀釋時可檢測到全細胞、上清液及omp部分之血清轉化，但在以1:1000稀釋時未檢測到。APP部分具有最佳反應性且可在以1:1000稀釋時檢測到。對於所有群組，在治療之前的第0天試樣中均未發現反應性。

根據本揭示內容無需過多實驗即可獲得並實施本文所揭示及主張之所有組合物及方法。儘管本發明之組合物及方法已根據較佳實施例予以闡述，但熟習此項技術者應明瞭，可改變該等組合物及方法及本文所述方法之步驟或步驟之順序，此並不背離本發明之概念、精神及範圍。更具體而言，應明瞭，在化學及生理上均相關之某些試劑可替代本文所述試劑且同時可達成相同或類似結果。熟習此項技術者顯而易見之所有該等類似替代物及修改皆被視為涵蓋於隨附申請專利範圍所界定的本發明之精神、範圍及概念內。

參考文獻

下列參考文獻明確地以引用方式併入本文中，從而提供例示性程序或其他補充本文所闡述者之細節。

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Oliveira等人，(2007) American Association Of Swine Veterinarians，第371-376頁.

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Versalovic等人，1991,Nucleic Acids Research，第19卷，第24期，6823-6831

圖1。研究第0天至第41天各治療群組之日平均溫度。

(無元件符號說明)

Claims

一種免疫原性組合物，其用於防止個體受到豬放線桿菌(Actinobacillus suis)感染，其包含a)自生長至介於0.775 OD₆₀₀ 與0.815 OD₆₀₀ 之間之一或多種豬放線桿菌培養物收集之上清液；及b)佐劑。
如請求項1之免疫原性組合物，其中該上清液基本上不含豬放線桿菌細胞。
如請求項1或2之免疫原性組合物，其中該上清液經滅活。
如請求項3之免疫原性組合物，其中該上清液經福馬林(formalin)滅活。
如請求項1或2之免疫原性組合物，其中該佐劑係Emulsigen^® -D。
如請求項1或2之免疫原性組合物，其中該個體係豬。
一種如請求項1至6中任一項之免疫原性組合物的用途，其用以製造用於降低個體與豬放線桿菌感染有關之臨床病徵之發生率或嚴重程度的藥劑，其中該臨床病徵發生率或嚴重程度比未接受該免疫原性組合物之個體降低。
如請求項7之用途，其中該臨床病徵係選自由腦脊膜炎、敗血症、子宮炎、肺炎、丹毒樣損傷及流產組成之群。
如請求項7之用途，其中該個體係豬。
一種製備如請求項1至6中任一項之免疫原性組合物的方法，其包括a)使豬放線桿菌培養物生長至介於0.775 OD₆₀₀ 至0.815 OD₆₀₀ 之間；b)自該培養物收集上清液；c)過濾該上清液以獲得濾液；及d)將該濾液與佐劑混合。
如請求項10之方法，其進一步包含滅活該上清液。
如請求項11之方法，其中該上清液在與佐劑混合之前經滅活。
如請求項10至12中任一項之方法，其中該佐劑係Emulsigen^® -D。
一種偵測來自個體之試樣中豬放線桿菌之活體外方法，其包括a)提供經過濾上清液，該上清液係藉由使豬放線桿菌培養物生長至介於0.775 OD₆₀₀ 至0.815 OD₆₀₀ 之間，自該培養物收集上清液，並過濾該上清液來製備；b)使該經過濾上清液與自該個體獲得之試樣接觸；及c)偵測能夠結合該經過濾上清液中之組份之抗體是否存在於該試樣中。
如請求項14之方法，其中使用能夠結合該試樣中之該抗體的第二抗體來檢測該結合性。
一種套組，其包含a)經過濾上清液，該上清液係藉由使豬放線桿菌培養物生長至介於0.775 OD₆₀₀ 至0.815 OD₆₀₀ 之間，自該培養物收集上清液，並過濾該上清液來製備；b)佐劑；及c)用於包裝該上清液及佐劑之容器。
如請求項16之套組，其進一步包含該套組之使用說明書。
如請求項16或17之套組，其進一步包含將該經過濾上清液投予至個體之構件。
一種用於製備如請求項1至6中任一項之免疫原性組合物的套組，其包含(i)如請求項1界定之上清液及(ii)佐劑，其中(i)及(ii)分開包裝。
如請求項19之套組，其進一步包含該套組之使用說明書。