KR102464115B1 - 돼지 흉막폐렴균 (1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형 및 15형) 불활화 사균체를 포함한 돼지 흉막폐렴 백신 조성물 - Google Patents

돼지 흉막폐렴균 (1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형 및 15형) 불활화 사균체를 포함한 돼지 흉막폐렴 백신 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 돼지 흉막폐렴균의 여러 혈청형 중 혈청형 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형 그리고 15형을 생균 같은 APP type 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형 그리고 15형의 불활화 사균체를 유효성분으로 포함하는 돼지 흉막폐렴의 예방 또는 치료용 백신 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 돼지 흉막폐렴 유래 혈청형 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형 그리고 15형 균주를 배양한 후 GI24, 클로르헥시딘 디글루코네이트 (Chlorhexidine digluconate), 클로르헥시딘 디글루네이트 수용액 (Chlorhexidine digluconate solution), 클로르헥시딘 디아세테이트 (Chlorhexidine diacetate) 및/또는 클로르헥시딘 디아세테이트 염 수화물 (Chlorhexidine diacetate salt hydrate) 등으로 처리하여 생균 같은 불활화 사균체를 혼합하여 백신 접종시킨 자돈에서 항원에 대한 체액성 면역 반응뿐 아니라 돼지 흉막 폐렴균 독성에 대하여 효과적으로 저항성(APP 1형~15형 균주에 대한)을 보임을 확인하였다. 따라서 본 발명의 생균 같은 불활화 사균체 혼합물은 안전하고 경제적이며 간편하게 접종할 수 있는 돼지 흉막폐렴 예방 및 치료용 백신으로 유용하게 사용될 것으로 기대된다.

Description

돼지 흉막폐렴균 (1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형 및 15형) 불활화 사균체를 포함한 돼지 흉막폐렴 백신 조성물 {Vaccine composition of novel inactivated Actinobacillus pleuroneumoniae bacteria (serotypes 1, 2, 5, 7, 10, 12 and 15)}
본 발명은 Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형 및 15형 불활화 사균체를 포함하는 Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) 1형 내지 15형(13형 및 14형 제외 - 현재까지 국내 분리 보고 없음)에 의한 돼지 흉막 폐렴의 예방 또는 치료용 백신 조성물에 관한 것이다.
돼지 흉막폐렴은 Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) 세균에 의해 발병하며 흔히 줄여서 APP라고 명명한다. 국내뿐만 아니라 전 세계적으로 발생하는 흔한 호흡기 질환으로, 치사율이 높을 뿐만 아니라 항생제 내성균의 증가로 인해 치료 효과가 쉽지 않다. 또한 육성돈 및 비육돈 시기에 감염 후 APP가 생산하는 독소로 기인한 급사가 일어나는 질병으로 농가에 경제적 손실을 입히는 돼지의 주요 호흡기 질환 중 하나이다. 돼지 흉막 폐렴균인 APP는 크게 15가지 혈청형이 존재하고 있으며, 균 모두 병원성을 가지고 있고, 지역과 나라별로 흉막 폐렴을 일으키는 혈청형이 달라 나라마다 혈청형이 다른 백신 개발이 필요한 실정이다. 우리나라에서는 특히 APP 1형, 2형, 5형, 7형, 12형이 가장 흔하게 돼지 흉막 폐렴을 발생시키는 것으로 알려져 있으며, 15혈청형을 비롯한 다른 혈청형도 현재 꾸준히 증가하고 있는 추세이다. 그러나 현재 사용되고 있는 불활화 백신(inactivated vaccine)으로는 다양한 혈청형에 대한 방어가 어려울 뿐만 아닐라 toxin에 의한 육성 및 비육돈의 급사를 예방할 수 없는 상태이다. 돼지 흉막폐렴의 원인균인 APP에 감염이 일단 되었다면, 기후가 급변하는 환절기나 사육환경이 좋지 못한 돼지환경으로 인해 스트레스를 받게 되면 자연스럽게 면역력 저하로 돼지 흉막폐렴이 발생할 수 있다. APP는 호흡기 세균인 만큼, 공기 전염이 가능하며, 더불어 APP가 생산하는 독소에 의해 폐 조직 및 혈구를 파괴해 병증을 더욱 악화시킨다. 보통 돼지 흉막폐렴 발병 시기는 어린 돼지 보다는 20kg이 넘는 육성돈에서부터 출하를 기다리는 돼지까지 이 시기에 집중적으로 발병하게 되는데, 이런 문제 때문에 농가는 엄청난 경제적 손실을 입게 되는 경우가 많다. 돼지에 실험적으로 감염을 시키면 APP의 독성작용에 의한 폐병변은 3시간이 지나면 발견할 수 있다. 병변의 말단부위는 죽거나 손상 받은 대식세포 또는 조직으로 채워지며, 감염 후 4일까지 쉽게 정상 폐와 구별할 수 있게 된다. 이후 병변이 진행되면서 병변의 중심부가 괴사되며 치유과정으로 진행되면 섬유화 된다. 많은 연구자들의 연구를 통해 단위체(subunit) 백신의 흉막폐렴 예방에 대한 가능성을 보여주었다 (Kamp et al., 1994; Haesebrouck et al., 2004). 특히 단위체 항원 후보 중에서 Apx 단백질의 경우 흉막폐렴 예방에 가능성이 높은 항원으로 연구되어 왔다 (Meeusen et al., 2007). 이러한 연구에 따라 Apx 톡신 단위체 항원과 불활화 박테린 (Bacterin)의 조합을 통해 새로운 백신이 개발되고 있다 (Seah et al., 2002; Kim et al., 2010; Seo et al., 2013; Lee et al., 2014). 그럼에도 불구하고 각 나라마다 새로운 혈청형이 계속 증가하고 있어 모든 혈청형에 대한 방어가 가능하도록 교차 방어가 가능한 불활화 박테린 추가가 필요한 실정이다.
클로르헥시딘 디글루코네이트 수용액 (Chlorhexidine digluconate solution) 또는 클로르헥시딘 디아세테이트 염 수화물 (Chlorhexidine diacetate salt hydrate)은 현재 사용되고 있는 소독제 중 가장 많이 선택되고 있는 소독제 중 하나이다. 클로르헥시딘 계열은 타액과 혀에서 세균을 죽여 입에서 감염성 질병을 예방하고 근절하는데 매우 효과적인 것으로 보고되고 있다. 더불어 그람 음성균이나 양성균 그리고 곰팡이까지 넓은 범위에 사용할 수 있는 소독제이다. 클로르헥시딘 계열은 강력한 항균기능을 가지고 있지만, 포유류 세포에는 상대적으로 낮은 독성을 보이는 것으로 보고되고 있어, 가장 유용한 소독제로 추천되고 있는 제품이다. 하지만 아직까지 세포를 죽이는 클로르헥시딘 계열의 기전에 대해서는 명확하게 알려지지 않고는 있지만, 세포벽에 부착하여 세포에 구멍을 만들어 세포를 죽음에 이르게 하는 것으로 알려져 있다.

APP 혈청형간 교차 방어가 가능하다 즉, 1형, 9형, 11형이 그리고 4형, 7형이, 더불어 3형, 6형, 8형, 15형이 각각 서로 교차 방어가 가능하다고 알려져 있다. 따라서 우선 클로르헥시딘 디글루코네이트 (또는 이의 수용액)를 이용하여 APP 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형, 15형 균주를 생균 같은 불활화 사균체 백신으로 유도하는 것이며, 그다음으로는 이렇게 유도된 신개념 사균체가 돼지에서 병독성 APP 1형 내지 15형까지 모든 혈청형을 혼합(13형 및 14형 제외 - 현재까지 국내 분리 보고 없음)하여 비강 내 도전 감염 후 이들 균주에 완벽한 방어 여부를 확인하기 위함이다.
따라서, 본 기술은 모든 혈청형을 예방할 수 있는 생균 같은 불활화 사균체를 제조하여 현재 국내에서 유행하고 있는 APP 1형, 2형, 5형, 7형, 12형뿐만 아니라 3형, 4형, 6형, 8형, 9형, 10형, 11형, 15형 등 다양한 혈청형에 대한 방어가 가능한 백신 제조 기술이다.
본 발명은 상기와 같이 모든 APP 혈청형의 감염을 예방 또는 감염의 억제 또는 감염으로 인한 증상을 완화시킬 수 있는 백신 조성물을 제공하기 위한 것으로. 본 발명자들은 클로르헥시딘 디글루코네이트 수용액 (Chlorhexidine digluconate solution) 또는 클로르헥시딘 디아세테이트 염 수화물 (Chlorhexidine diacetate salt hydrate)을 이용하여, 돼지 흉막폐렴균 (APP)를 신개념 불활화 사균체로 유도하여 생균 같은 불활화 사균체를 제작하였고, 상기 APP 불활화 사균체를 포함하는 불활화 백신이 돼지 흉막 폐렴에서 독소 함유 포르말린 불활화 사균체 혼합 백신보다 탁월한 방어효과를 가지는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기의 목적을 달성하기 위해 본 발명은 흉막폐렴균 APP type 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형 및 15형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 균주에 포르말린, GI24, 클로르헥시딘 디글루코네이트 (Chlorhexidine digluconate), 클로르헥시딘 디글루네이트 수용액 (Chlorhexidine digluconate solution), 클로르헥시딘 디아세테이트 (Chlorhexidine diacetate) 및 클로르헥시딘 디아세테이트 염 수화물 (Chlorhexidine diacetate salt hydrate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상과 반응시켜서 사멸화된, APP (Actinobacillus pleuropneumoniae) type 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형 및 15형으로 이루어진 군으로 선택되는 어느 하나 이상의 균주의 불활화 사균체를 제공할 수 있다.
상기 포르말린, GI24, 클로르헥시딘 디글루코네이트 (Chlorhexidine digluconate), 클로르헥시딘 디글루네이트 수용액 (Chlorhexidine digluconate solution), 클로르헥시딘 디아세테이트 (Chlorhexidine diacetate) 및 클로르헥시딘 디아세테이트 염 수화물 (Chlorhexidine diacetate salt hydrate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 농도는 0.1 ㎕/ml (0.0106ug/ml)에서 100㎕/ml (10.6ug/ml)일 수 있다.
상기 돼지 흉막폐렴균 APP type 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형 및 15형으로 이루어진 군으로 선택되는 균주는 기탁번호 KCTC 14111BP 일 수 있다.

본 발명은 또한 다음 단계를 포함하는 APP (Actinobacillus pleuropneumoniae) type 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형 및 15형으로 이루어진 균으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 균주의 불활화 사균체를 제조하는 방법을 제공할 수 있다.
(a) APP type 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형, 15형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 균주(수탁번호: KCTC 14111BP)를 각각 배지에 접종한 후 배양하는 단계;
(b) 상기 배양된 APP 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형 및 15형 균주로 이루어진 균으로부터 선택되는 어느 하나의 균주에 포르말린, GI24, 클로르헥시딘 디글루코네이트 (Chlorhexidine digluconate), 클로르헥시딘 디글루네이트 수용액 (Chlorhexidine digluconate solution), 클로르헥시딘 디아세테이트 (Chlorhexidine diacetate) 및 클로르헥시딘 디아세테이트 염 수화물 (Chlorhexidine diacetate salt hydrate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 첨가하여 실온에서 5분 내지 16시간 반응시키는 단계;
(c) 상기 (b) 단계 이후에 상기 배양된 APP 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형, 15형 균주로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 균주를 원심 후 0.1 내지 1 M sucrose 또는 0.1 내지 1 M glucose로 부유시키는 단계;
(d) 상기 (c) 단계 이후에 상기 배양된 APP type 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형 및 15형 균주로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 균주를 원심 후 상층 액을 버린 다음 클로르헥시딘 디글루코네이트 (Chlorhexidine digluconate), 클로르헥시딘 디글루네이트 수용액 (Chlorhexidine digluconate solution), 클로르헥시딘 디아세테이트 (Chlorhexidine diacetate) 및 클로르헥시딘 디아세테이트 염 수화물 (Chlorhexidine diacetate salt hydrate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 첨가하여 교반하는 단계; 및
(e) 상기 (d) 단계 이후에 교반물을 실온에서 5분 내지 16시간 반응시키는 단계.
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본 발명은 다른 목적을 달성하기 위해서, 상기 서술한 APP type 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형 및 15형으로 이루어진 어느 하나 이상의 균주의 불활화 사균체; 이의 배양물 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 돼지 흉막 폐렴 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공할 수 있다.
상기 백신 조성물은 담체, 희석제 및 보조제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.
상기 보조제는 알루미늄수산화 나트륨, IMS1313 (또는 VG), ISA 15A (또는 VG), ISA 35 (또는 VG), ISA 28 (또는 VG), ISA 201 (또는 VG), ISA 206 (또는 VG), GEL 01 및 GEL 02으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 백신 조성물은 자돈 또는 모돈의 경구, 경피, 근육 내, 복막 내, 피내, 피하 내 및 비강 경로로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 경로로 투여될 수 있다.
본 발명은 다른 목적을 달성하기 위해서, 상기 서술한 APP type 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형 및 15형으로 이루어진 어느 하나의 균주의 사균체; 이의 배양물 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 돼지 흉막 폐렴 예방 또는 개선용 사료 첨가제를 제공할 수 있다.
본 발명은 다른 목적을 달성하기 위해서, 상기 서술한 APP type 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형 및 15형으로 이루어진 어느 하나 이상의 균주의 불활화 사균체; 이의 배양물 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 자돈 또는 모돈에 급여 또는 접종하는 단계;를 포함하는 돼지 흉막 폐렴을 예방하는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 돼지 흉막폐렴균 type 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형 및 15형의 신개념 불활화 사균체만으로 다양한 혈청형에 대한 방어력이 뛰어나고 안전한 백신을 제공함으로써 돼지 흉막 폐렴의 감염 및 증상을 완화시킬 수 있다.
도 1은 클로르헥시딘 디글루코네이트 수용액 (Chlorhexidine digluconate solution) 또는 클로르헥시딘 디아세테이트 염 수화물 (Chlorhexidine diacetate salt hydrate)로 생균같은 불활화 사균체 유도 전*후의 전자현미경 (TEM)사진이다.
도 2는 각 그룹별로 APP의 혈청형 2와 5 항원에 대한 혈청 내 IgG 항체 역가 (A)를 나타낸다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
돼지 흉막폐렴은 Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) 세균에 의해 발병하며 흔히 줄여서 APP라고 명명한다. 국내뿐만 아니라 전 세계적으로 발생하는 흔한 호흡기 질병이지만, 감염 후 치사율이 높을 뿐만 아니라 항생제 내성균의 증가로 인해 치료 효과가 쉽지 않다. 또한 육성돈 및 비육돈 시기에 감염 후 APP가 생산하는 독소로 기인한 급사가 일어나는 질병으로 농가에 경제적 손실을 입히는 돼지의 주요 호흡기 질환 중 하나이다. 특히, 돼지 흉막폐렴균인 APP는 크게 15가지 혈청형이 존재하고 있으며, 균 모두 병원성을 가지고 있고, 지역과 나라별로 흉막 폐렴을 일으키는 혈청형이 달라 나라마다 상기 돼지 흉막폐렴을 예방 또는 치료하기 위해 많은 연구가 현재 진행 중이다. 가장 효과적으로, 소수의 혈청형 혼합 백신이 각 나라별 다른 혈청형에 대해 또는 많은 혈청형에 대한 방어효과를 가진 백신이 가장 이상적인 백신이라고 생각되고 있다. 그러나 기존의 백신 제조 방법으로는 백신 제조에 사용된 혈청형조차도 방어하지 못하는 경우가 있어 백신의 효력이 완전히 작용할 수 없는 상황이 많이 발생할 수 있다. 따라서 소수의 혈청형으로 국내 또는 많은 혈청형에 대해 방어 효능이 우수하면서 불활화 사균 백신처럼 안전한 신개념의 백신 개발이 필요하다. 특히, 백신 접종 전후에도 안심하고 항생제 처치 등이 가능한 백신 개발이 필요하다. 본 발명자들은 돼지 흉막폐렴 증상으로 폐사한 돼지로부터 분리한 APP type 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형 그리고 15형에 클로르헥시딘 디글루코네이트 수용액 (Chlorhexidine digluconate solution) 또는 클로르헥시딘 디아세테이트 염 수화물 (Chlorhexidine diacetate salt hydrate)로 생균 같은 불활화 사균체를 유도하였고, 상기 APP type 1형, 2형, 3형, 5형, 7형, 10형, 12형 또는 15형 혼합 불활화 사균체를 자돈에 근육 접종한 결과 적은 량으로도 효과적으로 돼지 흉막 폐렴을 예방하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 돼지 흉막폐렴균 APP type 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형 및 15형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 균주에 포르말린, GI24, 클로르헥시딘 디글루코네이트 (Chlorhexidine digluconate), 클로르헥시딘 디글루네이트 수용액 (Chlorhexidine digluconate solution), 클로르헥시딘 디아세테이트 (Chlorhexidine diacetate) 및 클로르헥시딘 디아세테이트 염 수화물 (Chlorhexidine diacetate salt hydrate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상과 반응시켜서 사멸화된, APP (Actinobacillus pleuropneumoniae) type 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형 및 15형으로 이루어진 군으로 선택되는 어느 하나 이상의 균주의 불활화 사균체에 관한 것이다.
본 발명의 연구자들은 돼지 흉막폐렴 증상을 보이는 돼지로부터 분리한 APP type 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형 또는 15형 균주를 배양한 후 GI24, 클로르헥시딘 디글루코네이트 (Chlorhexidine digluconate), 클로르헥시딘 디글루네이트 수용액 (Chlorhexidine digluconate solution), 클로르헥시딘 디아세테이트 (Chlorhexidine diacetate) 및/또는 클로르헥시딘 디아세테이트 염 수화물 (Chlorhexidine diacetate salt hydrate) 등을 1 ul/ml 내지 20 ul/ml (0.106 mg/ml 내지 2.12 mg/ml) 씩 첨가하여 생균 같은 불활화 사균화를 유도하여 백신 항원으로 제조하였다. 상기 APP type 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형 및 15형 불활화 사균체를 투사전자현미경을 이용하여 확인한 결과, 상기 APP type 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형 및 15형 불활화 사균체에서 구멍이 뚫린 세포막과 더불어 빈 세포질 공간이 관찰되었다. 이로써, APP type 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형 및 15형 불활화 사균체의 라이시스 (lysis)가 유도되어 불활화 사균체가 된 것을 확인하였다 (도 1B). 더불어 포르말린을 이용하여 APP type 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형 및 15형을 통상적인 방법에 따라 불활화 사균체를 제조하여 백신 항원으로 제조하였다.
상기 GI24, 클로르헥시딘 디글루코네이트 (Chlorhexidine digluconate), 클로르헥시딘 디글루네이트 수용액 (Chlorhexidine digluconate solution), 클로르헥시딘 디아세테이트 (Chlorhexidine diacetate) 및 클로르헥시딘 디아세테이트 염 수화물 (Chlorhexidine diacetate salt hydrate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 농도는 0.1 ㎕/ml (0.0106ug/ml) 내지 100㎕/ml (10.6mg/ml)일 수 있고, 바람직하게는 1㎕/ml (0.106mg/ml) 내지 20 ㎕/ml (2.12mg/ml)일 수 있고, 더 바람직하게는 1㎕/ml (0.106 mg/ml) 내지 5㎕/ml (0.53 mg/ml)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 포르말린은 통상적으로 백신 제조에 사용하는 농도와 제조 방법에 따라 사용하였다 (문 등 2019, 한국가축위생학회지, 42(4):257-264).
상기 GI24, 클로르헥시딘 디글루코네이트 (Chlorhexidine digluconate), 클로르헥시딘 디글루네이트 수용액 (Chlorhexidine digluconate solution), 클로르헥시딘 디아세테이트 (Chlorhexidine diacetate) 및 클로르헥시딘 디아세테이트 염 수화물 (Chlorhexidine diacetate salt hydrate) 등은 소독약 중에 하나이며, 넓은 항균스펙트럼을 지니고 그람음성, 그람양성의 양균에 살균력을 가지고 있다. 클로르헥시딘을 포함하는 모든 형태 [클로르헥시딘 디글루코네이트 (Chlorhexidine digluconate), 클로르헥시딘 디글루네이트 수용액 (Chlorhexidine digluconate solution), 클로르헥시딘 디아세테이트 (Chlorhexidine diacetate), 클로르헥시딘 디아세테이트 염 수화물 (Chlorhexidine diacetate salt hydrate)]로 처리 될 수 있고, 바람직하게는 클로르헥시딘 디글루코네이트 수용액 (Chlorhexidine digluconate solution) 또는 클로르헥시딘 디아세테이트 염 수화물 (Chlorhexidine diacetate salt hydrate)을 사용할 수 있다.
상기 돼지 흉막폐렴균 APP type 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형 및 15형 균주로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나는 기탁번호 KCTC 14111BP일 수 있다.

본 발명은 하기의 단계를 포함하는 APP (Actinobacillus pleuropneumoniae) type 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형 및 15형 불활화 사균체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 제조하는 방법에 관한 것이다.
(a) 기탁번호 KCTC 14111BP인 돼지 흉막폐렴균 APP type 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12(a) APP type 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형, 15형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 균주(수탁번호: KCTC 14111BP)를 각각 배지에 접종한 후 배양하는 단계;
(b) 상기 배양된 APP 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형 및 15형 균주로 이루어진 균으로부터 선택되는 어느 하나의 균주에 포르말린, GI24, 클로르헥시딘 디글루코네이트 (Chlorhexidine digluconate), 클로르헥시딘 디글루네이트 수용액 (Chlorhexidine digluconate solution), 클로르헥시딘 디아세테이트 (Chlorhexidine diacetate) 및 클로르헥시딘 디아세테이트 염 수화물 (Chlorhexidine diacetate salt hydrate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 첨가하여 실온에서 5분 내지 16시간 반응시키는 단계;
(c) 상기 (b) 단계 이후에 상기 배양된 APP 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형, 15형 균주로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 균주를 원심 후 0.1 내지 1 M sucrose 또는 0.1 내지 1 M glucose로 부유시키는 단계;
(d) 상기 (c) 단계 이후에 상기 배양된 APP type 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형 및 15형 균주로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 균주를 원심 후 상층 액을 버린 다음 클로르헥시딘 디글루코네이트 (Chlorhexidine digluconate), 클로르헥시딘 디글루네이트 수용액 (Chlorhexidine digluconate solution), 클로르헥시딘 디아세테이트 (Chlorhexidine diacetate) 및 클로르헥시딘 디아세테이트 염 수화물 (Chlorhexidine diacetate salt hydrate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 첨가하여 교반하는 단계; 및
(e) 상기 (d) 단계 이후에 교반물을 실온에서 5분 내지 16시간 반응시키는 단계.
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상기 (a) 단계 이후에 상기 배양된 APP type 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형 및 15형으로 이루어진 군으로 선택되는 어느 하나의 균주를 원심 후 0.1 내지 1.0 M sucrose 또는 0.1 내지 1.0 M glucose로 부유시키는 단계;를 추가로 포함할 수 있다. 상기 0.1 내지 1.0 M sucrose 또는 0.1 내지 1.0 M glucose는 바람직하게는 0.1 내지 0.5 M sucrose 또는 0.1 내지 0.5 M glucose, 더 바람직하게는 0.3 M sucrose 또는 0.3 M glucose일 수 있다.배지나 기타 NaCl이 들어간 용액에 곧바로 클로르헥시딘 및 유사 물질을 첨가하게 되면 이 두 시약이 반응하여 거품을 만들게 되고 그 거품은 튜브 벽에 붙어 잘 용해가 되지 않아, 정확한 용량으로 투여하는데 어려움이 있다. 상기 농도의 glucose 또는 sucrose를 사용하여 부유할 경우, 균을 정확한 용량으로 투여할 수 있다.
상기 (a) 단계의 배지는 한정하지는 않으나, β-NAD가 50 ug/ml씩 첨가된 Tryptic soy borth, Brain Heart Infusion broth, LB, Nutrient broth 일 수 있고, 바람직하게는 β-NAD가 50 ug/ml씩 첨가된 Tryptic soy borth 배지일 수 있다.
상기 (a) 단계의 배양 온도는 한정하지는 않으나, 25℃ 내지 47℃에서 배양 할 수 있고, 바람직하게는 30℃ 내지 42℃일 수 있으며, 가장 바람직하게는 35℃ 내지 37℃일 수 있다.
본 발명은 상기 서술한 APP type 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형 및 15형으로 이루어진 어느 하나의 균주의 불활화 사균체; 이의 배양물 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 돼지 흉막 폐렴 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명자들은 APP type 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형 및 15형에 포르말린, GI24, 클로르헥시딘 디글루코네이트 (Chlorhexidine digluconate), 클로르헥시딘 디글루네이트 수용액 (Chlorhexidine digluconate solution), 클로르헥시딘 디아세테이트 (Chlorhexidine diacetate) 및/또는 클로르헥시딘 디아세테이트 염 수화물 (Chlorhexidine diacetate salt hydrate) 등으로 처리한 생균 같은 APP type 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형 그리고 15형 불활화 사균체를 돼지의 근육에 접종한 결과, 돼지의 혈청 IgG의 항체 역가(2형과 5형만 측정)가 대조군에 비해 유의성 있게 증가하고 (도 2), 야외 병독주인 APP type 1형에서 15형 모두를 혼합 (13형, 14형 제외 - 현재까지 국내 분리 보고 없음)하여 도전감염을 시행한 결과, 아무것도 처리하지 않은 대조군은 2일째부터 폐사하기 시작하여 도전감염 3일 째에는 5마리 중 3마리가 폐사하였고 도전감염 후 1주일 째 부검 소견에서 생존 한 모든 돼지에서 전형적인 돼지 흉막폐렴 증상이 관찰 된 반면 (표 2), 본 발명의 균주를 3.0 x 109 cells/pig로 2회 접종한 군은 도전감염을 수행하지 않은 그룹과 더불어 폐사 및 돼지 흉막 폐렴의 증상이 관찰되지 않아 돼지 흉막폐렴을 100% 방어한 것이 관찰되었다 (표 2). 본 발명의 균주는 근육 접종하였을 때 탁월한 방어 효과가 있어, 돼지 흉막 폐렴을 예방 또는 치료할 수 있는 효과가 있다.
본 발명에서 용어 "백신"은 생체에 면역을 주는 항원을 함유한 생물학적인 제제로서, 감염증의 예방을 위하여 사람이나 동물에 주사하거나 경구 투여함으로써 생체에 면역이 생기게 하는 면역원 또는 항원성 물질을 말한다. 생체 내 면역은 병원균의 감염 후에 생체 내 면역력이 자동으로 얻어지는 자동 면역과 외부에서 주입한 백신에 의하여 얻어지는 수동 면역으로 크게 나누어진다. 자동 면역은 면역에 관계하는 항체의 생성기간이 길고 지속적인 면역력의 특징이 있는 반면, 백신에 의한 수동 면역은 감염증 치료에 즉시 작용하나 지속력이 떨어지는 단점이 있다.
상기 백신 조성물은 담체, 희석제 및 보조제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 상기 백신 조성물은 수의학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어 "수의학적으로 허용 가능한 담체"란 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항원 보강제, 안정제, 희석제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장성 작용제, 흡착 지연제 등을 포함한다. 백신용 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제, 희석제로는 글루코스, 락토즈, 덱스트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 글리세린, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트,젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트,프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다.
또한, 상기 백신용 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 드립 (drip) 또는 스프레이 등의 비강용 제형 그리고 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 레시틴 유사 유화제에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 글루코스, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 사용할 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 포함된다. 비수용성제제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리 에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 비강내 투여를 위한 제제에 적합한 침투제는 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다. 그러한 적합한 제형물은 안정성과 순응도를 위해 바람직하게 무균, 등장 및 완충되도록 제형 화된다. 비강내 투여를 위한 제제는 또한 정상적인 섬모 작용을 유지시키기 위해 점액 분비를 여러 측면에서 자극하도록 제조되며, 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA(1990))에 기술된 바와 같이, 적합한 제형이 바람직하게 등장성의, pH 5.5 내지 6.5를 유지하는 약간 완충된 제형이며, 가장 바람직하게 항미생물 방부제 및 적합한 약물 안정화제를 포함한다.
상기 백신 조성물은 안정제, 유화제, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, pH 조절제, 계면활성제, 리포솜, 이스콤 (iscom) 보조제, 합성 글리코펩티드, 증량제, 카복시폴리메틸렌, 서브바이랄 (subviral) 입자 보조제, 콜레라 독소, N,N-디옥타데실-N',N'-비스(2-하이드록시에틸)-프로판디아민, 모노포스포릴 지질 A, 디메틸디옥타데실-암모늄 브로마이드, Marcol-Aracel, Chlorhexidine 및 이의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 제 2 보조제를 추가로 함유할 수 있다. 바람직하게는 알루미늄수산화 나트륨, IMS1313 (또는 VG), ISA 15A (또는 VG), ISA 35 (또는 VG), ISA 28 (또는 VG), ISA 201 (또는 VG), ISA 206 (또는 VG), GEL 01 및 GEL 02으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 사용할 수 있고, 가장 바람직하게는 알루미늄수산화 나트륨 또는 IMS1313 (또는 VG))을 아쥬번트로 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 근육 내, 정맥 내, 피내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 바람직하게는 APP 불활화 사균체 백신을 경구 또는 근육 내 투여할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 조성물의 투여량은 돼지의 무게, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 상기 APP type 1형, 2형, 3형, 5형, 7형, 10형, 12형 그리고 15형 불활화 사균체 혼합 백신 조성물의 투여량은 돼지 1두당 약 3.0 x 108 내지 3.0 x 1011 세포, 바람직하게는 약 3.0 x 109 내지 3.0 x 1010 세포로 1회 내지는 2회 투여하는 것이 바람직하다.
상기 돼지는 임신 모돈, 포유자돈, 이유 자돈으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 상기 백신 조성물은 이유 자돈 및 육성 비육돈에 접종할 수 있다.
본 발명은 다른 목적을 달성하기 위해, 상기 서술한 APP type 1형, 2형, 5형, 7형, 10형 및 12형으로 이루어진 어느 하나의 균주의 불활화 사균체; 이의 배양물 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 돼지 흉막 폐렴 예방 또는 개선용 사료 첨가제를 제공한다.
본 발명의 사료 첨가제는 상기 서술한 APP type 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형 그리고 15형 불활화 사균체 또는 이의 혼합물을 원형 그대로 사용하거나 또는 추가적으로 가축에 허용되는 곡류 및 그 부산물 등의 공지된 담체, 안정제 등을 가할 수 있으며, 필요에 따라 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산 등의 유기산이나 인산나트륨, 인산칼륨, 산성 피로인산염, 폴리인산염 (중합인산염) 등의 인산염이나, 폴리페놀, 카테킨, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제, 항생물질, 항균제 및 기타의 첨가제 등을 가할 수도 있으며, 그 형상으로서는 분체, 과립, 펠릿, 현탁액 등의 적당한 상태일 수 있으며, 상기 사료첨가제를 공급하는 경우는 가축 등에 대하여 단독으로 또는 사료에 혼합하여 공급할 수 있다.
상기 서술한 APP type 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형 및 15형으로 이루어진 어느 하나의 균주의 불활화 사균체; 이의 배양물 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 자돈 또는 모돈에 급여 또는 접종하는 단계;를 포함하는 돼지 흉막 폐렴을 예방하는 방법을 제공할 수 있다.
이하에서는 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 하기 실시 예는 본 발명의 바람직한 일 구체적인 예일 뿐이며, 본 발명의 권리범위가 하기 실시 예의 범위로 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 박테리아 균주 및 성장 조건
본 실험에 사용된 APP type 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형 그리고 15형은 돼지 흉막 폐렴 증상으로 보이는 돼지로부터 분리하였고, 생균 같은 불활화 사균체 제조에 사용하였다. 상기 type 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형 그리고 15형 그리고 돼지 흉막 폐렴 증상을 보이는 돼지로부터 분리한 4형, 9형, 11형은 도전감염균주로 사용하였다. 모든 균주는 β-NAD가 50 ug/ml씩 첨가된 Tryptic soy borth와 chocolate agar에 접종되어 37℃에서 배양되었다.
<실시예 2> APP type 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형 그리고 15형 생균 같은 불활화 사균체 백신 제조
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APP type 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형 그리고 15형 각각 한 콜로니를 선택하여 β-NAD이 50 ug/ml씩 첨가된 Tryptic soy borth 200ml에 각각 접종하여 배양했다. 배양된 배지를 원심 분리하여 상층액을 버리고 GI24, 클로르헥시딘 디글루코네이트 (Chlorhexidine digluconate), 클로르헥시딘 디글루네이트 수용액 (Chlorhexidine digluconate solution), 클로르헥시딘 디아세테이트 (Chlorhexidine diacetate) 및/또는 클로르헥시딘 디아세테이트 염 수화물 (Chlorhexidine diacetate salt hydrate) 등을 5 ul/ml (5.3 mg/ml) 씩 첨가하여 침전균체를 풀어준 후 곧바로 멸균 PBS(Phosphate buffered saline) 200 ml로 재부유시키거나 또는 원심분리 후 0.1M 내지 0.3M sucrose 20 ml로 재부유시켜 GI24, 클로르헥시딘 디글루코네이트 (Chlorhexidine digluconate), 클로르헥시딘 디글루네이트 수용액 (Chlorhexidine digluconate solution), 클로르헥시딘 디아세테이트 (Chlorhexidine diacetate) 및/또는 클로르헥시딘 디아세테이트 염 수화물 (Chlorhexidine diacetate salt hydrate) 등을 1 ul/ml (1.06 mg/ml) 내지는 5 ul/ml (5.3 mg/ml)씩 첨가하여 실온에서 5분에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 생균 같은 불활화 사균체로 유도 여부를 확인하기 위해 각 반응액 중 100㎕ 씩을 chocolate agar와 β-NAD이 50 ug/ml씩 첨가된 Tryptic soy borth 10 ml에 각각 접종하여 37℃에서 7일간 배양하여 콜로니 형성 유무로 완전 불활화 여부를 확인하였다. 상기 확인된 반응액을 4,000 ×에서 30분간 원심 분리하여 농축하였고, 멸균 PBS(Phosphate buffered saline)로 세척한 후 최종적으로 IMS1313을 사용하여 각 혈청형 당 1.5*109 cells/ml이 되도록 희석하여 냉장보관하면 실험에 사용하였다.
<실시예 3> APP type 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형 그리고 15형 생균 같은 불활화 사균체의 투사전자현미경 (TEM)
상기 실시예 2의 방법으로 제조한 생균 같은 APP type 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형 그리고 15형 불활화 사균체를 IMS1313과 혼합하기 전에 하룻밤 2.5% 글루타르 알데히드로 선 고정 후, 박테리아 펠릿을 PBS로 3회 세척하고 2시간 동안 PBS에 1% 사산화오스뮴으로 후 고정하였다. 고정된 박테리아 세포를 PBS로 3회 세척하고 다양한 일련의 에탄올(50%, 70%, 90%, 100%)에 15분 동안 탈수시켰다. 20분 동안 무수 아세톤에 배치한 후, 이러한 샘플을 각각 1시간 동안 무수 아세톤 및 에폭시 수지의 1:1 및 1:3 혼합물에 옮기고, 밤새 순수 에폭시 수지에 옮겼다. 울트라마이크로톰 (Ultramicrotome)를 이용하여 얻은 초박 절편을 우라닐 아세테이트와 리드 시트레이트로 후-염색하였다. 표본을 투과전자현미경(Hitachi H-7650, Japan)으로 관찰하였다. TEM은 Lv et al (Lv et al. 2014)에 설명된 방식에 따라 촬영되었다. 도 1A에서 보는 것처럼, 상기 실시예 2에서 사용되었던 사균화 유도 물질로 처리하지 않은 APP type 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형 그리고 15형 균주는 온전한 세포막과 세포 내를 가득 메운 세포 내용물이 관찰되었다 (도 1A). 반면, 클로르헥시딘 디글루코네이트 (Chlorhexidine digluconate) 또는 클로르헥시딘 디글루코네이트액(Chlorhexidine digluconate solution)로 유도된 생균 같은 불활화 사균화된 APP type 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형 그리고 15형은 도 1B에서 보는 것처럼 하나의 구멍이 뚫린 세포막과 더불어 빈 세포질 공간이 관찰되었다.
<실시예 4> 포르말린 처리 APP type 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형 그리고 15형 불활화 사균체 백신 제조
APP type 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형 그리고 15형 균주 각각 한 콜로니를 선택하여 β-NAD이 50 ug/ml씩 첨가된 Tryptic soy borth 200ml에 각각 접종하여 배양하였다. 배양된 배지에 포르말린을 0.3%가 되도록 첨가하여 37℃에서 48시간 반응 시켰다. 반응 후 사균 여부를 확인하기 위해 각 반응액 중 100㎕ 씩을 chocolate agar와 β-NAD이 50 ug/ml씩 첨가된 Tryptic soy borth 10 ml에 각각 접종하여 37℃에서 7일간 배양하여 콜로니 형성 유무로 완전 불활화 여부를 확인하였다. 포르말린-불활화 APP 불활화 사균체는 4,000 rpm에서 30분간 원심하여 농축하였고, 멸균 PBS로 세 번 세척한 후 IMS1313을 사용하여 각 혈청형 당 1.5*109 cells/ml이 되도록 희석하여 냉장보관하면 포르말린-불활화 APP 불활화 사균체 백신으로 실험에 사용하였다.
<실시예 5> 백신 접종 및 면역반응 평가를 위한 ELISA
15마리의 자돈을 3개 그룹으로 나누어 따로 격리하여 사육하면서 백신접종에 의한 항체 생성 및 공격접종 시험을 실시하였다. 백신 접종 시기는 4주령과 6주령 1번에 걸쳐 2 ml 씩 근육접종으로 실시하였다. 그룹 A의 경우 대조군으로 멸균 PBS 2 ml을 접종하였으며, 그룹 B의 경우 포르말린-불활화 APP type 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형 그리고 15형이 동 균수로 혼합되게 섞어 총 사균체가 3*109 cells/pig in 2ml가 되도록 제조된 포르말린-불활화 APP 불활화 사균체 백신을 근육 접종하였으며, 그룹 C의 경우는 클로르헥시딘 디글루코네이트 수용액 (Chlorhexidine digluconate solution) 또는 클로르헥시딘 디아세테이트 염 수화물 (Chlorhexidine diacetate salt hydrate)로 유도된 생균 같은 불활화 사균화된 APP type 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형 그리고 15형이 동 균수로 혼합되게 섞어 총 사균체가 3*109 cells/pig in 2ml가 되도록 제조된 백신을 근육 접종하였다. 백신 접종 후 백신 접종에 의한 면역반응 평가를 위해 백신 1차 접종 전 (0 week post prime immunization; WPPI), 2차 접종 전(2 WPPI), 2차 접종 후 2주 후 (4 WPPI, 도전 감염 전)에 각각 혈액을 채취하여 시판되고 있는 APP 2형과 5형에 대한 항체가를 측정하기 위한 키트를 구매하여 2형과 5형에 대한 항체역가만을 측정하였다. 모든 가검물은 사용하기까지 영하 70℃에 저장하면서 실험에 사용하였다. APP serotype 2형과 APP serotype 5형 세포외막 단백질에 특이적인 IgG titer를 측정하기 위하여 ELISA 실험은 VDProSwine Respiratory ELISA system AP2-AB, AP5-AB(MEDIAN DiagnosticsInc.) kit를 사용하였다. 최초 혈청 샘플은 PBS로 1/100으로 희석하여 10배씩 serial dilution 방법으로 희석하여 최종 항체 가를 측정하여 결정하였다. 도 2에서 보여주듯이 각각의 혈청형에 대한 항원에 대한 항체 반응은 그룹 B 및 C에서 백신 접종 후 2주 후부터 증가하는 것을 관찰할 수 있었다.
<실시예 6> 공격접종을 통한 방어력 시험
공격 접종은 APP serotype 1형에서 15형까지 모든 혈청형 (3형, 6형, 8형, 13형, 14형 제외 - 현재까지 국내 분리 보고 없음, 그리고 3형, 6형, 8형은 15형과 서로 교차 방어가 가능하다고 알려지고 있음)을 2차 백신 접종 후 2주 후에 각 비강에 6*109 cfu/1 ml 씩 양쪽 비강에 각각 접종 하였다. 공격접종 후 모든 자돈은 매일 하루에 두 번씩 관찰하였으며 이상 반응 또는 이상 행동을 7일간 관찰하였다. 비정상적인 육안 관찰 소견을 보이는 모든 돼지는 안락사 시킨 후 폐 육안적 소견을 검사하였으며 공격 접종균의 분리를 시도하였다. 분리된 균은 chocolate agar에 배양한 후 APP serotype 1형-15형과 일치하는 primer를 이용하여 PCR 검사로 혈청형을 검사하였다. PCR에 사용된 프라이머는 하기 표 1과 같다.
실험에 시용된 프라이머
Target gene Primer name Sequence Size
APP 1 Ap 1F CTGGAGTAATTACGGCGACTATTCC 959
Ap 1R AGGAGAAGCTAGTAGTACTTGCATTTTC
APP 2 Ap 2F GAGTGTGATGATGATGCTCTGGTTC 247
Ap 2R TACCAATAACTGTTGCAACTAACGC
APP 4 Ap 4F CAGCATGGGTTTGGTCCTGTTG 204
Ap 4R GGCTTTCTCCGTGTATGAATAAAGTG
APP 5 Ap 5F AGCCACAAGACCCGAATGGTATAATG 825
Ap 5R CCATCAAATGCAGCTTCAAGGAGC
APP 7 Ap 7F TTGGAATGGATTCATGATTGGGC 601
Ap 7R CGGAAATGGCCTATTGAAAAACG
APP 9 / App 11 Ap 9/11F GTAGGACGTGGTAACATTGAGGC 2105
Ap 9/11R ACGGGTGCAATTTCTAAAGCTG
APP 10 Ap 11F GGTGGTGATGGAACAAGGTTATGG 183
Ap 11R CTGTAATTGATGCGAAATAGTAGATTGGTGC
APP 12 Ap 12F TAAAGGTATTATAACGCCGGCTCT 347
Ap 12R CTCCCATCTGTTGTCTAAGTAGTAG
APP 15 Ap 15F GCAACTTGGAGAACATGGTTAAATCAAG 1,595
Ap 15R CAACCCTCCAATGTAAGCGAAGG
apx IV apx IVA1 TTATCCGAACTTTGGTTTAGCC 418
apx IVA3 CATATTTGATAAAACCATCCGTC
2차 백신 접종 후 2주후에 각각의 그룹에 모든 돼지에게 공격 정종을 실시한 후 그룹 A에서 관찰 기간 동안 3마리가 폐사하였으며 나머지 2마리는 전형적인 흉막 폐렴 육안 소견을 보였으며 부검 후 5마리에서 공격접종 한 다양한 APP 혈청형 균주가 검출되었다. 그룹 B의 경우에는 관찰기간동안 1마리가 폐사하였고 2마리에서 전형적인 흉막폐렴 육안소견이 관찰되었고 돼지 흉막폐렴 증상을 보인 3마리 모두에서 다양한 APP 혈청형이 분리되었다. APP 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형 그리고 15형 생균 같은 불활화 사균체를 접종한 그룹 C에서는 관찰기간 동안 흉막 폐렴 증상 및 균이 검출되지 않아 우수한 방어 효력이 관찰되었다 (표 2).
자돈에 예방 접종 후 야외 독성 Actinobacillus pleuropneumoniae 1형-15혈청형 (3형, 6형, 8형, 13형, 14형 제외)으로 도전감염 후 방어 효율
그룹 실험에 사용된 두수 흉막폐렴에 의해 폐사한 두수 (%) 돼지 흉막 폐렴 임상 증상 발현 두수 (%)
A 5 3 (60) 5 (100)
B 5 1 (20) 3 (60)
C 5 0 0
기탁기관명 : 한국생명공학연구원수탁번호 : KCTC14111BP
수탁일자 : 20200114

Claims (9)

  1. 기탁번호 KCTC 14111BP인 돼지 흉막폐렴균 APP type 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형 및 15형 균주를 클로르헥시딘 디글루코네이트 (Chlorhexidine digluconate), 클로르헥시딘 디글루네이트 수용액 (Chlorhexidine digluconate solution), 클로르헥시딘 디아세테이트 (Chlorhexidine diacetate) 및 클로르헥시딘 디아세테이트 염 수화물 (Chlorhexidine diacetate salt hydrate)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상과 반응시켜서 사멸화시킨, 돼지 흉막폐렴균 APP (Actinobacillus pleuropneumoniae) type 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형 및 15형 균주의 불활화 사균체.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 클로르헥시딘 디글루코네이트 (Chlorhexidine digluconate), 클로르헥시딘 디글루네이트 수용액 (Chlorhexidine digluconate solution), 클로르헥시딘 디아세테이트 (Chlorhexidine diacetate) 및/또는 클로르헥시딘 디아세테이트 염 수화물 (Chlorhexidine diacetate salt hydrate)의 농도는 1 ul/ml(0.106 mg/ml) 내지 20 ul/ml(2.12 mg/ml)인, 돼지 흉막폐렴균 APP (Actinobacillus pleuropneumoniae) type 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형 및 15형 균주의 불활화 사균체.
  3. (a) 기탁번호 KCTC 14111BP인 돼지 흉막폐렴균 APP type 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형 및 15형 균주를 배지에 접종한 후 배양하는 단계;
    (b) 상기 배양된 APP 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형 및 15형 균주에 클로르헥시딘 디글루코네이트 (Chlorhexidine digluconate), 클로르헥시딘 디글루네이트 수용액 (Chlorhexidine digluconate solution), 클로르헥시딘 디아세테이트 (Chlorhexidine diacetate) 및 클로르헥시딘 디아세테이트 염 수화물 (Chlorhexidine diacetate salt hydrate)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 첨가하여 실온에서 5분 내지 1시간 반응시키는 단계;
    (c) 상기 (b) 단계 이후에 상기 배양된 APP 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형 및 15형 균주를 멸균 PBS(Phosphate buffered saline)로 재부유시키거나 원심 후 0.1 내지 1 M sucrose 또는 0.1 내지 1 M glucose로 재부유시키는 단계;
    (d) 상기 (c) 단계 이후에 상기 배양된 APP type 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형 및 15형 균주를 원심 후 상층액을 버린 다음 클로르헥시딘 디글루코네이트 (Chlorhexidine digluconate), 클로르헥시딘 디글루네이트 수용액 (Chlorhexidine digluconate solution), 클로르헥시딘 디아세테이트 (Chlorhexidine diacetate) 및 클로르헥시딘 디아세테이트 염 수화물 (Chlorhexidine diacetate salt hydrate)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 첨가하여 교반하는 단계; 및
    (e) 상기 (d) 단계 이후 교반물을 멸균 PBS(Phosphate buffered saline)로 재부유시켜 실온에서 5분 내지 1시간 반응시키는 단계;
    를 포함하는, 돼지 흉막폐렴균 APP (Actinobacillus pleuropneumoniae) type 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형 및 15형 균주의 불활화 사균체를 제조하는 방법.
  4. 제1항의 돼지흉막 폐렴균 APP type 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형 및 15형 균주의 불활화 사균체 및/또는 이의 배양물을 포함하는, 돼지 흉막폐렴 예방 또는 치료용 백신 조성물.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 백신 조성물은 담체, 희석제 및 보조제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함하는, 돼지 흉막폐렴 예방 또는 치료용 백신 조성물.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 보조제는 알루미늄수산화 나트륨, IMS1313, IMS1313 VG, ISA 15A, ISA 15A VG, ISA 35, ISA 35 VG, ISA 28, ISA 28 VG, ISA 201, ISA 201 VG, ISA 206, ISA 206 VG, GEL 01 및 GEL 02으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 돼지 흉막폐렴 예방 또는 치료용 백신 조성물.
  7. 제 4항에 있어서, 상기 백신 조성물은 자돈 또는 모돈의 경구, 경피, 근육 내, 복막 내, 피내, 피하 내 및 비강 경로로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 경로로 투여되는, 돼지 흉막폐렴 예방 또는 치료용 백신 조성물.
  8. 제 1항의 돼지 흉막폐렴균 APP type 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형 및 15형 균주의 불활화 사균체 및/또는 이의 배양물을 포함하는, 돼지 흉막 폐렴 예방 또는 개선용 사료 첨가제.
  9. 제 1항의 돼지 흉막폐렴균 APP type 1형, 2형, 5형, 7형, 10형, 12형 및 15형 균주의 불활화 사균체 및/또는 이의 배양물을 자돈 또는 모돈에 급여 또는 접종하는 단계;를 포함하는 돼지 흉막 폐렴을 예방하는 방법.
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Vaccine. 2000, Vol. 18, No. 26, pp. 2945-2955.

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