KR102514051B1 - 재조합 Apx IA-C-terminal, Apx IIA-C-terminal, Apx IIIA-C-terminal 및 Apx IVA-N-terminal 톡소이드를 포함하는 돼지 흉막 폐렴 백신 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발병은 재조합 Apx IA-C-terminal, Apx IIA-C-terminal, Apx IIIA-C-terminal 및 Apx IVA-N-terminal 톡소이드를 포함하는 돼지 흉막 폐렴의 예방 또는 치료용 백신 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발병은 재조합 Apx IA-C-terminal, Apx IIA-C-terminal, Apx IIIA-C-terminal 및 Apx IVA-N-terminal 톡소이드를 포함하는 돼지 흉막 폐렴 백신 조성물에 관한 것이다.
돼지 흉막 폐렴은 Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) 세균에 의해 발병하며 흔히 줄여서 APP라고 명명한다. 국내뿐만 아니라 전 세계적으로 발생하는 흔한 호흡기 질환으로, 치사율이 높을 뿐만 아니라 항생제 내성균의 증가로 인해 치료 효과가 쉽지 않다. 또한 육성돈 및 비육돈 시기에 감염 후 APP가 생산하는 독소로 기인한 급사가 일어나는 질병으로 농가에 경제적 손실을 입히는 돼지의 주요 호흡기 질환 중 하나이다. 돼지 흉막 폐렴균인 APP는 크게 15가지 혈청형이 존재하고 있으며, 균 모두 병원성을 가지고 있고, 지역과 나라별로 흉막 폐렴을 일으키는 혈청형이 달라 나라마다 혈청형이 다른 백신 개발이 필요한 실정이다. 우리나라에서는 특히 APP 1형, 2형, 5형, 7형, 12형이 가장 흔하게 돼지 흉막 폐렴을 발생시키는 것으로 알려져 있으며, 다른 혈청형도 현재 꾸준히 증가하고 있는 추세이다. 그러나 현재 사용되고 있는 불활화 백신(inactivated vaccine)으로는 다양한 혈청형에 대한 방어가 어려울 뿐만 아니라 toxin에 의한 육성 및 비육돈의 급사를 예방할 수 없는 상태이다. 또한 APP에는 총 4가지의 독소를 분비하는 것으로 알려져 있다. Apx I, Apx II, Apx III 및 Apx IV. 더불어 APP 15혈청형 별로 분비하는 독소가 달라 모든 혈청형을 예방하기 위해서는 APP가 분비하는 4종류의 톡소이드가 필요하다.
따라서 본 기술은 APP가 분비하는 모든 독소인 Apx IA-C-terminal, Apx IIA-C-terminal, Apx IIIA-C-terminal 및 Apx IVA-N-terminal fragment를 동량으로 혼합해 줌으로써 현재 국내에서 유행하고 있는 APP 1형, 2형, 5형, 7형, 12형뿐만 아니라 4형, 9형, 10형, 11형, 15형 등 모든 형에 대한 방어가 가능한 백신 제조 기술이다. 돼지 흉막 폐렴의 원인균인 APP에 감염이 일단 되었다면, 기후가 급변하는 환절기에, 사육환경이 좋지 못한 돼지환경으로 인해 스트레스를 받게 되면 자연스럽게 면역력 저하로 돼지 흉막 폐렴이 발생할 수 있다. APP는 호흡기 세균인 만큼, 공기 전염이 가능하며, 더불어 APP가 생산하는 독소에 의해 폐 조직 및 혈구를 파괴해 병증을 더욱 악화시킨다. 보통 돼지 흉막 폐렴 발병 시기는 어린 돼지 보다는 20kg이 넘는 육성돈에서부터 출하를 기다리는 돼지까지 이 시기에 집중적으로 발병하게 되는데, 이런 문제 때문에 농가는 엄청난 경제적 손실을 입게 되는 경우가 많다. 돼지에 실험적으로 감염을 시키면 APP의 독성작용에 의한 폐병변은 3시간이 지나면 발견할 수 있다. 병변의 말단부위는 죽거나 손상 받은 대식세포 또는 조직으로 채워지며, 감염 후 4일까지 쉽게 정상 폐와 구별할 수 있게 된다. 이후 병변이 진행되면서 병변의 중심부가 괴사되며 치유과정으로 진행되면 섬유화 된다. 많은 연구자들의 연구를 통해 단위체(subunit) 백신의 흉막 폐렴 예방에 대한 가능성을 보여주었다 (Kamp et al., 1994; Haesebrouck et al., 2004). 특히 단위체 항원 후보 중에서 Apx 단백질의 경우 흉막 폐렴 예방에 가능성이 높은 항원으로 연구되어 왔다 (Meeusen et al., 2007). 이러한 연구에 따라 Apx 톡신 단위체 항원의 조합을 통해 새로운 백신이 개발되었다 (Seah et al., 2002; Kim et al., 2010; Seo et al., 2013; Lee et al., 2014). 그럼에도 불구하고 이러한 단순한 Apx toxin 의 첨가만으로 실제 흉막 폐렴에 대한 방어력이나 면역반응이 효과적으로 이루어지지기 위해서는 APP가 생성하는 모든 종류의 독소가 포함되는 등 좀 더 개선된 방법을 모색해야만 하는 실정이다.
APP 15혈청형 모두는 Apx IV독소를 분비하며, 혈청형 마다 Apx I, II, III 중 하나 내지 두개의 독소를 분비하는 것으로 알려지고 있다 (표 1 참조). 특히 Apx IV는 in vivo에서만 발현되는 것으로 알려져 있으며, 최근 보고에 의하면 Apx IV는 아직까지 확실하지는 않지만 마크로파지와 PMNs를 손상시킬 수 있는 것으로 알려지고 있다. 따라서 재조합 Apx IA-C-terminal, Apx IIA-C-terminal, Apx IIIA-C-terminal 및 Apx IVA-N-terminal 톡소이드를 발현 정제하여 동량 혼합 백신으로 제조하여 자돈에 접종한 후 국내에서 분리한 병독성 APP 1형-15형까지 모든 혈청형을 혼합(3형, 6형, 8형, 13형, 14형 제외 - 현재까지 국내 분리 보고 없음)하여 비강 내 도전 감염 후 이들 균주에 완벽한 방어 여부를 확인하기 위함이다.
혈청형 | APX toxin |
Serotype 1, 5, 9, 11 | Apx I, Apx II |
Serotype 2, 3, 4, 6, 8, 15 | Apx II, Apx III |
Serotype 7, 12, 13 | Apx II |
Serotype 10, 14 | Apx I |
본 발명은 상기와 같이 모든 APP 혈청형의 감염을 예방 또는 감염의 억제 또는 감염으로 인한 증상의 완화시킬 수 있는 백신 조성물을 제공하기 위한 것으로, 본 발명은 돼지 흉막 폐렴균 유래 ApxIA의 C 말단, ApxIIA의 C 말단, ApxIIIA의 C 말단, 및 Apx IVA의 N 말단 항원 혼합물을 접종시킨 자돈에서 항원에 대한 체액성 면역 반응뿐 아니라 돼지 폐렴균 1형에서 15형 모두 (13형, 14형 제외 - 현재까지 국내 분리 보고 없음)를 혼합하여 도전감염에 대해서도 효과적인 저항성을 보이는 것을 확인함으로써 본원 발명을 완성하였다.
상기의 목적을 달성하기 위해 본 발명은 서열번호 1로 이루어진 ApxIA의 독소의 C 말단 조각(fragment), 서열번호 2로 이루어진 ApxIIA의 독소의 C 말단 조각(fragment), 서열번호 3로 이루어진 ApxIIIA의 독소의 C 말단 조각(fragment) 및 서열번호 4로 이루어진 Apx IVA의 독소의 N 말단 조각(fragment) 항원을 포함하는 돼지 흉막 폐렴 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공할 수 있다.
상기 백신 조성물은 담체, 희석제 및 보조제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.
상기 보조제는 알루미늄수산화 나트륨, IMS1313 (또는 VG), ISA 15A(또는 VG), ISA 35 (또는 VG), ISA 28 (또는 VG), ISA 201 (또는 VG), ISA 206 (또는 VG), GEL 01 및 GEL 02로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 백신 조성물은 자돈 또는 모돈의 경구, 경피, 근육 내, 복막내, 피내, 피하 내 및 비강 경로로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 경로로 투여될 수 있다.
본 발명은 다른 목적을 달성하기 위해서, 서열번호 1로 이루어진 ApxIA의 독소의 C 말단 조각(fragment), 서열번호 2로 이루어진 ApxIIA의 독소의 C 말단 조각(fragment), 서열번호 3로 이루어진 ApxIIIA의 독소의 C 말단 조각(fragment) 및 서열번호 4로 이루어진 Apx IVA의 독소의 N 말단 (fragment) 조각으로 이루어진 말단 조각 재조합 항원을 포함하는 돼지 흉막 폐렴 예방 또는 개선용 사료 첨가제를 제공할 수 있다.
본 발명은 다른 목적을 달성하기 위해서, 서열번호 1로 이루어진 ApxIA의 독소의 C 말단 조각(fragment), 서열번호 2로 이루어진 ApxIIA의 독소의 C 말단 조각(fragment), 서열번호 3로 이루어진 ApxIIIA의 독소의 C 말단 조각(fragment) 및 서열번호 4로 이루어진 Apx IVA의 독소의 N 말단 (fragment) 조각으로 이루어진 말단 조각 재조합 항원을 자돈 또는 모돈에 급여 또는 접종하는 단계;를 포함하는 돼지 흉막 폐렴을 예방하는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 돼지 흉막 폐렴균 유래 ApxIA의 C 말단, ApxIIA의 C 말단, ApxIIIA의 C 말단, 및 Apx IVA의 N 말단 항원 혼합물을 접종시킨 자돈에서 항원에 대한 체액성 면역 반응뿐 아니라 돼지 폐렴균 1형에서 15형 모두 (3형, 6형, 8형, 13형, 14형 제외 - 국내에서 분리된 적 없음)를 혼합하여 도전감염에 대해서도 효과적인 저항성을 보이는 효과가 있다. 이를 이용하여 다양한 혈청형에 대한 방어력이 뛰어나고 안전한 백신을 제공함으로써 돼지 흉막 폐렴의 감염 및 증상을 완화시킬 수 있다.
도 1은 재조합 Apx IA-C-terminal, Apx IIA-C-terminal, Apx IIIA-C-terminal 및 Apx IVA-N-terminal 항원에 대한 SDS-PAGE 결과이다. Lane 1: ApxIA; ApxIA-C 말단 항원, 2: ApxIIA; ApxIIA-C 말단 항원, 3: ApxIIIA; ; ApxIIIA-C 말단 항원, 4: ApxIVA; ApxIVA-N 말단 항원. 각각의 크기는 50, 36.9, 38.1, 그리고 113.4 kDa이다.
도 2는 그룹별로 재조합 Apx IA-C-terminal, Apx IIA-C-terminal, Apx IIIA-C-terminal 및 Apx IVA-N-terminal 항원에 대한 혈청 IgG 항체 역가를 나타낸다.
도 3은 도전감염 후 생존한 돼지를 각 그룹별로 부검한 사진이다.
도 2는 그룹별로 재조합 Apx IA-C-terminal, Apx IIA-C-terminal, Apx IIIA-C-terminal 및 Apx IVA-N-terminal 항원에 대한 혈청 IgG 항체 역가를 나타낸다.
도 3은 도전감염 후 생존한 돼지를 각 그룹별로 부검한 사진이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
돼지 흉막 폐렴은 Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) 세균에 의해 발병하며 흔히 줄여서 APP라고 명명한다. 국내뿐만 아니라 전 세계적으로 발생하는 흔한 호흡기 질병이지만, 감염 후 치사율이 높을 뿐만 아니라 항생제 내성균의 증가로 인해 치료 효과가 쉽지 않다. 또한 육성돈 및 비육돈 시기에 감염 후 APP가 생산하는 독소로 기인한 급사가 일어나는 질병으로 농가에 경제적 손실을 입히는 돼지의 주요 호흡기 질환 중 하나이다. 특히, 돼지 흉막 폐렴균인 APP는 크게 15가지 혈청형이 존재하고 있으며, 균 모두 병원성을 가지고 있고, 지역과 나라별로 흉막 폐렴을 일으키는 혈청형이 달라 나라마다 상기 돼지 흉막 폐렴을 예방 또는 치료하기 위해 많은 연구가 진행 중이다. 가장 효과적으로, 소수의 혈청형 혼합 백신이 각 나라별 다른 혈청형에 대해 또는 많은 혈청형에 대한 방어효과를 가진 백신이 가장 이상적인 백신이라고 생각되고 있다. 그러나 기존의 백신 제조 방법으로는 백신 제조에 사용된 혈청형조차도 방어하지 못하는 경우가 있어 백신의 효력이 완전히 작용할 수 없는 상황이 많이 발생할 수 있다. 따라서 소수의 혈청형으로 국내 또는 많은 혈청형에 대해 방어 효능이 우수하면서 사균 백신처럼 안전한 신개념의 백신 개발이 필요하다. 특히, 백신 접종 전후에도 안심하고 항생제 처치 등이 가능한 백신 개발이 필요하다. 이에 본원 발명자들은 돼지 흉막 폐렴에 백신 조성물을 연구하던 중, 돼지 흉막 폐렴균 유래 ApxIA의 C 말단, ApxIIA의 C 말단, ApxIIIA의 C 말단 및 Apx IVA의 N 말단 항원 혼합물을 접종시킨 자돈에서 항원에 대한 체액성 면역 반응뿐 아니라 돼지 폐렴균 1형에서 15형 모두를 혼합하여 도전감염에 대해서도 효과적인 저항성을 보이는 것을 확인함으로써 본원 발명을 완성하였다.
본 발명은 서열번호 1로 이루어진 ApxIA의 독소의 C 말단 조각(fragment), 서열번호 2로 이루어진 ApxIIA의 독소의 C 말단 조각(fragment), 서열번호 3로 이루어진 ApxIIIA의 독소의 C 말단 조각(fragment) 및 서열번호 4로 이루어진 Apx IVA의 독소의 N 말단 (fragment) 조각으로 이루어진 말단 조각 재조합 항원을 포함하는 돼지 흉막 폐렴 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명자들은 돼지 흉막 폐렴균 유래 ApxIA의 C 말단, ApxIIA의 C 말단, ApxIIIA의 C 말단 및 Apx IVA의 N 말단 항원 혼합물을 자돈의 근육에 접종한 결과, 돼지의 혈청 각 톡소이드에 대한 항체가 대조군에 비해 유의성 있게 증가하고 (도 2), 야외 병독주인 APP type 1형에서 15형 모두를 혼합 (3형, 6형, 8형, 13형, 14형 제외 - 현재까지 국내 분리 보고 없음)하여 도전감염을 시행한 결과, 아무것도 처리하지 않은 대조군은 2일째부터 폐사하기 시작하여 도전감염 3일 째에는 5마리 중 3마리가 폐사하였고 도전감염 후 1주일 째 부검 소견에서 생존 한 모든 돼지에서 전형적인 돼지 흉막 폐렴 증상이 관찰 된 반면 (도 3), 본 발명의 재조합 톡소이드를 25㎍씩 혼합하여 총 100㎍/pig로 2회 접종한 군은 도전감염을 수행하지 않은 그룹의 폐 증상(도 3)과 유사한 폐 증상이 관찰되어 돼지 흉막 폐렴을 100% 방어한 것이 관찰되었다. 본 발명의 균주는 근육 접종하였을 때 탁월한 방어 효과가 있어, 돼지 흉막 폐렴을 예방 또는 치료할 수 있는 효과가 있다.
발명에서 용어 "백신"은 생체에 면역을 주는 항원을 함유한 생물학적인 제제로서, 감염증의 예방을 위하여 사람이나 동물에 주사하거나 경구 투여함으로써 생체에 면역이 생기게 하는 면역원 또는 항원성 물질을 말한다. 생체 내 면역은 병원균의 감염 후에 생체 내 면역력이 자동으로 얻어지는 자동 면역과 외부에서 주입한 백신에 의하여 얻어지는 수동 면역으로 크게 나누어진다. 자동 면역은 면역에 관계하는 항체의 생성기간이 길고 지속적인 면역력의 특징이 있는 반면, 백신에 의한 수동 면역은 감염증 치료에 즉시 작용하나 지속력이 떨어지는 단점이 있다.
상기 재조합 톡소이드 유효량은 면역 반응을 유도하여 돼지에서 흉막 폐렴을 일으킬 수 있는 균의 감염의 빈도수 또는 이의 중증도를 감소시킬 수 있는 백신의 양을 의미하며, 당업자라면 적절하게 선택할 수 있다. 예를 들면, 유효량은 상기 재조합 톡소이드 항원으로 이루어진 재조합 톡소이드로부터 선택되는 어느 하나의 농도는 2㎍/ml 내지 200㎍/ml일 수 있으며, 바람직하게는 10㎍/ml 내지 100㎍/ml일 수 있고, 더 바람직하게는 25㎍/ml 내지 50㎍일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 백신 조성물은 담체, 희석제 및 보조제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 상기 백신 조성물은 수의학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어 "수의학적으로 허용 가능한 담체"란 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항원 보강제, 안정제, 희석제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장성 작용제, 흡착 지연제 등을 포함한다. 백신용 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제, 희석제로는 글루코스, 락토즈, 덱스트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 글리세린, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다.
또한, 상기 백신용 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 드립(drip) 또는 스프레이 등의 비강용 제형 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 레시틴 유사 유화제에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 글루코스, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 사용할 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제,감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 포함된다. 비수용성제제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리 에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 비강내 투여를 위한 제제에 적합한 침투제는 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다. 그러한 적합한 제형물은 안정성과 순응도를 위해 바람직하게 무균, 등장 및 완충되도록 제형 화된다. 비강내 투여를 위한 제제는 또한 정상적인 섬모 작용을 유지시키기 위해 점액 분비를 여러 측면에서 자극하도록 제조되며, 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA(1990))에 기술된 바와 같이, 적합한 제형이 바람직하게 등장성의, pH 5.5 내지 6.5를 유지하는 약간 완충된 제형이며, 가장 바람직하게 항미생물 방부제 및 적합한 약물 안정화제를 포함한다.
상기 백신 조성물은 안정제, 유화제, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, pH 조절제, 계면활성제, 리포솜, 이스콤 (iscom) 보조제, 합성 글리코펩티드, 증량제, 카복시폴리메틸렌, 서브바이랄 (subviral) 입자 보조제, 콜레라 독소, N,N-디옥타데실-N',N'-비스(2-하이드록시에틸)-프로판디아민, 모노포스포릴 지질 A, 디메틸디옥타데실-암모늄 브로마이드, Marcol-Aracel, Chlorhexidine 및 이의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 제 2 보조제를 추가로 함유 할 수 있다. 상기 보조제는 알루미늄수산화 나트륨, IMS1313 (또는 VG), ISA 15A(또는 VG), ISA 35 (또는 VG), ISA 28 (또는 VG), ISA 201 (또는 VG), ISA 206 (또는 VG), GEL 01 및 GEL 02으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 사용할 수 있고, 가장 바람직하게는 알루미늄수산화 나트륨 또는 IMS1313 (또는 VG))을 아쥬번트로 사용할 수 있다.
상기 백신 조성물은 자돈 또는 모돈의 경구, 경피, 근육 내, 복막내, 피내, 피하 내 및 비강 경로로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 경로로 투여될 수 있다.
발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 근육 내, 정맥 내, 피내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 바람직하게는 재조합 톡소이드 혼합 백신을 경구 또는 근육 내 투여할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 조성물의 투여량은 돼지의 무게, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 상기 돼지 흉막 폐렴균 유래 재조합 Apx IA-, Apx IIA- 및 Apx IIIA-C- 그리고 Apx IVA-N-말단 항원 혼합 백신 조성물의 투여량은 돼지 1두당 각 재조합 톡소이이드가 약 2㎍/ml 내지 200㎍/ml일 수 있으며, 바람직하게는 10㎍/ml 내지 100㎍/ml일 수 있고, 더 바람직하게는 25㎍/ml 내지 50㎍/ml로 1회 내지는 2회 투여하는 것이 바람직하다.
상기 돼지는 임신 모돈, 포유자돈, 이유 자돈으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 상기 백신 조성물은 이유 자돈 및 육성 비육돈에 접종할 수 있다.
본 발명은 다른 목적을 달성하기 위해서, 서열번호 1로 이루어진 ApxIA의 독소의 C 말단 조각(fragment), 서열번호 2로 이루어진 ApxIIA의 독소의 C 말단 조각(fragment), 서열번호 3로 이루어진 ApxIIIA의 독소의 C 말단 조각(fragment) 서열번호 4로 이루어진 Apx IVA의 독소의 N 말단 (fragment) 조각으로 이루어진 말단 조각 재조합 항원을 포함하는 돼지 흉막 폐렴 예방 또는 개선용 사료 첨가제를 제공할 수 있다.
본 발명의 사료 첨가제는 상기 서술한 각 재조합 Apx IA-C-terminal, Apx IIA-C-terminal, Apx IIIA-C-terminal 및 Apx IVA-N-terminal 항원 또는 이의 혼합물을 원형 그대로 사용하거나 또는 추가적으로 가축에 허용되는 곡류 및 그 부산물 등의 공지된 담체, 안정제 등을 가할 수 있으며, 필요에 따라 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산 등의 유기산이나 인산나트륨, 인산칼륨, 산성 피로인산염, 폴리인산염 (중합인산염) 등의 인산염이나, 폴리페놀, 카테킨, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제, 항생물질, 항균제 및 기타의 첨가제 등을 가할 수도 있으며, 그 형상으로서는 분체, 과립, 펠릿, 현탁액 등의 적당한 상태일 수 있으며, 상기 사료첨가제를 공급하는 경우는 가축 등에 대하여 단독으로 또는 사료에 혼합하여 공급할 수 있다.
본 발명은 다른 목적을 달성하기 위해서, 서열번호 1로 이루어진 ApxIA의 독소의 C 말단 조각(fragment), 서열번호 2로 이루어진 ApxIIA의 독소의 C 말단 조각(fragment), 서열번호 3로 이루어진 ApxIIIA의 독소의 C 말단 조각(fragment) 및 서열번호 4로 이루어진 Apx IVA의 독소의 N 말단 (fragment) 조각으로 이루어진 말단 조각 재조합 항원을 자돈 또는 모돈에 급여 또는 접종하는 단계;를 포함하는 돼지 흉막 폐렴을 예방하는 방법을 제공할 수 있다.
이하에서는 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 하기 실시 예는 본 발명의 바람직한 일 구체적인 예일 뿐이며, 본 발명의 권리범위가 하기 실시 예의 범위로 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 박테리아 혈청형과 성장 조건
흉막 폐렴 증상을 보이는 야외 분리주 A. pleuropneumoniae serotype 2(HJL67)와 A. pleuropneumoniae serotype 5(HJL263) 로부터 Apx IA-C-terminal, Apx IIA-C-terminal, Apx IIIA-C-terminal 및 Apx IVA-N-terminal 유전자를 cloning 하였으며, APP 1형, 2형, 4형, 5형, 7형, 9형, 10형, 11형, 12형 및 15형의 국내 분리주를 공격시험에 사용하였다.
<실시예 2> AApx IA-C-terminal, Apx IIA-C-terminal, Apx IIIA-C-terminal 및 Apx IVA-N-terminal fragment 발현 재조합 대장균주의 제작 및 toxin fragment의 정제
각각의 Apx IA-C-terminal, Apx IIA-C-terminal, Apx IIIA-C-terminal 및 Apx IVA-N-terminal 유전자는 APP 2와 5형의 genome으로부터 각각의 유전자에 맞는 PCR primer (표 2)를 이용해 증폭하였다. 각각의 유전자는 적절한 제한효소로 잘려 pET21a plasmid vector에 cloning 하였다. 각각의 유전자가 삽입된 pET21a plasmid DNA는 E. coli BL21에 transformation하여 HJL411, HJL412, HJL413, 및 HJL414로 명명하였다. 각각의 APX toxin의 C- 또는 N-fragment는 nitrilotriacetic acid agarose(Qiagen , USA)를 이용하여 affinity 정제 과정을 거쳐 정제하였다. 정제된 C- 또는 N-toxin fragment는 SDS-PAGE(sodium dodesyl sulfate-polyacrylamide을 이용하여 확인하였다 (도 1). 모든 정제된 toxin 항원은 -70 ℃에 보관하였다.
Name | Sequence(5′→3′) | Size (bp) | Accession number |
Apx IA-C-F | CGGGATCCGGTATTATTTCA | 1292 | X68815 |
Apx IA-C-R | GTCGAC AGT ACC ATC GCT GC | ||
Apx IIA-C-F | ATTCGGATCC CAA GGT TAT GA | 1110 | AY736188 |
Apx IIA-C-R | GCTTGTCGAC TGT AAT AGA ATC ATT T | ||
Apx IIIA-C-F | GGGATCC GCA CCA ATT ACT TT | 1293 | X68815 |
Apx IIIA-C-R | TGTCGAC AAG CAC ATT AAA ACC | ||
APX IV-N_F | CATATGGATGATGATATTGATAGAAAAGAA | 3093 | HM021153 |
APX IV-N_R | CTCGAGCCAATTTTCATAAAATCCTT |
<실시예 3> 백신 접종 및 면역반응 평가를 위한 ELISA
15마리의 자돈을 3개 그룹으로 나누어 따로 격리하여 사육하면서 백신접종에 의한 항체 생성 및 공격접종 시험을 실시하였다. 백신 접종 시기는 4주령과 6주령 1번에 걸쳐 1 ml 씩 근육접종으로 실시하였다. 그룹 A의 경우 음성 대조군으로 아무것도 접종하지 않았으며, 그룹 B의 경우 멸균 PBS 1 ml을 접종하였으며 그룹 C의 경우는 Apx IA-C-terminal, Apx IIA-C-terminal, Apx IIIA-C-terminal 및 Apx IVA-N-terminal 항원이 동량으로 혼합되게 섞어 총 재조합 단백질이 100㎍/ml가 되도록 제조된 백신을 근육 접종하였다. 백신 접종 후 백신 접종에 의한 면역반응 평가를 위해 백신 1차 접종 전 (0 week post prime immunization; WPPI), 2차 접종 전 (2 WPPI), 2차 접종 후 2주 후 (4 WPPI, 도전 감염 전))에 각각 혈액을 채취하여 혈청에 대한 항체가를 측정하였다. 모든 가검물은 사용하기까지 영하 70℃에 저장하면서 실험에 사용하였다. 재조합 Apx IA-C-terminal, Apx IIA-C-terminal, Apx IIIA-C-terminal 및 Apx IVA-N-terminal 항원에 대한 혈중 IgG 항체가를 측정하기 위해 정제된 재조합 각 재조합 C 또는 N 항원 250 ng/ml을 100 ul씩 ELISA 측정용 96 well plate에 coating 하여 일반적인 ELISA측정 방법에 따라 항체가를 측정하였다. 혈청 샘플은 PBS로 1/100으로 희석하여 사용되었다. 도 2에서 보여주듯이 재조합 Apx IA-C-terminal, Apx IIA-C-terminal, Apx IIIA-C-terminal 및 Apx IVA-N-terminal 항원을 혼합 접종하였음에도 불구하고 서로 간섭작용 없이 각 항원별로 높은 항체 역가를 유도하였음이 관찰되었다.
<실시예 4> 공격접종을 통한 방어력 시험
공격 접종은 APP serotype 1형, 2형, 4형, 5형, 7형, 9형, 10형, 11형, 12형 및 15형을 일차 백신 접종 후 4주 후에 혼합하여 각 비강에 약 5.0 ×109 cfu/ ml 씩 양쪽 비강에 각각 접종 하였다. 대조군은 멸균 PBS 2 ml을 같은 방법으로 접종하였다. 공격접종 후 모든 자돈은 매일 하루에 두 번씩 관찰하였으며 이상 반응 또는 이상행동을 7일간 관찰하였다. 비정상적인 육안 관찰 소견을 보이는 모든 돼지는 안락사시킨 후 폐 육안적 소견을 검사하였으며 공격 접종균의 분리를 시도하였다. 분리된 균은 chocolate agar에 배양한 후 APP serotype 1형, 2형, 4형, 5형, 7형, 9형, 10형, 11형, 12형 및 15형과 일치하는 primer를 이용하여 PCR 검사로 혈청형을 검사하였다. PCR에 사용된 프라이머는 하기 표 3과 같다.
Target gene | Primer name | Sequence | Size |
APP 1 | Ap 1F | CTGGAGTAATTACGGCGACTATTCC | 959 |
Ap 1R | AGGAGAAGCTAGTAGTACTTGCATTTTC | ||
APP 2 | Ap 2F | GAGTGTGATGATGATGCTCTGGTTC | 247 |
Ap 2R | TACCAATAACTGTTGCAACTAACGC | ||
APP 3 | Ap 3F | TTGTAGAGCCCGCCAGATTTACG | 500 |
Ap 3R | CATTCGCACCAGCAATCACC | ||
APP 4 | Ap 4F | CAGCATGGGTTTGGTCCTGTTG | 204 |
Ap 4R | GGCTTTCTCCGTGTATGAATAAAGTG | ||
APP 5 | Ap 5F | AGCCACAAGACCCGAATGGTATAATG | 825 |
Ap 5R | CCATCAAATGCAGCTTCAAGGAGC | ||
APP 6 | Ap 6F | TGACTGGCTTCGTGAAAATGAG | 718 |
Ap 6R | GTCTGAAGTTTTATTCGCAGCTCC | ||
APP 7 | Ap 7F | TTGGAATGGATTCATGATTGGGC | 601 |
Ap 7R | CGGAAATGGCCTATTGAAAAACG | ||
APP 8 | Ap 8F | ACATCCAAGCCGTTCTCCAG | 1126 |
Ap 8R | CATCCATGAGCCAATGAGGG | ||
APP 9 / App 11 | Ap 9/11F | GTAGGACGTGGTAACATTGAGGC | 2105 |
Ap 9/11R | ACGGGTGCAATTTCTAAAGCTG | ||
APP 10 | Ap 11F | GGTGGTGATGGAACAAGGTTATGG | 183 |
Ap 11R | CTGTAATTGATGCGAAATAGTAGATTGGTGC | ||
APP 12 | Ap 12F | TAAAGGTATTATAACGCCGGCTCT | 347 |
Ap 12R | CTCCCATCTGTTGTCTAAGTAGTAG | ||
APP 15 | Ap 15F | GCAACTTGGAGAACATGGTTAAATCAAG | 1,595 |
Ap 15R | CAACCCTCCAATGTAAGCGAAGG | ||
apx IV | apx IVA1 | TTATCCGAACTTTGGTTTAGCC | 418 |
apx IVA3 | CATATTTGATAAAACCATCCGTC |
2차 백신 접종 후 2주 후에 각각의 그룹에 모든 돼지에게 공격 정종을 실시한 후 그룹 A에서 음성 대조군으로 관찰기간 동안 아무런 임상 증상이 관찰되지 않았다. 그룹 B의 경우에는 관찰 기간 동안 3마리가 폐사하였으며 나머지 2마리는 전형적인 흉막 폐렴 육안 소견을 보였으며 부검 후 5마리에서 공격접종 한 다양한 APP 혈청형 균주가 검출되었다. 각 재조합 톡소이드 혼합 백신을 접종한 그룹 C에서는 관찰기간 동안 흉막 폐렴 증상 및 균이 검출되지 않아 우수한 방어 효력이 관찰되었다 (도 3).
<110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY
Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology
<120> Vaccine composition of recombinant Apx IA-C-terminal, Apx
IIA-C-terminal, Apx IIIA-C-terminal and Apx IV-C-terminal toxoids
<130> 1066992
<160> 4
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1290
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ApxIC
<400> 1
ggatccggta ttatttcagg tattttagat gcttctaaac aggcaatctt cgaacgagtt 60
gcaacgaaat tagcgaataa gattgacgaa tgggagaaaa aacacggtaa aaactatttt 120
gaaaacggtt atgacgcccg ccattccgca ttcttagaag atacctttga attgttatca 180
caatacaata aagagtattc ggtagagcgt gtcgttgcta ttacgcaaca acgttgggat 240
gtcaatatcg gggaacttgc cggtatcacg cgtaaaggtg cggatgcgaa aagcggtaag 300
gcttatgtcg atttctttga agaaggaaaa ttgttagaga aagatccgga tcgttttgat 360
aaaaaagtgt ttgatccgct tgaaggcaaa atcgaccttt cttcaattaa caaaaccact 420
ttattgaaat ttattacacc ggtttttacc gcaggtgaag agattcgtga gcgtaagcaa 480
accggtaaat acgaatatat gaccgaatta ttcgttaaag gtaaagaaaa atgggtggta 540
accggtgtgc agtcacataa tgcgatttat gactatacga atcttatcca attagcgata 600
gataaaaaag gtgaaaaacg tcaagtgacc attgaatctc atttgggtga gaaaaatgat 660
cgtatatatc tttcatccgg ttcatctatc gtatatgcgg gtaacggaca tgatgtagca 720
tattacgata aaaccgatac aggttactta acatttgacg gacaaagtgc acagaaagcc 780
ggtgaatata ttgtcactaa agaacttaaa gctgatgtaa aagttttaaa agaagtggtt 840
aaaactcagg atatttcagt tggaaaacgc agtgaaaaat tagaatatcg tgattatgag 900
ttaagcccat tcgaacttgg gaacggtatc agagctaaag atgaattaca ttctgttgaa 960
gaaattatcg gtagtaatcg taaagacaaa ttctttggta gtcgctttac cgatattttc 1020
catggtgcga aaggcgatga tgaaatctac ggtaatgacg gccacgatat cttatacgga 1080
gacgacggta atgatgtaat ccatggcggt gacggtaacg accatcttgt tggtggtaac 1140
ggaaacgacc gattaatcgg cggaaaaggt aataatttcc ttaatggcgg tgatggtgac 1200
gatgagttgc aggtctttga gggtcaatac aacgtattat taggtggtgc gggtaatgac 1260
attctgtatg gcagcgatgg tactgtcgac 1290
<210> 2
<211> 1101
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ApxIIC
<400> 2
ggatcccaag gttatgattc tcgtcattta gctgatttac aagacaatat gaagtttctt 60
atcaatttaa ataaagaact tcaggctgaa cgcgtagtag ctattaccca acaaagatgg 120
gataaccaaa ttggagacct agcggcaatt agccgtagaa cggataaaat ttccagtgga 180
aaagcttatg tggatgcttt tgaggagggg caacaccagt cctacgattc atccgtacag 240
ctagataaca aaaacggtat tattaatatt agtaatacaa atagaaagac acaaagtgtt 300
ttattcagaa ctccattact aactccaggt gaagagaatc gggaacgtat tcaggaaggt 360
aaaaattctt atattacaaa attacatata caaagagttg acagttggac tgtaacagat 420
ggtgatgcta gctcaagcgt agatttcact aatgtagtac aacgaatcgc tgtgaaattt 480
gatgatgcag gtaacattat cgaatctaaa gatactaaaa ttatcgcaaa tttaggtgct 540
ggtaacgata atgtatttgt tgggtcaagt actaccgtta ttgatggcgg ggacggacat 600
gatcgagttc actacagtag aggagaatat ggcgcattag ttattgatgc tacagccgag 660
acagaaaaag gctcatattc agtaaaacgc tatgtcggag acagtaaagc attacatgaa 720
acaattgcca cccaccaaac aaatgttggt aatcgtgaag aaaaaattga atatcgtcgt 780
gaagatgatc gttttcatac tggttatact gtgacggact cactcaaatc agttgaagag 840
atcattggtt cacaatttaa tgatattttc aaaggaagcc aatttgatga tgtgttccat 900
ggtggtaatg gtgtagacac tattgatggt aacgatggtg acgatcattt atttggtggc 960
gcaggcgatg atgttatcga tggaggaaac ggtaacaatt tccttgttgg aggaaccggt 1020
aatgatatta tctcgggagg taaagataat gatatttatg tccataaaac aggcgatgga 1080
aatgattcta ttacagtcga c 1101
<210> 3
<211> 1290
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ApxIIIC
<400> 3
ggatccgcac caattacttt gttggttact ggtatcacag gattaatttc tggtatttta 60
gagttctcta aacagccaat gttagatcat gttgcatcga aaattggtaa caaaattgac 120
gaatgggaga aaaaatacgg taaaaattac ttcgagaatg gctatgatgc tcgtcataaa 180
gctttcttag aagattcatt ctcattattg tctagtttta ataaacaata tgaaactgaa 240
agagctgttt taattacaca acaacgttgg gatgaatata ttggcgaact tgcgggtatt 300
actggcaaag gtgacaaact ctctagtggt aaggcgtatg tagattactt tcaagaaggt 360
aaattattag agaaaaaacc tgatgacttt agcaaagtag ttttcgatcc aactaagggc 420
gaaattgata tttcaaatag ccaaacgtca acgttgttaa aatttgttac gccattatta 480
acaccaggta cagagtcacg tgaaagaact caaacaggta aatatgaata tatcacgaag 540
ttagttgtaa aaggtaaaga taaatgggtt gttaatggcg ttaaagataa aggtgccgtt 600
tatgattata ctaatttaat tcaacatgct catattagtt catcagtagc acgtggtgaa 660
gaataccgtg aagttcgttt ggtatctcat ctaggcaatg gtaatgacaa agtgttctta 720
gctgcgggtt ccgcagaaat tcacgctggt gaaggtcatg atgtggttta ttatgataaa 780
accgatacag gtcttttagt aattgatgga accaaagcga ctgaacaagg gcgttattct 840
gttacgcgcg aattgagtgg tgctacaaaa atcctgagag aagtaataaa aaatcaaaaa 900
tctgctgttg gtaaacgtga agaaaccttg gaatatcgtg attatgaatt aacgcaatca 960
ggtaatagta acctaaaagc acatgatgaa ttacattcag tagaagaaat tattggaagt 1020
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gatgatctat taaatggtaa tgatggggat gatattctat acggtgataa aggtaacgat 1140
gagttaagag gtgataatgg taacgaccaa ctttatggtg gtgaaggtaa tgacaaacta 1200
ttaggaggta atggcaataa ttacctcagt ggtggtgatg gcaatgatga gcttcaagta 1260
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<400> 4
gatgatgata ttgatagaaa agaatttatg gtggggccgg gacgttttgt gaccgctgat 60
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aatgatgtgc ttaaaggaac tgaacatgag gatttgtttc tcggtggtga ggggaatgat 1080
acttattatg cgagagtagg cgatacaatt gaagacgccg acggcaaagg taaagtctat 1140
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tttactgatt atactaatta tcgttatgaa gttaaaggac taaaattgcc cgccgttaaa 1380
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ttatttagct tagaaagttt gaatattaaa tctttacata ccgcctatga agagcgtaat 2220
gattttctag ctggcaataa tatccttgct cagcttggaa agtatgaaaa aacggacggt 2280
acttttgcac aaatgggcga tttaaatttc agttttaacc cgttttatag ccgatttacc 2340
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gttcgggatt tgcgtgaagc cgccgcactt tctgaggagt tggctgcttt attacaacag 2460
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tgggcggcaa cggatttaca gtatcaacat tatgataaaa cattacttaa aacgctagaa 2580
agcaccgata gcagtgcttc tgtcgttaga gtcacgcctt ctcaattaag tagtatacgc 2640
aatgtaaagc atgatcctac cgttatgcaa aactttgaac aaagtaaggc aaaaattgca 2700
actttaaatt cactctacgg gttaaatatc gatcaacttt attacacgac ggataaagac 2760
attcgttata ttactgacaa agtgaataat atgtatcaaa caaccgtaga actcgcctat 2820
cgttctttac ttttacaaac gcgtttgaag aaatatgttt atagcgttaa tgcgaaacaa 2880
ttcgaaggga aatgggtagc cgattattct cgtactgaag ccttatttaa ctctactttt 2940
aaacaatcgc ccgaaaatgc attatatgat ttaagcgaat acctttcttt ctttaacgat 3000
cctacggaat ggaaagaagg gctattactg ttaagccgtt atatagatta tgctaaagca 3060
caaggatttt atgaaaattg g 3081
Claims (6)
- 서열번호 1의 염기서열에 의해 인코딩되는 ApxIA의 독소의 C 말단 조각(fragment), 서열번호 2의 염기서열에 의해 인코딩되는 ApxIIA의 독소의 C 말단 조각(fragment), 서열번호 3의 염기서열에 의해 인코딩되는 ApxIIIA의 독소의 C 말단 조각(fragment) 및 서열번호 4의 염기서열에 의해 인코딩되는 Apx IVA의 독소의 N 말단 (fragment) 조각으로 이루어진 말단 조각 재조합 항원을 포함하는, 돼지 흉막 폐렴 예방 또는 치료용 백신 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 백신 조성물은 담체, 희석제 및 보조제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함하는, 돼지 흉막 폐렴 예방 또는 치료용 백신 조성물.
- 제 2항에 있어서, 상기 보조제는 알루미늄수산화 나트륨, IMS1313 (또는 VG), ISA 15A (또는 VG), ISA 35 (또는 VG), ISA 28 (또는 VG), ISA 201 (또는 VG), ISA 206 (또는 VG), GEL 01 및 GEL 02으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 돼지 흉막 폐렴 예방 또는 치료용 백신 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 백신 조성물은 자돈 또는 모돈의 경구, 경피, 근육 내, 복막 내, 피내, 피하 내 및 비강 경로로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 경로로 투여되는, 돼지 흉막 폐렴 예방 또는 치료용 백신 조성물.
- 서열번호 1의 염기서열에 의해 인코딩되는 ApxIA의 독소의 C 말단 조각(fragment), 서열번호 2의 염기서열에 의해 인코딩되는 ApxIIA의 독소의 C 말단 조각(fragment), 서열번호 3의 염기서열에 의해 인코딩되는 ApxIIIA의 독소의 C 말단 조각(fragment) 및 서열번호 4의 염기서열에 의해 인코딩되는 Apx IVA의 독소의 N 말단 (fragment) 조각으로 이루어진 말단 조각 재조합 항원을 포함하는 돼지 흉막 폐렴 예방 또는 개선용 사료 첨가제.
- 서열번호 1의 염기서열에 의해 인코딩되는 ApxIA의 독소의 C 말단 조각(fragment), 서열번호 2의 염기서열에 의해 인코딩되는 ApxIIA의 독소의 C 말단 조각(fragment), 서열번호 3의 염기서열에 의해 인코딩되는 ApxIIIA의 독소의 C 말단 조각(fragment) 및 서열번호 4의 염기서열에 의해 인코딩되는 Apx IVA의 독소의 N 말단 (fragment) 조각으로 이루어진 말단 조각 재조합 항원을 자돈 또는 모돈에 급여 또는 접종하는 단계;를 포함하는 돼지 흉막 폐렴을 예방하는 방법.
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