KR20190061329A

KR20190061329A - 개선된 고스트 살모넬라 갈리나룸 사균체를 유효성분으로 포함하는 가금 티푸스의 예방 또는 치료용 백신 조성물

Info

Publication number: KR20190061329A
Application number: KR1020170159596A
Authority: KR
Inventors: 허진; 문성철; 정호경
Original assignee: 전북대학교산학협력단; 주식회사 코미팜
Priority date: 2017-11-27
Filing date: 2017-11-27
Publication date: 2019-06-05

Abstract

본 발명은 개선된 고스트 살모넬라 갈리나룸 사균체를 유효성분으로 포함하는 이유 가금 티푸스의 예방 또는 치료용 백신 조성물에 관한 것이다.

Description

개선된 고스트 살모넬라 갈리나룸 사균체를 유효성분으로 포함하는 가금 티푸스의 예방 또는 치료용 백신 조성물 {Vaccine composition for preventing or treating Fowl Typhoid comprising ghost Salmonella Gallinarum as effective component}

Salmonella Gallinarum (SG, 가금 티푸스균)에 의해 발생하는 가금 티푸스는 닭 그중에서도 주로 갈색레그혼종 등에서 패혈증을 일으키며 급성 및 만성으로 경과하며 폐사율이 높아 양계 농가에 경제적으로 막대한 피해를 입히고 있는 주요 세균성 질병 중 하나이다. 가금 티푸스는 어린 병아리보다는 주로 중병아리와 성숙 닭에서 주로 질병이 발생한다.

가금 티푸스의 원인균인 SG는 세포 내 기생세균으로 포르말린 등으로 제조되는 전통적인 백신 제조 방법에 의해서는 백신의 효능이 낮은 것이 특징이다. 즉 세포성 면역 반응이 살모넬라를 방어하는데 가장 효과적이라고 일반적으로 생각되고 있으며, 이를 위해서는 약독화 생균 백신이 가장 이상적이라 생각되고 있다. SG 약독화 생균 백신이 1950년대에 개발되어 60년대부터 지금까지 전 세계적으로 양계 농가에서 가금 티푸스를 예방하기 위한 생균백신으로 사용되어 오고 있다. 그러나 생균 백신의 경우에는 병원력을 회복하여 병독주로의 회귀에 대한 우려가 내재되어 있으며, 국내의 환경에 비추어 볼 때 약독화 생균 백신을 접종하고 항생제 처치를 하여야만 하는 경우가 많아 약독화 생균 백신의 효력이 완전히 작용할 수 없는 상황이 많이 발생할 수 있다. 따라서 사균 백신처럼 안전하면서 생균 백신처럼 효능이 우수한 백신 개발이 필요하며 특히 국내에서처럼 간절기 때에 백신 접종 후에도 안심하고 항생제 처치가 가능한 백신 개발이 절실하다.

대부분의 동식물에서 발견되는 항균 펩타이드 [Antimicrobial peptides (AMPs)]는 선천성 면역반응에 있어 중요한 역할을 담당하고 있으며, 더불어 이 AMPs은 세균에 대해 broad-spectrum 활동을 갖는다. 이 항균작용은 이 AMP 들이 세균의 세포막에 결합하여 빠르게 반응하여 세포막에 구멍을 만들어 세포질 성분이 빠져나가 결국 세포가 죽음에 이르게 한다. 지금까지 돼지에서 11개의 AMPs가 발견되었고, 그 중 하나가 porcine myeloid antimicrobial peptide-36 (PMAP-36)로 세균 세포벽과 결합할 수 있는 가장 많은 net positive charge를 갖고 있다. 지금까지 돼지에서 11개의 host defense peptide (HDP) 또는 antimicrobial peptide (AMP)가 보고되었으며, 이중 porcine myeloid antimicrobial peptide-36 (PMAP-36)이 가장 높은 양성전하를 가지고 있는 것으로 알려져 있다. PMAP-36의 N-terminal에 존재하는 α-helical domain이 활성부위로 알려져 있으며. 이 펩타이드는 양성전하를 가진 펩타이드와 세균 세포막의 음성 전하를 가진 분자성분과 전자 결합을 통해 세균 막을 관통할 수 있는 능력을 가지고 있다. 특히, PMAP-36의 36개의 아미노산 중에서 24개의 아미노산으로 이루어진 N-terminal의 알파 헤릭스 도메인(GI24)만으로도 PMAP-36이 가지고 있는 항균 효과를 그대로 유지하고 있음이 보고되었다.

따라서 본 연구의 목적은 첫 번째로 GI24 펩타이드 또는 PMAP-36 펩타이드를 이용하여 가금 티푸스균주 고스트 불활화 사균체를 유도하는 것이며, 두 번째로는 이렇게 유도된 고스트 사균체가 예방백신으로서 갈색레그혼종에서 가름 티푸스 도전 감염 균주에 대한 방어 여부를 확인하기 위함이다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명자들은 GI24 펩타이드 또는 PMAP-36를 이용하여 살모넬라 갈리나룸 (Salmonella Gallinarum) 균주를 고스트화로 유도하여 개선된 고스트 살모넬라 갈리나룸 사균체을 제작하였고, 상기 고스트 살모넬라 갈리나룸 사균체를 포함하는 백신이 가금 티푸스에서 생균 백신과 같이 탁월한 방어 효과를 가지는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기와 같은 본 발명의 과제를 달성하기 위해서, 본 발명은 살모넬라 갈리나룸 (Salmonella Gallinarum)에 서열번호 1의 아미노산으로 표시되는 GI24 또는 서열번호 2의 아미노산으로 표시되는 PMAP-36 (porcine myeloid antimicrobial peptide-36)를 처리한, 개선된 고스트 살모넬라 갈리나룸 (Salmonella Gallinarum) 사균체를 제공하는 것이다.

본 발명은 다른 목적을 달성하기 위해, 하기의 단계를 포함하는 개선된 살모넬라 갈리나룸 (Salmonella Gallinarum) 사균체를 제조하는 방법을 제공한다.

(a) 살모넬라 갈리나룸 (Salmonella Gallinarum)을 LB 액체 배지 또는 TBS (Tryptic Soy broth) 배지에 접종한 후 35~37℃ 조건으로 배양하는 단계; 및

(b) 상기 배양된 살모넬라 갈리나룸에 서열번호 1의 아미노산으로 표시되는 GI24 또는 서열번호 2의 아미노산으로 표시되는 PMAP-36 (porcine myeloid antimicrobial peptide-36)을 5~42℃ 조건으로 10분 내지 72시간 반응시키는 단계.

본 발명은 다른 목적을 달성하기 위해, 상기 서술한 개선된 고스트 살모넬라 갈리나룸 (Salmonella Gallinarum) 사균체; 이의 배양물 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 가금 티푸스의 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면 백신 조성물에 담체, 희석제 및 보조제로 이루어진 군으로 부터 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면 상기 보조제는 ISA70인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면 상기 보조제는 서열번호 1의 아미노산으로 표시되는 GI24 또는 서열번호 2의 아미노산으로 표시되는 PMAP-36 (porcine myeloid antimicrobial peptide-36)인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면 상기 백신 조성물을 경구, 경피, 근육 내, 복막 내, 피하 내 및 비강 경로로 이루어진 군으로 부터 선택되는 어느 하나 이상의 경로로 투여될 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면 상기 가금은 병아리, 닭, 오리, 칠면조, 메추리, 물새 비둘기 및 카나리아로 이루어진 군으로 부터 선택되는 어느 하나 인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 다른 목적을 달성하기 위해, 상기 고스트 살모넬라 갈리나룸 (Salmonella Gallinarum) 사균체; 이의 배양물 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 가금 티푸스의 예방 또는 치료용 사료 첨가제를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 상기 고스트 살모넬라 갈리나룸 (Salmonella Gallinarum) 사균체; 이의 배양물 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 가금류에 급여 또는 접종하는 단계; 를 포함하는 가금 티푸스를 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 고스트 살모넬라 갈리나룸 (Salmonella Gallinarum) 사균체를 닭의 근육에 접종한 뒤, 야외 병독주인 살모넬라 갈리나룸으로 도전감염을 시행한 결과, 백신을 접종하지 않은 대조군은 도전감염 후 4일째부터 폐사하기 시작하여 도전감염 후 8일 째에는 모든 닭이 폐사하였고, 포르말린과 시판용 사균 백신을 접종한 그룹에서는 각각 30%의 생존률이 관찰된 반면에 본 발명의 균주를 적은 량 (3×10⁸ cells/chicken)으로 접종한 닭은 80%의 생존률이 관찰되었으며, 생균 백신인 SG9R을 접종한 그룹과 SG 고스트 백신을 추천 량 (3×10⁹ cells/chicken)이상으로 접종한 그룹 및 PMAP-36 펩타이드로 제조된 고스트 사균체 (3 × 10⁹ cells/chicken)를 접종한 그룹에서는 100% 생존률을 나타내었다. 본 발명의 고스트 살모넬라 갈리나룸은 근육 접종하였을 때 생균 백신과 같이 탁월한 방어효과를 나타내므로, 가금 티푸스를 예방 또는 치료 할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 살모넬라 갈리나룸 (Salmonella Gallinarum)에 (A) GI24 또는 PMAP-36 펩타이드 미처리 군 및 (B) GI24 펩타이드 처리 군 (C) PMAP-36 펩타이드 처리 군의 전자현미경 사진 결과이다.
도 2는 각각의 항원 (대조군 (PBS); 생균백신(SG9R); 포르말린; GI24 펩타이드로 제조된 살모넬라 갈리나룸 (Salmonella Gallinarum) 사균체 3×10⁸; GI24 펩타이드로 제조된 살모넬라 갈리나룸 (Salmonella Gallinarum) 사균체 3×10⁹; GI24 펩타이드로 제조된 살모넬라 갈리나룸 (Salmonella Gallinarum) 사균체 3×10¹⁰; 시판용 사균 백신; PMAP-36 펩타이드로 제조된 (Salmonella Gallinarum) 사균체 3 × 10⁹)에 대한 혈청 항체 역가 결과이다.
도 3는 각각의 항원(대조군 (PBS); 생균백신(SG9R); 포르말린; GI24 펩타이드로 제조된 살모넬라 갈리나룸 (Salmonella Gallinarum) 사균체 3×10⁸; GI24 펩타이드로 제조된 살모넬라 갈리나룸 (Salmonella Gallinarum) 사균체 3×10⁹; GI24 펩타이드로 제조된 살모넬라 갈리나룸 (Salmonella Gallinarum) 사균체 3×10¹⁰; 시판용 사균 백신; PMAP-36 펩타이드로 제조된 살모넬라 갈리나룸 (Salmonella Gallinarum) 사균체 3 × 10⁹ )에 대한 plenocytes에서의 IFN-r 농도 결과이다.
도 4은 각각의 백신 접종 그룹(대조군 (PBS); 생균백신(SG9R); 포르말린; GI24 펩타이드로 제조된 살모넬라 갈리나룸 (Salmonella Gallinarum) 사균체 3×10⁸; GI24 펩타이드로 제조된 살모넬라 갈리나룸 (Salmonella Gallinarum) 사균체 3×10⁹; GI24 펩타이드로 제조된 살모넬라 갈리나룸 (Salmonella Gallinarum) 사균체 3×10¹⁰; 시판용 사균 백신; PMAP-36 펩타이드로 제조된 (Salmonella Gallinarum) 사균체 3 × 10⁹ )에 대한 도전감염 후 생존률 결과이다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

상기와 같은 본 발명의 과제를 달성하기 위해서, 본 발명은 살모넬라 갈리나룸 (Salmonella Gallinarum)에 서열번호 1의 아미노산으로 표시되는 GI24 또는 서열번호 2의 아미노산으로 표시되는 PMAP-36 (porcine myeloid antimicrobial peptide-36)를 처리한, 개선된 고스트 살모넬라 갈리나룸 (Salmonella Gallinarum) 사균체를 제공하는 것이다.

본 발명의 서열번호 1의 아미노산으로 표시되는 GI24 또는 서열번호 2의 아미노산으로 표시되는 PMAP-36 (porcine myeloid antimicrobial peptide-36)은 이를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 핵산 분자일 수 있다.

본 발명에서 용어 "핵산 분자"는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다. 본 발명의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자의 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.

본 발명의 핵산 분자는 상기한 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 정렬(align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 정렬된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 일 특정예에서는 최소 90%의 상동성, 다른 특정예에서는 최소 95%의 상동성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.

본 발명은 다른 목적을 달성하기 위해, 하기의 단계를 포함하는 개선된 고스트 살모넬라 갈리나룸 (Salmonella Gallinarum) 사균체를 제조하는 방법을 제공한다.

(a) 살모넬라 갈리나룸 (Salmonella Gallinarum)을 LB 액체 배지 또는 TSB (Tryptic Soy) 액체 배지에 접종한 후 35~37℃ 조건으로 배양하는 단계; 및

(b) 상기 배양된 살모넬라 갈리나룸에 서열번호 1의 아미노산으로 표시되는 GI24 또는 서열번호 2의 아미노산으로 표시되는 pPMAP-36 (porcine myeloid antimicrobial peptide-36)을 5~42℃ 조건으로 10분 내지 72시간 반응시키는 단계.

상기 Luria-Bertani (LB) 배지는 통상적으로 알려진 배지를 이용할 수 있으며, 박토-트립톤(Bacto-tryptone), 박토-효모 추출물(Bacto-yeast extract) 및 소듐클로라이드(NaCl)를 포함한다. 상기 TSB (Tryptic Soy) 배지는 통상적으로 알려진 배지를 이용할 수 있으며, 카제인의 췌장 소화물 (Pancreatic digest of casein), 콩의 파파익 소화물(Papaic digest of soybean), 덱스트로즈(Dextrose), 소듐클로라이드(NaCl) 및 디포타슘포스페이트(K2HPO4)를 포함한다.

본 발명에서 용어 "백신"은 생체에 면역을 주는 항원을 함유한 생물학적인 제제로서, 감염증의 예방을 위하여 사람이나 동물에 주사하거나 경구 투여함으로써 생체에 면역이 생기게 하는 면역원 또는 항원성 물질을 말한다. 생체 내 면역은 병원균의 감염 후에 생체 내 면역력이 자동으로 얻어지는 자동 면역과 외부에서 주입한 백신에 의하여 얻어지는 수동 면역으로 크게 나누어진다. 자동 면역은 면역에 관계하는 항체의 생성기간이 길고 지속적인 면역력의 특징이 있는 반면, 백신에 의한 수동 면역은 감염증 치료에 즉시 작용하나 지속력이 떨어지는 단점이 있다.

본 발명은 다른 목적을 달성하기 위해 상기 백신 조성물에 담체, 희석제 및 보조제로 이루어진 군으로 부터 선택되는 어느 하나이상을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 용어 “담체”는 “수의학적으로 허용 가능한 담체”로서, "수의학적으로 허용 가능한 담체"란 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항원 보강제, 안정제, 희석제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장성 작용제, 흡착 지연제 등을 포함한다. 백신용 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제, 희석제로는 락토즈, 덱스트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 글리세린, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다.

본 발명의 용어 “보조제는” 면역세포의 초기 활성화 과정에서 비특이적으로 항원에 대한 면역 반응을 촉진하는 물질로, 숙주에 면역원은 아니지만 면역계의 세포의 활성을 증대시킴으로써 면역을 강화하는 제제, 분자 등을 의미한다. 불화화 백신의 제작시 보조제의 선발은 백신 효능의 증요한 원이 된다. 본 발명의 백신과 함께 투여되어 면역반응을 증강시킬 수 있는 보조제는 임의의 다양한 보조제를 포함하며, 전형적인 보제로는 프로인 보조제, 알루미늄 화합물, 무라미 펩타이드, 리포폴리싸카라이드(LPS), 모노포스포릴리피드 A 또는 쿠일 A 등이 알려져 있다.

바람직하게는, 본 발명의 개선된 고스트 살모넬라 갈리나룸 사균체의 백신과 함께 사용되는 보조제는 ISA70일 수 있다.

바람직하게는 상기 보조제는 서열번호 1의 아미노산으로 표시되는 GI24 또는 서열번호 2의 아미노산으로 표시되는 PMAP-36 (porcine myeloid antimicrobial peptide-36)일 수 있다.

상기 백신 조성물은 상기 담체, 희석제 또는 보조제 외에 안정제, 유화제, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, pH 조정제, 계면활성제, 리포솜, 이스콤 (iscom) 보조제, 합성 글리코펩티드, 증량제, 카복시폴리메틸렌, 서브바이랄 (subviral) 입자 보조제, 콜레라 독소, N,N-디옥타데실-N',N'-비스(2-하이드록시에틸)-프로판디아민, 모노포스포릴 지질 A, 디메틸디옥타데실-암모늄 브로마이드 및 Marcol-Aracel 및 이의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 제 2 보조제를 추가로 함유할 수 있다.

또한, 상기 백신용 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 드립 (drip) 또는 스프레이 등의 비강용 제형 그리고 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 레시틴 유사 유화제에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 사용할 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 포함된다. 비수용성제제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리 에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 비강내 투여를 위한 제제에 적합한 침투제는 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다. 그러한 적합한 제형물은 안정성과 순응도를 위해 바람직하게 무균, 등장 및 완충되도록 제형화된다. 비강내 투여를 위한 제제는 또한 정상적인 섬모 작용을 유지시키기 위해 점액 분비를 여러 측면에서 자극하도록 제조되며, 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA(1990))에 기술된 바와 같이, 적합한 제형이 바람직하게 등장성의, pH 5.5 내지 6.5를 유지하는 약간 완충된 제형이며, 가장 바람직하게 항미생물 방부제 및 적합한 약물 안정화제를 포함한다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여 (예를 들어, 근육 내, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 바람직하게는 고스트 백신을 경구 또는 근육 내 그리고 피하 투여할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 조성물의 투여량은 닭의 무게, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 상기 고스트 백신 조성물의 투여량은 닭 1두당 약 3×10⁷ 내지 3×10¹¹ 세포, 바람직하게는 약 3×10⁹ 내지 3×10¹⁰ 세포로 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면 상기 가금은 병아리, 닭, 오리, 칠면조, 메추리, 물새 비둘기 및 카나리아로 이루어진 군으로 부터 선택되는 어는 하나 인 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 중병아리 또는 성숙 닭일 수 있다.

본 발명은 다른 목적을 달성하기 위해, 상기 살모넬라 갈리나룸 (Salmonella Gallinarum) 사균체; 이의 배양물 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 가금 티푸스의 예방 또는 치료용 사료 첨가제을 제공한다.

본 발명의 사료 첨가제는 살모넬라 갈리나룸 (Salmonella Gallinarum) 사균체 또는 이의 혼합물을 원형 그대로 사용하거나 또는 추가적으로 가축에 허용되는 곡류 및 그 부산물 등의 공지된 담체, 안정제 등을 가할 수 있으며, 필요에 따라 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산 등의 유기산이나 인산나트륨, 인산칼륨, 산성 피로인산염, 폴리인산염 (중합인산염) 등의 인산염이나, 폴리페놀, 카테킨, 알파-토코페롤, 로즈마리 추출물, 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제, 항생물질, 항균제 및 기타의 첨가제 등을 가할 수도 있으며, 그 형상으로서는 분체, 과립, 펠릿, 현탁액 등의 적당한 상태일 수 있으며, 상기 사료첨가제를 공급하는 경우는 가축 등에 대하여 단독으로 또는 사료에 혼합하여 공급할 수 있다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 상기 개선된 고스트 살모넬라 갈리나룸 (Salmonella Gallinarum) 사균체; 이의 배양물 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 가금류에 급여 또는 접종하는 단계;를 포함하는 가금 티푸스를 치료하는 방법을 제공한다.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 일 구체예일 뿐이며, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예의 범위로 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 박테리아 균주 및 생장조건

전형적인 가금티푸스 증상으로 폐사한 직후의 닭을 냉장 보관하여 실험실로 운반하여 무균적으로 폐사 닭으로부터 간과 비장 (spleen)을 채취하였다. 채취한 간과 비장을 멸균 Buffered Pepton Water가 담겨있는 용기에 넣어 스토마커를 이용하여 조직을 파쇄하여 37℃에서 24시간 배양하였다. 배양액 100㎕를 Rapparport-Vassiliadis Broth 10에 분주하여 42℃에서 24시간 배양하였다. 배양액 100㎕를 Brilliant Green Agar (BGA)에 분주하여 도말한 다음 37℃에서 24시간 배양하였다. BGA에서 빨간색을 가진 colony를 선별하여 API20E와 살모넬라-특이 프라이머를 이용한 PCR에서 살모넬라로 확인이 되면 다시 살모넬라 갈리나룸-특이프라이머들을 이용한 duplex-PCR을 수행하여 살모넬라 갈리나룸으로 확정하여 실험에 사용하였다.

Primer	Sequence	Size	Remark
OMPCF	ATC GCT GAC TTA TGC AAT CG	204	살모넬라-특이 프라이머
OMPCR	CGG GTT GCG TTA TAG GTC TG	204	살모넬라-특이 프라이머
SG-L	GAT CTG CTG CCA GCT CAA	252	살모넬라 갈리나룸-특이 프라이머
SG-R	GCG CCC TTT TCA AAA CAT A	252
SGP-L	CGG TGT ACT GCC CGC TAT	174
SGP-R	CTG GGC ATT GAC GCA AA	174

상기 닭에서 가금티푸스로 폐사한 갈색 레그혼종으로부터 분리한 Salmonella Galinarum (SG), HJL465이 SG 고스트 사균체 백신 제조와 포르말린 백신 제조에 사용되었으며, 더불어 백신 접종 후 모든 갈색레그혼종 도전감염 균주로도 사용되었다. 또한 백신 접종 후 항체 역가를 측정하거나 백신 접종 후 유도되는 Cytokine 측정을 위해 splenocyte를 재 자극하기 위한 OMPs (outer membrane proteins) 추출용 균주로도 사용되었다. 모든 균주는 LB broth와 LB agar에서 배양되었다.

2. GI24의 제조

GI24 펩타이드 (서열번호 1번 : GRFRRLRKKTRKRLKKIGKVLKWI-NH2)와 PMAP-36 펩타이드 (서열번호 2번 : GRFRRLRKKTRKRLKKIGKVLKWIPPIVGSIPLGC-NH2)를 peptron (대전, 한국) 제조하여 실험에 사용하였다.

3. 가금 티푸스균 (Salmonella Gallinarum, SG) 고스트 사균체 백신 제조

SG 균주의 한 콜로니를 선택하여 각각 200ml의 LB 액체 배지에 접종한 후 37°C에서 흡광도가 0.3에 도달할 때까지 배양했다. 배양된 배지에 준비된 GI24 또는 PMAP-36 펩타이드를 40 μg/ml가 되도록 첨가하여 SG 균주가 lysis가 유도 되도록 37°C에서 16시간 반응시켰다. 반응 후 lysis 여부를 확인하기 위해 각 반응액 중 100㎕씩을 LB 아가 배지 및 broth에 각각 접종하여 37°C에서 5일간 배양하여 colony 형성 유무로 반응액의 lysis 여부를 확인하였다. 또한 확인된 lysis 반응액은 4000 × g에서 30분간 원심하여 농축하였고, 멸균 PBS로 세 번 세척한 후 최종적으로 ISA70을 사용하여 6 × 10⁸ cells/ml, 6 × 10⁹ cells/ml, 6 × 10¹⁰cells/ml이 되도록 각각 희석하여 실험에 사용하였다.

4. 살모넬라 갈리나룸 (Salmonella Gallinarum) 사균체의 투사전자현미경 (TEM)

5주령의 120수의 갈색 레그혼종을 구입하여 이 연구에 사용하였으며, 모든 갈색 레그혼종은 그룹별로 사육이 가능한 축사로 옮겼다. 또한 항생제나 성장촉진제를 첨가하지 않은 상업용 양계 사료를 급여하였다. 총 120수의 갈색레그혼종을 8 그룹 (각 그룹 당 15수)으로 나눴다. 모든 그룹의 갈색 레그혼종은 근육내투여로 백신을 접종하였다 (생 후 6주령 1회, 9주령 2회, 단 약독화 생균인 SG9R의 경우에는 6주령에 1회 피하로 접종하였다). Group A의 갈색 레그혼종은 대조군으로 멸균 PBS로, 그룹 B는 약독화 생균을 2 × 10⁷ CFU in 0.2ml로, 그룹 C는 포르말린 불활화 사균체를 3 × 10⁹ cells in 0.5ml로, 그리고 그룹 D-F는 GI24 펩타이드로 제조된 SG 고스트 사균체를 각각 3 × 10⁸ cells/0.5ml, 3 × 10⁹ cells/0.5ml, 3 × 10¹⁰ cells/0.5ml로, 그룹 G는 바이오 타이포이드 (가금 티프스 불활화 사균백신; 메리알 코리아 ㈜) 시판용 사균 백신을 3 × 10⁹ cells/0.5ml로, 그룹 H는 PMAP-36 펩타이드로 제조된 고스트 사균체를 3 × 10⁹ cells/0.5ml로 각각 2회 접종하였다. 혈액 채취는 0 WPPI (weeks post prime immunization) (1차 접종 전), 3 WPPI (2차 접종 전), 6 WPPI (도전감염 전)에 각각 채취했다. 모든 가검물은 사용하기까지 영하 70도에 저장하면서 실험에 사용하였다. 본 실험에서 보고된 동물실험은 Korean Council on Animal Care의 인가를 받은 전북대학교 동물윤리 위원회의 승인을 받아 진행하였다.

5. 백신접종과 가검물 채취

6. 면역반응 평가를 위한 ELISA

혈청에서 SG OMPs-특이 항체 역가를 조사하기 위해 가금 IgG (Bethyl Lab Inc. Montgomery, TX, USA) ELISA quantitative kit를 제조사의 설명에 따라 사용하였다. 혈청역가를 위해 혈청은 1:200으로 희석하여 사용하였다. 백신 접종 된 갈색 레그혼종을 대상으로 SG OMPs에 대한 각 닭들의 혈청 IgG의 항체 역가는 도 2에 나타나 있다. 모든 백신 접종그룹의 갈색 레그혼종 닭들은 접종 6주 후에는 대조군에 비해 유의성 있는 항체 역가의 증가가 관찰되었다.

7. Splenocytes로부터 사이토카인 측정

6 WPPI에 각 그룹에서 5마리의 닭이 비장을 체취하기 위해 희생되었고, 비장들은 무균적으로 채취되었다. 비장세포들은 이전의 연구 Hur 등 (Hur et al., 2016)에서 기술된 방법에 따라 준비되었다. 즉, 각 그룹별로 5마리의 닭을 마지막 예방 접종 후 3주째에 각각 무균적으로 spleen을 채취하여 RPMI 1640에 모음. 그다음 0.8% ammonium chloride (w/v)를 이용하여 erythrocytes를 용해하였고, 380×g, 4℃ 10분간 원심한 후 침전물을 멸균 PBS로 3번 세척하였다. 마지막 원심 후 complete medium (RPMI 1640 supplemented with 100IU/ml penicillin, 100ug/ml streptomycine and 10% FCS)으로 재 부유하였다. 배양을 위한 cell 수를 계산 하여 SG OMPs로 72시간 반응 시킨 후 380×g, 4℃ 10분간 원심한 후 상층액을 -80℃에 보관하며 ELISA로 cytokines 농도를 측정하였다. 도 3에서 보는 바와 같이 포르말린이나 시판용 사균체 백신을 접종한 그룹에서는 대조군에 비해 월등한 농도의 증가가 관찰되지 않았지만 약독화 생균 및 SG 고스트 사균체 백신 (GI24 또는 PMAP-36 펩타이드로 제조된 고스트 사균체 모두)을 접종한 그룹에서는 대조군에 비해 월등한 IFN-r의 증가가 관찰되었다.

8. 도전감염

도전 실험을 위해 야외 독성 균주인 HJL456을 Hur 등(Hur et al., 2011)이 기술한 방법에 따라 준비하였다. 모든 갈색 레그혼종은 6 WPPI 째에 챌린지 균주인 Salmonella Gallinarum 독성주를 배양하여 접종균량이 5 × 10⁸ CFU가 되도록 희석하여 경구접종으로 도전 감염되었다. 그 후에 모든 닭은 챌린지 후 14일 동안 매일 하루에 두 번 폐사 여부가 관찰되었다. 도 4에서 보는 바와 같이, 대조군은 도전감염 4일 후부터 폐사하기 시작하여 8일 째에는 모두 폐사하였고, 포르말린-불활화 백신과 시판용 불활화 백신을 각각 접종한 그룹은 각각 도전감염 후 7일과 8일 째부터 폐사가 관찰되어 실험이 끝나는 시점인 도전감염 후 14일 째에는 생존률이 30%에 불과하였다. 하지만 SG 고스트 불활화 사균체를 3 × 10⁸ cells/0.5ml,로 접종한 그룹에서만 도전가염 후 12일째부터 폐사가 관찰되어 실험이 종료되는 시점인 도전감염 후 14일 째에는 80%의 생존률이 관찰 되었을 뿐 만 아니라 3 × 10⁹ cells/0.5ml, 3 × 10¹⁰ cells/0.5ml로 접종한 그룹과 PMAP-36 펩타이드로 제조된 고스트 사균체를 3 × 10⁹ cells/0.5ml로 접종한 그룹에서는 약독화 생균 백신을 접종한 그룹에서처럼 실험이 끝날 때까지 100% 생존하였다.

Claims

살모넬라 갈리나룸 (Salmonella Gallinarum)에 서열번호 1의 아미노산으로 표시되는 GI24 또는 서열번호 2의 아미노산으로 표시되는 PMAP-36 (porcine myeloid antimicrobial peptide-36)를 처리한, 개선된 고스트 살모넬라 갈리나룸 (Salmonella Gallinarum) 사균체.
(a) 살모넬라 갈리나룸 (Salmonella Gallinarum)을 LB 액체 배지 또는 TSB (tryptic soy broth) 액체 배지에 접종한 후 35~37℃ 조건으로 배양하는 단계; 및
(b) 상기 배양된 살모넬라 갈리나룸에 서열번호 1의 아미노산으로 표시되는 GI24 또는 서열번호 2의 아미노산으로 표시되는 pPMAP-36 (porcine myeloid antimicrobial peptide-36)를 5~42℃ 조건으로 10분 내지 72시간 반응시키는 단계
를 포함하는 개선된 고스트 살모넬라 갈리나룸 (Salmonella Gallinarum) 사균체를 제조하는 방법.
제 1항의 고스트 살모넬라 갈리나룸 (Salmonella Gallinarum) 사균체; 이의 배양물 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 가금 티푸스 예방 또는 치료용 백신 조성물.
제 3항에 있어서, 상기 백신 조성물은 담체, 희석제 및 보조제로 이루어진 군으로 부터 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함하는, 백신 조성물.
제 4항에 있어서, 상기 보조제는 ISA70인 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
제 4항에 있어서, 상기 보조제는 서열번호 1의 아미노산으로 표시되는 GI24 또는 서열번호 2의 아미노산으로 표시되는 PMAP-36 (porcine myeloid antimicrobial peptide-36)인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제 3항에 있어서, 상기 백신 조성물을 경구, 경피, 근육 내, 복막 내, 피하 내 및 비강 경로로 이루어진 군으로 부터 선택되는 어느 하나 이상의 경로로 투여되는, 백신 조성물.
제 3항에 있어서, 상기 가금은 병아리, 닭, 오리, 칠면조, 메추리, 물새 비둘기 및 카나리아로 이루어진 군으로 부터 선택되는 어는 하나 인 것을 특징으로 하는, 가금 티푸스 예방 또는 치료용 백신 조성물.
제 1항의 고스트 살모넬라 갈리나룸 (Salmonella Gallinarum) 사균체; 이의 배양물 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 가금 티푸스 예방 또는 치료용 사료 첨가제.
제 1항의 고스트 살모넬라 갈리나룸 (Salmonella Gallinarum) 사균체; 이의 배양물 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 가금 티푸스 예방 또는 치료용 사료 첨가제.