KR102439333B1 - Stx2eA2-단량체-Stx2eB-오량체 재조합 단백질을 포함하는 돼지의 병원성 대장균증의 예방 또는 치료용 백신 조성물 - Google Patents

Stx2eA2-단량체-Stx2eB-오량체 재조합 단백질을 포함하는 돼지의 병원성 대장균증의 예방 또는 치료용 백신 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 돼지의 부종병 원인 중 하나인 Stx2e 독소 중에서 Stx2eA2-단량체-Stx2eB 오량체 재조합 단백질을 과발현 시키기 위해 Stx2eA2 유전자 및 Stx2eB 유전자를 각각 pTWIN1 및 pET30a에 각각 클로닝 한 후 이들 벡터를 E. coli BL21(DE3)pLysS를 형질 전환시켰다. Stx2eB 유전자로부터 발현된 단량체 Stx2eB가 5개가 모이면 펜타곤 구조를 이루면서 Stx2eB 오량체를 형성하게 되고, 상기 오량체 Stx2eB 및 Stx2eA2 단량체가 결합하여 안정적인 Stx2eA2-단량체-Stx2eB-오량체 재조합 단백질이 제조된다. 이렇게 과발현된 Stx2eA2 단편-Stx2eB 오량체 재조합 단백질과 IMS 1313 adjuvant를 혼합하여 항원으로써 부종병 예방백신으로 자돈이 5일령, 3주령일 때 각각 근육으로 접종하였다. 접종 후 Stx2eA2-단량체-Stx2eB-오량체 재조합 단백질 75ug을 접종한 그룹의 자돈에서는 대조군에 비해 현저한 항체 역가가 관찰되었으며, Stx2eA2-단량체-Stx2eB-오량체 재조합 단백질 75ug을 접종한 그룹에서는 부종병 또는 이유자돈 설사병의 임상 증상 및 폐사가 관찰되지 않았다. 따라서 본 발명의 재조합 Stx2eA2-단량체와 Stx2eB 오량체 단백질을 함유한 백신은 돼지 부종병을 예방할 수 있는 톡소이드 백신으로 유용할 것으로 기대된다.

Description

Stx2eA2-단량체-Stx2eB-오량체 재조합 단백질을 포함하는 돼지의 병원성 대장균증의 예방 또는 치료용 백신 조성물 {Vaccine composition for preventing or treating pathogenic Escherichia coli in pigs comprising Stx2eA2-(Stx2eB)5 recombinant protein as a vaccine}
본 발명은 Stx2eA2-단량체-Stx2eB-오량체 재조합 단백질을 포함하는 돼지의 병원성 대장균증의 예방 또는 치료용 백신 조성물 또는 Stx2eA2-단량체-Stx2eB-오량체 재조합 단백질; 및 F4를 발현하는 병원성 대장균 및 F18을 발현하는 병원성 대장균 사균체 혼합 항원을 포함하는 돼지의 병원성 대장균증의 예방 또는 치료용 백신 조성물에 관한 것이다.
산업 동물에 있어서 자돈 시기에 폐사 및 증체율 저하의 가장 큰 원인 중 하나는 소화기 질병에 의한 설사로 인한 폐사 및 사료 효율의 저하에 따른 결과이다. 이처럼 양돈 산업에 심각한 경제적 손실을 초래하는 세균성 소화기 질환을 예방하기 위하여 전 세계적으로 효과적인 예방백신을 개발하고자 많은 심혈을 기울이고 있다. 소화기 점막은 대다수의 질환 유발 병원균과 처음으로 접하는 장소임과 동시에 이들 세균의 감염을 방어하는 최전방으로서 매우 중요한 곳이다.
돼지에서 이유 후 설사병 및 부종 병은 계속 증가하고 있으며 이를 예방하기 위한 예방 백신 개발이 활발히 수행되고 있지만, 아직 상용화되어 판매되고 있는 제품은 극히 드문 실정이다. 이유 후 자돈에서의 대장균성 설사는 주로 F4ac+와 F18ac+ 장관독소형 대장균 (Enterotoxigenic Escherichia coli: ETEC)에 의해 주로 발생하며 부종병은 Stx2e+ E. coli에 의해 주로 발병되는 것으로 보고되고 있다.
특히 돼지 부종병은 최근 구제역 (Foot and Mouth Disease: FMD)와 돼지 유행성 설사병 (Porcine epidemic diarrhea: PED)에 이어 양돈가에 경제적으로 막대한 피해를 주고 있는 주요 질병으로 돼지 부종병은 Stx2e 독소를 갖는 대장균 (부종 병균)이 상부 장관 내에서 급격하게 증식하여 독소가 혈중에 흡수됨으로써 발병되는 세균병으로, 4~12 주령의 자돈에게 다발하여, 안검 부종이나 신경 증상 등을 나타내고, 그 대부분은 발병 후 24시간 이내에 폐사한다. 부종 병균의 감염에 의한 치사율은 50 ∼ 90%로 매우 높고, 재발이나 발육 불량 등에 의한 생산성의 저하를 초래하기 때문에 경제적 손실이 매우 큰 것으로 알려져 있다. 국내에서는 돼지 부종병 예방용 백신이 거의 상용화 되지 않아 항생 물질로 치료하고 있지만, 발병 후 항생제 투여로는 치료시기를 놓치는 경우가 많다. 또한 약제 내성균의 출현도 보고되어 있어 유효한 예방법이나 치료법의 개발이 절실히 요망되고 있다. 예를 들어 한국등록특허번호 제 10-1743442호에는 장독소성 대장균 항원을 발현하는 고스트 살모넬라 변이주를 유효성분으로 포함하는 돼지 부종병의 예방 또는 치료용 백신 조성물을 개시하고 있고, 한국공개특허번호 제 10-2018-0114684호에는 신규한 Stx2e 에피토프 단백질 및 이를 포함하는 돼지 부종병 백신 조성물을 개시하고 있다.
Stx2e는 rRNA N-글리코시다아제 활성을 갖는 A subunit (Stx2eA)과 수용체 (globotetraosyl ceramide (Gb4)) 결합 능을 갖는 B subunit 오량체 (Stx2eB)로 구성되는 전형적인 AB5형의 독소 단백질로 알려져 있다. 또한 Stx2eA는 독성 부분인 Stx2eA1과 Stx2eB를 연결해 주는 Stx2eA2 두 부분으로 나누어져 있으며 또한 Stx2eA1과 Stx2eA2는 하나의 disulfide 본드를 가지고 있다. 장관으로부터 흡수된 Stx2e는 B subunit 오량체에 의해 혈관 내피세포 등의 세포 표층과 접촉하고 Stx2e의 A1 subunit이 표적 세포질 내로 들어가 리보솜의 단백질 합성을 저해함으로써 부종병의 증상을 유발한다.
본 발명자들은 이유 후 자돈에서 주로 대장균에 의해 발생하는 돼지 부종병 및 이유자돈 설사병을 예방하기 위해 기존의 부종병의 백신으로 사용하는 Stx2eB의 오량체를 돼지의 자돈에게 접종한 뒤 도전감염을 하였을 때, 부종병에 대한 항체가 제대로 형성되지 않아 폐사하는 것을 확인하였다. 연구한 결과 Stx2eB 오량체를 항원으로 접종할 경우 상기 오량체의 구조가 유지가 되지 않아 백신으로써 효과 없는 것으로 확인되었다. 따라서 상기 Stx2eB의 오량체 구조를 유지하여 증가한 예방 또는 치료 효과를 가지는 백신을 연구하던 중, Stx2eA의 염기 서열에서 부종병의 증상을 일으키는 독소 부분을 제외하고, Stx2eA1과 Stx2eB를 연결해주는 링크 부위인 Stx2eA2를 Stx2eB의 오량체와 연결된 Stx2eA2-단량체-Stx2eB-오량체 재조합 단백질을 재조합 톡소이드로 제조하였다. 나아가 상기 Stx2eA2-단량체-Stx2eB-오량체 재조합 단백질을 자돈에 접종한 뒤 도전 감염을 한 결과 Stx2eB-오량체 항원보다 면역반응을 잘 유도하여 돼지 부종병을 효과적으로 방어함을 확인하였다. 또한 상기 Stx2eA2-단량체-Stx2eB-오량체 재조합 단백질과 F4+ E. coli 및 F18+ E. coli 사균체를 혼합하여 자돈에 접종한 뒤 도전 감염을 한 결과 Stx2eB-오량체 항원보다 면역반응을 잘 유도하여 돼지의 병원성 대장균증을 효과적으로 방어함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 돼지 부종병의 주 원인인 독소 중 Stx2eA2 부위와 Stx2eB을 대량 발현시키면, Stx2eB가 오량체를 형성하고 상기 Stx2eA2가 오량체와 결합하면서, Stx2eA2-단량체-Stx2eB-오량체 재조합 단백질이 형성된다. 상기 Stx2eA2는 상기 Stx2eB 오량체 형태가 공고히 유지 할 수 있게 해주는 효과가 있다. 또한 상기 Stx2eA2-단량체-Stx2eB-오량체 재조합 단백질을 자돈에 접종한 뒤 도전 감염을 한 결과 Stx2eB-오량체 항원보다 면역반응을 잘 유도하여 돼지 부종병을 효과적으로 방어함을 확인하였다. 또한 상기 Stx2eA2-단량체-Stx2eB-오량체 재조합 단백질과 F4+ E. coli 및 F18+ E. coli 사균체를 혼합하여 자돈에 접종한 뒤 도전 감염을 한 결과 Stx2eB-오량체 항원보다 면역반응을 잘 유도하여 돼지의 병원성 대장균증을 효과적으로 방어함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 Stx2eA2-단량체(monomer) 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 Stx2eB-오량체로 이루어진 Stx2eA2- 단량체-Stx2eB-오량체 재조합 단백질을 포함하는 돼지의 병원성 대장균증의 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 Stx2eA2-단량체(monomer) 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 Stx2eB-오량체로 이루어진 Stx2eA2-단량체-Stx2eB-오량체 재조합 단백질을 포함하는 돼지의 병원성 대장균증의 예방용 사료 첨가제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 Stx2eA2-단량체(monomer) 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 Stx2eB-오량체로 이루어진 Stx2eA2- 단량체-Stx2eB-오량체 재조합 단백질을 포함하는 백신 조성물을 모돈 또는 자돈에 접종하는 단계를 포함하는 돼지의 병원성 대장균증에 대한 면역력을 증진하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 Stx2eA2-단량체(monomer) 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 Stx2eB-오량체로 이루어진 Stx2eA2-단량체-Stx2eB-오량체 재조합 단백질; 및 Fimbriae 4 (F4)를 발현하는 병원성 대장균 및 Fimbriae 18 (F18)을 발현하는 병원성 대장균이며, 미생물 기탁번호 KCTC13847BP(미생물 명칭: Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) F4, F18)로 기탁된 병원성 대장균의 혼합 균주와 GI24, 클로르헥시딘 디글루코네이트 (Chlorhexidine digluconate), 클로르헥시딘 디클루네이트 수용액 (Chlorhexidine digluconate solution), 클로르헥시딘 디아세테이트 (Chlorhexidine acetate) 및 클로르헥시딘 디아세테이트 염 수화물 (Chlorhexidine diacetate salt hydrate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 반응시킨 사균체; 를 포함하는 돼지의 병원성 대장균증의 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위해, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 Stx2eA2-단량체(monomer) 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 Stx2eB-오량체로 이루어진 Stx2eA2-단량체-Stx2eB-오량체 재조합 단백질을 포함하는 돼지의 병원성 대장균증의 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공할 수 있다.
상기 백신 조성물은 수산화 알루미늄, GEL 01, GEL 02, IMS 1313 (VG), IMS 1313 (VG N), ISA 15A (VG), ISA 28R (VG), ISA 35 (VG), ISA 201 (VG), ISA 206 (VG), ISA 660 (VG), 기름속 수형 에멀젼(water-in-oil emulsion), 불완전한 프로인트항원보강제(불완전 Freund's adjuvant), 백반(alum), 알루미늄 하이드록사이드(aluminum hydroxide), Toll-like 수용체 작용제(Toll-like receptor agonist), 면역자극성 올리고뉴클레오티드(Immunostimulatory oligonucleotide) 및 생물학적 보조제(biological adjuvant)로 이루어진 군으로 선택되는 어느 하나 이상의 보조제(adjuvant)를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 Stx2eA2-단량체-Stx2eB-오량체 재조합 단백질의 농도 10ug 내지 1,000ug일 수 있다.
상기 보조제는 수산화 알루미늄, GEL 01, GEL 02, IMS 1313 (VG), IMS 1313 (VG N), ISA 15A (VG), ISA 28R (VG), ISA 35 (VG), ISA 201 (VG), ISA 206 (VG), ISA 660 (VG), 기름속 수형 에멀젼(water-in-oil emulsion), 불완전한 프로인트항원보강제(불완전 Freund's adjuvant), 백반(alum), 알루미늄 하이드록사이드(aluminum hydroxide), Toll-like 수용체 작용제(Toll-like receptor agonist), 면역자극성 올리고뉴클레오티드(Immunostimulatory oligonucleotide) 및 생물학적 보조제(biological adjuvant)인, 백신 조성물일 수 있다.
상기 백신 조성물은 자돈 또는 모돈에 접종될 수 있다.
상기 돼지의 병원성 대장균증은 돼지의 부종병, 신생자돈 설사병, 조발성 설사병, 3주령 설사병, 백리, 포유자돈 설사병 또는 이유자돈 설사병일 수 있다.
상기 백신 조성물은 Fimbriae 4 (F4)를 발현하는 병원성 대장균 및 Fimbriae 18 (F18)을 발현하는 병원성 대장균이며, 미생물 기탁번호 KCTC13847BP(미생물 명칭: Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) F4, F18)로 기탁된 병원성 대장균의 혼합 균주와 GI24, 클로르헥시딘 디글루코네이트 (Chlorhexidine digluconate), 클로르헥시딘 디클루네이트 수용액 (Chlorhexidine digluconate solution), 클로르헥시딘 디아세테이트 (Chlorhexidine acetate) 및 클로르헥시딘 디아세테이트 염 수화물 (Chlorhexidine diacetate salt hydrate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 반응시킨 사균체를 추가로 포함할 수 있다.
상기 사균체는 각각 1×108 cells/ml 내지 1×1011 cells/ml으로 동량 혼합할 수 있다.
서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 Stx2eA2-단량체(monomer) 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 Stx2eB-오량체로 이루어진 Stx2eA2-단량체-Stx2eB-오량체 재조합 단백질을 포함하는 돼지의 병원성 대장균증 예방용 사료 첨가제를 제공할 수 있다.
상기 돼지의 병원성 대장균증은 돼지의 부종병, 신생자돈 설사병, 조발성 설사병, 3주령 설사병, 백리, 포유자돈 설사병 또는 이유자돈 설사병일 수 있다.
본 발명은 또한 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 Stx2eA2-단량체(monomer) 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 Stx2eB-오량체로 이루어진 Stx2eA2-단량체-Stx2eB-오량체 재조합 단백질을 포함하는 백신 조성물을 모돈 또는 자돈에 접종하는 단계를 포함하는 돼지의 병원성 대장균증을 예방하는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 재조합 Stx2eA2-단량체-Stx2eB-오량체 단백질은 일반적으로 알려진 오량체 Stx2eB 단백질 보다 이의 구조적 안정성을 증가 시켜, 백신으로서의 항체의 생성을 증가시키는 효과가 있다. 또한 톡소이드의 일종으로 독성은 없으면서 부착 부위에 대한 항혈청을 유도하여 돼지에서 부종병을 유발하는 대장균에 감염되어 분비된 Stx2e에 작용하여 Stx2e가 유효세포에 부착하는 것을 방지하여 돼지 부종병을 효과적으로 예방 또는 치료하는 효과가 있다. 상기 Stx2eA2-단량체-Stx2eB-오량체 재조합 단백질을 백신으로 자돈에 접종한 뒤 항체 유도 여부를 확인한 결과, Stx2eB-오량체 항원만을 접종한 경우보다 각 항원에 대한 면역반응을 잘 유도하였으며, 병원성 야외 분리주로 도전감염 하였을 경우 돼지 부종병을 효과적 예방하는 효과가 있다. 확인하였다. 또한 상기 Stx2eA2-단량체-Stx2eB-오량체 재조합 단백질과 F4+ E. coli 및 F18+ E. coli 사균체를 혼합하여 자돈에 접종한 뒤 도전 감염을 한 결과 Stx2eB-오량체 항원보다 면역반응을 잘 유도하여 돼지의 병원성 대장균증 및 부종병을 효과적으로 방어하는 효과가 있다.
도 1은 본 발명에 사용된 Stx2eA2 단량체 단백질 발현 재조합 벡터 pTWIN1의 모식도이다.
도 2는 본 발명에 사용된 Stx2eB 단백질 발현 재조합 발현 pET30의 모식도이다.
도 3은 본 발명의 Stx2eA2-단량체-Stx2eB-오량체 재조합 단백질 발현 확인을 위한 SDS-PAGE 결과이다.
도 4는 본 발명의 백신 조성물을 자돈에 접종한 후 Stx2eA2-단량체-Stx2eB-오량체 재조합 단백질에 대한 혈청 IgG 항체역가를 분석한 결과이다.
도 5는 본 발명의 백신 조성물을 자돈에 접종한 후 야외독성 F4+ Stx2e+ LT+ STa+ STb+ F4+ STEC와 F18+ Stx2e+ LT+ STa+ STb+ F4+ STEC를 혼합하여 경구 접종 후 예방 효과에 대한 결과이다.
도 6은 F4를 발현하는 병원성 대장균 (Stx2e만을 또는 Stx2e도 동시에 발현하는 F4 발현 대장균도 포함된다) 또는 F18을 발현하는 병원성 대장균 (Stx2e만을 또는 Stx2e도 동시에 발현하는 F18 발현 대장균도 포함된다)을 GI24, 클로르헥시딘 디글루코네이트 (Chlorhexidine digluconate 또는 Chlorhexidine digluconate solution) 또는 클로르헥시딘 디아세테이트 (Chlorhexidine acetate 또는 Chlorhexidine diacetate 또는 Chlorhexidine diacetate salt hydrate)로 처리 전*후의 전자현미경 사진이다.
도 7은 본 발명의 백신 조성물을 자돈에 접종한 후 Stx2eA2-단량체-Stx2eB-오량체 재조합 단백질에 대한 혈청 IgG 항체역가를 분석한 결과이다.
도 8은 본 발명의 백신 조성물을 자돈에 접종한 후 K88ac와 FedA (F18 fimbria의 한 구성체) 재조합 단백질에 대한 혈청 IgG 항체역가를 분석한 결과이다.
도 9는 본 발명의 백신 조성물을 자돈에 접종한 후 야외독성 F4+ Stx2e+ LT+ STa+ STb+ F4+ STEC와 F18+ Stx2e+ LT+ STa+ STb+ F4+ STEC를 혼합하여 경구 접종 후 예방 효과에 대한 결과이다.
돼지에서 이유 후 설사병 및 부종병은 계속 증가하고 있는 실정이며 이를 예방하기 위한 예방 백신 개발이 활발히 수행되고 있지만 아직 상용화되어 판매되고 있는 제품은 거의 없다. 부종병의 예방 백신으로 가장 많이 연구되어 지고 있는 것은 재조합 Stx2eB의 오량체 단백질이다. 그러나 본 발명자들이 재조합 Stx2eB의 오량체 단백질을 자돈에게 접종한 뒤 도전 감염을 하였을 경우, 항체 유도가 되지 않고 부종병이 발현하는 것으로 확인되었다. 그 이유에 대해서 연구한 결과 Stx2eB의 오량체의 구조가 견고하게 유지되지 못해 항원으로서의 역할을 제대로 수행하지 못하는 것으로 확인되었다. 이에 본 연구자들은 Stx2eB의 오량체의 구조를 견고하게 유지할 수 있는 방안을 연구하던 중, Stx2eA의 염기 서열에서 부종병의 증상을 일으키는 독소 부분(Stx2eA1)을 제외하고, Stx2eA1과 Stx2eB를 연결시켜주는 부위인 Stx2eA2를 Stx2eB의 오량체와 결합할 경우, Stx2eB의 오량체의 구조가 견고하게 유지되어 항원으로서의 역할을 하는 것을 확인하였다. 더불어 상기 Stx2eA2-단량체-Stx2eB-오량체 재조합 단백질을 백신으로 자돈에 접종한 뒤 항체 유도 여부를 확인하여 본 결과 Stx2eB-오량체 항원만을 접종한 경우보다 각 항원에 대한 면역반응을 잘 유도하였으며, 병원성 야외 분리주로 도전감염 하였을 경우 돼지 부종병을 효과적으로 방어함을 확인하였다. 또한 상기 Stx2eA2-단량체-Stx2eB-오량체 재조합 단백질과 F4+ E. coli 및 F18+ E. coli 사균체를 혼합하여 자돈에 접종한 뒤 도전 감염을 한 결과 Stx2eB-오량체 항원보다 면역반응을 잘 유도하여 돼지의 병원성 대장균증 및 부종병을 효과적으로 방어함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 Stx2eA2-단량체 (monomer) 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 Stx2eB-오량체로 이루어진 Stx2eA2-단량체-Stx2eB-오량체 재조합 단백질을 포함하는 돼지의 병원성 대장균증의 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공할 수 있다.
상기 Stx2eA2 단량체는 재조합 단량체 Stx2eB subunit이 백신으로서 역할을 수행할 수 있는 Stx2eB 오량체를 형성 후에 Stx2eB 오량체와 결합하여 이 형태 유지를 곤고히 함으로써 백신으로서의 역할을 증대시키는 효과가 있다.
더불어 상기 Stx2eA2-단량체-Stx2eB-오량체 재조합 단백질을 백신으로 자돈에 접종한 뒤 항체 유도 여부를 확인하여 본 결과 Stx2eB-오량체 항원만을 접종한 경우보다 각 항원에 대한 면역반응을 잘 유도하였으며, 병원성 야외 분리주로 도전감염 하였을 경우 돼지 병원성 대장균 감염을 효과적으로 방어하였다.
상기 백신 조성물은 담체 또는 보조제를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 보조제는 수산화 알루미늄, GEL 01, GEL 02, IMS 1313 (VG), IMS 1313 (VG N), ISA 15A (VG), ISA 28R (VG), ISA 35 (VG), ISA 201 (VG), ISA 206 (VG), ISA 660 (VG), 기름속 수형 에멀젼(water-in-oil emulsion), 불완전한 프로인트항원보강제(Freund's adjuvant), 백반(alum), 알루미늄 하이드록사이드, Toll-like 수용체 작용제(agonist), 면역자극성 (Immunostimulatory) 올리고뉴크레오티드 또는 생물학적 보조제일 수 있고, 가장 바람직하게는 IMS 1313 (VG)일 수 있다. 상기 담체란 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항원 보강제, 안정제, 희석제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장성 작용제, 흡착 지연제 등을 포함한다. 백신용 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제, 희석제로는 락토즈, 덱스트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 글리세린, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 근육 내, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 바람직하게는 경구 또는 근육 내 투여할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 백신 조성물은 자돈 또는 모돈에 접종할 수 있으나, 가장 바람직하게는 자돈에 접종하는 것일 수 있다. 또한 상기 조성물의 투여량은 돼지의 무게, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
상기 Stx2eA2-단량체-Stx2eB-오량체 재조합 단백질의 경우에는 포유 자돈 또는 이유 자돈의 경우 자돈 1두당 약 1 ug 내지 1,000 ug, 바람직하게는 약 30 ug 내지 200 ug으로, 가장 바람직하게는 75 ug으로 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 용어 "백신"은 생체에 면역을 주는 항원을 함유한 생물학적인 제제로서, 감염증의 예방을 위하여 사람이나 동물에 주사하거나 경구 투여함으로써 생체에 면역이 생기게 하는 면역원 또는 항원성 물질을 말한다. 생체 내 면역은 병원균의 감염 후에 생체 내 면역력이 자동으로 얻어지는 자동 면역과 외부에서 주입한 백신에 의하여 얻어지는 수동 면역으로 크게 나누어진다. 자동 면역은 면역에 관계하는 항체의 생성기간이 길고 지속적인 면역력의 특징이 있는 반면, 백신에 의한 수동 면역은 감염증 치료에 즉시 작용하나 지속력이 떨어지는 단점이 있다.
상기 백신 조성물은 안정제, 유화제, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, pH 조정제, 계면활성제, 리포솜, 이스콤 (iscom) 보조제, 합성 글리코펩티드, 증량제, 카복시폴리메틸렌, 서브바이랄 (subviral) 입자 보조제, 콜레라 독소, N,N-디옥타데실-N',N'-비스(2-하이드록시에틸)-프로판디아민, 모노포스포릴 지질 A, 디메틸디옥타데실-암모늄 브로마이드 및 이의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 제 2 보조제를 추가로 함유할 수 있다. 또한, 상기 백신용 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 드립 (drip) 또는 스프레이 등의 비강용 제형 그리고 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 레시틴 유사 유화제에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 사용할 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 포함된다. 비수용성제제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리 에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 비강내 투여를 위한 제제에 적합한 침투제는 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다. 그러한 적합한 제형물은 안정성과 순응도를 위해 바람직하게 무균, 등장 및 완충되도록 제형화된다. 비강내 투여를 위한 제제는 또한 정상적인 섬모 작용을 유지시키기 위해 점액 분비를 여러 측면에서 자극하도록 제조되며, 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA(1990))에 기술된 바와 같이, 적합한 제형이 바람직하게 등장성의, pH 5.5 내지 6.5를 유지하는 약간 완충된 제형이며, 가장 바람직하게 항미생물 방부제 및 적합한 약물 안정화제를 포함한다.
상기 재조합 Stx2eA2-단량체-Stx2eB-오량체 단백질은 단독으로 또는 알루미늄 수산화나트륨, IMS1313 등과 같은 면역증강제와 혼합하여 근육, 피하 등으로 접종하여 백신으로 사용될 수 있다.
상기 백신 조성물은 자돈 또는 모돈에 접종할 수 있다.
상기 돼지의 병원성 대장균증은 돼지의 부종병, 신생자돈 설사병, 조발성 설사병, 3주령 설사병, 백리, 포유자돈 설사병 또는 이유자돈 설사병일 수 있다.
상기 백신 조성물은 Fimbriae 4 (F4)를 발현하는 병원성 대장균 및 Fimbriae 18 (F18)을 발현하는 병원성 대장균이며, 미생물 기탁번호 KCTC13847BP(미생물 명칭: Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) F4, F18)로 기탁된 병원성 대장균의 혼합 균주와 GI24, 클로르헥시딘 디글루코네이트 (Chlorhexidine digluconate), 클로르헥시딘 디클루네이트 수용액 (Chlorhexidine digluconate solution), 클로르헥시딘 디아세테이트 (Chlorhexidine acetate) 및 클로르헥시딘 디아세테이트 염 수화물 (Chlorhexidine diacetate salt hydrate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 반응시킨 사균체를 추가로 포함할 수 있다.
상기 Stx2eA2 단량체(monomer)를 포함하는 Stx2eB-오량체;와 F4를 발현하는 병원성 대장균 또는 F18을 발현하는 병원성 대장균을 각각 GI24, 클로르헥시딘 디글루코네이트 (Chlorhexidine digluconate), 클로르헥시딘 디클루네이트 수용액 (Chlorhexidine digluconate solution), 클로르헥시딘 디아세테이트 (Chlorhexidine acetate) 및 클로르헥시딘 디아세테이트 염 수화물 (Chlorhexidine diacetate salt hydrate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나와 반응시켜 불활화 된 사균체의 혼합은 백신으로서의 역할을 증대시키는 효과가 있고, 바람직하게는 클로르헥시딘 디아세테이트 (Chlorhexidine diacetate) 또는 클로르헥시딘 디클루네이트 수용액 (Chlorhexidine digluconate solution)을 사용할 수 있다. 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 Fimbriae 4 (F4)를 발현하는 병원성 대장균 및 Fimbriae 18 (F18)을 발현하는 병원성 대장균은 혼합 균주이며, 미생물 기탁번호 KCTC13847BP(미생물 명칭: Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) F4,F18)으로 기탁된 대장균 균주일 수 있다.
상기 Fimbriae 4 (F4)를 발현하는 병원성 대장균 및 Fimbriae 18 (F18)을 발현하는 병원성 대장균은 F4+, F18+, LT+, STa+, STb+ 및 Stx2e+ 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 독소를 분비할 수 있으며, 바람직하게는 Stx2e+, F4+ 및 F18+으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나이상의 독소를 분비할 수 있으며, 더 바람직하게는 F4+ 및 Stx2e+, 또는 F18+ 및 Stx2e+일 수 있다.
더불어 상기 Stx2eA2-단량체-Stx2eB-오량체 재조합 단백질과 Stx2e+ F4+ 대장균과 Stx2e+ F18+ 대장균 사균체를 혼합하여 백신으로 자돈에 접종한 뒤 항체 유도 여부를 확인하여 본 결과 Stx2eB-오량체 항원만을 접종한 경우보다 각 항원에 대한 면역반응을 잘 유도하였으며, 병원성 야외 분리주로 도전감염 하였을 경우 병원성 대장균 감염을 효과적으로 방어하였다.
상기 사균체는 각각 1×108 cells/ml 내지 1×1011cells/ml으로 동량 혼합될 수 있다.
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 Stx2eA2-단량체 (monomer) 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 Stx2eB-오량체로 이루어진 Stx2eA2-단량체-Stx2eB-오량체 재조합 단백질을 포함하는, 돼지의 병원성 대장균증 예방용 사료 첨가제를 제공할 수 있다.
상기 사료 첨가제는 Fimbriae 4 (F4)를 발현하는 병원성 대장균 및 Fimbriae 18 (F18)을 발현하는 병원성 대장균이며, 미생물 기탁번호 KCTC13847BP(미생물 명칭: Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) F4, F18)로 기탁된 병원성 대장균의 혼합 균주와 GI24, 클로르헥시딘 디글루코네이트 (Chlorhexidine digluconate), 클로르헥시딘 디클루네이트 수용액 (Chlorhexidine digluconate solution), 클로르헥시딘 디아세테이트 (Chlorhexidine acetate) 및 클로르헥시딘 디아세테이트 염 수화물 (Chlorhexidine diacetate salt hydrate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 반응시킨 사균체를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 사료 첨가제는 Stx2eA2-단량체-Stx2eB-오량체 재조합 단백질을 원형 그대로 사용하거나 또는 추가적으로 가축에 허용되는 곡류 및 그 부산물 등의 공지된 담체, 안정제 등을 가할 수 있으며, 필요에 따라 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산 등의 유기산이나 인산나트륨, 인산칼륨, 산성 피로인산염, 폴리인산염 (중합인산염) 등의 인산염이나, 폴리페놀, 카테킨, 알파-토코페롤, 로즈마리 추출물, 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제, 항생물질, 항균제 및 기타의 첨가제 등을 가할 수도 있으며, 그 형상으로서는 분체, 과립, 펠릿, 현탁액 등의 적당한 상태일 수 있으며, 상기 사료첨가제를 공급하는 경우는 가축 등에 대하여 단독으로 또는 사료에 혼합하여 공급할 수 있다.
본 발명은 또한 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 Stx2eA2-단량체(monomer) 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 Stx2eB-오량체로 이루어진 Stx2eA2-단량체-Stx2eB-오량체 재조합 단백질을 포함하는 백신 조성물을 모돈 또는 자돈에 접종하는 단계를 포함하는 돼지의 병원성 대장균증에 대한 면역력을 증진시키는 방법을 제공할 수 있다.
상기 백신 조성물은 Fimbriae 4 (F4)를 발현하는 병원성 대장균 및 Fimbriae 18 (F18)을 발현하는 병원성 대장균이며, 미생물 기탁번호 KCTC13847BP(미생물 명칭: Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) F4, F18)로 기탁된 병원성 대장균의 혼합 균주와 GI24, 클로르헥시딘 디글루코네이트 (Chlorhexidine digluconate), 클로르헥시딘 디클루네이트 수용액 (Chlorhexidine digluconate solution), 클로르헥시딘 디아세테이트 (Chlorhexidine acetate) 및 클로르헥시딘 디아세테이트 염 수화물 (Chlorhexidine diacetate salt hydrate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 반응시킨 사균체를 추가로 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 박테리아 균주, 플라스미드 및 성장 조건
본 발명에서 사용된 모든 균주와 플라스미드는 하기 표 1에 기재되어 있다. 부종병 의심 자돈으로부터 분리한 야외분리 균주인 STEC 150229 및 HJL574 그리고 HJL746을 도전감염 균주로 사용하였다. HJL574로부터 재조합 Stx2eA2 단량체와 Stx2eB 단백질을 과발현 시켰다. STEC 150229, HJL574, HJL746 및 HJL2005는 LB 액체배지(Luria-Bertani broth; Becton, Dickinson and Company, 미국) 또는 LB 한천배지에서 37℃로 배양하였다. 또한 HJL2005는 재조합 Stx2eA2 단량체와 Stx2eB 단백질을 과발현시키기 위해 0.5 mM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) (Duchefa)이 첨가 후 18℃에서 24시간 배양하였다.
본 발명에 사용된 균주 및 벡터
균주/플라스미드 설명 출처
균주
Escherichia coli
HJL574 Wild type Stx2e+ LT+ STa+ F18+ STEC isolate from piglet with edema disease 본 발명
HJL746 Wild type Stx2e+ LT+ STa+ STb+ F4+ STEC isolate from piglet with edema disease 본 발명
STEC150229 Wild type Stx2e+ F18+ STEC isolate from piglet with edema disease 본발병
HJL2005 E. coli BL21(DE3)pLysS with pStx2eA2-단량체-fusion and pStx2eB 본 발명
플라스미드
pStx2eA2 단량체-fusion pTWIN1 containing the gene for Stx2eA2 (a.a. 215-319 of Stx2eA) fragment 본 발명
pStx2eB pET30a containing the gene for Stx2eB 본 발명
실시예 2. Stx2eA2-단량체-Stx2eB-오량체 재조합 단백질 발현 및 정제
상기 재조합한 HJL2005 균주를 암피실린 (Ampicillin), 클로람페니콜 (Chloramphenicol), 카나마이신 (Kanamycin)이 포함된 100 ml의 LB에 접종하여 37℃ 온도에서 200rpm 속도로 밤새 배양하였다. 암피실린 (Ampicillin), 클로람페니콜 (Chloramphenicol), 카나마이신 (Kanamycin)이 포함된 1L LB에 배양액 10 ml를 접종하여 O.D. 600 값이 0.5가 될 때까지 37℃ 온도에서 200rpm 속도로 배양하였다. IPTG를 최종농도 0.8 mM이 되도록 첨가한 후 18℃ 온도에서 150 rpm 속도로 16시간 동안 발현을 유도하였다. 배양액을 4000rpm으로 20분간 원심 분리하여 단백질이 과 발현된 세포를 수득하였다. 세포를 초음파 분쇄법으로 파쇄한 후 12,000 rpm으로 20분간 원심 분리하여 상등액을 분획하였다. 상등액을 0.45 μm 주사기 필터 (syringe filter)로 필터한 후 HisTrap FF 컬럼이 연결된 FPLC 시스템을 이용하여 순수 정제하였다. A 버퍼 (10mM Tris, pH 8.0, 300mM NaCl)를 이용하여 단백질을 컬럼에 부착하였고, Imidazole이 포함된 B 버퍼(10 mM Tris, pH8.0, 300mM NaCl, 300mM Imidazole)의 양을 순차적으로 증가시켜 단백질을 컬럼에서 용리(elution)하였다. 정제된 단백질을 농축한 후 사용할 때 까지 4℃에서 보관하였다. 상기 수득한 Stx2eA2-단량체-Stx2eB-오량체 재조합 단백질을 SDS-PAGE한 결과, Stx2eA2-단량체-Stx2eB-오량체 재조합 단백질이 형성된 것을 확인하였다 (도 3).
실시예 3. 백신 접종 및 샘플 수집
본 발명에 사용된 임신 모돈(n=3)과 자돈(n=15)은 국내 전북 소재 종돈 장에서 부종병 증상이 없고 Stx2e에 음성인 농장을 대상으로 구입하여 실험에 사용하였다. 임신 모돈은 통상적으로 농가에서의 백신 프로그램에 따라 예방접종하였다. 예상되는 분만일 14일 전에 임신 모돈을 각각 자돈을 위한 열전등(heat lamp)과 분만틀을 가진 분만우리에 옮겼다. 임신 모돈은 항생제 또는 다른 생장 촉진제 없는 식단으로 급여하였다. 자돈은 출생 후 최대 21일까지 모돈과 키웠다. 전체 3마리 임신 모돈으로부터 출생한 자돈 15마리를 3그룹으로 나누었다. 자돈이 5일령이 되었을 때 그룹 A 및 B 자돈은 멸균 PBS로 1ml 접종하였고 그룹 C 자돈은 Stx2eA2 단편-Stx2eB-오량체 재조합 단백질과 IMS1313 adjuvant가 혼합된 백신으로 Stx2eA2 단량체-Stx2eB-오량체 재조합 단백질은 75ug이 되게 혼합하여 근육 접종하였다 (0 week post prime immunization; WPPI). 그리고 자돈이 19일령이 되었을 때 같은 그룹의 자돈들은 같은 항원으로 2차 접종 하였다(2 WPPI).돼지가 21일령이 되었을 때 전북대학교 특성화 캠퍼스로 각 그룹당 5마리씩 이송하여 1주일간의 적응기간을 보냈다. 혈액 샘플은 2차 접종 전 (2 WPPI) 그리고 도전감염 전 (5주령, 4 WPPI)에 각각 채혈하여 수집하였다. 모든 샘플은 사용 전까지 -70℃에 저장하였다. 모든 실험동물은 한국동물보호협회 지침에 따라 준수사항을 전북대 동물윤리위원회로부터 승인을 받아 사용하였다.
실시예 4. ELISA 면역 반응 측정
재조합 Stx2eA2-단량체-Stx2eB-오량체 단백질 항원에 대한 면역증진 효과를 실험하기 위해, pig IgG ELISA Quantitation Kit(Bethyl Lab Inc., 미국)을 사용하여 효소면역분석법(ELISA)을 수행하였다. 자돈의 혈청 샘플을 1:200으로 희석하여 IgG 역가에 사용하였다. 효소 반응은 o-페닐렌디아민(Sigma-Aldrich, 미국)으로 발색하여 492nm에서 흡광도를 측정하였다. 자돈의 혈청 내 재조합 Stx2eA2-단량체-Stx2eB-오량체 단백질 항원에 대한 항체 반응은 도 4에 개시되었다. Stx2eA2-단량체-Stx2eB-오량체 재조합 단백질 항원에 대한 혈청 IgG 역가는 대조군인 그룹 A와 비교해 봤을 때 그룹 B (PBS를 접종한 그룹)는 대조군과 유사한 결과가 관찰된 반면, 75ug을 접종한 그룹 C 그룹은 대조군에 비해 현저하게 증가했다(P≤0.05)(도 4).
실시예 5. 도전감염
도전감염 실험을 위해 JHL574와 JHL746, STEC 150229를 도전감염 균주(challenge strain)로 준비하였다. 자돈이 5주령이 되었을 때 각 균주는 1×109 CFU/ml로 준비되어 동량씩 혼합되어 그룹 A 자돈을 제외한 모든 자돈에 2ml씩 경구로 접종되었다. 자돈은 접종 14일 동안 매일 임상증상 및 폐사 여부를 모니터링하였다. 부종병 또는 이유 자돈 설사병의심 증상이 발견된 자돈에서 직장도말(rectal swab)로 검체를 채취하여 병원성 대장균을 분리하였고, 상기 표 2에서 기술된 프라이머를 이용하여 F4+ 대장균인지 또는 F18+ 대장균이지 여부를 PCR 방법으로 확인하였다. 그룹 C의 자돈(75ug을 접종한 그룹)은 도전감염 14일까지 임상증상 및 폐사가 관찰되지 않은 반면, 대조군인 그룹 B 자돈 5두 모두 부종병의 임상 증상을 보이며 3두가 폐사하였다 (표 3, 도 5).
이 실험에 사용된 프라이머 및 이의 PCR 산물의 크기
Primer 　 Sequence Size (bp)
F4 F TGA ATG ACC TGA CCA ATG GTG GAA CC 484
R GCG TTT ACT CTT TGA ATC TGT CCG AG
F18 F TGG CAC TGT AGG AGA TAC CAT TCA GC 334
R GGT TTG ACC ACC TTT CAG TTG AGC AG
LT F ACG GCG TTA CTA TCC TGT CTA TGT GC 275
R TTG GTC TCG GTC AGA TAT GTG ATT CT
STa F GTC AGT CAA CTG AAT CAC TTG ACT CT 152
R CAT GGA GCA CAG GCA GGA TTA CAA CA
Stx2e F CGG TAT CCT ATT CCC AGG AGT TTA CG 599
R GTC TTC CGG CGT CAT CGT ATA AAC AG
야외 병원성 대장균 감염균주에 대한 도전감염 후 자돈의 임상 증상
그룹 자돈수 폐사 자돈 수(%) 부종병 임상 증상 발현 자돈 수 (%)
A 5 0 0
B 5 3 (60) 5 (100)
C 5 0 0
실시예 6. F4+ 병원성 대장균, F18+ 병원성 대장균 신개념 사균체 제조
F4+ 병원성 대장균 (HJL746) 또는 F18+ 병원성 대장균 (HJL574) 균주의 한 콜로니를 선택하여 각각 200ml의 LB 액체 배지에 접종한 후 37℃에서 흡광도가 0.8에 도달할 때까지 배양했다. 배양된 배지에 준비된 클로르헥시딘 디글루코네이트 (Chlorhexidine digluconate 또는 Chlorhexidine digluconate solution) 또는 클로르헥시딘 디아세테이트 (Chlorhexidine diacetate)를 3 ul/ml ~ 20 ul/ml (3.18mg/ml ~ 12.2mg/ml) 씩 첨가하여 각 병원성 대장균 균주가 lysis가 유도 되도록 실온에서 5분에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 생균같은 사균체로 유도 여부를 확인하기 위해 각 반응액 중 100㎕ 씩을 LB 아가 배지 및 broth에 각각 접종하여 37℃에서 5일간 배양하여 colony 형성 유무로 반응액의 lysis 여부를 확인하였다. 또한 확인된 lysis 반응액은 4,000 × g에서 30분간 원심하여 농축되었고, 멸균 PBS로 세 번 세척한 후 최종적으로 각 혈청형 당 2 × 109 cells/ml이 되도록 희석하여 냉장보관하면 실험에 사용하였다.
실시예 7. F4+ 병원성 대장균, F18+ 병원성 대장균 신개념 사균체의 투사전자현미경 (TEM)
상기 실시예 6의 방법으로 제조한 F4+ 병원성 대장균 및 F18+ 병원성 대장균 신개념 사균체를 ajuvant인 IMS 1313 그리고 실시 예2에서 준비한 Stx2eA2-단량체-Stx2eB-오량체 재조합 단백질과 혼합하기 전에 하룻밤 2.5% 글루타르 알데히드로 선 고정 후, 박테리아 펠릿을 PBS로 3회 세척하고 2시간 동안 PBS에 1% 사산화오스뮴으로 후 고정하였다. 고정된 박테리아 세포를 PBS로 3회 세척하고 다양한 일련의 에탄올(50%, 70%, 90%, 100%)에 15분 동안 탈수시켰다. 20 분 동안 무수 아세톤에 배치한 후, 이러한 샘플을 각각 1시간 동안 무수 아세톤 및 에폭시 수지의 1:1 및 1:3 혼합물에 옮기고, 밤새 순수 에폭시 수지에 옮겼다. 울트라마이크로톰 (Ultramicrotome)를 이용하여 얻은 초박 절편을 우라닐 아세테이트와 리드 시트레이트로 후-염색하였다. 표본을 투과전자현미경(Hitachi H-7650, Japan)으로 관찰하였다. TEM은 Lv et al (Lv et al. 2014)에 설명된 방식에 따라 촬영되었다. 도 6A에서 보는 것처럼, 상기 실시예 6에서 사용되었던 사균화 유도 물질로 처리하지 않은 F4+ 병원성 대장균 및 F18+ 병원성 대장균 균주는 온전한 세포막과 세포 내를 가득 메운 세포 내용물이 관찰되었다 (도 6A). 반면, GI24 또는 클로르헥시딘 디글루코네이트 (Chlorhexidine digluconate 또는 Chlorhexidine digluconate solution) 또는 클로르헥시딘 디아세테이트 (Chlorhexidine diacetate)로 유도된 F4+ 병원성 대장균 및 F18+ 병원성 대장균 신개념 사균체는 도 6B에서 보는 것처럼 하나의 구멍이 뚫린 세포막과 더불어 빈 세포질 공간이 관찰되었다.
실시예 8. 백신 접종 및 샘플 수집
본 발명에 사용된 임신 모돈(n=3)과 자돈(n=15)은 국내 전북 소재 종돈장에서 부종병 증상이 없고 Stx2e에 음성인 농장을 대상으로 구입하여 실험에 사용하였다. 임신 모돈은 통상적으로 농가에서의 백신 프로그램에 따라 예방접종하였다. 예상되는 분만일 14일 전에 임신 모돈을 각각 자돈을 위한 열전등(heat lamp)과 분만틀을 가진 분만우리에 옮겼다. 임신 모돈은 항생제 또는 다른 생장 촉진제 없는 식단으로 급여하였다. 자돈은 출생 후 최대 21일까지 모돈과 키웠다. 전체 3마리 임신 모돈으로부터 출생한 자돈 15마리를 3그룹으로 나누었다. 자돈이 5일령이 되었을 때 그룹 A 및 B 자돈은 멸균 PBS로 1ml 접종하였고 그룹 C 자돈은 Stx2eA2 단편-Stx2eB-오량체 재조합 단백질과 F4+ 병원성 대장균 및 F18+ 병원성 대장균 신개념 사균체가 각각 1 × 109 cells/ml씩이 되도록 IMS1313 adjuvant가 혼합된 백신으로 Stx2eA2 단량체-Stx2eB-오량체 재조합 단백질은 75ug이 되게 혼합하여 근육 접종하였다 (0 week post prime immunization; WPPI). 그리고 자돈이 19일령이 되었을 때 같은 그룹의 자돈들은 같은 항원으로 2차 접종 하였다(2 WPPI).돼지가 21일령이 되었을 때 전북대학교 특성화 캠퍼스로 각 그룹당 5마리씩 이송하여 1주일간의 적응기간을 보냈다. 혈액 샘플은 2차 접종 전 (2 WPPI) 그리고 도전감염 전 (5주령, 4 WPPI)에 각각 채혈하여 수집하였다. 모든 샘플은 사용 전까지 -70℃에 저장하였다. 모든 실험동물은 한국동물보호협회 지침에 따라 준수사항을 전북대 동물윤리위원회로부터 승인을 받아 사용하였다.
실시예 9. ELISA 면역 반응 측정
각 Stx2eA2-단량체-Stx2eB-오량체 및 F4 (K88ac) 그리고 F18 (FedA) 재조합 단백질 항원에 대한 면역증진 효과를 실험하기 위해, pig IgG ELISA Quantitation Kit(Bethyl Lab Inc., 미국)을 사용하여 효소면역분석법(ELISA)을 수행하였다. 자돈의 혈청 샘플을 1:200으로 희석하여 IgG 역가에 사용하였다. 효소 반응은 o-페닐렌디아민(Sigma-Aldrich, 미국)으로 발색하여 492nm에서 흡광도를 측정하였다. 자돈의 혈청 내 각 Stx2eA2-단량체-Stx2eB-오량체 및 F4 (K88ac) 그리고 F18 (FedA) 재조합 단백질 각 항원에 대한 항체 반응은 도 7및 도 8에 개시되었다. Stx2eA2-단량체-Stx2eB-오량체 재조합 단백질 항원에 대한 혈청 IgG 역가는 대조군인 그룹 A와 비교해 봤을 때 그룹 B (PBS를 접종한 그룹)는 대조군과 유사한 결과가 관찰된 반면, 75ug을 접종한 그룹 C 그룹은 대조군에 비해 현저하게 증가했다(P≤0.05)(도 7). 더불어 예방 접종한 자돈에서의 F4 (K88ac) 그리고 F18 (FedA) 재조합 단백질항원에 대한 혈청 IgG 역가는 대조군인 그룹 A와 비교해 봤을 때 그룹 B (PBS를 접종한 그룹)는 대조군과 유사한 결과가 관찰된 반면, 그룹 C의 경우에는 대조군에 비해 유의성 있게 증가했다 (P≤0.07)(도 8).
실시예 10. 도전감염
도전감염 실험을 위해 JHL565, JHL574와 JHL746, JHL593, STEC 150229를 도전감염 균주(challenge strain)로 준비하였다. 자돈이 5주령이 되었을 때 각 균주는 1×109 CFU/ml로 준비되어 동량씩 혼합되어 그룹 A 자돈을 제외한 모든 자돈에 2ml씩 경구로 접종되었다. 자돈은 접종 14일 동안 매일 임상증상 및 폐사 여부를 모니터링하였다. 부종병 또는 이유 자돈 설사병의심 증상이 발견된 자돈에서 직장도말(rectal swab)로 검체를 채취하여 병원성 대장균을 분리하였고, 상기 표 2에서 기술된 프라이머를 이용하여 F4+ 대장균인지 또는 F18+ 대장균이지 여부를 PCR 방법으로 확인하였다. 그룹 C의 자돈(75ug을 접종한 그룹)은 도전감염 14일까지 임상증상 및 폐사가 관찰되지 않은 반면, 대조군인 그룹 B 자돈 5두 모두 부종병의 임상 증상을 보이며 3두가 폐사하였다 (표4, 도 9).
야외 병원성 대장균 감염균주에 대한 도전감염 후 자돈의 임상 증상
그룹 자돈수 폐사 자돈 수(%) 부종병 임상 증상 발현 자돈 수 (%)
A 5 0 0
B 5 3 (60) 5 (100)
C 5 0 0
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC13847BP
수탁일자 : 20190502
SEQUENCE LISTING <110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY Komipharm International Co., Ltd <120> Vaccine composition for preventing or treating pathogenic Escherichia coli in pigs comprising Stx2eA2-(Stx2eB)5 recombinant protein as a vaccine <130> 1067275 <160> 4 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> amino acid sequence of Stx2eA2 <400> 1 Pro Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Ile Ser Asn Val 1 5 10 15 Leu Pro Glu Tyr Arg Gly Glu Ala Gly Val Arg Val Gly Arg Ile Ser 20 25 30 Phe Asn Asn Ile Ser Ala Ile Leu Gly Thr Val Ala Val Ile Leu Asn 35 40 45 Cys His His Gln Gly Ala Arg Ser Val Arg Ala Val Asn Glu Glu Ser 50 55 60 Gln Pro Glu Cys Gln Ile Thr Gly Asp Arg Pro Val Ile Lys Ile Asn 65 70 75 80 Asn Thr Leu Trp Glu Ser Asn Thr Ala Ala Ala Phe Leu Asn Arg Lys 85 90 95 Ser Gln Pro Leu Tyr Thr Thr Gly Glu 100 105 <210> 2 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> amino acid sequence of Stx2eB <400> 2 Met Ser Glu Asp Thr Lys Ser Pro Lys Lys Lys Ser Ser Pro Ile Arg 1 5 10 15 Ala Asn Arg Leu Ala His Met Gly Ser Ala Thr Met Ala His His His 20 25 30 His His His Lys Lys Met Phe Ile Ala Val Leu Phe Ala Leu Val Ser 35 40 45 Val Asn Ala Met Ala Ala Asp Cys Ala Lys Gly Lys Ile Glu Phe Ser 50 55 60 Lys Tyr Asn Glu Asp Asn Thr Phe Thr Val Lys Val Ser Gly Arg Glu 65 70 75 80 Tyr Trp Thr Asn Arg Trp Asn Leu Gln Pro Leu Leu Gln Ser Ala Gln 85 90 95 Leu Thr Gly Met Thr Val Thr Ile Ile Ser Asn Thr Cys Ser Ser Gly 100 105 110 Ser Gly Phe Ala Gln Val Lys Phe Asn 115 120 <210> 3 <211> 98 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> amino acid sequence for expressing Stx2eA2 in vector <400> 3 ccatggccca ccaccatcat caccatgaaa gtaatacagc agcagcgttt ctgaacagaa 60 agtcacagtc tttatataca actggtgaat gaggatcc 98 <210> 4 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> amino acid sequence for expressing Stx2eB in vector <400> 4 catatgagtg aggacacaaa atcaccgaaa aagaagtcga gcccaatccg tgccaataga 60 ctagcccaca tgggatccgc caccatggcc caccatcatc accaccataa gaagatgttt 120 atagcggttt tatttgcatt ggtttctgtt aatgcaatgg cggcggattg tgctaaaggt 180 aaaattgagt tttccaagta taatgaggat aataccttta ctgtgaaggt gtcaggaaga 240 gaatactgga cgaacagatg gaatttgcag ccattgttac aaagtgctca gctgacaggg 300 atgactgtaa caatcatatc taatacctgc agttcaggct caggctttgc ccaggtgaag 360 tttaac 366

Claims (9)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 Stx2eA2-단량체(monomer) 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 Stx2eB-오량체로 이루어진 Stx2eA2-단량체-Stx2eB-오량체 재조합 단백질을 포함하는 돼지의 병원성 대장균증의 예방 또는 치료용 백신 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 백신 조성물은 수산화 알루미늄, GEL 01, GEL 02, IMS 1313 (VG), IMS 1313 (VG N), ISA 15A (VG), ISA 28R (VG), ISA 35 (VG), ISA 201 (VG), ISA 206 (VG), ISA 660 (VG), 기름속 수형 에멀젼(물-in-oil emulsion), 불완전 프로인트항원보조제(불완전한 Freund’s adjuvant), 백반(alum), 알루미늄 하이드록사이드(aluminum hydroxide), Toll-like 수용체 작용제(Toll-like receptor agonist), 면역자극성 올리고뉴클레오티드(Immunostimulatory oligonucleotide) 및 생물학적 보조제(biological adjuvant)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 보조제(adjuvant)를 추가적으로 포함하는, 돼지의 병원성 대장균증의 예방 또는 치료용 백신 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 백신 조성물은 Stx2eA2-단량체-Stx2eB-오량체 재조합 단백질의 농도 10ug 내지 1,000ug인, 돼지의 병원성 대장균증의 예방 또는 치료용 백신 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 백신 조성물은 자돈 또는 모돈에 접종하는, 돼지의 병원성 대장균증의 예방 또는 치료용 백신 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 돼지의 병원성 대장균증은 돼지의 부종병, 신생자돈 설사병, 조발성 설사병, 3주령 설사병, 백리, 포유자돈 설사병 또는 이유자돈 설사병인, 돼지의 병원성 대장균증의 예방 또는 치료용 백신 조성물.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 백신 조성물은 Fimbriae 4 (F4)를 발현하는 병원성 대장균 및 Fimbriae 18 (F18)을 발현하는 병원성 대장균이며, 미생물 기탁번호 KCTC13847BP(미생물 명칭: Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) F4, F18)로 기탁된 병원성 대장균의 혼합 균주와 GI24, 클로르헥시딘 디글루코네이트 (Chlorhexidine digluconate), 클로르헥시딘 디클루네이트 수용액 (Chlorhexidine digluconate solution), 클로르헥시딘 디아세테이트 (Chlorhexidine acetate) 및 클로르헥시딘 디아세테이트 염 수화물 (Chlorhexidine diacetate salt hydrate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 반응시킨 사균체를 추가로 포함하는, 돼지의 병원성 대장균증의 예방 또는 치료용 백신 조성물.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 사균체는 각각 1 × 108 cells/ml 내지 1 × 1011 cells/ml으로 동량 혼합되는, 돼지의 병원성 대장균증의 예방 또는 치료용 백신 조성물.
  8. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 Stx2eA2 단량체(monomer) 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 Stx2eB-오량체로 이루어진 Stx2eA2-단량체-Stx2eB-오량체 재조합 단백질을 포함하는, 돼지의 병원성 대장균증 예방용 사료 첨가제.
  9. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 Stx2eA2-단량체(monomer) 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 Stx2eB-오량체로 이루어진 Stx2eA2-단량체-Stx2eB-오량체 재조합 단백질을 포함하는 백신 조성물을 모돈 또는 자돈에 접종하는 단계를 포함하는, 돼지의 병원성 대장균증에 대한 면역력을 증진시키는 방법.
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