KR102018707B1

KR102018707B1 - 돼지 흉막폐렴의 예방 또는 치료용 백신 조성물

Info

Publication number: KR102018707B1
Application number: KR1020170097080A
Authority: KR
Inventors: 박병선; 한제민; 이수진; 신동주; 정영주; 정청환; 조은행; 이낙형; 김태환
Original assignee: 주식회사 고려비엔피
Priority date: 2017-07-31
Filing date: 2017-07-31
Publication date: 2019-09-06
Also published as: KR20190014265A

Abstract

본 발명은 흉막폐렴균 ApxIA 단백질의 단편과 흉막폐렴균 ApxIIA 단백질의 단편을 포함하는 융합 단백질에 관한 것으로, 톡신 ApxI의 구성요소인 A, B, C, D 중, ApxI의 구조 단백질인 ApxIA의 N 말단 일부의 부분 단백질인 NA(1~380 amino acid) 와, ApxII 톡신의 구조단백질인 ApxIIA의 부분 단백질인 F#5(439~801 amino acid)를 융합한 융합 단백질 L을 이용한 백신이 ApxI과 ApxII 톡신의 조합을 가지고 있는 흉막폐렴균의 혈청형 1 뿐만 아니라, ApxII과 ApxIII 톡신의 조합을 가지는 흉막폐렴균의 혈청형 2에 대해서도 방어효과를 가지는 것을 확인하여, 흉막폐렴균의 두가지 혈청형에 대한 백신으로 이용이 가능하다.

Description

돼지 흉막폐렴의 예방 또는 치료용 백신 조성물{Vaccine composition for preventing or treating porcine pleuropneumonia}

본 발명은 돼지 흉막폐렴균의 Apx 독소의 융합 단백질을 이용한 돼지 흉막폐렴의 예방 또는 치료용 백신 조성물에 관한 것이다.

돼지의 흉막폐렴은 흉막폐렴균인 액티노바실러스 플로르뉴모니아 (Actinobacillus pleuropneumoniae , APP)에 의해 유발되는 데, 일반적으로 급성으로 진행되어 육성돈 또는 비육돈의 급사 등을 야기하는 질병으로서, 주요 증상은 식욕결핍, 호흡곤란, 구토, 청색증, 고열, 코와 입의 출혈, 급사 등이다. 감염 초기에 급성형으로 진행되는 경우가 많아서 치료가 어려우며, 만성으로 진행되는 경우일지라도 증체율 감소, 출하 지연 등으로 양돈 산업에 막대한 경제적 피해를 일으키는 질병이다. 지금까지 전세계적으로 15종류의 혈청형이 분리 동정되었다. 국내 양돈장의 경우 15종의 혈청형 중 2번 및 5번에 의한 흉막폐렴이 가장 많이 발생하고 있는 실정이다. 한편 종돈 수입과 관련하여, 최근 국내에서는 혈청형 1, 3, 4, 6, 7, 10, 12번에 의한 흉막폐렴의 발생 보고가 있어 이에 대한 대책도 필요하다.

상기 흉막폐렴균의 병원성 인자로 리포폴리사카라이드 (lipopolysaccharides), 외막 단백질 (outer membrane proteins), 우레아제 (urease), 캡슐 폴리사카라이드 (capsular polysaccharides), 부착인자 (adhesion factors), Apx 톡신 (Apx toxin) I-IV 등이 알려져 있다.

상기 흉막폐렴균은 ApxI, Apx, ApxⅢ, ApxIV 네 종류의 독소를 생산하는 데, ApxI은 강한 용혈성과 세포독성을 지닌 단백질로서 1형, 5형, 9형, 10형, 11형과 같은 혈청형에서 분비된다. Apx는 약한 용혈성과 중간정도의 세포독성을 지닌 단백질로서 10형을 제외한 모든 혈청형에서 분비된다. Apx는 용혈성질은 없지만, 세포독성을 지니고 있으며, 2형, 3형, 4형, 6형, 8형에서 분비된다. ApxIV는 약한 용혈성을 지니고 있으며, 현재 아직 그 역할이 자세히 밝혀져 있지 않다. 특히, 흉막폐렴균의 혈청형 1과 흉막폐렴균의 혈청형 2는 서로 다른 Apx 톡신의 조합으로 이루어져 있다. 흉막폐렴균의 혈청형 1의 경우 ApxI과 ApxII의 조합을 가지고 있으며, 흉막폐렴균의 혈청형 2의 경우 ApxII와 ApxIII의 조합을 가지고 있다.

또한, 각각의 Apx 독소는 ApxA, ApxB, ApxC, ApxD의 4가지 구성요소로 이루어져 있으며, Apx 독소의 분비와 생산을 위해 상기 4가지 유전자를 필요로 한다. ApxA 유전자는 구조적 독소 단백질이고, ApxC 유전자는 독소를 활성화시키는 역할을 한다. ApxB와 ApxD 유전자는 활성화된 독소를 분비하는 역할을 담당한다.

본 발명에서는 서로 다른 Apx 톡신의 조합으로 이루어진 흉막폐렴균의 혈청형 1과 흉막폐렴균의 혈청형 2를 동시에 방어할 수 있는 백신을 개발하고자 하였다.

대한민국 공개특허 제10-2012-0054037호

본 발명의 목적은 흉막폐렴균 ApxIA 단백질의 단편과 흉막폐렴균 ApxIIA 단백질의 단편을 포함하는 융합 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 융합단백질을 코딩하는 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 융합 단백질, 상기 형질전환체의 단백질 추출물 또는 상기 형질전환체에서 분리된 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는, 흉막폐렴의 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 융합 단백질, 상기 형질전환체의 단백질 추출물 또는 상기 형질전환체에서 분리된 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는, 흉막폐렴의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 융합 단백질, 상기 형질전환체의 단백질 추출물 또는 상기 형질전환체에서 분리된 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는, 흉막폐렴의 예방 또는 개선용 사료 첨가용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 백신 조성물, 사료 조성물 또는 사료 첨가용 조성물을 인간을 제외한 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 흉막폐렴을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자는 톡신 ApxI과 ApxII의 조합을 가지고 있는 흉막폐렴균의 혈청형 1에 대한 백신을 제조하기 위하여, 톡신 ApxI의 구성요소인 A, B, C, D 중, ApxI의 구조 단백질인 ApxIA의 N 말단 일부의 부분 단백질인 NA(1~380 amino acid) 와, ApxII 톡신의 구조단백질인 ApxIIA의 부분 단백질인 F#5(439~801 amino acid)를 융합한 융합 단백질 L을 이용한 백신이 ApxI과 ApxII 톡신의 조합을 가지고 있는 흉막폐렴균의 혈청형 1 뿐만 아니라, ApxII와 ApxIII 톡신의 조합을 가지는 흉막폐렴균의 혈청형 2에 대해서도 방어효과를 가지는 것을 확인하여, 흉막폐렴균의 두가지 혈청형에 대한 백신으로 이용이 가능함을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 흉막폐렴균 ApxIA 단백질의 단편과 흉막폐렴균 ApxIIA 단백질의 단편을 포함하는 융합 단백질을 제공한다.

흉막폐렴균인 액티노바실러스 플로르뉴모니아 (Actinobacillus pleuropneumoniae, APP)의 혈청형 1의 경우 ApxI과 ApxII의 조합을 가지고 있으며, 흉막폐렴균인 액티노바실러스 플로르뉴모니아 (Actinobacillus pleuropneumoniae , APP)의 혈청형 2의 경우 ApxII와 ApxIII의 조합을 가지고 있다. 보다 구체적으로, 상기 흉막폐렴균의 혈청형 1의 경우 ApxI과 ApxII의 구조단백질인 ApxIA과 ApxIIA의 조합을 가지고 있으며, 흉막폐렴균의 혈청형 2의 경우 ApxII와 ApxIII의 구조단백질인 ApxIIA와 ApxIIIA의 조합을 가지고 있다.

이에, 본 발명에서는, 흉막폐렴균인 액티노바실러스 플로르뉴모니아 (Actinobacillus pleuropneumoniae , APP) 1형이 보유하는 독소의 하나인 ApxI의 구조 단백질인 ApxIA 단백질의 단편에 해당하는 ApxIA의 N 말단인 NA(1~380 amino acid)와, ApxII의 구조단백질인 ApxIIA의 단편에 해당하는 ApxIIA의 일부인 F#5(439~801 amino acid)를 융합한 융합 단백질 L을 제조하였다.

구체적으로, 본원발명의 일실시예에서는 액티노바실러스 플로르뉴모니아의 1형(APP1) 균주에서 유전자를 추출하고 이를 주형으로 하여, GS LINKER가 포함하는 프라이머를 이용하여 유전자 NA와 F#5를 증폭하였으며, 증폭된 이들 유전자를 GS LINKER를 통해 연결시켜 ApxIA의 N 말단 일부를 구성하는 NA와 ApxIIA의 일부를 구성하는 F#5를 GS LINKER로 연결된 융합된 유전자 L을 제조하였다.

이에 따라, 본 발명에서, 상기 융합 단백질은 흉막폐렴균 ApxIA 단백질의 단편과 흉막폐렴균 ApxIIA 단백질의 단편은 펩티드 링커로 연결될 수 있다.

본 발명에서, 상기 흉막폐렴균 ApxIA 단백질 단편은 ApxIA의 N 말단 일부를 구성하는 NA의 아미노산 서열에 해당하는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.

본 발명에서, 상기 흉막폐렴균 ApxIIA 단백질의 단편은 F#5로, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.

본 발명에서, 상기 펩티드 링커는 GS LINKER로, 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.

본 발명에서, 상기 융합 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열과, 서열번호 2의 아미노산 서열과, 서열번호 3의 아미노산이 연결된 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 흉막폐렴균 ApxIA 단백질의 단편과 흉막폐렴균 ApxIIA 단백질의 단편을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.

상기 융합 단백질에 대하여는 전술한 바와 같다. 상기 유전자는 하나이상의 코돈 서열이 숙주세포의 발현에 적합한 코돈으로 변형된 것일 수 있다. 상기 숙주세포는 대장균, 효모 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 유전자는 서열번호 4의 아미노산 서열을 코딩할 수 있다. 예를 들면, 상기 유전자는 서열번호 5의 염기서열을 가질 수 있다.

본원발명의 일실시예에서는 유전자 증폭을 통해 증폭된 NA와 F#5를 GS LINKER를 통해 연결하여 제조된 융합 유전자 L을 제조한 후, 이를 pET-28a 발현 벡터에 연결시킨 후, 대장균에 형질전환 시킨 후 발현 벡터에 제대로 삽입된 지를 유전자 염기서열을 통해 확인한 결과 서열번호 5의 염기서열을 가지는 것을 확인하였다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

상기 융합 단백질과 유전자에 대하여는 전술한 바와 같다.

본 발명에서 용어, "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

본 발명에서 용어 "벡터"는 숙주 세포로 염기의 클로닝 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말한다. 벡터는 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위(replicon)일 수 있다. "복제단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제 가능한, 임의의 유전적 단위 (예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 말한다. 용어 "벡터"는 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 숙주 세포로 염기를 도입하기 위한 바이러스 및 비 바이러스 매개물을 포함한다.

본 발명의 상기 재조합 벡터에는 흉막폐렴균 ApxIA 단백질의 단편과 흉막폐렴균 ApxIIA 단백질의 단편을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 유전자가 포함될 수 있다. 보다 구체적으로 서열번호 4의 아미노산을 코딩하는 유전자가 포함되는 것이다. 또는 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 유전자가 포함되는 것이다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

본 발명에서 용어, "형질전환"은 외부로부터 주어진 DNA에 의하여 생물의 유전적인 성질이 변하는 것으로, 즉 생물의 어떤 계통의 세포에서 추출된 핵산의 일종인 DNA를 다른 계통의 살아있는 세포에 도입했을 때 상기 DNA가 그 세포에 들어가서 유전형질이 변화하는 현상으로 형질변환이라고도 한다.

본 발명에서 용어, "형질전환체"는 형질전환으로 인해 생성된 형질전환식물 또는 형질전환동물을 의미하며, 유전자 재조합 기술을 이용하여 특정 유전자의 변형 또는 변이가 유발되어 생성된 유전자재조합체를 포함한다. 본 발명의 형질전환체는 당업계에 공지된 형질전환에 이용될 수 있는 세포이면 제한없이 당업자에 의해 적절하게 선택되어 사용될 수 있으며, 인간을 제외한 형질전환체로, 미생물 유래의 형질전환체일 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 융합 단백질, 상기 형질전환체의 단백질 추출물 또는 상기 형질전환체에서 분리된 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는, 흉막폐렴의 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.

본 발명에서, 상기 흉막폐렴은 흉막폐렴균인 액티노바실러스 플로르뉴모니아의 1형(APP1)과 액티노바실러스 플로르뉴모니아의 2형(APP2)일 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 융합 단백질인 L 백신의 경우 APP1과 APP2 두가지 혈청형에 대해 방어효과를 가진다는 것을 확인했다

본 발명에서 용어, "융합 단백질", "형질전환체"는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명에서 용어, "예방"은 본 발명의 상기 융합 단백질, 상기 형질전환체의 단백질 추출물 또는 상기 형질전환체에서 분리된 재조합 단백질을 유효성분으로 하는 조성물의 투여로 흉막폐렴을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.

본 발명에서 용어, "치료"는 본 발명의 상기 융합 단백질, 상기 형질전환체의 단백질 추출물 또는 상기 형질전환체에서 분리된 재조합 단백질을 유효성분으로 하는 조성물의 투여로 흉막폐렴이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.

본 발명에서 용어, "백신"은 생체에 면역을 주는 항원을 함유한 생물학적인 제제로서, 감염증의 예방을 위하여 사람이나 동물에 주사하거나 경구투여함으로써 생체에 면역이 생기게 하는 면역원 또는 항원성 물질을 말한다.

본 발명에서 용어, "면역원" 또는 "항원성 물질"은 펩티드, 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 발현하는 유산균, 단백질, 상기 단백질을 발현하는 유산균, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 재조합 박테리아 및 재조합 바이러스로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있다. 구체적인 예를 들면, 상기 항원 물질은 불활성화된 전체 또는 부분 세포 제제 형태, 또는 통상적인 단백질 정제, 유전 공학 기법 또는 화학 합성에 의해 수득되는 항원 분자 형태일 수 있다.

상기 항원의 함량은 백신 조성물 총 중량에 대해서 1 내지 10 중량%일 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 1종 이상의 면역증강제를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서의 용어 "면역증강제"란, 일반적으로 항원에 대한 체액 및/또는 세포 면역 반응을 증가시키는 임의의 물질을 지칭한다. 전통적인 백신들은 죽은 병원성 미생물의 비가공 제제로 구성되어, 병원성 미생물의 배양액과 관련된 불순물들은 면역 반응을 향상시키기 위한 면역증강제로서 작용할 수 있으나, 정제된 단백질 서브유닛의 균질 제제를 백신접종을 위한 항원으로서 사용하는 경우, 상기와 같은 항원에 의해 발동된 면역성은 불충분하여 면역증강제로서 일부 외래물질의 첨가가 필요해 진다. 면역증강제를 사용함으로써 면역 반응을 자극하는데 보다 적은 용량의 항원이 요구될 수 있으며, 이에 의해 백신 생산 비용이 절감될 수 있다. 이러한 면역증강제는 그 원료(미네랄, 세균, 식물)와 성분(유제현탁액)에 따라 분류된다. 구체적으로, 콜레라 톡신(CT; cholera toxin), 알루미늄하이드록사이드, 카보폴(carbopol), 광물성 오일 또는 생분해성(Biodegradable) 오일이 있다.

본 발명에 따른 백신 조성물은 안정제, 유화제, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, pH 조정제, 계면활성제, 리포솜, 이스콤(iscom) 보조제, 합성 글리코펩티드, 증량제, 카복시폴리메틸렌, 세균 세포벽, 세균 세포벽의 유도체, 세균백신, 동물 폭스바이러스 단백질, 서브바이랄(subviral) 입자 보조제, 콜레라 독소, N, N-디옥타데실-N',N'-비스(2-하이드록시에틸)-프로판디아민, 모노포스포릴 지질 A, 디메틸디옥타데실-암모늄 브로마이드 및 이의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 제2 보조제를 추가로 함유할 수 있다.

또한, 본 발명의 백신 조성물은 수의학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, "수의학적으로 허용 가능한 담체"란 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항원보강제, 안정제, 희석제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장성 작용제, 흡착지연제 등을 포함한다. 백신용 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제, 희석제로는 락토즈, 덱스트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 글리세린, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

또한, 본 발명의 백신 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 레시틴 유사 유화제에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 슈크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 사용할 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 포함된다. 비수용성제제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 융합 단백질, 상기 형질전환체의 단백질 추출물 또는 상기 형질전환체에서 분리된 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는, 흉막폐렴의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어, "융합 단백질", "형질전환체", "예방"은 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명의 사료 조성물은 상기 융합 단백질, 상기 형질전환체의 단백질 추출물 또는 상기 형질전환체에서 분리된 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 한 당업계에 공지된 다양한 형태의 조성비로 당업자에 의해 적절하게 구성될 수 있다.

본 발명에서, 상기 사료 조성물은 사료첨가제 이외에, 개체의 유지와 성장을 위해 반드시 사료로부터 공급되어야 할 필수 영양소로서 에너지, 아미노산, 광물질, 비타민 및 물을 포함할 수 있다.

본 발명의 사료 조성물을 적용할 수 있는 개체는 특별히 한정되지 않고, 어떠한 형태의 것이든 적용 가능하다. 예를 들면, 닭, 돼지, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 래트, 마우스, 소, 양, 염소 등과 같은 동물에 제한없이 적용가능하다.

상기 사료는, 각종 사료, 기능성 사료, 음료, 사료 첨가제 및 음료(음수) 첨가제를 모두 포함하는 의미로 사용된다.

또한, 상기 사료 조성물에서, 상기 유효성분의 양은 사료 조성물 총 중량의 0.00001 중량% 이상, 구체적으로 0.1 중량% 이상일 수 있고, 80 중량% 이하, 구체적으로 50 중량% 이하, 더욱 구체적으로 40 중량% 이하로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 융합 단백질, 상기 형질전환체의 단백질 추출물 또는 상기 형질전환체에서 분리된 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는, 흉막폐렴의 예방 또는 개선용 사료 첨가용 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어 "사료첨가용 조성물"이란, 사료에 첨가하여 생산성 향상이나 건강을 증진시킬 수 있는 물질을 의미한다.

본 발명의 사료 첨가용 조성물은 당업계에 공지된 다양한 형태로 제조될 수 있으며, 바람직하게는 상기 융합 단백질, 상기 형질전환체의 단백질 추출물 또는 상기 형질전환체에서 분리된 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 것이다.

본 발명에 따른 사료 첨가제는 개별적으로 사용될 수 있고 종래 공지된 사료 첨가제와 병용하여 사용될 수 있고 종래의 사료첨가제와 순차적 또는 동시에 사용될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 사료 첨가용 조성물은 사료용 조성물을 적용할 수 있는 개체는 특별히 한정되지 않고, 어떠한 형태의 것이든 적용 가능하다. 예를 들면, 닭, 돼지, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 래트, 마우스, 소, 양, 염소 등과 같은 동물에 제한없이 적용가능하다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 백신 조성물, 사료 조성물 또는 사료 첨가용 조성물을 인간을 제외한 동물에 투여하는 단계를 포함하는, 흉막폐렴을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 동물은 닭, 돼지, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 래트, 마우스, 소, 양, 염소 등과 같은 동물에 제한없이 적용가능하다. 예를 들면, 상기 동물은 돼지이다.

본 발명에서, 상기 투여는 당업계에 알려져 있는 임의의 투여 수단에 의하여 투여될 수 있다. 예를 들면, 상기 투여는 정맥내, 근육내, 경구, 경피 (transdermal), 점막, 코안 (intranasal), 기관내(intratracheal) 또는 피하로 개체로 직접적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 전신적으로 또는 국부적으로 투여되는 것일 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 본 발명의 조성물은 치료학적으로 또는 예방학적으로 유효한 양으로 투여되는 것일 수 있다. 상기 "치료학적으로 또는 예방학적으로 유효한 양"은 당업자라면, 증상의 경중, 개체의 성별, 나이 및 체중 등을 고려하여 적절하게 선택할 수 있다. 상기 치료학적으로 또는 예방학적으로 유효한 양은, 예를 들면 투여되는 개체 1kg 당 1pg 내지 1g의 상기 융합 단백질, 상기 형질전환체의 단백질 추출물 또는 상기 형질전환체에서 분리된 재조합 단백질일 수 있다.

본 발명은 흉막폐렴균 ApxIA 단백질의 단편과 흉막폐렴균 ApxIIA 단백질의 단편을 포함하는 융합 단백질에 관한 것으로, 톡신 ApxI의 구성요소인 A, B, C, D 중, ApxI의 구조 단백질인 ApxIA의 N 말단 일부의 부분 단백질인 NA(1~380 amino acid)와 ApxII 톡신의 구조단백질인 ApxIIA의 부분 단백질인 F#5(439~801 amino acid)를 융합한 융합 단백질 L을 이용한 백신이 ApxI과 ApxII 톡신의 조합을 가지고 있는 흉막폐렴균의 혈청형 1 뿐만 아니라, ApxII와 ApxIII 톡신의 조합을 가지는 흉막폐렴균의 혈청형 2에 대해서도 방어효과를 가지는 것을 확인하여, 흉막폐렴균의 두가지 혈청형에 대한 백신으로 이용이 가능하다.

도 1은 유전자 NA, F#5, 그리고 L의 PCR 결과를 나타낸다.
도 2는 유전자 L의 염기서열을 토대로 만든 아미노산 염기서열을 나타낸다. 붉은 글씨는 GS linker로서, GS linker의 앞에 위치한 아미노산은 NA에 해당하고, GS linker의 뒤에 위치한 아미노산은 F#5 부분을 나타낸다.
도 3은 western blot 실험 결과로, 단백질 NA, F#5, 그리고 L의 발현 결과를 나타낸다.
도 4는 단백질 L을 Ni-NTA resin으로 정제한 결과를 나타낸다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

실시예 1: 액티노바실러스 플로르뉴모니아의 1형( APP1 )의 배양 및 유전자 추출

BHI(brain-heart infusion)배지에 0.01% NAD(Nicotinamide adenine dinucleotide)를 첨가하여 37℃, 200rpm의 조건으로 APP1을 배양하였다. 이후의 클로닝 작업을 위해, APP1 균에서 유전자를 추출했다.

실시예 2: APP1의 NA 유전자 및 F#5 유전자의 융합 및 클로닝

상기 실시예 1에서 제조한 유전자를 template로 하고, 표 1의 프라이머를 사용하여, 유전자 NA와 F#5를 증폭하였으며, 이들 유전자에 대한 프라이머는 표 1과 같다. 볼드체로 표시한 부분인 GS linker에 해당한다.

프라이머 리스트(primer list)

Name	Sequence	Tm(GSP)
BamHI NA F	CCGGGATCCATGGCTAACTCTCAGCTCGA (서열번호 8)	58.4
GS NA R	ACTACCACTTCCACCTCCACCACTACCTCCACCTCCACTTCCAGCCCCAACACCTGCGGA (서열번호 9)	60.7
GS F#5 F	GGAAGTGGAGGTGGAGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGTGGTAGTCAAGGTTATGATTCTCGTCA (서열번호 10)	54
SalI F#5 R	CCGGTCGACTTATGTAATAGAATCATTTCCATCG (서열번호 11)	54.7
	볼드체 - GS linker

상기 증폭된 NA와 F#5 유전자는 GS linker를 통해 연결시켜서, NA와 F#5가 융합된 유전자 L을 제조하였으며, 이를 전기영동으로 확인했다(도 1). 도 1은 유전자 NA, F#5, 그리고 L의 PCR 결과를 나타낸다. T4 ligase를 사용하여, NA, F#5, 이들의 융합 유전자 L를 발현 벡터인 pET-28a에 각각 연결시켰다. 발현 벡터인 pET-28a는 단백질 발현 시, 단백질의 N-말단 부위에 6xHis tag이 붙도록 하는데, 이를 이용하여, 이후, western blot과 단백질 정제를 진행하였다.

실시예 3: 융합 유전자를 포함한 발현벡터를 대장균에 형질전환

상기 실시예 2에서 구축된 벡터를 발현 균주인 BL21(DE3)에 열 충격 형질전환(heat shock transformation)으로 형질공동시켰다. 해당 유전자가 발현벡터에 제대로 삽입되었는지를 유전자 염기서열 분석을 통해 확인하였고, 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 것을 확인하였으며, 이를 토대로 아미노산 서열을 확인한 결과, 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 것을 확인하였다 (도 2). 도 2는 상기 융합 유전자 L의 염기서열을 토대로 만든 아미노산 염기서열을 나타낸다. 붉은 글씨는 GS linker로서, GS linker의 앞 부분은 NA에 해당하고, GS linker의 뒷 부분은 F#5을 나타낸다.

실시예 4: 재조합 단백질의 발현 확인

상기 실시예 2에서 구축된 발현 균주를 카나마이신(kanamycin, 50ug/ml)과 클로람페니콜(chloramphenicol, 34ug/ml)을 포함하는 10ml LB broth에 접종하여, 37℃ 진탕 배양기에서 오버나잇(overnight) 배양하였다. 다음날, 카나마이신(kanamycin, 50ug/ml)과 클로람페니콜(chloramphenicol, 34ug/ml)를 포함하는 400ml LB broth에 1% 접종하여 37℃ 진탕 배양기에서 OD 값이 0.6이 될 때까지 배양하였다. 이후에, IPTG 1Mm을 처리하여, 37℃ 진탕 배양기에서 4시간 더 배양하였다. 배양을 마친 균액 1ml을 회수하한 후, 이의 pellet을 100ul PBS로 풀어준 뒤, 5x sample buffer로 끓여서 준비한 sample을 웨스턴블롯(western blot)으로 재조합 단백질의 발현을 확인하였다 (도 3). 도 3은 western blot 실험 결과로, 단백질 NA, F#5, 그리고 융합 단백질 L의 발현 결과를 나타낸다.

실시예 5: 재조합 단백질의 정제

상기 실시예 4에서 배양된 발현 균주 400ml을 PBS로 씻어준 후, 초음파 파쇄법(sonication)을 통해 균을 파쇄하였다. 10,000rpm, 4℃, 15분의 원심분리를 통해, 수용성 단백질(soluble) 구획과 비수용성(inclusion body)구획을 분리하였고, 비수용성 구획을 8M urea가 포함된 binding buffer(8M urea, 300mM sodium chloride, 50mM monosodium phosphate, 10mM imidazole)에 넣었다. Binding buffer로 해당 비수용성 구획을 녹여준 후, 12,000rmp, 4℃, 20분의 원심분리를 통해 그 상층액을 얻었다. FPLC(fast protein liquid chromatography)를 통해 단백질 정제를 진행하였으며, 단백질에 붙어있는 6xHis가 니켈(Nickel) 이온에 결합하는 성질을 이용하여, Ni-NTA resin을 사용했다. 정제를 끝낸 단백질은 투석을 통해 urea와 imidazole을 제거하였다. 정제를 완료한 융합 단백질 L을 SDS-PAGE로 확인하였다 (도 4). 도 4는 상기 융합 단백질 L을 Ni-NTA resin으로 정제한 결과를 나타낸다.

실시예 6: 백신 효능 검증을 위한 마우스에서의 면역시험

1) 실험 동물에 톡소이드 백신 접종

6주령된 쥐(BALB/c) 30 마리를 백신 접종 그룹과 대조군으로 나누었는데, 표 2에 제시된 바와 같이, 실험 백신 그룹은 각각, NA 백신 그룹, F#5 백신 그룹, L 백신 그룹으로 나누었다. 각각의 실험 그룹에는 이들 톡소이드 백신을 각각 25ug/dose만큼 접종하였으며, 면역증강제(adjuvant)로는 carbopol을 사용했다.

2) 실험 동물에서 톡소이드 백신 방어 효과 확인

백신을 접종하고 17일 뒤, 액티노바실러스 플로르뉴모니아의 1형(APP1)과 액티노바실러스 플로르뉴모니아의 2형(APP2)의 공격접종을 통해 톡소이드 백신의 방어 효과를 확인했다. NA 백신은 ApxIA를 방어함으로써, 액티노바실러스 플로르뉴모니아의 1형(APP1)에 대한 방어효과를 가질 것으로 가정하였으며, F#5백신은 ApxIIA를 방어함으로써, 액티노바실러스 플로르뉴모니아의 2형(APP2)에 대한 방어효과를 가질 것을 가정하였다. L 백신은 NA와 F#5의 융합단백질을 이용한 백신으로, APP1과 APP2 두 균에 대해 방어효과를 가질 것으로 기대하였다. 상기와 같이 예측한 백신의 효과를 증명하기 위해, 표 2 및 표 3에 제시된 대로 실험하였다.

표 3에서 확인된 바와 같이, L 백신의 경우 APP1과 APP2 두가지 혈청형에 대해 방어효과를 가진다는 것을 확인했다. 또한, L백신의 경우 NA 단독백신보다 APP1에 대해서 방어율이 2 배 이상 높은 것을 확인했다.

구체적으로, 흉막폐렴균의 혈청형 1의 경우 ApxIA와 ApxIIA의 조합을 가지고 있으며, 흉막폐렴균의 혈청형 2의 경우 ApxIIA와 ApxIIIA의 조합을 가지고 있다. ApxIA의 N 말단 일부의 부분 단백질인 NA를 백신으로 사용한 경우, APP 혈청형 1에 대한 방어효과가 40%에 불과했으나, ApxIIA의 일부분인 F#5를 백신으로 사용한 경우, APP 혈청형 2에 대한 방어효과가 100%인 것을 확인하였다. 또한, ApxIA의 N 말단의 일부인 NA와 ApxIIA의 일부인 F#5를 융합한 융합 백신 L의 경우, APP 혈청형 1에 대한 방어 효과가 80%로 NA 백신에 비해 우수한 것을 확인하였다.

아울러, 상기 융합 백신 L의 경우, APP2 혈청형에 대한 방어 효과도 우수한 수준으로 가지는 바, 상기 융합 백신은 APP 혈청형 1과 2의 방어에 사용이 가능하다.

이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

<110> KBNP, Inc. <120> Vaccine composition for preventing or treating porcine pleuropneumonia <130> DP20170125 <160> 11 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 380 <212> PRT <213> Actinobacillus pleuropneumoniae <220> <221> PEPTIDE <222> (1) <223> NA <400> 1 Met Ala Asn Ser Gln Leu Asp Arg Val Lys Gly Leu Ile Asp Ser Leu 1 5 10 15 Asn Gln His Thr Lys Ser Ala Ala Lys Ser Gly Ala Gly Ala Leu Lys 20 25 30 Asn Gly Leu Gly Gln Val Lys Gln Ala Gly Gln Lys Leu Ile Leu Tyr 35 40 45 Ile Pro Lys Asp Tyr Gln Ala Ser Thr Gly Ser Ser Leu Asn Asp Leu 50 55 60 Val Lys Ala Ala Glu Ala Leu Gly Ile Glu Val His Arg Ser Glu Lys 65 70 75 80 Asn Gly Thr Ala Leu Ala Lys Glu Leu Phe Gly Thr Thr Glu Lys Leu 85 90 95 Leu Gly Phe Ser Glu Arg Gly Ile Ala Leu Phe Ala Pro Gln Phe Asp 100 105 110 Lys Leu Leu Asn Lys Asn Gln Lys Leu Ser Lys Ser Leu Gly Gly Ser 115 120 125 Ser Glu Ala Leu Gly Gln Arg Leu Asn Lys Thr Gln Thr Ala Leu Ser 130 135 140 Ala Leu Gln Ser Phe Leu Gly Thr Ala Ile Ala Gly Met Asp Leu Asp 145 150 155 160 Ser Leu Leu Arg Arg Arg Arg Asn Gly Glu Asp Val Ser Gly Ser Glu 165 170 175 Leu Ala Lys Ala Gly Val Asp Leu Ala Ala Gln Leu Val Asp Asn Ile 180 185 190 Ala Ser Ala Thr Gly Thr Val Asp Ala Phe Ala Glu Gln Leu Gly Lys 195 200 205 Leu Gly Asn Ala Leu Ser Asn Thr Arg Leu Ser Gly Leu Ala Ser Lys 210 215 220 Leu Asn Asn Leu Pro Asp Leu Ser Leu Ala Gly Pro Gly Phe Asp Ala 225 230 235 240 Val Ser Gly Ile Leu Ser Val Val Ser Ala Ser Phe Ile Leu Ser Asn 245 250 255 Lys Asp Ala Asp Ala Gly Thr Lys Ala Ala Ala Gly Ile Glu Ile Ser 260 265 270 Thr Lys Ile Leu Gly Asn Ile Gly Lys Ala Val Ser Gln Tyr Ile Ile 275 280 285 Ala Gln Arg Val Ala Ala Gly Leu Ser Thr Thr Ala Ala Thr Gly Gly 290 295 300 Leu Ile Gly Ser Val Val Ala Leu Ala Ile Ser Pro Leu Ser Phe Leu 305 310 315 320 Asn Val Ala Asp Lys Phe Glu Arg Ala Lys Gln Leu Glu Gln Tyr Ser 325 330 335 Glu Arg Phe Lys Lys Phe Gly Tyr Glu Gly Asp Ser Leu Leu Ala Ser 340 345 350 Phe Tyr Arg Glu Thr Gly Ala Ile Glu Ala Ala Leu Thr Thr Ile Asn 355 360 365 Ser Val Leu Ser Ala Ala Ser Ala Gly Val Gly Ala 370 375 380 <210> 2 <211> 363 <212> PRT <213> Actinobacillus pleuropneumoniae <220> <221> PEPTIDE <222> (1) <223> F#5 <400> 2 Gln Gly Tyr Asp Ser Arg His Leu Ala Asp Leu Gln Asp Asn Met Lys 1 5 10 15 Phe Leu Ile Asn Leu Asn Lys Glu Leu Gln Ala Glu Arg Val Val Ala 20 25 30 Ile Thr Gln Gln Arg Trp Asp Asn Gln Ile Gly Asp Leu Ala Ala Ile 35 40 45 Ser Arg Arg Thr Asp Lys Ile Ser Ser Gly Lys Ala Tyr Val Asp Ala 50 55 60 Phe Glu Glu Gly Gln His Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Val Gln Leu Asp 65 70 75 80 Asn Lys Asn Gly Ile Ile Asn Ile Ser Asn Thr Asn Arg Lys Thr Gln 85 90 95 Ser Val Leu Phe Arg Thr Pro Leu Leu Thr Pro Gly Glu Glu Asn Arg 100 105 110 Glu Arg Ile Gln Glu Gly Lys Asn Ser Tyr Ile Thr Lys Leu His Ile 115 120 125 Gln Arg Val Asp Ser Trp Thr Val Thr Asp Gly Asp Ala Ser Ser Ser 130 135 140 Val Asp Phe Thr Asn Val Val Gln Arg Ile Ala Val Lys Phe Asp Asp 145 150 155 160 Ala Gly Asn Ile Ile Glu Ser Lys Asp Thr Lys Ile Ile Ala Asn Leu 165 170 175 Gly Ala Gly Asn Asp Asn Val Phe Val Gly Ser Ser Thr Thr Val Ile 180 185 190 Asp Gly Gly Asp Gly His Asp Arg Val His Tyr Ser Arg Gly Glu Tyr 195 200 205 Gly Ala Leu Val Ile Asp Ala Thr Ala Glu Thr Glu Lys Gly Ser Tyr 210 215 220 Ser Val Lys Arg Tyr Val Gly Asp Ser Lys Ala Leu His Glu Thr Ile 225 230 235 240 Ala Thr His Gln Thr Asn Val Gly Asn Arg Glu Glu Lys Ile Glu Tyr 245 250 255 Arg Arg Glu Asp Asp Arg Phe His Thr Gly Tyr Thr Val Thr Asp Ser 260 265 270 Leu Lys Ser Val Glu Glu Ile Ile Gly Ser Gln Phe Asn Asp Ile Phe 275 280 285 Lys Gly Ser Gln Phe Asp Asp Val Phe His Gly Gly Asn Gly Val Asp 290 295 300 Thr Ile Asp Gly Asn Asp Gly Asp Asp His Leu Phe Gly Gly Ala Gly 305 310 315 320 Asp Asp Val Ile Asp Gly Gly Asn Gly Asn Asn Phe Leu Val Gly Gly 325 330 335 Thr Gly Asn Asp Ile Ile Ser Gly Gly Lys Asp Asn Asp Ile Tyr Val 340 345 350 His Lys Thr Gly Asp Gly Asn Asp Ser Ile Thr 355 360 <210> 3 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GS LINKER <400> 3 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser 1 5 10 <210> 4 <211> 757 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein L <400> 4 Met Ala Asn Ser Gln Leu Asp Arg Val Lys Gly Leu Ile Asp Ser Leu 1 5 10 15 Asn Gln His Ile Lys Ser Ala Ala Lys Ser Gly Ala Gly Ala Leu Lys 20 25 30 Asn Gly Leu Gly Gln Val Lys Gln Ala Gly Gln Glu Leu Ile Leu Tyr 35 40 45 Ile Pro Lys Asp Tyr Gln Ala Ser Thr Gly Ser Ser Leu Asn Asp Leu 50 55 60 Val Lys Ala Ala Glu Ala Leu Gly Ile Glu Val His Arg Ser Glu Lys 65 70 75 80 Asn Gly Thr Ala Leu Ala Lys Glu Leu Phe Gly Thr Thr Glu Lys Leu 85 90 95 Leu Gly Phe Ser Glu Arg Gly Ile Ala Leu Phe Ala Pro Gln Phe Asp 100 105 110 Lys Leu Leu Asn Lys Asn Gln Lys Leu Ser Lys Ser Leu Gly Gly Ser 115 120 125 Ser Glu Ala Leu Gly Gln Arg Leu Asn Lys Thr Gln Thr Ala Leu Ser 130 135 140 Ala Leu Gln Ser Phe Leu Gly Thr Ala Ile Ala Gly Met Asp Leu Asp 145 150 155 160 Ser Leu Leu Arg Arg Arg Arg Asn Gly Glu Asp Val Ser Gly Ser Glu 165 170 175 Leu Ala Lys Ala Gly Val Asp Leu Ala Ala Gln Leu Val Asp Asn Ile 180 185 190 Ala Ser Ala Thr Gly Thr Val Asp Ala Phe Ala Glu Gln Leu Gly Lys 195 200 205 Leu Gly Asn Ala Leu Ser Asn Thr Arg Leu Ser Gly Leu Ala Ser Lys 210 215 220 Leu Asn Asn Leu Pro Asp Leu Ser Leu Ala Gly Pro Gly Phe Asp Ala 225 230 235 240 Val Ser Gly Ile Leu Ser Val Val Ser Ala Ser Phe Ile Leu Ser Asn 245 250 255 Lys Asp Ala Asp Ala Gly Thr Lys Ala Ala Ala Gly Ile Glu Ile Ser 260 265 270 Thr Lys Ile Leu Gly Asn Ile Gly Lys Ala Val Ser Gln Tyr Ile Ile 275 280 285 Ala Gln Arg Val Ala Ala Gly Leu Ser Thr Thr Ala Ala Thr Gly Gly 290 295 300 Leu Ile Gly Ser Val Val Ala Leu Ala Ile Ser Pro Leu Ser Phe Leu 305 310 315 320 Asn Val Ala Asp Lys Phe Glu Arg Ala Lys Gln Leu Glu Gln Tyr Ser 325 330 335 Glu Arg Phe Lys Lys Phe Gly Tyr Glu Gly Asp Ser Leu Leu Ala Ser 340 345 350 Phe Tyr Arg Glu Thr Gly Ala Ile Glu Ala Ala Leu Thr Thr Ile Asn 355 360 365 Ser Val Leu Ser Ala Ala Ser Ala Gly Val Gly Ala Gly Ser Gly Gly 370 375 380 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gln Gly Tyr Asp Ser Arg 385 390 395 400 His Leu Ala Asp Leu Gln Asp Asn Met Lys Phe Leu Ile Asn Leu Asn 405 410 415 Lys Glu Leu Gln Ala Glu Arg Val Val Ala Ile Thr Gln Gln Arg Trp 420 425 430 Asp Asn Gln Ile Gly Asp Leu Ala Ala Ile Ser Arg Arg Thr Asp Lys 435 440 445 Ile Ser Ser Gly Lys Ala Tyr Val Asp Ala Phe Glu Glu Gly Gln His 450 455 460 Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Val Gln Leu Asp Asn Lys Asn Gly Ile Ile 465 470 475 480 Asn Ile Ser Asn Thr Asn Arg Lys Thr Gln Ser Val Leu Phe Arg Thr 485 490 495 Pro Leu Leu Thr Pro Gly Glu Glu Asn Arg Glu Arg Ile Gln Glu Gly 500 505 510 Lys Asn Ser Tyr Ile Thr Lys Leu His Ile Gln Arg Val Asp Ser Trp 515 520 525 Thr Val Thr Asp Gly Asp Ala Ser Ser Ser Val Asp Phe Thr Asn Val 530 535 540 Val Gln Arg Ile Ala Val Lys Phe Asp Asp Ala Gly Asn Ile Ile Glu 545 550 555 560 Ser Lys Asp Thr Lys Ile Ile Ala Asn Leu Gly Ala Gly Asn Asp Asn 565 570 575 Val Phe Val Gly Ser Ser Thr Thr Val Ile Asp Gly Gly Asp Gly His 580 585 590 Asp Arg Val His Tyr Ser Arg Gly Glu Tyr Gly Ala Leu Val Ile Asp 595 600 605 Ala Thr Ala Glu Thr Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Val Lys Arg Tyr Val 610 615 620 Gly Asp Ser Lys Ala Leu His Glu Thr Ile Ala Thr His Gln Thr Asn 625 630 635 640 Val Gly Asn Arg Glu Glu Lys Ile Glu Tyr Arg Arg Glu Asp Asp Arg 645 650 655 Phe His Thr Gly Tyr Thr Val Thr Asp Ser Leu Lys Ser Val Glu Glu 660 665 670 Ile Ile Gly Ser Gln Phe Asn Asp Ile Phe Lys Gly Ser Gln Phe Asp 675 680 685 Asp Val Phe His Gly Gly Asn Gly Val Asp Thr Ile Asp Gly Asn Asp 690 695 700 Gly Asp Asp His Leu Phe Gly Gly Ala Gly Asp Asp Val Ile Asp Gly 705 710 715 720 Gly Asn Gly Asn Asn Phe Leu Val Gly Gly Thr Gly Asn Asp Ile Ile 725 730 735 Ser Gly Gly Lys Asp Asn Asp Ile Tyr Val His Lys Thr Gly Asp Gly 740 745 750 Asn Asp Ser Ile Thr 755 <210> 5 <211> 2274 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of fusion protein L <400> 5 atggctaact ctcagctcga tagagtcaaa ggattgattg attcacttaa tcaacatata 60 aaaagtgcag ctaaatcagg tgccggcgca ttaaaaaatg gtttgggaca ggtgaagcaa 120 gcagggcagg aattaatttt atatattccg aaagattatc aagctagtac cggctcaagt 180 cttaatgatt tagtgaaagc ggcggaggct ttagggatcg aagtacatcg ctcggaaaaa 240 aacggtaccg cactagcgaa agaattattc ggtacaacgg aaaaactatt aggtttctcg 300 gaacgaggca tcgcattatt tgcacctcag tttgataagt tactgaataa gaaccaaaaa 360 ttaagtaaat cgctcggcgg ttcatcggaa gcattaggac aacgtttaaa taaaacgcaa 420 acggcacttt cagccttaca aagtttctta ggtacggcta ttgcgggtat ggatcttgat 480 agcctgcttc gtcgccgtag aaacggtgag gacgtcagtg gttcggaatt agctaaagcg 540 ggtgtggatc tagccgctca gttagtggat aacattgcaa gtgcaacggg tacggtggat 600 gcgtttgccg aacaattagg taaattgggc aatgccttat ctaacactcg cttaagcggt 660 ttagcaagta agttaaataa ccttccagat ttaagccttg caggacctgg gtttgatgcc 720 gtatcaggta tcttatctgt tgtttcggct tcattcattt taagtaataa agatgccgat 780 gcaggtacaa aagcggcggc aggtattgaa atctcaacta aaatcttagg caatatcggt 840 aaagcggttt ctcaatatat tattgcgcaa cgtgtggcgg caggcttatc cacaactgcg 900 gcaaccggtg gtttaatcgg ttcggtcgta gcattagcga ttagcccgct ttcgttctta 960 aatgttgcgg ataagtttga acgtgcgaaa cagcttgaac aatattcgga gcgctttaaa 1020 aagttcggtt atgaaggtga tagtttatta gcttcattct accgtgaaac cggtgcgatt 1080 gaagcggcat taaccacgat taacagtgtg ttaagtgcgg cttccgcagg tgttggggct 1140 ggaagtggag gtggaggtag tggtggaggt ggaagtggta gtcaaggtta tgattctcgt 1200 catttagctg atttacaaga caatatgaag tttcttatca atttaaataa agaacttcag 1260 gctgaacgcg tagtagctat tacccaacaa agatgggata accaaattgg agacctagcg 1320 gcaattagcc gtagaacgga taaaatttcc agtggaaaag cttatgtgga tgcttttgag 1380 gaggggcaac accagtccta cgattcatcc gtacagctag ataacaaaaa cggtattatt 1440 aatattagta atacaaatag aaagacacaa agtgttttat tcagaactcc attactaact 1500 ccaggtgaag agaatcggga acgtattcag gaaggtaaaa attcttatat tacaaaatta 1560 catatacaaa gagttgacag ttggactgta acagatggtg atgctagctc aagcgtagat 1620 ttcactaatg tagtacaacg aatcgctgtg aaatttgatg atgcaggtaa cattatagaa 1680 tctaaagata ctaaaattat cgcaaattta ggtgctggta acgataatgt atttgttggg 1740 tcaagtacta ccgttattga tggcggggac ggacatgatc gagttcacta cagtagagga 1800 gaatatggcg cattagttat tgatgctaca gccgagacag aaaaaggctc atattcagta 1860 aaacgctatg tcggagacag taaagcatta catgaaacaa ttgccaccca ccaaacaaat 1920 gttggtaatc gtgaagaaaa aattgaatat cgtcgtgaag atgatcgttt tcatactggt 1980 tatactgtga cggactcact caaatcagtt gaagagatca ttggttcaca atttaatgat 2040 attttcaaag gaagccaatt tgatgatgtg ttccatggtg gtaatggtgt agacactatt 2100 gatggtaacg atggtgacga tcatttattt ggtggcgcag gcgatgatgt tatcgatgga 2160 ggaaacggta acaatttcct tgttggagga accggtaatg atattatctc gggaggtaaa 2220 gataatgata tttatgtcca taaaacaggc gatggaaatg attctattac ataa 2274 <210> 6 <211> 1022 <212> PRT <213> Actinobacillus pleuropneumoniae <220> <221> PEPTIDE <222> (1) <223> ApxIA <400> 6 Met Ala Asn Ser Gln Leu Asp Arg Val Lys Gly Leu Ile Asp Ser Leu 1 5 10 15 Asn Gln His Thr Lys Ser Ala Ala Lys Ser Gly Ala Gly Ala Leu Lys 20 25 30 Asn Gly Leu Gly Gln Val Lys Gln Ala Gly Gln Lys Leu Ile Leu Tyr 35 40 45 Ile Pro Lys Asp Tyr Gln Ala Ser Thr Gly Ser Ser Leu Asn Asp Leu 50 55 60 Val Lys Ala Ala Glu Ala Leu Gly Ile Glu Val His Arg Ser Glu Lys 65 70 75 80 Asn Gly Thr Ala Leu Ala Lys Glu Leu Phe Gly Thr Thr Glu Lys Leu 85 90 95 Leu Gly Phe Ser Glu Arg Gly Ile Ala Leu Phe Ala Pro Gln Phe Asp 100 105 110 Lys Leu Leu Asn Lys Asn Gln Lys Leu Ser Lys Ser Leu Gly Gly Ser 115 120 125 Ser Glu Ala Leu Gly Gln Arg Leu Asn Lys Thr Gln Thr Ala Leu Ser 130 135 140 Ala Leu Gln Ser Phe Leu Gly Thr Ala Ile Ala Gly Met Asp Leu Asp 145 150 155 160 Ser Leu Leu Arg Arg Arg Arg Asn Gly Glu Asp Val Ser Gly Ser Glu 165 170 175 Leu Ala Lys Ala Gly Val Asp Leu Ala Ala Gln Leu Val Asp Asn Ile 180 185 190 Ala Ser Ala Thr Gly Thr Val Asp Ala Phe Ala Glu Gln Leu Gly Lys 195 200 205 Leu Gly Asn Ala Leu Ser Asn Thr Arg Leu Ser Gly Leu Ala Ser Lys 210 215 220 Leu Asn Asn Leu Pro Asp Leu Ser Leu Ala Gly Pro Gly Phe Asp Ala 225 230 235 240 Val Ser Gly Ile Leu Ser Val Val Ser Ala Ser Phe Ile Leu Ser Asn 245 250 255 Lys Asp Ala Asp Ala Gly Thr Lys Ala Ala Ala Gly Ile Glu Ile Ser 260 265 270 Thr Lys Ile Leu Gly Asn Ile Gly Lys Ala Val Ser 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Claims

흉막폐렴균 ApxIA 단백질의 단편과 흉막폐렴균 ApxIIA 단백질의 단편을 포함하는, 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 융합 단백질.
제1항에 있어서, 상기 흉막폐렴균 ApxIA 단백질의 단편과 흉막폐렴균 ApxIIA 단백질의 단편은 펩티드 링커로 연결된 것인, 융합 단백질.
제1항에 있어서, 흉막폐렴균 ApxIA 단백질의 단편은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 융합 단백질.
제1항에 있어서, 흉막폐렴균 ApxIIA 단백질의 단편은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 융합 단백질.
제2항에 있어서, 상기 펩티드 링커는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 융합 단백질.
삭제
제1항의 융합단백질을 코딩하는 유전자.
제7항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
제8항의 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체.
제1항의 융합 단백질, 제9항의 형질전환체의 단백질 추출물 또는 상기 형질전환체에서 분리된 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는, 흉막폐렴의 예방 또는 치료용 백신 조성물.
제1항의 융합 단백질, 제9항의 형질전환체의 단백질 추출물 또는 상기 형질전환체에서 분리된 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는, 흉막폐렴의 예방 또는 개선용 사료 조성물.
제1항의 융합 단백질, 제9항의 형질전환체의 단백질 추출물 또는 상기 형질전환체에서 분리된 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는, 흉막폐렴의 예방 또는 개선용 사료 첨가용 조성물.
제10항의 조성물을 인간을 제외한 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 흉막폐렴을 예방 또는 치료하는 방법.