KR101030792B1 - 돼지 써코바이러스２(ｐｃｖ２) 유전자의 표면발현용 벡터 및 이로 형질전환된 살모넬라 백신 균주 - Google Patents

Abstract

본 발명은 비병원성 균주인 살모넬라 유래 세포외막 단백질을 이용한 돼지 써코바이러스(PCV) 유전자의 세포표면 발현용 재조합 벡터 및/또는 이로 형질전환된 살모넬라 백신 균주의, PCV2 감염에 따른 질환의 예방 및 치료에 있어서의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 이러한 비병원성 균주 살모넬라를 이용하여 PCV2 바이러스의 구조 단백질을 발현시킨 라이브벡터(live vector)를 사용함으로써 살모넬라뿐만 아니라 PCV2 바이러스에 의해 발생하는 질병예방에도 효과가 뛰어난 다가 백신의 제조 및 활용에 유용하다.

Description

돼지 써코바이러스２(ＰＣＶ２) 유전자의 표면발현용 벡터 및 이로 형질전환된 살모넬라 백신 균주{Surface Expression Vector for Porcine CircoVirus type 2 gene and Salmonella Vaccine Transformed by Therof}

본 발명은 살모넬라 유래 세포외막 단백질을 이용한 돼지 써코바이러스(PCV) 유전자의 세포표면 발현용 재조합 벡터 및/또는 이로 형질전환된 비병원성 살모넬라 백신 균주에 관한 것으로, 이들의 살모넬라 감염 또는 PCV2 감염에 따른 질환의 예방 및 치료에 있어서의 용도에 관한 것이다.

돼지 써코바이러스 제2형(Porcine CircoVirus type 2; PCV2)은 1991년 캐나다를 시작으로 미국, 프랑스, 스페인, 아일랜드, 덴마크, 영국, 독일 등 전 세계적으로 발생하고 있고, 아시아지역에서는 국내를 비롯한 일본과 대만에서도 발생이 확인된 원형의 외가닥 DNA바이러스로서, 써코비리데(Circoviridae)에 속한다. PCV2는 1974년 돼지 신장 세포에서 발견된 비병원성의 PCV1과 달리 감염에 의해 돼지 전신소모성 증후군(Postweaning Multi-systemic Wasting Syndrome; PMWS)을 유발하는 원인체 중 하나인 것으로 알려져 있고, 이는 양돈장에 오염되면 근절하기 힘든 바이러스이다.

최근 국내 양돈산업에 있어 살모넬라, PED, PCV2 등의 감염으로 인한 피해는 연간 약 600만두 이상 폐사하여 양돈농가 손실액이 1조 1,840억원으로 추정(한국농촌경제연구원)되고 있다. 이러한 전염성 질환을 예방하기 위한 백신이 절대적으로 필요하고 상용화된 백신이 있다 하더라도 개선되어야 할 점이 많이 존재하고 있다.

살모넬라 감염원으로는 오염된 원료사료나 물 또는 별 증상 없이 균을 보균하고 있는 성돈이 중요한 전염원이 될 수 있다. 즉 보균축이 여러가지 스트레스 등이 원인이 되어 발병하게되고 발병축의 분변을 통하여 경구감염된다. 균의 배설은 질병에서 회복된후에도 약 3개월동안 일어난다. 그러나 소수의 돼지는 영구적으로 균을 보균하며, 배설한다. 균은 거름속에서 오래 생존하며, 분변중에서는 20주까지 생존함이 보고되었다. 그래서 축사의 오염은 이러한 혈청형에 의해서 유발되는 질병의 역학에 있어서 중요하다. 많은 종류의 살모넬라가 원인균이 될 수 있으며, 그 중에서도 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella choleraesuis) 및 살모넬라 타이피수이스(Salmonella typhisuis)는 살모넬라에 의한 급성패혈증의 주된 원인균이고, 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 엔테라이티디스(Salmonella enteritidis) 및 살모넬라 더비(Salmonella derby) 등은 주로 만성장염을 일으키는 원인균이다.

따라서, 살모넬라 감염 예방은 감염으로 인한 질병의 피해는 물론 식육안전을 위해 실시하고 있는 HACCP의 중요한 감염 예방 세균이기도 하다. 하지만 아직 살모넬라 감염으로 인한 증상과 피해가 보고되고 있으나 상용화된 백신이 없어 항생제 처방을 통한 치료를 하고 있으나 잘 알려진 바와 같이 세포내 기생하는 살모넬라의 특징 때문에 다시 재발하는 경우가 많은 것으로 보고되고 있다.

PCV2 감염으로 인한 피해는 더욱 더 심각하다. PCV2 감염으로 인한 피해로 인해 2010년 정부가 300억원의 예산을 조성 농가에 관납백신을 공급할 정도로 PCV2 백신의 중요성은 이미 다 알려진 사실이다. 이와 관련하여, 종래 특정 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV) 유전자(ORF2, ORF3, ORF4, ORF5, ORF6, ORF7)가 상이한 벡터 시스템, 즉, 배큘로바이러스, 위광견병 바이러스, TGEV 및 플라스미드 DNA를 통해 발현되는 시스템을 이용하고 있다.

그러나 PCV2 불활화 백신의 문제점은 아직 백신에 의해 항체 형성이 미약하고 백신접종 이후에도 여전히 돼지의 체내에 바이러스가 감염되어 있는 상태를 유지하여 면역 스트레스나 기타 다른 감염원에 의해 쉽게 증상을 발생시키고 있다. 따라서, 양돈 산업계에 미치는 이러한 강력한 영향으로 인해, PCV2에 대한 효과적인 백신 개발이 점차 중요해지고 있다.

이에, 본 발명자들은 최근 첨단 분자생물학적 주요 기술의 하나인 세포 표면 발현(cell surface display) 기술을 이용하여 기존 살모넬라 백신의 문제점을 개선할 뿐만 아니라, PCV2 바이러스 감염 질환도 동시에 예방할 수 있는 백신을 개발하고자 예의 노력한 결과, 살모넬라 유래의 세포외막 단백질을 표면 발현 모체(surface anchoring motif)로 사용하여 PCV2 바이러스의 구조 단백질을 발현시킨 비병원성 균주인 살모넬라의 라이브벡터(live vector)를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 살모넬라 또는 PCV2 감염의 치료 또는 예방용 백신에 관한 것으로,

본 발명의 주된 목적은 돼지 써코바이러스2(PCV2) 유전자 발현 벡터가 형질도입된 살모넬라 균주 백신을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 살모넬라 균주 유래의 세포외막 단백질 A(OmpA)을 암호화하는 유전자 및 돼지 써코바이러스2(PCV2) 유전자 일부를 암호화하는 DNA서열을 함유하는 재조합 발현벡터를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 살모넬라 균주 백신을 이용하여 동물의 PCV2 감염 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 데 있다.

상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 살모넬라 균주 유래의 세포외막 단백질을 암호화하는 유전자 및 돼지 써코바이러스2(PCV2) 유전자 일부를 암호화하는 DNA서열을 함유하는, 세포표면 발현용 재조합벡터를 제공한다.

상기 세포외막 단백질은 표면 발현 모체(surface anchoring motif)로서 기능하는데, 예를 들어 OmpA, OmpS, LamB, OprF, OmpC, PhoE 및 FadL로 구성된 군에서 선택될 수 있고, 가장 바람직하게는 OmpA를 사용할 수 있다. 대표적으로, 상기 살모넬라 균주 유래의 OmpA 단백질은 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 사용할 수 있다. 특히, 본 발명에서는 OmpA 단백질 서열 중 N-말단 TM(transmembrane) 도메인을 표면 발현 모체로 이용하는 것을 특징으로 하고 대표적인 서열을 서열번호 2로 기재하였다.

또한, 상기 돼지 써코바이러스2(PCV2) 유전자 일부를 암호화하는 DNA서열은 ORF1, ORF2, ORF3, ORF4, ORF5,ORF6, ORF7 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 PCV 오픈 리딩프레임(ORF)을 코딩하는 것을 사용하는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 PCV2 ORF2를 코딩하는 것을 사용한다. 대표적인 PCV2 ORF2의 염기서열을 서열번호 3으로 표시하였다.

상기 세포표면 발현용 재조합벡터는 도 13의 개열지도를 가질 수 있다. 특히, 기본벡터로서 대장균(E. coli)을 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 설명한 세포표면 발현용 재조합벡터로 형질전환된 재조합 살모넬라 균주 및 이의 백신으로서의 용도를 제공한다.

상기 살모넬라 균주는 살모넬라 티피뮤리움, 살모넬라 더비, 살모넬라 스크와젠그론드, 살모넬라 브렌더럽, 살모넬라 엠반다카, 살모넬라 뉴우포터, 살모넬라 엔테라이티디스, 살모넬라 갈리나룸, 살모넬라 풀로룸 등이 있으며, 바람직하게는 살모넬라 티피뮤리움, 살모넬라 브렌더럽 또는 살모넬라 엔테라이티디스를 사용하는 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는 살모넬라 티피무리움일 수 있다.

그리고, 이러한 재조합 살모넬라 균주의 표면에 돼지 써코바이러스2(PCV2) 유전자가 발현된다. 특히, PCV2 ORF2 단백질이 세포 표면 발현되어 있다. 상기 형질전환된 재조합 살모넬라 균주는 기탁번호 KCCM 11099P로 기탁되어 있는 균주를 포함한다.

이러한 재조합 살모넬라 균주는 살모넬라 감염 또는 PCV2 감염에 따른 질환의 치료 또는 예방용 생백신으로 사용할 수 있다.

한편, 본 발명은 상기 재조합 살모넬라 균주에 의해 발현되어 포유류에서 체액성 면역반응을 유도할수 있는 재조합 융합 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 살모넬라 균주 또는 상기 재조합 융합 단백질을 함유하는 것을 특징으로 하는 살모넬라 감염 또는 PCV2 감염에 따른 질환의 치료 또는 예방 백신용 조성물을 제공할 수 있다. 상기 백신 조성물은 IPTG(Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranoside)을 함유하는 것이 바람직하다. 그리고 상기 백신 조성물은 경구 투여용 사료첨가제의 형태로 제공되는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 인간을 제외한 동물에게 상기 설명한 백신 조성물의 면역학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 살모넬라 감염 또는 PCV2 감염에 따른 질환의 치료 또는 예방방법 상기 동물은 돼지인 방법을 제공한다.

이 때, 상기 살모넬라 균주를 대상 동물, 예를 들어 돼지에 0.5 ~ 1.5 1x10^9 CFU/ml으로 접종시키는 것이 바람직하다.

그리고, 상기 PCV2 감염에 따른 질환은 이유후 전신 소모성 증후군(Postweaning Multi-systemic Wasting Syndrome; PMWS)이 가장 대표적이고, 살모넬라 감염에 따른 질환은 살모넬라증(Salmonellosis)이 대표적이다.

특히, 본 발명의 효과는 "어린 동물"에서 더욱 효과적인데, 예를 들어, 1 내지 35일령의 동물이 바람직하고, 일령이 적을수록 더욱 바람직하다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 살모넬라 균주 유래의 세포외막 단백질을 암호화하는 유전자 및 돼지 써코바이러스2(PCV2) 유전자 일부를 암호화하는 DNA서열을 함유하는, 세포표면 발현용 재조합벡터 및 이로 형질전환시킨 살모넬라 균주는 살모넬라뿐만 아니라 PCV2 바이러스에 의해 발생하는 질병예방에 효과적인 다가 백신이다. 상기 백신은 경구 투여에 의하여 재조합 단백질의 생산을 편리하게 유도할 수 있으므로 보다 용이하게 돼지 써코바이러스에 의한 감염 또는 살모넬라 감염으로 인한 피해를 줄일 수 있다.

도 1은 본 발명의 TA 클로닝에 사용한 TA vector(pcr2.1, invitogen)의 개열지도이다.
도 2는 OmpA 및 PCV2 ORF2 유전자의 TA 클로닝 기작을 간단히 나타낸 도식도이다.
도 3은 본 발명의 세포표면 발현 벡터의 기본 벡터로 사용한 pGEX 4T-1 벡터의 개열지도이다.
도 4는 pGEX 4T-1 벡터에 OmpA 유전자를 클로닝하여 표면발현 벡터인 sdv1 벡터를 제조하는 과정을 개략적으로 나타낸 도식도이다.
도 5는 상기 sdv1 벡터에 PCV2 ORF2 유전자를 클로닝하여 최종 sdv1PCV2 벡터를 제조하는 과정을 개략적으로 나타낸 도식도이다.
도 6은 상기 sal-sdv1PCV2에 의해 발현되는 PCV2 ORF2 및 OmpA을 PCR 방법을 이용하여 확인한 사진이다.
도 7은 IPTG에 의하여 표면에 과발현된 PCV2 ORF2를 웨스턴 블럿을 이용하여 확인한 사진이다.
도 8 내지 도 11은 기니 피그(guinea pig)에서의 동물실험 PCV2 항체가를 확인한 그래프들이다.
도 12는 기니 피그(guinea pig)에서의 동물실험 살모넬라 항체가를 확인한 그래프이다.
도 13은 본 발명의 세포표면 발현용 재조합 벡터 sal-sdv1PCV2의 개열지도이다.

본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.

"핵산"은 당분야에 공지된 용어이다. 여기에서 "핵산"은 핵염기로 구성된 DNA, RNA 또는 이의 유도체 또는 유사체 분자(가닥)을 말한다. 예를 들면 핵염기에는 DNA에서 볼 수 있는 자연 생성 또는 유도된 퓨린 또는 피리미딘 염기(가령, 아데닌 "A", 구아닌 "G", 티민 "T" 또는 시토신 "C") 또는 RNA (가령, A, G, 우라실 "U" 또는C)를 포함한다.

"폴리펩티드"는 단일 폴리펩티드뿐 아니라 다수의 폴리펩티드들을 포함하는 것이며, 펩티드 결합에 의해 서로 결합된 하나 이상의 아미노산의 쇄 또는 쇄들을 포함한다. 상기 용어는 또한 해독후 변형을 가진 폴리펩티드를 포함한다.

"단백질"은 또한 기준 단백질과 본질적으로 동일한 생물 활성 또는 기능을 보유하는, 단백질의 단편, 유사체 및 유도체를 포함하는 것이다.

"∼에 의해 코딩되는" 또는 "∼를 코딩하는"이란 핵산 서열이 폴리펩티드 서열을 코딩하는 것을 말하며, 여기서 상기 폴리펩티드 서열은 상기 핵산 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드인 적어도 3∼5개 아미노산, 더 바람직하게는 적어도 8∼10개 아미노산, 더욱 더 바람직하게는 적어도 15∼20개 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 포함한다. 상기 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드를 사용하여 면역학적으로 확인할 수 있는 폴리펩티드 서열도 포함된다. 따라서, 항원 "폴리펩티드", "단백질" 또는 "아미노산" 서열은 항원의 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 대해 70% 이상의 유사성, 바람직하게는 약 80% 이상의 유사성, 더 바람직하게는 약 90∼95%의 유사성, 가장 바람직하게는 약 99%의 유사성을 가질 수 있다.

본 발명에서 사용되는 "유전자"는 유전적 기능이 관련되어 있는 핵산 분자(염색체, 플라스미드 등)의 뉴클레오티드 서열이다. 유전자는, 예를 들어, 유기체의 게놈 내의 특정 물리적 위치("유전자좌")를 차지하는 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 포유동물의 DNA 서열)을 포함하는, 유기체의 유전 단위이다. 유전자는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 같은 발현 생성물을 코딩할 수 있다. 일반적으로, 유전자는 폴리펩티드 코딩 서열과 같은 코딩 서열 및 프로모터 서열, 폴리아데닐화 서열, 전사 조절 서열(예를 들어, 인핸서 서열)과 같은 비코딩 서열을 포함한다. 다수의 진핵생물 유전자가 "인트론"(비코딩 서열)이 개재되어 있는 "엑손"(코딩 서열)을 갖는다.

"오픈 리딩 프레임" 또는 "ORF", 또는 "orf"는 정지 코돈이 개재하지 않은 상태로 특정 바이러스 단백질을 코딩하는 데 필요한 최소한의 뉴클레오티드 서열을 말한다.

"프로모터"는 유전자의 발현을 조절하는 핵산 서열을 가리킨다. "프로모터 서열"은 세포 내에서 RNA 중합효소에 결합하여 코딩 서열의 하류로 전사를 개시할 수 있는 DNA 조절 영역이다. 프로모터 서열 내에는 RNA 중합효소 결합을 담당하는 단백질 결합 도메인(보존 서열)뿐만 아니라 전사 개시 부위가 발견된다.

"서열의 연결 또는 융합 (fusion)"은 융합된 구성요소를 포함하는 단일 폴리펩타이드 사슬을 말한다. 융합된 구성요소들은 직접적 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 예를 들어, 다른 서열(즉, 링커 혹은 기능도메인)이 융합된 요소들 사이에 위치할 수 있다. 본 발명에서는 티로신 수산화효소 3'UTR(Tyrosine hydroxylase 3‘ Untranslated region) 서열과 허혈성 치료 유전자 서열의 융합을 의미한다.

"형질전환 또는 트랜스펙션"은 세포외부 DNA가, 수반물질이 있고 없는 상태로 숙주 세포로 들어가는 과정을 말한다. "트랜스펙션된 세포"란 세포 외부 DNA가 세포 내로 도입되어 세포 외부 DNA를 가지고 있는 세포를 가리킨다. DNA는 세포로 도입되어 핵산이 염색체에 삽입되거나 혹은 염색체 외 물질로 복제될 수 있다.

"작동 가능하게 연결된"이란 언급된 구성요소들이 그 일반적 기능을 수행하도록 구성되어 있는 요소들의 배열을 말한다. 따라서, 코딩 서열(예를 들어, 관심있는 항원을 코딩하는 서열)에 작동 가능하게 연결된 특정 프로모터는 조절 단백질 및 적절한 효소가 존재할 경우 코딩 서열의 발현을 가능하게 할 수 있다. 일부 경우, 특정 조절요소가 이들이 코딩 서열의 발현을 지시하는 기능을 할 수 있는 한 코딩 서열에 인접할 필요는 없다.

" 벡터" 라는 용어는 숙주 세포에 삽입되어 숙주 세포 게놈과 재조합되고 이에 삽입되거나, 또는 에피좀으로서 자발적으로 복제하는 컴피턴트 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 핵산을 의미한다. 이러한 벡터로는 선형 핵산, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, RNA 벡터, 바이러스 벡터 등이 있다.

"숙주 세포"는 하나 이상의 DNA 또는 벡터가 도입되는 진핵 또는 원핵 세포를 가리키며, 특정 대상 세포만이 아니라 그 자손 혹은 잠재적 자손까지도 가리키는 것으로 이해되어야 한다. 어떤 변형이 돌연변이 혹은 환경적 영향 때문에 후속 세대에 일어날 수 있기 때문에 사실 상기 자손은 부모 세포와 동일하지는 않지만, 본 명세서에서 사용된 바와 같이 상기 용어의 범주 내에서 여전히 포함된다.

"백신" 또는 "백신 조성물"은 본원에서 상호 교환하여 사용될 수 있으며, 동물에서 면역 반응을 유발하고/하거나, 질병 또는 감염에 의한 사망 가능성으로부터 동물을 보호하는 1종 이상의 면역학적 활성 성분을 포함하는 약학적 조성물을 말하며, 이것은 활성 성분의 면역학적 활성을 증대시키는 1종 이상의 추가적인 성분들을 포함할 수도 있고 포함하지 않을 수도 있다. 백신은 약학적 조성물에 전형적인 그 밖의 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다.

항원 또는 백신 조성물에 대한 "면역 반응"은, 피험체에서, 관심있는 항원 또는 백신 조성물 중에 존재하는 분자에 대해 체액성 및/또는 세포 매개성 면역 반응이 발생되는 것이다. "체액성 면역 반응"은 항체 매개성 면역 반응으로서 본 발명의 항원/백신에 대한 친화성을 갖는 항체의 생성을 포함하는 한편, "세포 매개성 면역 반응"은 T 림프구 및/또는 다른 백혈구에 의해 매개되는 것이다. "세포 매개성 면역 반응"은 주요 조직 적합성 복합체(MHC)의 클래스 I 또는 클래스 II 분자와 회합된 항원성 에피토프의 제시에 의해 유발된다.

"면역학적 유효량"이란, 당업자에게 공지되어 있는 표준 분석법에 의해 측정시, 세포성(T세포) 또는 체액성(B 세포 또는 항체) 반응 중 어느 하나의 면역 반응을 유발하기에 충분한 항원 또는 백신의 양을 말한다. 면역원으로서의 항원의 유효성은 증식 분석법, 세포 용해 분석법, 예컨대 T 세포가 그 특정 표적 세포를 용해시키는 능력을 측정하는 크롬 방출 분석법에 의해, 또는 혈청 중의 항원에 특이적인 순환 항체 수준을 측정함으로써 B 세포 활성 수준을 측정하는 것의 의해 측정할 수 있다. 또한, 면역 반응의 보호 수준은, 주사된 항원으로 면역화된 숙주를 항원 공격함으로써 측정할 수 있다.

“투여” 및 유사 용어는 조성물, 예를 들면, 플라스미드와 운반체의 혼합물을 치료 개체에 전달하여, 상기 조성물이 신체 부위에 전달되고 상기 플라스미드가 표적 세포를 트랜스펙션시키도록 하는 것을 의미한다. 따라서, 조성물은 예로써 전신 투여, 전형적으로 피하, 근육내, 정맥내, 또는 복강내 투여에 의해 개체에 투여된다. 하지만, 당분야에 공지된 바와 같이, 심근 유전자 전달을 수행하기 위한 전달 옵션에는 심외막(epicardial), 심내막(endocardial), 관상동맥내(intracoronary), 역관류(retroperfusion), 심막내(intapericardial) 투여 경로가 포함된다(J.M. Isner, supra). 모든 유형의 벡터는 심외막과 심내막 투여 경로를 통한 심근내 주입 및 심막내 주입에 의해 전달될 수 있다. 관상동맥내와 역관류 전달은 바이러스 벡터 또는 다른 벡터에 의해 보호되지 않는 플라스미드 DNA의 순환기내 분해로 인하여, 비-바이러스 유전자 전달 또는 다른 유전자 전달 방법에 적합하지 않다.

"예방"은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸리기 쉬운 경향이 있는 동물에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다.

"치료"는 (a) 질환 또는 질병의 발전의 억제; (b) 질환 또는 질병의 경감; 및 (c) 질환 또는 질환의 제거를 의미한다. 따라서, 본 명세서에서 용어 “치료학적 유효량”은 상기한 약리학적 효과를 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

치료 목적을 위한 "포유류"는 인간, 가축 및 농장 가축 및 동물원, 스포츠 혹은 개, 말, 고양이, 소, 원숭이 등의 애완용 동물을 포함하여 포유류로 분류되는 어떠한 동물도 가리킨다. 바람직하게는 상기 포유류는 돼지이다.

"돼지(porcine, swine, pig)", "양돈", "육돈"은 상호 교환하여 사용될 수 있으며, 멧돼지과(Suidae)의 일원인 임의의 동물을 지칭한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 유전자의 세포 표면 발현 시스템을 이용한 것으로, 돼지 써코바이러스2(PCV2) 항원 유전자가 살모넬라 표면에 발현되는 것을 특징으로 하는 살모넬라 백신 균주에 관한 것이다.

구체적으로, 살모넬라 균주 유래의 세포외막 단백질을 암호화하는 유전자 및 돼지 써코바이러스2(PCV2) 유전자 일부를 암호화하는 DNA서열을 함유함을 특징으로 하는 세포표면 발현용 재조합 발현벡터; 및 이러한 재조합 발현벡터로 형질전환시킨 살모넬라 균주에 관한 것으로, 살모넬라 감염 또는 PCV2 감염 관련 질환 예방 및 치료 시스템에 관한 것이다.

본 발명은 살모넬라 균주 유래의 세포외막 단백질A(OmpA) 및 PCV2 유전자를 기본 벡터에 삽입하여 살모넬라 균주에 형질전환시키고, 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자에게 공지된 표준 클로닝 기술 및 통상적인 방법을 이용하여 살모넬라 표면에 안정적으로PCV2 단백질을 발현시킴으로써 구현할 수 있다.

본 발명은 일 관점에서 살모넬라 균주 유래의 세포외막 단백질 및 PCV2 유전자 일부를 암호화하는 DNA서열을 함유하는, 세포표면 발현용 재조합 발현벡터에 관한 것이다.

벡터는 유전 물질(핵산)로 이루어진 구조물을 말한다. 전형적으로, 발현 벡터는 세균 숙주 세포에서 작용성인 복제 개시점, 및 발현 벡터를 포함하는 세균 숙주 세포를 검출하기 위한 선택성 마커를 함유한다. 본원에 기술된 특정 태양에서, 발현 벡터는 폐쇄된 원형 DNA 분자이다.

세포 표면 발현은 단백질이나 펩타이드 등을 적절한 표면 발현 모체(surface anchoring motif)와 융합시켜서 그램 음성, 양성균,곰팡이, 효모, 동물세포의 표면에 발현 시키는 기술을 말한다. 예를 들어, 박테리아나 효모와 같은 미생물의 표면 단백질을 표면 발현 모체로 사용하여 외래 단백질을 미생물 표면에 안정적으로 발현시키는 것이다.

미생물에서 세포 표면 발현을 성공적으로 수행하기 위해서는 우선 세포 표면에 발현시키고자 하는 외래 단백질을 세포 표면까지 안정적이며 효율적으로 이동시킬 수 있는 표면 발현 모체의 사용이 요구된다. 즉, 성공적인 세포표면 발현기술을 위해서는 상기 표면발현 모체가 가장 중요하다. 다시 말하면, 이 기술의 핵심은 외래단백질을 효과적으로 세포표면에 발현시킬 수 있는 모체의 선정 또는 개발에 있다. 따라서, 표면발현 모체는 외래단백질을 세포표면까지 보내기 위해 세포내막을 통과할 수 있도록 도와주는 분비신호가 있고, 둘째 세포 외막 표면에 안정되게 외래단백질이 부착될 수 있도록 도와주는 표적신호가 있으며, 셋째 세포 표면에 다량으로 발현되나 세포의 성장에 거의 영향을 미치지 않고, 단백질의 크기에 관계없이 외래단백질의 3차원 구조에 변화없이 안정적으로 발현될 수 있어야 한다.

이러한 표면발현 모체는 외막 단백질, 포자단백질, 리포단백질(lipoprotein), 자기전달체(autotranspoters) 및 표면 부속물(surfaceappendage)의 S층(S-layer) 단백질 등이 있다. 그 중에서 세포외막 단백질의 경우 그 3차원적인 구조가 세포외막을 통과하는 루프 구조를 가지고 있으므로, 다양한 단백질을 발현할 수 있는 융합 사이트(fusion site)를 제공할 수 있는 장점으로 인하여 표면 발현 모체로 많이 사용된다. 세포외막 단백질로는 OmpA, OmpS, LamB, OprF, PhoE 등을 예로 들 수 있다.

본 발명에서는 이러한 세포외막 단백질을 표면발현 모체로 사용하는 것을 특징으로 한다.

예를 들어, 상기 세포외막 단백질은 OmpA, OmpS, LamB, OprF, OmpC, PhoE 및 FadL로 구성된 군에서 선택될 수 있고, 가장 바람직하게는 OmpA를 사용할 수 있다.

OmpA는 b-barrel 구조를 외막(outer membrane) 안에서 형성하고 있다. 표면 밖으로 4개의 루프(loop)를 형성하고 있으며 이 루프를 이용하여 세포 표면발현 기술에 적용한다.

OmpA 단백질은 325개의 잔기로 이루어진 단백질이며 2개의 도메인을 가지고 있는데, N-terminal transmembrane (TM) 도메인 약 170개 및 C-terminal periplasmic 도메인 약 136개 정도로 이루어져 있다. 가운데는 Ala-Pro rich hinge region이 자리 잡고 있다. 본 발명에서는 N-말단 TM(transmembrane) 도메인을 표면 발현 모체로 이용하였다. 따라서, Omp A의 TM 도메인 서열만 포함해도 본 발명의 재조합벡터 기능인 세포 표면 발현(cell surface display)이 가능하다.

또한, 상기 세포외막 단백질은 살모넬라 유래인 것이 바람직하다. 살모넬라 세포외막 단백질(Omp) 항원은 혈청형별로 공통되는 항원을 가지면서 살모넬라 면역에 중요하게 인식되는 세포성 면역과 체액성 면역을 동시에 활성화시키는 면역물질로 인식되고 있다. 예를 들어, 살모넬라 티피 또는 살로넬라 티피무리움 유래일 수 있고, 바람직하게는 살로넬라 티피무리움 유래이다.

살모넬라 균주로부터 Omp를 획득하는 방법은 공지된 방법 즉, Arockiasamy 등(Analytic Biochemistry 283, 2000) 또는 Yuichi 등(Infection and Immunity 61, 1993)에 기재된 방법에 따라 수행되어질 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 살모넬라 티피무리움 유래의 OmpA를 세포 표면 발현 모체로 사용한 벡터를 제작하였다. 상기 살모넬라 티피무리움 유래의 OmpA의 서열로는 대표적으로 서열번호 1의 서열을 사용할 수 있다. 그리고, 그 중에서 특히 중요한 N-말단 TM(transmembrane) 도메인을 서열번호 2로 기재하였다.

본 발명의 상기 표면 발현용 벡터는 표면 발현 모체로 OmpA 같은 세포외막 단백질을 사용하고 돼지 써코바이러스2(PCV2) 항원 유전자 일부를 암호화하는 DNA서열을 함유한다.

"PCV2 항원"이란 용어는 숙주에서 PCV2에 대한 면역 반응을 유도하는 아미노산 서열을 의미하는데, 이는 임의의 PCV2 단백질의 전장의 서열, 이의 유사체 또는 이의 면역원성 단편을 포함한다. "면역원성 단편"이란 하나 이상의 에피토프를 포함하여 숙주에서 면역 반응을 유도하는 단백질의 단편을 의미하는데, 이러한 단편은 당업계에 공지된 임의의 수의 에피토프 지도작성 기술을 이용하여 동정할 수 있다.

특히, PCV2 항원 유전자의 ORF1, ORF2, ORF3, ORF4, ORF5,ORF6, ORF7 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 PCV2 오픈 리딩프레임(ORF) 서열을 함유하는 것이 바람직하고, 가장 바람직하게는 PCV2 ORF2 DNA 서열을 함유한다. 예를 들어 서열번호 3으로 표시되는 DNA 서열일 수 있다.

상기 PCV2 항원 유전자 일부를 암호화하는 DNA서열, 가장 바람직하게는 PCV2 ORF2 DNA 서열은 OmpA 단백질을 암호화하는 유전자 서열 중 TM 도메인을 코딩하는 서열과 융합되는 것을 특징으로 한다.

한편, 상기 세포외막 단백질을 코딩하는 유전자 및 PCV2 항원유전자 서열은 "생물학적으로 기능적 등가"인 유전자 서열도 포함한다. 따라서, 상기 유전자의 아미노산과 동일한 또는 기능적으로 등가인 아미노산의 약 70% 내지 약 90% 상동성을 가지는 서열은 단백질의 생물학적 활성이 유지된다는 조건을 가진다면 생물학적으로 기능적 등가의 서열이 될 수 있다.

본 발명에서, 상기 세포외막 단백질을 코딩하는 유전자 및 PCV2 항원 유전자 서열은 일반적으로 공지된 방법을 통해 벡터에 삽입할 수 있다.

통상적으로, 하나 이상의 제한 효소로 DNA 서열 및 벡터를 절단하고 단편들을 함께 결찰하여 최종적으로 발현될 DNA 서열을 벡터에 결합시킨다. 제한 효소 소화처리 및 결찰은 당업자들에게 익히 알려졌다.

벡터로는 상기 세포외막 단백질(예를 들어, OmpA)을 코딩하는 유전자 및 PCV2 항원 유전자(예를 들어 PCV2 ORF2)을 발현시킬 수 있는 프로모터와 클로닝을 위한 멀티 클로닝사이트를 가지고 있는 임의의 발현벡터를 제한없이 사용할 수 있으나, 특히, 플라스미드 또는 박테리아성 벡터를 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 일 실시예에서는 E. coli 벡터인 pGEX 4T-1(Amersham, cat : 27458001)를 사용하였다.

그리고, 상기 벡터 내에서 상기 세포외막 단백질을 코딩하는 유전자 및 PCV2 항원 유전자는 하나의 프로모터 또는 별개의 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다.

본 발명의 벡터에 포함되는 프로모터는 종래 알려진 임의의 프로모터가 포함된다. 상기 프로모터에는 원핵 생물, 곰팡이,식물 및 동물에서 작용하는 프로모터가 포함될 수 있는데, 특히, 박테리아 벡터에서 작용하는 프로모터를 사용할 수 있다.

상기 프로모터로 바람직하게는 trc, lac, tac, lacUV5-t7 hybrid 등과 같은 Lac operon based 프로모터가 포함되나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서는 tac 프로모터를 사용하였다.

한편, 본 발명의 발현벡터는 통상적으로 DNA 발현에 필요한 조절 요소 이외에, 다른 요소가 또한 DNA 분자에 포함될 수 있다.

이러한 추가 요소는 인핸서(enhancer)를 포함한다. 인핸서는 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴 및 바이러스 인핸서, 이를테면 SV40, RSV, 및 EBV 인핸서, 거대세포 바이러스 최조 인핸서, 폴리오마 인핸서, 아데노바이러스 인핸서 및 레트로 바이러스 LTR 인핸서를 포함한 그룹중에서 선택될 수 있으나, 이들에만 한정되지 않는다.

전사 개시 및 조절 부위를 함유하는 것 이외에, 발현 벡터는 또한 전사 종결에 필요한 서열 및 전사 영역에서 전사에 대한 리보좀 결합 부위를 포함할 수 있다. 예를 들어, 전사체의 적절한 폴리아데닐화 반응을 위해 발현 구조체에 폴리아데닐화 시그날이 포함될 수 있다. 폴리아데닐화 시그날의 성질은 본 발명의 성공적인 실행에 중요한 것으로 보지는 않으며, 임의 서열이 이용될 수 있다. 이 밖에도 당업자들이라면 발현 벡터에 유용한 다수의 조절 서열을 알 수 있을 것이다.

또한, 발현 벡터는 재조합 벡터 작제물을 함유하는 세포의 부차집단을 선택할 수 있는 선택 마커를 포함할 수 있다. 마커는 본원에 개시된 융합서열을 함유하는 동일 벡터에 함유될 수 있거나, 별도의 벡터상에 존재할 수도 있다. 선택성 마커는 발현되었을 때, 선택성 마커를 포함하지 않는 세로로부터 세포의 용이한 확인, 분리 선별을 할수 있도록 세포에 확인가능한 특징을 부여하는 핵산 서열을 말한다. 당분야에 공지된 임의 선택성 마커도 본 발명의 핵산에서 선택성 마커로 사용될 수 있다.

특히, 본 발명의 상기 재조합벡터를 이용하여 PCV2 항원 유전자를 발현함에 있어서, Lac 오페론에서 베타 갈락토시다아제가 만들어질때 유도물질로 작용하는 IPTG(Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranoside)를 이용하는 것이 바람직하다.

IPTG는 β-galactosidase의 활성의 유도물질로서, lac 프로모터나 tac 프로모터를 갖는 발현 벡터의 발현 유도제로써 사용할 수 있다. 즉, IPTG로 PCV2 항원 유전자 발현을 on/off 시킬 수 있으며, 이를 이용하여 IPTG로 PCV2 항원 생산시 효율성을 조절할 수 있다.

즉, 본 발명의 재조합벡터는 이하와 같은 장점을 가진다.

ㆍ살모넬라 유래 OmpA를 표면 발현 모체로 사용하여 PCV 항원 유전자의 세포표면 발현율을 높임

ㆍ박테리아성(예를 들어, E. coli) 벡터를 사용하는 경우 IPTG(Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranoside)를 이용하여 PCV 항원 유전자의 과발현이 가능함

ㆍ약 20kda 정도의 다소 큰 분자량을 가지는 PCV2 ORF2 바이러스성 단백질을 살모넬라의 표면에 발현시킬 수 있음.

또한, 본 발명은 다른 관점에서 상기 재조합 벡터로 형질전환된, PCV2 항원 유전자(예를 들어, PCV2 ORF2)을 발현하는 살모넬라 균주; 및 살모넬라 또는 PCV2 감염에 따른 질환의 치료 또는 예방용 백신으로서의 이의 용도에 관한 것이다.

살모넬라 균주는 장관계의 Peyer's patch의 M 세포를 통과해 Peyer's patch내 또는 림프절에서 사이토카인을 발현함으로써 paracrine(인접 세포에 작용) 또는 endocrine (먼거리에 존재하는 세포에 작용) 형태의 효력을 발휘할 수 있으므로, 살모넬라는 이와 같이 M 세포를 통과해 숙주 전체에 효과를 발휘할 수 있는 사이토카인 유전자를 발현할 수 있다

본 발명에 있어서 살모넬라 균주(숙주)는 살모넬라 티피뮤리움, 살모넬라 더비, 살모넬라 스크와젠그론드, 살모넬라 브렌더럽, 살모넬라 엠반다카, 살모넬라 뉴우포터, 살모넬라 엔테라이티디스, 살모넬라 갈리나룸, 살모넬라 풀로룸 등이 있으며, 바람직하게는 축종에 관계없이 감염되고 병원성이 강한 균종인 살모넬라 티피뮤리움, 살모넬라 브렌더럽 또는 살모넬라 엔테라이티디스를 사용하는 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는 살모넬라 티피무리움일 수 있다. 상기 본 발명에 사용가능한 균주들은 국립수의과학검역원에서 자유로이 분양받을 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 살모넬라 typhimurium H683 Δasd 균주를 사용하였다.

상기 균주들을 이용하여 세포 표면에 PCV2 항원 유전자(예를 들어, PCV2 ORF2)를 발현하는 재조합 살모넬라 균주는 당업계에서 통상적으로 사용하는 형질전환방법에 의하여 제조 가능하다. 당분야의 기술적 범주에서 통상의 분자 생물학, 미생물학, 면역학 및 재조합 DNA 기술 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 일 구체예로써 제조된 재조합 살모넬라 균주는 기탁번호 KCCM 11099P의 재조합 살모넬라 균주이다.

상기 제작된 재조합 살모넬라 균주는 경구 투여방법으로 다양한 재조합 단백질의 강력한 생리 활성들을 숙주의 장 관계뿐만 아니라 몸 전체에 미치게 할 수 있다.

특히, 비병원성의 살모넬라 균주 표면에 외래 면역원인 PCV2 유전자(예를 들어, PCV2 ORF2)을 발현시켜 살아있는 상태(live)로 경구투여할 경우 종래의 약독화된 병원성 세균이나 바이러스를 이용한 백신들보다 더 지속적이고 강한 면역반응을 유도할 수 있다. 이러한 면역반응 유도는 살아있는 상태의 살모넬라 균주에 대한 체내의 면역 반응에 의한 것으로, 살모넬라의 표면 구조물들이 표면 발현된 외래단백질 PCV2 ORF2의 항원성(antigenicity)을 증가시키는 보조제(adjuvant)로서 작용하기 때문이다. 따라서, 이러한 표면발현 시스템을 이용한 비병원성 살모넬라 균주의 재조합 생백신은 기존의 PCV2 감염의 치료 또는 예방용 백신보다 더욱 효과적이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 상기 재조합 살모넬라를 배양하여 PCV2, 바람직하게는 PCV2 ORF2 단백질을 살모넬라 표면에 발현하는 단계; 및 (b) 상기 PCV2, 바람직하게는 PCV2 ORF2 단백질이 표면발현된 살모넬라를 회수하는 단계를 포함하는, PCV2 ORF2 단백질이 표면발현된 재조합 살모넬라를 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 PCV2 단백질은 발현벡터에 함유된 살모넬라 티피무리움 유래의 OmpA 단백질에 의하여 미생물의 표면으로 이동하여 위치하게 된다.

상기 PCV2 단백질은 그 기능을 잃지 않으면서, 미생물의 표면에 발현되기 때문에, 미생물에 표면발현된 상태로 사용될 수 있으며, 미생물에 표면발현된 채로 동물에 투여되어 동물 체내에서 PCV2에 대한 면역반응을 유도할 수도 있다.

이처럼, 본 발명의 주요한 특징은 살모넬라 균주 유래의 세포외막 단백질, 가장 바람직하게는 OmpA를, PCV2 유전자, 특히 PCV2 ORF2의 새로운 표면발현 모체로 활용하여, 외래단백질 PCV2 ORF2를 살모넬라 균주의 표면에 효과적으로 발현시키는 것이다.

본 발명의 상기 시스템은 하기와 같은 장점을 가진다.

ㆍ살모넬라 또는 PCV2 감염 예방에 필수적인 세포성 면역과 체액성 면역을 동시에 자극할 수 있어 효능이 뛰어남.

ㆍ항원이 발현된 살모넬라 균주만을 이용할 수 있기 때문에 생산비가 절감되어 경제적인 백신 상용화가 가능함

ㆍ재조합 살모넬라 균주만을 이용하여 과량의 항원이 필요 없어 백신으로 인한 부작용을 감소시킬 수 있음

ㆍ비병원성 살모넬라를 이용하여 경구투여 백신 개발의 기초기술로 응용 가능함

ㆍ비병원성 또는 섭취 가능한 미생물(GRAS)을 이용한 백신 개발에 응용 가능함.

한편, 본 발명의 또 다른 관점에서, 본 발명은 상기에서 설명한 살모넬라 균주를 함유하는 것을 특징으로 하는 면역증강용 약학조성물에 관한 것이다. 상기 면역증강 활성은 PCV2 유전자가 발현되거나 살모넬라 감염으로 인해 생기는 것이다.

"약학 조성물"은 생리적으로 적합한 담체 및 부형제와 같은 다른 화학적 성분을 가지는, 본 명세서에서 설명된 하나 이상의 활성 성분이나 제제의 제조물을 칭한다. 약학 조성물의 목적은 화합물을 유기체에 투여하는 것을 용이하게 하는 것이다.

바람직한 형태로서, 조성물은 당업자에게 공지된 추가 성분을 포함할 수 있고, 하나 이상의 수의학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. "수의학적으로 허용되는 담체"는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 보강제, 안정제, 희석제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장제, 흡수지연제 등을 포함한다.

상기 조성물은 예를 들어, 상기 PCV2 ORF2 단백질을 발현하는 살모넬라 균주를 포함하는 조성물을 의미한다. 또한 세포 배양물 상청액의 일부를 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 혹은 비경구적으로 투여할 수 있다. 바람직하게는 경구로 투여한다.

경구제로서는 과립제, 산제, 정제, 캡슐제, 용제, 유제 혹은 현탁제 등의 제형으로 할 수 있다. 비경구제로서는 주사제, 점적제, 외용약제 혹은 좌제(座劑) 등의 제형을 선택할 수 있다. 주사제에는 피하 주사제, 근육 주사제 혹은 복강내 주사제 등을 나타낼 수 있다. 외용약제에는 경비 투여제 혹은 연고제 등을 나타낼 수 있다. 주성분인 본 발명의 약제를 포함하도록 상기 제형으로 하는 제제 기술은 공지되어 있다.

예를 들면, 경구 투여용 정제는 본 발명의 약제에 부형제, 붕해제, 결합제 및 활택제 등을 추가하여 혼합하고 압축 성형함으로써 제조할 수 있다. 부형제에는 유당, 전분 혹은 만니톨 등이 일반적으로 사용된다. 붕해제로서 는 탄산칼슘이나 카르복시메틸셀룰로오스칼슘 등이 일반적으로 사용된다. 결합제에는 아라비아 고무, 카르복시 메틸셀룰로오스 혹은 폴리비닐피롤리돈이 사용된다. 활택제로서는 탈크나 스테아린산 마그네슘 등이 공지의 것이다.

상기 조성물에 함유된 살모넬라 균주는 경구 투여에 의하여 재조합 단백질의 생산을 편리하게 유도할 수 있으므로, 상기 살모넬라 균주를 함유하는 조성물은 경구투여용 사료첨가제인 것이 가장 바람직하다.

또한, 당업자는 본 발명에 사용된 조성물이 공지된 주사성 생리학적으로 허용되는 멸균 용액을 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 비경구 주사 또는 주입을 위한 즉석제조 용액(ready-to-use solution)의 제조 시에는, 식염수 또는 대응하는 혈장 단백질 용액과 같은 등장성 수용액을 쉽게 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 면역원성 및 백신조성물은 희석제, 등장제, 안정제 또는 보강제를 포함할 수 있다. 희석제는 물, 식염수, 덱스트로스, 에탄올, 글리세롤 등을 포함할 수 있다. 등장제는 특히 염화나트륨, 덱스트로스, 만니톨, 소르비톨 및 락토스를 포함할 수 있다. 안정제는 특히 알부민 및 에틸렌디아민테트라아세트산의 알칼리 염을 포함한다

또한, 본 발명의 약학적 조성물을 고형, 액상 혹은 반고형상 조성물로 함으로써 외용제로 할 수 있다. 고형 혹은 액상의 조성물에 관해서는 상기에 설명한 바와 같은 조성물로 함으로써 외용제로 할 수 있다. 반고형상 조성물은 적당한 용제에 필요에 따라 증점제를 추가하여 제조할 수 있다. 용제에는 물, 에틸알코올 혹은 폴리에틸렌글리콜 등을 사용할 수 있다. 증점제에는 일반적으로 벤토나이트, 폴리비닐알코올, 아크릴산, 메타크릴산 혹은 폴리비닐 피롤리돈 등이 사용된다. 이 조성물에는 염화벤잘코늄 등의 보존제를 추가할 수 있다. 또한, 담체로서 카카오유지와 같은 유성 기제, 혹은 셀룰로오스 유도체와 같은 수성 겔 기제를 조합함으로써 좌제로 할 수도 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 대상 동물의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 목적하는 치료에효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.

"PCV2 항원의 유효량"이란 PCV2 항원이 면역 반응을 유도하거나 유도할 수 있는 항원의 양을 의미하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 유효량은 적어도 10주, 바람직하게는 적어도 12주, 더욱 바람직하게는 적어도 15주, 가장 바람직하게는 적어도 20주의 면역 지속기간(DOI)을 부여하는 항원의 양으로서 정의되는 것이 바람직하다.

일반적으로, 상기 조성물에 포함되는 살모넬라 균주는 필요에 따라 적정의 농도로 동물에게 접종될 수 있다. 예를 들어, OD 600에서 OD값을 측정 후 대상 동물에 약 0.5 ~ 1.5 1x10^10 CFU/ml 값으로 접종시킬 수 있고, 본 발명의 일 실시예에서는 1x10^10 CFU/ml 의 값으로 접종하였습니다.

그러나, 투여량은 이에 한정되지 않고, 제형의 종류, 투여 방법, 연령이나 체중, 증상 등을 고려하여 최종적으로는 수의사의 판단에 의해 적절히 결정할 수 있다

또 다른 관점에서, 본 발명은 살모넬라 감염 또는 PCV2 감염과 관련이 있거나 이들의 감염에 의한 임상 증상을 감소시키기 위한 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것으로서, 이러한 치료를 필요로 하는 동물에게 전술한 PCV2 항원 유전자를 표면에 발현하고 있는 재조합 살모넬라 균주 백신 또는 이를 함유하는 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.

특히, 본 발명은 "어린 동물"에서 효과적인데, 이는 1 내지 35일령의 동물을 의미하고, 일령이 적을수록 바람직하다. 따라서 가장 바람직하게는 1 또는 2일령의 동물을 의미한다. 그리고 본 명세서에 사용된 "동물"은 돼지(swine), 돼지(pig) 또는 새끼돼지를 의미한다.

PCV2의 감염은 주로 접촉감염에 의해 전파되고 태반감염에 의해 전파되는것으로 알려져 있다.

PCV2 감염에 의한 임상 증상은 (1) 소엽사이 부종이 있는 간질성 폐렴, (2) 창백한 피부 또는 황달, (3) 얼룩덜룩한 위축성 간, (4) 위궤양, (5) 신장염,(6) 생식기 장애, 예컨대 유산, 사산, 미라 등, (7) 일반적으로 로소니아 인트라셀룰라리스 감염(회장염)과 관련이 있는 것으로 알려진 연막계 병변, (8) 림프절병증, (9) 림프구 부족 및/또는 (10) 다핵/거대 조직구, (11)돼지 피부염 및 신장병 증후군(PDNS), (12) PCVAD 관련 사망률, (13) PCVAD 관련 체중 감소, (14) 감퇴된 성장변동성, (15) 감소된 빈도의 '왜소병' 및 (16) 감소된 돼지 생식기 및 호흡기 질환 합병증(PRRSV)으로의 공동감염을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다.

PCV2 감염에 따른 질환은 대표적으로 이유후 전신성 소모성 증후군(Postweaning Multi-systemic Wasting Syndrome; PMWS)을 들 수 있다. 이유성 전신성 소모성 증후군은 자돈에서 모체이행항체가 떨어지는 6주에서 16주령 사이에 발생하는데 특히 8-12주령의 돼지에서 집중적으로 발생한다. 특히, 상기 이유후 전신성 소모성 증후군(PMWS)의 경우 체중손실, 수척, 전형적인 위축증상, 호흡곤란, 황달, 설사, 기침, 중추신경계 불안 등의 임상증상을 보인다.

한편, 살모넬라 감염에 따른 질환은 대표적으로 살모넬라증(Salmonellosis)을 들 수 있다. 살모넬라증(Salmonellosis)은 살모넬라 감염에 의한 돼지의 급성 또는 만성의 소화기전염병으로 일명 돼지 파라타이포이드(paratyphoid)라 불리우며 위장염 및 패혈증을 특징으로 하고 주로 비육기에 많이 발생한다. 특히 써코와 복합 감염되어 폐사율을 30~50%까지 올리는 주범이기도 하다.

살모넬라증은 전 세계적으로 발생되며, 돼지에서 질병을 일으키는 중요한 Salmonella의 혈청형은 S. choleraesuis 와 S. typhimurium 이다. 어린돼지의 급성패혈증을 일으키는 S. choleraesuis 및 S. typhisuis는 돼지에서만 병을 일으키는 특성이 있다. 국내의 경우 S. typhimurium에 의한 경우가 흔한 것으로 알려져 있다. 특히, 급성패혈증형은 2-4개월령의 어린 돼지에서 흔히 발생하며, 주된 증상은 체온상승(41-42℃), 원기소실과 식욕감퇴, 귀주위와 다리부위에 청색증(cyanosis)이 생기며, 발병 2-4일 이내에 대부분 폐사된다. 급성 장염형은 비육기 가축에 주로 발생되며 식욕이 일정하지 않고 심한 수양성 설사와 고열, 원기쇠약, 폐염 및 신경증상을 동반하며 중증의 경우 피부변색이 나타난다. 만성 장염의 경우는 계속적인 설사로 인하여 심하게 여위여 있고 초기 황백색 또는 회백색의 연변에서 점차적으로 젤라틴 양의 점액성 설사로 변하고 설사변은 장점막상피세포의 괴사편을 함유하고 있으며 간혹 혈액이 섞여 있는 경우도 있다.

본 발명의 재조합 살모넬라 균주는 이러한 살모넬라뿐만 아니라 PCV2 바이러스에 의해 발생하는 질병예방에 효과적인 다가 백신으로 매우 유용하다.

(실시예)

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.

이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

재료준비

사용된 salmonella strain은typhimurium H683 Δasd cell line(제주대학교 수의과대학)로서, 세포 배양시 TSB 배지에 2,6 Diaminopimelic acid (DAP)를 50 ug/ml 로 사용하였고, 37℃ 및 160 rpm의 조건하에서 배양하였다.

실시예 1 : PCV2 표면 발현용 벡터 제작

우선 준비된 비병원성의 salmonella typhimurium H683 Δasd 세포주로부터 OmpA 부분 유전자(a.a -21 to 159)의 클로닝을 진행하였다.

Oligonucleotide	Sequence (5' -> 3')	특징
OmpA-21	atgaaaaagacagctatcgcg (서열번호 4)
OmpA+324	ttaagcctgcggctgagttac (서열번호 5)
sdv1 F'	CCTATACTAGGATGAAAAAGACAGCTATCGCG (서열번호 6)	EcoNI
sdv1 R'	GGATCCGGTGCCGATGGTGTTGGCATCACCG (서열번호 7)	BamHI
PCV2-TA F'	cgccATGACGTATCCAAGGAGGCG(서열번호 8)	ATG
PCV2-TA R'	TTAAGGGTTAAGTGGGGGGTCTTTAAG(서열번호 9)	stop
PCV2-S F'	GTCGACATATGACGTATCCAAGGAGG(서열번호 10)	Sal I & ATG
PCV2-S R'	GCGGCCGCATGATGATGATGATGATGAGGGTTAAGTGGGGGGTC(서열번호 11)	Not I & his taq

DNA sol kit을 사용하여 배양된 salmonella typhimurium H683 Δasd으로부터 genomic DNA를 준비하고, 표 1에 기재되어 있는 대로, 상기 Genomic DNA을 주형으로 사용하여 하기 sdv1 F', sdv1 R' 프라이머로 OmpA(-21 to 159 a.a.)를 PCR 수행 후 도 1에 나타낸 TA vector(pcr2.1, invitogen)로 클로닝 하였다.

한편, PCV2 ORF2는 recombinant baculovirus seed(PRO-VAC®CIRCOMASTER, 코미팜)로부터 PCV2-TA F’, PCV2-TA R’ 프라이머를 사용하여 TA vector로 cloning을 하였다. 이러한 OmpA 및 PCV2 ORF2의 TA 클로닝 원리를 도 2에 나타내었다.

그리고, 도 3에 나타낸 pGEX 4T-1 vector(연세대학교, 기탁번호?)를 surface display vector의 기본 벡터로 사용했다.

상기 pGEX-4T-1의 대부분의 system은 그대로 유지를 하면서 EcoNI 과 BamHI을 처리하여 GST taq 부분을 제거하였다. 그리고 동일 제한효소 EcoNI 와 BamHI을 이용하여 클로닝한 ompA partial gene(a.a -21 to 159)을 삽입하여 표면발현 벡터(sdv1 으로 명명)로서의 기본 vector를 완성하였다(도 4).

그리고, 상기 클로닝한 PCV ORF2 gene을 sdv1 vector와 클로닝하기 위해서 다시 PCV2-S F' 와 PCV2-S R' primer를 사용하여 클로닝을 진행하였다.

이 때 5’end에는 Sal I site를 넣었고, 3’end에는 Not I site 와 his taq을 클로닝하였다. 이렇게 만들어진 PCV2 ORF2 gene을 Sal I과 Not I enzyme site를 이용하여 sdv1 vector로 cloning 진행하였다. 즉, sdv1 vector와 PCV2 ORF2 gene을 ligation 하여 sdv1PCV2 vector를 완성하였다.(도 5) 상기 sdv1PCV2 vector 의 개열지도를 도 13에 나타내었다.

그 결과, tac promoter에 의하여 GST 대신 ompA(a.a -21 to 159)와 PCV2 ORF2가 융합 되어 발현하였다. 또한 amp+ 있어서 selection에 용이하였다.

실시예 2 : 형질전환 및 PCR 에 의한 확인

salmonella 표면에 외부 단백질인 PCV2 ORF2 단백질을 발현시키기 위하여 sdv1PCV2 vector를 제작하였고, salmonella typhimurium H683 Δasd cell line에 이 벡터를 형질전환(transfection) 하는데 있어서 CaCl₂을 이용한 화학적 형질전환(chemical transfection) 방법을 사용하였다.

우선 얼음에서 30 min간 인큐베이션 후 42℃에서 90 초 동안 열 충격(heat shock)을 가한 후, 다시 얼음에서 10분간 인큐베이션하였다. 형질전환 후 2 hr 동안 LB(amp-)에서 전-배양(pre-culture) 후 LA(amp+)에 도말 하였다.

이렇게 만들어진 세포주 Sal-sdv1PCV2를 기탁하고(KCCM 11099P), PCR 방법을 이용하여 확인하였다. Sal-sdv1PCV2를 배양 후에, 플라스미드를 준비하여 주형으로 사용하고, OmpA(a.a -21 to 159) 와 PCV2 ORF2의 유전자를 PCR 방법으로 확인하였다.

DNA : 1 ul

primer 1 : 1 ul

primer 2 : 1 ul

A.DW : 17 ul

사용한 PCR 조건은 아래와 같다.

PCR cycle	Temperature(℃)	Time
initial denatureation	94	5분
33 cycle denaturation annealing extension	95	40초
	55	40초
	72	45초
final extension	72	5분
end	4

그 결과를 도 6에 나타내었다.

PCV2 ORF2 gene : PCV2-S F' & PCV2-S R' primer를 이용하여 PCV2의 ORF2 gene 확인하였고, OmpA(-21_159) : sdv1 F' & sdv1 R'primer를 이용하여 OmpA gene 을 확인하였다.

실시예 3 : 단백질발현에 따른 SDS - PAGE 및 웨스턴 블럿 확인

IPTG에 의하여 PCV2 ORF2를 표면에 과발현시켰다.즉, 50 ug/ml 농도의 DAP, TSB 배지에서 37℃에서 160 rpm으로 세포배양 후 OD 600 0.5 ~ 0.6에서 IPTG 0.15 mM을 사용하여 PCV2 ORF2의 표면 과발현을 유도하였다. 상기 유도 후 3시간 동안 배양 (약 OD 600 1.3 ~1.5)하여 수득하였다.

그리고, IPTG에 의해서 과 발현된 PCV2 ORF2 단백질은 SDS-PAGE와 western blot 방법으로 확인하였다.

OmpA 와 PCV2 ORF2가 fusion된 단백질은 약 48 kda 정도의 크기를 가지며 fusion 단백질 c-term에 his tag이 있어 his taq을 인지하는 antibody를 이용하여 western blot 실험을 진행했다. western blot 실험시 샘플은 과발현한 whole cell을 PBS washing 하여 사용하였다. 1차, 2차 antibody로 his-mouse 와 mouse-HRP antibody를 각각 1 : 1000 , 1 : 5000으로 희석하여 사용해서 western blot 실험을 했다.

융합된 단백질이 표면에 발현되었는지 확인하기 위하여 트립신과 PCV2 ORF2 gene에 있는 트립신 사이트(trypsin site)를 이용하였다. Salmonella에서 fusion 단백질을 과발현 시켜서 culture 후 trypsin을 처리하여 37’c에서 15 min incubation하였다. PBS buffer를 사용하여 3번 washing을 한 다음에 SDS-PAGE와 western blot 방법을 이용하여 확인하였다.

그 결과를 하기 표 3 및 도 7에 나타내었다. 이 실험 결과를 통해 많은 단백질이 세포표면에서 발현되는 것을 확인할 수 있었다.

salmonella typhimurium H683 Δasd 의 cell line에 sdv1PCV2 vecto를 transformation 한 sal-sdv1PCV2 와 transformation전의 salmonella typhimurium H683 Δasd cell line 의 단백질 발현 유무 확인결과, 기존 cell line에서는 IPTG 유/무와 관계없이 단백질이 발현이 안되었지만, sdv1PCV2 vector가 transformation 된 cell line에서는 IPTG 의 유/무에 따른 단백질 차이를 보였다.

특히, 상기 3번과 4번을 비교해 보면 확실하게 4번에서 IPTG에 의하여 단백질이 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 즉, PCV2 ORF2의 C-term에 his taq 이 결합되어 있어서 단백질 발현 유/무를 확인 할 수 있는 것이다.

한편, 실험 결과 5, 6, 7번 결과를 비교해 보면 시간에 따른 특별한 상관관계는 파악할 수 없으나 8번 trypsin을 처리하지 않은 결과와 대조적으로 단백질이 trypsin에 제거되는 것을 볼 수 있었다. 이는 PCV2의 ORF2의 유전자 안에 trypsin site가 존재하기 때문에 trypsin을 처리시 salmonella surface에 발현된 PCV2 의 ORF2 단백질은 제거되고 내부에 발현된 단백질은 cell wall에 보호를 받아 영향을 받지 않기 때문이다.

실시예 4 : 기니 피그(guinea pig)에서의 동물실험 항체가 확인

(1) PCV2 항체형성

sal-sdv1PCV2의 IPTG에 의한 induction 유/무에 따른 기니피그에서의 PCV2 항체 형성을 비교해 보았다.

우선, 실험은 sal-sdv1PCV2를 IPTG를 사용해서 induction 유/무로 크게 2 그룹으로 나눌 수 있고, 항체가 확인을 위해서 sal-sdv1PCV2를 기니피그에 접종시 불활화한 것과 live 상태로 다시 2 그룹으로 나누어 총 4가지 그룹으로 실험을 진행했다.

각 그룹은 모두 1x10^10 CFU로 동일한 양을 사용했으며, 모두 PBS buffer로 3회씩 washing 해서 배지의 영향을 최소화하였다. 또한 불활화 그룹의 경우 포름알데히드 0.2% 을 첨가하여 37℃에서 overnight 하여 충분하게 불활화시켰다. 또한 불활화 시킨 A 와 B 그룹은 2주후 2차 접종을 시켰고, C 와 D 그룹은 1차 접종만 하여 항체가 변화를 지켜 보았다.

그 결과를 도 8 내지 도 11에 나타내었다.

실험결과 A, B, C, D 그룹을 보면 확실히 B 와 D 그룹에서는 시간이 지나면서 Positive Control(PC) 까지 항체가가 증가하는 것을 볼 수 있다. 또한 불활화 시킨 B 그룹에서는 2차 접종 후인 3주차부터 항체가가 증가하는 것이 뚜렷하게 보이며(도 9), live 그룹인 D 에서는 1주차부터 4주차까지 꾸준히 항체가가 증가하는 것을 볼 수 있다(도 11). 반면 IPTG를 넣지 않은 A(도 8) 와 C 그룹(도 10)은 모두 불활화와 생균주에 상관없이 항체 생성되지 않았다.

이러한 결과는 sal-sdv1PCV2의 IPTG에 의한 induction에 따른 기니피그에서의 PCV2 항체 형성이 효과적임을 보여준다.

(2) salmonella 항체가 확인

한편 상기 재조합균주 sal-sdv1PCV2를 IPTG 조건 하에서 배양한 후 1x10^10 CFU를 기니피그에게 근육주사 하였다.

그리고, 1차 접종후 2주, 2차 접종 후 1주, 2주, 3주 각각 채혈하여 salmonella 의 항체가를 확인하였다. 항체생성 유무를 확인하기 위해서 swine salmonella antibody test kit을 사용하였고, 접종한 동물이 기니피그이므로 2차 항체를 기니피그-HRP 항체를 1:500으로 희석해서 사용하였다.

즉, 혈청을 분리한 후 플레이트에서 1차 항체와 결합시키고(100 ul, 1hr, RT), 3회 세척한 후(300 ul) 다시 2차 항체를 결합시켰다(100 ul 1hr, RT). 다시 3회 세척하고(300 ul) 발색시킨 후 이를 OD 450에서 확인하였다.

그 결과를 도 12에 나타내었다. 즉, 시간이 지나면서 살모넬라에 대한 항체가도 증가하는 것을 볼 수 있다.

이처럼, 본 발명의 재조합 살모넬라 균주는 PCV2 감염에 대해 항체생성 효율이 우수할 뿐만 아니라 살모넬라 감염에 대해서도 항체생성 효과를 나타내는 다가 백신으로서, 살모넬라 또는 PCV2에 의해 발생하는 질병 예방에도 효과적이다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

한국미생물보존센터(국외) KCCM11099P 20100907

서열목록 전자파일 첨부

Claims (28)

1. 돼지 써코바이러스2(PCV2) ORF2 유전자를 암호화하는 DNA서열이,
   살로넬라 티피뮤리움 균주 유래의 세포외막 단백질A(OmpA)을 암호화하는 유전자 서열 중 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 TM 도메인(OmpA -21 에서 159까지의 아미노산을 코딩하는 서열)과 융합되어 있는 것을 특징으로 하는, 세포표면 발현용 재조합벡터.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, 상기 살모넬라 티피뮤리움 균주 유래의 OmpA 단백질은 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 세포표면 발현용 재조합벡터.
   
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 제1항에 있어서, 상기 PCV2 ORF2는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포표면 발현용 재조합벡터.
   
10. 제1항에 있어서, 상기 재조합벡터는 기본벡터가 대장균의 것을 특징으로 하는 세포표면 발현용 재조합벡터.
    
11. 제1항에 있어서, 상기 세포표면 발현용 재조합벡터는 도 13의 개열지도를 가지는 것을 특징으로 하는 세포표면 발현용 재조합벡터.
    
12. 제1항, 제4항, 제9항, 제10항 및 제11항 중 어느 한 항에 따른 세포표면 발현용 재조합벡터로 형질전환된 재조합 살모넬라 티피뮤리움 균주.
    
13. 삭제
14. 삭제
15. 제12항에 있어서, 상기 돼지 써코바이러스2(PCV2) ORF2 유전자는 재조합 살모넬라 티피뮤리움 균주 표면에 발현되는 것을 특징으로 하는 재조합 살모넬라 균주.
    
16. 삭제
17. 제12항에 있어서, 상기 살모넬라 티피뮤리움 균주는 수탁번호 KCCM 11099P의 균주인 것을 특징으로 하는 재조합 살모넬라 티피뮤리움 균주.
    
18. 제12항에 있어서, 상기 재조합 살모넬라 티피뮤리움 균주는 살모넬라 감염 또는 PCV2 감염에 따른 질환의 치료 또는 예방용 생백신인 것을 특징으로 하는 재조합 살모넬라 티피뮤리움 균주.
    
19. 제12항에 따른 살모넬라 티피뮤리움 균주에 의해 발현되어 포유류에서 체액성 면역반응을 유도할 수 있는 재조합 융합 단백질.
    
20. 제12항의 재조합 살모넬라 티피뮤리움 균주를 함유하는 것을 특징으로 하는 살모넬라 감염 또는 PCV2 감염에 따른 질환의 치료 또는 예방 백신용 조성물.
    
21. 제20항에 있어서, 상기 백신 조성물은 IPTG(Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranoside)을 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
    
22. 제20항에 있어서, 상기 살모넬라 티피뮤리움 균주가 0.5 ~ 1.5 x 10^10 CFU/ml으로 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
    
23. 제20항에 있어서, 상기 조성물은 경구 투여용 사료첨가제인 것을 특징으로 하는 조성물.
    
24. 인간을 제외한 동물에게 제20항의 백신 조성물의 면역학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 살모넬라 감염 또는 PCV2 감염에 따른 질환의 치료 또는 예방방법.
    
25. 제24항에 있어서, 상기 백신 조성물은 IPTG(Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranoside)을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
    
26. 제24항에 있어서, 상기 동물은 돼지인 방법.
    
27. 제24항에 있어서, 상기 PCV2 감염에 따른 질환은 이유후 전신 소모성 증후군(Postweaning Multi-systemic Wasting Syndrome; PMWS)인 방법.
    
28. 제24항에 있어서, 상기 살모넬라 감염에 따른 질환은 살모넬라증(Salmonellosis)인 방법.

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