WO2014142515A1

WO2014142515A1 - 재조합 효모 전세포를 이용한 돼지 써코바이러스(pcv2) 서브유닛 백신과 그의 제조 방법

Info

Publication number: WO2014142515A1
Application number: PCT/KR2014/002002
Authority: WO
Inventors: 최의성; 박경민; 서성화; 안정오; 이은교; 김천석; 윤인중; 유성식; 심영정
Original assignee: 한국생명공학연구원; 주식회사 중앙백신연구소
Priority date: 2013-03-11
Filing date: 2014-03-11
Publication date: 2014-09-18
Also published as: KR20140111541A; CN105247037A; KR102217387B1

Abstract

본 발명은 효모 전세포 또는 이의 파쇄물을 이용한 재조합 돼지 써코바이러스(PCV2) 서브유닛 백신 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 본 발명의 효모 전세포 또는 이의 파쇄물은 백신조성물로써 뛰어난 효과가 있을 뿐만 아니라, 효모의 다양한 장점 및 재조합 미생물을 사용한 돼지 써코바이러스 백신 제조 과정에서 피할 수 없었던 세포파쇄나 항원 추출, 정제, 안정화 등 백신 제조 공정을 획기적으로 단순화시킬 수 있다.

Description

재조합 효모 전세포를 이용한 돼지 써코바이러스(PCV2) 서브유닛 백신과 그의 제조 방법

본 발명은 재조합 효모 전세포를 이용한 PCV 관련 질병(porcine circovirus associated diseases)을 예방할 수 있는 모돈 및 자돈 접종용 재조합 돼지 써코바이러스(PCV2) 서브유닛 백신 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

돼지의 써코 바이러스 2형(PCV-2; porcine circovirus 2)은, 이유자돈 전신성소모성증후군(Postweaning multisystemic wasting syndrome; PMWS)의 중요한 원인체로 밝혀진 바이러스이다. 돼지 써코바이러스의 피해를 예방할 수 있는 백신개발이 어려운 이유는 동물세포를 이용한 백신생산에 비교적 단가가 비싼 배양배지 및 동물세포배양기 등이 필요하고, 혈청배지에 포함된 다양한 이종단백질로 인하여 백신 접종시 이들에 의한 부작용이 발생할 가능성이 상존하고 있기 때문이다.

PCV2 관련 백신은 PCV2a 바이러스주의 ORF2 항원을 사용하여 4종류가 국제 시장에 출시되어 있다. 국외의 경우 기술적으로 가장 우위에 있는 기업은 프랑스의 메리알(Merial)로써 PCV에 관련된 많은 특허를 출원 등록한 상태이며 불활성화된 PCV2 전백신(whole virus)을 사용하고 있다(Circovac). 베링거 인겔하임(Boehringer-ingelheim)사의 경우에는 베큘로바이러스(Baculovirus)에 ORF2를 발현하여 그 재조합 단백질을 이용한 백신(Circumvent PCV 및 Ciroflex)을 상품화하였으며, 정제과정을 거쳐서 1ml씩 1회 접종하는 장점을 가지고 있다. 인터벳(Intervet)사 역시 베큐로바이러스에 ORF2를 발현하여 정제된 재조합단백질을 이용한 백신을 개발하였으며 자돈에 3주 간격으로 2ml로 2회 접종하는 접종방법으로 설계되었다. 포트닷지사는 PCV-1 바이러스에 PCV2의 ORF2을 발현하여 키메라 백신(Chimera vaccine)을 개발하였으며, 자돈에 2ml 1회 접종 적용방법으로 상품화하였다.

바이러스 서브유닛 재조합 백신의 경우 바이러스 유사입자(Virus-like particle, VLP) 형성이 항원성을 증가시키는 것으로 알려져 있으며, 효모의 경우 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae) 균주에서 오래 전부터 알려져 온 레트로트랜스포손 구성요소(retrotransposon element)인 Ty1을 이용하는 기술이 개발되어 왔다. Ty1은 레트로바이러스 뉴클레오캡시드/코어(core)와 유전학적, 구조적 및 기능적으로 유사하다. Ty1을 응용한 백신은 1987년에 보고된 바 있고 백신 후보 유전자를 Ty1 유전자의 3' 부분에 융합하여 발현하였을 때 바이러스 유사입자 형성에 지장이 없으며 별다른 다른 인자가 필요하지 않고 세포 내에서 바이러스 유사입자를 형성할 수 있다는 장점이 있다. 효모에서 백신을 생산하는 경우 효모 세포벽 성분이 항원보조제 역할을 겸할 수 있다는 여러 보고가 있다(Chan GC, Chan WK, Sze DM. 2009, The effects of beta-glucan on human immune and cancer cells. J Hematol Oncol 2: 25.).

효모 세포 내에 발현된 항원을 세포로부터 추출하여 얻기 위해 세포를 파쇄하는 경우, 세포 파쇄액을 제조한 후에 바이러스 유사입자 등의 항원이 안정적으로 용액상으로 유지되기가 어려운 것으로 알려지고 있으며 바이러스 유사입자가 응집체를 형성하여 침전되는 것을 방지하기 위한 여러 가지 첨가제(예, polysorbate 20 등의 계면활성제, sucrose나 trehalose, sorbitol 등의 당류 등)가 요구될 수 있다(Lang R, Winter G, Vogt L, Zuercher A, Dorigo B, Schimmele B (2009)). 이러한 단점을 극복하기 위해 개발된 효모 전세포(yeast whole cell)를 이용한 재조합 백신은 1개 이상의 항원 발현이 가능하며 안전성이 높고 대량생산이 용이하다는 효모의 장점을 활용할 수 있다.

본 발명에서는 돼지 써코바이러스 항원 ORF2를 발현하는 효모 전세포 백신(yeast whole cell vaccine)의 면역원성이 매우 우수함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 2형 돼지 써코바이러스(porine circovirus type II) 캡시드 단백질을 암호화하는 유전자 ORF2를 포함하는 재조합 벡터를 발현시킨 효모 전세포(yeast whole cell) 또는 이의 파쇄물 및 이를 포함하는 돼지 써코바이러스 백신 조성물과 이의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 구현예에서, 2형 돼지 써코바이러스(porine circovirus type II) 캡시드 단백질 ORF2를 포함하는 돼지 써코바이러스 백신용 효모 전세포(Yeast whole cell)를 제공한다. 상기 구현예에서, 상기 유전자 ORF2는 서열번호 1을 암호화하는 유전자일 수 있다. 상기 효모는 숙주 세포로써 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주일 수 있으며 그 중에서도 Y2805 균주일 수 있다. 또한, 상기 효모 전세포는 열-불활성화 또는 포르말린-불활성화될 수 있다.

본 발명의 일 구현예는 2형 돼지 써코바이러스(porine circovirus type II) 캡시드 단백질 ORF2를 포함하는 돼지 써코바이러스 백신용 효모 전세포의 파쇄물을 제공한다. 상기 유전자 ORF2는 서열번호 1을 암호화하는 유전자일 수 있다. 상기 효모는 숙주 세포로써 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주일 수 있으며 그 중에서도 Y2805 균주일 수 있다. 또한, 상기 효모 전세포는 열-불활성화 또는 포르말린-불활성화될 수 있으며, 이의 파쇄물은 열-불활성된 또는 포르말린-불활성화된 효모 전세포로부터 유래한 것일 수 있다.

본 발명의 일 구현예는 2형 돼지 써코바이러스(porine circovirus type II) 캡시드 단백질 ORF2를 포함하는 효모 전세포 또는 이의 파쇄물을 포함하는 돼지 써코바이러스 백신용 조성물을 제공한다. 상기 구현예에서, 상기 유전자 ORF2는 서열번호 1을 암호화하는 유전자인 것을 특징으로 하고, 상기 ORF2는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩타이드임을 특징으로 한다. 또한, 상기 효모는 숙주 세포로써 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주일 수 있고, 그 중에서도 Y2805 균주일 수 있으며 gal 80 유전자가 결손된 것일 수 있다. 또한, 상기 효모 전세포는 열-불활성화 또는 포르말린-불활성화된 것일 수 있다. 본 발명에 따른 백신용 조성물은 4x10⁹ 이하의 상기 효모 전세포를 사용할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 2형 돼지 써코바이러스(porine circovirus type II) 캡시드 단백질을 암호화하는 유전자 ORF2를 포함하는 재조합 발현 벡터를 준비하는 단계; 및 상기 재조합 백터를 효모에 형질전환시키는 단계를 포함하는 돼지 써코바이러스 백신용 형질전환 효모 전세포 및 이의 파쇄물을 제조하는 방법을 제공한다. 상기 구현예에서, 상기 유전자 ORF2는 서열번호 1을 암호화하는 유전자일 수 있다. 상기 효모는 숙주 세포로써 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주일 수 있고, 그 중에서도 Y2805일 수 있으며, 상기 Y2805 균주는 gal 80 유전자가 결손것일 수 있다. 본 일 구현예에 따른 제조 방법에 있어서, 재조합 발현 벡터는 GAL10 프로모터를 포함할 수 있고, 이에 따라 상기 ORF2는 Ty1과 융합하여 발현이 증가될 수 있다. 또한, 상기 효모 전세포는 추가로 열-불활성화되거나 포르말린-불활성화될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 2형 돼지 써코바이러스(porine circovirus type II) 캡시드 단백질 ORF2를 포함하는 효모 전세포를 포함하는 돼지 써코바이러스 백신용 조성물 또는 이의 파쇄물을 포함하는 백신조성물을 돼지에 투여하여 백신화시키는 방법을 제공한다. 상기 구현예에서, 상기 ORF2는 서열번호 1로 표시되는 유전자에 의해 암호화될 수 있으며, 상기 ORF2는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩타이드일 수 있다. 상기 효모는 숙주세포로써 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주를 사용할 수 있으며, 상기 균주는 Y2805 균주일 수 있고, gal 80 유전자가 결손된 것일 수 있다. 본 일 구현예에 따른 제조 방법에 있어서, 상기 재조합 발현 벡터는 GAL10 프로모터를 포함할 수 있고, 이에 따라 상기 ORF2는 Ty1과 융합하여 발현이 증가될 수 있다.

본 발명에 따른 백신은 당업자에게 공지된 기술에 따라 불활화 또는 불활성화될 수 있다. 불활성화는, 이에 한정하지 않지만 화학적 루트, 예컨대 항원을 포름알데히드(포르말린), 파라포름알데히드, 베타-프로피올락톤 또는 에틸렌이민 또는 이의 유도체와 같은 화학제에 노출시켜 실시한다.

본 발명에서, "형질전환체"는 외래 DNA, 예를 들면 플라스미드 또는 하이브리드 DNA를 세포 내로 도입시킨 후에 그 세포 내에서 상기 DNA가 복제되고 발현되는 세포체를 의미한다. 효모에서의 외래 DNA를 포함하는 플라스미드 형질전환은 리튬 아세테이트 방법(Nucleic Acids Research 19,5791(1991))에 따라 실시한다.

본 발명에서, "클로닝"이란 유전자에 제한효소 인식부위를 새로이 형성하기 위한 PCR 기법을 통해 유전자를 플라스미드를 포함하는 전달체에 삽입 또는 제거하는 일련의 과정을 의미한다.

본 발명에서, "백신화"란 특정 질병에 대한 치료제로 사용할 수 있도록, 예를 들어 단백질 또는 항원 같은 유효성분이 체내에 주입되어 면역반응을 유발하여 메모리 B세포를 생성시키고, 추후 동일한 항원에 대하여 신속한 면역반응을 유도하는 과정을 말한다.

본 발명에서, "세포 파쇄"란 세포 내용물을 방출시키기 위해, 예를 들어 비드와 세포를 교반하는 과정처럼 세포막 또는 세포벽을 파괴하는 과정이고, "세포 파쇄물"이란 세포를 파쇄시켜서 세포내 및 세포외 물질이 혼합되어 있는 것을 의미한다.

본 발명의 '이유자돈 전신성소모성증후군(PMWS)'이란, 이유자돈에서의 소모성 증상을 특징으로 하는 돼지의 질병으로, 캐나다, 미국, 북 아일랜드, 유럽, 한국, 일본, 대만 등의 국가에서 보고되고 있다. '전신성소모성증후군(PMWS)'에 걸리면 이유자돈에서 폐사나 위축, 증체량의 감소를 초래하며, 보통 6개월에서 1년간 지속되기 때문에 매우 심각한 경제적 피해를 가져오게 된다. 실제 국내에서는 1997년 첫 발병 보고 후 2007년 연간 약 600만두가 폐사하는 등, 양돈농가가 약 2조원의 손실을 감수하고 있는 것으로 나타났다(한국농촌경제연구원).

본 발명의 "효모"는 특히 인체에 안전하다고 알려진 GRAS(generally regarded as safe) 균주로써, 효모발현시스템을 이용한 백신 생산시 혈청배지를 사용하지 않아도 되고, 비싼 동물세포배양기 대신 미생물 발효조를 이용할 수 있으며, 동물세포대비 단백질 발현양도 비교적 높은 편이다. 동물세포 대신 효모를 이용한 백신생산 시 균체 성장속도 및 단백질 발현양 증가로 인한 생산성 향상, 값비싼 배지 및 동물세포배양기 미사용으로 인한 생산비 감축 및 혈청배지 미사용으로 인한 백신의 안전성 및 안정성 향상 등의 장점이 있다. 특히, 효모 전세포을 사용하여 추가의 면역반응을 유발할 수 있으며 효모 세포벽이 항원 보조제 역할을 겸함으로써 면역반응 유발을 증진시킬 수 있다.

본 발명의 효모 전세포는 백신조성물로써 뛰어난 효과가 있을 뿐만 아니라, 효모의 다양한 장점 및 재조합 미생물을 사용한 돼지 써코바이러스 백신 제조 과정에서 피할 수 없었던 세포파쇄나 항원 추출, 정제, 안정화 등 백신 제조 공정을 획기적으로 단순화시킬 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 ADH1 프로모터 또는 GAL10 프로모터를 포함하는 ORF2를 발현하는 재조합 벡터를 도시한 것이다.

도 2는 상기 재조합 벡터에서 Ty1과 ORF2의 융합 발현 벡터를 도시한 것이다.

도 3은 도 1 및 도 2의 ORF2 발현 벡터를 효모 숙주 Y2805 내에서의 발현을 나타내는 웨스턴 블롯 결과이다.

도 4는 셀룰로오스 결합 도메인(CBD)을 상기 벡터로 융합시킨 발현 벡터를 도시한 것이다.

도 5는 도 4의 벡터를 발현시켜 웨스턴 블롯 분석한 결과이다.

도 6은 도 1 및 도 2의 벡터와 히스티딘-태그(His-tag)를 제거한 ORF2를 발현시켜 초원심분리한 분획의 전기영동 및 웨스턴 블롯과 바이러스 유사 입자(VLP) 형성 유무를 전자현미경으로 관찰한 결과이다.

도 7은 ORF2 또는 NLS를 제거한 ORF2에 사카로마이세스 세레비지애의 MFα를 융합시킨 벡터를 나타낸 것이다.

도 8은 도 7의 벡터를 발현시켜 웨스턴 블롯 분석한 결과이다.

도 9는 다양한 숙주세포에 따른 ORF2 발현양의 차이를 분석한 웨스턴 블롯 결과이다.

도 10은 숙주세포 Y2805 및 BY4741과 각각의 gal 80 결손주를 사용하고 GAL10 프로모터와 ADH1 프로모터를 사용하여 ORF2를 발현시켜 웨스턴 블롯 분석한 결과이다.

도 11은 표 5를 실험하여 얻은 균체의 성장결과이다.

도 12는 표 6을 실험하여 얻은 T/C 값(접종군 평균/대조군 평균)을 나타낸 것이다.

도 13은 표 8을 실험하여 얻은 결과를 나타낸 그래프이다.

도 14는 표 10을 실험하여 얻은 결과를 나타낸 그래프이다.

이하, 비제한적인 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 이들 실시예에 의하여 본 발명의 범위가 국한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야 및 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 사카로마이세스 세레비지애 균주에서 PCV 2형의 ORF2 발현을 통한 바이러스 유사 입자의 제조

1-1 사카로마이세스 세레비지애 균주에서 PCV 2형의 ORF2 발현을 위한 벡터구축 및 발현 확인

효모 사카로마이세스 세레비지애 균주에서 효율적으로 발현하기 위해 효모 코돈에 적합하도록 변경한 ORF2 서열을 바이오니아(Bioneer)사에서 인공합성(서열번호 1) 하였다. 합성한 유전자는 효모 발현 벡터인 YEGα-HIR525에 클로닝하였다. 프로모터는 GAL10과 ADH1 두 가지를 사용하였고, ORF2가 발현되는 것을 확인하기 위해 C-말단에 6개의 히스티딘 표지를 첨가하였다. GAL10 프로모터의 경우, 5‘과 3’ 말단에 제한효소 EcoRI과 SalI 인식부위를 가지도록 프라이머(표 1)를 제작하고, 동일한 제한효소로 절단한 발현벡터 YEGα-HIR525에 삽입하였다. 이렇게 구축된 벡터를 SmaI과 EcoRI으로 잘라 GAL10 프로모터를 제거하고 이 위치에 ADH1 프로모터를 삽입하였으며, 사용한 프라이머는 하기의 표 1에 표시하였다. 상기 재조합 발현벡터(도 1)를 사카로마이세스 세레비지애 Y2805균주에 리튬/아세테이트(lithium/acetate) 방법을 이용하여 형질전환하였고, UD (yeast nitrogen base 6.7g/L, uracil dropout supplement 0.77g/L, 글루코스 20g/L) 플레이트에서 배양한 후 PCR을 통해 형질전환체(transformant)를 선별하였다.

표 1

발현 확인을 위한 히스티딘 표지뿐만 아니라, 바이러스 서브유닛 재조합 백신의 경우 바이러스 유사입자 형성이 항원성을 증가시키는 것으로 알려져 있으며 효모의 경우 사카로마이세스 세레비지애 균주에서 오래 전부터 알려져 온 레트로트랜스포손 구성요소인 Ty1을 이용하는 기술이 개발되어 왔다. Ty1은 레트로바이러스 뉴클레오캡시드/코어(core)와 유전학적, 구조적 및 기능적으로 유사한 점을 특징으로 하며 백신 개발에 대한 응용은 1987년에 보고된 바 있고 백신 후보 유전자를 Ty1 유전자의 3' 말단 부분에 융합하여 발현하였을 때 바이러스 유사입자 형성에 지장이 없으며 다른 인자의 존재를 요구하지 않고 세포 내에서 바이러스 유사입자를 형성하는 커다란 장점을 가지는 것으로 알려져 있다. 따라서, ORF2의 바이러스 유사입자 형성을 도와 줄 것으로 예상하고 Ty1(서열번호 3 및 4)과 ORF2를 융합발현 하였다. 이 때 ORF2의 색 위치 신호(Nuclear Localization Signal: NLS) 서열은 제거하고 융합하였다. Y2805 유래의 Ty1와 NLS를 제거한 ORF2를 각각 PCR로 증폭한 뒤 오버랩(overlap) PCR을 통해서 두 단편을 연결하였다. PCR에 사용한 프라이머는 하기의 표 2와 같고, YEGa-HIR525의 EcoRI, SalI 위치에 삽입하였다.

표 2

또한, 사카로마이세스 세레비지애 Y2805 균주에 리튬/아세테이트 방법을 이용하여 재조합 발현벡터(도 2)를 형질전환 하였고, UD(yeast nitrogen base 6.7g/L, uracil dropout supplement 0.77g/L, 글루코스 20g/L) 플레이트에서 배양한 후 PCR을 통해 형질전환체를 선별하였다.

Y2805내에서 ORF2가 효율적으로 발현되는지를 확인하기 위해 배양 후 웨스턴 블롯 분석을 실시하였다. 대장균은 LB 배지(1% 펩톤, 0.5% 효모추출물, 1% 염화나트륨)에 접종하여 37℃에서 16시간 배양하였고, 효모는 UD 액체배지 2 ㎖에 단일 집락을 접종하고, 30℃, 180rpm에서 초기 배양한 후, 본 배양을 수행하였다. 본 배양은 YP(Glu1% Gal1%) 배지(2% 펩톤, 1% 효모추출물, 1% 글루코스, 1% 갈락토스)를 250㎖ 배플 플라스크에 25㎖씩 분주한 뒤, 초기 배양한 균주를 OD₆₀₀이 0.1이 되도록 접종하였고, 30℃, 180rpm에서 교반하면서 48시간 배양하였다. 배양액은 13,000rpm에서 3분간 원심 분리하여 상등액은 제거하고, 50mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.0)을 배양액 부피의 1/4만큼 넣어 세포를 풀어준 뒤 같은 부피의 비드(425-600μm)를 첨가하여 5분간 교반(vortexing)함으로써 세포를 파쇄하였다. 세포파쇄 후 13,000rpm에서 3분간 원심분리하여 파쇄되지 않은 세포와 세포파편을 제거하고 상등액에 SDS-PAGE 로딩 다이(loading dye)를 첨가하여 100℃에서 5분간 중탕하였다. 얼음에 박아 잠시 식힌 후 4-20% 농도구배 겔(gradient gel)에 로딩하고 80V에서 전기영동을 실시하였다. Trans-Bolt^TM Turbo(Bio-Rad)를 이용하여 나이트로셀룰로스 멤브레인에 반-건조법으로 단백질을 옮기고 TBS-T 완충액(20mM Tris-HCl pH8.0, 137mM NaCl, Tween 20 0.1%)에 탈지 분유를 5%로 첨가하여 1시간 동안 블로킹(blocking)하였다. 1차 항체를 1-2시간 정도 반응시키고 TBS-T 완충액으로 멤브레인을 씻은(5-10분씩 3회) 뒤 2차 항체를 넣어 1시간 반응시킨다. 그리고 2차 항체에 결합된 AP(alkaline phosphatase)의 기질로 BCIP/NBT 퍼플 리퀴드(Purple liquid, Sigma)를 첨가하고 5-10분 정도 반응시켜 항체가 결합된 부위가 보라색 밴드로 나타나는 것을 관찰하였다. 발현 확인을 위해 히스티딘 표지를 붙였으므로, 1차 항체로 항-His 태그 래빗 폴리클로날 IgG(rabbit polyclonal IgG, Santa Cruz Biotechnology) 및 2차 항체로 고우트 항-래빗 IgG-알칼라인 포스파타아제(goat anti-Rabbit IgG-alkaline phosphatase, Sigma)를 사용하였으며, 또한, PCV2에 면역화된 기니피그 혈청을 1차 항체로 하여 ORF2가 검출이 되는지 확인하였다. 이 경우는 2차 항체로 고우트 항-기니아 피그 IgG-AP(goat anti-guinea pig IgG-AP, Santa Cruz Biotechnology)를 사용하였다. 웨스턴 블롯 분석 결과를 도 3에 나타내었다. 대장균의 경우 GAL10 프로모터를 사용하는 경우 ORF2가 약하게 발현되는 것이 확인되었지만, ADH1의 경우는 발현이 되지 않았다. 반면, Y2805에서는 두 경우 모두 ORF2가 발현되었고 GAL10 프로모터가 ADH1 프로모터보다 발현양이 많은 것을 관찰할 수 있다. 그리고 Ty1과 융합 발현한 ORF2의 경우 상당히 많은 양의 단백질이 발현되는 것을 확인하였다.

실시예 1-2: 셀룰로오스 결합 도메인(Cellulose binding domain)과 ORF2의 융합발현 및 확인

셀룰로오스 결합 도메인(Cellulose binding domain, CBD)은 다른 단백질과 융합 발현하였을 때 세포 내에서 불용성의 입자를 형성할 수 있는 것으로 알려져 있어 이를 이용하여 바이러스 유사입자와 유사한 기능을 기대하고 융합발현을 시도하였다. 셀룰로오스 결합 도메인(CBD)과 융합발현 하는 경우 α-아밀라제의 신호서열을 가짐으로써 세포 외로 분비되는 경우(SS-CBD)와 그렇지 않은 경우(CBD)로 나누어 융합발현을 시도하였다. 이 때 ORF2 유전자는 핵 위치 신호(nuclear localization signal: NLS)를 포함하지 않도록 하였다. CBD와 ORF2를 각각 증폭시킨 후 오버랩 PCR로 연결시키고, YEGa-HIR525의 EcoRI, SalI 위치에 삽입하였다. 사용한 프라이머는 하기의 표 3과 같으며, 구축된 플라스미드(도 4)는 위에서 언급한 방법으로 Y2805에 형질전환하였다.

표 3

GAL10 프로모터를 포함한 플라스미드는 YP(Glu1% Gal1%) 배지에, ADH1 프로모터를 포함한 플라스미드는 YP(Glu 2%) 배지에 접종하여 30℃에서 48시간 배양하였고, 신호 서열을 포함한 Y2805는 무세포 추출물(cell free extract)과 배양 상등액(supernatant) 또한 웨스턴 블롯을 실시하였다. 항체는 항-His 태그 항체를 사용하였다. 신호 서열을 포함하는 경우는 세포 내외에서 모두 발현이 되지 않아 세포 내 발현만이 가능함을 알 수 있었다(도 5). 반면 신호 서열을 포함하지 않는 경우는 GAL10 프로모터와 ADH1 프로모터 모두 발현이 관찰되었으며, GAL10 프로모터가 효모발현에 있어 더 적합한 것으로 나타났다.

실시예 1-3: 사카로마이세스 세레비지애 균주에서 발현된 ORF2의 바이러스 유사입자 형성 관찰

다양하게 제조된 ORF2 발현 카세트 중에서 웨스턴 블롯을 통해 발현이 효과적으로 잘 되는 것으로 보이는 세 가지 효모 균주를 선별하였다. 또한 히스티딘 태그를 가지지 않는 ORF2만을 발현하는 플라스미드 pGAL10-ORF2를 실시예 1-1의 방법대로 제조하였다. 이렇게 제조한 네가지 종류의 pGAL10-ORF2, pGAL10-ORF2-His, pGAL10-Ty1-ORF2(-NLS), pGAL-CBD-ORF2(-NLS)-His 플라스미드를 갖는 Y2805를 YPDG에서 30℃, 180rpm으로 48시간 배양하였다. 13,000rpm으로 10분간 원심분리 하여 세포를 회수하고, TEN 완충액(10mM Tris-HCl pH7.4, 2mM EDTA, 140mM NaCl)와 비드(beads)를 첨가한 후 약 10분간 교반하여 세포를 파쇄하였다. 파쇄액은 13,000rpm 및 4℃에서 20분간 원심분리 하여 상등액을 취하고 이를 초원심분리에 사용하였다. 초원심분리는 TEN 완충액에 15, 25, 35, 45, 60%의 수크로즈 용액을 만들고 원심분리 튜브에 낮은 농도의 수크로즈 용액부터 차례로 오버래이(overlay)하여 넣어 줌으로써 수크로즈 농도구배를 형성하였다. 원심분리 튜브의 상단에 위에서 준비한 무세포 추출물을 넣고, 36,000rpm에서 4시간 동안 원심분리하였다. 분리한 샘플은 튜브의 바닥에서부터 1.5ml씩 분획을 나누고 SDS-PAGE와 웨스턴 블롯을 실시하였다. 웨스턴 블롯에서 ORF2의 밴드만 관찰된 분획을 모으고 아미콘 한외여과용 필터(Amicon Ultra centrifugal filter, Millipore, 10K 멤브레인)를 이용하여 수크로즈를 제거하고 농축하여 전자현미경으로 관찰하였다. ORF2만 발현하는 경우 약 25nm 크기의 바이러스 유사입자가 형성되는 것을 관찰하였다(도 6). 반면에 히스티딘 표지가 존재하는 경우는 바이러스 유사입자가 형성되지 않는 것으로 보아 C-말단에 결합된 히스티딘 표지가 바이러스 유사입자 형성을 방해하는 것으로 추측된다. 바이러스 유사입자 형성에 도움을 줄 것으로 예상했던 Ty1 융합발현은 바이러스 유사입자 형성을 다소 방해하는 것으로 나타났다. CBD와 융합 발현한 경우는 His 태그가 존재하지만 바이러스 유사입자를 잘 형성하는 것으로 관찰되었다.

실시예 2: ORF2의 분비 발현 및 확인

재조합 서브유닛 백신의 경우 세포 외 분비발현이 가능하다면 세포파쇄가 필요 없고 정제가 용이한 장점이 있다. 전통적으로 대장균에 비하여 효모는 안전성 등 다른 여러 장점과 더불어 단백질 분비기구가 발달되어 있어 분비발현에 적합하다. 따라서 ORF2를 효모 균주에서 분비발현을 시도하였다.

대장균에서는 전체 유전자를 사용하여 발현시켰을 경우 발현율이 매우 저조하였으나 아미노 말단에 위치한 NLS 구역 47개 아미노산 서열이 입체배좌 에피토프 형성에 특별히 필요하지 않은 점을 이용하여 NLS-결핍 클론을 발현함으로써 발현율을 증진시키는 연구가 보고된 바 있다. ORF2의 분비를 위해 사카로마이세스 세레비지애의 교배 인자 알파(mating factor alpha, MFα)의 신호 서열을 이용하였고, ORF2 전체서열을 발현하는 경우와 NLS를 제거한 경우로 벡터를 구축하였다. 사용한 프라이머는 하기 표 4와 같고, 효모 코돈으로 최적화한 합성서열을 주형으로 하여 PCR로 증폭한 후 XbaI과 SalI으로 절단하여 YEGα-HIR525의 XbaI, SalI 자리에 삽입하였다. 구축된 벡터의 모식도는 도 7에 나타내었으며, 사카로마이세스 세레비지애 Y2805 균주에 리튬/아세테이트 방법을 이용하여 형질전환하였고, UD(yeast nitrogen base 6.7g/L, uracil dropout supplement 0.77g/L, 글루코스 20g/L) 플레이트에서 배양한 후 PCR을 통해 형질전환체를 선별하였다.

표 4

UD 액체배지에서 초기 배양한 뒤 YP(Glu1% Gal1%) 배지에서 48시간 본 배양을 하고, 항-His 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 분석을 실시하였다. MFα 분비 시그널이 존재하는 경우에는 NLS 존재 유무와 상관없이 배지로 분비되지 않을 뿐만 아니라 세포 내부에서도 발현되지 않았다(도 8). 그리고 NLS가 없는 경우 ORF2의 발현양이 상당히 증가한다는 사실을 확인할 수 있다.

실시예 3. 사카로마이세스 세레비지애 균주에서 ORF2 발현을 위한 균주 선별

실시예 1-1에서 발현율이 우수한 것으로 나타난 GAL10프로모터를 이용하여 추가적으로 재조합 발현에 많이 사용되고 있는 다양한 사카로마이세스 세레비지애 균주에 ORF2를 도입하고 발현양을 비교해 보았다. 발현 벡터는 실시예 1-3에서 구축한 pGAL10-ORF2를 사용하였으며 사카로마이세스 세레비지애 Y2805와 비교하기 위해 사용한 균주는 INV Sc1, ATCC200589, BY4741, L3262, ATCC201228, ATCC201741 이다. 형질전환과 배양 방법은 상기 기술한 것과 동일하게 수행하였고, 동일한 양의 시료를 분석에 사용하여 웨스턴 블롯을 실시하였다. 분석 결과는 도 9와 같고, 1차원 광학 밀도 프로그램(optical density 1D program, UVIBand Max사)을 이용하여 ORF2의 발현양을 비교 분석하였다. ATCC200589 균주에서는 ORF2가 발현되지 않았으며 ATCC201228 또한 발현양이 미미하였다. 나머지 균주들은 Y2805 균주에서 발현된 ORF2의 양을 100으로 하여 비교하였을 때, INV Sc1은 19.7%, BY4741은 15.0%, L3262는 40.0%로 나타났으며 ATCC201741은 20.4%인 것으로 관찰되었다. 이와 같이 균주별로 ORF2의 발현양이 상당히 차이가 큼을 알 수 있었고 Y2805균주가 가장 우수한 것으로 나타났다.

상기 실시예에서 발현율이 우수하였던 GAL10 프로모터의 경우 갈락토스 유발 프로모터로서 최적발현을 위해서는 배지 내에 글루코스가 존재하지 않아야 하는 조건과 갈락토스가 존재하여야 하는 조건을 모두 만족시켜야 하는데 갈락토스는 글루코스에 비하여 매우 비싼 탄소원이다. 본 발명자들은 값 비싼 갈락토스의 첨가 없이 글루코스만 사용하여도 GAL10 프로모터를 발현시킬 수 있는 사카로마이세스 세레비지애 gal 80 결손주를 이용하여 재조합 단백질을 경제적으로 생산할 수 있는 방법을 개발한 바 있다(이스트 GAL80 결핍주를 이용한 재조합 단백질의 생산 방법 국내등록 특허 제10-0947376호, 2010.3.5.).

gal 80 결손주에서 ORF2의 발현 양상을 조사하기 위해서, 위에서 가장 발현율이 우수했던 사카로마이세스 세레비지애 Y2805, Y2805 △gal80, 및 발현율이 저조했던 BY4741, BY4741 △gal80 균주에 실시예 1-3에서 구축한 pGAL10-ORF2를 사용하여 리튬/아세테이트 방법을 이용하여 형질전환하였고, UD(yeast nitrogen base 6.7g/L, uracil dropout supplement 0.77g/L, 글루코스 20g/L) 플레이트에서 배양한 후 PCR을 통해 형질전환체를 선별하였다. 효모는 UD액체배지 2㎖에 단일집락을 접종하고, 30℃, 180rpm에서 초기 배양한 후, 본 배양을 수행하였다. 본 배양은 Y2805와 BY4741의 경우는 YP(Glu1% Gal1%) 배지(2% 펩톤, 1% 효모추출물, 1% 글루코스, 1% 갈락토스), Y2805 △gal80, BY4741 △gal80의 경우는 YP(Glu2%)를 250㎖ 배플 플라스크에 25㎖씩 분주한 뒤, 초기 배양한 균주를 OD₆₀₀가 0.1이 되도록 접종하였고, 30℃, 180rpm에서 교반하면서 48시간 배양하였다. 웨스턴 블롯 방법은 상기 기술한 것과 동일하며, 분석 결과는 도 10과 같다. 네 균주의 경우 모두 ORF2가 발현되었지만 BY4741균주보다는 Y2805균주에서, 그리고 ADH1 프로모터보다 GAL10 프로모터가 ORF2 발현양이 월등히 많은 것을 관찰할 수 있었다(도 10).

실시예 4. ORF2를 발현하는 재조합 사카로마이세스 세레비지애 균주의 발효조를 사용한 발효 배양

써코바이러스 백신의 목적 동물인 돼지를 사용한 동물시험을 위해 ORF2를 발현하는 재조합 효모균주를 발효 배양하였다. 위의 실시 예에서 가장 우수한 것으로 나타난 유전자발현 플라스미드/효모숙주세포 조합인 pGAL10-ORF2/Y2805 △gal80 균주를 사용하여 5L 발효기에서 유가식 배양을 하였다. 하기 표 5는 상기 유가식 배양 시 사용된 배지 조성을 나타낸 것이다.

표 5

유가식 배양은 24% 암모니아수를 이용하여 pH를 6.0으로, 배양 중에 온도는 30℃로 유지시켰다. 균체의 성장은 점차적으로 증가하여 OD600이 71까지 도달하였다(도 11). 배양 후 세포를 회수한 후 균질기(Homogenizer)를 이용하여, 1,000 bar에서 4회 세포파쇄를 수행하였고 실시예 1에 기술한 방법에 준하여 세포파쇄액을 준비하였다.

실시예 5. 면역원성 조사

실시예 5-1. 사카로마이세스 세레비지애 균주에서 발현된 ORF2의 다양한 제제 형태 시험백신 제조 및 기니피그를 이용한 면역원성 조사

사카로마이세스 세레비지애 균주에서 발현시킨 ORF2가 항원으로서 역할을 할 수 있는지 평가하기 위하여 기니피그에 접종하여 항체가 생성되는지를 확인하였다. 이 때 세포파쇄 유무, 정제를 위한 히스티딘 표지의 유무 또는 NLS 포함 여부 등 유전자 조작에 따른 비교 평가를 하였다. 특히 세포벽 파쇄가 어려운 효모의 단점을 극복하기 위해서, 재조합 단백질을 발현하는 효모 균주를 파쇄하지 않고 효모 전세포를 항원으로 즉시 사용 가능한지 알아보기 위하여 ORF2가 발현되는 것을 확인한 효모 균주를 파쇄하지 않고 전세포를 열-불활성화 처리구와 포르말린-불활성화 처리구로 나누어 시험백신을 제조하였다.

ORF2를 발현하는 Y2805 △gal80 균주를 실시예 1에서 서술한 바와 같이 배양하고 원심분리 후 얻은 균체(whole yeast cell)를 OD₆₀₀ 값을 토대로 균수를 추정 (1 OD = 2x10⁷/ml)하여 2x10⁹/ml이 접종될 수 있도록 균체 농도를 맞추어 시험백신을 제작하였으며 효모 균체의 불활성화를 위하여 두 가지 방법을 사용하였다. 먼저 열-불활성화는 균체를 60℃에서 2 시간 처리 후 -20℃에서 보관하여 사용하였고, 포르말린-불활성화는 0.2% 포르말린 농도로 실온에서 72시간 처리 후 균체를 배지에 도말하여 효모가 자라지 않는 것을 확인한 후 사용하였다.

또한, 세포 내에 발현된 ORF2를 균체로부터 얻기 위하여 실시예 1에서 기술한 바와 같은 방법으로 세포를 파쇄하여 세포파쇄액을 제조하였다. ORF2 세포파쇄액(ORF2 세포파쇄물), 세포파쇄액을 0.2 마이크론 멤브레인 필터로 세포 찌꺼기를 제거한 경우 (ORF2 (MF)), ORF2의 아미노말단 47개 아미노산 NLS 서열을 제거한 경우 (ORF2(-NLS)), 그리고 ORF2의 카르복시 말단에 히스티딘-표지되어 있는 경우 (ORF2(+His))의 4가지 시험백신도 제조하였다. 제조한 시험 백신의 종류와 접종량 및 항원보조제를 포함하는 백신 조성 등 시험백신 생산내역은 하기의 표 6에 표시하였다.

표 6

해당 항원 후보들을 이용하여 상업적으로 사용되고 있는 PCV2 백신 CircoFLEX(베링거 인겔하임)를 양성대조군으로 하여 면역원성을 조사하였다. 시험백신은 양성대조군 조성과 동일하게 조합하여 시험백신을 제작하였고, 제작한 시험백신으로 기니피그에 접종 후 채혈하여 혈청을 분리, 얻어진 혈청에 대하여 ELISA를 실시하여 면역원성을 비교하였다.

실험동물은 기니피그이며, 기니피그 당 1회 접종량은 1ml으로 조절하여 6종 시험백신 외에 베링거 인겔하임사의 CircoFLEX를 양성대조군으로, PBS를 음성대조군으로 추가적으로 실험하였다. 주입은 피하 주입으로 각 그룹당 8마리씩 접종하여 3주 후 혈액을 채혈하여 혈청 분리 및 56℃에서 30분간 비동화하여 ELISA를 수행하였다. ELISA는 항체 검출 샌드위치 간접 ELISA(Ab detection Sandwich indirect ELISA)로서 JBT사에서 구입한 단일클론 항체를 1㎍/ml로 맞추어 사용하였고 PCV2 ORF2 항원은 베링거 인겔하임사에서 구입한 원액을 20배 희석하여 사용하였고 혈청 시료는 50배 희석하여 사용하였다. PCV2 특이 항체 코팅은 37℃에서 2시간, 블로킹은 37℃에서 2시간, PCV2 항원 코팅(coating)은 37℃에서 1시간, 검체 반응은 37℃에서 1시간, 컨쥬게이트(conjugate) 반응은 37℃에서 1시간, 기질은 실온 암소 조건에서 10분간 반응시켰고 정지용액(Stop Solution)을 가한 후 O.D450 값을 측정하였다 (표 7).

표 7

표 7의 실험에서 얻은 결과인 T/C 값(접종군 평균/대조군 평균)을 도 12에 나타내었다. T/C 값이 2.0 이상일 때 양성 판정을 하게 되며 평균값을 비교한 결과 효모 전세포를 사용한 시험백신 1, 2, 및 효모 균체 파쇄 후 얻은 세포 벽을 포함하는 세포 파쇄액인 시험백신 3이 양성대조군과 거의 유사한 결과를 보여 재조합 백신 항원으로서 긍정적인 결과를 얻었다. 이러한 결과는 효모 전세포 성분이 항원 보조제와 같은 역할을 한다는 선행 연구 결과와도 일치한다. 전세포를 사용하는 경우 열-불활성화, 포르말린-불활성화 등 전처리 방법에 따른 면역원성 차이는 보이지 않았다. 멤브레인 필터로 세포찌꺼기를 제거한 MF의 경우 다소 낮은 면역원성은 접종량이 다소 낮은데 기인하는 것으로 보이며 히스티딘 표지된 융합 단백질을 항원으로 하는 시험백신의 경우 히스티딘-표지 융합에 따른 입체 장애에 의한 항체의 결합에 대한 영향이 있을 것으로 추정되었다. 한편 아미노말단 NLS가 결여된 ORF2(-NLS)경우는 면역원성에 커다란 영향을 미치지 않는다는 보고와 달리 음성의 결과 값을 보여 백신후보로서 적합하지 않은 것으로 나타났다.

실시예 5-2. 사카로마이세스 세레비지애 균주에서 발현된 ORF2의 목적동물 돼지 자돈을 사용한 면역원성 조사

써코바이러스 백신의 실제 목적동물인 돼지를 실험동물로 사용하여 PCV2 ORF2의 3가지 형태의 시험백신을 제조하여 면역원성을 조사하였다. 시험백신은 실시예 8의 5-1에 기술한 방법으로 준비한 재조합 효모 균체, 세포파쇄액 및 멤브레인 여과를 거친 세포파쇄액(MF)을 하기 표 8에 표시한 바와 같이 준비하여 접종하였다.

표 8

동물시험은 그룹별로 3두의 10~12주령 육성돈에 2㎖씩 1회 근육접종하여 6주간 실험하였고 양성대조군으로 CircoFLEX를 사용하여 1㎖ 근육접종 하였다. 모노 블로킹 ELISA(mono blocking ELISA, Synbiotics사) 방법으로 면역원성을 나타내는 S/P 값의 변화의 추이 결과는 표 9에 표시하였고 그 평균값을 도 13에 나타내었다. CircoFLEX와 유사한 추이를 보이고 있어 효모 발현 PCV ORF2는 백신으로서의 효력이 있다고 판단하였다. 특히 MF 처리를 거친 시험백신, 세포파쇄액, 전세포(whole cell)의 순서대로 항체가가 높아짐을 보였고 특히 전세포 백신의 경우에 가장 높은 항체가를 보였다.

표 9

실시예 6. 효모 전세포의 투여량 조사 및 백신보조제 무첨가(adjuvant-free) 가능성의 조사

효모의 경우 세포벽의 구성성분의 일종인 베타-글루칸이 면역반응을 활성화 시키는 보조제(adjuvant) 역할을 할 수 있는 것으로 알려져 있으므로 본 발명에서는 효모 전세포를 사용함으로써 보조제를 첨가하지 않은 상태로(adjuvant-free) 백신으로 사용이 가능한지 조사하였다. 특히 바이러스 유사입자를 형성하도록 도와주는 역할을 하는 것으로 알려진 Ty1이 융합된 형태의 ORF2(ORF2-Ty1)도 백신보조제 무첨가 형태로 사용이 가능한지 함께 조사하였다.

즉, ORF2를 생산하는 효모전세포를 백신보조제 첨가구와 무첨가구으로 나누고 ORF2-Ty1 융합발현 균주 전세포는 백신 무첨가로 하여 아래 표 10과 같이 시험백신을 제조하고 실험동물인 기니피그에 접종하여 얻은 혈청으로 ELISA를 수행하여 각 백신의 면역원성을 평가하였다.

표 10

먼저 백신보조제 첨가의 경우 기존 투여량보다 투여량을 낮추어 가며 면역원성이 유지되는지 조사하였다. 앞서 동물실험에서 시험한 전세포의 균수는 2X10⁹/㎖ 이며, 이를 기준으로 하여 10배, 100배 희석하여 각각 2x10⁸/㎖, 2x10⁷/㎖를 시험하였다. 백신 보조제를 첨가하지 않는 군의 경우 전세포의 균수는 기존과 같이 2X10⁹/㎖를 시험하였다. 효모 전세포의 불활화는 포르말린을 0.2% 실온에서 일주일간 처리하였다. 백신 보조제로는 수산화 알루미늄 겔을 20%의 농도로 사용하였다.

동물시험은 기니피그로 하여, 기니피그당 1회 접종량은 1㎖으로 조절하여 5종의 시험백신 외에 베링거 인겔하임(Boehringer Ingelheim)사의 CircoFLEX를 양성대조군으로, 무접종 군을 음성대조군으로 추가적으로 실험하였다. 전체 7 그룹이며, 각 그룹당 10 마리로하여 근육주사로 접종하고 5 마리는 3 주차 채혈하고, 나머지 5 마리는 5 주차에 채혈하였다. 채혈한 혈액은 혈청 분리 및 56℃에서 30 분간 비동화하여 ELISA를 수행하였다. ELISA는 항체 검출 샌드위치 간접 ELISA(Ab detection sandwich indirect ELISA) 방법으로 수행하여 그 결과를 아래 표 11 및 표 12와 도 14에 표시하였다.

표 11

표 12

항체 검출 샌드위치 간접 ELISA 방식으로 혈청시험한 결과, PCV ORF2가 발현된 효모 전세포의 백신보조제 첨가 그룹(vac 1 ~ vac 3)에서는 투여 항원량 2x10⁷ - 2x10⁹ 세포(cfu) 범위 내에서 항원량에 따른 차이가 없이 양성대조군과 동등 또는 그 이상의 우수한 수준의 양성 T/C 값을 보였다. PCV ORF2가 발현된 효모 전세포의 백신보조제 무첨가(adjuvant-free) 그룹 (vac 4)에서도 양성대조군과 거의 동등한 수준의 면역원성을 보였으며 2x10⁹ 세포 이하의 투여량에서도 면역원성을 유지할 가능성을 조사해 볼 필요가 있는 것으로 판단되었다.

따라서 PCV2 ORF2를 발현하는 효모의 전세포를 백신으로 사용함에 있어서 백신 보조제를 첨가하는 경우 최소 2x10⁷ 세포 이상의 항원량을 투여하면 백신으로서의 효능이 나타남을 알 수 있었다. 또한 별도의 백신보조제를 첨가 하지 않아도(adjuvant-free) 백신 효능을 나타냄을 확인할 수 있었다.

ORF2-Ty1을 융합발현 하는 효모전세포의 경우(vac 5)에도 2x10⁹ 세포 투여량 수준에서 다른 시험군과 비슷한 수준의 양성반응을 보였다.

서열목록

서열번호 1: 사카로마이세스 세레비지애 균주에서 효율적으로 발현하기 위해 효모 코돈에 적합하도록 변경한 ORF2 서열을 바이오니아(Bioneer)사에서 인공합성한 염기 서열

서열번호 2: 사카로마이세스 세레비지애 균주에서 효율적으로 발현하기 위해 효모 코돈에 적합하도록 변경한 ORF2의 아미노산 서열

서열번호 3: 사카로마이세스 세레비지애 균주에서 유래한 레트로트랜스포손 구성요소(retrotransposon element)인 Ty1의 염기서열

서열번호 4: 사카로마이세스 세레비지애 균주에서 유래한 레트로트랜스포손 구성요소(retrotransposon element)인 Ty1의 아미노산 서열

<110> Choon Ang Vaccine Lab. / Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology

<120> A porcine circovirus 2 vaccine using a recombinant yeast whole

cell and a method for manufacturing thereof

<130> 52669

<150> KR 13/0025823

<151> 2013-03-11

<160> 4

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 702

<212> DNA

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 1

atgacatatc cgcgtagacg ttacagaaga cgtagacaca gaccaaggtc gcatctgggc 60

caaatcctac gccgaagacc ttggcttgta caccccagac acagatacag atggcgtagg 120

aagaatggaa tattcaacac tagactatca aggacattcg gatacacaat aaaacggact 180

actgtgaaaa cgccctcttg ggctgttgat atgatgaggt ttaatataaa tgacttccta 240

cccccaggtg gaggttctaa cccaagaagt gttccatttg agtattatag aattagaaaa 300

gtcaaggttg agttctggcc ttgttcccca ataacgcaag gagatagagg tgtgggttct 360

tctgctgtaa ttttggacga caactttgtc actaaggcca cagctctcac ttatgaccct 420

tatgttaact actcctcaag acatactatc actcagccat tttcttacca tagcagatat 480

ttcaccccaa agcctgtctt agactccact attgattact ttcagcctaa taataaaaga 540

aatcaacttt ggctgcgatt gcaaaccact ggtaatgttg accatgttgg gttgggtacc 600

gcatttgaaa actctatata cgatcaagaa tacaacatta gggttacaat gtatgttcag 660

ttcagagaat ttaatttaaa agatccacct ttgaaccctt ag 702

<210> 2

<211> 233

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 2

Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg

1 5 10 15

Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro

20 25 30

Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg

35 40 45

Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Ile Lys Arg Thr Thr Val Lys Thr

50 55 60

Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asn Asp Phe Leu

65 70 75 80

Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Pro Arg Ser Val Pro Phe Glu Tyr Tyr

85 90 95

Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr

100 105 110

Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Ser Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn

115 120 125

Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr

130 135 140

Ser Ser Arg His Thr Ile Thr Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr

145 150 155 160

Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro

165 170 175

Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Thr Gly Asn

180 185 190

Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp

195 200 205

Gln Glu Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe

210 215 220

Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro

225 230

<210> 3

<211> 1323

<212> DNA

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 3

atggaatccc aacaattatc tcaacattca cccatttctc atggtagcgc ctgtgcttcg 60

gttacttcta aggaagtcca cacaaatcaa gatccgttag acgtttcagc ttccaaaaca 120

gaagaatgtg agaaggcttc cactaaggct aactctcaac agacaacaac acctgcttca 180

tcagctgttc cagagaaccc ccatcatgcc tctcctcaaa ctgctcagtc acattcacca 240

cagaatgggc cgtacccaca gcagtgcatg atgacccaaa accaagccaa tccatctggt 300

tggtcatttt acggacaccc atctatgatt ccgtatacac cttatcaaat gtcgcctatg 360

tactttccac ctgggccaca atcacagttt ccgcagtatc catcatcagt tggaacgcct 420

ctgaggactc catcacctga gtcaggtaat acatttactg attcatcctc agcggactct 480

gatatgacat ccactaaaaa atatgtcaga ccaccaccaa tgttaacctc acctaatgac 540

tttccaaatt gggttaaaac atacatcaaa tttttacaaa actcgaatct cggtggtatt 600

attccgacag taaacggaaa acccgtacgt cagatcactg atgatgaact caccttcttg 660

tataacactt ttcaaatatt tgctccctct caattcctac ctacctgggt caaagacatc 720

ctatccgttg attatacgga tatcatgaaa attctttcca aaagtattga aaaaatgcaa 780

tctgataccc aagaggcaaa cgacattgtg accctggcaa atttgcaata taatggcagt 840

acacctgcag atgcatttga aacaaaagtc acaaacatta tcgacagact gaacaataat 900

ggcattcata tcaataacaa ggtcgcatgc caattaatta tgagaggtct atctggcgaa 960

tataaatttt tacgctacac acgtcatcga catctaaata tgacagtcgc tgaactgttc 1020

ttagatatcc atgctattta tgaagaacaa cagggatcga gaaacagtaa acctaattac 1080

aggagaaatc cgagtgatga gaagaatgat tctcgcagct atacgaatac aaccaaaccc 1140

aaagttatag ctcggaatcc tcaaaaaaca aataattcga aatcgaaaac agccagggct 1200

cacaatgtat ccacatctaa taactctccc agcacggaca acgattccat cagtaaatca 1260

actactgaac cgattcaatt gaacaataag cacgaccttc atcttaggcc agaaacttac 1320

tga 1323

<210> 4

<211> 439

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 4

Met Glu Ser Gln Gln Leu Ser Gln His Ser Pro Ile Ser His Gly Ser

1 5 10 15

Ala Cys Ala Ser Val Thr Ser Lys Glu Val His Thr Asn Gln Asp Pro

20 25 30

Leu Asp Val Ser Ala Ser Lys Thr Glu Glu Cys Glu Ala Ser Thr Lys

35 40 45

Ala Asn Ser Gln Gln Thr Thr Thr Pro Ala Ser Ser Ala Val Pro Glu

50 55 60

Asn Pro His His Ala Ser Pro Gln Thr Ala Gln Ser His Ser Pro Gln

65 70 75 80

Asn Gly Pro Tyr Pro Gln Gln Cys Met Met Thr Gln Asn Gln Ala Asn

85 90 95

Pro Ser Gly Trp Ser Phe Tyr Gly His Pro Ser Met Ile Pro Tyr Thr

100 105 110

Pro Tyr Gln Met Ser Pro Met Tyr Phe Pro Pro Gly Pro Gln Ser Gln

115 120 125

Phe Pro Gln Tyr Pro Ser Ser Val Gly Thr Pro Leu Arg Thr Pro Ser

130 135 140

Pro Glu Ser Gly Asn Thr Phe Thr Asp Ser Ser Ser Ala Asp Ser Asp

145 150 155 160

Met Thr Ser Thr Lys Lys Tyr Val Arg Pro Pro Pro Met Leu Thr Ser

165 170 175

Pro Asn Asp Phe Pro Asn Trp Val Lys Thr Tyr Ile Lys Phe Leu Gln

180 185 190

Asn Ser Asn Leu Gly Gly Ile Ile Pro Thr Val Asn Gly Lys Pro Val

195 200 205

Arg Gln Ile Thr Asp Asp Glu Leu Thr Phe Leu Tyr Asn Thr Phe Gln

210 215 220

Ile Phe Ala Pro Ser Gln Phe Leu Pro Thr Trp Val Lys Asp Ile Leu

225 230 235 240

Ser Val Asp Tyr Thr Asp Ile Met Lys Ile Leu Ser Lys Ser Ile Glu

245 250 255

Lys Met Gln Ser Asp Thr Gln Glu Ala Asn Asp Ile Val Thr Leu Ala

260 265 270

Asn Leu Gln Tyr Asn Gly Ser Thr Pro Ala Asp Ala Phe Glu Thr Lys

275 280 285

Val Thr Asn Ile Ile Asp Arg Leu Asn Asn Asn Gly Ile His Ile Asn

290 295 300

Asn Lys Val Ala Cys Gln Leu Ile Met Arg Gly Leu Ser Gly Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Phe Leu Arg Tyr Thr Arg His Arg His Leu Asn Met Thr Val Ala

325 330 335

Glu Leu Phe Leu Asp Ile His Ala Ile Tyr Glu Glu Gln Gln Gly Ser

340 345 350

Arg Asn Ser Lys Pro Asn Tyr Arg Arg Asn Pro Ser Asp Glu Lys Asn

355 360 365

Asp Ser Arg Ser Tyr Thr Asn Thr Thr Lys Pro Lys Val Ile Ala Arg

370 375 380

Asn Pro Gln Lys Thr Asn Asn Ser Lys Ser Lys Thr Ala Arg Ala His

385 390 395 400

Asn Val Ser Thr Ser Asn Asn Ser Pro Ser Thr Asp Asn Asp Ser Ile

405 410 415

Ser Lys Ser Thr Thr Glu Pro Ile Gln Leu Asn Asn Lys His Asp Leu

420 425 430

His Leu Arg Pro Glu Thr Tyr

435

ORF2를 발현하는 Y2805 gal80 결핍주 (Y2805△gal80/pGAL10-ORF2)와 Ty1과 ORF2를 융합발현하는 Y2805 균주 (Y2805/pGAL10-Ty1-ORF2)를 2013년 2월 20일자로 미생물자원센터(Korean Collection for Type Culture: KCTC)에 각각 KCTC 12372BP와 KCTC 12373BP로 기탁하였다.

기탁기관명: 한국생명공학연구원

수탁번호: KCTC 12372BP

수탁일자: 2013년 2월 20일

기탁기관명: 한국생명공학연구원

수탁번호: KCTC 12373BP

수탁일자: 2013년 2월 20일

[규칙 제91조에 의한 정정 23.05.2014]　

[규칙 제91조에 의한 정정 23.05.2014]　

Claims

2형 돼지 써코바이러스(porine circovirus type II) 캡시드 Orf2 유전자를 포함하는 돼지 써코바이러스 백신용 효모 전세포(Yeast whole cell).
제 1항에 있어서,

상기 Orf2 유전자는 서열번호 1로 표시되는 유전자인 것을 특징으로 하는, 돼지 써코바이러스 백신용 효모 전세포.
제 1항에 있어서,

상기 Orf2 유전자는 서열번호 2의 단백질을 암호화하는 것을 특징으로 하는, 돼지 써코바이러스 백신용 효모 전세포.
제 1항에 있어서,

상기 효모는 숙주 세포로써 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주를 사용하는 것을 특징으로 하는, 돼지 써코바이러스 백신용 효모 전세포.
제 4항에 있어서,

상기 균주는 Y2805 균주인 것을 특징으로 하는, 돼지 써코바이러스 백신용 효모 전세포.
제 1항에 있어서,

상기 효모 전세포는 열-불활성화 또는 포르말린-불활성화된 것을 특징으로 하는, 돼지 써코바이러스 백신용 효모 전세포.
2형 돼지 써코바이러스(porine circovirus type II) 캡시드 Orf2 유전자를 포함하는 돼지 써코바이러스 백신용 효모 전세포의 파쇄물.
제 7항에 있어서,

상기 Orf2 유전자는 서열번호 1로 표시되는 유전자인 것을 특징으로 하는, 돼지 써코바이러스 백신용 효모 전세포의 파쇄물.
제 7항에 있어서,

상기 Orf2 유전자는 서열번호 2의 단백질을 암호화하는 것을 특징으로 하는, 돼지 써코바이러스 백신용 효모 전세포의 파쇄물.
제 7항에 있어서,

상기 효모는 숙주 세포로써 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주를 사용하는 것을 특징으로 하는, 돼지 써코바이러스 백신용 효모 전세포의 파쇄물.
제 10항에 있어서,

상기 균주는 Y2805 균주인 것을 특징으로 하는, 돼지 써코바이러스 백신용 효모 전세포의 파쇄물.
2형 돼지 써코바이러스(porine circovirus type II) 캡시드 단백질 ORF2를 포함하는 효모 전세포 또는 이의 파쇄물을 포함하는 돼지 써코바이러스 백신용 조성물.
제 12항에 있어서,

상기 단백질 ORF2는 서열번호 1의 유전자로 암호화된 것을 특징으로 하는, 돼지 써코바이러스 백신용 조성물.
제 12항에 있어서,

상기 단백질 ORF2는 서열번호 2로 표시되는 폴리펩타이드임을 특징으로 하는, 돼지 써코바이러스 백신용 조성물.
제 12항에 있어서,

상기 효모는 숙주 세포로써 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주를 사용하는 것을 특징으로 하는, 돼지 써코바이러스 백신용 조성물.
제 15항에 있어서,

상기 균주는 Y2805 균주인 것을 특징으로 하는, 돼지 써코바이러스 백신용 조성물.
제 16항에 있어서,

상기 Y2805균주는 gal 80 유전자가 결손된 것을 특징으로 하는, 돼지 써코바이러스 백신용 조성물.
제 12항에 있어서,

상기 효모 전세포는 열-불활성화 또는 포르말린-불활성화된 것을 특징으로 하는, 돼지 써코바이러스 백신용 조성물.
제 12항에 있어서,

보조제(adjuvant)를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 돼지 써코바이러스 백신용 조성물
제 12항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 효모 전세포는 4x10⁹세포 이하를 사용하는 것을 특징으로 하는, 돼지 써코바이러스 백신용 조성물.
2형 돼지 써코바이러스(porine circovirus type II) 캡시드 단백질을 암호화하는 Orf2 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 준비하는 단계; 및

상기 재조합 벡터를 효모에 형질전환시키는 단계를 포함하는 돼지 써코바이러스 백신용 형질전환 효모 전세포의 제조방법.
제 21항에 있어서,

상기 Orf2 유전자는 서열번호 1로 표시되는 유전자인 것을 특징으로 하는, 돼지 써코바이러스 백신용 형질전환 효모 전세포의 제조방법.
제 21항에 있어서,

상기 Orf2 유전자는 서열번호 2의 폴리펩타이드를 암호화하는 것을 특징으로 하는, 돼지 써코바이러스 백신용 형질전환 효모 전세포의 제조방법.
제 21항에 있어서,

상기 효모는 숙주 세포로써 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주를 사용하는 것을 특징으로 하는, 돼지 써코바이러스 백신용 형질전환 효모 전세포의 제조방법.
제 24항에 있어서,

상기 균주는 Y2805인 것을 특징으로 하는, 돼지 써코바이러스 백신용 형질전환 효모 전세포의 제조방법.
제 25항에 있어서,

상기 Y2805 균주는 gal 80 유전자가 결손된 것을 특징으로 하는, 돼지 써코바이러스 백신용 형질전환 효모 전세포의 제조방법.
제 21항에 있어서,

상기 재조합 발현 벡터는 GAL10 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는, 돼지 써코바이러스 백신용 형질전환 효모 전세포의 제조방법.
제 21항에 있어서,

상기 Orf2유전자는 Ty1과 융합하여 발현이 증가되는 것을 특징으로 하는, 돼지 써코바이러스 백신용 형질전환 효모 전세포의 제조방법.
제 21항에 있어서,

상기 효모 전세포를 열-불활성화하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 돼지 써코바이러스 백신용 형질전환 효모 전세포의 제조방법.
제 21항에 있어서,

상기 효모 전세포를 포르말린-불활성화하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 돼지 써코바이러스 백신용 형질전환 효모 전세포의 제조방법.
2형 돼지 써코바이러스(porine circovirus type II) 캡시드 단백질을 암호화하는 Orf2 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 준비하는 단계;

상기 제조합 백터를 효모에 형질전환시켜서 형질전환체를 준비하는 단계; 및

상기 형질전환체를 파쇄시켜키는 단계를 포함하는 돼지 써코바이러스 백신용 형질전환 효모 전세포의 파쇄물 제조방법.
2형 돼지 써코바이러스(porine circovirus type II) 캡시드 단백질 ORF2를 포함하는 효모 전세포 또는 이의 파쇄물을 포함하는 백신조성물을 돼지에 투여하여 백신화시키는 방법.
제 32항에 있어서,

상기 ORF2는 서열번호 1로 표시되는 유전자에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 돼지를 백신화시키는 방법.
제 32항에 있어서,

상기 ORF2는 서열번호 2로 표시되는 폴리펩타이드임을 특징으로 하는, 돼지를 백신화시키는 방법.
제 32항에 있어서,

상기 효모는 숙주세포로써 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주를 사용하는 것을 특징으로 하는, 돼지를 백신화시키는 방법.
제 35항에 있어서,

상기 균주는 Y2805 균주인 것을 특징으로 하는, 돼지를 백신화시키는 방법.
제 36항에 있어서,

상기 Y2805 균주는 gal 80 유전자가 결손된 것을 특징으로 하는, 돼지를 백신화시키는 방법.
제 32항에 있어서,

상기 재조합 발현 벡터는 GAL10 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는, 돼지를 백신화시키는 방법.
제 32항에 있어서,

상기 ORF2는 Ty1과 융합하여 발현이 증가되는 것을 특징으로 하는, 돼지를 백신화시키는 방법.