KR102010061B1 - 신규한 셀룰로오스 결합 도메인의 염기서열, 이를 포함하는 재조합 벡터 및 이를 활용한 단백질 분리정제 방법 - Google Patents

신규한 셀룰로오스 결합 도메인의 염기서열, 이를 포함하는 재조합 벡터 및 이를 활용한 단백질 분리정제 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 셀룰로오스 결합 도메인의 염기서열, 이를 포함하는 재조합 벡터 및 이를 활용한 단백질 분리정제 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 극호열균(Thermotoga maritima)에서 유래한 자일라아제(xylanase) 10A 단백질의 CBM9(family 9 carbohydrate-binding module) 도메인의 38번째 아미노산인 아스파라긴이 글루타민으로 치환된, 셀룰로오스 결합 도메인 CBM9(N38Q)을 암호화 하는, 셀룰로오스 결합 도메인 염기서열; 상기 셀룰로오스 결합 도메인 염기서열을 포함하는 재조합 벡터; 극호열균(Thermotoga maritima)에서 유래한 xylanase 10A 단백질의 CBM9(family 9 carbohydrate-binding module) 도메인의 38번째 아미노산인 아스파라긴이 글루타민으로 치환된, 셀룰로오스 결합 도메인 CBM9(N38Q)의 아미노산 서열을 포함하는 셀룰로오스 결합 도메인의 펩타이드; 및 이러한 셀룰로오스 결합 도메인(Cellulose binding domain)을 포함하는 단백질의 분리 방법에 관한 것이다.

Description

신규한 셀룰로오스 결합 도메인의 염기서열, 이를 포함하는 재조합 벡터 및 이를 활용한 단백질 분리정제 방법{Novel sequence of cellulose binding domain, recombinant expression vector composed with the same and protein purification method for a protein using thereof}
본 발명은 신규한 셀룰로오스 결합 도메인의 염기서열, 이를 포함하는 재조합 벡터 및 이를 활용한 단백질 분리정제 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 셀룰로오스 결합능이 향상된 신규한 셀룰로오스 결합 도메인의 염기서열에 관한 기술이다.
셀룰로오스(Cellulose)는 식물의 세포막 및 목질부를 구성하는 기본성분으로 식물체의 약 30% 이상을 차지하는 유기화합물의 일종이다. 다당류에 속하며, 화학구조는 D-글루코스(glucose)가 베타-1,4 글루코시드(beta-1,4 glucoside) 결합으로 다수 중합되어, 천연상태의 분자량이 수만 내지 수십만에 이른다. 셀룰로오스는 무취의 흰색 고체로 물, 에탄올, 및 에테르에는 녹지 않으며 알칼리에 상당히 강한 내성을 가지고 있으나, 산(acid)이나 구리암모니아용액(cuprammonium solution) 내에서는 가수분해 되어 중간산물로 셀로비오스(cellobiose)를 다량 생성하고, 최종적으로는 글루코스(glucose)로 변환된다. 셀룰로오스는 자연계에서 가장 풍부한 천연자원의 한 종류인 만큼 이를 이용하고자 하는 많은 연구들이 진행 중이다.
한편, 셀룰로오스를 분해하는 셀룰라아제(cellulase)는 셀룰로오스 결합 도메인(cellulose binding domain, CBD)을 가지고 있어, 셀룰로오스에 특이적으로 결합하여 셀룰로오스를 효과적으로 분해한다.
대한민국 등록특허 제10-0618563호와 같이 상기와 같은 셀룰로오스 결합 도메인을 필요로 하는 목적 단백질에 결합시켜 셀룰로오스에 특이적으로 결합하는 재조합 단백질을 제조하고자 하는 시도들이 활발히 이루어지고 있다.
그러나, 최근 식물 유래 재조합 단백질, 백신 등의 생산과 관련하여 관심이 집중되고 있는 만큼, 식물체를 이용하여 대량의 재조합 단백질을 생산하고, 고순도의 재조합 단백질을 대량으로 신속하고 저렴하게 분리하는 향상된 기술에 대한 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.
이에 본 발명의 한 측면은 셀룰로오스 결합력을 증대시켜 분리 수율을 향상시킬 수 있는 셀룰로오스 결합 도메인 염기서열을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 측면은 셀룰로오스 결합 도메인 염기서열을 포함하는, 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 셀룰로오스 결합력을 증대시켜 분리 수율을 향상시킬 수 있는 셀룰로오스 결합 도메인 펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 펩타이드를 포함하는 재조합 단백질의 분리 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 견지에 의하면, 극호열균(Thermotoga maritima)에서 유래한 자일라아제(xylanase) 10A 단백질의 CBM9(family 9 carbohydrate-binding module) 도메인의 38번째 아미노산인 아스파라긴이 글루타민으로 치환된, 셀룰로오스 결합 도메인 CBM9(N38Q)을 암호화 하는, 셀룰로오스 결합 도메인 염기서열이 제공된다.
본 발명의 다른 견지에 의하면, 셀룰로오스 결합 도메인 염기서열을 포함하는, 재조합 벡터가 제공된다.
본 발명의 또 다른 견지에 의하면, 극호열균(Thermotoga maritima)에서 유래한 xylanase 10A 단백질의 CBM9(family 9 carbohydrate-binding module) 도메인의 38번째 아미노산인 아스파라긴이 글루타민으로 치환된, 셀룰로오스 결합 도메인 CBM9(N38Q)의 아미노산 서열을 포함하는, 셀룰로오스 결합 도메인의 펩타이드가 제공된다.
본 발명의 또 다른 견지에 의하면, 상기 펩타이드를 포함하는 재조합 단백질을 함유하는 식물 추출물, 및 비결정셀룰로오스(amorphous cellulose)를 혼합하는 단백질 결합 단계(binding step); (b) 결합되지 않은 단백질을 제거하는 세척 단계(washing step); 및 (c) 상기 비결정셀룰로오스에 결합된 단백질을 용출(elution)하는 단계를 포함하는, 셀룰로오스 결합 도메인(Cellulose binding domain)을 포함하는 단백질의 분리 방법이 제공된다.
본 발명의 신규한 셀룰로오스 결합 도메인의 염기서열 및 이를 포함하는 재조합 벡터를 이용한 식물 발현 재조합 단백질 분리 방법은 재조합 단백질의 셀룰로오스 결합력을 증대시켜 분리 수율을 향상시킬 수 있으므로, 관련 기술 분야에서 널리 응용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 CBM9 또는 CBM9(N38Q) 융합 단백질을 식물에서 발현시키기 위한 재조합 벡터의 구성을 나타내는 모식도이다.
도2는 CBM9 또는 CBM9(N38Q) 융합 단백질의 식물에서의 발현을 웨스턴 블로팅으로 확인한 결과이다.
도 3은 식물에서 발현된 CBM9 또는 CBM9(N38Q) 융합 단백질의 비결정셀룰로오스 결합을 웨스턴 블로팅으로 확인한 결과이다.
도 4는 비결정셀룰로오스를 이용하여 분리된 CBM9(N38Q) 융합 단백질을 웨스턴 블로팅으로 확인한 결과이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시 형태를 설명한다. 그러나, 본 발명의 실시 형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 의하면 셀룰로오스 결합 능력이 향상된 셀룰로오스 결합 도메인이 제공되며, 식물체를 이용하여 재조합 단백질을 발현시키고 분리 정제를 대량으로 신속하고 간단하게 수행할 수 있다.
단백질의 당화(glycosylation) 과정은 단백질의 생물학적인 기능 조절을 위하여 세포 내에서 일어나는 과정으로 효소의 안정성을 높이거나, 활성을 조절하거나 기질과의 결합력을 조절하기도 하는데, 본 발명에서는 셀룰로오스 결합 도메인의 N 당화(glycosylation) 예상 위치의 염기를 치환함으로써 돌연변이시켜 셀룰로오스 결합능을 증대하고자 하였다.
보다 상세하게, 본 발명의 셀룰로오스 결합 도메인 염기서열은 극호열균(Thermotoga maritima)에서 유래한 자일라아제(xylanase) 10A 단백질의 CBM9(family 9 carbohydrate-binding module) 도메인의 38번째 아미노산인 아스파라긴이 글루타민으로 치환된, 셀룰로오스 결합 도메인 CBM9(N38Q)을 암호화 하는 것이다.
본 발명의 상기 셀룰로오스 결합 도메인 CBM9(N38Q)을 암호화 하는 염기서열은 서열번호 1의 염기서열인 것이 바람직하다.
한편, 상기 본 발명의 셀룰로오스 결합 도메인이 목적 단백질과 결합된 융합 단백질의 소포체로의 이동과 축척을 위해 융합 단백질의 아미노말단과 카르복실말단에 각각 신호 펩타이드(signal peptide)를 추가할 수 있으며, 이를 위해 아미노말단에 BiP(chaperone binding protein)을 코팅할 수 있는 염기 서열 및 카르복실말단에 HDEL(His-Asp-Glu-Leu)을 코팅할 수 있는 염기 서열을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 견지에 의하면, 상기 본 발명의 셀룰로오스 결합 도메인을 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 벡터가 제공되며, 보다 상세하게는 상기 본 발명의 셀룰로오스 결합 도메인 염기서열을 포함하는 재조합 벡터가 제공될 수 있다.
상기 셀룰로오스 결합 도메인은 목적 단백질을 코딩하는 염기서열의 3' 말단에 결합되어 재조합 벡터로 제조된다.
상기 목적 단백질은 특히 제한되는 것은 아니며, 예를 들어 써코바이러스 2형(porcine circovirus type2, PCV2) 캡시드 단백질, 구제역 바이러스 캡시드 단백질등으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다.
본 발명에서 사용된 상기 용어 "목적 단백질(또는 단백질)"은 본 발명에 따른 유전공학적 방법으로 생산하고자 하는 단백질을 말하는 것으로, 특별히 어느 하나에 제한되지 않는다. 바람직하게는 상업적 용도로 이용되고 있어 다량으로 생산될 필요가 있는 단백질들이 포함될 수 있다.
상기 재조합 벡터는 식물 발현용 벡터인 것이 바람직하며, 이 경우 식물체에서 단백질을 발현 시켜 획득할 수 있다. 이때, 상기 식물 발현용 벡터는 pCAMBIA 1300, pBI121 등으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나인 식물 발현용 벡터일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 견지에 의하면, 극호열균(Thermotoga maritima)에서 유래한 xylanase 10A 단백질의 CBM9(family 9 carbohydrate-binding module) 도메인의 38번째 아미노산인 아스파라긴이 글루타민으로 치환된, 셀룰로오스 결합 도메인 CBM9(N38Q)의 아미노산 서열을 포함하는, 셀룰로오스 결합 도메인의 펩타이드가 제공된다.
상기 셀룰로오스 결합 도메인 CBM9(N38Q)의 아미노산 서열은 목적 단백질의 아미노말단에 결합될 수 있으며, 상기 목적 단백질은 상술한 바와 같이 써코바이러스 2형(porcine circovirus type2, PCV2) 캡시드 단백질, 구제역 바이러스 캡시드 단백질 등으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다.
상기와 같이 본 발명의 셀룰로오스 결합 도메인의 펩타이드를 포함하는 목적 단백질의 경우 셀룰로오스 결합 도메인(Cellulose binding domain)을 이용하는 단백질의 분리 방법에 의해 분리 및 정제를 대량으로 수행할 수 있으며, 특히 본 발명에 의한 셀룰로오스 결합 도메인을 적용하는 경우 재조합 단백질의 셀룰로오스 결합력을 증대시켜 분리 수율을 현저하게 향상시킬 수 있다.
보다 상세하게, 본 발명의 단백질의 분리 방법은 (a) 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항의 펩타이드를 포함하는 재조합 단백질을 함유하는 식물 추출물, 및 비결정셀룰로오스(amorphous cellulose)를 혼합하는 단백질 결합 단계(binding step); (b) 결합되지 않은 단백질을 제거하는 세척 단계(washing step); 및 (c) 상기 비결정셀룰로오스에 결합된 단백질을 용출(elution)하는 단계를 포함하며, 고순도의 재조합 단백질을 식물체로부터 대량으로 신속하고 저렴하게 분리할 수 있다.
즉, 본 발명과 같이 목적 단백질을 코딩하는 유전자의 3' 말단에 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 셀룰로오스 결합 도메인(cellulose binding domain, CBD)의 염기서열을 결합시켜 재조합 벡터를 제작하고, 상기 재조합 벡터를 이용하여 목적 단백질을 생산하는 형질전환된 식물체를 제조한 뒤, 미세결정셀룰로오스(Microcrystalline cellulose, MCC) 및/또는 비결정셀룰로오스(Amorphous cellulose, AMC)를 이용하여 목적 단백질을 분리할 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명에서 상기 셀룰로오스(cellulose)는 미세결정셀룰로오스(microcrystalline cellulose) 또는 비결정셀룰로오스(amorphous cellulose) 등을 사용할 수 있다. 이때, 미세결정셀룰로오스 또는 비결정셀룰로오스는 바람직하게는 식물 중량의 0.1 내지 0.5배 중량으로 사용될 수 있으며, 예를 들어 식물 중량 10g 당 셀룰로오스 중량이 1 내지 5, 바람직하게는 2 내지 4g 이 되도록 사용할 수 있으나, 상기 용량에 한정되는 것은 아니며, 목적 단백질의 발현 정도 등의 조건에 따라 조절될 수 있다.
또한, 상기 비결정셀룰로오스는 40 내지 75%의 인산(phosphoric acid)에 미세결정셀룰로오스를 첨가하고 교반하여 비결정셀룰로오스를 제조한 다음, 상기 비결정셀룰로오스에 500mM 내지 1.5M의 탄산나트륨(Na2CO3)을 첨가함으로써 제조될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 셀룰로오스 결합 도메인을 포함하는 목적 단백질은 서열번호 1로 구성되는 셀룰로오스 결합 도메인의 염기 서열로 코딩된 아미노산 서열 또는 이와 실질적으로 동질의 활성을 나타내는 서열을 포함하는 재조합 단백질일 수 있다.
여기서, '실질적으로 동질의 활성'이란 셀룰로오스 결합 도메인의 활성을 의미하는 것으로, 기능적으로 동일한, 예를 들어, 아미노산 서열 중 일부가 치환되거나, 결실, 또는 부가된 아미노산 서열 변형체를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 셀룰로오스 결합 도메인을 포함하는 단백질의 분리 방법에서, 상기 결합 단계는 10 내지 60 mM의 트리스-염화수소(Tris-HCl) , 10 내지 200 mM의 염화나트륨(sodium chloride: NaCl) 및 0.05 내지 0.2 %의 트리톤 X-100(Triton X-100)을 포함하는 완충용액(buffer)을 사용하여 이루어질 수 있으며, 가장 바람직하게는 50 mM의 트리스-염화수소, 150 mM의 염화나트륨 및 0.1 %의 트리톤 X-100을 포함하는 완충용액을 사용하는 것일 수 있다.
또한, 상기에서 세척 단계는 10 내지 60 mM의 트리스-염화수소(Tris-HCl), 10 내지 200 mM의 염화나트륨(sodium chloride: NaCl) 및 0.05 내지 0.2 %의 트리톤 X-100(Triton X-100)을 포함하는 완충용액(buffer)을 사용하여 이루어질 수 있으며, 가장 바람직하게는 50 mM의 트리스-염화수소 및 150 mM의 염화나트륨을 포함하는 완충용액을 사용하는 것일 수 있다.
또한, 상기에서 단백질을 용출하는 단계는 pH 7.0 내지 10의 10 내지 60 mM 트리스-염화수소(Tris-HCl) 완충용액, 10 내지 200 mM의 염화나트륨(sodium chloride: NaCl) 및 1 내지 20%의 셀로비오스(Cellobiose)를 포함하는 완충용액(buffer)을 사용하여 이루어질 수 있으며, 가장 바람직하게는 pH 8.8의 50 mM 트리스-염화수소 완충용액, 50 mM의 염화나트륨 및 3 %의 셀로비오스(Cellobiose)를 포함하는 완충용액을 사용하는 것일 수 있다.
이하, 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 예시에 불과하며, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. CBM9 융합 단백질 식물체 발현 벡터 제작
셀룰로오스 결합 도메인으로는 극호열균(Thermotoga maritima)에서 유래한 자일라나아제(xylanase) 10A 단백질의 CBM9(family 9 carbohydrate-binding module)을 사용하였다.
한편, 본 발명의 신규한 셀룰로오스 결합 도메인을 도출하기 위해 CBM9의 38번째 아미노산인 아스파라긴을 글루타민으로 치환하여 CBM9 당화 돌연변이(CBM9(N38Q)) 염기서열을 제조하였으며,
상기 CBM9 또는 본 발명의 CBM9 당화 돌연변이인 CBM9(N38Q)의 단백질을 발현하는 식물체 발현 재조합 벡터를 각각 다음과 같이 제작하고 그 모식도를 도 1에 나타내었다.
제조된 단백질의 소포체로의 이동과 축척을 위해 단백질의 아미노말단과 카르복실말단에 각각 신호 펩타이드(signal peptide)인 BiP(chaperone binding protein)와 HDEL(His-Asp-Glu-Leu)을 코딩할 수 있는 염기서열을 결합시켰다.
한편, 이후 웨스턴 블로팅에 의한 확인을 위해 HA 에피토프 코딩 염기서열을 CBM9 및 CBM9 당화 돌연변이인 CBM9(N38Q)의 아미노 말단 위치에 각각 추가하였다. HA 에피토프 코딩 염기서열이 결합된 CBM9의 염기서열은 서열번호 2에 나타내었다.
한편, CBM9의 38번째 아미노산인 아스파라긴이 글루타민으로 치환된 CBM9 당화 돌연변이(CBM9(N38Q)) 유전자는 CBM9 유전자를 주형으로 C9-F 프라이머(서열번호 2), C9-38-F 프라이머(서열번호 3), C9-38-R 프라이머(서열번호 4), C9-R 프라이머(서열번호 5)를 사용하여 overlapping PCR 반응을 수행하여 제작하였다. C9-F 프라이머와 C9-38-R 프라이머를 사용한 PCR로 획득한 유전자 조각과 C9-38-F 프라이머와 C9-R 프라이머를 사용한 PCR로 획득한 유전자 조각을 혼합 후 이를 주형으로 C9-F 프라이머와 C9-R 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 이렇게 획득된 CBM9 및 CBM9 당화 돌연변이 CBM9(N38Q) 의 염기서열을 각각 돼지 써코바이러스 2형(porcine circovirus type2, PCV2) 캡시드 단백질을 코딩하는 유전자의 5' 말단에 결합시켜고 식물발현용 벡터(vector)인 pCAMBIA 1300에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하였다.
2. CBM9 융합 단백질의 식물체 일시 발현
상기 1.에서 획득된 재조합 벡터들을 각각 아그로박테리아 균주 GV3101에 전기충격법(Electrophoration)을 이용하여 형질전환시켰다.
형질 전환된 아그로박테리아를 5ml의 YEP 액체 배지(효모 추출물 10 g, 펩톤 10 g, NaCl 5 g, 카나마이신 50 mg/L, 리팜피신 25mg/L)에서 280℃의 조건에서 16시간 동안 진탕배양 한 후 1차 배양액 1ml을 50ml의 새 YEP 배지에 접종하여 28 ℃의 조건에서 6시간 동안 진탕배양 하였다.
이렇게 배양된 아그로박테리아는 원심분리(7,000rpm, 4℃, 5분)하여 수집한 후, 인필트레이션(infiltration) 버퍼(10 mM MES, pH 5.7, 10 mM MgCl2, 200 μM 아세토시링곤)에 600nm의 파장에서 O.D. 1.0의 농도로 다시 현탁시켰다.
아그로박테리아 현탁액은 주사 바늘을 제거한 주사기를 이용하여 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana) 잎의 뒷면에 주입하는 방법으로 아그로-인필트레이션(Agro-infiltration)을 수행하였다.
아그로-인필트레이션 수행 4일 후 잎에서 단백질을 추출하고 웨스턴 블로팅을 통해 융합 단백질의 발현을 확인하고 그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, CBM9:PCV2와 CBM9(N38Q):PCV2는 비슷한 수준으로 발현되었으며, CBM9(N38Q):PCV2의 크기가 CBM9:PCV2보다 상대적으로 작게 나타났다. 이러한 결과로부터 식물체에서 발현시켰을 때 CBM9은 당화(Glycosylation)되는데 반하여 CBM9 당화 돌연변이(CBM9(N38Q))는 당화되지 않는다는 것을 확인할 수 있었다.
3. 식물에서 발현시킨 CBM9 및 CBM9 당화 돌연변이 융합 단백질의 비결정셀룰로오스 결합력 비교
(1) 비결정셀룰로오스 (Amorphous cellulose, AMC )의 제조
증류수 6mL에 미세결정셀룰로오스 2g을 첨가하고 교반한 후 최종 농도가 60%가 되도록 인산을 조금씩 첨가하면서 교반하여 혼합하고 30분간 반응시켰다. 교반된 용액에 증류수를 20mL을 첨가하여 혼합한 후에 원심분리(7,000rpm, 4℃, 10분)로 상층액을 제거하였다. 결정화된 셀룰로오스에 1M의 Na2CO3 2mL 및 및 20mL의 증류수를 첨가하여 혼합한 후 원심분리(7,000rpm, 4℃, 10분)하여 상층액을 제거하는 과정을 2회 수행하였다. 상기 방식으로 제작된 비결정셀룰로오스의 최종 부피를 200mL이 되도록 조정한 다음 사용시까지 4℃에 보관하였다.
(2) CBM9 및 CBM9 당화 돌연변이 융합 단백질의 비결정셀룰로오스 결합력 비교
식물체에서 발현된 CBM9 또는 CBM9 당화 돌연변이(CBM9(N38Q)) 융합 단백질의 비결정셀룰로오스에 대한 결합력을 비교하기 위하여, 상기 2.와 같이 획득된 CBM9 및 CBM9 당화 돌연변이 융합단백질을 식물체 잎에서 일시 발현시킨 후 막자 사발에 담고 액체질소를 이용하여 분말화시켰다.
이렇게 분말화된 식물 0.2g에 단백질 추출 완충 용액(50mM Tris (pH 7.2), 150mM NaCl, 0.1 % Triton X-100, 1X 단백질 가수분해 효소 억제제(protease inhibitor)) 1ml을 첨가하고 잘 혼합하였다. 원심분리(14,000rpm, 4℃, 10분)통해 파쇄물이 제거된 식물 단백질 추출물을 획득하고 비결정셀룰로오스 0.2g을 첨가한 후 1시간 동안 4℃에서 혼합시켜 CBM9 및 CBM9 당화 돌연변이 융합단백질이 비결정셀룰로오스에 결합하도록 하였다.
이후 원심분리(14,000rpm, 4℃, 5분)통해 비결정셀룰로오스에 결합되지 않은 단백질들을 제거 한 후 0.1% Triton X-100이 첨가된 세척용 완충용액(50mM Tris (pH 7.2), 50mM NaCl)으로 비결정셀룰로오스를 1회 세척하고, Triton X-100이 첨가 되지 않은 세척용 완충용액을 이용하여 2회 세척하였다.
그 후, 비결정셀룰로오스에 결합된 CBM9 및 CBM9 당화 돌연변이 융합단백질은 HA 항체를 이용한 웨스턴 블로팅으로 확인한 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 식물에서 발현시킨 CBM9 융합 단백질의 절반 정도는 비결정셀룰로오스에 결합하지 않았고(UB) 이는 CBM9 융합 단백질의 비결정셀룰로오스에 대한 결합력이 약하다는 것을 의미하는 반면, CBM9 당화 돌연변이 융합단백질은 거의 손실 없이(UB) 비결정셀룰로오스에 대부분 결합(B)되는 것으로 보아 비결정셀룰로오스에 대한 상대적인 강한 결합력을 가지는 것을 확인할 수 있었다.
이러한 결과는 본 발명의 CBM9의 당화 돌연변이를 활용하여 융합 단백질의 비결정셀룰로오스에 대한 결합력을 향상시켜 단백질 분리정제 효율을 증대시킬 수 있음을 의미한다.
4. 비결정셀룰로오스를 이용한 CBM9 당화 돌연변이 융합단백질의 분리
비결정셀룰로오스를 이용한 CBM9 당화 돌연변이 융합단백질(CBM9(N38Q):PCV2)의 분리 정제를 아래와 같이 수행하였다.
상기 2.의 공정으로 CBM9 당화 돌연변이 융합단백질을 일시 발현시킨 식물체 잎 2.5g을 막자 사발에 담고 액체 질소를 이용하여 분말화시켰다. 분말화된 식물에 단백질 추출 완충용액(50mM Tris (pH 7.2), 50mM NaCl, 0.1 % Triton X-100, 1X 단백질가수분해효소 억제제(protease inhibitor))을 식물체 1g당 5 mL이 되도록 첨가하고 잘 혼합하였다. 원심분리(14,000rpm, 4℃, 10분)와 miracloth를 이용하여 파쇄물이 제거된 식물 단백질 추출물에 비결정셀룰로오스 0.5g을 첨가하고 잘 혼합시켜 셀룰로오스 결합 도메인이 비결정셀룰로오스에 결합시킨 후에 컬럼에 흘려주어 비결정셀룰로오스에 결합하지 않는 단백질들을 제거하였다.
이후 0.1% Triton X-100이 첨가된 세척용 완충용액(50mM Tris (pH 7.2), 50mM NaCl) 15mL을 컬럼에 흘려주어 1회 세척하고, Triton X-100이 첨가되지 않은 세척용 완충용액을 이용하여 2회 세척하였다. 비결정셀룰로오스에 결합된 CBM9 당화 돌연변이 융합단백질(CBM9(N38Q):PCV2)의 분리는 용출용 완충용액(50mM Tris-HCl(pH 8.8), 50mM NaCl, 3% Cellobiose)을 컬럼에 흘려주는 방식으로 진행하였으며 분리된 단백질은 HA 항체를 이용하여 웨스턴 블로팅으로 확인하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 식물에서 발현시킨 CBM9 당화 돌연변이 융합단백질(CBM9(N38Q):GFP)은 비결정셀룰로오스에 잘 결합되었으며 세척 단계(W)에서는 결합되어 있는 단백질들이 거의 용출되지 않았고 마지막 용출단계(E)에서 비결정셀룰로오스에 결합된 CBM9 당화 돌연변이 융합단백질(CBM9(N38Q):PCV2)이 잘 분리되고 있다는 것을 확인할 수 있었다.
이상에서 본 발명의 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.
본 발명의 서열 목록은 하기와 같다.
서열번호 1: HA 코딩 서열이 없는 CBM9(N38Q) 염기 서열
GTGGCTACAGCAAAGTATGGCACGCCCGTGATTGATGGAGAAATCGATGAGATTTGGAACACCACTGAAGAGATTGAAACAAAGGCTGTTGCAATGGGGTCATTAGATAAGCAGGCAACTGCGAAGGTGCGAGTACTATGGGATGAAAATTACCTTTACGTTTTGGCTATCGTTAAAGATCCAGTTCTCAATAAGGATAATTCTAATCCGTGGGAGCAGGATAGCGTTGAAATATTCATTGATGAAAACAATCATAAGACAGGATATTACGAGGATGACGATGCACAGTTTAGGGTGAATTATATGAATGAGCAAACTTTTGGCACTGGTGGTAGTCCTGCTAGATTTAAAACGGCCGTCAAACTTATCGAGGGAGGATATATTGTAGAAGCCGCGATAAAGTGGAAGACCATCAAGCCAACACCAAACACCGTTATTGGTTTCAATATTCAGGTCAACGACGCTAATGAGAAAGGTCAAAGAGTCGGGATCATATCCTGGTCTGACCCTACTAACAATTCTTGGCGTGACCCTTCAAAGTTCGGTAATTTGAGGCTGATTAAG
서열번호 2: HA- CBM9(N38Q)
TACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTGTGGCTACAGCAAAGTATGGCACGCCCGTGATTGATGGAGAAATCGATGAGATTTGGAACACCACTGAAGAGATTGAAACAAAGGCTGTTGCAATGGGGTCATTAGATAAGCAGGCAACTGCGAAGGTGCGAGTACTATGGGATGAAAATTACCTTTACGTTTTGGCTATCGTTAAAGATCCAGTTCTCAATAAGGATAATTCTAATCCGTGGGAGCAGGATAGCGTTGAAATATTCATTGATGAAAACAATCATAAGACAGGATATTACGAGGATGACGATGCACAGTTTAGGGTGAATTATATGAATGAGCAAACTTTTGGCACTGGTGGTAGTCCTGCTAGATTTAAAACGGCCGTCAAACTTATCGAGGGAGGATATATTGTAGAAGCCGCGATAAAGTGGAAGACCATCAAGCCAACACCAAACACCGTTATTGGTTTCAATATTCAGGTCAACGACGCTAATGAGAAAGGTCAAAGAGTCGGGATCATATCCTGGTCTGACCCTACTAACAATTCTTGGCGTGACCCTTCAAAGTTCGGTAATTTGAGGCTGATTAAG
서열번호 3: C9-F 프라이머
GGATCCTCTACCCATACGATGTTCCAGATTAC
서열번호 4: C9-38-F 프라이머
CAGGCAACTGCGAAGGTGCG
서열번호 5: C9-38-R 프라이머
CACCTTCGCAGTTGCCTGCTTATCTAATGACCCCATTGCAAC
서열번호 6: C9-R 프라이머
CCCGGGCCTTAGCTGCTGCTTCTTTAGCG
서열번호 7: HA 코딩 서열이 없는 CBM9(N38Q) 아미노산 서열
VATAKYGTPVIDGEIDEIWNTTEEIETKAVAMGSLDKQATAKVRVLWDENYLYVLAIVKDPVLNKDNSNPWEQDSVEIFIDENNHKTGYYEDDDAQFRVNYMNEQTFGTGGSPARFKTAVKLIEGGYIVEAAIKWKTIKPTPNTVIGFNIQVNDANEKGQRVGIISWSDPTNNSWRDPSKFGNLRLIK
서열번호 8: HA 코딩 서열이 있는 CBM9(N38Q) 아미노산 서열
YPYDVPDYAVATAKYGTPVIDGEIDEIWNTTEEIETKAVAMGSLDKQATAKVRVLWDENYLYVLAIVKDPVLNKDNSNPWEQDSVEIFIDENNHKTGYYEDDDAQFRVNYMNEQTFGTGGSPARFKTAVKLIEGGYIVEAAIKWKTIKPTPNTVIGFNIQVNDANEKGQRVGIISWSDPTNNSWRDPSKFGNLRLIK
서열번호 9: BiP 염기 서열
ATGGCTCGCTCGTTTGGAGCTAACAGTACCGTTGTGTTGGCGATCATCTTCTTCGGTGAGTGATTTTCCGATCTTCTTCTCCGATTTAGATCTCCTCTACATTGTTGCTTAATCTCAGAACCTTTTTTCGTTGTTCCTGGATCTGAATGTGTTTGTTTGCAATTTCACGATCTTAAAAGGTTAGATCTCGATTGGTATTGACGATTGGAATCTTTACGATTTCAGGATGTTTATTTGCGTTGTCCTCTGCAATAGAAGAGGCTACGAAGTTA
서열번호 10: HDEL 염기 서열
CATGATGAGCTC
서열번호 11: PCV2염기서열
AAAAATGGCATTTTCAATACACGCCTCAGTCGAACTTTTGGATATACTGTCAAGCGTACTACAGTCACCACGCCATCTTGGGCTGTGGATATGATGAGATTTAAGTTGGATGACTTTGTTCCTCCTGGAGGGGGAACCAACAAAATTTCTATACCGTTTGAGTACTATAGAATCAGAAAAGTTAAGGTTGAGTTCTGGCCGTGTTCCCCCATAACTCAGGGTGATAGGGGTGTGGGTTCAACTGCTGTTATTCTAGATGATAACTTCGTACCTAAGGCCAACGCATTGACTTATGACCCCTATGTAAACTACTCATCTAGACATACAATCCCACAACCTTTCTCCTACCACTCGCGTTATTTTACACCAAAGCCTGTTTTAGATTCTACCATTGATTATTTCCAACCAAATAACAAGAGGAATCAGCTTTGGTTGAGATTACAAACCTCACGGAACGTGGATCATGTCGGATTGGGTACTGCATTTGAAAATAGTAAGTATGATCAGGACTACAATATCCGTGTGACAATGTACGTTCAATTTAGGGAATTTAATCTTAAAGACCCACCACTTAATCCA
서열번호 12: PCV2아미노산 서열
KNGIFNTRLSRTFGYTVKRTTVTTPSWAVDMMRFKLDDFVPPGGGTNKISIPFEYYRIRKVKVEFWPCSPITQGDRGVGSTAVILDDNFVPKANALTYDPYVNYSSRHTIPQPFSYHSRYFTPKPVLDSTIDYFQPNNKRNQLWLRLQTSRNVDHVGLGTAFENSKYDQDYNIRVTMYVQFREFNLKDPPLNP
<110> POSCO <120> Novel sequence of cellulose binding domain, recombinant expression vector composed with the same and protein purification method for a protein using thereof <130> DPP171360 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 564 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBM9(N38Q) <400> 1 gtggctacag caaagtatgg cacgcccgtg attgatggag aaatcgatga gatttggaac 60 accactgaag agattgaaac aaaggctgtt gcaatggggt cattagataa gcaggcaact 120 gcgaaggtgc gagtactatg ggatgaaaat tacctttacg ttttggctat cgttaaagat 180 ccagttctca ataaggataa ttctaatccg tgggagcagg atagcgttga aatattcatt 240 gatgaaaaca atcataagac aggatattac gaggatgacg atgcacagtt tagggtgaat 300 tatatgaatg agcaaacttt tggcactggt ggtagtcctg ctagatttaa aacggccgtc 360 aaacttatcg agggaggata tattgtagaa gccgcgataa agtggaagac catcaagcca 420 acaccaaaca ccgttattgg tttcaatatt caggtcaacg acgctaatga gaaaggtcaa 480 agagtcggga tcatatcctg gtctgaccct actaacaatt cttggcgtga cccttcaaag 540 ttcggtaatt tgaggctgat taag 564 <210> 2 <211> 591 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HA- CBM9(N38Q) <400> 2 tacccatacg atgttccaga ttacgctgtg gctacagcaa agtatggcac gcccgtgatt 60 gatggagaaa tcgatgagat ttggaacacc actgaagaga ttgaaacaaa ggctgttgca 120 atggggtcat tagataagca ggcaactgcg aaggtgcgag tactatggga tgaaaattac 180 ctttacgttt tggctatcgt taaagatcca gttctcaata aggataattc taatccgtgg 240 gagcaggata gcgttgaaat attcattgat gaaaacaatc ataagacagg atattacgag 300 gatgacgatg cacagtttag ggtgaattat atgaatgagc aaacttttgg cactggtggt 360 agtcctgcta gatttaaaac ggccgtcaaa cttatcgagg gaggatatat tgtagaagcc 420 gcgataaagt ggaagaccat caagccaaca ccaaacaccg ttattggttt caatattcag 480 gtcaacgacg ctaatgagaa aggtcaaaga gtcgggatca tatcctggtc tgaccctact 540 aacaattctt ggcgtgaccc ttcaaagttc ggtaatttga ggctgattaa g 591 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C9-F primer <400> 3 ggatcctcta cccatacgat gttccagatt ac 32 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C9-38-F primer <400> 4 caggcaactg cgaaggtgcg 20 <210> 5 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C9-38-R primer <400> 5 caccttcgca gttgcctgct tatctaatga ccccattgca ac 42 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C9-R primer <400> 6 cccgggcctt agctgctgct tctttagcg 29 <210> 7 <211> 188 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CBM9(N38Q) <400> 7 Val Ala Thr Ala Lys Tyr Gly Thr Pro Val Ile Asp Gly Glu Ile Asp 1 5 10 15 Glu Ile Trp Asn Thr Thr Glu Glu Ile Glu Thr Lys Ala Val Ala Met 20 25 30 Gly Ser Leu Asp Lys Gln Ala Thr Ala Lys Val Arg Val Leu Trp Asp 35 40 45 Glu Asn Tyr Leu Tyr Val Leu Ala Ile Val Lys Asp Pro Val Leu Asn 50 55 60 Lys Asp Asn Ser Asn Pro Trp Glu Gln Asp Ser Val Glu Ile Phe Ile 65 70 75 80 Asp Glu Asn Asn His Lys Thr Gly Tyr Tyr Glu Asp Asp Asp Ala Gln 85 90 95 Phe Arg Val Asn Tyr Met Asn Glu Gln Thr Phe Gly Thr Gly Gly Ser 100 105 110 Pro Ala Arg Phe Lys Thr Ala Val Lys Leu Ile Glu Gly Gly Tyr Ile 115 120 125 Val Glu Ala Ala Ile Lys Trp Lys Thr Ile Lys Pro Thr Pro Asn Thr 130 135 140 Val Ile Gly Phe Asn Ile Gln Val Asn Asp Ala Asn Glu Lys Gly Gln 145 150 155 160 Arg Val Gly Ile Ile Ser Trp Ser Asp Pro Thr Asn Asn Ser Trp Arg 165 170 175 Asp Pro Ser Lys Phe Gly Asn Leu Arg Leu Ile Lys 180 185 <210> 8 <211> 197 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HA-CBM9(N38Q) <400> 8 Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Val Ala Thr Ala Lys Tyr Gly 1 5 10 15 Thr Pro Val Ile Asp Gly Glu Ile Asp Glu Ile Trp Asn Thr Thr Glu 20 25 30 Glu Ile Glu Thr Lys Ala Val Ala Met Gly Ser Leu Asp Lys Gln Ala 35 40 45 Thr Ala Lys Val Arg Val Leu Trp Asp Glu Asn Tyr Leu Tyr Val Leu 50 55 60 Ala Ile Val Lys Asp Pro Val Leu Asn Lys Asp Asn Ser Asn Pro Trp 65 70 75 80 Glu Gln Asp Ser Val Glu Ile Phe Ile Asp Glu Asn Asn His Lys Thr 85 90 95 Gly Tyr Tyr Glu Asp Asp Asp Ala Gln Phe Arg Val Asn Tyr Met Asn 100 105 110 Glu Gln Thr Phe Gly Thr Gly Gly Ser Pro Ala Arg Phe Lys Thr Ala 115 120 125 Val Lys Leu Ile Glu Gly Gly Tyr Ile Val Glu Ala Ala Ile Lys Trp 130 135 140 Lys Thr Ile Lys Pro Thr Pro Asn Thr Val Ile Gly Phe Asn Ile Gln 145 150 155 160 Val Asn Asp Ala Asn Glu Lys Gly Gln Arg Val Gly Ile Ile Ser Trp 165 170 175 Ser Asp Pro Thr Asn Asn Ser Trp Arg Asp Pro Ser Lys Phe Gly Asn 180 185 190 Leu Arg Leu Ile Lys 195 <210> 9 <211> 272 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BiP <400> 9 atggctcgct cgtttggagc taacagtacc gttgtgttgg cgatcatctt cttcggtgag 60 tgattttccg atcttcttct ccgatttaga tctcctctac attgttgctt aatctcagaa 120 ccttttttcg ttgttcctgg atctgaatgt gtttgtttgc aatttcacga tcttaaaagg 180 ttagatctcg attggtattg acgattggaa tctttacgat ttcaggatgt ttatttgcgt 240 tgtcctctgc aatagaagag gctacgaagt ta 272 <210> 10 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HDEL <400> 10 catgatgagc tc 12 <210> 11 <211> 579 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCV2 <400> 11 aaaaatggca ttttcaatac acgcctcagt cgaacttttg gatatactgt caagcgtact 60 acagtcacca cgccatcttg ggctgtggat atgatgagat ttaagttgga tgactttgtt 120 cctcctggag ggggaaccaa caaaatttct ataccgtttg agtactatag 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90 95 Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr Ser Ser Arg His Thr Ile Pro Gln 100 105 110 Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp 115 120 125 Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp 130 135 140 Leu Arg Leu Gln Thr Ser Arg Asn Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr 145 150 155 160 Ala Phe Glu Asn Ser Lys Tyr Asp Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Val Thr 165 170 175 Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn 180 185 190 Pro

Claims (12)

  1. 극호열균(Thermotoga maritima)에서 유래한 자일라아제(xylanase) 10A 단백질의 CBM9(family 9 carbohydrate-binding module) 도메인의 38번째 아미노산인 아스파라긴이 글루타민으로 치환된, 셀룰로오스 결합 도메인 CBM9(N38Q)을 암호화 하는, 셀룰로오스 결합 도메인 유전자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 셀룰로오스 결합 도메인 CBM9(N38Q)을 암호화 하는 염기서열은 서열번호 1의 염기서열인, 셀룰로오스 결합 도메인 유전자.
  3. 제1항에 있어서, 아미노말단에 BiP(chaperone binding protein)을 코팅할 수 있는 염기 서열 및 카르복실 말단에 HDEL(His-Asp-Glu-Leu)을 코팅할 수 있는 염기 서열을 추가로 포함하는, 셀룰로오스 결합 도메인 유전자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 셀룰로오스 결합 도메인 유전자를 포함하는, 재조합 벡터.
  5. 제4항에 있어서, 목적 단백질을 코딩하는 유전자의 염기서열 5' 말단에 상기 셀룰로오스 결합 도메인의 염기서열이 결합된, 재조합 벡터.
  6. 제5항에 있어서, 상기 목적 단백질은 써코바이러스 2형(porcine circovirus type2, PCV2) 캡시드 단백질 및 구제역 바이러스 캡시드 단백질로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나인, 재조합 벡터.
  7. 제4항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 식물 발현용 벡터인, 재조합 벡터.
  8. 제7항에 있어서, 상기 식물 발현용 벡터는 pCAMBIA 1300 및 pBI121로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나인 식물 발현용 벡터인, 재조합 벡터.
  9. 극호열균(Thermotoga maritima)에서 유래한 xylanase 10A 단백질의 CBM9(family 9 carbohydrate-binding module) 도메인의 38번째 아미노산인 아스파라긴이 글루타민으로 치환된, 셀룰로오스 결합 도메인 CBM9(N38Q)의 아미노산 서열을 포함하는, 셀룰로오스 결합 도메인의 펩타이드.
  10. 제9항에 있어서, 상기 셀룰로오스 결합 도메인 CBM9(N38Q)의 아미노산 서열은 목적 단백질의 아미노 말단에 결합된, 셀룰로오스 결합 도메인의 펩타이드.
  11. 제10항에 있어서, 상기 목적 단백질은 써코바이러스 2형(porcine circovirus type2, PCV2) 캡시드 단백질 및 구제역 바이러스 캡시드 단백질로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나인, 셀룰로오스 결합 도메인의 펩타이드.
  12. (a) 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항의 펩타이드를 포함하는 재조합 단백질을 함유하는 식물 추출물, 및 비결정셀룰로오스(amorphous cellulose)를 혼합하는 단백질 결합 단계(binding step);
    (b) 결합되지 않은 단백질을 제거하는 세척 단계(washing step); 및
    (c) 상기 비결정셀룰로오스에 결합된 단백질을 용출(elution)하는 단계를 포함하는, 셀룰로오스 결합 도메인(Cellulose binding domain)을 포함하는 단백질의 분리 방법.
KR1020170172502A 2017-12-14 2017-12-14 신규한 셀룰로오스 결합 도메인의 염기서열, 이를 포함하는 재조합 벡터 및 이를 활용한 단백질 분리정제 방법 KR102010061B1 (ko)

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KR1020170172502A KR102010061B1 (ko) 2017-12-14 2017-12-14 신규한 셀룰로오스 결합 도메인의 염기서열, 이를 포함하는 재조합 벡터 및 이를 활용한 단백질 분리정제 방법

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KR101732624B1 (ko) 2014-12-22 2017-05-08 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장) 식물 유래의 돼지 열병 백신용 조성물 및 이의 제조방법

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논문(J CHROMATOGR B.)
뉴클레오타이드 서열

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