CN114605557B - 一种降解黄曲霉毒素b1和/或玉米赤霉烯酮的融合蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

一种降解黄曲霉毒素b1和/或玉米赤霉烯酮的融合蛋白及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114605557B
CN114605557B CN202210240954.4A CN202210240954A CN114605557B CN 114605557 B CN114605557 B CN 114605557B CN 202210240954 A CN202210240954 A CN 202210240954A CN 114605557 B CN114605557 B CN 114605557B
Authority
CN
China
Prior art keywords
fusion protein
seq
zearalenone
gly
leu
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210240954.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114605557A (zh
Inventor
邓诣群
李扬
吴骏
汪玲玲
文继开
李艳红
吴婉莹
陈超
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
South China Agricultural University
Original Assignee
South China Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by South China Agricultural University filed Critical South China Agricultural University
Priority to CN202210240954.4A priority Critical patent/CN114605557B/zh
Publication of CN114605557A publication Critical patent/CN114605557A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114605557B publication Critical patent/CN114605557B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0055—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10)
    • C12N9/0057—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10) with oxygen as acceptor (1.10.3)
    • C12N9/0061—Laccase (1.10.3.2)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L5/00—Preparation or treatment of foods or foodstuffs, in general; Food or foodstuffs obtained thereby; Materials therefor
    • A23L5/20—Removal of unwanted matter, e.g. deodorisation or detoxification
    • A23L5/25—Removal of unwanted matter, e.g. deodorisation or detoxification using enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y110/00—Oxidoreductases acting on diphenols and related substances as donors (1.10)
    • C12Y110/03—Oxidoreductases acting on diphenols and related substances as donors (1.10) with an oxygen as acceptor (1.10.3)
    • C12Y110/03002—Laccase (1.10.3.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P60/00—Technologies relating to agriculture, livestock or agroalimentary industries
    • Y02P60/80—Food processing, e.g. use of renewable energies or variable speed drives in handling, conveying or stacking
    • Y02P60/87—Re-use of by-products of food processing for fodder production

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种降解黄曲霉毒素B1和/或玉米赤霉烯酮的融合蛋白及其制备方法和应用。构建了一种融合蛋白，所述融合蛋白含有玉米赤霉烯酮降解酶和漆酶，所述玉米赤霉烯酮降解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述漆酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，玉米赤霉烯酮降解酶位于漆酶的N端，所述玉米赤霉烯酮降解酶和漆酶之间通过氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的连接肽连接。所述融合蛋白能在同一环境条件下高效降解黄曲霉毒素B1和玉米赤酶烯酮，0.1mg的融合蛋白在50℃条件下，可在8h内，将2μg ZEN完全代谢，将2μg AFB1代谢95.6％。

Description

一种降解黄曲霉毒素B1和/或玉米赤霉烯酮的融合蛋白及其制 备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种降解黄曲霉毒素B1和/或玉米赤霉烯酮的融合蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
霉菌毒素污染严重的影响到了农业畜牧业的正常发展，造成了大量的经济损失。其中，黄曲霉毒素B1、玉米赤酶烯酮和呕吐毒素三者的污染范围更是广泛且深刻。黄曲霉毒素B1(AFB1)与玉米赤酶烯酮毒素(ZEN)是谷物饲料中常见的两种霉菌毒素。AFB1对哺乳动物危害主要包括中毒性肝炎、肝细胞坏死、免疫抑制和肝癌。AFB1在人和动物体内被代谢转化成AFB1-8，9-环氧化物(AF BO)，AFBO攻击DNA碱基鸟嘌呤的N7位点，生成AFB1-N7-Gua，导致DNA损伤。ZEN是一种由镰刀菌属真菌分泌的非甾体雌激素霉菌毒素，危害动物的生殖系统。霉菌毒素不易降解，使得农业畜牧业的从业者在加工生产过程中，蒙受经济损失与浪费，也给消费者带来了不小的食品安全风险。
目前已知真菌的降解酶大部分是属于氧化还原酶类，有漆酶和过氧化物酶等。漆酶属于多铜氧化酶家族的一员，有着广泛的底物谱，可氧化多种酚和非酚芳香族化合物，真菌漆酶和细菌漆酶都有着保守的铜离子活性中心。漆酶作为多铜氧化酶家族的一大成员，受到了广泛的关注，在众多行业中，漆酶是最有前途的酶制剂之一，它能在空气中降解底物并产生水，没有环境污染物产生。与真菌漆酶相比，细菌漆酶在热稳定性、pH范围和对碱性条件的耐受性方面都具有显著优势。近年来，异源功能表达或定向进化等方法已经用于将细菌漆酶转化为高增值的生物催化剂，漆酶可用于染料脱色、有毒污染物的降解、食品工业、生物传感器、造纸和纸桨生产和有机化合物合成等方面，在工业中表现出巨大的经济价值。
玉米赤霉烯酮降解酶是一种已知的玉米赤霉烯酮内酯水解酶，该酶能够打开玉米赤霉烯酮分子中的内酯环，使得开环后的玉米赤霉烯酮不再能与雌激素受体结合，从而起到毒素降解的作用。
漆酶降解黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮降解酶降解玉米赤霉烯酮，各有其最适的反应条件，但两种酶无法在同一环境条件下发挥优越的降解霉菌毒素的效果，降解效率低下，适用范围窄，不利于工业生产使用。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的上述不足，提供一种降解黄曲霉毒素B1和/或玉米赤霉烯酮的融合蛋白及其制备方法和应用。
本发明的第一个目的是提供一种融合蛋白。
本发明的第二个目的是提供一种编码基因。
本发明的第三个目的是提供一种重组质粒。
本发明的第四个目的是提供一种重组菌株。
本发明的第五个目的是提供所述融合蛋白、所述编码基因、所述重组质粒和、或所述重组菌株在降解黄曲霉毒素B1和/或玉米赤霉烯酮毒素中的应用。
本发明的第六个目的是提供所述融合蛋白的制备方法。
本发明的第七个目的是提供一种降解黄曲霉毒素B1和/或玉米赤霉烯酮毒素的方法。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
一种融合蛋白，所述融合蛋白含有玉米赤霉烯酮降解酶和漆酶，所述玉米赤霉烯酮降解酶位于漆酶的N端。
优选地，所述玉米赤霉烯酮降解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO1所示，所述漆酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
更优选地，所述玉米赤霉烯酮降解酶和漆酶之间通过连接肽连接。
更优选地，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:20所示。
最优选地，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
一种编码基因，所述编码基因编码所述融合蛋白。
优选地，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示。
一种重组质粒，为含有所述编码基因，或表达所述融合蛋白的质粒。
优选地，所述质粒为pET28a+。
一种重组菌株，为含有或转化有所述重组质粒，或表达任一所述融合蛋白的宿主菌株。
优选地，所述宿主菌株为E.coli BL21(DE3)。
所述融合蛋白、所述编码基因、所述重组质粒和/或所述重组菌株在降解黄曲霉毒素B1和/或玉米赤霉烯酮毒素中的应用。
所述融合蛋白的制备方法，培养所述的重组菌株至OD600达到0.5～0.7时，加入终浓度0.25～0.5mM的IPTG，15～17℃条件下诱导12～24h，离心，收集重组微生物细胞，破碎，收集上清液，过滤，纯化，得到所述融合蛋白。
优选地，所述IPTG终浓度为0.5mM，诱导时间为12h。
优选地，培养至重组微生物细胞OD600达到0.6，诱导时间为16℃。
一种降解黄曲霉毒素B1和/或玉米赤霉烯酮毒素的方法，用所述融合蛋白进行降解。
优选地，降解温度为30～50℃，降解时添加Tris·HCl和/或磷酸钠缓冲液。
最优选地，降解温度为50℃，降解时添加Tris·HCl缓冲液。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
构建了一种融合蛋白，所述融合蛋白含有玉米赤霉烯酮降解酶和漆酶，所述玉米赤霉烯酮降解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述漆酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，玉米赤霉烯酮降解酶位于漆酶的N端，所述漆酶和玉米赤霉烯酮降解酶之间通过氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的连接肽连接。所述融合蛋白能在同一环境条件下高效降解黄曲霉毒素B1(AFB1)和玉米赤酶烯酮(ZEN)，0.1mg的融合蛋白在50℃条件下，可在8h内，将2μgZEN完全代谢，将2μg AFB1代谢95.6％。
附图说明
图1为重组融合酶His标签表达情况。RmZHD-CueO融合酶检测的结果。其中，M为标准蛋白；1为诱导前菌体；2为诱导后菌体；3菌体破碎后沉淀；4菌体破碎后离心上清；5为上样穿透样品；9～12为梯度洗脱收集样品。
图2为RmZHD-CueO融合酶表达结果，其中1、2、3为0.25mM IPTG 16℃诱导12h的表达情况；4、5、6为0.25mM IPTG 16℃诱导24h的表达情况；7、8、9为0.5mM IPTG 16℃诱导12h的表达情况。10、11、12为0.5mM IPTG 16℃诱导24h的表达情况。
图3为CueO-RmZHD融合酶表达结果，其中1、2为0.25mM IPTG 16℃诱导24h的表达情况；3、4为0.25mM IPTG 16℃诱导12h的表达情况。5、6为0.5mM IPTG 16℃诱导24h的表达情况；7、8为0.5mM IPTG 16℃诱导12h的表达情况。
图4为RmZHD-CueO融合酶降解ZEN的质谱检测结果，其中A为：ZEN标品一级色谱图；B为：标品ZEN标准品一级质谱图；C为：RmZHD-CueO融合酶代谢ZEN的色谱图；D为：ZEN的水解产物一级质谱图；E为：ZEN的水解产物一级色谱图。
图5为RmZHD-CueO融合酶降解AFB1的质谱检测结果，其中A为：AFB1标准品一级色谱图；B为：AFB1标准品一级质谱图；C为：重组RmZHD-CueO代谢AFB1的色谱图；D：AFQ1产物一级质谱图。E：AFQ1产物一级色谱图。
图6为RmZHD-CueO融合酶的代谢底物条件对代谢效果的影响，图6a中1为：AFB1标品；2为：30℃，Tris·HCl缓冲液孵育ZEN和AFB1；3为：30℃，磷酸钠缓冲液孵育ZEN和AFB1；4为：30℃，Tris·HCl缓冲液孵育AFB1；5为：30℃，磷酸钠缓冲液孵育AFB1；6为：50℃，Tris·HCl缓冲液孵育ZEN和AFB1；7为：50℃，磷酸钠缓冲液孵育ZEN和AFB1；8为：50℃，Tris·HCl缓冲液孵育AFB1；9为：50℃，磷酸钠缓冲液孵育AFB1；
图6b中1为：ZEN标品；2为：30℃，Tris·HCl缓冲液孵育ZEN和AFB1；3为：30℃，磷酸钠缓冲液孵育ZEN和AFB1；4为：30℃，Tris·HCl缓冲液孵育ZEN；5为：30℃，磷酸钠缓冲液孵育ZEN；6为：50℃，Tris·HCl缓冲液孵育ZEN和AFB1；7为：50℃，磷酸钠缓冲液孵育ZEN和AFB1；8为：50℃，Tris·HCl缓冲液孵育ZEN；9为：50℃，磷酸钠缓冲液孵育ZEN。
图7为不同linker的RmZHD-CueO融合酶对代谢AFB1效果的影响。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1 RmZHD-CueO融合酶的表达纯化
1.融合酶的设计策略：
将玉米赤霉烯酮降解酶(RmZHD)置于漆酶(CueO)的N端进行表达，RmZHD与CueO之间通过一个连接肽(linker)进行连接。RmZHD的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，大肠杆菌K12漆酶CueO的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.表达载体的构建：
选取pET28a+作为表达载体，选取NheⅠ和XhoⅠ两个限制性内切酶位点，作为同源重组的酶切位点。根据RmZHD、CueO及pET28a+的序列，设计特异性扩增引物，扩增引物核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:4所示，扩增得到RmZHD片段。
再根据RmZHD与CueO基因序列设计特异性扩增引物，扩增引物核苷酸序列分别如SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:6所示，扩增得到CueO片段。
使用NheⅠ和XhoⅠ限制性内切酶酶切质粒，得到质粒片段。使用同源重组酶，将RmZHD片段和CueO片段通过氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的连接肽连接连接，转入E.coliDH5α，筛选阳性克隆并测序，测序结果显示成功构建载体RmZHD-CueO(GGGGS)。
在连接时，将RmZHD置于CueO的N端进行表达，再诱导融合酶的表达，编码上述融合酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示。
3.表达纯化：
将构建成功的表达载体，用热激法转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，挑取单菌落，于含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃、200rpm条件下振摇培养5h后，以1：100的比例转进500mL含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃、200rpm条件下，摇至OD600至0.6左右，加入终浓度0.5mM的IPTG，16℃，150rpm条件下诱导12h。于4℃、5000rpm条件下离心10min，弃上清收集菌体。每克菌体用20mL结合缓冲液(25mM Tris，150mM氯化钠，pH 7.5)重悬，进行超声破碎，破碎后于4℃、6000rpm条件下离心15min，收集上清，将上清过0.22μm滤膜抽滤，然后进行镍离子亲和层析(Ni-NTA)纯化，梯度洗脱，分管收集洗脱液并进行SDS-PAGE电泳。重组蛋白的SDS-PAGE电泳结果如图1所示，表明成功纯化得到纯度较高的RmZHD-CueO融合酶。
实施例2 RmZHD-CueO融合酶表达条件对表达效果的影响
一、实验方法
RmZHD-CueO融合酶大小约为87KDa，考虑到蛋白分子量大，表达剧烈可能会造成蛋白折叠错误。考察蛋白表达实验中IPTG的浓度和表达时间对蛋白表达效果的影响。蛋白表达实验中，IPTG的浓度分别选用0.25和0.5mM，表达温度设为16℃，表达时间分别为12h和24h，其他实验步骤见实施例1。
二、实验结果
如图2所示，IPTG的浓度为0.5或0.25mM时，表达时间为12h，表达效果良好，而表达时间为24h的目的蛋白表达量反而下降。最终将选择在16℃，0.5mM IPTG，表达12h作为最终表达条件。
对比例1融合酶中各酶连接顺序对表达效果的影响
一、实验方法
按照实施例1的方法，设计核苷酸序列分别如SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的特异性引物，扩增得到CueO片段，设计核苷酸序列分别如SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示的特异性引物，扩增得到RmZHD片段。使用NheⅠ和XhoⅠ限制性内切酶酶切质粒，得到质粒片段。使用同源重组酶将CueO片段和RmZHD片段通过和氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的连接肽连接，转入E.coli DH5α，筛选阳性克隆并测序，测序结果显示成功构建载体CueO-RmZHD。
在连接时，将制备融合酶的RmZHD和CueO表达顺序颠倒，即将CueO置于RmZHD的N端进行表达，再诱导融合酶的表达。
蛋白表达实验中，IPTG的浓度分别选用0.25和0.5mM，表达温度设为16℃，表达时间分别为12h和24h，其他实验方法见实施例1。
二、实验结果
结果如图3所示，将CueO置于RmZHD的N端进行表达，在86kda大小无明显条带，诱导前后带型一致，CueO-RmZHD融合酶表达失败。在构建整个质粒过程中，蛋白顺序的不同影响了融合酶表达。
实施例3 RmZHD-CueO融合酶代谢玉米赤霉烯酮(ZEN)的LC/MS检测与鉴定
一、实验方法
玉米赤霉烯酮(ZEN)浓度为10μg/mL，添加量为2μg，添加实施例1制备得到的RmZHD-CueO融合酶100μg，采用pH值为7.2的20mM Tris·HCl缓冲液补齐至反应体系为200μL。在50℃下孵育8h。使用二氯甲烷萃取后氮吹，将吹干产物溶解到200μL的甲醇中。使用安捷伦6530C LC/MS检测鉴定RmZHD-CueO融合酶代谢ZEN的底物、产物及ZEN标准品(10μg/mL)。
色谱条件：
样品的上样量5μL，柱温25℃。在0～1分钟时流动相体积比为90％水和10％甲醇。在1～15分钟时间段，甲醇比例逐渐提高至90％，水比例相应降低至10％。流速为0.25mL/min，柱子为SB-C18，1.8μm 3.0*100mm。
质谱条件：
采用正离子模式。使用Dual AJS ESI离子源。干燥气温度：300℃。干燥气流速：8L/min。喷雾器压力：45psig。鞘气温度：350℃。鞘气流速：10L/min。MS TOF参数，碰撞电压为：175v。
ZEN+H+质核比大小319.1543。ZEN代谢产物+NaH+质核比大小315.1567。
二、实验结果
ZEN标准品的色谱图和质谱图分别如图4A和图4B所示，根据计算，ZEN在氢离子正模式下，质核比为319.1540。在Fragmentor＝175V条件下，在12.104分钟检测到ZEN，平均质核比为319.1543，误差小于万分之一。
根据预测，ZEN的水解产物易与钠离子结合生成一个正电荷的离子，预测大小为315.1567，ZEN的水解产物的出峰时间为9.371分钟(如图4E所示)，质核比大小为315.1563，在误差范围内，出峰时间小于ZEN标准品。代谢后的ZEN相比代谢前增加了羟基，极性增加，在C18反向色谱柱中，出峰时间提前，符合基本化学原理。同时在12.104分钟并未检测出ZEN底物(如图4E和图4D所示)。可以证明，RmZHD-CueO融合酶代谢ZEN情况良好，在类生产环境中，孵育8h可以将ZEN完全代谢(如图4C所示)。LC/MS检测结果表明RmZHD-CueO融合酶代谢ZEN的代谢产物正确，代谢效果良好。
实施例4 RmZHD-CueO融合酶代谢黄曲霉毒素B1(AFB1)的LC/MS检测与鉴定
一、实验方法
黄曲霉毒素B1(AFB1)浓度为10μg/mL，添加量为2μg，添加实施例1制备得到的RmZHD-CueO融合酶100μg，采用pH值为7.2的20mM Tris·HCl缓冲液补齐至反应体系为200μL。在50℃下孵育8h。使用二氯甲烷萃取后氮吹，将吹干产物溶解到200μL的甲醇中。使用安捷伦6530C LC/MS检测鉴定RmZHD-CueO融合酶代谢AFB1的底物、产物及AFB1标准品(10μg/mL)，仪器检测条件见实施例3。AFB1+H+质核比大小313.0707，AFB1代谢产物AFQ1+H+质核比大小329.0656。
二、实验结果
AFB1标准品的色谱图和质谱图分别如图5A和图5B所示，AFB1标准品质核比实际大小为313.0709，符合误差，经同位素分析无误差，在Fragmentor＝175V条件下，出峰时间为9.901分钟。
AFB1经过漆酶氧化后形成AFQ1，经过计算，质核比在正离子模式下带一个正电荷为329.0656，经检测实际大小为329.0660，符合误差，经过软件分子式判定，代谢产物为AFQ1，且出峰时间为9.46分钟(如图5D～E所示)，代谢后的AFB1生成产物AFQ1，增加了羟基，极性增加，出峰时间提前于AFB1(如图5A和C)，符合AFB1和AFQ1的化学性质。
实施例5 RmZHD-CueO融合酶代谢底物条件对代谢效果的影响
一、实验方法
安捷伦6530C LC/MS仪器检测条件见实施例3。
RmZHD代谢ZEN的最适温度为30～60℃，而CueO的最适温度为50℃。RmZHD代谢ZEN和CueO代谢AFB1的最适pH相同。
RmZHD-CueO融合酶分别在30℃、50℃条件下，分别用pH值为7.2的20mMTris·HCl缓冲液和pH值为7.2的50mM磷酸钠的缓冲液对ZEN和AFB1孵育8h，再分别检测RmZHD-CueO融合酶单独对AFB1及其对ZEN的代谢能力，检测方法见实施例3。
二、实验结果
如图6a所示，在30℃条件下用pH值为7.2的Tris·HCl缓冲液和磷酸盐缓冲液孵育AFB1后，AFB1残留量分别为29.08％和32.6％。在50℃条件下，用Tris·HCl缓冲液和磷酸盐缓冲液孵育AFB1后，AFB1残留量分别为4.41％和4.85％。因此RmZHD-CueO融合酶在50℃条件下，用Tris·HCl缓冲液孵育AFB1后，能使AFB1残留量最低。
基于RmZHD的良好降解能力和较宽的反应温度，ZEN代谢效果良好。如图6b所示，在上述最佳反应条件下，ZEN在8h内代谢完全，且检测到相应代谢产物生成。
在50℃条件下，用pH值为7.2的20mMTris·HCl缓冲液分别孵育AFB1和ZEN，分别单独用RmZHD代谢ZEN，CueO代谢AFB1，与RmZHD-CueO融合酶在相同条件下代谢AFB1和ZEN相比，代谢能力没有明显差别。
对比例2不同linker对融合酶代谢AFB1的影响
一、实验方法
直接进行融合的融合蛋白，可能造成融合区的挤压导致活性减弱甚至于丧失。作为融合蛋白重组不可或缺的组成部分，linker在构建稳定且保证蛋白本身的生物活性的融合蛋白中发挥着重要的作用。linker为两个融合蛋白间起连接作用的氨基酸链，具有一定的柔性以允许两侧的蛋白完成各自独立的功能。linker在选取的长短和结构上都将对蛋白本身造成一定的影响。
在融合蛋白初步构建完成同时功能验证成功后，考虑到蛋白的完整表达，选取无linker、linker为SSG(SEQ ID NO:18)和linker为GGGGS(SEQ ID NO:5)的RmZHD-CueO融合酶水解AFB1。因漆酶CueO处于整条蛋白链末端，所以用RmZHD-CueO融合酶对降解AFB1的活性表示linker的选择是否合适。
按照实施例1的方法，设计核苷酸序列分别如SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示的特异性引物，扩增得到RmZHD片段；设计核苷酸序列分别如SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示的特异性引物，扩增得到CueO片段。
使用NheⅠ和XhoⅠ限制性内切酶酶切质粒，得到质粒片段。使用同源重组酶将RmZHD片段和CueO片段连接，不使用连接肽，转入E.coli DH5α，筛选阳性克隆并测序，测序结果显示成功构建载体RmZHD-CueO。连接时，将RmZHD置于CueO的N端进行表达。
以相同的方法，设计核苷酸序列分别如SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17所示的特异性引物，扩增得到RmZHD片段；设计核苷酸序列分别如SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19所示的特异性扩增引物，扩增得到CueO片段。使用同源重组酶将RmZHD片段和CueO片段通过氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示的连接肽连接，转入E.coli DH5α，筛选阳性克隆并测序，测序结果显示成功构建载体RmZHD-CueO(SSG)。连接时，将RmZHD置于CueO的N端进行表达。
linker为GGGGS(SEQ ID NO:7)的RmZHD-CueO酶构建纯化方法见实施例1。融合酶的表达纯化方法见实施例1。
通过使用安捷伦6530C LC/MS检测AFB1减少的量，仪器检测条件和其他实验方法见实施例3，以此来确定各RmZHD-CueO融合酶对底物AFB1的水解速度，并通过代谢速度差异，来评估不同linker对融合酶代谢AFB1的效果。
二、试验结果
表1不同linker的RmZHD-CueO融合酶代谢AFB1的水解速度
Figure BDA0003541631870000101
结果如图7所示，可以看出，linker为GGGGS(SEQ ID NO:5)的RmZHD-CueO融合酶水解AFB1的水解速度最快，AFB1的响应值最低。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
序列表
<120> 一种降解黄曲霉毒素B1和/或玉米赤霉烯酮的融合蛋白及其制备方法和应用
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 266
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ala Ala Thr Arg Thr Arg Gly Tyr Val Thr Thr Lys Asp Gly Ile
1 5 10 15
Lys Trp Tyr Tyr Glu Gln Glu Gly Ser Gly Pro Asp Val Val Leu Ile
20 25 30
Pro Asp Gly Leu Gly Glu Cys Gln Met Phe Asp Lys Pro Met Ser Leu
35 40 45
Ile Ala Ser Asn Gly Phe Arg Val Thr Thr Phe Asp Met Pro Gly Met
50 55 60
Ser Arg Ser Ser Asp Ala Pro Pro Glu Thr Tyr Gln Asp Ile Thr Gly
65 70 75 80
Arg Lys Leu Ala Gly Tyr Ile Ile Thr Leu Leu Asp Thr Leu Asp Ile
85 90 95
Lys Ile Ala Ser Val Trp Gly Cys Ser Ser Gly Ala Ser Thr Val Leu
100 105 110
Ala Leu Cys Ser Asp Tyr Pro Glu Arg Val Arg Asn Gly Met Pro His
115 120 125
Glu Val Pro Thr Glu Asn Pro Asp Ile Leu Leu His Ile His Glu Val
130 135 140
Asp Pro Ala Thr Ile Ser Gln Glu Met Ala Ala Asn Ser Arg Ala Ala
145 150 155 160
Ser Gly Asn Val Glu Ala Trp Asp Ala Leu Gly Pro Glu Val His Ala
165 170 175
Arg Leu His Asp Asn Tyr Pro Arg Trp Ala Tyr Gly Tyr Pro Arg Thr
180 185 190
Ile Pro Pro Ser Ala Pro Val Lys Thr Glu Asp Leu His Lys Val Pro
195 200 205
Ile Asp Trp Thr Val Gly Ala Ser Thr Pro Thr Lys Leu Phe Phe Glu
210 215 220
Asn Ile Val Ile Ala Ala Arg Glu Gly Ile Asn Ile Gly Thr Leu Pro
225 230 235 240
Gly Asn His Phe Pro Tyr Val Ser His Pro Glu Glu Phe Ala Lys Tyr
245 250 255
Val Val Glu Thr Ser Arg Lys Tyr Leu Lys
260 265
<210> 2
<211> 516
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Gln Arg Arg Asp Phe Leu Lys Tyr Ser Val Ala Leu Gly Val Ala
1 5 10 15
Ser Ala Leu Pro Leu Trp Ser Arg Ala Val Phe Ala Ala Glu Arg Pro
20 25 30
Thr Leu Pro Ile Pro Asp Leu Leu Thr Thr Asp Ala Arg Asn Arg Ile
35 40 45
Gln Leu Thr Ile Gly Ala Gly Gln Ser Thr Phe Gly Gly Lys Thr Ala
50 55 60
Thr Thr Trp Gly Tyr Asn Gly Asn Leu Leu Gly Pro Ala Val Lys Leu
65 70 75 80
Gln Arg Gly Lys Ala Val Thr Val Asp Ile Tyr Asn Gln Leu Thr Glu
85 90 95
Glu Thr Thr Leu His Trp His Gly Leu Glu Val Pro Gly Glu Val Asp
100 105 110
Gly Gly Pro Gln Gly Ile Ile Pro Pro Gly Gly Lys Arg Ser Val Thr
115 120 125
Leu Asn Val Asp Gln Pro Ala Ala Thr Cys Trp Phe His Pro His Gln
130 135 140
His Gly Lys Thr Gly Arg Gln Val Ala Met Gly Leu Ala Gly Leu Val
145 150 155 160
Val Ile Glu Asp Asp Glu Ile Leu Lys Leu Met Leu Pro Lys Gln Trp
165 170 175
Gly Ile Asp Asp Val Pro Val Ile Val Gln Asp Lys Lys Phe Ser Ala
180 185 190
Asp Gly Gln Ile Asp Tyr Gln Leu Asp Val Met Thr Ala Ala Val Gly
195 200 205
Trp Phe Gly Asp Thr Leu Leu Thr Asn Gly Ala Ile Tyr Pro Gln His
210 215 220
Ala Ala Pro Arg Gly Trp Leu Arg Leu Arg Leu Leu Asn Gly Cys Asn
225 230 235 240
Ala Arg Ser Leu Asn Phe Ala Thr Ser Asp Asn Arg Pro Leu Tyr Val
245 250 255
Ile Ala Ser Asp Gly Gly Leu Leu Pro Glu Pro Val Lys Val Ser Glu
260 265 270
Leu Pro Val Leu Met Gly Glu Arg Phe Glu Val Leu Val Glu Val Asn
275 280 285
Asp Asn Lys Pro Phe Asp Leu Val Thr Leu Pro Val Ser Gln Met Gly
290 295 300
Met Ala Ile Ala Pro Phe Asp Lys Pro His Pro Val Met Arg Ile Gln
305 310 315 320
Pro Ile Ala Ile Ser Ala Ser Gly Ala Leu Pro Asp Thr Leu Ser Ser
325 330 335
Leu Pro Ala Leu Pro Ser Leu Glu Gly Leu Thr Val Arg Lys Leu Gln
340 345 350
Leu Ser Met Asp Pro Met Leu Asp Met Met Gly Met Gln Met Leu Met
355 360 365
Glu Lys Tyr Gly Asp Gln Ala Met Ala Gly Met Asp His Ser Gln Met
370 375 380
Met Gly His Met Gly His Gly Asn Met Asn His Met Asn His Gly Gly
385 390 395 400
Lys Phe Asp Phe His His Ala Asn Lys Ile Asn Gly Gln Ala Phe Asp
405 410 415
Met Asn Lys Pro Met Phe Ala Ala Ala Lys Gly Gln Tyr Glu Arg Trp
420 425 430
Val Ile Ser Gly Val Gly Asp Met Met Leu His Pro Phe His Ile His
435 440 445
Gly Thr Gln Phe Arg Ile Leu Ser Glu Asn Gly Lys Pro Pro Ala Ala
450 455 460
His Arg Ala Gly Trp Lys Asp Thr Val Lys Val Glu Gly Asn Val Ser
465 470 475 480
Glu Val Leu Val Lys Phe Asn His Asp Ala Pro Lys Glu His Ala Tyr
485 490 495
Met Ala His Cys His Leu Leu Glu His Glu Asp Thr Gly Met Met Leu
500 505 510
Gly Phe Thr Val
515
<210> 3
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcggcagcca tatggctagc atggcagcca cccgtac 37
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tttcagatat ttacggctgg tc 22
<210> 5
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgtaaatatc tgaaaggtgg tggtggttct atgcaacgtc gtgatttc 48
<210> 6
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tggtggtggt ggtgctcgag ttataccgta aaccctaaca tcatc 45
<210> 7
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 8
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggcagccata tggctagcat gcaacgtcgt gatttc 36
<210> 9
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cgaaccacca ccacctaccg taaaccctaa catcat 36
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggtggtggtg gttcgatggc agccaccc 28
<210> 11
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gtggtggtgg tgctcgagtt tcagatattt acggctggt 39
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
agccatatgg ctagcatggc agccacccgt 30
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
atcacgacgt tgcattttca gatatttacg 30
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cgtaaatatc tgaaaatgca acgtcgtgat 30
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gtggtggtgg tggtgtaccg taaaccctaa 30
<210> 16
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
aagaaggaga tatacatgca tcatcaccat caccacgcag ccacccgtac 50
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tttcagatat ttacggctgg tc 22
<210> 18
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cgtaaatatc tgaaatctgg tggttctggt ggttctggtg gtatgcaacg 50
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
taccgtaaac cctaacatc 19
<210> 20
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Ser Gly Gly
1
<210> 21
<211> 2364
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
atggcagcca cccgtacccg cggctacgtt accaccaaag acggcatcaa gtggtactac 60
gagcaagaag gcagtggccc ggatgtggtt ctgattccgg atggtttagg cgagtgccag 120
atgttcgaca aaccgatgtc tttaattgcc agcaacggct ttcgcgtgac caccttcgat 180
atgccgggta tgagtcgcag tagcgatgca ccgccggaga cctatcaaga tattaccggc 240
cgcaaactgg ctggttatat catcacttta ctggatactt tagatatcaa gatcgccagc 300
gtgtggggtt gtagtagcgg tgcaagcacc gtgctggcac tgtgcagcga ttatccggaa 360
cgcgttcgca atggtatgcc gcatgaagtg ccgaccgaaa acccggacat tttactgcat 420
atccatgaag ttgatcccgc taccattagc caagaaatgg cagccaatag ccgcgcagcc 480
agcggcaatg tggaagcatg ggatgcttta ggtccggaag tgcatgcacg tctgcatgat 540
aactatccgc gctgggcata tggctatcct cgcaccattc cgccgagcgc accggtgaaa 600
accgaggatc tgcacaaagt gccgatcgat tggaccgtgg gtgccagcac cccgaccaaa 660
ctgttttttg agaacattgt gattgcagcc cgtgaaggca tcaacattgg cactttaccg 720
ggtaatcatt ttccgtacgt gagccatccg gaggaattcg ccaaatacgt ggtggagacc 780
agccgtaaat atctgaaagg tggtggtggt tctatgcaac gtcgtgattt cttaaaatat 840
tccgtcgcgc tgggtgtggc ttcggctttg ccgctgtgga gccgcgcagt atttgcggca 900
gaacgcccaa cgttaccgat ccctgatttg ctcacgaccg atgcccgtaa tcgcattcag 960
ttaactattg gcgcaggcca gtccaccttt ggcgggaaaa ctgcaactac ctggggctat 1020
aacggcaatc tgctggggcc ggcggtgaaa ttacagcgcg gcaaagcggt aacggttgat 1080
atctacaacc aactgacgga agagacaacg ttgcactggc acgggctgga agtaccgggt 1140
gaagtcgacg gcggcccgca gggaattatt ccgccaggtg gcaagcgctc ggtgacgttg 1200
aacgttgatc aacctgccgc tacctgctgg ttccatccgc atcagcacgg caaaaccggg 1260
cgacaggtgg cgatggggct ggctgggctg gtggtgattg aagatgacga gatcctgaaa 1320
ttaatgctgc caaaacagtg gggtatcgat gatgttccgg tgatcgttca ggataagaaa 1380
tttagcgccg acgggcagat tgattatcaa ctggatgtga tgaccgccgc cgtgggctgg 1440
tttggcgata cgttgctgac caacggtgca atctacccgc aacacgctgc cccgcgtggt 1500
tggctgcgcc tgcgtttgct caatggctgt aatgcccgtt cgctcaattt cgccaccagc 1560
gacaatcgcc cgctgtatgt gattgccagc gacggtggtc tgctacctga accagtgaag 1620
gtgagcgaac tgccggtgct gatgggcgag cgttttgaag tgctggtgga ggttaacgat 1680
aacaaaccct ttgacctggt gacgctgccg gtcagccaga tggggatggc gattgcgccg 1740
tttgataagc ctcatccggt aatgcggatt cagccgattg ctattagtgc ctccggtgct 1800
ttgccagaca cattaagtag cctgcctgcg ttaccttcgc tggaagggct gacggtacgc 1860
aagctgcaac tctctatgga cccgatgctc gatatgatgg ggatgcagat gctaatggag 1920
aaatatggcg atcaggcgat ggccgggatg gatcacagcc agatgatggg ccatatgggg 1980
cacggcaata tgaatcatat gaaccacggc gggaagttcg atttccacca tgccaacaaa 2040
atcaacggtc aggcgtttga tatgaacaag ccgatgtttg cggcggcgaa agggcaatac 2100
gaacgttggg ttatctctgg cgtgggcgac atgatgctgc atccgttcca tatccacggc 2160
acgcagttcc gtatcttgtc agaaaatggc aaaccgccag cggctcatcg cgcgggctgg 2220
aaagataccg ttaaggtaga aggtaatgtc agcgaagtgc tggtgaagtt taatcacgat 2280
gcaccgaaag aacatgctta tatggcgcac tgccatctgc tggagcatga agatacgggg 2340
atgatgttag ggtttacggt ataa 2364

Claims (9)

1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由玉米赤霉烯酮降解酶、连接肽和漆酶组成，所述玉米赤霉烯酮降解酶位于漆酶的N端，
所述玉米赤霉烯酮降解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述漆酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，
所述玉米赤霉烯酮降解酶和漆酶之间通过连接肽连接，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:20所示。
2.一种编码基因，其特征在于，所述编码基因编码权利要求1所述融合蛋白。
3.一种重组质粒，其特征在于，为含有权利要求2所述编码基因，或表达权利1所述融合蛋白的质粒。
4.一种重组菌株，其特征在于，为含有或转化有权利要求3所述重组质粒，或表达权利1所述融合蛋白的宿主菌株。
5.权利要求1所述融合蛋白、权利要求2所述编码基因、权利要求3所述重组质粒和/或权利要求4所述重组菌株在降解黄曲霉毒素B1和/或玉米赤霉烯酮毒素中的应用，其中，所述融合蛋白连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
6.权利要求1所述融合蛋白、权利要求2所述编码基因、权利要求3所述重组质粒和/或权利要求4所述重组菌株在降解黄曲霉毒素B1中的应用，其中，所述融合蛋白连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示。
7.权利要求1所述融合蛋白的制备方法，其特征在于，培养权利要求4所述的重组菌株至OD600达到0.5～0.7时，加入终浓度0.25～0.5mM的IPTG，15～17℃条件下诱导12～24h，离心，收集重组微生物细胞，破碎，收集上清液，过滤，纯化，得到所述融合蛋白。
8.一种降解黄曲霉毒素B1和/或玉米赤霉烯酮毒素的方法，其特征在于，用权利要求1所述融合蛋白进行降解，其中，所述融合蛋白连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
9.一种降解黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，用权利要求1所述融合蛋白进行降解，其中，所述融合蛋白连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示。
CN202210240954.4A 2022-03-10 2022-03-10 一种降解黄曲霉毒素b1和/或玉米赤霉烯酮的融合蛋白及其制备方法和应用 Active CN114605557B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210240954.4A CN114605557B (zh) 2022-03-10 2022-03-10 一种降解黄曲霉毒素b1和/或玉米赤霉烯酮的融合蛋白及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210240954.4A CN114605557B (zh) 2022-03-10 2022-03-10 一种降解黄曲霉毒素b1和/或玉米赤霉烯酮的融合蛋白及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114605557A CN114605557A (zh) 2022-06-10
CN114605557B true CN114605557B (zh) 2023-07-11

Family

ID=81862631

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210240954.4A Active CN114605557B (zh) 2022-03-10 2022-03-10 一种降解黄曲霉毒素b1和/或玉米赤霉烯酮的融合蛋白及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114605557B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116286915A (zh) * 2023-04-24 2023-06-23 北京科润生科技发展有限公司 一种重组霉菌毒素降解蛋白及其制备方法和应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100351382C (zh) * 2004-03-04 2007-11-28 深圳市构思生物技术有限公司 一种漆酶表达载体
CN109820132B (zh) * 2018-12-07 2022-07-12 中国农业大学 细菌漆酶CotA蛋白在降解霉菌毒素中的应用
CN111202940B (zh) * 2019-12-20 2021-05-04 华南农业大学 玉米赤霉烯酮内酯水解酶RmZHD在降解大环内酯类抗生素中应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN114605557A (zh) 2022-06-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Biswas et al. Biosynthesis of cyanobacterial phycobiliproteins in Escherichia coli: chromophorylation efficiency and specificity of all bilin lyases from Synechococcus sp. strain PCC 7002
CN113195521B (zh) Mtu ΔI-CM内含肽变体和其应用
EP2612866A2 (en) Polypeptide associated with the synthesis of 1-deoxynojirimycin, and a use therefor
CN114605557B (zh) 一种降解黄曲霉毒素b1和/或玉米赤霉烯酮的融合蛋白及其制备方法和应用
CN113801862A (zh) 一种海洋链霉菌磷脂酶d突变体及其重组表达菌株的制备方法
CN114196648B (zh) 一种橄榄醇合成酶变体t及其用途
CN109280673B (zh) 糖苷水解酶家族7蛋白基因及其编码的蛋白和应用
WO2014097733A1 (ja) ヒト上皮細胞増殖因子の製造方法
KR20140037726A (ko) 가용성 재조합 단백질의 생산, 추출 및 정제 방법
WO2003010204A1 (en) Process for preparation of polypeptides of interest from fusion peolypeptides
US10927363B2 (en) DNA sequence and expression vector for alginate lyase
Martinez et al. Cyanobacterial phycobilisomes as a platform for the stable production of heterologous enzymes and other proteins
CN114045276A (zh) 一种比酶活提高的中性玉米赤霉烯酮降解酶突变体
CN110951716A (zh) 一种外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D及其重组菌株和应用
CN117801125B (zh) 艾塞那肽前体的融合蛋白及其应用
CN114990097B (zh) L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体及其应用
CN116218805A (zh) Irx10-ct蛋白在从头合成木聚糖中的应用
WO2023034960A2 (en) Heterohexameric fusion constructs for protein expression in cyanobacteria
CN117165643A (zh) 一种糖苷内切酶在水解高甘露糖型n-糖蛋白中的应用
KR20000064999A (ko) 신규한 유전자 및 유전자군 및 신규한 β-글루코시다제
CN116426511A (zh) 腈水解酶突变体及其应用
CN116949086A (zh) 利用马克斯克鲁维酵母重组表达血红蛋白的方法
CN111926026A (zh) 一种重组双亚基编码原儿茶酸3,4双加氧酶及其制备方法和应用
CN113151333A (zh) 一种生产重组亚硝酸盐还原酶的方法
CN116426547A (zh) 一种人工改造2,4-二氯苯酚羟化酶基因及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant