CN114990097B - L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了L‑天冬氨酸‑α‑脱羧酶突变体及其应用，提供的两种L‑天冬氨酸‑α‑脱羧酶突变体，分别通过将桃蚜来源的L‑天冬氨酸‑α‑脱羧酶的氨基端前4位或前39位氨基酸残基切除获得。相比野生型的L‑天冬氨酸‑α‑脱羧酶，两种突变体的可溶性蛋白表达分别增加了62%和56%，催化相对活性分别提高了64%和162%。可溶表达和活性提高的突变体用于β‑丙氨酸的合成时，可大幅提高β‑丙氨酸的生产效率，具有很高的应用价值。

Description

L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体及其应用。
背景技术
β-丙氨酸，又称3-氨基丙酸，在制药工业中是一种重要的前体，例如用于骨质疏松症抑制剂帕米膦酸钠和消炎药巴沙拉嗪；也是运动员改善身体机能的重要营养补充。β-丙氨酸还是生产聚β-丙氨酸（尼龙-3）的基本单位，可用于化妆品生产、水净化和建筑材料。
L-天冬氨酸-α-脱羧酶(L-aspartate-α-decarboxylase，EC4.1.1.11，ADC)能够催化L-天冬氨酸Cα位的羧基进行脱羧生成β-丙氨酸和CO2，是一种非常有竞争力的β-丙氨酸生产方法。
L-天冬氨酸-α-脱羧酶根据其来源主要分为两类：一类来源于原核生物，另一类来源于真核生物。原核生物来源的ADC需要进行自剪切修饰，才能获得催化功能，存在基于机理的不可逆失活，且催化活性较真核生物来源ADC的弱，真核生物来源的ADC不存在机理失活，工业应用潜力大。目前已报道的真核生物来源的ADC有来源于昆虫赤拟谷盗、埃及伊蚊和桃蚜（专利申请号CN201911088195.9），其中桃蚜来源的ADC（MpADC）表现出较强的底物亲和性及酶活性，具有较大的工业化应用潜力，但其在异源表达过程中不易正确折叠而形成包涵体，放大发酵培养时，存在培养条件苛刻，可溶表达少等困难，限制了MpADC的应用。进一步提高MpADC的催化活性及增加可溶性表达，对扩大其应用价值具有重要意义。
发明内容
为了改良MpADC的性能，提高其工业应用潜力，本发明的目的在于提供L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体及其应用，通过对桃蚜来源的L-天冬氨酸-α-脱羧酶基因进行突变，去除蛋白N末端部分无规卷曲肽段，得到了两种催化活性和可溶表达均显著提高的突变体。
本发明通过以下技术方案实现上述目的：
将野生型L-天冬氨酸-α-脱羧酶基因（SEQ ID NO.1，来源于申请号为CN201911088195.9的专利）采用常规方式克隆到表达载体pET28a上，获得能够表达野生型MpADC（氨基酸序列为SEQ ID NO.2）的表达载体；
通过基因工程技术分别去掉野生型MpADC氨基端前4位或前39位氨基酸残基，得到两种截短的MpADC突变体，分别命名为MpADC-△4（氨基酸序列为SEQ ID NO.4）和MpADC-△39（氨基酸序列为SEQ ID NO.6）。
编码上述两种L-天冬氨酸-α-脱羧酶及突变体的基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO.3或SEQ ID NO.5所示。
本发明提供了含上述基因的载体。
本发明还提供了含上述基因或上述载体的宿主细胞。
将上述含野生型和两种截断型突变体基因的表达载体转入大肠杆菌BL21（DE3）中，得到三株基因工程菌。
将三株基因工程菌分别进行发酵培养，于发酵罐37℃培养至OD600为15，并用IPTG于20℃诱导20-22h，诱导蛋白表达，SDS-PAGE检测蛋白的表达情况，用Image-j软件评估三种蛋白可溶性表达量，表明MpADC-△4和MpADC-△39两种突变体的蛋白可溶性表达分别是野生型蛋白表达的162%和156%。
纯化蛋白，得纯的L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体，活性检测表明，MpADC-△4和MpADC-△39两种突变体的催化活性分别是野生型活性的164%和262%。
本发明还提供了所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体及所述基因工程菌在制备含有β-丙氨酸的产品中的应用，所述方法以上述工程菌株进行全细胞催化，反应体系包含湿菌体50g/L，0.5 mM磷酸吡哆醛（PLP），通过补加底物L-天冬氨酸的方式控制反应pH在6.0-6.5范围内，反应温度37 ℃，以L-天冬氨酸为底物催化产生β-丙氨酸。
本发明的有益效果在于：
1）相比野生型的L-天冬氨酸-α-脱羧酶，突变体的可溶性蛋白表达分别增加了62%和56%，催化活性分别提高了64%和162%。
2）构建表达L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体的基因工程菌，用于制备β-丙氨酸，反应13.5小时后，β-丙氨酸的产物浓度为 232.36g/L，底物残余浓度为 23.83g/L，底物转化率94.68%，时空产率为 17.21 g·L -1·h -1。
附图说明
图1：MpADC、MpADC-△4和MpADC-△39三种工程菌表达的蛋白质SDS-PAGE图。
图2：用Image-j评估MpADC、MpADC-△4和MpADC-△39可溶性表达量结果。
图3：MpADC、MpADC-△4和MpADC-△39三种酶的纯化结果。
图4：MpADC全细胞催化反应液的HPLC出峰图谱。
图5：MpADC、MpADC-△4和MpADC-△39的三种酶的相对酶活。
图6：MpADC-△39工程菌全细胞催化合成β-丙氨酸的结果。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明进一步说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明所用试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
材料和方法
实施例中所用LB 液体培养基、TB液体培养基（g/L）皆为常规方法配制。
实施例中引物合成及测序皆委托杭州擎科生物技术有限公司完成。
实施例中的分子生物学实验包括质粒构建，感受态细胞制备、转化等，主要参照《基因工程原理》（第二版）吴乃虎编著、《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著进行。质粒提取、PCR扩增实验、胶回收及重组实验根据所用试剂盒供应商提供的说明书进行。
实施例1：MpADC、MpADC-△4和MpADC-△39表达载体的构建
将野生型L-天冬氨酸-α-脱羧酶基因（SEQ ID NO.1，来源于申请号为CN201911088195.9的专利）采用常规方式克隆到载体质粒pET28a上，获得能够表达野生型MpADC（氨基酸序列为SEQ ID NO.2）的重组基因载体，命名为pET-28a-MpADC。
以pET-28a-MpADC序列为模板，通过SnapGene4.3.6 设计引物，扩增引物如表1。以F-cut4和R-cut引物对扩增pET-28a-MpADC-△4重组质粒，以F-cut39和R-cut引物对扩增获得pET-28a-MpADC-△-39重组质粒。
表1构建突变体所用引物
PCR产物用琼脂糖凝胶核酸电泳鉴定，随后用DpnI消化模板，根据纯化试剂盒说明书纯化后，两种PCR纯化产物使用擎科公司的Trelief™ SoSoo Cloning Kit Ver.1试剂盒进行重组反应，再将重组反应产物全部化转到E. coli DH5α感受态细胞内，挑取单菌落测序验证，最终获得引入含有pET-28a-MpADC-△4和pET-28a-MpADC-△39重组质粒的克隆菌株。
实施例2：MpADC、MpADC-△4和MpADC-△39表达菌株的构建。
提取实施例1中获得的克隆菌株中的三种质粒，转化至含有pGro7(分子伴侣质粒)的E. coli BL21（DE3）表达载体中，挑取单菌落接种于含有卡那霉素50 μg/mL、氯霉素25 μg/mL的5mL LB培养基试管中，37℃、220rpm震荡培养10 h，获得表达基因工程菌。
实施例3：MpADC、MpADC-△4和MpADC-△39的外源诱导表达。
取500μL实施例2所述三个菌株，转接至含有卡那霉素50 μg/mL、氯霉素25μg/mL的50mL TB 摇瓶中，培养约2 h（OD600为2.5左右），加入终浓度为 0.2 mmol/LIPTG，20℃、180rpm诱导培养20 h 左右，6000 rpm，5min，离心收集菌体，超声破碎，SDS-PAGE检测蛋白表达，结果如图1所示，图中1：MpADC上清；2：MpADC沉淀；3：MpADC-△4上清；4：MpADC-△4沉淀；5：MpADC-△39上清；6：MpADC-△39沉淀；M：蛋白Marker ，可见相比野生型的MpADC，两种突变体在上清中的可溶表达都得到了增加。
进一步用Image-j软件评估原始菌株和突变菌株的蛋白可溶性表达量，如说明书附图2所示，突变菌株MpADC-△4、MpADC-△39的目的蛋白可溶性表达量分别是原始菌株表达量的162%和156%。
实施例4：MpADC、MpADC-△4和MpADC-△39的纯化
（1）破碎细胞：将收集的三种菌体，先用破胞液重悬清洗一次，再按照1 g菌体加5mL破胞液的比例重悬，在涡旋仪上混悬至无块状后，调节超高压低温细胞破碎仪压力为1500 MPa，破碎6-8次至菌体完全破碎、液体呈半透明状，4 ℃、10000 rpm离心20 min，取上清液，过0.45 μm滤膜，置于冰上备用。
（2）上样及洗脱：利用蠕动泵将样品泵入预先用破胞液平衡好的镍柱上（HisTrapTMFF 1 mL），缓慢上样5倍柱体积，然后先用5倍柱体积的破胞液洗脱除去没有和镍柱结合的蛋白，随后依次用25mM的咪唑缓冲液除杂蛋白，200 mM的咪唑缓冲液洗脱目的蛋白，将含有目的蛋白的洗脱收集液用10 KDa孔径的超滤离心管浓缩目的蛋白（4000g、4℃），直至洗脱液体积浓缩至2.5 mL为止。
（3）浓缩液的脱盐：用脱盐凝胶柱除去蛋白浓缩液中含有的咪唑等盐离子，将得到的脱盐蛋白，每100 μL分装成一管，置于-80 ℃保存备用。
（4）SDS-PAGE检测目的蛋白的纯度，结果如图3所示，图中M：蛋白Marker ； 1：MpADC纯酶；2：MpADC-△4纯酶；3：MpADC-△39纯酶。结果表明，三种蛋白都达到了较高的纯度。
实施例5：MpADC、MpADC-△4和MpADC-△39三种酶的催化活性测定
本发明通过测试单位时间内、等量酶产生的β-丙氨酸量来评估L-天冬氨酸-α-脱羧酶的活性，定义野生型酶的活性为100%。反应体系1ml：底物2mM，PLP 0.5mM，酶10.7μg/mL， PBS维持反应体系 pH6.5，在37℃的条件下，反应5 min，100℃灭活。12000g离心2min，取上清。
用HPLC法测L-天冬氨酸和β-丙氨酸浓度，具体检测方法为OPA柱前衍生反向HPLC测氨基酸的方法：
（1）样品预处理：反应液100 ℃灭活5min，12000 rpm离心2 min，取上清检测。
（2）衍生操作：吸取0.1 M pH=9.5硼酸溶液300 μL，加入200 μL样品和200 μL衍生剂震荡混合，避光衍生2 min，经0.45 μm的滤膜过滤，进样10 μL。
（3）色谱方法：采用色谱柱为月旭LP-C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，柱温35 ℃，流动相为甲醇：50 mM醋酸钠 (pH 3.5)=55:45洗脱，检测波长为334 nm，流速为0.8 mL/min，进样 10 μL，保留时间约为8 min，柱压约13 MPa，L-天冬氨酸和β-丙氨酸的保留时间如附图4所示。
纯酶的相对活性测试结果如附图5所示：定义野生型MpADC的相对活性为100%，则MpADC-△4的相对活性约164%，MpADC-△39的相对活性约262%，均得到了大幅提升。
实施例6：MpADC-△39工程菌全细胞催化产生β-丙氨酸
为了评估最优选突变体MpADC-△39在β-丙氨酸生产中的应用潜力，本发明做1L体系的催化反应，体系中初始底物L-天冬氨酸为55 g/L，重组大肠杆菌湿菌体50g/L（OD约30），PLP 0.5 mM，用氢氧化钠调pH至6.5，反应过程中pH上升，可通过补加底物L-天冬氨酸的方式控制反应pH在6.0-6.5之间；在磁力搅拌器（IKA®C-MAG HS 7）控制温度37 ℃、转速800 rpm，反应pH上升速度变慢后加20% H2SO4控制pH至不再上升，停止反应。
反应过程中，每间隔1 h取样用HPLC测β-丙氨酸的产量。结果如图6所示：经13.5小时反应后，pH基本不再变化，意味着反应终止，此时最终产物β-丙氨酸浓度为 232.36g/L，底物残余浓度为 23.83g/L，底物转化率 94.68%，时空产率为 17.21 g·L -1·h -1。
本发明的L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体，蛋白可溶性表达提高，催化活性增加，工业应用潜力大。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求保护范围内。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1602
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 1
atgccggcgg cgagcgcgcc gaccgactat gcgaccgcgc gtccggtgga gctgatggtt 60
accgcgagcg cgctggatga aaagccgtgc ggtcagagcc cgattatgga gagcctgagc 120
gcggcggtgt gcggttataa aagcgcgccg aacgcgagcg accatgaagc gtttgtgcgt 180
gatgcggttc gtctgatgct ggagcaggcg gtgttccgtg gtaccgaccg tcgtcgtccg 240
gttctgaact ggaagagccc ggaggaactg caagcggcgt tcgactttgc gctggatcgt 300
agcccgacca cccatggtca cctgctgcac ctgatcgagg ataccattga acacagcgtt 360
aaaaccggcc acccgtactt tatcaaccag ctgttcagca gcgtggaccc gtatggtctg 420
attggccaat ggctgaccga tgcgctgaac ccgagcgttt acacctttga agtggcgccg 480
gttatgacca tcatggagga aaccgtgctg accgagatgc gtaagtttct gggttacccg 540
gaaggcaaag gtgacggcat tttctgcccg ggtggcagca tcgcgaacgg ctatgcgatt 600
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cgtctggtgg tttacaccag cgcggacgcg cactatagca tcaagaaact gtgcgcgttt 720
gagggtatcg gcagcgataa cctgtacctg attaacaccg acaccaaggg taaaatggat 780
gttggccacc tgcgtcagca aatccagcgt accctggagg aaaaggcggt gccgattatg 840
gttagcgcga ccgcgggtac caccgtgctg ggtgcgtttg acccgattgc ggagattgcg 900
gatgtgtgcc acgaatatgg tatctggctg catgttgatg cggcgtgggg tggcggtgcg 960
ctggttagca agaaacacaa acacctgctg aacggcattg accgtgcgga tagcgttacc 1020
tggaacccgc acaagatgct gaccgcgccg cagcaatgca gcaccttcct gaccaaacac 1080
gagcgtgtgc tgaccgaaag caacagcagc tgcgcgcagt acctgtttca aaaggacaaa 1140
ttctacgata ccacctatga caccggtgat aagcacatcc aatgcggccg tcgtgcggac 1200
gttttcaaat tttggttcat gtggaaggcg aaaggtaccg atggcctgga ggcgcacgtg 1260
gacgaaaact ttgataacgc gaagtatttc accgaaatga tccgtaaccg tgcgggtttt 1320
aaactggttc tggaggaacc ggagtacacc aacattacct tttggtacgt gccgccgagc 1380
ctgcgtggtc gtcagaacga gccggacttt aagaacaaac tgcacaaggt ggcgccgaag 1440
atcaaagagc gtatgatgaa agaaggtacc atgatgatta cctaccaacc ggcggacgat 1500
ctgccgaact tctttcgtct ggttctgcag aacagcagcc tggaccaaaa cgacatggat 1560
tatttcgtga acgagattga acgtctgggt agcgatctgt aa 1602
<210> 2
<211> 537
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 2
Met Pro Ile Val Met Pro Ala Ala Ser Ala Pro Thr Asp Tyr Ala Thr
1 5 10 15
Ala Arg Pro Val Glu Leu Met Val Thr Ala Ser Ala Leu Asp Glu Lys
20 25 30
Pro Cys Gly Gln Ser Pro Ile Met Glu Ser Leu Ser Ala Ala Val Cys
35 40 45
Gly Tyr Lys Ser Ala Pro Asn Ala Ser Asp His Glu Ala Phe Val Arg
50 55 60
Asp Ala Val Arg Leu Met Leu Glu Gln Ala Val Phe Arg Gly Thr Asp
65 70 75 80
Arg Arg Arg Pro Val Leu Asn Trp Lys Ser Pro Glu Glu Leu Gln Ala
85 90 95
Ala Phe Asp Phe Ala Leu Asp Arg Ser Pro Thr Thr His Gly His Leu
100 105 110
Leu His Leu Ile Glu Asp Thr Ile Glu His Ser Val Lys Thr Gly His
115 120 125
Pro Tyr Phe Ile Asn Gln Leu Phe Ser Ser Val Asp Pro Tyr Gly Leu
130 135 140
Ile Gly Gln Trp Leu Thr Asp Ala Leu Asn Pro Ser Val Tyr Thr Phe
145 150 155 160
Glu Val Ala Pro Val Met Thr Ile Met Glu Glu Thr Val Leu Thr Glu
165 170 175
Met Arg Lys Phe Leu Gly Tyr Pro Glu Gly Lys Gly Asp Gly Ile Phe
180 185 190
Cys Pro Gly Gly Ser Ile Ala Asn Gly Tyr Ala Ile Asn Cys Ala Arg
195 200 205
Phe Ser Ala Phe Pro Glu Val Lys Thr Arg Gly Met His Gly Leu Pro
210 215 220
Arg Leu Val Val Tyr Thr Ser Ala Asp Ala His Tyr Ser Ile Lys Lys
225 230 235 240
Leu Cys Ala Phe Glu Gly Ile Gly Ser Asp Asn Leu Tyr Leu Ile Asn
245 250 255
Thr Asp Thr Lys Gly Lys Met Asp Val Gly His Leu Arg Gln Gln Ile
260 265 270
Gln Arg Thr Leu Glu Glu Lys Ala Val Pro Ile Met Val Ser Ala Thr
275 280 285
Ala Gly Thr Thr Val Leu Gly Ala Phe Asp Pro Ile Ala Glu Ile Ala
290 295 300
Asp Val Cys His Glu Tyr Gly Ile Trp Leu His Val Asp Ala Ala Trp
305 310 315 320
Gly Gly Gly Ala Leu Val Ser Lys Lys His Lys His Leu Leu Asn Gly
325 330 335
Ile Asp Arg Ala Asp Ser Val Thr Trp Asn Pro His Lys Met Leu Thr
340 345 350
Ala Pro Gln Gln Cys Ser Thr Phe Leu Thr Lys His Glu Arg Val Leu
355 360 365
Thr Glu Ser Asn Ser Ser Cys Ala Gln Tyr Leu Phe Gln Lys Asp Lys
370 375 380
Phe Tyr Asp Thr Thr Tyr Asp Thr Gly Asp Lys His Ile Gln Cys Gly
385 390 395 400
Arg Arg Ala Asp Val Phe Lys Phe Trp Phe Met Trp Lys Ala Lys Gly
405 410 415
Thr Asp Gly Leu Glu Ala His Val Asp Glu Asn Phe Asp Asn Ala Lys
420 425 430
Tyr Phe Thr Glu Met Ile Arg Asn Arg Ala Gly Phe Lys Leu Val Leu
435 440 445
Glu Glu Pro Glu Tyr Thr Asn Ile Thr Phe Trp Tyr Val Pro Pro Ser
450 455 460
Leu Arg Gly Arg Gln Asn Glu Pro Asp Phe Lys Asn Lys Leu His Lys
465 470 475 480
Val Ala Pro Lys Ile Lys Glu Arg Met Met Lys Glu Gly Thr Met Met
485 490 495
Ile Thr Tyr Gln Pro Ala Asp Asp Leu Pro Asn Phe Phe Arg Leu Val
500 505 510
Leu Gln Asn Ser Ser Leu Asp Gln Asn Asp Met Asp Tyr Phe Val Asn
515 520 525
Glu Ile Glu Arg Leu Gly Ser Asp Leu
530 535
<210> 3
<211> 1602
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgccggcgg cgagcgcgcc gaccgactat gcgaccgcgc gtccggtgga gctgatggtt 60
accgcgagcg cgctggatga aaagccgtgc ggtcagagcc cgattatgga gagcctgagc 120
gcggcggtgt gcggttataa aagcgcgccg aacgcgagcg accatgaagc gtttgtgcgt 180
gatgcggttc gtctgatgct ggagcaggcg gtgttccgtg gtaccgaccg tcgtcgtccg 240
gttctgaact ggaagagccc ggaggaactg caagcggcgt tcgactttgc gctggatcgt 300
agcccgacca cccatggtca cctgctgcac ctgatcgagg ataccattga acacagcgtt 360
aaaaccggcc acccgtactt tatcaaccag ctgttcagca gcgtggaccc gtatggtctg 420
attggccaat ggctgaccga tgcgctgaac ccgagcgttt acacctttga agtggcgccg 480
gttatgacca tcatggagga aaccgtgctg accgagatgc gtaagtttct gggttacccg 540
gaaggcaaag gtgacggcat tttctgcccg ggtggcagca tcgcgaacgg ctatgcgatt 600
aactgcgcgc gttttagcgc gttcccggaa gttaagaccc gtggtatgca tggtctgccg 660
cgtctggtgg tttacaccag cgcggacgcg cactatagca tcaagaaact gtgcgcgttt 720
gagggtatcg gcagcgataa cctgtacctg attaacaccg acaccaaggg taaaatggat 780
gttggccacc tgcgtcagca aatccagcgt accctggagg aaaaggcggt gccgattatg 840
gttagcgcga ccgcgggtac caccgtgctg ggtgcgtttg acccgattgc ggagattgcg 900
gatgtgtgcc acgaatatgg tatctggctg catgttgatg cggcgtgggg tggcggtgcg 960
ctggttagca agaaacacaa acacctgctg aacggcattg accgtgcgga tagcgttacc 1020
tggaacccgc acaagatgct gaccgcgccg cagcaatgca gcaccttcct gaccaaacac 1080
gagcgtgtgc tgaccgaaag caacagcagc tgcgcgcagt acctgtttca aaaggacaaa 1140
ttctacgata ccacctatga caccggtgat aagcacatcc aatgcggccg tcgtgcggac 1200
gttttcaaat tttggttcat gtggaaggcg aaaggtaccg atggcctgga ggcgcacgtg 1260
gacgaaaact ttgataacgc gaagtatttc accgaaatga tccgtaaccg tgcgggtttt 1320
aaactggttc tggaggaacc ggagtacacc aacattacct tttggtacgt gccgccgagc 1380
ctgcgtggtc gtcagaacga gccggacttt aagaacaaac tgcacaaggt ggcgccgaag 1440
atcaaagagc gtatgatgaa agaaggtacc atgatgatta cctaccaacc ggcggacgat 1500
ctgccgaact tctttcgtct ggttctgcag aacagcagcc tggaccaaaa cgacatggat 1560
tatttcgtga acgagattga acgtctgggt agcgatctgt aa 1602
<210> 4
<211> 533
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Pro Ala Ala Ser Ala Pro Thr Asp Tyr Ala Thr Ala Arg Pro Val
1 5 10 15
Glu Leu Met Val Thr Ala Ser Ala Leu Asp Glu Lys Pro Cys Gly Gln
20 25 30
Ser Pro Ile Met Glu Ser Leu Ser Ala Ala Val Cys Gly Tyr Lys Ser
35 40 45
Ala Pro Asn Ala Ser Asp His Glu Ala Phe Val Arg Asp Ala Val Arg
50 55 60
Leu Met Leu Glu Gln Ala Val Phe Arg Gly Thr Asp Arg Arg Arg Pro
65 70 75 80
Val Leu Asn Trp Lys Ser Pro Glu Glu Leu Gln Ala Ala Phe Asp Phe
85 90 95
Ala Leu Asp Arg Ser Pro Thr Thr His Gly His Leu Leu His Leu Ile
100 105 110
Glu Asp Thr Ile Glu His Ser Val Lys Thr Gly His Pro Tyr Phe Ile
115 120 125
Asn Gln Leu Phe Ser Ser Val Asp Pro Tyr Gly Leu Ile Gly Gln Trp
130 135 140
Leu Thr Asp Ala Leu Asn Pro Ser Val Tyr Thr Phe Glu Val Ala Pro
145 150 155 160
Val Met Thr Ile Met Glu Glu Thr Val Leu Thr Glu Met Arg Lys Phe
165 170 175
Leu Gly Tyr Pro Glu Gly Lys Gly Asp Gly Ile Phe Cys Pro Gly Gly
180 185 190
Ser Ile Ala Asn Gly Tyr Ala Ile Asn Cys Ala Arg Phe Ser Ala Phe
195 200 205
Pro Glu Val Lys Thr Arg Gly Met His Gly Leu Pro Arg Leu Val Val
210 215 220
Tyr Thr Ser Ala Asp Ala His Tyr Ser Ile Lys Lys Leu Cys Ala Phe
225 230 235 240
Glu Gly Ile Gly Ser Asp Asn Leu Tyr Leu Ile Asn Thr Asp Thr Lys
245 250 255
Gly Lys Met Asp Val Gly His Leu Arg Gln Gln Ile Gln Arg Thr Leu
260 265 270
Glu Glu Lys Ala Val Pro Ile Met Val Ser Ala Thr Ala Gly Thr Thr
275 280 285
Val Leu Gly Ala Phe Asp Pro Ile Ala Glu Ile Ala Asp Val Cys His
290 295 300
Glu Tyr Gly Ile Trp Leu His Val Asp Ala Ala Trp Gly Gly Gly Ala
305 310 315 320
Leu Val Ser Lys Lys His Lys His Leu Leu Asn Gly Ile Asp Arg Ala
325 330 335
Asp Ser Val Thr Trp Asn Pro His Lys Met Leu Thr Ala Pro Gln Gln
340 345 350
Cys Ser Thr Phe Leu Thr Lys His Glu Arg Val Leu Thr Glu Ser Asn
355 360 365
Ser Ser Cys Ala Gln Tyr Leu Phe Gln Lys Asp Lys Phe Tyr Asp Thr
370 375 380
Thr Tyr Asp Thr Gly Asp Lys His Ile Gln Cys Gly Arg Arg Ala Asp
385 390 395 400
Val Phe Lys Phe Trp Phe Met Trp Lys Ala Lys Gly Thr Asp Gly Leu
405 410 415
Glu Ala His Val Asp Glu Asn Phe Asp Asn Ala Lys Tyr Phe Thr Glu
420 425 430
Met Ile Arg Asn Arg Ala Gly Phe Lys Leu Val Leu Glu Glu Pro Glu
435 440 445
Tyr Thr Asn Ile Thr Phe Trp Tyr Val Pro Pro Ser Leu Arg Gly Arg
450 455 460
Gln Asn Glu Pro Asp Phe Lys Asn Lys Leu His Lys Val Ala Pro Lys
465 470 475 480
Ile Lys Glu Arg Met Met Lys Glu Gly Thr Met Met Ile Thr Tyr Gln
485 490 495
Pro Ala Asp Asp Leu Pro Asn Phe Phe Arg Leu Val Leu Gln Asn Ser
500 505 510
Ser Leu Asp Gln Asn Asp Met Asp Tyr Phe Val Asn Glu Ile Glu Arg
515 520 525
Leu Gly Ser Asp Leu
530
<210> 5
<211> 1497
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atggagagcc tgagcgcggc ggtgtgcggt tataaaagcg cgccgaacgc gagcgaccat 60
gaagcgtttg tgcgtgatgc ggttcgtctg atgctggagc aggcggtgtt ccgtggtacc 120
gaccgtcgtc gtccggttct gaactggaag agcccggagg aactgcaagc ggcgttcgac 180
tttgcgctgg atcgtagccc gaccacccat ggtcacctgc tgcacctgat cgaggatacc 240
attgaacaca gcgttaaaac cggccacccg tactttatca accagctgtt cagcagcgtg 300
gacccgtatg gtctgattgg ccaatggctg accgatgcgc tgaacccgag cgtttacacc 360
tttgaagtgg cgccggttat gaccatcatg gaggaaaccg tgctgaccga gatgcgtaag 420
tttctgggtt acccggaagg caaaggtgac ggcattttct gcccgggtgg cagcatcgcg 480
aacggctatg cgattaactg cgcgcgtttt agcgcgttcc cggaagttaa gacccgtggt 540
atgcatggtc tgccgcgtct ggtggtttac accagcgcgg acgcgcacta tagcatcaag 600
aaactgtgcg cgtttgaggg tatcggcagc gataacctgt acctgattaa caccgacacc 660
aagggtaaaa tggatgttgg ccacctgcgt cagcaaatcc agcgtaccct ggaggaaaag 720
gcggtgccga ttatggttag cgcgaccgcg ggtaccaccg tgctgggtgc gtttgacccg 780
attgcggaga ttgcggatgt gtgccacgaa tatggtatct ggctgcatgt tgatgcggcg 840
tggggtggcg gtgcgctggt tagcaagaaa cacaaacacc tgctgaacgg cattgaccgt 900
gcggatagcg ttacctggaa cccgcacaag atgctgaccg cgccgcagca atgcagcacc 960
ttcctgacca aacacgagcg tgtgctgacc gaaagcaaca gcagctgcgc gcagtacctg 1020
tttcaaaagg acaaattcta cgataccacc tatgacaccg gtgataagca catccaatgc 1080
ggccgtcgtg cggacgtttt caaattttgg ttcatgtgga aggcgaaagg taccgatggc 1140
ctggaggcgc acgtggacga aaactttgat aacgcgaagt atttcaccga aatgatccgt 1200
aaccgtgcgg gttttaaact ggttctggag gaaccggagt acaccaacat taccttttgg 1260
tacgtgccgc cgagcctgcg tggtcgtcag aacgagccgg actttaagaa caaactgcac 1320
aaggtggcgc cgaagatcaa agagcgtatg atgaaagaag gtaccatgat gattacctac 1380
caaccggcgg acgatctgcc gaacttcttt cgtctggttc tgcagaacag cagcctggac 1440
caaaacgaca tggattattt cgtgaacgag attgaacgtc tgggtagcga tctgtaa 1497
<210> 6
<211> 498
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Met Glu Ser Leu Ser Ala Ala Val Cys Gly Tyr Lys Ser Ala Pro Asn
1 5 10 15
Ala Ser Asp His Glu Ala Phe Val Arg Asp Ala Val Arg Leu Met Leu
20 25 30
Glu Gln Ala Val Phe Arg Gly Thr Asp Arg Arg Arg Pro Val Leu Asn
35 40 45
Trp Lys Ser Pro Glu Glu Leu Gln Ala Ala Phe Asp Phe Ala Leu Asp
50 55 60
Arg Ser Pro Thr Thr His Gly His Leu Leu His Leu Ile Glu Asp Thr
65 70 75 80
Ile Glu His Ser Val Lys Thr Gly His Pro Tyr Phe Ile Asn Gln Leu
85 90 95
Phe Ser Ser Val Asp Pro Tyr Gly Leu Ile Gly Gln Trp Leu Thr Asp
100 105 110
Ala Leu Asn Pro Ser Val Tyr Thr Phe Glu Val Ala Pro Val Met Thr
115 120 125
Ile Met Glu Glu Thr Val Leu Thr Glu Met Arg Lys Phe Leu Gly Tyr
130 135 140
Pro Glu Gly Lys Gly Asp Gly Ile Phe Cys Pro Gly Gly Ser Ile Ala
145 150 155 160
Asn Gly Tyr Ala Ile Asn Cys Ala Arg Phe Ser Ala Phe Pro Glu Val
165 170 175
Lys Thr Arg Gly Met His Gly Leu Pro Arg Leu Val Val Tyr Thr Ser
180 185 190
Ala Asp Ala His Tyr Ser Ile Lys Lys Leu Cys Ala Phe Glu Gly Ile
195 200 205
Gly Ser Asp Asn Leu Tyr Leu Ile Asn Thr Asp Thr Lys Gly Lys Met
210 215 220
Asp Val Gly His Leu Arg Gln Gln Ile Gln Arg Thr Leu Glu Glu Lys
225 230 235 240
Ala Val Pro Ile Met Val Ser Ala Thr Ala Gly Thr Thr Val Leu Gly
245 250 255
Ala Phe Asp Pro Ile Ala Glu Ile Ala Asp Val Cys His Glu Tyr Gly
260 265 270
Ile Trp Leu His Val Asp Ala Ala Trp Gly Gly Gly Ala Leu Val Ser
275 280 285
Lys Lys His Lys His Leu Leu Asn Gly Ile Asp Arg Ala Asp Ser Val
290 295 300
Thr Trp Asn Pro His Lys Met Leu Thr Ala Pro Gln Gln Cys Ser Thr
305 310 315 320
Phe Leu Thr Lys His Glu Arg Val Leu Thr Glu Ser Asn Ser Ser Cys
325 330 335
Ala Gln Tyr Leu Phe Gln Lys Asp Lys Phe Tyr Asp Thr Thr Tyr Asp
340 345 350
Thr Gly Asp Lys His Ile Gln Cys Gly Arg Arg Ala Asp Val Phe Lys
355 360 365
Phe Trp Phe Met Trp Lys Ala Lys Gly Thr Asp Gly Leu Glu Ala His
370 375 380
Val Asp Glu Asn Phe Asp Asn Ala Lys Tyr Phe Thr Glu Met Ile Arg
385 390 395 400
Asn Arg Ala Gly Phe Lys Leu Val Leu Glu Glu Pro Glu Tyr Thr Asn
405 410 415
Ile Thr Phe Trp Tyr Val Pro Pro Ser Leu Arg Gly Arg Gln Asn Glu
420 425 430
Pro Asp Phe Lys Asn Lys Leu His Lys Val Ala Pro Lys Ile Lys Glu
435 440 445
Arg Met Met Lys Glu Gly Thr Met Met Ile Thr Tyr Gln Pro Ala Asp
450 455 460
Asp Leu Pro Asn Phe Phe Arg Leu Val Leu Gln Asn Ser Ser Leu Asp
465 470 475 480
Gln Asn Asp Met Asp Tyr Phe Val Asn Glu Ile Glu Arg Leu Gly Ser
485 490 495
Asp Leu

Claims (9)

1.L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体，其特征在于所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体是通过将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的氨基端前4位或前39位氨基酸残基切除获得的，分别对应获得氨基酸序列为SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6所示的突变体。
2.编码权利要求1所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体的基因。
3.含权利要求2所述基因的载体。
4.含权利要求2所述基因或权利要求3所述载体的宿主细胞。
5.一种基因工程菌，其特征在于是以大肠杆菌为宿主，表达权利要求1所述的L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体。
6.如权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌以大肠杆菌BL21为宿主。
7.如权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌含有以pET系列的表达载体，具体所述载体为pET28a。
8.一种制备L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体的方法，其特征在于将表达权利要求1所述的L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体的基因工程菌接种于培养基中，37℃培养至OD600为15，加IPTG于20℃诱导20-22h。
9.权利要求1所述的L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体或权利要求5-7任一所述的基因工程菌在制备含有β-丙氨酸产品中的应用。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109055346A (zh) * 2018-09-27 2018-12-21 江南大学 一种热稳定性提高的L-天冬氨酸-α-脱羧酶
CN109735522A (zh) * 2018-12-26 2019-05-10 浙江工业大学 一种L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109055346A (zh) * 2018-09-27 2018-12-21 江南大学 一种热稳定性提高的L-天冬氨酸-α-脱羧酶
CN109735522A (zh) * 2018-12-26 2019-05-10 浙江工业大学 一种L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Pyrazinamide triggers degradation of its target aspartate decarboxylase;Pooja Gopal et al.;《Nature communications》;第1-10页 *
埃及伊蚊来源半胱亚磺酸脱羧酶的性质解析与分子改造;郑文慧;《中国硕士论文全文库》;全文 *
赤拟谷盗来源天冬氨酸甜脱羧酶分子改造及催化合成β-丙氨酸工艺的建立;王超等;《食品与发酵工业》;第45卷(第11期);第7-13页 *

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