JP2012531198A - Crm197及びその誘導体の産生のための人工遺伝子の細菌発現 - Google Patents
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Abstract
本発明は、CRM197をコードし、その大腸菌中での発現に最適化された、配列番号1を含むポリヌクレオチド配列に関するものである。その結果、本発明は、大腸菌中での、融合タンパク質CRM197−タグを経由した、CRM197の生産方法に関する。
Description
本発明は、人工遺伝子配列を用いた医薬的興味のあるタンパク質の産生であって、前述の配列が発現ベクター中に挿入されているものと、前述の発現ベクターを用いて転換された微生物中での対応タンパク質の過剰発現と、発現したタンパク質を単離する方法の分野に関する;具体的に、それは、CRM197全体及びその誘導体をコードする人工遺伝子の構築、大腸菌(エシェリキア・コリ)中でのCRM197及びその誘導体の発現、並びにタンパク質CRM197の単離及び精製方法に関するものである。
タンパク質CRM197(交差反応性物質197,58kDa)は、ジフテリア毒素(DTx)の変異体であって、その毒性を低減する単一変異を特徴とするものである(即ち、ヌクレオチド変異が、52位におけるグリシン−グルタミン酸置換を生じさせる)(Uchida T.et al,1973;Giannini G.et al,1984)。それにもかかわらず、タンパク質CRM197は、ジフテリア毒素と同一の炎症特性及び免疫刺激特性を保持しており、それは、ボルデテラ・パータッシス、クロストリジウム・テタニ、コリネバクテリウム・ジフセリエ、ヘパティティスBウイルス、及びヘモフィルス・インフルエンザB型に対する結合型ワクチンの調製に広く使用されている(WO93/24148及びWO97/00697,WO02/055105)。野生型ジフテリア毒素と同様に、CRM197は、ジスルフィド架橋により一緒に結合した2つのドメインA及びBを含む。ドメインA(21kDa)は、触媒ドメインであり、一方、ドメインB(37kDa)は、細胞受容体に結合するための1つのサブドメインと、転位のためのもう1つのサブドメインとを含有する(Gill D.M.et al,1971;Uchida T.et al,1973)。DTxと同様に、タンパク質CRM197は、(ドメインBを用いて)細胞受容体HB−EGF(ヘパリン結合性上皮増殖因子)に結合することができ、それは、エンドサイトーシスによって細胞内部で転位を可能にする。エンドソーム中で低いpHにさらされ、膜中におけるドメインBの挿入及びサイトゾル中におけるその後のドメインAの転位に欠かせない立体構造変化を引き起こす(Papini E.et al,1993;Cabiaux V.et al,1997)。転位に必須の条件は、2つのドメインA及びB間のペプチド結合のプロテアーゼによる破断である。ジスルフィド架橋の還元と組み合わされて、この消化はドメインAを放出し、それを活性にする一方で、単一ポリペプチドとして合成された全タンパク質は、不活性である(Gill D.M.et al,1971)。
ジフテリア毒素のドメインAは、ADPリボシル化活性を有し、ADPリボース基のNADから伸長因子2(EF−2)への転移を触媒しており、それはタンパク質合成に関与するものである。形成される複合体は、不活性であり、それ故に真核生物のタンパク質合成の妨害を引き起こす(Honjio T.et al,1971)。また、タンパク質の細胞毒性効果も、ドメインAのもう1つの活性によるものであり、それはDNAを非特異的に分解することができる(Giannini G.et al,1984)。このエンドヌクレアーゼ活性は、二価の陽イオンによって決まり、その上、CRM197中に保持される(Bruce C.et al,1990;Lee J.W.et al,2005)。
CRM197及び他の非毒性変異体は、通常、特定のβファージ(そのゲノムはジフテリア毒素(DTx)をコードする変異型tox遺伝子を含有する)に感染したコリネバクテリウム・ジフセリエの溶原性培養物を用いて産生されている。ジフテリア毒素及び他の変異体は、特定の増殖条件下の培地中に分泌され、次いで、ろ過又は沈殿によって回収され、その後、クロマトグラフィー法を用いて精製される(Cox J.,1975)。DTx及びその誘導体(CRMs)の両方の産生のために最初に使用される手順は、高収率を保証し得るが、コリネバクテリウムの単一溶原株からのCRM197の産生は、ワクチン中での抱合体としての使用に対して経済的に有利でなかった。CRM197の産生を工業規模に増大させるため、二重及び三重溶原変異体をその後に単離したが、それらは染色体中に組み込まれた2つ又は3つのtox遺伝子を含有するものである(Rappuoli R.et al,1983;Rappuoli R.,1983)。1990年、Rappuoliは、DTxに由来するタンパク質の産生方法であって、染色体中に組み込まれた変異tox遺伝子の2コピーを備えたコリネバクテリウム菌株を使用する方法について説明した。また、収率を増加させるため、増殖条件を確立した(培地、第一鉄イオンの濃度、増殖温度、酸素濃度等)(米国特許4925792,1990年)。CRM197は、対数増殖期を通じて、定常期の開始まで、培地中に蓄積しており、それは、発酵が開始してから20時間前後でピークに達する。その後、収率の大幅な減少の痕跡があるが、おそらくタンパク質分解が原因である(米国特許4925792,1990年)。
発現効率の増加のための二重及び三重溶原株の構築は、骨の折れる選別段階を伴う長期間のプロセスであることに注意しなくてはいけない。高レベルのCRM197を得るための代替方法は、CRM197をコードするファージ遺伝子のプラスミドpNG−22による融合から得られる、特異的プラスミド,pPX3511を使用する(米国特許5614382,1995年)。これは、多重溶原性菌種の選択を必要とせずに、遺伝子のコピー数を増大させることを可能にする(細胞につき5〜10まで)。繰り返して言うが、ファージβ197tox−に感染したコリネバクテリウム菌株の場合のように、CRM197は、第一鉄の含量が低い特定の培地中において発現される。上記菌種の遺伝子処理に必要とされる時間の低減にもかかわらず、CRM197の産出量は、二重溶原菌の使用と比較して劇的には増大しない。最近では、DTx又は他の各種CRMsの産生のための発酵方法が、幾つかの特許に記載されており、通常、C.ジフセリエ培養物の使用を含む。一般的に言えば、増殖は、温度、攪拌及び曝気の制御された条件下で行われ、その毒素及び/又はその誘導体の最大産生量は、20時間の培養後に生じる(Dehottay P.M.H.et al,US2008/0193475;Wolfe H.et al,US2008/0153750)。
一方、コリネバクテリウムの代替物としての細菌宿主の使用に関する研究は、制限されている。ドメインA及びBの発現、並びに一部中間形態のDTx(ドメインAがドメインBの部分と一緒のもの)に関し、大腸菌中でテストが行われた。これらの研究は、一般に、毒性、受容体への結合、タンパク質の折り畳み及び安定性の観点から、ドメインA及びB(並びにそれらの部分)の役割を詳細に調べるために行われている(Bishai WR et al,1987a;Bishai WR et al,1987b)。これら断片(その一部は融合タンパク質として産生される)は、それらの溶解度及び最終収率(0.4〜10mg/Lの範囲で変化し、全タンパク質の約7%に相当する)を評価する目的で、異なるプロモーター及び異なる発現条件を用いて大腸菌中で発現されてきた。並行して、1875bpの断片であって、元のtoxプロモーター、シグナル配列及びCRM197をコードする全遺伝子を含む断片をクローン化した。ウエスタンブロッティング実験における対照として使用されると、このクローンは、細胞質周囲レベルで発現した場合、各種断片よりも安定しいるようであるが、タンパク質の溶解度は、高温下、細胞質中で発現した場合、著しく低下する(Bishai WR et al,1987b)。
天然のtoxプロモーターを用いて、完全なドメインAを発現することが可能であるが(Leong D.et al,1983)、大腸菌中におけるドメインB単独の発現は、このドメインが非常に不安定で、タグとの融合においてのみ発現するため、より複雑であると証明されている(Spilsberg B.et al,2005)。
明らかに、上記毒素及びその誘導体の異種産生は、最適なタンパク質立体構造の採用、潜在的な分解及び低い最終収率に関する多くの問題によって制限される。理想的なタンパク質立体構造に関与する2つの分子間ジスルフィド架橋の形成を回避するための1つの戦略は、幾つかの修飾ペプチド誘導体、特にはペプチドDTa(CRM197配列の最初の185aaからなる)、ペプチドDTb(255aa、細胞受容体に結合するドメイン及びN末端での8aaの欠失がある)、及び先の2つのペプチドの融合から得られるペプチドDTaDTb(440aa)の構築を含んだ。これら断片は、C.ジフセリエゲノムを鋳型として用いるPCRによって合成され、その後、トリプトファン誘導システムを利用することによって、それらは大腸菌中で発現した(Corvaia N.et al,FR2827606A1 2003年)。
最近では、可溶形態のHB−EGFに結合する能力に関する潜在的な抗腫瘍作用のため、CRM197への関心が高まっている(Mekada et al,US2006/0270600A1)。この抗腫瘍機能は、CRM197だけでなく、DT毒素の他の非毒性誘導体(例えば、二重変異体DT52E148K、又は融合タンパク質GST−DT)にも起因し得る。これら変異体は、CRM197をコードする遺伝子から開始して、PCRによって構築された。しかしながら、前述の研究では、35℃にて16〜17時間成長させた、C.ジフセリエの培養物を用いて、CRM197全体を産生した。CRM197は、硫酸アンモニウムによる初期沈殿によって上澄みから精製され、次に、イオン交換及び疎水性クロマトグラフィーの連続する3つの工程が続いた(Mekada et al,US2006/0270600A1)。
それ故、ジフセリエ毒素全体又はCRM195の大腸菌中での発現を記載する文献において利用できる研究はない。
従って、短期間に、費用効率の高い収率で、好ましくはコリネバクテリウムに代わる細菌宿主の使用によって、CRM197(及びその誘導体)を産生するための代替方法を処理する必要が明らかにある。
(定義及び略語)
CRM197:交差反応性物質
DTx:ジフテリア毒素
DTA:ジフテリア毒素ドメインA
DTB:ジフテリア毒素ドメインB
EF−2:伸長因子−2
SDS−PAGE:ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動
IPTG:イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド
CRM197:交差反応性物質
DTx:ジフテリア毒素
DTA:ジフテリア毒素ドメインA
DTB:ジフテリア毒素ドメインB
EF−2:伸長因子−2
SDS−PAGE:ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動
IPTG:イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド
(発明の概要)
本発明は、大腸菌中でのタンパク質CRM197の過剰発現に特異的な人工ポリヌクレオチド配列(配列番号1)を用いて、上述の問題を解決する。その遺伝子は、タグ配列に関連でき、その結果、大腸菌中での融合タンパク質,CRM197−タグの発現を可能にする。また、本発明は、配列番号1の配列を含有するプラスミド、及び前記プラスミドの導入によって遺伝子改変した大腸菌株に関係する。一の態様では、本発明は、上述の遺伝子改変した大腸菌から産生された組換え融合タンパク質CRM197−タグに関係する。
本発明は、大腸菌中でのタンパク質CRM197の過剰発現に特異的な人工ポリヌクレオチド配列(配列番号1)を用いて、上述の問題を解決する。その遺伝子は、タグ配列に関連でき、その結果、大腸菌中での融合タンパク質,CRM197−タグの発現を可能にする。また、本発明は、配列番号1の配列を含有するプラスミド、及び前記プラスミドの導入によって遺伝子改変した大腸菌株に関係する。一の態様では、本発明は、上述の遺伝子改変した大腸菌から産生された組換え融合タンパク質CRM197−タグに関係する。
また、本発明は、先に説明したように遺伝子改変した大腸菌中での発現及びその後の精製による、N末端タグを持つ組換えタンパク質CRM197(ドメインA及びB)の生産方法に関係する。また、上記方法は、天然型のタンパク質CRM197を得るための上記タグの除去を含む。
本発明は、微生物コリネバクテリウム・ジフセリエの使用に代わるものとしての、タンパク質CRM197及び類似のタンパク質を産生するための新規な方法を提供する。本発明に記載の手順によれば、興味のある上記タンパク質は、基礎研究及び内科治療分野での適用のため、大量に得ることができる。本発明は、以下に示す利点を示す:i)それは、微生物である大腸菌(産業的及び薬理学的用途のための異種タンパク質の発現において十分に使用される)を使用する;ii)大腸菌の遺伝的特徴は、何年にもわたり知られており、多くの代替システム(ベクター及び菌株)がその発現に使用可能である;iii)それは、非病原性微生物である;iv)大腸菌の使用は、それが高バイオマス収率で急速に成長するため、生産回数が低減できるようになる。
Giannini G.et al(1984)によって説明され、細胞外に搬出するための天然シグナル配列のない、全CRM197に相当する配列は、Letoソフトウェア(Entelechon GmbH,レーゲンスブルク,ドイツ)の助けにより、大腸菌中での発現のために最適化された配列番号1のポリヌクレオチド配列を得るために使用された。
また、配列番号1の遺伝子配列は、細胞質安定性を促進し及び/又は各種タグペプチドに対して親和性の高いマトリックス及び樹脂を用いたその後の精製を容易にするため、タグポリペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列と、5’及び3’の両末端にて、関連することができる。タグポリペプチドをコードする既知ヌクレオチド配列は、非常に多く存在する。これらの中でも、タグMASMTGGQQMG(T7−タグ)、NDYKDDDDKC(FLAG−タグ)、WSHPQFEK(Strep−タグ)、YPYDVPDYA(HAT−タグ)、KETAAAKFERQHMDS(S−タグ)、及びNEQKLISEEDLC(Myc−タグ)について、6,8,10のヒスチジン(H)(His−タグ)をコードするヌクレオチド配列がある。
また、配列番号1の遺伝子は、他のタグ配列、例えばチオレドキシン(Trx)、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)、マルトース結合タンパク質(MBP)、セルロース結合タンパク質(CBD)及びキチン結合タンパク質(CBP)と関連することができる。
タグ配列は、そのタグを後で除去することができる適切な酵素による認識に特異的な切断配列と適切に関連することができる。エンテロキナーゼ、トロンビン、Xa因子又はフューリンは、タグを除去するため、好適に使用され、最もよく知られ且つほとんどの場合に使用される切断ペプチド配列は、それぞれDDDDK、LVPRGS、IE/DGR及びRXXRである。
一の好適な実施態様において、配列番号1の遺伝子は、ポリ−ヒスチジンタグをコードするポリヌクレオチドと関連する。his−タグ配列は、5’末端側端部及び3’末端側端部の両方に加えることができる。
以下に示すものは、his−タグペプチド配列の例である:MGGSHHHHHHGMASMTGGQQMGR,MGSSHHHHHHSSG,MGSSHHHHHHSSGL,MGSGHHHHHH,MGHHHHHHHHHHSSG,MHHHHHHSSG,ALEHHHHHH,AALEHHHHHH。
一の特に好適な実施態様は、配列番号2であり、ここでは、84のヌクレオチドの配列が、5’末端側端部にて配列番号1の配列に加えられ、6のヒスチジンを含有する配列MGGSHHHHHHGMASMTGGQQMGR及びエンテロキナーゼの切断配列DDDDKをコードする。
当然ながら、配列番号1を含む配列は、開始及び停止コドンと、クローニングのために用いる制限酵素の認識部位をコードする適切な配列とを備えるのに適しているのが好ましい。
配列番号1を含む遺伝子は、化学合成によって調製でき、次いで、適切な発現ベクター中でクローン化できる。一の特定の実施態様において、人工配列(配列番号1及び2)は、組立手順によって合成的に調製されたものであり、配列番号4と配列番号6の配列をそれぞれ備えるタンパク質をコードする配列番号3と5がそれぞれ得られた。
また、本発明は、配列番号1の配列、好ましくはタグと制限酵素及び/又はプロテアーゼに特異的な認識部位とを備えたその誘導体を含む発現ベクター(プラスミド)に関する。
pETシリーズからのプラスミドは、配列番号1を含む人工遺伝子をクローン化するのに好適に使用される。具体的に、ベクターpET9aは、ファージT7のRNAポリメラーゼ酵素に対して特異的なプロモーターT7を含有する。このポリメラーゼは、極めて効率的であり(細菌RNAポリメラーゼよりもはるかに高い)、また特異的である(それは、細菌プロモーターを認識しない)。プラスミドpET9aの他、pETシリーズ(Novagen)において、そのプロセスに適した他のベクターには、pET3a,pET3b,pET3c,pET5a,pET5b,pET5c,pET9b,pET9c,pET12a,pET12b,pET12c,pET17bが含まれ、一般には、強力なファージT7プロモーターを有する全てのベクターが含まれる(例えば、pRSETA,B及びC[Invitrogen]並びにpTYB1,pTYB2,pTYB3及びpTYB4[New England Biolabs])。
クローニングのため、制限酵素として、Ndel及びBamHIを使用することが好ましい。
得られた構築物は、大腸菌株を転換するために使用できる。前述の大腸菌株は、異なる誘導質、IPTG(イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド)又はアラビノース等を利用する代わりの遺伝子発現調節システムを特徴とすることができる。
pET型プラスミドであって、ファージT7のRNAポリメラーゼ酵素に対して特異的なプロモーターT7を含有するものを用いる場合、そのときの配列番号1を含有するpET構築物による転換に適した大腸菌株は、T7RNAポリメラーゼ酵素を提供可能なもののうちいずれでもよいが、好ましくは、ER2566,ER2833,ER3011,ER3012,BL21AITM,BL21(DE3),BL21StarTM(DE3),BL21−Gold(DE3),BL21(DE3)pLys,C41(DE3),C43(DE3),BLR(DE3),B834(DE3 TunerTM(DE3)等の大腸菌B型;又はHMS174(DE3),AD494(DE3),OrigamiTM(DE3),NovaBlue(DE3),RosettaTM(DE3)等のK−12に由来する大腸菌である。細菌株は、電気穿孔法によって転換されるのが好ましいが、他の既知の方法が、同様に適している場合もある。
特定の実施態様において、配列番号3と5を備える遺伝子は、それぞれ配列番号1と2を含み、化学的に合成され、次いで、pETシリーズの特定のプラスミド中でクローン化される。クローニング及び発現に用いるベクターは、複製開始点pBR322を特徴とするpET9a(Novagen,Darmstadt,ドイツ)であった。それは、以下のことを保証する:細胞当たりの多数のコピー;細菌宿主の内部にプラスミドを保持するための選択的マーカー(カナマイシン耐性のkan遺伝子);クローニングに適した多数の制限部位を含有するポリリンカー領域;及びCRM197の過剰発現を調節するために誘導できる特異的プロモーターである。
Ndel及びBamHIは、(ポリリンカー中)プラスミドの内部で人工遺伝子をクローニングするための制限酵素として使用され、配列決定は、その適切な配向及び位置を検証するために使用された。得られた構築物は、電気穿孔法によって幾つかの大腸菌株を転換するために使用され、Petri皿(カナマイシンが加えられた固体LBを含有する)上に転換コロニーを選択する。ベクターpET9a中でクローン化されるCRM197発現に適切な細菌株の中でも、大腸菌B型の2つの誘導体、即ちBL21AI及びBL21(DE3)が選択された。両者は、誘導プロモーターによって制御される、染色体中に組み込まれたファージT7RNAポリメラーゼをコードする遺伝子のコピーを含有する。細胞内部で一度、この酵素は、プロモーターpT7から下流でクローン化された人工遺伝子CRM197又はCRM197−タグの転写を活性化させることができる。BL21AI菌株は、プロモーターpBADによって制御されるT7RNAポリメラーゼをコードする遺伝子を有するため、培地へのアラビノースの添加のおかげで、誘導が起こる。BL21(DE3)菌株は、代わりに、lacプロモーターによって制御されるT7RNAポリメラーゼの遺伝子を含有するプロファージλ(DE3)の細菌ゲノム中への組み込みのおかげで、得られた。この後者のケースでは、発現システムのカスケード誘導が、IPTG,ラクトース類似体によって活性化される。pET9a−CRM197構築物との転換及び興味のある上記タンパク質の発現に適した他の大腸菌株は、BL21StarTM(DE3),BL21−Gold(DE3),BL21(DE3)pLys等のBL21(DE3)誘導体、ER2566の誘導体、及びT7RNAポリメラーゼをコードする遺伝子のコピーをそのゲノム中に含有する全ての改変したB又はK−12菌株である。
転換した大腸菌株を選択したら、異なる培地及び誘導条件で発現試験を行った。予備試験の目的は、細菌タンパク質と比べて高レベルのタンパク質CRM197を得ることができるようにする方法(好ましくは最大で約30〜40%)を確認することであった。検討した因子は、培地、増殖温度(30℃及び37℃)、誘導因子の濃度及び誘導時間であった。用いた培地は、古典的LBであったが、高いバイオマス生産を可能にする他のリッチ培地を用いることもできる。組換えタンパク質を過剰発現させたとき、その生成物は、培地中に分泌させ得るか(特異的なシグナル配列を有する場合)、又は可溶性形態若しくは不溶性封入体の形態で細胞質内に構築できる。タンパク質の局在は、その後の精製過程に影響を与える。配列番号5によって表される人工遺伝子(his−タグ付き)の転写から得られた、配列番号6を持つ融合タンパク質CRM197−タグという特定の場合では、タンパク質が不溶性形態の本体によって発現され(封入体)、工業生産のために非常に都合よく蓄積する。本発明に記載の発現プロトコルは、前述の不溶性形態でのCRM197−タグの蓄積を含み、それを可溶性形態に戻し、生物学的に活性な形態のタンパク質を得るためにそれを再生する際に関与する工程について説明する。更に、本発明は、2つのクロマトグラフィー精製工程と、タグを取り除くための最終工程とを含む。最も適切なクロマトグラフィー法の選択は、CRM197−タグの化学的物理的特徴、pI(等電点)、アミノ酸組成及び寸法等によって決まる。タグとの融合は、そのタンパク質を、タグに対する高い親和性を持つ特定の樹脂を(カラム及びバッチの両方で)用いて精製できるようにする。タグの存在は、細胞質中でのタンパク質の安定性を増加させることとその後の精製の両方において有用である。
そこで、一の態様において、本発明は、配列番号1及びポリペプチドタグをコードする短い配列を含むポリヌクレオチドによってコード化された組換え融合タンパク質CRM197−タグに関する。
特に好適には、配列番号2を含むヌクレオチドによってコード化された、配列番号6の配列の組換え融合タンパク質である。
上記の組換え融合タンパク質CRM197−タグは、医療目的、乳癌、卵巣癌及び前立腺癌等の腫瘍の治療、又は動脈硬化プラークの減少に対し、潜在的に有用である。また、前述の融合タンパク質は、ニューモコッカス・ヘモフィラス・インフルエンザ、メニンゴコッカス、ストレプトコッカス・ニューモニエ及び他の病原性細菌に対するワクチン等のワクチン用の抱合キャリヤーとして役立つこともできる。
更に、本発明は、CRM197−タグタンパク質を産生するための方法であって、先に説明した通りに改変された大腸菌株の使用を含む方法に関するものである。
前述の方法は、
(i)上述のように大腸菌の培養物を用いてタンパク質を適当に誘導して発現させること;
(ii)
a.攪拌しながら、0〜5℃にて、1.5〜2.5時間の、Tris−HCl20〜50mM pH7.5〜8.5、NaCl100〜150mM、洗剤0.5〜1.5%及びプロテアーゼ阻害薬0.5〜1.5%を含有する緩衝液中での溶解;
b.固体残留物(ペレット)からの上澄みの分離;
c.攪拌しながら、20〜30℃にて、1.5〜2.5時間の、Tris−HCl20〜50mM、NaCl100〜150mM、洗剤0.5〜1.5%及び尿素5〜7Mを含有するpH7.5〜8.5の可溶化緩衝液による、先の経路から生じる固体残留物の処理;
d.固体残留物からの上澄みの分離であって、該上澄みが可溶化CRM197−タグタンパク質を含有する分離;
によって抽出すること;
(iii)
a.アフィニティークロマトグラフィー又は透析;
b.分子排除クロマトグラフィー(ゲルろ過)又はアニオン交換クロマトグラフィー
によって、工程(ii)から得られるタンパク質を精製及び再生すること
を含むことが好ましい。
(i)上述のように大腸菌の培養物を用いてタンパク質を適当に誘導して発現させること;
(ii)
a.攪拌しながら、0〜5℃にて、1.5〜2.5時間の、Tris−HCl20〜50mM pH7.5〜8.5、NaCl100〜150mM、洗剤0.5〜1.5%及びプロテアーゼ阻害薬0.5〜1.5%を含有する緩衝液中での溶解;
b.固体残留物(ペレット)からの上澄みの分離;
c.攪拌しながら、20〜30℃にて、1.5〜2.5時間の、Tris−HCl20〜50mM、NaCl100〜150mM、洗剤0.5〜1.5%及び尿素5〜7Mを含有するpH7.5〜8.5の可溶化緩衝液による、先の経路から生じる固体残留物の処理;
d.固体残留物からの上澄みの分離であって、該上澄みが可溶化CRM197−タグタンパク質を含有する分離;
によって抽出すること;
(iii)
a.アフィニティークロマトグラフィー又は透析;
b.分子排除クロマトグラフィー(ゲルろ過)又はアニオン交換クロマトグラフィー
によって、工程(ii)から得られるタンパク質を精製及び再生すること
を含むことが好ましい。
大腸菌が、配列番号5等の、配列番号2を含むプラスミドによって改変された実施態様においては、組換えタンパク質CRM197−タグが、6のヒスチジンを含有するタグ配列との融合において産生された。ここで、6のヒスチジンは、その発現を可能にし、アフィニティークロマトグラフィーによるその後の精製を容易にする。この手順によって得られるCRM197及び類似タンパク質の量は、発現レベルを支配するパラメータ(培地、増殖温度、誘導時間等)を調節することによって改変できる。BL21AI又はBL21(DE3)の大腸菌株が適切なプラスミドで転換されたものを使用する場合、最良の発現条件は、37℃で3時間の誘導後に得られ(図1)、その転換株BL21AIは望ましい。これら条件下、発現収率は、40%もあり、CRM197−タグは、溶解及び可溶性画分の除去後に得られた不溶性画分の約80%に相当する。最適な増殖、溶解及び回収条件を採用する生産方法では、CRM197−タグ発現収率が0.5〜1g/Lもあり得ることを主張することができる。
配列番号5を用いる特定の場合では、配列番号6を発現する組換えCRM197−タグは、6のヒスチジンを含有する28のアミノ酸のタグを有し、二価の金属イオン(銅、ニッケル等)に対する親和性が高い;この特徴は、不溶性形態で発現した融合タンパク質の精製を容易にするのに利用される。また、アフィニティークロマトグラフィーは、不溶性画分からCRM197−タグを回収するために必要な変性剤を除去するのに使用できる。この場合、その除去は(2つの逆勾配段階において)徐々に行われ、正しいタンパク質の立体構造(折り畳み)の採用を容易にする。
興味のある上記タンパク質と関係を保ったままの混入タンパク質は、分子量が互いにかなり異なる場合、ゲルろ過クロマトグラフィーによって後で除去できる。或いは、CRM197のpI値(5.8〜5.9)を利用して、イオン交換クロマトグラフィーを用いた第二の精製通路を行うことができる。このため、本発明は、アフィニティークロマトグラフィーの後で、必要に応じて使用される2つの異なる精製方法を含む。組換えタンパク質の最終収率及び純度のレベルは、どのタイプの方法を用いても、同程度である。そのタンパク質は、ブラッドフォード分析によって数量化され、10%アクリルアミドゲル(SDS−PAGE)中において可視化される。
本発明に記載のプロトコルに従って得られたCRM197−タグタンパク質の発現収率は、(LB培地を備えた目盛り付きフラスコ中で)250±50mg/培地Lである。先に述べたように、発酵槽中で行われる工業的過程では、適切な増殖培地及び条件を用いて、その収率が更に増加する。本発明に記載の溶解及び抽出の方法が単純で安価であることを強調する価値がある;その上、上記方法の段階は、特定の緩衝剤/試薬又は特別な実験装置(細胞溶解用の超音波処理器等)の必要性を避けるために設計されており、すべては、工業的過程に適したプロトコルを達成することを視野に入れている。
最後に、本発明は、二重の目的、即ちCRM197の発現を可能にし、その安定性を増大させ且つその精製を容易にする目的を有するタグを取り除く手順に関係する。
その結果として、本発明は、CRM197の調製方法であって、先に説明したように改変された大腸菌株の使用を含む方法にも関係する。
上述のCRM197の生産方法は、上述の融合タンパク質CRM197−タグの発現と、その後の、適切な酵素を用いた消化によるタグの除去とを含むことが好ましい。
配列番号6の配列を持つCRM197−タグの場合、タグの除去に適した酵素は、エンテロキナーゼであり、その消化は、Tris−HCl10〜20mM,pH7.5〜8.5、NaCl40〜60mM、CaCl21.5〜2.5mM及び0.01〜0.03%重量対重量(w/w)の範囲の濃度の酵素を含有する緩衝液中において、20〜25℃にて18〜24時間行われるのが好ましい。
タグを取り除いた後、タグのないタンパク質は、アフィニティークロマトグラフィーによって精製されるのが好ましい。
本発明に従う方法によって得られる配列番号7のCRM197組換えタンパク質は、構造及び機能の点で、既知の方法を用いて産生されたCRM197と同一である;それは、天然の形態で得られ、その結果、活性があり、延いては、既知の用途に使用できる。
本発明は、以下に示す実施態様の例を考慮すると、より分かりやすいだろう。
(配列)
配列番号1−大腸菌中での発現のために最適化されたCRM197をコードする人工配列
配列番号1−大腸菌中での発現のために最適化されたCRM197をコードする人工配列
配列番号2−大腸菌中におけるCRM197−Hisタグをコードする人工配列
下線が引かれた部分:6のヒスチジンを含有するタグペプチドをコードする配列
イタリック体で下線が引かれた部分:エンテロキナーゼによって認識される5aaをコードする15のヌクレオチド(DDDDK)
イタリック体で下線が引かれた部分:エンテロキナーゼによって認識される5aaをコードする15のヌクレオチド(DDDDK)
配列番号3−大腸菌中でのCRM197タンパク質の発現のための人工配列
太字部分:Ndel(CATATG)及びBamHI(GGATCC)制限部位
下線が引かれた部分:開始(ATG)及び停止(TAA TGA)コドン.
下線が引かれた部分:開始(ATG)及び停止(TAA TGA)コドン.
配列番号4−配列番号3からのCRM197タンパク質配列
配列番号5−大腸菌中での融合タンパク質CRM197−Hisタグの発現のための人工配列
太字部分:Ndel(CATATG)及びBamHI(GGATCC)制限部位.
下線が引かれた部分:6のヒスチジンを含有するタグペプチドをコードする84のヌクレオチド:
イタリック体で下線が引かれた部分:エンテロキナーゼによって認識される5aaをコードする15のヌクレオチド(DDDDK).
開始コドン:ATG
停止コドン:TAA TGA
下線が引かれた部分:6のヒスチジンを含有するタグペプチドをコードする84のヌクレオチド:
開始コドン:ATG
停止コドン:TAA TGA
配列番号6−配列番号5からのタンパク質配列CRM197−Hisタグ
太字部分:6のヒスチジン(H)とエンテロキナーゼの切断部位(DDDDK)とを含有するタグ配列(28のアミノ酸)
配列番号7−配列番号6からタグを除去した後のCRM197タンパク質配列
(実験パート)
例1−配列番号3及び配列番号4の遺伝子の合成、並びに構築物pET9a−CRM197−タグの調製
合成遺伝子は、約27〜43bpのオリゴヌクレオチドマルチプル(10〜15bpで重複する領域を持つ)を一緒に結合させることにより得られた。この手順は、「組み立て」と呼ばれている。具体的には、各種合成オリゴヌクレオチドの末端をリン酸化して上記結合反応をできるようにし、次いで、それらを、酵素TaqDNAリガーゼの存在下、等モル量で混合した。前述の酵素は、高温(45〜65℃)で活性があり、一方のオリゴヌクレオチドの5’位にあるリン酸塩ともう一方のオリゴヌクレオチドの3’位にあるヒドロキシ基の間のホスホジエステル結合の形成を触媒する。次いで、結合性生成物をPCRによって増幅し、Ndel及びBamHI酵素を用いてpET9aベクター中においてクローン化した。増幅に用いたプライマーは、以下の通りであった:
CRM197 fwd:5’ggaattCATATGGGTGCCGATGACGTGGTTGA 3’
CRM197 rev:5’cgGGATCCTCATTAAGATTTGATTTCGAAG 3’
CRM197−His fwd:5’ggaattCATATGGGTGGTTCTCATCATCACCATCA 3’
CRM197−His rev:5’cgGGATCCTCATTAAGATTTGATTTCGAAGAACAGG 3’
例1−配列番号3及び配列番号4の遺伝子の合成、並びに構築物pET9a−CRM197−タグの調製
合成遺伝子は、約27〜43bpのオリゴヌクレオチドマルチプル(10〜15bpで重複する領域を持つ)を一緒に結合させることにより得られた。この手順は、「組み立て」と呼ばれている。具体的には、各種合成オリゴヌクレオチドの末端をリン酸化して上記結合反応をできるようにし、次いで、それらを、酵素TaqDNAリガーゼの存在下、等モル量で混合した。前述の酵素は、高温(45〜65℃)で活性があり、一方のオリゴヌクレオチドの5’位にあるリン酸塩ともう一方のオリゴヌクレオチドの3’位にあるヒドロキシ基の間のホスホジエステル結合の形成を触媒する。次いで、結合性生成物をPCRによって増幅し、Ndel及びBamHI酵素を用いてpET9aベクター中においてクローン化した。増幅に用いたプライマーは、以下の通りであった:
CRM197 fwd:5’ggaattCATATGGGTGCCGATGACGTGGTTGA 3’
CRM197 rev:5’cgGGATCCTCATTAAGATTTGATTTCGAAG 3’
CRM197−His fwd:5’ggaattCATATGGGTGGTTCTCATCATCACCATCA 3’
CRM197−His rev:5’cgGGATCCTCATTAAGATTTGATTTCGAAGAACAGG 3’
PCR(30サイクル)は、以下に示す分量を用いた標準プロトコルに従って行われた:
3μl 結合性生成物
5μl dNTPs(4mM)
5μl 1ThermoPol反応緩衝液10X(New England Biolabs)
2μl fwd_プライマー(50pmol)
2μl rew_プライマー(50pmol)
0.5μl Vent DNAポリメラーゼ(New England Biolabs)
及び体積を50μlに揃えるための水32.5μlの添加。
3μl 結合性生成物
5μl dNTPs(4mM)
5μl 1ThermoPol反応緩衝液10X(New England Biolabs)
2μl fwd_プライマー(50pmol)
2μl rew_プライマー(50pmol)
0.5μl Vent DNAポリメラーゼ(New England Biolabs)
及び体積を50μlに揃えるための水32.5μlの添加。
配列番号1及び配列番号2を含むPCR産物を精製してプライマー、dNTPs及び酵素を除去し、次いで、Ndel及びBamHIを用いて消化させ、それ故に、配列番号3及び配列番号5の配列の遺伝子を得た。並行して、1μgのプラスミドpET9aを同一の条件下(37℃2時間)で同一の酵素により消化した。最後に、1:1及び3:1の挿入物対ベクター比により、上記結合反応を16℃にて12〜16時間行った。この反応のアリコートを用い、レシピエント細菌性細胞を転換した。
例2−細菌の菌株及び培地
BL21AI(インビトロゲン)及びBL21(DE3)大腸菌株(ノバジェン)をCRM197−タグ(配列番号5)の発現用宿主として用いた。一般的に使用される液体及び固体の培地は、古典的LB(ルリア−ベルタニ;Sambrook et al,1989,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY)であった。適切に処理した宿主株を10ngのpET9a−CRM197−タグ構築物(例1から得られたもの)を用いて転換した;1mmの適切なキュベット及び1.8kVのパルス(GenePulserII,Bio−Rad)を用いる標準プロトコルに従って、電気穿孔を行った。電気穿孔を行った細胞を37℃のSOC培地(Sambrook et al,1989)中で攪拌しながら45分間成長させ、次いで、固体のLB培地に移し、それにカナマイシンを加え(最終濃度50μg/mL)、形質転換体を選択した。一般には、好気性条件において、攪拌(180rpm)しながら37℃にて培養を行った。
BL21AI(インビトロゲン)及びBL21(DE3)大腸菌株(ノバジェン)をCRM197−タグ(配列番号5)の発現用宿主として用いた。一般的に使用される液体及び固体の培地は、古典的LB(ルリア−ベルタニ;Sambrook et al,1989,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY)であった。適切に処理した宿主株を10ngのpET9a−CRM197−タグ構築物(例1から得られたもの)を用いて転換した;1mmの適切なキュベット及び1.8kVのパルス(GenePulserII,Bio−Rad)を用いる標準プロトコルに従って、電気穿孔を行った。電気穿孔を行った細胞を37℃のSOC培地(Sambrook et al,1989)中で攪拌しながら45分間成長させ、次いで、固体のLB培地に移し、それにカナマイシンを加え(最終濃度50μg/mL)、形質転換体を選択した。一般には、好気性条件において、攪拌(180rpm)しながら37℃にて培養を行った。
例3−発現
アラビノース13mM(BL21AI菌株のため)及びIPTG1mM(BL21[DE3]菌株のため)を上記培地に加え、配列番号5のCRM197−タグの発現を誘導した。転換した菌株を選択した後、少量(10mL)に対し発現試験を行った。単一コロニーを1mLのLB培地(カナマイシンを備える)中で成長させ、対数増殖期に達するまで(分光光度法による600nmでの吸光度を測定することによって確認される)、新鮮な培地中で適切に再開された。その誘導因子を約0.5〜0.6ODの吸光度値にて加え、様々な時間の間(1時間、3時間及び15時間)、培養物を誘導した。その細胞を遠心分離(4000g15分間)により集め、得られた細胞ペレットを溶解させ全タンパク質を放出させた。最初は、単純にサンプル緩衝液(Bio−Rad)の存在下において5分間サンプルを煮沸することによって溶解を行い、20μLのサンプルそれぞれをSDS−PAGE電気泳動(10%アクリルアミド)において分離した。タンパク質バンドを可視化するため、そのゲルをComassieブリリアント・ブルーの溶液で染色し、CRM197−タグに相当する過剰発現のバンド(約61kDa;図1)が確認できた。前述のバンドは、アクリルアミドゲル中で見える全タンパク質の約40%を示した。
アラビノース13mM(BL21AI菌株のため)及びIPTG1mM(BL21[DE3]菌株のため)を上記培地に加え、配列番号5のCRM197−タグの発現を誘導した。転換した菌株を選択した後、少量(10mL)に対し発現試験を行った。単一コロニーを1mLのLB培地(カナマイシンを備える)中で成長させ、対数増殖期に達するまで(分光光度法による600nmでの吸光度を測定することによって確認される)、新鮮な培地中で適切に再開された。その誘導因子を約0.5〜0.6ODの吸光度値にて加え、様々な時間の間(1時間、3時間及び15時間)、培養物を誘導した。その細胞を遠心分離(4000g15分間)により集め、得られた細胞ペレットを溶解させ全タンパク質を放出させた。最初は、単純にサンプル緩衝液(Bio−Rad)の存在下において5分間サンプルを煮沸することによって溶解を行い、20μLのサンプルそれぞれをSDS−PAGE電気泳動(10%アクリルアミド)において分離した。タンパク質バンドを可視化するため、そのゲルをComassieブリリアント・ブルーの溶液で染色し、CRM197−タグに相当する過剰発現のバンド(約61kDa;図1)が確認できた。前述のバンドは、アクリルアミドゲル中で見える全タンパク質の約40%を示した。
興味のある上記タンパク質の発現を確認した後、最適な条件(アラビノース13mMによる3時間の誘導)において、多量の培養物(500mL)を用いた試験を続いて行った。
例4−抽出
超音波処理器の使用に頼ることなく、細胞を溶解させるため、既知の組成の異なる溶解液を調製し、溶液の体積のサンプルのものに対する比を変えつつ、それらの有効性を評価した。溶解緩衝液の成分は、Tris−HCl pH8(20〜50mMの範囲の濃度)、NaCl(100〜150mMの範囲の濃度)、0.5〜1.5%の範囲の濃度の洗剤(Triton X−100,SDS,Tween20)及びプロテアーゼ阻害薬(例えばPMSF1mM)であった。また、我々は、β−メルカプトエタノール又はDTT等の還元剤の効果を評価した(10〜50mM)。氷上で2時間攪拌して、細胞ペレットを溶解させた。上澄み(可溶性タンパク質画分に相当する)を遠心分離(10,000g30分間)によって分離し、SDS−PAGEゲルにおいて分析した(図2)。組換えタンパク質は、それが封入体の形態で蓄積し、溶解後に得られるペレット中でクラスター化されるため、この画分中では、目に見えなかった。結果として、本発明は、不溶性画分からCRM197−タグを回収するため、可溶化溶液の使用を含む(図2)。この溶液の成分は、Tris−HCl pH8(20〜50mMの範囲の濃度)、NaCl(100〜150mMの範囲の濃度)、0.5〜1.5%の洗剤(Triton X−100,SDS,Tween20)及び6〜7Mの尿素であった。封入体を含有するペレットを、20〜30℃の範囲の温度にて、攪拌しながら、2時間可溶化させた。上澄みは、遠心分離によって回収され、SDS−PAGEゲル中において分析した。ここで、CRM197−タグに相当するバンドが目に見えた(図2)。尿素を用いて可溶化したサンプルでは、CRM197−タグに関するバンドが、ゲル中に含まれるタンパク質の約50%に相当した。
超音波処理器の使用に頼ることなく、細胞を溶解させるため、既知の組成の異なる溶解液を調製し、溶液の体積のサンプルのものに対する比を変えつつ、それらの有効性を評価した。溶解緩衝液の成分は、Tris−HCl pH8(20〜50mMの範囲の濃度)、NaCl(100〜150mMの範囲の濃度)、0.5〜1.5%の範囲の濃度の洗剤(Triton X−100,SDS,Tween20)及びプロテアーゼ阻害薬(例えばPMSF1mM)であった。また、我々は、β−メルカプトエタノール又はDTT等の還元剤の効果を評価した(10〜50mM)。氷上で2時間攪拌して、細胞ペレットを溶解させた。上澄み(可溶性タンパク質画分に相当する)を遠心分離(10,000g30分間)によって分離し、SDS−PAGEゲルにおいて分析した(図2)。組換えタンパク質は、それが封入体の形態で蓄積し、溶解後に得られるペレット中でクラスター化されるため、この画分中では、目に見えなかった。結果として、本発明は、不溶性画分からCRM197−タグを回収するため、可溶化溶液の使用を含む(図2)。この溶液の成分は、Tris−HCl pH8(20〜50mMの範囲の濃度)、NaCl(100〜150mMの範囲の濃度)、0.5〜1.5%の洗剤(Triton X−100,SDS,Tween20)及び6〜7Mの尿素であった。封入体を含有するペレットを、20〜30℃の範囲の温度にて、攪拌しながら、2時間可溶化させた。上澄みは、遠心分離によって回収され、SDS−PAGEゲル中において分析した。ここで、CRM197−タグに相当するバンドが目に見えた(図2)。尿素を用いて可溶化したサンプルでは、CRM197−タグに関するバンドが、ゲル中に含まれるタンパク質の約50%に相当した。
例5−精製
尿素を用いて可溶化したサンプル(4℃にて貯蔵したもの)は、予備精製と、カラム中においてタンパク質を再生するために尿素を除去するという二重目的のため、アフィニティークロマトグラフィー(HiTrap Chelating,GE Healthcare)を受けた。もう一つの適切な再生方法は、透析であり、減少する濃度の尿素(6〜7Mから0まで)を備えた溶液を用いる。クロマトグラフィーカラムを製造業者の取扱説明書に従って調整及び処理した。6−ヒスチジンタグ付きのCRM197タンパク質の場合、カラムはニッケルイオン(NiSO40.1M)と複合体を形成した。この手順は、3つの段階を含む:1)洗剤の除去;2)2段階逆勾配による尿素の除去;3)イミダゾール勾配(0〜500mM)による溶出である。サンプルを、遅いフロー条件(0.5mL/min)下で、充填し、再生させ、一方、他の段階は、1mL/minの流量で完了した。得られた最終画分は、Tris−HCl pH8、NaCl、イミダゾールの溶液中にCRM197タンパク質(タグと融合したもの)を含有した(図3は、一部のクロマトグラフィー画分を示す)。
尿素を用いて可溶化したサンプル(4℃にて貯蔵したもの)は、予備精製と、カラム中においてタンパク質を再生するために尿素を除去するという二重目的のため、アフィニティークロマトグラフィー(HiTrap Chelating,GE Healthcare)を受けた。もう一つの適切な再生方法は、透析であり、減少する濃度の尿素(6〜7Mから0まで)を備えた溶液を用いる。クロマトグラフィーカラムを製造業者の取扱説明書に従って調整及び処理した。6−ヒスチジンタグ付きのCRM197タンパク質の場合、カラムはニッケルイオン(NiSO40.1M)と複合体を形成した。この手順は、3つの段階を含む:1)洗剤の除去;2)2段階逆勾配による尿素の除去;3)イミダゾール勾配(0〜500mM)による溶出である。サンプルを、遅いフロー条件(0.5mL/min)下で、充填し、再生させ、一方、他の段階は、1mL/minの流量で完了した。得られた最終画分は、Tris−HCl pH8、NaCl、イミダゾールの溶液中にCRM197タンパク質(タグと融合したもの)を含有した(図3は、一部のクロマトグラフィー画分を示す)。
本発明は、ゲルろ過クロマトグラフィー(Superdex200カラム,GE Healthcare)によるその後の精製を含む。この工程が完了する前に、サンプルを限外ろ過(Amicon,Millipore)によって濃縮し、脱塩してイミダゾールを除去した(HiTrap脱塩カラム,GE Healthcare)。Superdexカラムは、Tris−HCl50mM pH8、NaCl150mMを含有する緩衝液を用いて調整された。その画分をSDS−PAGEゲルにおいて分析し、純CRM197−タグを含有するものをプールし、凍結させた。図4は、CRM197−タグ精製の各種段階を示す。
分子排除クロマトグラフィーに代わるものとして、イオン交換クロマトグラフィーによってCRM197−タグを精製することができる。この場合、pH8の適切な緩衝液を用いて調整された陰イオン交換樹脂を用いるのが好ましい。
例6−Tag除去
また、タグ配列(MGGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDDDDK)は、精製に必要な6のヒスチジンに加えて、特異的なプロテアーゼ,エンテロキナーゼ(New England BioLabs)によって認識される切断部位,DDDDKを含有する。タグのない純粋な組換えタンパク質(配列番号6)を得るため、CRM197−タグ(配列番号5)をエンテロキナーゼと共にインキュベートした。Tris−HCl20mM pH8、NaCl50mM、CaCl22mMの緩衝液中、0.02%(w/w)に相当する酵素量を用いて、消化反応を22〜24℃にて18〜24時間行った。図5は、SDS−PAGEゲルを示し、ここで、消化されたCRM197は、2つのドメインA及びBに分離して、目に見える(レーン2)(サンプルは、ドメイン間のジスルフィド架橋を破壊する還元剤と共に煮沸された)。そのプロトコルは、アフィニティークロマトグラフィーによってタグだけからCRM197(タグなし、配列番号6)を分離するためのその後の工程を含む(上述したCRM197−タグの精製に使用したものと同一のカラム中において、同一の樹脂を使用する)。
また、タグ配列(MGGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDDDDK)は、精製に必要な6のヒスチジンに加えて、特異的なプロテアーゼ,エンテロキナーゼ(New England BioLabs)によって認識される切断部位,DDDDKを含有する。タグのない純粋な組換えタンパク質(配列番号6)を得るため、CRM197−タグ(配列番号5)をエンテロキナーゼと共にインキュベートした。Tris−HCl20mM pH8、NaCl50mM、CaCl22mMの緩衝液中、0.02%(w/w)に相当する酵素量を用いて、消化反応を22〜24℃にて18〜24時間行った。図5は、SDS−PAGEゲルを示し、ここで、消化されたCRM197は、2つのドメインA及びBに分離して、目に見える(レーン2)(サンプルは、ドメイン間のジスルフィド架橋を破壊する還元剤と共に煮沸された)。そのプロトコルは、アフィニティークロマトグラフィーによってタグだけからCRM197(タグなし、配列番号6)を分離するためのその後の工程を含む(上述したCRM197−タグの精製に使用したものと同一のカラム中において、同一の樹脂を使用する)。
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Claims (10)
- 配列番号1の配列を含む、ポリヌクレオチド。
- 更に、タグポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を少なくとも含む、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- タグ配列が、タグを後で取り除くことのできる適切な酵素による認識に適した切断配列と関係がある、請求項2に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項1〜3のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
- 大腸菌種に属し、請求項4に記載の発現ベクターを含む、遺伝子改変微生物。
- 請求項2又は3に記載のポリヌクレオチドによってコードされる組換え融合タンパク質CRM197−タグ。
- 請求項6に記載のタンパク質CRM197−タグの生産方法であって、請求項5に記載されるように遺伝子改変した大腸菌中での培養による発現を含むことを特徴とする方法。
- 請求項5に記載されるように遺伝子改変した大腸菌中での発現を用いた、タンパク質CRM197の生産方法。
- 請求項6に記載のタンパク質を中間体として含む、請求項8に記載の方法。
- 薬用の又は医薬組成物におけるキャリヤーとしての、請求項6に記載の組換え融合タンパク質。
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