JP2021536253A - 組換えレクチンタンパク質の調製のための改善されたプロセス - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2018年9月7日に出願されたインド仮出願番号第201821008382号、及び2019年1月14日に出願されたインド仮出願番号第201921001559号の恩典を請求し、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、組換えレクチンタンパク質、及び、組換えレクチンタンパク質を調製する方法に関する。本発明はまた、粗組換えレクチンタンパク質を精製する方法にも関する。
レクチンは、糖鎖結合タンパク質であり、これは、他の分子の糖部分に高度に特異的である巨大分子である。レクチンは、細胞レベル及び分子レベルで認識を行ない、細胞、糖鎖、及びタンパク質の関与する生物学的な認識現象において数多くの役割を果たす。それらは、糖タンパク質に結合し沈降させ、赤血球を凝集させる、二価又は多価の糖鎖結合タンパク質である。動物に見られるレクチンは、細胞相互作用を補助することが多いことが判明し、一方、植物レクチンは、潜在的な捕食者又は病原体を防ぐことが知られている。いくつかのレクチンは、癌関連グリカンを検出することができ、それ故、悪性腫瘍のバイオマーカーとしての役目を果たす可能性、及び癌細胞株におけるグリコシル化モチーフの変化の研究を支える可能性を有する。
本発明の主な目的は、先行技術の対象物の欠点を克服し、配列番号1のアミノ酸配列を調製するための非常に効率的なプロセスを考案することである。
本発明の1つの態様では、組換えレクチンタンパク質を調製する方法が提供され、該方法は、宿主細胞培養液中で組換えレクチン遺伝子によってコードされる組換えレクチンタンパク質を発現させる工程を含み、ここでの細胞の発現は、細胞が160分間以下の倍加時間を有するような条件下で行なわれる。いくつかの実施態様では、細胞の発現は、細胞が少なくとも100分間の倍加時間を有するような条件下で行なわれる。
a)場合により、組換えレクチン遺伝子を発現ベクターにクローニングし、該発現ベクターを宿主細胞に挿入する工程;
b)適切な培地中で宿主細胞を培養する工程(ここでの該培養は、25℃から40℃の温度で行なわれる増殖期間と、組換えレクチン遺伝子によってコードされる組換えレクチンタンパク質が発現される間の発現期間とを含み、ここでの発現期間は、15℃から30℃の温度で行なわれ、ここでの炭素対窒素の比は、発現期間中に3:1から6:1に維持される);
c)場合により、(b)で発現される組換えレクチンタンパク質を単離して、粗組換えレクチンタンパク質を得る工程;及び
d)場合により、粗組換えレクチンタンパク質を精製して、組換えレクチンタンパク質の単離物を得る工程
を含む。
a)陰イオン交換クロマトグラフィーによって粗組換えレクチンタンパク質を最初に精製して、第一の精製された溶出物を得る工程;
b)第一の精製された溶出物を疎水性相互作用クロマトグラフィーによって任意選択で精製して、第二の精製された溶出物を得る工程;
c)第二の精製された溶出物を陽イオン交換クロマトグラフィーによって任意選択で精製して、第三の精製された溶出物を得る工程;
d)第二又は第三の精製された溶出物を陰イオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製して、第四の精製された溶出物を得る工程;及び
e)透析ろ過によって第四の精製された溶出物の緩衝液を交換して、精製された組換えレクチンタンパク質単離物を得る工程
を含む。
a)少なくとも15℃かつ22℃以下の発現温度;
b)発現(すなわち誘導)期間が少なくとも10時間かけて行なわれる;
c)炭素源は、0.5〜2g/L/hの速度で培養液に添加される;
d)窒素源は、0.4〜1.5g/L/hの速度で培養液に添加される;
e)少なくとも0.1mMかつ0.5mM以下の誘導物質の濃度;
f)少なくとも1回のクロマトグラフィー工程を使用して粗組換えレクチンタンパク質を精製する工程
の少なくとも1つを含む。
本明細書において使用する「倍加時間」という用語は、細胞数が倍加するのに、例えば、1つの細胞が2つの細胞に増えるのに、又は細胞集団の数が倍加するのに、必要とされる期間を指す。当業者は理解しているであろうように、倍加時間は、2の自然対数を増殖率の冪指数で割ることによって計算することができる。
−増殖期間(その間に、宿主細胞を、タンパク質発現前に増殖させる)及び
−発現期間(その間にタンパク質の発現が行なわれる)を含む。
−少なくとも15℃かつ22℃以下(例えば18℃)の発現温度;
−発現(すなわち誘導)期間が少なくとも10時間かけて行なわれる;
−炭素源は、0.5〜2g/L/hの速度で培養液に添加される;
−窒素源は、0.4〜1.5g/L/hの速度で培養液に添加される;
−少なくとも0.1mMかつ0.5mM以下の誘導物質の濃度。
(i)配列番号1;
(ii)配列番号3;
(iii)配列番号4;又は
(iv)配列番号1、3又は4に対して少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%の相同性を有するアミノ酸配列
から選択されたアミノ酸配列を含み得るか又はからなり得る。
a)場合により、組換えレクチン遺伝子を発現ベクターにクローニングし、該発現ベクターを宿主細胞に導入する工程;
b)適切な培地中で宿主細胞を培養する工程(ここでの該培養は、25℃から40℃の温度で行なわれる増殖期間と、組換えレクチン遺伝子によってコードされる組換えレクチンタンパク質が発現される間の発現期間とを含み、ここでの発現期間は、15℃から30℃の温度で行なわれ、ここでの炭素対窒素の比は、発現期間中に3:1から6:1に維持される);
c)場合により、(b)で発現される組換えレクチンタンパク質を単離して、粗組換えレクチンタンパク質を得る工程;及び
d)場合により、粗組換えレクチンタンパク質を精製して、組換えレクチンタンパク質の単離物を得る工程
を含む。
i)陰イオン交換クロマトグラフィーによって粗組換えレクチンタンパク質を最初に精製して、第一の精製された溶出物を得る工程;
ii)第一の精製された溶出物を疎水性相互作用クロマトグラフィーによって任意選択で精製して、第二の精製された溶出物を得る工程;
iii)第二の精製された溶出物を陽イオン交換クロマトグラフィーによって任意選択で精製して、第三の精製された溶出物を得る工程;
iv)第二又は第三の精製された溶出物を陰イオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製して、第四の精製された溶出物を得る工程;及び
v)透析ろ過によって第四の精製された溶出物の緩衝液を交換して、精製された組換えレクチンタンパク質単離物を得る工程
を含む。
a.組換えレクチンタンパク質をコードしているヌクレオチド配列(配列番号5の配列)を、ベクターに包埋されている間に、組換え宿主細胞においてクローニングして、クローンを調製する工程、
b.適切な培地中、約25℃〜約40℃の初期温度及び約15℃〜30℃の誘導期間温度で、炭素源対窒素源の比が3:1から6:1であるようなフィード速度を有する、組換えレクチンタンパク質(例えば、配列番号1のアミノ酸配列を有する)の発現のための工程「a」で調製されたクローンのフェッドバッチ発酵により、発酵産物を得る工程;
c.粗組換えレクチンタンパク質(例えば、配列番号1のアミノ酸配列を有する)を得るための、工程「b」で得られた発酵産物の単離及び清澄化;及び
d.工程「c」で得られた粗組換えレクチンタンパク質(例えば、配列番号1のアミノ酸配列を有する)の精製
を含む。場合により、精製は、
i.陰イオン交換クロマトグラフィーによって粗組換えレクチンタンパク質(例えば、配列番号1のアミノ酸配列を有する)を最初に精製して、第一の精製された溶出物を得る工程;
ii.工程iから得られた第一の精製された溶出物を疎水性相互作用クロマトグラフィーによって任意選択で精製して、第二の精製された溶出物を得る工程;
iii.工程iiから得られた第二の精製された溶出物又は工程iから得られた第一の精製された溶出物を陽イオン交換クロマトグラフィーによって精製して、第三の精製された溶出物を得る工程;
iv.工程iiiから得られた第三の精製された溶出物又は工程iiから得られた第二の精製された溶出物を陰イオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製して、精製された溶出物を得る工程;
v.透析ろ過によって工程ivから得られた精製された溶出物の緩衝液を交換して、組換えレクチンタンパク質(例えば、配列番号1のアミノ酸配列を有する)を純粋な産物として得る工程を含む。
a.陰イオン交換クロマトグラフィーによって粗組換えレクチンタンパク質(例えば、配列番号1のアミノ酸配列を有する)を最初に精製して、第一の精製された溶出物を得る工程;
b.工程aから得られた第一の精製された溶出物を疎水性相互作用クロマトグラフィーによって任意選択で精製して、第二の精製された溶出物を得る工程;
c.工程bから得られた第二の精製された溶出物又は工程aから得られた第一の精製された溶出物を陽イオン交換クロマトグラフィーによって精製して、第三の精製された溶出物を得る工程;
d.工程cで得られた第三の精製された溶出物又は工程bから得られた第二の精製された溶出物を陰イオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製して、精製された溶出物を得る工程;
e.透析ろ過によって工程dから得られた精製された溶出物の緩衝液を交換して、組換えレクチンタンパク質(例えば、配列番号1のアミノ酸配列を有する)を純粋な産物として得る工程を含む。
a.配列番号1のアミノ酸配列をコードしている配列番号5のヌクレオチド配列を、ベクターに包埋されている間に、組換え宿主細胞においてクローニングして、クローンを調製する工程、
b.適切な培地中、約25℃〜約40℃の初期温度及び約15℃〜30℃の誘導期間温度で、炭素源対窒素源の比が3:1から6:1であるようなフィード速度を有する、配列番号1のアミノ酸配列を有する組換えレクチンの発現のための工程「a」で調製されたクローンのフェッドバッチ発酵により、発酵産物を得る工程;
c.配列番号1のアミノ酸配列を有する粗組換えレクチンを得るための、工程「b」で得られた発酵産物の単離及び清澄化;及び
d.工程「c」で得られた配列番号1のアミノ酸配列を有する粗組換えレクチンの精製(この精製は、
i.陰イオン交換クロマトグラフィーによって配列番号1のアミノ酸配列を有する粗組換えレクチンを最初に精製して、第一の精製された溶出物を得る工程;
ii.工程iから得られた第一の精製された溶出物を疎水性相互作用クロマトグラフィーによって任意選択で精製して、第二の精製された溶出物を得る工程;
iii.工程iiから得られた第二の精製された溶出物又は工程iから得られた第一の精製された溶出物を陽イオン交換クロマトグラフィーによって精製して、第三の精製された溶出物を得る工程;
iv.工程iiiで得られた第三の精製された溶出物又は工程iiから得られた第二の精製された溶出物を陰イオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製して、精製された溶出物を得る工程;
v.透析ろ過によって工程ivから得られた精製された溶出物の緩衝液を交換して、配列番号1のアミノ酸配列を有する組換えレクチンを純粋な産物として得る工程を含む)
を含む。
本発明の態様によると、配列番号1のアミノ酸配列を有する組換えレクチンの産生のために使用される宿主細胞は、細菌細胞又は酵母であり得る。好ましい細菌細胞はE.coli、特にE.coli BL21 DE3 Gold株である。配列番号5のアミノ酸配列を有する組換えレクチンをコードしている配列番号5のヌクレオチド配列は、ベクターに、好ましくはpET27bにクローニングされ得る。その後、プラスミドを、宿主E.coli BL21 DE3 Goldにおいて形質転換及び発現させ得る。
例示的な実施態様では、組換えレクチンタンパク質をコードしている、ヌクレオチド配列を含有している、プラスミドpET27bを含有している、E.coli BL21 DE3 Gold株を、ルリアHiVegブロス(20g/l)、Na2HPO4(7.5g/l)、デキストロース(5g/l)、MgSO4・7H2O(1g/l)、最終濃度が20μg/mlとなるまでのカナマイシン、及び0.1%(v/v)のFeSO4、ZnSO4、CoCl2、NaMoO4、CaCl2、MnCl2、CuSO4、又はH3BO3の塩酸中の微量金属溶液を含有している、接種培地中で増殖させる。接種材料は、細胞を30〜40℃で12〜16時間増殖させることによって調製される。組換えE.coli BL21 DE3 Gold株のフェッドバッチ発酵は、酵母エキス(10g/l)、デキストロース(12g/l)、KH2PO4(3g/l)、K2HPO4(12.5g/l)、(NH4)2SO4(5g/l)、NaCl(0.5g/l)、MgSO4・7H2O(1g/l)、及び0.1%(v/v)のFeSO4、ZnSO4、CoCl2、NaMoO4、CaCl2、MnCl2、CuSO4、又はH3BO3の塩酸中の微量金属溶液を含んでいる産生培地中で行なわれ得る。カナマイシンは、20μg/mlの最終濃度となるまで添加され得る。フィードは、適切な炭素源、例えばグルコース又はグリセロール、好ましくは50%(w/v)のグリセロール、及び窒素源、例えばトリプトン、ペプトン、又は酵母エキス、好ましくは40%(w/v)の酵母エキスを用いて開始され得る。フィードは、所定のフィード速度でlog5時間後に開始され得る。C:Nの比を3:1から6:1の範囲内に、好ましくはC:Nの比を4:1に維持しつつ、発酵中の炭素源のフィード速度は、0.5〜2g/L/hであり、窒素源のフィード速度は、0.4〜1.5g/L/hであり得る。当業者は、それらの適切性に応じて比率及び量を変更してもよい。なぜなら、それらは、特定のバッチサイズのために示されたパラメーターに特異的であるからである。
発酵プロセスから得られた細胞溶解液から得られた組換えレクチンタンパク質の精製プロセスは、以下の工程を含み得る:
a カラム1:陰イオン交換クロマトグラフィー、
b カラム2:疎水性相互作用クロマトグラフィー、
c カラム3:陽イオン交換クロマトグラフィー、
d カラム4:陰イオン交換クロマトグラフィー。
実施例は、本発明を実施する最善のモードを実証するために示され、いずれにしても本発明の範囲を制限するものではない。
pET20bベクター(特許番号WO2010/095143A2号に開示されているような)に事前にクローニングされた配列番号1のアミノ酸配列を有する組換えレクチンをコードしているヌクレオチド配列(配列番号5)を、pET27bベクターにサブクローニングした。pET20bにクローニングされた配列番号5を有するE.coli BL21 DE3細胞を、ルリアHivegブロス(Himedia社、ムンバイ、インド)中で増殖させた。プラスミドは、GeneJETプラスミドミニプレップキット(サーモサイエンティフィック社)を使用して、製造業者の説明書に従って細胞から単離された。プラスミドpET20bを、制限酵素NdeI及びBamHI(ニューイングランドバイオラボ社)で消化した。消化されたプラスミドをアガロースゲル電気泳動上で泳動させ、分離した挿入断片を、GeneJETゲル抽出キット(サーモサイエンティフィック社)を使用して、ゲルから溶出させた。類似のベクターpET27bを単離し、同じ制限酵素(NdeI及びBamHI)で消化した。pET20bから分離した挿入断片(配列番号5)を、pET27bベクター(pET27b−Lec)にクローニングし、E.coli BL21 DE3(Gold)に形質転換した。クローンを、コロニーPCRによってスクリーニングし、陽性クローンをさらに、発現分析のために使用した。陽性クローンを、Hivegルリアブロス中で37℃で増殖させ、1〜1.2細胞密度(OD600nm)において0.25mMのIPTGを用いて誘導し、4時間さらに増殖させた。配列番号1のアミノ酸配列を有する組換えレクチンの発現は、SDS−PAGE分析によって確認された。ベクターpET27bにおける挿入断片の配列は、単離されたプラスミドのDNAシークエンスによって確認された。陽性クローンのグリセロールストックを調製し、−80℃に維持した。
グリセロールストックからの培養液を、2%Hivegルリアブロス、0.75%のNa2HPO4、0.5%のデキストロース、及びカナマイシン(20μg/ml)を含有している培地に接種した。培養液を30±2℃及び110rpmで16時間増殖させた。約300mlの培養液を、1%の酵母エキス(w/v)、1.2%デキストロース(w/v)、0.3%のKH2PO4(w/v)、1.25%のK2HPO4(w/v)、0.5%の(NH4)2SO4(w/v)、0.05%のNaCl(w/v)、0.1%のMgSO4・7H2O(w/v)、0.1%(v/v)の微量金属溶液、カナマイシン(20μg/ml)を含有している、2.3Lの産生培地に接種した。発酵は、1〜2vvmの通気量で、5Lの発酵槽(バイオスタットB、ザルトリウムステディム社)中で行なわれ、溶存酸素は50〜60%に維持され、pHはアルカリを用いて6.6〜7.0に維持された。初期増殖は、37℃の温度で行なわれた。温度を徐々に下げ、誘導期間中は22℃に維持した。炭素源(グリセロール)及び窒素源(酵母エキス)のフィードは、C:N比を4:1の範囲内に維持しながら、予め決められたフィード速度で5log時間後に開始された。培養液は、約45(OD600)の細胞密度において1mMのIPTGを用いて誘導された。発酵は24時間まで続けられ、培養ブロスは、9000rpmで15分間の遠心分離によって収集された。発酵ブロスから得られた細胞塊の湿潤重量は、372gであった。
細胞ペレットを、溶解緩衝液(25mMのトリス、1mMのEDTA、pH8.5)に1:10(w/v)の比で懸濁し、オーバーヘッドスターラーで少なくとも2時間撹拌し、均一な懸濁液を形成した。懸濁液を、約18,000プサイでの高圧ホモジナイゼーションによって溶解した。細胞溶解液を、15℃で9,000rpmで15分間の遠心分離にかけた。結果として得られた上清を保持し、配列番号1のアミノ酸配列を有する組換えレクチンの精製のためにさらに処理した。
上清を、少なくとも0.025%のポリエチレンイミンを用いて15〜30分間撹拌することによって処理した。ポリエチレンイミンによる処理後に得られた全細胞溶解液を、1mMのEDTAを含有し、pH8.0±0.5である、25mMのトリス緩衝液を用いて予め平衡化された、3600cm2の面積の0.1μmの中空繊維を使用して清澄化した。5〜10プサイの膜間差圧を、清澄化プロセス全体を通して維持した。残留物を上記の平衡緩衝液を用いて段階的モードで透析ろ過して、ろ過透過液中の配列番号1のアミノ酸配列を有する組換えレクチンを回収した。配列番号1のアミノ酸配列を有する組換えレクチンについて、90%を超える回収率が、ろ過透過液中に得られた。280nmにおける吸光度によって測定したところ84.4gの全タンパク質が、ろ過透過液中に回収された。関心対象のタンパク質の純度は、HPLCによって測定したところ49.4%であった。
清澄化されたタンパク質溶液を、1mMのEDTAを含有し、pH8.0±0.5である、25mMのトリス緩衝液で予め平衡化された、セルファインMax Q−r樹脂にローディングした。ローディング後、平衡緩衝液による洗浄を行ない、続いて、1〜3g/LのNaClを含有している平衡緩衝液で洗浄した。タンパク質を、1mMのEDTA、11〜15g/LのNaClを含有し、pH8±0.5である、25mMのトリス緩衝液を用いて溶出した。このカラムで回収された全タンパク質は、41.6gで77.4%の純度の活性タンパク質であった。
カラム1の溶出液のpHを、酢酸を用いて4.5に調整し、続いて、硫酸アンモニウムにより沈降させた。その後、溶液を遠心分離にかけ、透明な上清を疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂(セルファインMaxブチル)上でさらなる精製のために処理した。カラムを、1mMのEDTA、0.5〜2Mの硫酸アンモニウムを含有し、pH4.5である、25mMの酢酸ナトリウムを用いて平衡化させ、その後、タンパク質溶液をローディングした。ローディング後、平衡緩衝液による洗浄を行ない、続いて、25mMの酢酸ナトリウム、1mMのEDTA、15g/Lの硫酸アンモニウムを含有し、pH4.5である、溶出緩衝液を用いて溶出した。90.3%の純度を有する、27.5gの全タンパク質がカラム2から溶出された。
カラム2から得られたタンパク質を、精製水を用いて約20mS/cmの伝導率となるまで希釈し、1mMのEDTAを含有し、pH4.5である、25mMの酢酸ナトリウム緩衝液を用いて予め平衡化されたSPセファロースFF樹脂にローディングした。ローディング後に、平衡緩衝液によりカラムを洗浄し、続いて、25mMの酢酸ナトリウム、1mMのEDTA、0.5MのNaClを含有し、pH4.5である、20%の段階的勾配の溶出緩衝液を流した。溶出は、50〜70%の溶出緩衝液の段階的勾配を流すことによって行なわれた。93.0%の純度を有する計24.6gのタンパク質がカラムから回収された。カラム3の溶出液の緩衝液の交換を、3KDaの膜上で行ない、25mMのトリス緩衝液(pH8.0)中にタンパク質を得た。
緩衝液の交換後、20.9gのタンパク質が、ソース30Q樹脂上で得られ処理された。カラムを、25mMのトリス緩衝液(pH8.0)を用いて平衡化し、続いて、タンパク質溶液をローディングした。ローディング後、カラムを平衡緩衝液で洗浄した。その後、溶出は、25mMのトリス、0.5MのNaClを含有し、pH8.0、15カラム容量である、線形勾配の溶出緩衝液を流すことによって行なわれた。一本のピークが得られ、これはHPLCによって分析したところ、99.0%を超える純度を示した。280nmにおける1ODが1mgに等価であると考えて、280nmにおける吸光度によって測定したところ、計9.0gが得られた。最終溶出液を、TBS緩衝液に対して緩衝液を交換した(50mMのトリス緩衝液、150mMのNaCl、pH7.8)。
配列番号1のアミノ酸配列を有する組換えレクチンの純度は、SDS−PAGE及びHPLC分析によって決定された。HPLC分析による配列番号1のアミノ酸配列を有する組換えレクチンの純度は、97〜99%であった。配列番号1のアミノ酸配列を有する組換えレクチンのSDS−PAGEによる分析は、約16KDaの分子量で一本のバンドを示した。タンパク質の同一性は、ウェスタンブロットによって確認され、生物学的活性は、赤血球凝集アッセイ、及び様々な癌細胞株を使用したンビトロでの細胞ベースアッセイによって確認された。配列番号1のアミノ酸配列を有する精製された組換えレクチンの分子量は、16044ダルトンであった。
以前の実施例に記載のグリセロールストックの培養液を、2%Hivegルリアブロス、0.75%のNa2HPO4、0.5%のデキストロース及びカナマイシン(20μg/ml)を含有している培地に接種した。バッチ1〜3についての培養液を37℃及び110rpmで16時間増殖させた。
E.coliの倍加時間は、試料発酵プロセス中の、すなわち産生培地への接種後の、様々な時点及び温度で決定された。結果は表2に示される。この実施例では、誘導物質、この実施態様ではIPTGを接種から9時間後に加えた。したがって、この実施例では、増殖期間は、9時間より前の時点であると理解され、発現期間は、誘導物質の添加時及び添加後の時点であると理解されるだろう。
この実施例では、組換えレクチンは、実施例10において産生されたものなどの培養ブロスから単離及び精製される。
1.組換えレクチンタンパク質を調製する方法であって、該方法は、宿主細胞培養液中で組換えレクチン遺伝子によってコードされる組換えレクチンタンパク質を発現させる工程を含み、ここでの細胞の発現は、細胞が160分間以下の倍加時間を有するような条件下で行なわれる。
i)配列番号1;
ii)配列番号3;
iii)配列番号4;又は
iv)i)、ii)、又はiii)に対して少なくとも60%の相同性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む、1〜15のいずれか一項に記載の方法。
Claims (31)
- 組換えレクチンタンパク質を調製する方法であって、該方法は、宿主細胞培養液中で組換えレクチン遺伝子によってコードされる組換えレクチンタンパク質を発現させる工程を含み、細胞の発現が、細胞が160分間以下の倍加時間を有するような条件下で行なわれる、該方法。
- 細胞の発現が、細胞が少なくとも100分の倍加時間を有するような細胞の条件下で行なわれる、請求項1に記載の方法。
- 発現が、少なくとも15℃かつ22℃以下の温度で行なわれる、請求項1に記載の方法。
- 宿主細胞培養液が少なくとも10Lの容量を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記方法が、宿主細胞を培養する工程を含み、該培養は、宿主細胞を、タンパク質発現前に増殖させる増殖期及びタンパク質の発現が行なわれる発現期を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
- 増殖期が、発現期が行なわれる温度よりも高い温度で実施される、請求項5記載の方法。
- 増殖期から発現期までの温度を、少なくとも4時間かつ7時間以下の期間をかけて下げる、請求項5又は6記載の方法。
- 発現期が、少なくとも0.1mMかつ0.7mM以下の濃度の誘導物質の添加によって誘導される、請求項5〜7のいずれかに請求されているような方法。
- 発現期が、培養液の吸光度が少なくとも25かつ40以下である場合に、誘導物質の添加によって誘導される、請求項5〜8のいずれか一項記載の方法。
- 吸光度が、培養液中の宿主細胞集団の測定であり、600nmで測定される、請求項9に記載の方法。
- 組換えレクチンタンパク質の発現用の宿主細胞が、大腸菌(E.coli)である、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
- 誘導物質が、IPTGである、請求項8〜11のいずれか一項記載の方法。
- 誘導物質が、0.5mM以下の濃度で培養液に添加される、請求項8〜12のいずれか一項記載の方法。
- 組換えレクチンタンパク質が、
a.配列番号1;
b.配列番号3;
c.配列番号4;又は
d.a、b、又はcに対して少なくとも60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、又は99%の相同性を有するアミノ酸配列
から選択される、請求項1〜13のいずれか一項記載の方法。 - 前記方法が、さらに、
a)場合により、組換えレクチン遺伝子を発現ベクターにクローニングし、該発現ベクターを宿主細胞に挿入すること;
b)適切な培地中で宿主細胞を培養すること、該培養は、25℃から40℃の温度で行なわれる増殖期と、組換えレクチン遺伝子によってコードされる組換えレクチンタンパク質が発現される間の発現期とを含み、ここでの発現期間は、15℃から30℃の温度で行なわれ、炭素対窒素の比は、発現期中に3:1から6:1に維持される;
c)場合により、(b)で発現される組換えレクチンタンパク質を単離して、粗組換えレクチンタンパク質を得ること;及び
d)場合により、粗組換えレクチンタンパク質を精製し、組換えレクチンタンパク質の単離物を得ること
を含む、請求項1〜14のいずれか一項記載の方法。 - 工程「a」の発現ベクターが、図1に示されているとおりである、請求項15に記載の方法。
- 工程「b」の炭素源が、誘導期間中、少なくとも0.5g/L/hの速度かつ2g/L/h以下の速度で培養液に添加され、炭素源が、グルコース又はグリセロールである、請求項15に記載の方法。
- 工程「b」の窒素源が、誘導期間中、少なくとも0.4g/L/hの速度かつ1.5g/L/h以下の速度で培養液に添加され、窒素源が、トリプトン、ペプトン、又は酵母エキスである、請求項15に記載の方法。
- 工程「c」の粗組換えレクチンタンパク質の単離が、遠心分離に続いて細胞表面の破壊によって行なわれる、請求項15に記載の方法。
- 工程「d」の粗組換えレクチンタンパク質の精製が、少なくとも1回のクロマトグラフィー工程を含む、請求項15に記載の方法。
- 少なくとも1回のクロマトグラフィー工程が、陰イオン交換クロマトグラフィー及び/又は陽イオン交換クロマトグラフィーを含む、請求項20に記載の方法。
- 少なくとも1回のクロマトグラフィー工程が、疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む、請求項20に記載の方法。
- 工程「d」の粗組換えレクチンタンパク質の精製が、ろ過工程を含む、請求項15に記載の方法。
- 組換えレクチンタンパク質が、
a.配列番号1;
b.配列番号3;
c.配列番号4;又は
d.a、b、又はcに対して少なくとも60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、又は99%の相同性を有するアミノ酸配列
から選択される、請求項15に記載の方法。 - 宿主細胞培養液が、少なくとも10Lの容量を有する、請求項15に記載の方法。
- a)陰イオン交換クロマトグラフィーによって粗組換えレクチンタンパク質を最初に精製して、第一の精製された溶出物を得る工程;
b)第一の精製された溶出物を疎水性相互作用クロマトグラフィーによって任意選択で精製して、第二の精製された溶出物を得る工程;
c)第二の精製された溶出物を陽イオン交換クロマトグラフィーによって任意選択で精製して、第三の精製された溶出物を得る工程;
d)第一、第二、又は第三の精製された溶出物を陰イオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製して、第四の精製された溶出物を得る工程;及び
e)透析ろ過によって第四の精製された溶出物の緩衝液を交換して、精製された組換えレクチンタンパク質単離物を得る工程
を含む、粗組換えレクチンタンパク質を精製する方法。 - 粗組換えレクチンタンパク質が、請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法によって得られる、請求項26に記載の方法。
- 請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法によって産生された組換えレクチンタンパク質。
- 20%未満の、開始メチオニンを有する組換えレクチンを有する組換えレクチンタンパク質を調製するための方法であって、該方法は、以下の条件:
a)少なくとも15℃かつ22℃以下の発現温度;
b)発現(すなわち誘導)期が少なくとも10時間かけて行なわれる;
c)炭素源は、0.5〜2g/L/hの速度で培養液に添加される;
d)窒素源は、0.4〜1.5g/L/hの速度で培養液に添加される;
e)少なくとも0.1mMかつ0.5mM以下の誘導物質の濃度;
f)少なくとも1回のクロマトグラフィー工程を使用して粗組換えレクチンタンパク質を精製する工程
の少なくとも1つを含む、該方法。 - 20%未満の、開始メチオニンを有する組換えレクチンを有する組換えレクチンタンパク質。
- 組換えレクチンが、
a.配列番号1;
b.配列番号3;
c.配列番号4;又は
d.a、b、又はcに対して少なくとも60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、又は99%の相同性を有するアミノ酸配列
から選択される、請求項28又は30に記載の組換えレクチンタンパク質。
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