JP5673986B1 - タンパク質の沈殿による製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
組換え生物によるタンパク質生産技術では、動物細胞(非特許文献1)や微生物(非特許文献1)が利用されており、動物細胞ではCHO細胞(非特許文献2)、微生物では大腸菌や酵母(非特許文献3)などが用いられている。例えば、微生物としてCorynebacterium glutamicum(以下、C. glutamicumと略すこともある)を用いたタンパク質分泌生産系がある(特許文献1)。
クロマトグラフィーでは、様々な性質を有するクロマトグラフィー用基材が用いられる。クロマトグラフィーでは、タンパク質とクロマトグラフィー用基材との相互作用や、クロマトグラフィー基材が有する分子ふるい効果が利用される(非特許文献4)。タンパク質とクロマトグラフィー用基材との相互作用としては、静電相互作用、水素結合、疎水性相互作用や、特異的相互作用などが挙げられる(非特許文献4及び5)。
固液分離は、可溶化状態にあるタンパク質を、溶液条件を変化させることによって不溶化(すなわち固体化)し、遠心分離などの簡便な方法によって固体部分を取得し、これを再び可溶化状態に導くことで分離する方法である。タンパク質を不溶化させる手段の具体例としては、等電点沈殿(非特許文献6)、塩析(非特許文献7)、有機溶媒による沈殿(非特許文献8)や、水溶性高分子による沈殿(非特許文献9)などが挙げられる。
等電点沈殿は、タンパク質がその等電点において溶解度が最も低くなることを利用する。塩析、有機溶媒による沈殿および水溶性高分子による沈殿は、タンパク質の溶解度がそれぞれ高濃度の塩、有機溶媒、および水溶性高分子の存在によって低下することを利用する。その他の不溶化手段としては、タンパク質の凝集(非特許文献10及び非特許文献11)が挙げられる。タンパク質の凝集は、精製するタンパク質が可溶化状態にあり且つ精製するタンパク質以外のタンパク質が凝集するような条件を選べる場合に特に有効な手段となり得る。
付加配列そのものの性質を利用する方法では、温度変化によって相転移を起し不溶化するエラスチンを利用する方法(非特許文献12)や、pH変化によって可溶性の会合体を形成するMISTICを利用する方法(特許文献2)などがある。
付加配列と付加配列以外の物質との相互作用を利用する方法では、付加配列以外の物質がクロマトグラフィー用基材上に設置されることが多い(非特許文献13)。付加配列と付加配列以外の物質の相互作用としては、静電相互作用、水素結合、疎水性相互作用や、特異的相互作用などが挙げられる。
一方、タンパク質に精製用の配列を付加しその付加配列の性質を利用する方法では、同じ付加配列を利用すれば、複数のタンパク質の精製に同じまたは類似の精製方法を適用できることが多く、汎用性の高い方法と言える。
しかし、付加配列の性質を利用する方法でも、エラスチンを利用した方法は熱により失活しやすい目的タンパク質には適用できないという課題や、MISTICを利用した方法は生じた会合体の分離が困難であるなどの課題がある。
すなわち、本発明は、下記の[1]〜[33]に関するものである。
[1]自己組織化能を有するタンパク質と目的タンパク質との融合タンパク質の製造方法であって、下記(1)〜(4)の工程:
(1)融合タンパク質を含む溶液を調製する工程、
(2)工程(1)で得られた溶液のpHを、下記計算式:
回収率(%)=[工程(4)で得られた溶液における融合タンパク
質の量/{工程(4)で得られた溶液における融合タンパク質の量
+工程(3)の固体分離後の溶液における融合タンパク質の量}]
×100
で計算される回収率を10%以上にするpHへと調節する工程、
(3)工程(2)で得られた溶液から固体を分離する工程、及び、
(4)工程(3)で分離した固体を、工程(2)で得られた溶液のpHよ
りも0.1以上高く、かつ、12以下のpHを有する溶液中に溶解
させる工程
を含む、融合タンパク質の製造方法。
[2]自己組織化能を有するタンパク質が細胞表層タンパク質である、前記[1]記載の方法。
[3]細胞表層タンパク質がCspB成熟タンパク質又はその一部である、前記[2]記載の方法。
[4]CspB成熟タンパク質又はその一部が下記(a)または(b)である、前記[3]記載の方法。
(a)配列番号3記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号3記載のアミノ酸配列と95%以上の相同性を有するタンパク質
[5]CspB成熟タンパク質の一部が、CspB成熟タンパク質のN末端から6〜250アミノ酸残基からなる配列である、前記[3]記載の方法。
[6]CspB成熟タンパク質の一部が、CspB成熟タンパク質のN末端から6、17、50又は250のいずれかのアミノ酸残基からなる配列である、前記[5]記載の方法。
[7]目的タンパク質のアミノ酸残基数が10〜1000である、前記[1]〜[6]のいずれかに記載の方法。
[8]自己組織化能を有するタンパク質と目的タンパク質との間に、さらに、酵素的切断又は化学的切断に使用されるアミノ酸配列を含む、前記[1]〜[7]のいずれかに記載の方法。
[9]自己組織化能を有するタンパク質と目的タンパク質との間にある酵素的切断に使用されるアミノ酸配列が、ProTEVプロテアーゼ認識配列、トリプシンの認識配列又はFactor Xaプロテアーゼの認識配列である、前記[8]記載の方法。
[10]工程(2)のpHが9以下である、前記[1]〜[9]のいずれかに記載の方法。
[11]工程(2)のpH調節を、硫酸、塩酸、酢酸、リン酸及びトリフルオロ酢酸からなる群より選ばれる酸を用いて行う、前記[1]〜[10]のいずれかに記載の方法。
[12]工程(3)の分離を、遠心分離及び/又は膜ろ過により行う、前記[1]〜[11]のいずれかに記載の方法。
[13]工程(1)で得られた溶液が、融合タンパク質を発現する遺伝子構築物を有するコリネ型細菌の培養液の上清である、前記[1]〜[12]のいずれかに記載の方法。
[14]工程(2)に規定される回収率が30%以上である、前記[1]〜[13]のいずれかに記載の方法。
[15]目的タンパク質の製造方法であって、下記(1)〜(5)の工程:
(1)自己組織化能を有するタンパク質と目的タンパク質との融合タン
パク質を含む溶液を調製する工程であって、該融合タンパク質が、
自己組織化能を有するタンパク質と目的タンパク質との間に、酵
素的切断又は化学的切断に使用されるアミノ酸配列を含んでいる
工程、
(2)工程(1)で得られた溶液のpHを、下記計算式:
回収率(%)=[工程(4)で得られた溶液における融合タンパ
ク質の量/{工程(4)で得られた溶液における融合タンパク質
の量+工程(3)の固体分離後の溶液における融合タンパク質の
量}]×100
で計算される回収率を10%以上にするpHへと調節する工程、
(3)工程(2)で得られた溶液から固体を分離する工程、及び、
(4)工程(3)で分離した固体を、工程(2)で得られた溶液のpH
よりも0.1以上高く、かつ、12以下のpHを有する溶液中に
溶解させる工程、
(5)工程(4)と同時、工程(4)の途中、または工程(4)の後に
、融合タンパク質を、自己組織化能を有するタンパク質と目的タ
ンパク質との間にあるアミノ酸配列部位で酵素的切断又は化学的
切断する処理に付する工程、
を含む、目的タンパク質の製造方法。
[16]融合タンパク質を切断する処理に付する工程が、酵素的切断処理に付する工程である、前記[15]記載の方法。
[17]自己組織化能を有するタンパク質が細胞表層タンパク質である、前記[15]記載の方法。
[18]細胞表層タンパク質がCspB成熟タンパク質又はその一部である、前記[17]記載の方法。
[19]CspB成熟タンパク質又はその一部が下記(a)または(b)である、前記[18]記載の方法。
(a)配列番号3記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号3記載のアミノ酸配列と95%以上の相同性を有するタンパク質
[20]CspB成熟タンパク質の一部が、CspB成熟タンパク質のN末端から6〜250アミノ酸残基からなる配列である、前記[18]記載の方法。
[21]CspB成熟タンパク質の一部が、CspB成熟タンパク質のN末端から6、17、50又は250のいずれかのアミノ酸残基からなる配列である、前記[20]記載の方法。
[22]目的タンパク質のアミノ酸残基数が10〜1000である、前記[15]〜[21]のいずれかに記載の方法。
[23]目的タンパク質がテリパラチドである、前記[15]〜[22]のいずれかに記載の方法。
[24]目的タンパク質が配列番号93で示されるビバリルジン中間体である、前記[15]〜[22]のいずれかに記載の方法。
[25]自己組織化能を有するタンパク質と目的タンパク質との間にある酵素的切断に使用されるアミノ酸配列が、ProTEVプロテアーゼ認識配列、トリプシンの認識配列又はFactor Xaプロテアーゼの認識配列である、前記[15]〜[24]のいずれかに記載の方法。
[26]工程(2)のpHが9以下である、前記[15]〜[25]のいずれかに記載の方法。
[27]工程(2)のpH調節を、硫酸、塩酸、酢酸、リン酸及びトリフルオロ酢酸からなる群より選ばれる酸を用いて行う、前記[15]〜[26]のいずれかに記載の方法。
[28]工程(3)の分離を、遠心分離及び/又は膜ろ過により行う、前記[15]〜[27]のいずれかに記載の方法。
[29]工程(1)で得られた溶液が、融合タンパク質を発現する遺伝子構築物を有するコリネ型細菌の培養液の上清である、前記[15]〜[28]のいずれかに記載の方法。
[30]工程(4)及び/又は工程(5)の後に、(6)融合タンパク質または目的タンパク質を精製する工程を含む、前記[15]〜[29]のいずれかに記載の方法。
[31]工程(6)をカラムクロマトグラフィーにより行う、前記[30]記載の方法。
[32]工程(2)に規定される回収率が30%以上である、前記[15]〜[31]のいずれかに記載の方法。
[33]自己組織化能を有するタンパク質と目的タンパク質との融合タンパク質を含む溶液のpHを9以下に調節することによって固体を発生させた後、該固体を分離することを特徴とする、融合タンパク質の固体を発生させ分離する方法。
(1)融合タンパク質を含む溶液を調製する工程、
(2)工程(1)で得られた溶液のpHを、下記計算式:
回収率(%)=[工程(4)で得られた溶液における融合タンパ
ク質の量/{工程(4)で得られた溶液における融合タンパク質
の量+工程(3)の固体分離後の溶液における融合タンパク質の
量}]×100
で計算される回収率を10%以上にするpHへと調節する工程、
(3)工程(2)で得られた溶液から固体を分離する工程、及び、
(4)工程(3)で分離した固体を、工程(2)で得られた溶液のpH
よりも0.1以上高く、かつ、12以下のpHを有する溶液中に
溶解させる工程
を含む、融合タンパク質の製造方法である。
「融合タンパク質」は、「自己組織化能を有するタンパク質」と「目的タンパク質」とから構成される。「自己組織化能を有するタンパク質」は「目的タンパク質の」上流(N末端側)にあってもよく、下流(C末端側)に有ってもよい。なお、後述するように、融合タンパク質は「自己組織化能を有するタンパク質」のアミノ酸配列と「目的タンパク質」のアミノ酸配列との間に「切断に使用されるアミノ酸配列」を含んでいてもよい。
「自己組織化能」とは、適当な環境条件下でタンパク質自身が集合し、生理的に意味のある高次構造を形成する能力をいう。
「自己組織化能を有するタンパク質」は、自己組織化能を保持している限り、完全長配列であってもよく、部分配列であってもよい。
「自己組織化能を有するタンパク質」は、自己組織化能を保持している限り、その大きさ(アミノ酸残基数)に特に制限はないが、アミノ酸残基数は、好ましくは5〜1000アミノ酸、より好ましくは5〜700アミノ酸、さらに好ましくは5〜500アミノ酸である。
「自己組織化能を有するタンパク質」は、自己組織化能を保持している限り、天然タンパク質のバリアントであってもよい。例えば、天然タンパク質のアミノ酸配列中に、1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたものであってもよい。前記の「1又は数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜5個である。
細胞表層タンパク質は、細菌に広く見出されるS-layerと呼ばれる細胞表層構造の構成タンパク質であり、生理条件において自己組織化して層状の構造を形成することが知られている(Ilk N, Egelseer EM, Sleytr UB. S-layer fusion proteins--construction principles and applications. Curr Opin Biotechnol. 2011 Dec;22(6):824-31. Epub 2011 Jun 21.)。
細胞表層タンパク質の具体例としては、コリネ型細菌であるC. glutamicumに由来するPS1及びCspB(PS2)(特表平6−502548号公報)や、Corynebacterium ammoniagenesに由来するSlpA(CspA)(特開平10−108675号公報)等が挙げられる。
これらのうち、CspB(PS2)(499アミノ酸残基)が好ましい。なお、CspBはPS2と同義である。
CspBについては、界面活性剤であるドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を含む溶液を菌体に作用させると、自己組織化した層状の構造が破壊され、SDS溶液中にCspBが抽出されてくることが種々のC. glutamicumで見出されている(Hansmeier N, Bartels FW, Ros R, Anselmetti D, Tauch A, Puhler A, Kalinowski J. Classification of hyper-variable Corynebacterium glutamicum surface-layer proteins by sequence analyses and atomic force microscopy. J Biotechnol. 2004 Aug 26; 112(1-2):177-93.)。
Gln Glu Thr Asn Pro Thr Phe Asn Ile Asn Asn Gly Phe Asn Asp Ala
Asp Gly Ser Thr Ile Gln Pro Val Glu Pro Val Asn His Thr Glu Glu
Thr Leu Arg Asp Leu Thr Asp Ser Thr Gly Ala Tyr Leu Glu Glu Phe
Gln Tyr Gly Asn Val Glu Glu Ile Val Glu Ala Tyr Leu Gln Val Gln
Ala Ser Ala Asp Gly Phe Asp Pro Ser Glu Gln Ala Ala Tyr Glu Ala
Phe Glu Ala Ala Arg Val Arg Ala Ser Gln Glu Leu Ala Ala Ser Ala
Glu Thr Ile Thr Lys Thr Arg Glu Ser Val Ala Tyr Ala Leu Lys Ala
Asp Arg Glu Ala Thr Ala Ala Phe Glu Ala Tyr Leu Ser Ala Leu Arg
Gln Val Ser Val Ile Asn Asp Leu Ile Ala Asp Ala Asn Ala Lys Asn
Lys Thr Asp Phe Ala Glu Ile Glu Leu Tyr Asp Val Leu Tyr Thr Asp
Ala Asp Ile Ser Gly Asp Ala Pro Leu Leu Ala Pro Ala Tyr Lys Glu
Leu Lys Asp Leu Gln Ala Glu Val Asp Ala Asp Phe Glu Trp Leu Gly
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Gln Lys Ser Asp Val Leu Val Pro Gln Leu Phe Leu Glu Arg Ala Thr
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Glu Asp Glu Ala Tyr Tyr Gln Ala Lys Leu Asp Phe Ala Ile Glu Thr
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Glu Ala Glu Arg Ala Ala Asp Ala Ala Tyr Arg Ala Glu Gln Leu Arg
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Ala Asn Ala Gly Asn Asn Asp Asn Gly Gly Asp Asn Ser Ser Asp Asp
Lys Gly Thr Gly Ser Ser Asp Ile Gly Thr Trp Gly Pro Phe Ala Ala
Ile Ala Ala Ile Ile Ala Ala Ile Ala Ala Ile Phe Pro Phe Leu Ser
Gly Ile Val Lys Phe
例えば、CspB成熟タンパク質が、配列番号3に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である場合、「N末端から6〜250アミノ酸残基からなる配列」とは、配列番号3の1位(N末端)のアミノ酸残基から、6〜250位(同N末端から6〜250番目)のアミノ酸残基までのアミノ酸配列をいう。
さらに好ましくは、CspB成熟タンパク質のN末端から6、17、50又は250のいずれかのアミノ酸残基からなる配列である。
なお、アミノ酸配列における「X位(Xは、例えば、6、17、50又は250である)」とは、同アミノ酸配列のN末端からX番目までを意味し、N末端のアミノ酸残基が1位のアミノ酸残基である。すなわち、上記各アミノ酸残基の位置は相対的な位置を示すものであって、アミノ酸の欠失、挿入、付加などによってその位置は前後することがある。
例えば、CspB成熟タンパク質が配列番号3に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である場合、「N末端からの50位のアミノ酸残基」とは、配列番号3における50位に相当するアミノ酸残基を意味し、50位よりもN末端側の1アミノ酸残基が欠失している場合は、N末端から49番目までのアミノ酸残基が「N末端からの50位のアミノ酸残基」であるものとする。また、50位よりもN末端側に1アミノ酸残基が挿入されている場合、N末端から51番目のアミノ酸残基が「N末端からの50位のアミノ酸残基」であるものとする。
また「目的タンパク質」は、当該タンパク質を産生する宿主との関係において同種タンパク質であってもよく、異種タンパク質であってもよい。
多量体タンパク質とは、2またはそれ以上のサブユニットからなる多量体として存在しうるタンパク質をいう。多量体において、各サブユニットは、ジスルフィド結合等の共有結合で連結されていてもよく、水素結合や疎水性相互作用等の非共有結合で連結されていてもよく、それらの組み合わせにより連結されていてもよい。多量体は、単一の種類のサブユニットからなるホモ多量体であってもよく、2またはそれ以上の種類のサブユニットからなるヘテロ多量体であってもよい。なお、多量体タンパク質がヘテロ多量体である場合には、多量体を構成するサブユニットの内、少なくとも1つのサブユニットが異種タンパク質であってもよい。すなわち、全てのサブユニットが異種由来であってもよく、一部のサブユニットのみが異種由来であってもよい。
目的タンパク質は、天然で分泌性であるタンパク質であってもよく、天然では非分泌性であるタンパク質であってもよいが、天然で分泌性であるタンパク質であるのが好ましい。
また、目的タンパク質をコードする遺伝子は、必要により宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンに変換されていてもよい。
なお、目的タンパク質は、生理活性タンパク質の一部であるが、生理活性を有しないものであってもよい。この場合、目的タンパク質を取得後、必要な修飾(例えば、アミノ酸配列の付加)を行うことで、生理活性タンパク質とすることができる。具体例としては、生理活性タンパク質であるビバリルジン(Bivariludin)(20アミノ酸)の一部(18アミノ酸残基)であるペプチド(Biva18)(配列番号93:Arg Pro Gly Gly Gly Gly Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu)が挙げられる。
プロ構造部の切断は、本発明の製造方法の工程(4)と同時、工程(4)の途中、または工程(4)の後に行うことができる。
「工程(4)と同時」とは、工程(4)で用いる「工程(2)で得られた溶液のpHよりも0.1以上高く、かつ、12以下のpHを有する溶液」に、プロ構造部の切断に用いる試薬(例えば、後述のプロテアーゼ)を予め添加しておき、この溶液を用いて工程(4)とプロ構造部の切断とを同時に行うことをいう。
「工程(4)の途中」とは、工程(4)で用いる「工程(2)で得られた溶液のpHよりも0.1以上高く、かつ、12以下のpHを有する溶液」へプロ構造部の切断に用いる試薬を添加せずに工程(4)を開始し、工程(4)の途中で前記試薬を添加して、プロ構造部の切断を行うことをいう。
「工程(4)の後」とは、工程(4)が終了した後に、プロ構造部の切断に用いる試薬を用いて、プロ構造部の切断を行うことをいう。
プロ構造部の切断は、例えば、プロテアーゼにより行うことができる。プロテアーゼを使用する場合は、最終的に得られるタンパク質の活性という観点から、プロタンパク質は一般には天然のタンパク質とほぼ同じ位置で切断されることが好ましく、天然のタンパク質と完全に同じ位置で切断され天然のものと同一の成熟タンパク質が得られるのがより好ましい。従って、一般には、天然に生じる成熟タンパク質と同一のタンパク質を生じる位置でプロタンパク質を切断する特異的プロテアーゼが最も好ましい。
プロテアーゼには、proTEVprotease(プロメガ社製)のような商業的に入手できるものの他、微生物の培養液、例えば放線菌の培養液等から得られるものが含まれる。そのようなプロテアーゼは未精製状態で使用することもでき、必要に応じて適当な純度まで精製した後に使用してもよい。
融合タンパク質を菌体内に蓄積する宿主を用いた場合、工程(1)の溶液を調製するためには菌体を破砕する処理を行う。融合タンパク質を細胞外へ分泌することができる宿主は、かかる破砕処理が不要になるので好ましい。
細菌としては、例えば、コリネ型細菌や大腸菌等を用いることができる。
細菌以外の微生物としては、例えば、酵母等を用いることができる。
昆虫細胞としてはカイコ等、動物細胞ではCHO細胞等を用いることができる。
これらのなかでは、コリネ型細菌が好ましい。
コリネ型細菌を使用することの利点としては、従来から目的タンパク質の分泌生産に利用されている糸状菌、酵母、Bacillus属細菌等と比べ、もともと菌体外に分泌される不純物タンパク質が極めて少なく、融合タンパク質を分泌生産した場合の精製工程の簡略化や省略化が期待できること、また、糖、アンモニア、および無機塩等を含有するシンプルな培地で良く生育し、培地代や培養方法、培養生産性で優れていること、等が挙げられる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム(Corynebacterium acetoacidophilum)
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム(Corynebacterium acetoglutamicum)
コリネバクテリウム・アルカノリティカム(Corynebacterium alkanolyticum)
コリネバクテリウム・カルナエ(Corynebacterium callunae)
コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)
コリネバクテリウム・リリウム(Corynebacterium lilium)
コリネバクテリウム・メラセコーラ(Corynebacterium melassecola)
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス(コリネバクテリウム・エフィシエンス)(Corynebacterium thermoaminogenes (Corynebacterium efficiens))
コリネバクテリウム・ハーキュリス(Corynebacterium herculis)
ブレビバクテリウム・ディバリカタム(Brevibacterium divaricatum)
ブレビバクテリウム・フラバム(Brevibacterium flavum)
ブレビバクテリウム・イマリオフィラム(Brevibacterium immariophilum)
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(コリネバクテリウム・グルタミカム)(Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum))
ブレビバクテリウム・ロゼウム(Brevibacterium roseum)
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム(Brevibacterium saccharolyticum)
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス(Brevibacterium thiogenitalis)
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス(Corynebacterium ammoniagenes)
ブレビバクテリウム・アルバム(Brevibacterium album)
ブレビバクテリウム・セリナム(Brevibacterium cerinum)
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム(Microbacterium ammoniaphilum)
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806
Corynebacterium alkanolyticum ATCC 21511
Corynebacterium callunae ATCC 15991
Corynebacterium glutamicum ATCC 13020, ATCC 13032, ATCC 13060,ATCC 13869,FERM BP-734
Corynebacterium lilium ATCC 15990
Corynebacterium melassecola ATCC 17965
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Corynebacterium herculis ATCC 13868
Brevibacterium divaricatum ATCC 14020
Brevibacterium flavum ATCC 13826, ATCC 14067, FERM BP-2205
Brevibacterium immariophilum ATCC 14068
Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869
Brevibacterium roseum ATCC 13825
Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066
Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240
Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6871, ATCC 6872
Brevibacterium album ATCC 15111
Brevibacterium cerinum ATCC 15112
Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354
自己組織化能を有するタンパク質を目的タンパク質の上流に配置する場合は、自己組織化能を有するタンパク質をコードする核酸配列は、シグナルペプチドをコードする核酸配列の下流に、該自己組織化能を有するタンパク質が該シグナルペプチドと接続して発現するよう連結されていればよい。さらに、目的タンパク質をコードする核酸配列は、自己組織化能を有するタンパク質をコードする核酸配列の下流に、該目的タンパク質が該自己組織化能を有するタンパク質と接続して発現するよう連結されていればよい。
自己組織化能を有するタンパク質を目的タンパク質の下流に配置する場合は、目的タンパク質をコードする核酸配列は、シグナルペプチドをコードする核酸配列の下流に、該目的タンパク質が該シグナルペプチドと接続して発現するよう連結されていればよい。さらに、自己組織化能を有するタンパク質をコードする核酸配列は、目的タンパク質をコードする核酸配列の下流に、該自己組織化能を有するタンパク質が該目的タンパク質と接続して発現するよう連結されていればよい。
遺伝子構築物は、宿主で融合タンパク質遺伝子を発現させるために有効な制御配列(オペレーターやターミネーター等)を、それらが機能し得るように適切な位置に有していてもよい。
例えば、宿主としてコリネ型細菌を用いる場合、プロモーターは、コリネ型細菌で機能するプロモーターである。
「コリネ型細菌で機能するプロモーター」とは、コリネ型細菌においてプロモーター活性を有するプロモーターをいう。
コリネ型細菌由来のプロモーターとしては、例えば、細胞表層タンパク質のPS1、CspB(PS2ともいう)、SlpA(CspAともいう)の遺伝子のプロモーターや、各種アミノ酸生合成系遺伝子のプロモーターが挙げられる。
各種アミノ酸生合成系遺伝子のプロモーターとして、具体的には、例えば、グルタミン酸生合成系のグルタミン酸脱水素酵素遺伝子、グルタミン合成系のグルタミン合成酵素遺伝子、リジン生合成系のアスパルトキナーゼ遺伝子、スレオニン生合成系のホモセリン脱水素酵素遺伝子、イソロイシンおよびバリン生合成系のアセトヒドロキシ酸合成酵素遺伝子、ロイシン生合成系の2-イソプロピルリンゴ酸合成酵素遺伝子、プロリンおよびアルギニン生合成系のグルタミン酸キナーゼ遺伝子、ヒスチジン生合成系のホスホリボシル-ATPピロホスホリラーゼ遺伝子、トリプトファン、チロシンおよびフェニルアラニン等の芳香族アミノ酸生合成系のデオキシアラビノヘプツロン酸リン酸(DAHP)合成酵素遺伝子、イノシン酸およびグアニル酸のような核酸生合成系におけるホスホリボシルピロホスフェート(PRPP)アミドトランスフェラーゼ遺伝子、イノシン酸脱水素酵素遺伝子、およびグアニル酸合成酵素遺伝子のプロモーターが挙げられる。
コリネ型細菌に対して異種のプロモーターとして、具体的には、例えば、tacプロモーター、lacプロモーター、trpプロモーター、およびaraBADプロモーター等のE. coli由来のプロモーターが挙げられる。その中で、tacプロモーター等の強力なプロモーターが好ましく、araBADプロモーター等の誘導型のプロモーターも好ましい。
分泌性タンパク質は、一般に、プレタンパク質(プレペプチドともいう)またはプレプロタンパク質(プレプロペプチドともいう)として翻訳され、その後、プロセッシングにより成熟タンパク質(mature protein)になることが知られている。具体的には、分泌性タンパク質は、一般に、プレタンパク質またはプレプロタンパク質として翻訳された後、プレ部分であるシグナルペプチドがプロテアーゼ(一般にシグナルペプチダーゼと呼ばれる)によって切断され成熟タンパク質またはプロタンパク質に変換されて分泌され、プロタンパク質はプロテアーゼによってさらにプロ部分が切断されて成熟タンパク質になる。
したがって、本発明では、宿主による融合タンパク質の分泌生産のためにシグナルペプチドを利用する。なお、本明細書において、分泌性タンパク質のプレタンパク質およびプレプロタンパク質を総称して「分泌性タンパク質前駆体」という場合がある。
本発明で使用されるシグナルペプチドは、宿主で機能するシグナルペプチドである限り特に限定されず、宿主由来のシグナルペプチドであってもよく、異種由来のシグナルペプチドであってもよい。
例えば、宿主としてコリネ型細菌を用いる場合、シグナルペプチドは、コリネ型細菌で機能するシグナルペプチドである。
「コリネ型細菌で機能するシグナルペプチド」とは、融合タンパク質のN末端に連結した際に、コリネ型細菌が融合タンパク質を分泌することができるペプチドをいう。
コリネ型細菌で機能するシグナルペプチドとして、宿主であるコリネ型細菌の分泌性タンパク質のシグナルペプチドであるのが好ましく、コリネ型細菌の細胞表層タンパク質のシグナルペプチドであるのがより好ましい。コリネ型細菌の細胞表層タンパク質としては、C. glutamicumに由来するPS1及びCspB(PS2)(特表平6−502548号公報)、及びC. ammoniagenesに由来するSlpA(CspA)(特開平10−108675号公報)が挙げられる。PS1のシグナルペプチドのアミノ酸配列を配列番号4に、CspB(PS2)のシグナルペプチドのアミノ酸配列を配列番号5に、SlpA(CspA)のシグナルペプチドのアミノ酸配列を配列番号6に示す。また、米国特許第4965197号明細書によれば、コリネ型細菌由来のDNaseにもシグナルペプチドがあると言われており、そのようなシグナルペプチドも本発明に利用することができる。
シグナルペプチドをコードする遺伝子は、天然型のままでも使用できるが、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変してもよい。
なお、付加配列をコードする核酸配列と目的タンパク質をコードする核酸配列との間に、さらに、酵素的または化学的切断に使用されるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含んでいてもよい。酵素的または化学的切断に使用されるアミノ酸配列を融合タンパク質へ挿入することで、発現した融合タンパク質を酵素的または化学的に切断して、目的タンパク質を得ることができる。
切断は、定法に従い酵素的または化学的に行うことができる。
切断工程は、工程(4)と同時、工程(4)の途中、または工程(4)の後に行うことができる。
「工程(4)と同時」とは、工程(4)で用いる「工程(2)で得られた溶液のpHよりも0.1以上高く、かつ、12以下のpHを有する溶液」に、切断試薬(例えば、後述の酵素的切断に用いるプロテアーゼ)を予め添加しておき、この溶液を用いて工程(4)と切断工程とを同時に行うことをいう。
「工程(4)の途中」とは、工程(4)で用いる「工程(2)で得られた溶液のpHよりも0.1以上高く、かつ、12以下のpHを有する溶液」へ切断試薬を添加せずに工程(4)を開始し、工程(4)の途中で前記試薬を添加して、切断工程を行うことをいう。
「工程(4)の後」とは、工程(4)が終了した後に、切断試薬を用いて、切断工程を行うことをいう。
切断工程の後、当該技術分野において周知慣用の方法を用いることで、自己組織化能を有するタンパク質から目的タンパク質を容易に分離することができる。この際、工程(2)と同様にして、切断工程に付した溶液のpHを調節して自己組織化能を有するタンパク質のみを沈殿させ、工程(3)と同様にして自己組織化能を有するタンパク質のみを固体として分離しても良い。
宿主が細菌である場合、遺伝子構築物は、プラスミドのように染色体外で自律増殖するベクター上に存在していてもよく、染色体上に組み込まれていてもよい。
例えば、遺伝子構築物を、宿主としてのコリネ型細菌へ、ベクターを用いて導入する場合、ベクターは、コリネ型細菌で自律複製可能なものであれば特に制限されず、例えば、細菌プラスミド由来のベクター、酵母プラスミド由来のベクター、バクテリオファージ由来のベクター、コスミドや、ファージミド等であってよい。ベクターとしては、コリネ型細菌由来のプラスミドが好ましい。コリネ型細菌で自律複製可能なベクターとして、具体的には、pHM1519(Agric, Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984));pAM330(Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984));これらを改良した薬剤耐性遺伝子を有するプラスミド;特開平3-210184号公報に記載のプラスミドpCRY30;特開平2-72876号公報及び米国特許5,185,262号明細書公報に記載のプラスミドpCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE及びpCRY3KX;特開平1-191686号公報に記載のプラスミドpCRY2およびpCRY3;特開昭58-192900号公報に記載のpAJ655、pAJ611及びpAJ1844;特開昭57-134500号公報に記載のpCG1;特開昭58-35197号公報に記載のpCG2;特開昭57-183799号公報に記載のpCG4およびpCG11等が挙げられる。
培養は、使用する宿主に適切な条件で行うことができる。例えばコリネ型細菌の場合、pH5.0〜8.5、15℃〜37℃の適切な範囲にて好気的条件下で行い、1〜7日間程度培養する。また、コリネ型細菌のL−アミノ酸生産における培養条件や、その他Sec系、Tat系のシグナルペプチドを用いたタンパク質の製造法に記載の条件を用いることが出来る(WO01/23591、WO2005/103278参照)。
融合タンパク質の発現のために誘導型プロモーターを用いた場合は、培地にプロモーター誘導剤を添加して培養を行うこともできる。
また、場合により、融合タンパク質(更には目的タンパク質)は、逆相HPLCを用いて濃度測定や純度測定をすることもできる。
培養液からの菌体の分離は、当該技術分野で周知慣用の方法、例えば、遠心分離、膜ろ過等により実施することができる。菌体分離工程は、通常、融合タンパク質(又は目的タンパク質)の回収率及び純度の向上の観点から工程(1)で実施される。しかし、諸般の事情により他の工程で行うことが好ましい場合には、工程(1)以外の任意の工程で行ってもよい。
回収率(%)=[工程(4)で得られた溶液における融合タン
パク質の量/{工程(4)で得られた溶液における融合タンパ
ク質の量+工程(3)の固体分離後の溶液における融合タンパ
ク質の量}]×100
で計算される回収率を10%以上にするpHへと調節する。
なお、以下の説明で用いられる「沈殿」に関する用語(例えば、「沈殿物」や「沈殿溶解液」等)は、特段の記載がない限り、融合タンパク質を対象とするものである。沈殿が宿主菌体を対象とする場合には、その旨を記載する。
また、融合タンパク質又は目的タンパク質の分析に関する記載は、除菌したサンプルに対するものである。
還元SDS−PAGEによる融合タンパク質の定量は、当該技術分野において周知慣用の方法、例えば実施例1に記載された還元SDS−PAGE後の融合タンパクのバンドの濃さを指標として行うことができる。この場合、回収率の計算式は、下記の通りとなる。
回収率(%)=[工程(4)で得られた溶液における融合タンパク質のバンドの濃さ/{工程(4)で得られた溶液における融合タンパク質のバンドの濃さ+工程(3)の固体分離後の溶液における融合タンパク質のバンドの濃さ}]×100
逆相HPLCによる融合タンパク質の定量は、当該技術分野において周知慣用の方法、例えば実施例1−2に記載された逆相HPLCにより得られたクロマトグラムの融合タンパク質のピークエリアに基づく定量法を用いて行うことができる。
回収率は、目的タンパク質の種類及び用途や、必要な量等によって変動しうるが、10%以上、好ましくは20%以上、さらに好ましくは30%以上である。
工程(2)で用いるpH値は、目的タンパク質の種類及び用途や、必要な量等によって変動しうるが、9以下が好ましい。例えば、−0.5〜9、好ましくは1.5〜9である。
つまり、本発明の融合タンパク質の製造方法は、下記(A)〜(C)の工程:
(A)融合タンパク質を含む溶液を調製する工程であって、該溶液のpHが、下記計算式:
回収率(%)=[工程(C)で得られた溶液における融合タンパ
ク質の量/{工程(C)で得られた溶液における融合タンパク質
の量+工程(B)の固体分離後の溶液における融合タンパク質の
量}]×100
で計算される回収率を10%以上にするpHである工程、
(B)工程(A)で得られた溶液から固体を分離する工程、及び、
(C)工程(B)で分離した固体を、工程(A)で得られた溶液のpHよりも0.1以上高く、かつ、12以下のpHを有する溶液中に溶解させる工程、
を含むものとなる。
なお、上述の工程(1)及び(2)に関する説明は、工程(A)に適用される。また、後述の工程(3)及び(4)に関する説明は、工程(B)及び(C)に適用される。
工程(2)で得られた溶液中には、融合タンパク質以外の様々な菌体由来成分(例えば色素や脂質や不純物タンパク質)や培地由来成分(たとえば色素や無機塩類)が残存しているが、工程(3)によってこれらを除くことができ、結果として融合タンパク質の純度を簡便に向上させることができる。
分離は、当該技術分野において周知慣用の方法により実施することができる。例えば、遠心分離や膜ろ過等を用いることができる。複数の方法を組み合わせ(例えば、遠心分離と膜ろ過との組合せ)を実施してもよい。
融合タンパク質から自己組織化能を有するタンパク質を切断することにより、目的タンパク質を得ることができる。
切断は、当該技術分野で周知慣用の方法に従って実施することができる。切断方法としては、例えば、酵素的切断や化学的切断等が挙げられる。切断の特異性に優れる点で酵素的切断が好ましい。切断工程は、工程(4)で得られた融合タンパク質を含む溶液に対して行ってもよく、工程(4)で得られた溶液から融合タンパク質を分離した後に行ってもよい。工程(4)で得られた融合タンパク質を含む溶液に対して行う場合、切断工程は、工程(4)と同時、工程(4)の途中、工程(4)の後のいずれでも良い。
例えば、融合タンパク質または目的タンパク質を含む溶液を、カラムクロマトグラフィー(例えば、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、逆相クロマトグラフィー(例えば逆相HPLC)、中高圧液体クロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニーティークロマトグラフィー)、アルコール沈殿法、限外濾過膜法等の既知の適切な方法、またはこれらの組合せに付することにより、融合タンパク質または目的タンパク質を精製することができる。
なお、融合タンパク質の切断工程後に得られた溶液を、工程(2)と同様の工程に付すると、自己組織化能を有するタンパク質が沈殿する。この工程を行うことで、目的タンパク質の精製をより効率的に行うことができる。
修飾した目的タンパク質は、当該技術分野で周知慣用の方法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、逆相HPLC、疎水クロマトグラフィー等により精製することができる。
生理活性ペプチド テリパラチド(Teriparatide)を有する融合タンパク質の製造
実施例1では、目的タンパク質として生理活性ペプチドであるTeriparatide(34アミノ酸残基)(Teri)を用い、自己組織化能を有するタンパク質としてCspB成熟タンパク質のN末端から50アミノ酸残基からなる配列(CspB50)を用い、酵素的切断に使用されるアミノ酸配列としてproTEVプロテアーゼ認識配列を用い、宿主として、コリネ型細菌であるC. glutamicumを用いた。
(i)プロインスリン遺伝子の全合成と、C. glutamicum ATCC13869の細胞表層タンパク質CspBのシグナル配列を用いたプロインスリン分泌発現プラスミドpPKPInsの構築
プロインスリン(以下、PIns と表記する)のアミノ酸配列は既に決定されている(Genbank Accession No. NP_000198.1)。この配列とC. glutamicumのコドン使用頻度を考慮して、<配列番号9>〜<配列番号16>に示したDNAを合成した。これらのDNAを鋳型とし、<配列番号17>と<配列番号18>に示したDNAをプライマーとして用いて、PInsをコードする遺伝子をPCR法によって増幅し、<配列番号19>に示した約0.3kbpのDNA断片を得た。
このDNA断片をクローニングベクターpHSG398(タカラバイオ社製)のSma I部位に挿入する事によりpHSG-PInsを得た。このpHSG-PInsを鋳型にして、<配列番号17>と<配列番号18>に示したDNAをプライマーとして用いて、PIns遺伝子領域をPCR法によって増幅し、約0.3kbpのPIns遺伝子断片を得た。
挿入断片の塩基配列決定の結果、予想通りの融合遺伝子が構築されていることを確認した。なお、塩基配列の決定はBigDye(登録商標)Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(アプライドバイオシステムズ社製)と3130 ジェネティックアナライザ(アプライドバイオシステムズ社製)を用いて行った。
上述の通り、C. glutamicumの細胞表層タンパク質であるCspBをコードしている遺伝子の塩基配列は既に決定されている(Mol. Microbiol., 9, 97-109(1993))。C. glutamicumにおいてCspBは細胞表層に局在し、S-layerと呼ばれる層を形成しているが、その局在にはC末端側の疎水性に富んだアミノ酸残基領域が関与している事が知られている(Mol. Microbiol., 9, 97-109(1993))。この配列を参考にして、<配列番号20>と<配列番号22>に記載のプライマーを合成し、常法に従って(斉藤、三浦の方法[Biochem. Biophys. Act., 72, 619(1963)])調製したC. glutamicum ATCC13869の染色体DNAを鋳型として、CspBをコードする遺伝子のプロモーターを含む5'-上流域(以下、CspBプロモーター領域ともいう)、ならびにCspBのN末端のシグナルペプチド30アミノ酸残基およびCspB成熟タンパク質のN末端440アミノ酸残基をコードする領域をPCR法にて増幅した。なお、CspB成熟タンパク質のN末端440アミノ酸残基とは、C. glutamicum ATCC13869のCspB成熟タンパク質全長469アミノ酸(配列番号3)からC末端側の疎水性領域である29アミノ酸を除いたものである。PCR反応にはPyobest DNA polymerase(タカラバイオ社製)を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。
前記(ii)で構築したpPKK17PInsおよびpPKK50PInsを鋳型として、<配列番号20>と<配列番号50>、<配列番号20>と<配列番号51>に示した各合成DNAをプライマーとして、CspBプロモーター領域、ならびにCspBのN末端のシグナルペプチド30アミノ酸残基およびCspB成熟タンパク質のN末端17または50アミノ酸残基をコードする領域に、さらにFactor Xaプロテアーゼにより認識されるIEGRをコードする領域が付加された断片をPCR法にてそれぞれ増幅した。一方、前記(i)で構築したプラスミドpPKPInsを鋳型とし、<配列番号52>と<配列番号49>、<配列番号53>と<配列番号49>に示した各合成DNAをプライマーとして、PIns遺伝子領域をPCR法にて増幅し、PIns遺伝子断片を得た。更に、増幅させた両DNA断片(CspBプロモーター領域、ならびにCspBシグナルペプチド、成熟CspBのN末端17または50アミノ酸残基(QETNPT)、およびIEGRをコードする領域の断片と、PIns遺伝子断片)を鋳型に、<配列番号20>と<配列番号49>に記載のDNAをプライマーとして用いたPCR法により、両DNA断片が融合したDNA断片を得た。なお、<配列番号20>と<配列番号49>のプライマーは制限酵素Kpn Iの認識配列がデザインされており、<配列番号50>と<配列番号51>のプライマーはIEGRをコードする塩基配列とPIns遺伝子との融合遺伝子を構築するためのPInsのN末端側のアミノ酸配列をコードする配列がデザインされている。PCR反応にはPyrobest DNA polymerase(タカラバイオ社製)を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。これらのDNA断片を制限酵素Kpn I処理後に、特開平9-322774に記載のpPK4のKpn I部位に挿入することによって、それぞれpPKK17Xa-PIns, pPKK50Xa-PInsを得た。挿入断片の塩基配列決定の結果、予想通りの融合遺伝子が構築されていることを確認した。なお、塩基配列の決定はBigDye(登録商標)Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(アプライドバイオシステムズ社製)と3130ジェネティックアナライザ(アプライドバイオシステムズ社製)を用いて行った。
ある目的タンパク質を、当該目的タンパク質以外のアミノ酸配列と融合させた形で発現させる場合、目的タンパク質のアミノ酸配列と、融合させたアミノ酸配列との間に特定の基質特異性の高いプロテアーゼ認識配列を配位する事により、発現した融合タンパク質を特定のプロテアーゼで切断し、簡便に目的タンパク質を得る方法が広く知られている。一方、基質特異性の高いプロテアーゼとして、Factor XaプロテアーゼやProTEVプロテアーゼなどが知られており、それぞれタンパク質中のIle-Glu-Gly-Arg(=IEGR)(配列番号7)およびGlu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln(=ENLYFQ)(配列番号8)の配列を認識して各配列のC末端側を特異的に切断する。よって、例えば、CspB融合PInsにおいて、CspB成熟タンパク質のN末端アミノ酸残基をコードする塩基配列とプロインスリンをコードする塩基配列との間にFactor Xaプロテアーゼの認識配列(IEGR)もしくはProTEVプロテアーゼの認識配列(ENLYFQ)をコードする塩基配列を挿入した融合PIns遺伝子を構築し、融合PInsを分泌発現させる事によって、これらのプロテアーゼを用いて、簡便に融合PInsからPInsを得る事が可能となる。
ヒト成長ホルモン(human growth hormone;hGH)のアミノ酸配列は既に決定されている(Genbank Accession No. CAA23779.1)。この配列のうちN末端のシグナル配列26残基を除いた成熟型hGHのアミノ酸配列とC. glutamicumのコドン使用頻度を考慮して、<配列番号56>〜<配列番号69>に示したDNAを合成した。これらのDNAを鋳型とし、別途合成した<配列番号70>と<配列番号71>に示したDNAをプライマーとして用いて、hGH遺伝子をPCR法によって増幅し、<配列番号72>に記した約0.6kbpのDNA断片を得た。このDNA断片をクローニングベクターpHSG398(タカラバイオ社製)のSmaI部位に挿入する事によりpHSG-hGHを得た。このpHSG-hGHを鋳型にして、<配列番号70>と<配列番号71>に示したDNAをプライマーとして用いて、hGH遺伝子領域をPCR法によって増幅し、約0.6kbpのhGH遺伝子断片を得た。次にWO01/23591記載のpPKSPTG1(pPKSPTG1は、プロトランスグルタミナーゼ(プロ構造部付きトランスグルタミナーゼ)の分泌発現用ベクターであって、C. glutamicum ATCC13869株由来のcspB遺伝子のプロモーター、同プロモーターの下流に発現可能に連結されたC. ammoniagenes ATCC6872株由来のCspA(SlpA)<Genbank Accession No. BAB62413.1>のシグナルペプチド25アミノ酸残基をコードするDNA、および同シグナルペプチドをコードするDNAの下流に同シグナルペプチドとの融合タンパク質として発現するよう連結されたS. mobaraense由来のプロトランスグルタミナーゼ遺伝子を有する)、およびWO01/23591記載のpPKPTG1(C. glutamicum ATCC13869株由来のCspBのプロモーター領域とシグナルペプチドをコードするDNAを含む)を鋳型として、<配列番号20>と<配列番号73>、または<配列番号20>と<配列番号74>に示したプライマーを用いて、C. glutamicum ATCC13869由来CspBのプロモーター領域、およびC. ammoniagenes ATCC6872株由来CspAまたはC. glutamicum ATCC13869株由来CspBのシグナルペプチドをコードする領域をPCR法にて増幅し、それぞれ約0.7kbpのDNA断片を得た。更に、増幅させた両DNA断片(hGH遺伝子断片と、CspBプロモーター領域および各シグナルペプチドをコードする領域の断片)を鋳型に、<配列番号20>と<配列番号71>に記載のDNAをプライマーとして用いたPCR法により、両DNA断片が融合したそれぞれ約1.2kbpのDNA断片を得た。なお、配列番号<配列番号20>と<配列番号71>のプライマーには制限酵素Kpn Iの認識配列がデザインされており、<配列番号73>、<配列番号74>の各プライマーは各シグナルペプチドをコードする領域とhGH遺伝子との融合遺伝子を構築するためのhGHのN末端アミノ酸残基をコードする配列がデザインされている。PCR反応にはPyrobest DNA polymerase(タカラバイオ社製)を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。これらのDNA断片を制限酵素Kpn I処理後に、特開平9-322774に記載のpPK4のKpn I部位に挿入することによって、それぞれpPS-hGH, pPK-hGHを得た。挿入断片の塩基配列決定の結果、予想通りの融合遺伝子が構築されていることを確認した。なお、全ての塩基配列の決定はBigDye(登録商標)Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(アプライドバイオシステムズ社製)と3130 ジェネティックアナライザ(アプライドバイオシステムズ社製)を用いて行った。
前記(iv)で構築したpPKK6Xa-PIns、pPKK17Xa-PIns、pPKK50Xa-PInsのそれぞれを鋳型として、<配列番号20>と<配列番号75>、<配列番号20>と<配列番号76>、<配列番号20>と<配列番号77>のそれぞれに示した各合成DNAをプライマーとして、CspBプロモーター領域、ならびにCspBのN末端のシグナルペプチド30アミノ酸残基、CspB成熟タンパク質のN末端アミノ酸残基(6、17、50残基)、およびFactor Xaプロテアーゼ認識配列(IEGR)をコードする領域をPCR法にて増幅した。一方、前記(v)で構築したプラスミドpPS-hGHを鋳型とし、<配列番号70>と<配列番号71>に示した合成DNAをプライマーとして、hGH遺伝子領域をPCR法にて増幅した。更に、増幅させた両DNA断片(CspBプロモーター領域、ならびにCspBシグナルペプチド、成熟CspBのN末端アミノ酸残基、およびIEGRをコードする領域の各断片と、hGH遺伝子断片)を鋳型に、<配列番号20>と<配列番号71>に記載のDNAをプライマーとして用いたPCR法により、両DNA断片が融合したDNA断片を得た。なお、<配列番号20>と<配列番号71>のプライマーは制限酵素Kpn Iの認識配列がデザインされており、<配列番号75>、<配列番号76>、<配列番号77>の各プライマーはFactor Xaプロテアーゼ認識配列(IEGR)をコードする領域とhGH遺伝子との融合遺伝子を構築するためのhGHのN末端アミノ酸残基をコードする配列がデザインされている。PCR反応にはPyrobest DNA polymerase(タカラバイオ社製)を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。これらのDNA断片を制限酵素Kpn I処理後に、特開平9-322774に記載のpPK4のKpn I部位に挿入することによって、それぞれpPKK6Xa-hGH, pPKK17Xa-hGH, pPKK50Xa-hGHを得た。
ヒトの副甲状腺ホルモンPTHの成熟体のアミノ酸配列は既に決定されている(Genbank Accession No. AAA60215.1)。このヒトの副甲状腺ホルモンPTHのN末端1-34残基までのペプチドは、骨粗鬆症薬としての生理活性を有するペプチドTeriparatideとして知られている。このTeriparatideのアミノ酸配列とC. glutamicumのコドン使用頻度を考慮して、<配列番号78>と<配列番号79>に示したDNAを合成した。このDNAを鋳型とし、別途合成した<配列番号80>と<配列番号81>に示したDNAをプライマーとして用いて、<配列番号82>に記したTeriparatide遺伝子をPCR法によって増幅した。このDNA断片をクローニングベクターpHSG398(タカラバイオ社製)のSma I部位に挿入する事によりpHSG-Teriを得た。このpHSG-Teriを鋳型にして、<配列番号80>と<配列番号81>に示したDNAをプライマーとして用いて、Teriparatide遺伝子領域をPCR法によって増幅した。次にWO01-23591記載のpPKSPTG1(C. glutamicum ATCC13869株由来のCspBのプロモーター領域と、C. ammoniagenes ATCC6872株由来のCspA(SlpA)シグナルペプチドをコードするDNAを含む)、およびWO01/23591記載のpPKPTG1(C. glutamicum ATCC13869株由来のCspBのプロモーター領域とシグナルペプチドをコードするDNAを含む)を鋳型として、<配列番号20>と<配列番号83>もしくは<配列番号20>と<配列番号84>に示したプライマーを用いて、C. glutamicum ATCC13869由来CspBのプロモーター領域、およびC. ammoniagenes ATCC6872株由来CspAまたはC. glutamicum ATCC13869株由来CspBのシグナルペプチドをコードする領域をPCR法にて増幅した。更に、増幅させた両DNA断片(Teriparatide遺伝子断片と、CspBプロモーター領域および各シグナルペプチドをコードする領域の断片)を鋳型に、<配列番号20>と<配列番号81>に記載のDNAをプライマーとして用いたPCR法により、両DNA断片が融合したそれぞれ約0.8kbpのDNA断片を得た。なお、<配列番号20>と<配列番号81>のプライマーには制限酵素Kpn Iの認識配列がデザインされており、<配列番号83>と<配列番号84>の各プライマーは各シグナルペプチドをコードする領域とTeriparatide遺伝子との融合遺伝子を構築するためのTeriparatideのN末端アミノ酸残基をコードする配列がデザインされている。PCR反応にはPyrobest DNA polymerase(タカラバイオ社製)を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。これらのDNA断片を制限酵素Kpn I処理後に、特開平9-322774に記載のpPK4のKpn I部位に挿入することによって、それぞれpPS-Teri, pPK-Teriを得た。
前記(iii)で構築したプラスミドpPKK50Xa-PInsを鋳型として、<配列番号20>と<配列番号87>に示した各合成DNAをプライマーとしてCspBのプロモーター領域を含む5’-上流域とN末端のシグナルペプチド30アミノ酸残基と成熟細胞表層タンパク質のN末端側50残基とproTEVプロテアーゼにより認識されるアミノ酸配列ENLYFQをコードする領域をPCR法にて増幅した。一方、前記(vii)で構築したプラスミドpPKK6Xa-Teriを鋳型とし、<配列番号88>と<配列番号89>に示した合成DNAをプライマーとしてTeriparatide遺伝子領域をPCR法にて増幅した。更に、増幅させた各DNA断片(CspBプロモーターとCspBシグナルペプチドならびにCspBのN末端アミノ酸配列50残基とアミノ酸配列ENLYFQをコードする領域の断片と、Teriparatide遺伝子断片)を鋳型に、<配列番号20>と<配列番号89>に記載のDNAをプライマーとして用いたPCR法により、各DNA断片が融合したDNA断片を得た。なお、<配列番号20>と<配列番号89>のプライマーは制限酵素Kpn Iの認識配列がデザインされており、<配列番号88>のプライマーはENLYFQをコードする塩基配列とTeriparatideとの融合遺伝子を構築するためのTeriparatideのN末端側のアミノ酸配列をコードする配列がデザインされている。PCR反応にはPyrobest DNA polymerase(タカラバイオ社製)を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。これらのDNA断片を制限酵素Kpn I処理後に、特開平9-322774記載のpPK4のKpn I部位に挿入することによって、プラスミドpPKK50TEV-Teriを得た。挿入断片の塩基配列決定の結果、予想通りの融合遺伝子が構築されていることを確認した。なお、塩基配列の決定はBigDye(登録商標) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(アプライドバイオシステムズ社製)と3130ジェネティックアナライザ(アプライドバイオシステムズ社製)を用いて行った。
(1)で構築したpPKK50TEV-Teriを用いて、WO01/23591記載のC. glutamicum YDK010株を形質転換した。得られた形質転換株を、25 mg/lのカナマイシンを含むMM液体培地(グルコース 120 g、硫酸マグネシウム七水和物 0.4 g、硫酸アンモニウム 30 g、リン酸二水素カリウム 1 g、硫酸鉄七水和物 0.01 g、硫酸マンガン五水和物 0.01 g、チアミン塩酸塩 200 μg、ビオチン 500 μg、DL−メチオニン 0.15 g、炭酸カルシウム 50 g、水で1LにしてpH7.5に調節)で、それぞれ30 ℃で72時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清を還元SDS-PAGEに供してからCBB R-250(バイオラッド社製)にて染色を行い、目的の融合タンパク質50-Teriのバンドを確認した。
一方、得られた形質転換株を、25 mg/lのカナマイシンを含むMMTG液体培地(グルコース 120 g、塩化カルシウム2 g、硫酸マグネシウム七水和物 3 g、硫酸アンモニウム 3 g、リン酸二水素カリウム 1.5 g、硫酸鉄七水和物 0.03 g、硫酸マンガン五水和物 0.03g、チアミン塩酸塩 450 μg、ビオチン 450 μg、DL−メチオニン 0.15 g、炭酸カルシウム 50 g、水で1LにしてpH6.7に調節)を1L容量のジャーファーメンターに300mL張り込み、アンモニアガスを添加してpH6.7に維持しながら、30℃で3日間、通気攪拌培養を行なった。
培養終了後、培養液をマイクロチューブに移し、遠心機を用いて12000 Gで10分間遠心し、菌体を分離した。得られた遠心上清を、細孔径0.22 μmの除菌フィルターでろ過し、得られたろ液を「菌体除去済み培養液」(「工程(1)で得られた溶液」に相当)とし、-80℃で凍結保存した。
凍結保存した菌体除去済み培養液を25℃で解凍し、遠心機を用いて12000 Gで1分間遠心し、凍結保存中に生成した主に無機塩からなる沈殿を分離した。4本のマイクロチューブのそれぞれに、0、5、10、30 μLの0.5 M 硫酸水溶液と30、25、20、0μLのMilliQ水を添加し均一にした後に、得られた遠心上清100 μLずつを分注し、容量をすべて130μLに調製した。
これらを撹拌後、10分間静置することで、pH7.4、pH6.6、pH3.8、pH1.7の「pH調節済み培養液」を得た(「工程(2)で得られた溶液」に相当)。pH6.6、pH3.8及びpH1.7の「pH調節済み培養液」は白濁し、沈殿生成を確認した。これら「pH調節済み培養液」を、遠心機を用いて12000 Gで5分間遠心し、pH変化により生成した沈殿を分離した(「工程(3)で分離した固体」に相当)。得られた遠心上清をそれぞれ別のマイクロチューブに移し、「pH調節済み培養液上清」とした(「工程(3)の固体分離後の溶液」に相当)。残った沈殿に、除いた遠心上清と同じ容量の緩衝液(100 mM Tris-HCl, pH8.5)を添加し、撹拌すると、沈殿は速やかに溶解し、「沈殿溶解液」を得た(「工程(4)で得られた溶液」に相当)。沈殿溶解液のpHはいずれも中性付近で、それぞれpH8.3、pH8.3、pH8.1、pH7.8であった。上記、沈殿が発生したpH範囲と、生じた沈殿が中性付近で可逆的に速やかに再溶解したことを考慮すると、工程(2)において見られた沈殿現象は、一般的に不可逆であるタンパク質の酸変性現象とは全く異なる現象であることがわかった。
上記操作により得られたpH7.4、pH6.6、pH3.8、pH1.7の「pH調節済み培養液上清」と、「沈殿溶解液」を還元SDS-PAGEに供し、50-Teriのバンドを確認することで、pH変化に伴う50-Teriの沈殿および可溶化を分析評価した。なお、還元SDS-PAGEはAny kDTM ミニプロティアン(登録商標) TGXTM プレキャストゲル(バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社)を用いて行い、SYPRO(登録商標)Ruby(ライフテクノロジーズジャパン株式会社)で染色することで、融合タンパク質50-Teriのバンドを検出した。続いて、各pHでのバンドの濃さをソフトウェア・Multi Gauge (FUJIFILM社製)を用いて数値化し、以下の計算式により各pHでの50-Teriの回収率を算出した。
なお、後述の実施例及び比較例でも還元SDS-PAGEによって回収率計算を行う場合は、実施例1と同様にして実施した。
図1−Bに、「pH調節済み培養液」のpHと、「pH調節済み培養液上清」及び対応する「沈殿溶解液」の各電気泳動図における融合タンパク質50-Teriのバンド部分と、回収率を示す。
pH7.4の「pH調節済み培養液上清」に存在していた50-Teriは、pH6.6、pH3.8及びpH1.7で検出されず、代わりに「沈殿溶解液」で検出された。
生理活性ペプチドTeriparatideを有する融合タンパク質50-Teriの製造および目的タンパク質Teriparatideの製造
実施例1−2では、実施例1と同様に、目的タンパク質として生理活性ペプチドであるTeriparatide(34アミノ酸残基)(Teri)を用い、自己組織化能を有するタンパク質としてCspB成熟タンパク質のN末端から50アミノ酸残基からなる配列(CspB50)を用い、酵素的切断に使用されるアミノ酸配列としてproTEVプロテアーゼ認識配列を用い、宿主として、コリネ型細菌であるC. glutamicumを用いた。
実施例1の(1)に記載の手順に従い構築した。
実施例1の(2)に記載の手順に従い、pPKK50TEV-Teriで形質転換したC. glutamicum YDK010株を培養した。
実施例1の(3)に記載の手順に従い実施した。
凍結保存した菌体除去済み培養液を25℃で解凍し、遠心機を用いて12000 Gで1分間遠心し、凍結保存中に生成した主に無機塩からなる沈殿を分離した。8本のマイクロチューブのそれぞれに、0μL、5μL、10μL、15μL、20μL、30μL、40μL、50μLの0.5 M 硫酸水溶液と、50μL、45μL、40μL、25μL、30μL、20μL、10μL、0μLのMilliQ水を添加し均一にした後に、得られた遠心上清600μLずつを分注して、容量をすべて650μLに調製した。
これらを撹拌後、10分間静置することで、pH7.9、pH7.6、pH7.3、pH7.1、pH6.6、pH4.9、pH4.1、pH3.7の「pH調節済み培養液」を得た(「工程(2)で得られた溶液」に相当)。pH7.1、pH6.6、pH4.9、pH4.1、pH3.7の「pH調節済み培養液」は白濁し、沈殿生成を確認した。これら「pH調節済み培養液」を、遠心機を用いて12000 Gで5分間遠心し、pH変化により生成した沈殿を分離した(「工程(3)で分離した固体」に相当)。得られた遠心上清をそれぞれ別のマイクロチューブに移し、「pH調節済み培養液上清」とした(「工程(3)の固体分離後の溶液」に相当)。残った沈殿に、除いた遠心上清と同じ容量の緩衝液(100 mM Tris-HCl, pH8.5)を添加し、撹拌すると、沈殿は速やかに溶解し、「沈殿溶解液」を得た(「工程(4)で得られた溶液」に相当)。「沈殿溶解液」のpHはいずれも中性付近で、それぞれpH8.0、pH8.0、pH8.0、pH8.0、pH8.0、pH7.9、pH7.7、pH7.6であった。
上記操作により得られたpH7.9、pH7.6、pH7.3、pH7.1、pH6.6、pH4.9、pH4.1、pH3.7の「pH調節済み培養液上清」と「沈殿溶解液」を還元SDS-PAGE及び逆相HPLCに供し、pH変化に伴う50-Teriの沈殿および可溶化を分析評価した。なお、50-Teri回収率の算出は逆相HPLCを用いて以下の計算式により行った。
回収率(%)=[工程(4)で得られた溶液における融合タンパク質の量/{工程(4)で得られた溶液における融合タンパク質の量+工程(3)の固体分離後の溶液における融合タンパク質の量}]×100
各融合タンパク質の量は、逆相HPLCにおける該当ピークエリアから定量した。具体的には、既知物質(IGF-1)を用いた検量線作成を行い、各測定サンプルの該当ピークエリアをこの検量線に当てはめることで、融合タンパク質の量を算出した。逆相HPLC条件を以下に示す。
System: ウォーターズアライアンスPDAシステム一式
Column: YMC-Triart C18 φ4.6 x 100mm, 粒子径5μm, 細孔径12nm
Column temp.: 30 ℃
Mobile phaseA: 10 mM 酢酸アンモニウム水溶液, 10% アセトニトリル水溶液, pH7.0
Mobile phaseB: 10 mM 酢酸アンモニウム水溶液, 80% アセトニトリル水溶液, pH7.0
Flow rate: 1.0 mL/min
Detection: 220 nm
Injection volume: 30 μL
図1−2Bに、各「pH調節済み培養液」及び対応する「沈殿溶解液」の各電気泳動図と、融合タンパク質50-Teriのバンド部分を抽出した図を示す。
pH7.9、pH7.6、pH7.3、pH7.1の「pH調節済み培養液上清」に存在していた50-TeriはpH6.6、pH4.9、pH4.1、pH3.7で検出されなかった一方、対応する「沈殿溶解液」で著量検出された。
上記(4)において、pH4.9に調節した「pH調節済み培養液」から得た沈殿物である融合タンパク質50-Teriを20mM Tris HCl緩衝液(pH5.0)で洗浄し、沈殿物に付着した培養液を除去した。次に、沈殿物を6M尿素+20mM Tris HCl緩衝液(pH8.0)で溶解し「沈殿溶解液」を調製した。この「沈殿溶解液」に超純水を加えることで10倍希釈したのちにProTEVプロテアーゼ(融合タンパク質中のアミノ酸配列:ENLYFQを認識。プロメガ社。V6102)を添加することで、融合タンパク質を、自己組織化能を有するタンパク質を含むCspB50TEVと目的タンパク質Teriparatideとに酵素的に切断し、酵素切断液を得た。
この酵素切断液を逆相HPLCで分析したところ、Teriparatideと思われるピークを検出した(図1−2D)。
続いて、酵素切断液中に生じた物質がTeriparatideであることを確認するために、「酵素切断液」を逆相HPLCに供し、上記で示した逆相HPLC条件における保持時間18.6分付近の溶出液を取得することでTeriparatideと思われる物質を精製した。この精製物質をN末端アミノ酸配列分析及び質量分析に付し、標品Teriparatide(BACHEM, cat# H-4835)と対比した。
N末端アミノ酸配列分析は、エドマン分解法を基にしたプロテインシーケンサーPPSQ-10(島津製作所製)を用い、島津製作所推奨の方法(取扱い説明書)にしたがって行った。
質量分析は、MALDI−TOF−MS法を基にしたAXIMA−TOF2(島津製作所製)を用いて、島津製作所推奨の方法(取扱い説明書)にしたがって行った。
N末端アミノ酸分析結果について、精製物質のN末端側10アミノ酸残基は、標品TeriparatideのN末端側10アミノ酸残基と一致していた。
質量分析の結果について、精製物質を供した測定では4118.9の測定質量(測定誤差は±0.1%)が検出され、標品Teriparatideを供した測定では4118.1の測定質量(測定誤差は±0.1%)が検出された(図1−2E)。つまり、精製物質と標品Teriparatideの測定質量が一致しており、精製物質が目的タンパク質のTeriparatideであることがわかる。本実施例で得られたTeriparatideの純度を、逆相HPLCを用いて検出したピーク面積を基に、以下の式を用いて算出したところ、94%であった。
純度 (%)=(Teriparatideのピーク面積/すべてのピーク面積の合計)x100
なお、逆相HPLCは以下の条件で実施した。
System: ウォーターズアライアンスPDAシステム一式
Column: YMC-Pack C8 φ4.6 x 100mm, 粒子径5μm, 細孔径30nm
Column temp.: 30 ℃
Mobile phaseA: 10 mM 酢酸アンモニウム水溶液, 10% アセトニトリル水溶液, pH7.0
Mobile phaseB: 10 mM 酢酸アンモニウム水溶液, 80% アセトニトリル水溶液, pH7.0
Flow rate: 1.0 mL/min
Detection: 220 nm
Injection volume: 30 μL
これらの結果より、精製物質がTeriparatideであること、及び、融合タンパク質から目的タンパク質を取得できることを確認した。
生理活性ペプチドBivariludin(ビバリルジン)の一部を有する融合タンパク質(CspB50Lys-Bivalirudin18(略して50-Biva18)の製造および目的タンパク質Bivalirudin18(略してBiva18)の製造
実施例2では、目的タンパク質として生理活性ペプチドであるBivariludin(ビバリルジン)の一部(18アミノ酸残基)(Biva18)を用い、自己組織化能を有するタンパク質としてCspB成熟タンパク質のN末端から50アミノ酸残基からなる配列(CspB50)を用い、宿主として、コリネ型細菌であるC. glutamicumを用いた。
トロンビン阻害活性を持つ抗血液凝固薬として知られている生理活性ペプチドBivariludinは、N末端にD体のフェニルアラニン残基を持つ全長20残基からなるペプチドである。
このN末端のD-フェニルアラニン残基とL-プロリン残基を除いた18残基のペプチド(=Biva18)のアミノ酸配列とC. glutamicumのコドン使用頻度を考慮して、Biva18遺伝子を含む<配列番号90>を全合成した。
次に、実施例1(1)(iii)に記載のプラスミドpPKK50Xa-PInsを鋳型として、<配列番号20>と<配列番号91>に示した各合成DNAをプライマーとしてCspBのプロモーター領域を含む5’-上流域とN末端のシグナルペプチド30アミノ酸残基と成熟細胞表層タンパク質のN末端側50残基とリジン残基をコードする領域をPCR法にて増幅した。更に、増幅させた
DNA断片(CspBプロモーターとCspBシグナルペプチドならびにCspBのN末端アミノ酸配列50残基とリジン残基をコードする領域の断片)と、Biva18遺伝子断片である<配列番号90>を鋳型に、<配列番号20>と<配列番号92>に記載のDNAをプライマーとして用いたPCR法により、各DNA断片が融合したDNA断片を得た。なお、<配列番号20>と<配列番号92>のプライマーは制限酵素Kpn Iの認識配列がデザインされており、<配列番号91>のプライマーはCspBのN末端アミノ酸配列50残基とリジン残基をコードする塩基配列とBiva18との融合遺伝子を構築するためのBiva18のN末端側のアミノ酸配列をコードする配列がデザインされている。PCR反応にはPyrobest DNA polymerase(タカラバイオ社製)を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。これらのDNA断片を制限酵素Kpn I処理後に、特開平9-322774記載のpPK4のKpn I部位に挿入することによって、プラスミドpPKK50Lys-Biva18を得た。挿入断片の塩基配列決定の結果、予想通りの融合遺伝子が構築されていることを確認した。なお、塩基配列の決定はBigDye(登録商標) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(アプライドバイオシステムズ社製)と3130ジェネティックアナライザ(アプライドバイオシステムズ社製)を用いて行った。
(1)で構築したpPKK50Lys-Biva18用いて、WO01/23591記載のC. glutamicum YDK010株を形質転換した。得られた形質転換株を、25 mg/lのカナマイシンを含むMM液体培地(グルコース 120 g、硫酸マグネシウム七水和物 0.4 g、硫酸アンモニウム 30 g、リン酸二水素カリウム1 g、硫酸鉄七水和物 0.01 g、硫酸マンガン五水和物 0.01 g、チアミン塩酸塩 200 μg、ビオチン 500 μg、DL−メチオニン 0.15 g、炭酸カルシウム 50 g、水で1LにしてpH7.5に調節)で、それぞれ30 ℃で72時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清を還元SDS-PAGEに供してからCBB R-250(バイオラッド社製)にて染色を行い、目的のタンパク質Bivalirudin18のバンドを確認した。
一方、得られた形質転換株を、25 mg/lのカナマイシンを含むMMTG液体培地(グルコース 120 g、塩化カルシウム2 g、硫酸マグネシウム七水和物 3 g、硫酸アンモニウム 3 g、リン酸二水素カリウム1.5 g、硫酸鉄七水和物 0.03 g、硫酸マンガン五水和物 0.03g、チアミン塩酸塩 450 μg、ビオチン 450 μg、DL−メチオニン 0.15 g、炭酸カルシウム 50 g、水で1LにしてpH6.7に調節)をを1L容量のジャーファーメンターに300mL張り込み、アンモニアガスを添加してpH6.7に維持しながら、30℃で3日間、通気攪拌培養を行なった。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清を還元SDS-PAGEに供してからCBB R-250(バイオラッド社製)にて染色を行い、目的のタンパク質バンドを確認した。
実施例1と同様に実施した。
凍結保存した菌体除去済み培養液を25℃で解凍し、遠心機を用いて12000 Gで1分間遠心し、凍結保存中に生成した主に無機塩からなる沈殿を分離した。4本のマイクロチューブのそれぞれに、0、5、10、30 μLの0.5 M 硫酸水溶液と30、25、20、0μLのMilliQ水を添加し均一にした後に、得られた遠心上清100 μLずつを分注し、容量をすべて130μLに調製した。
これらを撹拌後、10分間静置することで、pH7.8、pH4.7、pH2.9、pH1.6の「pH調節済み培養液」を得た(「工程(2)で得られた溶液」に相当)。pH2.9、pH1.6の「pH調節済み培養液」は白濁し、沈殿生成を確認した。これら「pH調節済み培養液」を、遠心機を用いて12000 Gで5分間遠心し、pH変化により生成した沈殿を分離した(「工程(3)で分離した固体」に相当)。得られた遠心上清をそれぞれ別のマイクロチューブに移し、「pH調節済み培養液上清」とした(「工程(3)の固体分離後の溶液」に相当)。分離した沈殿に、pH調節済み培養液上清と同じ容量の緩衝液(100 mM Tris-HCl, pH8.5)を添加し、撹拌すると、沈殿は速やかに溶解し、「沈殿溶解液」を得た(「工程(4)で得られた溶液」に相当)。「沈殿溶解液」のpHはいずれも中性付近で、それぞれpH8.3、pH8.3、pH8.1、pH7.8であった。
上記操作により得られたpH7.8、pH4.7、pH2.9、pH1.6の「pH調節済み培養液上清」と、「沈殿溶解液」を還元SDS-PAGEに供し、融合タンパク質50-Biva18のバンドを確認することで、pH変化に伴う融合タンパク質50-Biva18の沈殿および可溶化を評価した。
pH7.8、pH4.7、pH2.9、pH1.6の「pH調節済み培養液」の算出された50-Biva18回収率は、それぞれ3%、5%、65%、63%であった。図2−Aに、算出した回収率と「pH調節済み培養液」のpHとの関係を示す。
図2−Bに、「pH調節済み培養液」のpHと、「pH調節済み培養液上清」及び対応する「沈殿溶解液」の各電気泳動図における融合タンパク質50-Biva18のバンド部分と、回収率を示す。
pH7.8及びpH4.7で「pH調節済み培養液上清」に存在していた50-Biva18はpH2.9、pH1.6で薄いバンドとなり、代わりに「沈殿溶解液」で濃いバンドとして検出された。
なお、逆相HPLCは以下の条件で実施した。
System: ウォーターズアライアンスPDAシステム一式
Column: YMC-Triart C18 φ4.6 x 100mm, 粒子径5μm, 細孔径12nm
Column temp.: 30 ℃
Mobile phaseA: 10 mM 酢酸アンモニウム水溶液, 10% アセトニトリル水溶液, pH7.0
Mobile phaseB: 10 mM 酢酸アンモニウム水溶液, 80% アセトニトリル水溶液, pH7.0
Flow rate: 1.0 mL/min
Detection: 220 nm
Injection volume: 30 μL
上記(4)において、pH3.0に調節した「pH調節済み培養液」から得た沈殿物である融合タンパク質50-Biva18をpH3.0の硫酸溶液で洗浄し、沈殿に付着した培養液を除去した。次に、沈殿物を50 mM 炭酸水素ナトリウム緩衝液(pH8.3)で溶解し「沈殿溶解液」を調製した。この沈殿溶解液に、Trypsin(融合タンパク質中のアミノ酸配列:Lysを認識。SIGMA-ALDRICH社。T-303-10G)を添加することで、「酵素切断液」を得た。この酵素切断液を逆相HPLCに供したところ、酵素添加前に見られた融合タンパク質50-Biva18のピークは検出されず、代わりに新たなピークが検出されたことから、切断反応が良好に進行したことがわかった(図2−D)。
続いて、酵素切断液中に生じた物質がBiva18であることを確認するために、「酵素切断液」を逆相HPLCに供し、保持時間5分付近の溶出液を取得することでBiva18と思われる物質を精製した。
この精製物質を質量分析に供し、質量を測定した結果、monoisotopic m/z で1935.8の測定質量(測定誤差は±0.1%)が検出された。一方、Biva18のアミノ酸配列から計算されるmonoisotopic m/z理論値は、Biva18の配列をMS-Isotope (http://prospector.ucsf.edu/prospector/cgi-bin/msform.cgi?form=msisotope)に入力することで取得した結果、1935.9であり、精製物質で検出された測定質量1935.8(測定誤差は±0.1%)と一致することを確認した(図2−E)。つまり、精製物質が目的タンパク質のBiva18であることが確認された。
本実施例で得られたBiva18の純度を、逆相HPLCを用いて検出したピーク面積を基に、以下の計算式を用いて算出したところ、92%であった。
純度(%)=(Biva18のピーク面積/すべてのピーク面積の合計)x100
なお、逆相HPLCは以下の条件で実施した。
System: ウォーターズアライアンスPDAシステム一式
Column: YMC-Triart C18 φ4.6 x 100mm, 粒子径5μm, 細孔径12nm
Column temp.: 30 ℃
Mobile phaseA: 10 mM 酢酸アンモニウム水溶液, 10% アセトニトリル水溶液, pH7.0
Mobile phaseB: 10 mM 酢酸アンモニウム水溶液, 80% アセトニトリル水溶液, pH7.0
Flow rate: 1.0 mL/min
Detection: 220 nm
Injection volume: 30 μL
これらの結果より、精製物質がBiva18であること、及び、融合タンパク質から目的とするタンパク質を取得できることを確認した。
次に逆相HPLCに代わり、「酵素切断液」を強陰イオン交換樹脂クロマトグラフィーに供し、Biva18を精製した。
<クロマトグラフィー条件>
カラム:強陰イオン交換樹脂(HiTrap Q FF, 1 mL, GE healthcare)
A buffer (binding) 25 mM リン酸Na水溶液, pH7.0
B buffer (elution) 250 mM リン酸Na水溶液, pH7.0
流速:1 mL/min
検出:280 nm
サンプル通液量:0.3 mg-Biva18 (酵素切断液 250 μL + A buffer 750 μLで調製)
グラジエント溶出:linear gradient, 0-100%B over 20 Column Volumes (CV)
強陰イオンクロマトグラフィーの結果、酵素切断液中に含まれるBiva18はすべて樹脂に吸着し、続くグラジエント溶出において、95%B付近の溶出液を取得することでBiva18を精製した(図2−F)。得られたBiva18の純度を、逆相HPLCを用いて検出したピーク面積を基に、前述の計算式を用いて算出したところ、83%であった(図2−G)。
プロインスリンを有する融合タンパク質CspB50TEV-Proinsulin(略して50-PIns)の製造
実施例3では、目的タンパク質として生理活性ペプチドであるインスリンのプロタンパク質であるプロインスリン(86アミノ酸残基)(PIns)を用い、自己組織化能を有するタンパク質としてCspB成熟タンパク質のN末端から50アミノ酸残基からなる配列(CspB50)を用い、宿主として、コリネ型細菌であるC. glutamicumを用いた。
実施例1(1)(ii)に記載のプラスミドpPKK50PIns用いて、WO01/23591記載のC. glutamicum YDK010株を形質転換した。得られた各形質転換株を、25 mg/lのカナマイシンを含むMM液体培地(グルコース 120 g、硫酸マグネシウム七水和物 0.4 g、硫酸アンモニウム 30 g、リン酸二水素カリウム1 g、硫酸鉄七水和物 0.01 g、硫酸マンガン五水和物 0.01 g、チアミン塩酸塩 200 μg、ビオチン 500 μg、DL−メチオニン 0.15 g、炭酸カルシウム 50 g、水で1LにしてpH7.5に調節)で、それぞれ30 ℃で72時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清を還元SDS-PAGEに供してからCBB R-250(バイオラッド社製)にて染色を行い、目的のタンパク質バンドを確認した。
実施例1と同様に実施した。
凍結保存した菌体除去済み培養液を25℃で解凍し、遠心機を用いて12000 Gで1分間遠心し、凍結保存中に生成した沈殿を分離した。4本のマイクロチューブそれぞれに、0、5、10、30 μLの0.5 M 硫酸水溶液と30、25、20、0μLのMilliQ水を添加し均一にした後に、得られた遠心上清100 μLずつを分注し、容量をすべて130μLに調製した。
これらを撹拌後、10分間静置することで、pH7.8、pH4.8、pH4.0、pH2.0の「pH調節済み培養液」を得た(「工程(2)で得られた溶液」に相当)。pH4.8、pH4.0、pH2.0の「pH調節済み培養液」は白濁し、沈殿生成を確認した。これら「pH調節済み培養液」を、遠心機を用いて12000 Gで5分間遠心し、pH変化により生成した沈殿を分離した(「工程(3)で分離した固体」に相当)。得られた遠心上清をそれぞれ別のマイクロチューブに移し、「pH調節済み培養液上清」とした(「工程(3)の固体分離後の溶液」に相当)。残った沈殿に、除いた遠心上清と同じ容量の緩衝液(100 mM Tris-HCl, pH8.5)を添加し、撹拌すると、沈殿は速やかに溶解し、「沈殿溶解液」(「工程(4)で得られた溶液」に相当)を得たが、pH2.0で生じた沈殿の一部は不溶であった。「沈殿溶解液」のpHはいずれも中性付近で、それぞれpH8.3、pH8.3、pH8.3、pH8.3であった。
上記操作により得られたpH7.8、pH4.8、pH4.0、pH2.0の「pH調節済み培養液上清」と、「沈殿溶解液」を還元SDS-PAGEに供し、50-PInsのバンドを確認することで、pH変化に伴う50-PInsの沈殿および可溶化を評価した。
算出されたpH7.8、pH4.8、pH4.0、pH2.0の「pH調節済み培養液」の50-PIns回収率は、それぞれ1%、54%、58%、60%であった。図3−Aに、算出した回収率と「pH調節済み培養液」のpHとの関係を示す。
図3−Bに、「pH調節済み培養液」のpHと、「pH調節済み培養液上清」及び対応する「沈殿溶解液」の各電気泳動図における融合タンパク質50-PInsのバンド部分と、回収率を示す。
pH7.8で「pH調節済み培養液上清」に存在していた50-PInsはpH4.8、pH4.0、pH2.0で薄いバンドとなり、代わりに「沈殿溶解液」で濃いバンドとして検出された。
自己組織化能を有するタンパク質を用いない、プロインスリンの製造
比較例1では、目的タンパク質としてプロインスリン(86アミノ酸残基)(PIns)を用い、宿主として、コリネ型細菌であるC. glutamicumを用いた。しかし、自己組織化能を有するタンパク質は用いなかった。
実施例1(1)(i)に記載のプラスミドpPKPIns用いて、WO01/23591記載のC. glutamicum YDK010株を形質転換した。得られた各形質転換株を、25 mg/lのカナマイシンを含むMM液体培地(グルコース 120 g、硫酸マグネシウム七水和物 0.4 g、硫酸アンモニウム 30 g、リン酸二水素カリウム1 g、硫酸鉄七水和物 0.01 g、硫酸マンガン五水和物 0.01 g、チアミン塩酸塩 200 μg、ビオチン 500 μg、DL−メチオニン 0.15 g、炭酸カルシウム 50 g、水で1LにしてpH7.5に調節)で、それぞれ30 ℃で72時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清を還元SDS-PAGEに供してからCBB R-250(バイオラッド社製)にて染色を行い、目的のタンパク質バンドを確認した。
実施例1と同様に実施した。
凍結保存した菌体除去済み培養液を25℃で解凍し、遠心機を用いて12000 Gで1分間遠心し、凍結保存中に生成した沈殿を分離した。4本のマイクロチューブのそれぞれに、0、5、10、30 μLの0.5 M 硫酸水溶液と30、25、20、0μLのMilliQ水を添加し均一にした後に、得られた遠心上清100 μLずつを分注し、容量をすべて130μLに調製した。
これらを撹拌後、10分間静置することで、pH7.5、pH4.6、pH4.0、pH2.2の「pH調節済み培養液」を得た。pH2.2の「pH調節済み培養液」は白濁し、沈殿生成を確認した。これら「pH調節済み培養液」を、遠心機を用いて12000 Gで5分間遠心し、pH変化により生成した沈殿を分離した。得られた遠心上清をそれぞれ別のマイクロチューブに移し、「pH調節済み培養液上清」とした。残った沈殿に、除いた遠心上清と同じ容量の緩衝液(100 mM Tris-HCl, pH8.5)を添加し、撹拌したが、pH2.0で生じた沈殿の一部は不溶であった。得られた「沈殿溶解液」のpHはいずれも中性付近で、それぞれpH8.4、pH8.3、pH8.3、pH8.1であった。
上記操作により得られたpH7.5、pH4.6、pH4.0、pH2.2の「pH調節済み培養液上清」と、「沈殿溶解液」を還元SDS-PAGEに供し、PInsのバンドを確認することで、pH変化に伴うPInsの沈殿および可溶化を評価した。
pH7.5、pH4.6、pH4.0、pH2.2の「pH調節済み培養液」のPIns回収率は、それぞれ7%、6%、0%、7%であった。図4−Aに、算出した回収率と「pH調節済み培養液」のpHとの関係を示す。
図4−Bに、「pH調節済み培養液」のpHと、「pH調節済み培養液上清」及び対応する「沈殿溶解液」の各電気泳動図における融合タンパク質PInsのバンド部分と、回収率を示す。
pH7.5で「pH調節済み培養液上清」に存在していたPInsはpH4.6、pH4.0、pH2.2でも検出され、「沈殿溶解液」では検出されなかった。
プロインスリンを有する融合タンパク質の製造
実施例4では、目的タンパク質としてプロインスリン(86アミノ酸残基)(PIns)を用い、自己組織化能を有するタンパク質としてCspB成熟タンパク質のN末端から250アミノ酸残基からなる配列CspB250を用い、宿主として、コリネ型細菌であるC. glutamicumを用いた。
実施例1(1)(ii)に記載のプラスミドpPKK250PIns用いて、WO01/23591記載のC. glutamicum YDK010株を形質転換した。得られた各形質転換株を、25 mg/lのカナマイシンを含むMM液体培地(グルコース 120 g、硫酸マグネシウム七水和物 0.4 g、硫酸アンモニウム 30 g、リン酸二水素カリウム1 g、硫酸鉄七水和物 0.01 g、硫酸マンガン五水和物 0.01 g、チアミン塩酸塩 200 μg、ビオチン 500 μg、DL−メチオニン 0.15 g、炭酸カルシウム 50 g、水で1LにしてpH7.5に調節)で、それぞれ30 ℃で72時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清を還元SDS-PAGEに供してからCBB R-250(バイオラッド社製)にて染色を行い、目的のタンパク質バンドを確認した。
実施例1と同様に実施した。
凍結保存した菌体除去済み培養液を25℃で解凍し、遠心機を用いて12000 Gで1分間遠心し、凍結保存中に生成した沈殿を分離した。4本のマイクロチューブのそれぞれに、0、5、10、30 μLの0.5 M 硫酸水溶液と30、25、20、0μLのMilliQ水を添加し均一にした後に、得られた遠心上清100 μLずつを分注し、容量をすべて130μLに調製した。
これらを撹拌後、10分間静置することで、pH7.8、pH4.4、pH3.0、pH1.7のpH調節済み培養液を得た(「工程(2)で得られた溶液」に相当)。各「pH調節済み培養液」は白濁せず、目視による沈殿生成は確認できなかった。これら「pH調節済み培養液」を、遠心機を用いて12000 Gで5分間遠心したところ、pH4.4以下の「pH調節済み培養液」で沈殿(「工程(3)で分離した固体」に相当)を確認した。これらpH変化により生成した沈殿を遠心分離後、得られた遠心上清をそれぞれ別のマイクロチューブに移し、pH調節済み培養液上清とした(「工程(3)の固体分離後の溶液」に相当)。残った沈殿に、除いた遠心上清と同じ容量の緩衝液(100 mM Tris-HCl, pH8.5)を添加し、撹拌すると、沈殿は速やかに溶解し、「沈殿溶解液」を得た(「工程(4)で得られた溶液」に相当)。「沈殿溶解液」のpHはいずれも中性付近で、すべてpH8.3であった。
上記操作により得られたpH7.8、pH4.4、pH3.0、pH1.7の「pH調節済み培養液上清」と、「沈殿溶解液」を還元SDS-PAGEに供し、250-PInsのバンドを確認することで、pH変化に伴う250-PInsの沈殿および可溶化を評価した。
算出されたpH7.8、pH4.4、pH3.0、pH1.7の「pH調節済み培養液」の250-PIns回収率は、それぞれ7%、66%、70%、74%であった。図5−Aに、算出した回収率と「pH調節済み培養液」のpHとの関係を示す。
図5−Bに、「pH調節済み培養液」のpHと、「pH調節済み培養液の上清」及び対応する「沈殿溶解液」の各電気泳動図における融合タンパク質250-PInsのバンド部分と、回収率を示す。
pH7.8で「pH調節済み培養液上清」に存在していた250-PInsはpH4.4、pH3.0、pH1.7で薄いバンドとなり、代わりに「沈殿溶解液」で濃いバンドとして検出された。
プロインスリンを有する融合タンパク質の製造
実施例5では、目的タンパク質としてプロインスリン(86アミノ酸残基)(PIns)を用い、自己組織化能を有するタンパク質としてCspB成熟タンパク質のN末端から17アミノ酸残基からなる配列(CspB17)を用い、宿主として、コリネ型細菌であるC. glutamicumを用いた。
実施例1(1)(ii)に記載のプラスミドpPKK17PIns用いて、WO01/23591記載のC. glutamicum YDK010株を形質転換した。得られた各形質転換株を、25 mg/lのカナマイシンを含むMM液体培地(グルコース 120 g、硫酸マグネシウム七水和物 0.4 g、硫酸アンモニウム 30 g、リン酸二水素カリウム1 g、硫酸鉄七水和物 0.01 g、硫酸マンガン五水和物 0.01 g、チアミン塩酸塩 200 μg、ビオチン 500 μg、DL−メチオニン 0.15 g、炭酸カルシウム 50 g、水で1LにしてpH7.5に調節)で、それぞれ30 ℃で72時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清を還元SDS-PAGEに供してからCBB R-250(バイオラッド社製)にて染色を行い、目的のタンパク質バンドを確認した。
実施例1と同様に実施した。
凍結保存した菌体除去済み培養液を25℃で解凍し、遠心機を用いて12000 Gで1分間遠心し、凍結保存中に生成した沈殿を分離した。4本のマイクロチューブのそれぞれに、0、5、10、30 μLの0.5 M 硫酸水溶液と30、25、20、0μLのMilliQ水を添加し均一にした後に、得られた遠心上清100 μLずつを分注し、容量をすべて130μLに調製した。
これらを撹拌後、10分間静置することで、pH7.8、pH4.6、pH3.7、pH2.0の「pH調節済み培養液」を得た(「工程(2)で得られた溶液」に相当)。pH2.0の「pH調節済み培養液」は白濁し、沈殿生成を確認した。これら「pH調節済み培養液」を、遠心機を用いて12000 Gで5分間遠心し、pH変化により生成した沈殿を分離した(「工程(3)で分離した固体」に相当)。得られた遠心上清をそれぞれ別のマイクロチューブに移し、「pH調節済み培養液上清」とした(「工程(3)の固体分離後の溶液」に相当)。残った沈殿に、除いた遠心上清と同じ容量の緩衝液(100 mM Tris-HCl, pH8.5)を添加し、撹拌すると、沈殿は速やかに溶解したが、pH2.0で生じた沈殿の一部は不溶であった。得られた「沈殿溶解液」(「工程(4)で得られた溶液」に相当)のpHはいずれも中性付近で、すべてpH8.5であった。
上記操作により得られたpH7.8、pH4.6、pH3.7、pH2.0の「pH調節済み培養液上清」と、「沈殿溶解液」を還元SDS-PAGEに供し、17-PInsのバンドを確認することで、pH変化に伴う17-PInsの沈殿および可溶化を評価した。
pH7.8、pH4.6、pH3.7、pH2.0の「pH調節済み培養液」の17-PIns回収率は、それぞれ9%、46%、43%、45%であった。図6−Aに、算出した回収率と「pH調節済み培養液」のpHとの関係を示す。
図6−Bに、pH調節済み培養液のpHと、「pH調節済み培養液上清」及び対応する「沈殿溶解液」の各電気泳動図における融合タンパク質17-PInsのバンド部分と、回収率を示す。
pH7.8で「pH調節済み培養液上清」に存在していた17-PInsは、pH4.6、pH3.7、pH2.0で、「沈殿溶解液」でも濃いバンドとして検出された。
プロインスリンを有する融合タンパク質の製造
実施例6では、目的タンパク質としてプロインスリン(86アミノ酸残基)(PIns)を用い、自己組織化能を有するタンパク質としてCspB成熟タンパク質のN末端から6アミノ酸残基からなる配列(CspB6)を用い、宿主として、コリネ型細菌であるC. glutamicumを用いた。
実施例1と同様に実施した。
凍結保存した菌体除去済み培養液を25℃で解凍し、遠心機を用いて12000 Gで1分間遠心し、凍結保存中に生成した沈殿を分離した。4本のマイクロチューブのそれぞれに、0、5、10、30 μLの0.5 M 硫酸水溶液と30、25、20、0μLのMilliQ水を添加し均一にした後に、得られた遠心上清100 μLずつを分注し、容量をすべて130μLに調製した。
これらを撹拌後、10分間静置することで、pH7.6、pH4.6、pH3.5、pH1.8の「pH調節済み培養液」を得た(「工程(2)で得られた溶液」に相当)。pH1.8の「pH調節済み培養液」は白濁し、沈殿生成を確認した。これら「pH調節済み培養液」を、遠心機を用いて12000 Gで5分間遠心し、pH変化により生成した沈殿を分離した(「工程(3)で分離した固体」に相当)。得られた遠心上清をそれぞれ別のマイクロチューブに移し、「pH調節済み培養液上清」とした(「工程(3)の固体分離後の溶液」に相当)。残った沈殿に、除いた遠心上清と同じ容量の緩衝液(100 mM Tris-HCl, pH8.5)を添加し、撹拌すると、沈殿は速やかに溶解したが、pH1.8で生じた沈殿の一部は不溶であった。得られた「沈殿溶解液」(「工程(4)で得られた溶液」に相当)のpHはいずれも中性付近で、すべてpH8.5であった。
上記操作により得られたpH7.6、pH4.6、pH3.5、pH1.8の「pH調節済み培養液上清」と、「沈殿溶解液」を還元SDS-PAGEに供し、6-PInsのバンドを確認することで、pH変化に伴う6-PInsの沈殿および可溶化を評価した。
算出されたpH7.6、pH4.6、pH3.5、pH1.8の「pH調節済み培養液」の6-PIns回収率は、それぞれ3%、34%、31%、45%であった。図7−Aに、算出した回収率と「pH調節済み培養液」のpHとの関係を示す。
図7−Bに、「pH調節済み培養液」のpHと、「pH調節済み培養液上清」及び対応する「沈殿溶解液」の各電気泳動図における融合タンパク質6-PInsのバンド部分と、回収率を示す。
pH7.6で「pH調節済み培養液上清」に存在していた6-PInsは、pH4.6、pH3.5、pH1.8で、「沈殿溶解液」でもバンドとして検出された。
Teriparatideを有する融合タンパク質の製造
実施例7では、実施例1と同様、目的タンパク質として生理活性ペプチドであるTeriparatide(34アミノ酸残基)(Teri)を用い、自己組織化能を有するタンパク質としてCspB成熟タンパク質のN末端から50アミノ酸残基からなる配列(CspB50)を用い、酵素的切断に使用されるアミノ酸配列としてproTEVプロテアーゼ認識配列を用い、宿主として、コリネ型細菌であるC. glutamicumを用いた。
但し、融合タンパク質を含む溶液のpH調節に塩酸を用いた(実施例1では硫酸を使用)。
実施例1と同様に実施した。
実施例1と同様に実施した。
実施例1と同様。
凍結保存した菌体除去済み培養液を25℃で解凍し、遠心機を用いて12000 Gで1分間遠心し、凍結保存中に生成した沈殿を分離した。4本のマイクロチューブのそれぞれに、0、3.5、5、10 μLの1M 塩酸水溶液と10、6.5、5、0μLのMilliQ水を添加し均一にした後に、得られた遠心上清100 μLずつを分注し、容量をすべて110μLに調製した。
これらを撹拌後、10分間静置することで、pH7.9、pH7.0、pH5.3、pH3.1の「pH調節済み培養液」を得た(「工程(2)で得られた溶液」に相当)。pH7.0以下の「pH調節済み培養液」は白濁し、沈殿生成を確認した。これら「pH調節済み培養液」を、遠心機を用いて12000 Gで5分間遠心し、pH変化により生成した沈殿を分離した(「工程(3)で分離した固体」に相当)。得られた遠心上清をそれぞれ別のマイクロチューブに移し、「pH調節済み培養液上清」とした(「工程(3)の固体分離後の溶液」に相当)。残った沈殿に、除いた遠心上清と同じ容量の緩衝液(100 mM Tris-HCl, pH8.5)を添加し、撹拌すると、沈殿は速やかに溶解し、「沈殿溶解液」を得た(「工程(4)で得られた溶液」に相当)。「沈殿溶解液」のpHはいずれも中性付近で、それぞれpH8.5、pH8.5、pH8.4、pH8.3であった。
上記操作により得られたpH7.9、pH7.0、pH5.3、pH3.1の「pH調節済み培養液上清」と、「沈殿溶解液」を還元SDS-PAGEに供し、50-Teriのバンドを確認することで、pH変化に伴う50-Teriの沈殿および可溶化を評価した。
算出されたpH7.9、pH7.0、pH5.3、pH3.1の「pH調節済み培養液」の50-Teri回収率は、それぞれ2%、80%、100%、99%であった。図8−Aに、算出した回収率と「pH調節済み培養液」のpHとの関係を示す。
図8−Bに、「pH調節済み培養液」のpHと、「pH調節済み培養液の上清」及び対応する「沈殿溶解液」の各電気泳動図における融合タンパク質50-Teriのバンド部分と、回収率を示す。
pH7.9で「pH調節済み培養液上清」に存在していた50-TeriはpH7.0、pH5.3、pH3.1で検出されず、代わりに「沈殿溶解液」で検出された。
Teriparatideを有する融合タンパク質の製造
実施例8では、実施例1と同様、目的タンパク質として生理活性ペプチドであるTeriparatide(34アミノ酸残基)(Teri)を用い、自己組織化能を有するタンパク質としてCspB成熟タンパク質のN末端から50アミノ酸残基からなる配列(CspB50)を用い、酵素的切断に使用されるアミノ酸配列としてproTEVプロテアーゼ認識配列を用い、宿主として、コリネ型細菌であるC. glutamicumを用いた。
但し、融合タンパク質を含む溶液のpH調節に酢酸を用いた(実施例1では硫酸を使用)。
実施例1と同様に実施した。
実施例1と同様に実施した。
実施例1と同様に実施した。
凍結保存した菌体除去済み培養液を25℃で解凍し、遠心機を用いて12000 Gで1分間遠心し、凍結保存中に生成した沈殿を分離した。4本のマイクロチューブのそれぞれに、0、2、4、10 μLの10%酢酸水溶液と10、8、6、0μLのMilliQ水を添加し均一にした後に、得られた遠心上清100 μLずつを分注し、容量をすべて110μLに調製した。
これらを撹拌後、10分間静置することで、pH7.9、pH6.8、pH5.0、pH4.3の「pH調節済み培養液」を得た(「工程(2)で得られた溶液」に相当)。pH6.8以下の「pH調節済み培養液」は白濁し、沈殿生成を確認した。これら「pH調節済み培養液」を、遠心機を用いて12000 Gで5分間遠心し、pH変化により生成した沈殿を分離した(「工程(3)で分離した固体」に相当)。得られた遠心上清をそれぞれ別のマイクロチューブに移し、「pH調節済み培養液上清」とした(「工程(3)の固体分離後の溶液」に相当)。残った沈殿に、除いた遠心上清と同じ容量の緩衝液(100 mM Tris-HCl, pH8.5)を添加し、撹拌すると、沈殿は速やかに溶解し、「沈殿溶解液」を得た(「工程(4)で得られた溶液」に相当)。「沈殿溶解液」のpHはいずれも中性付近で、それぞれpH8.5、pH8.3、pH8.1、pH7.9であった。
上記操作により得られたpH7.9、pH6.8、pH5.0、pH4.3の「pH調節済み培養液上清」と、「沈殿溶解液」を還元SDS-PAGEに供し、50-Teriのバンドを確認することで、pH変化に伴う50-Teriの沈殿および可溶化を評価した。
pH7.9、pH6.8、pH5.0、pH4.3の「pH調節済み培養液」の回収率は、それぞれ2%、95%、99%、98%であった。図9−Aに、算出した回収率と「pH調節済み培養液」のpHとの関係を示す。
図9−Bに、「pH調節済み培養液」のpHと、「pH調節済み培養液上清」及び対応する「沈殿溶解液」の各電気泳動図における融合タンパク質50-Teriのバンド部分と、回収率を示す。
pH7.9で「pH調節済み培養液上清」に存在していた50-TeriはpH6.8、pH5.0、pH4.3で検出されず、代わりに「沈殿溶解液」で検出された。
Teriparatideを有する融合タンパク質の製造
実施例9では、実施例1及び実施例1−2と同様、目的タンパク質として生理活性ペプチドであるTeriparatide(34アミノ酸残基)(Teri)を用い、自己組織化能を有するタンパク質としてCspB成熟タンパク質のN末端から50アミノ酸残基からなる配列(CspB50)を用い、酵素的切断に使用されるアミノ酸配列としてproTEVプロテアーゼ認識配列を用い、宿主として、コリネ型細菌であるC. glutamicumを用いた。
実施例1と同様に実施した。
実施例1と同様に実施した。
実施例1と同様に実施した。
凍結保存した菌体除去済み培養液を25℃で解凍し、遠心機を用いて12000 Gで1分間遠心し、凍結保存中に生成した沈殿を分離した。マイクロチューブに50 μLの0.5M 硫酸水溶液と得られた遠心上清600 μLを添加した。
これを撹拌後、10分間静置することで、pH3.7の「pH調節済み培養液」を得た(「工程(2)で得られた溶液」に相当)。このpH3.7という値は、実施例1及び実施例1−2の結果に基づき「回収率を10%以上にするpH」として採用したものである。この「pH調節済み培養液」を、遠心機を用いて12000 Gで5分間遠心し、pH変化により生成した沈殿を分離した(「工程(3)で分離した固体」に相当)。得られた遠心上清を別のマイクロチューブに移し、「pH調節済み培養液上清」とした(「工程(3)の固体分離後の溶液」に相当)。残った沈殿に、除いた遠心上清と同じ容量の緩衝液(100 mM Tris-HCl, pH8.5)を添加し、撹拌すると、沈殿は速やかに溶解し、「沈殿溶解液」を得た(「工程(4)で得られた溶液」に相当)。「沈殿溶解液」のpHは中性付近で、pH7.4であった。このpH7.4という値は、実施例1及び実施例1−2の結果に基づき「工程(2)で得られた溶液のpHよりも0.1以上高く、かつ、12以下のpH」として採用したものである。
菌体除去済み培養液(操作前)と、上記操作により得られた「沈殿溶解液」とを逆相HPLCに供して50-Teri及びその他のピーク面積を求め、下記計算式を用いて純度を算出し対比することにより、上記操作に伴う50-Teriの純度向上を評価した。
純度 (%)=(50-Teriのピーク面積/すべてのピーク面積の合計)x100
なお、逆相HPLCは以下の条件で実施した。
System: ウォーターズアライアンスPDAシステム一式
Column: YMC-Pack C8 φ4.6 x 100mm, 粒子径5μm, 細孔径30nm
Column temp.: 30 ℃
Mobile phaseA: 10 mM 酢酸アンモニウム, 10% アセトニトリル, pH7.0 (pH無調整)
Mobile phaseB: 10 mM 酢酸アンモニウム, 80% アセトニトリル, pH7.0 (pH無調整)
Flow rate: 1.0 mL/min
Detection: 280 nm, 220 nm
Injection volume: 30 μL
各溶液の逆相HPLCの分析結果を図10−A及び10−Bに示す。図10−Aは、280 nmの波長で検出したピークを示し、図10−Bは、220 nmの波長で検出したピークを示す。
280 nmの波長で検出した場合、菌体除去済み培養液における50-Teriの純度が11%であるのに対し、沈殿溶解液における50-Teriの純度は46%へと向上した(図10−A)。同様に、220 nmの波長で検出した場合、菌体除去済み培養液における50-Teriの純度が46%であるのに対し、沈殿溶解液における50-Teriの純度は73%へと向上した(図10−B)。
このことから、本発明に従う上記操作が、50-Teriを回収できるだけでなく純度も向上させることがわかった。
配列番号1:C.glutamicum ATCC13869のcspB遺伝子の塩基配列
配列番号2:C.glutamicum ATCC13869のCspBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号3:C.glutamicum ATCC13869のCspB成熟タンパク質のアミノ酸配列
配列番号4:C. glutamicum由来PS1のシグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号5:C. glutamicum由来PS2(CspB)のシグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号6:C. ammoniagenes由来SlpA(CspA)のシグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号7:Factor Xaプロテアーゼの認識配列
配列番号8:ProTEVプロテアーゼの認識配列
配列番号9〜16:プロインスリン全合成用DNAの塩基配列
配列番号17、18:プライマー
配列番号19:プロインスリン遺伝子の塩基配列
配列番号20〜55:プライマー
配列番号56〜69:ヒト成長ホルモンhGH全合成用DNAの塩基配列
配列番号70、71:プライマー
配列番号72:hGH遺伝子の塩基配列
配列番号73〜77:プライマー
配列番号78、79:Teriparatide合成用DNAの塩基配列
配列番号80、81:プライマー
配列番号82:Teriparatide遺伝子の塩基配列
配列番号83〜86:プライマー
配列番号87〜89:プライマー
配列番号90:Biva18合成用DNAの塩基配列
配列番号91、92:プライマー
配列番号93:Biva18のアミノ酸配列
Claims (29)
- 自己組織化能を有するタンパク質と目的タンパク質との融合タンパク質の製造方法であって、下記(1)〜(4)の工程:
(1)融合タンパク質を含む溶液を調製する工程、
(2)工程(1)で得られた溶液のpHを、下記計算式:
回収率(%)=[工程(4)で得られた溶液における融合タンパク質の量/{
工程(4)で得られた溶液における融合タンパク質の量+工程(3)の固体分
離後の溶液における融合タンパク質の量}]×100
で計算される回収率を10%以上にするpHへと調節する工程、
(3)工程(2)で得られた溶液から固体を分離する工程、及び、
(4)工程(3)で分離した固体を、工程(2)で得られた溶液のpHよりも0.1以上高く、かつ、12以下のpHを有する溶液中に溶解させる工程
を含み、
自己組織化能を有するタンパク質が、配列番号3記載のアミノ酸配列のN末端から6〜250アミノ酸残基を含むタンパク質である、融合タンパク質の製造方法。 - 自己組織化能を有するタンパク質が、配列番号3記載のアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項1記載の方法。
- 自己組織化能を有するタンパク質が、配列番号3記載のアミノ酸配列のN末端から6〜250アミノ酸残基からなる、請求項1記載の方法。
- 自己組織化能を有するタンパク質が、配列番号3記載のアミノ酸配列のN末端から6、17、50又は250のいずれかのアミノ酸残基からなる、請求項3記載の方法。
- 目的タンパク質のアミノ酸残基数が10〜1000である、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 自己組織化能を有するタンパク質と目的タンパク質との間に、さらに、酵素的切断又は化学的切断に使用されるアミノ酸配列を含む、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 自己組織化能を有するタンパク質と目的タンパク質との間にある酵素的切断に使用されるアミノ酸配列が、ProTEVプロテアーゼ認識配列、トリプシンの認識配列又はFactor Xaプロテアーゼの認識配列である、請求項6記載の方法。
- 工程(2)のpHが9以下である、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- 工程(2)のpH調節を、硫酸、塩酸、酢酸、リン酸及びトリフルオロ酢酸からなる群より選ばれる酸を用いて行う、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- 工程(3)の分離を、遠心分離及び/又は膜ろ過により行う、請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
- 工程(1)で得られた溶液が、融合タンパク質を発現する遺伝子構築物を有するコリネ型細菌の培養液の上清である、請求項1〜10のいずれかに記載の方法。
- 工程(2)に規定される回収率が30%以上である、請求項1〜11のいずれかに記載の方法。
- 目的タンパク質の製造方法であって、下記(1)〜(5)の工程:
(1)自己組織化能を有するタンパク質と目的タンパク質との融合タンパク質を含む溶
液を調製する工程であって、該融合タンパク質が、自己組織化能を有するタン
パク質と目的タンパク質との間に、酵素的切断又は化学的切断に使用されるアミ
ノ酸配列を含んでいる工程、
(2)工程(1)で得られた溶液のpHを、下記計算式:
回収率(%)=[工程(4)で得られた溶液における融合タンパク質の量/{
工程(4)で得られた溶液における融合タンパク質の量+工程(3)の固体分
離後の溶液における融合タンパク質の量}]×100
で計算される回収率を10%以上にするpHへと調節する工程、
(3)工程(2)で得られた溶液から固体を分離する工程、及び、
(4)工程(3)で分離した固体を、工程(2)で得られた溶液のpHよりも0.1以
上高く、かつ、12以下のpHを有する溶液中に溶解させる工程、
(5)工程(4)と同時、工程(4)の途中、または工程(4)の後に、融合タンパク
質を、自己組織化能を有するタンパク質と目的タンパク質との間にあるアミノ
酸配列部位で酵素的切断又は化学的切断する処理に付する工程、
を含み、
自己組織化能を有するタンパク質が、配列番号3記載のアミノ酸配列のN末端から6〜250アミノ酸残基を含むタンパク質である、目的タンパク質の製造方法。 - 融合タンパク質を切断する処理に付する工程が、酵素的切断処理に付する工程である、請求項13記載の方法。
- 自己組織化能を有するタンパク質が、配列番号3記載のアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項13記載の方法。
- 自己組織化能を有するタンパク質が、配列番号3記載のアミノ酸配列のN末端から6〜250アミノ酸残基からなる、請求項13記載の方法。
- 自己組織化能を有するタンパク質が、配列番号3記載のアミノ酸配列のN末端から6、17、50又は250のいずれかのアミノ酸残基からなる、請求項16記載の方法。
- 目的タンパク質のアミノ酸残基数が10〜1000である、請求項13〜17のいずれかに記載の方法。
- 目的タンパク質がテリパラチドである、請求項13〜18のいずれかに記載の方法。
- 目的タンパク質が配列番号93で示されるビバリルジン中間体である、請求項13〜18のいずれかに記載の方法。
- 自己組織化能を有するタンパク質と目的タンパク質との間にある酵素的切断に使用されるアミノ酸配列が、ProTEVプロテアーゼ認識配列、トリプシンの認識配列又はFactor Xaプロテアーゼの認識配列である、請求項13〜20のいずれかに記載の方法。
- 工程(2)のpHが9以下である、請求項13〜21のいずれかに記載の方法。
- 工程(2)のpH調節を、硫酸、塩酸、酢酸、リン酸及びトリフルオロ酢酸からなる群より選ばれる酸を用いて行う、請求項13〜22のいずれかに記載の方法。
- 工程(3)の分離を、遠心分離及び/又は膜ろ過により行う、請求項13〜23のいずれかに記載の方法。
- 工程(1)で得られた溶液が、融合タンパク質を発現する遺伝子構築物を有するコリネ型細菌の培養液の上清である、請求項13〜24のいずれかに記載の方法。
- 工程(4)及び/又は工程(5)の後に、(6)融合タンパク質または目的タンパク質を精製する工程を含む、請求項13〜25のいずれかに記載の方法。
- 工程(6)をカラムクロマトグラフィーにより行う、請求項26に記載の方法。
- 工程(2)に規定される回収率が30%以上である、請求項13〜27のいずれかに記載の方法。
- 自己組織化能を有するタンパク質と目的タンパク質との融合タンパク質を含む溶液のpHを9以下に調節することによって固体を発生させた後、該固体を分離すること、及び、自己組織化能を有するタンパク質が、配列番号3記載のアミノ酸配列のN末端から6〜250アミノ酸残基を含むタンパク質であることを特徴とする、融合タンパク質の固体を発生させ分離する方法。
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