JP6064912B2 - タンパク質の分泌生産法 - Google Patents
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- C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
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Description
[1]異種タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物を有するコリネ型細菌を培養し、分泌生産された異種タンパク質を回収することを含む、異種タンパク質の製造方法であって、
前記遺伝子構築物が、コリネ型細菌で機能するプロモーター配列、該プロモーター配列の下流に接続されたコリネ型細菌で機能するシグナルペプチドをコードする核酸配列、および該シグナルペプチドをコードする核酸配列の下流に接続されたGln-Glu-Thrを含むアミノ酸配列と異種タンパク質との融合タンパク質をコードする核酸配列を含む、方法(ただし、前記Gln-Glu-Thrを含むアミノ酸配列が、配列番号96の1〜14位または1〜38位のアミノ酸残基からなる配列である場合を除く)。
[2]前記Gln-Glu-Thrを含むアミノ酸配列が、下記A〜Hのアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列である、前記方法:
(A)Gln-Glu-Thr
(B)Gln-Glu-Thr-Xaa1(配列番号102)
(C)Gln-Glu-Thr-Xaa1-Xaa2(配列番号103)
(D)Gln-Glu-Thr-Xaa1-Xaa2-Xaa3(配列番号104)
(E)Gln-Glu-Thrに成熟CspBの4〜7位のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列
(F)Gln-Glu-Thrに成熟CspBの4〜8位のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列
(G)Gln-Glu-Thrに成熟CspBの4〜17位のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列
(H)Gln-Glu-Thrに成熟CspBの4〜50位のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列
前記アミノ酸配列において、Xaa1はAsn、Gly、Thr、Pro、またはAlaであり、Xaa2はPro、Thr、またはValであり、Xaa3はThrまたはTyrである。
[3]前記Gln-Glu-Thrを含むアミノ酸配列が、Gln-Glu-Thr-Asn-Pro-Thr(配列番号97)、Gln-Glu-Thr-Gly-Thr-Tyr(配列番号98)、Gln-Glu-Thr-Thr-Val-Thr(配列番号99)、Gln-Glu-Thr-Pro-Val-Thr(配列番号100)、およびGln-Glu-Thr-Ala-Val-Thr(配列番号101)からなる群より選択されるアミノ酸配列である、前記方法。
[4]前記遺伝子構築物が、Gln-Glu-Thrを含むアミノ酸配列をコードする核酸配列と異種タンパク質をコードする核酸配列との間に、さらに、酵素的切断に使用されるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、前記方法。
[5]前記酵素的切断に使用されるアミノ酸配列が、Factor Xaプロテアーゼの認識配列またはProTEVプロテアーゼの認識配列である、前記方法。
[6]前記プロテアーゼの認識配列が、配列番号105または106に示すアミノ酸配列である、前記方法。
[7]前記コリネ型細菌で機能するシグナルペプチドが、コリネ型細菌由来のCspBのシグナルペプチドである、前記方法。
[8]前記CspBのシグナルペプチドが配列番号92に示すアミノ酸配列を有する、前記方法。
[9]前記培養されるコリネ型細菌がコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属する細菌である、前記方法。
[10]前記培養されるコリネ型細菌がコリネバクテリウム・グルタミカムまたはコリネバクテリウム・スタティオニスである、前記方法。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム(Corynebacterium acetoacidophilum)
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム(Corynebacterium acetoglutamicum)
コリネバクテリウム・アルカノリティカム(Corynebacterium alkanolyticum)
コリネバクテリウム・カルナエ(Corynebacterium callunae)
コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)
コリネバクテリウム・リリウム(Corynebacterium lilium)
コリネバクテリウム・メラセコーラ(Corynebacterium melassecola)
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス(コリネバクテリウム・エフィシエンス)(Corynebacterium thermoaminogenes (Corynebacterium efficiens))
コリネバクテリウム・ハーキュリス(Corynebacterium herculis)
ブレビバクテリウム・ディバリカタム(Brevibacterium divaricatum)
ブレビバクテリウム・フラバム(Brevibacterium flavum)
ブレビバクテリウム・イマリオフィラム(Brevibacterium immariophilum)
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(コリネバクテリウム・グルタミカム)(Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum))
ブレビバクテリウム・ロゼウム(Brevibacterium roseum)
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム(Brevibacterium saccharolyticum)
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス(Brevibacterium thiogenitalis)
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス(コリネバクテリウム・スタティオニス)(Corynebacterium ammoniagenes(Corynebacterium stationis))
ブレビバクテリウム・アルバム(Brevibacterium album)
ブレビバクテリウム・セリナム(Brevibacterium cerinum)
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム(Microbacterium ammoniaphilum)
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806
Corynebacterium alkanolyticum ATCC 21511
Corynebacterium callunae ATCC 15991
Corynebacterium glutamicum ATCC 13020, ATCC 13032, ATCC 13060,ATCC 13869,FERM BP-734
Corynebacterium lilium ATCC 15990
Corynebacterium melassecola ATCC 17965
Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340 (FERM BP-1539)
Corynebacterium herculis ATCC 13868
Brevibacterium divaricatum ATCC 14020
Brevibacterium flavum ATCC 13826, ATCC 14067, AJ12418(FERM BP-2205)
Brevibacterium immariophilum ATCC 14068
Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869
Brevibacterium roseum ATCC 13825
Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066
Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240
Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis) ATCC 6871, ATCC 6872
Brevibacterium album ATCC 15111
Brevibacterium cerinum ATCC 15112
Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354
C. glutamicum ATCC13058(AY524990)
C. glutamicum ATCC13744(AY524991)
C. glutamicum ATCC13745(AY524992)
C. glutamicum ATCC14017(AY524993)
C. glutamicum ATCC14020(AY525009)
C. glutamicum ATCC14067(AY524994)
C. glutamicum ATCC14068(AY525010)
C. glutamicum ATCC14747(AY525011)
C. glutamicum ATCC14751(AY524995)
C. glutamicum ATCC14752(AY524996)
C. glutamicum ATCC14915(AY524997)
C. glutamicum ATCC15243(AY524998)
C. glutamicum ATCC15354(AY524999)
C. glutamicum ATCC17965(AY525000)
C. glutamicum ATCC17966(AY525001)
C. glutamicum ATCC19223(AY525002)
C. glutamicum ATCC19240(AY525012)
C. glutamicum ATCC21341(AY525003)
C. glutamicum ATCC21645(AY525004)
C. glutamicum ATCC31808(AY525013)
C. glutamicum ATCC31830(AY525007)
C. glutamicum ATCC31832(AY525008)
C. glutamicum LP-6(AY525014)
C. glutamicum DSM20137(AY525015)
C. glutamicum DSM20598(AY525016)
C. glutamicum DSM46307(AY525017)
C. glutamicum 22220(AY525005)
C. glutamicum 22243(AY525006)
(A)Gln-Glu-Thr
(B)Gln-Glu-Thr-Xaa1(配列番号102)
(C)Gln-Glu-Thr-Xaa1-Xaa2(配列番号103)
(D)Gln-Glu-Thr-Xaa1-Xaa2-Xaa3(配列番号104)
(E)Gln-Glu-Thrに成熟CspBの4〜7位のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列
(F)Gln-Glu-Thrに成熟CspBの4〜8位のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列
(G)Gln-Glu-Thrに成熟CspBの4〜17位のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列
(H)Gln-Glu-Thrに成熟CspBの4〜50位のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列
A〜Hのアミノ酸配列において、Xaa1はAsn、Gly、Thr、Pro、またはAlaであり、Xaa2はPro、Thr、またはValであり、Xaa3はThrまたはTyrである。また、A〜Hのアミノ酸配列において、「Gln-Glu-Thrに成熟CspBの4〜X位のアミノ酸残基が付加された」とは、Gln-Glu-ThrのThrに成熟CspBのN末端の4位からX位までのアミノ酸残基が付加されていることを意味する。なお、通常、成熟CspBのN末端の1〜3番目のアミノ酸残基はGln-Glu-Thrであり、その場合、「Gln-Glu-Thrに成熟CspBの4〜X位のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列」とは、成熟CspBの1〜X位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と同義である。
プロインスリン(以下、PIns と表記する)のアミノ酸配列は既に決定されている(Genbank Accession No. NP_000198.1)。この配列とC. glutamicumのコドン使用頻度を考慮して、<配列番号1>〜<配列番号8>に示したDNAを合成した。これらのDNAを鋳型とし、<配列番号9>と<配列番号10>に示したDNAをプライマーとして用いて、PInsをコードする遺伝子をPCR法によって増幅し、<配列番号11>に示した約0.3kbpのDNA断片を得た。このDNA断片をクローニングベクターpHSG398(タカラバイオ社製)のSma I部位に挿入する事によりpHSG-PInsを得た。このpHSG-PInsを鋳型にして、<配列番号9>と<配列番号10>に示したDNAをプライマーとして用いて、PIns遺伝子領域をPCR法によって増幅し、約0.3kbpのPIns遺伝子断片を得た。
上述の通り、C. glutamicumの細胞表層タンパク質であるCspBをコードしている遺伝子の塩基配列は既に決定されている(非特許文献8;[Mol. Microbiol., 9, 97-109(1993)])。C. glutamicumにおいてCspBは細胞表層に局在し、S-layerと呼ばれる層を形成しているが、その局在にはC末端側の疎水性に富んだアミノ酸残基領域が関与している事が知られている(非特許文献8;[Mol. Microbiol., 9, 97-109(1993)])。この配列を参考にして、<配列番号12>と<配列番号14>に記載のプライマーを合成し、常法に従って(斉藤、三浦の方法[Biochem. Biophys. Act., 72, 619(1963)])調製したC. glutamicum ATCC13869の染色体DNAを鋳型として、CspBをコードする遺伝子のプロモーターを含む5’-上流域(以下、CspBプロモーター領域ともいう)、ならびにCspBのN末端のシグナルペプチド30アミノ酸残基およびCspB成熟タンパク質のN末端440アミノ酸残基をコードする領域をPCR法にて増幅した。なお、CspB成熟タンパク質のN末端440アミノ酸残基とは、C. glutamicum ATCC13869のCspB成熟タンパク質全長469アミノ酸(配列番号96)からC末端側の疎水性領域である29アミノ酸を除いたものである。PCR反応にはPyobest DNA polymerase(タカラバイオ社製)を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。
実施例1(1)で構築した成熟CspBのN末端アミノ酸残基を融合していないプロインスリンの分泌発現プラスミドであるpPKPIns、および実施例1(2)構築したC. glutamicum ATCC13869の細胞表層タンパク質CspBの成熟タンパク質N末端の1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 17, 20, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 440アミノ酸残基を融合したプロインスリンの分泌発現プラスミドであるpPKK1PIns、pPKK2PIns、pPKK3PIns、pPKK4PIns、pPKK5PIns、pPKK6PIns、pPKK7PIns、pPKK8PIns、pPKK9PIns、pPKK10PIns、pPKK11PIns、pPKK12PIns、pPKK13PIns、pPKK14PIns、pPKK15PIns、pPKK17PIns、pPKK20PIns、pPKK50PIns、pPKK100PIns、pPKK150PIns、pPKK200PIns、pPKK250PIns、pPKK300PIns、pPKK350PIns、pPKK400PIns、pPKK440PInsを用いて、WO2004/029254に記載のC. glutamicum YDK010株を形質転換した。なお、C. glutamicum YDK010株は、C. glutamicum AJ12036(FERM BP-734)の細胞表層タンパク質PS2(CspB)の欠損株である(WO2004/029254)。得られた各形質転換体を、25 mg/lのカナマイシンを含むMM液体培地(グルコース 120 g、硫酸マグネシウム七水和物 3g、硫酸アンモニウム 30g、リン酸二水素カリウム 1.5g、硫酸鉄七水和物 0.03g、硫酸マンガン四水和物 0.03g、チアミン塩酸塩 0.45mg、ビオチン 0.45mg、DL-メチオニン0.15g、および炭酸カルシウム 50gを水で1LにしてpH7.0に調整)で30 ℃、72時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清10 μlを還元SDS-PAGEに供してからCBB R-250(バイオラッド社製)にて染色を行った。その結果、CspBの成熟タンパク質のN末端アミノ酸を融合していないPInsを発現するプラスミドpPKPInsを導入した株では、目的とする分子量を有するタンパク質を示すバンドが肉眼で辛うじて確認できる程度に検出されたのに対して、CspBの成熟タンパク質のN末端アミノ酸を融合したPInsを発現する各プラスミドを導入した株では、目的とする分子量を有するタンパク質を示すタンパク質バンドが濃く検出され、CspBの成熟タンパク質のN末端アミノ酸との融合により有意に分泌量が向上している事が確認された。この分泌量の向上効果は、特にCspBのN末端3〜8残基、17残基、および50アミノ酸残基を融合させた場合において顕著であった(図1)。さらに、分泌量については、SDS-PAGEにて検出された目的の各タンパク質バンドについて、デンシトメーターを用いた定量を行った。その結果、PInsの分泌量は、成熟CspBのN末端アミノ酸を融合させていないPInsを発現するpPKPIns導入株に比べて、成熟CspBのN末端アミノ酸を融合させたPInsを発現するプラスミドを導入したほぼ全ての株で1.5倍以上に増加しており、特に成熟CspBのN末端4, 6, 17, 50アミノ酸残基を融合させたpPKK4PIns, pPKK6PIns, pPKK17PIns, pPKK50PIns導入株では10倍以上に増加していた(表1の「Secretion amount (%)」)。また、成熟CspBのN末端3〜8アミノ酸残基を融合させた場合においても、PInsの分泌量は5倍以上に増加していた(表1の「Secretion amount (%)」)。さらに、目的の各融合タンパク質の分子量を考慮して、分泌された分子数の相対値を算出した。その結果、PInsの分泌量は、特に成熟CspBのN末端3〜8、17、および50アミノ酸残基を融合させた場合において顕著に増加している事が再確認された(表1の「Relative amount (%)」)。一方、これら分泌量の向上が確認された各融合タンパク質のN末端アミノ酸配列をプロテインシークエンサーPPSQ-21A(島津製作所製)で決定しようと試みたところ、いずれもN末端アミノ酸残基が決定されなかった事から、後述する結果を考慮し、これら融合タンパク質のN末端アミノ酸残基はピログルタミン酸残基に変換されている事が確認された。
(1)細胞表層タンパク質CspBホモログを有するCorynebacterium属細菌由来の各CspB成熟タンパク質のN末端6アミノ酸残基を融合させたプロインスリン分泌発現プラスミドの構築
Corynebacterium属細菌の中には細胞表層タンパク質CspBのホモログが存在する株と存在しない株があるが、28株のC. glutamicumについては、CspBホモログのアミノ酸配列が報告されている[非特許文献9;J Biotechnol., 112, 177-193(2004)]。この28株由来のCspBホモログのN末端アミノ酸配列を比較すると、シグナル配列30アミノ酸と、成熟タンパク質のN末端3アミノ酸残基(Gln-Glu-Thr)は完全に保存されていた。さらに、CspBホモログの成熟タンパク質のN末端について6アミノ酸残基までを比較すると、Gln-Glu-Thr-Asn-Pro-Thr(以下、QETNPTともいう(配列番号97))、Gln-Glu-Thr-Gly-Thr-Tyr(以下、QETGTYともいう(配列番号98))、Gln-Glu-Thr-Thr-Val-Thr(以下、QETTVTともいう(配列番号99))、Gln-Glu-Thr-Pro-Val-Thr(以下、QETPVTともいう(配列番号100))、Gln-Glu-Thr-Ala-Val-Thr(以下、QETAVTともいう(配列番号101))の5パターンに分類できることがわかった。一方、実施例1で用いたC. glutamicum ATCC13869の成熟CspBのN末端配列はQETNPT型である。そこで、他の4パターン(QETGTY型、QETTVT型、QETPVT型、QETAVT型)のアミノ酸を融合させたプロインスリン発現プラスミドを構築する目的で、実施例1(2)にて構築したpPKK6PInsを鋳型とし、それぞれ<配列番号12>と<配列番号42>、<配列番号12>と<配列番号43>、<配列番号12>と<配列番号44>、<配列番号12>と<配列番号45>に示した各合成DNAをプライマーとして、CspBプロモーター領域、およびCspBシグナルペプチド30アミノ酸残基をコードする領域に、さらに成熟CspBのN末端の6アミノ酸残基(QETGTY、QETTVT、QETPVT、QETAVT)をコードする領域が付加された断片をPCR法にてそれぞれ増幅した。一方、実施例1(1)で構築したプラスミドpPKPInsを鋳型とし、<配列番号9>と<配列番号41>に示した合成DNAをプライマーとして、PIns遺伝子領域をPCR法にて増幅し、PIns遺伝子断片を得た。
実施例1(1)で構築した成熟CspBのN末端アミノ酸残基を融合していないプロインスリンの分泌発現プラスミドであるpPKPIns、実施例1(2)で構築したC. glutamicum ATCC13869の細胞表層タンパク質CspBの成熟タンパク質のN末端6アミノ酸残基(QETNPT)を融合したプロインスリンの分泌発現プラスミドであるpPKK6PIns、および実施例2(1)で構築したCorynebacterium属細菌由来の各CspBホモログの成熟タンパク質のN末端6アミノ酸残基(QETGTY、QETTVT、QETPVT、QETAVT)を融合させたプロインスリン発現プラスミドであるpPK-QETGTY-PIns、pPK-QETTVT-PIns、pPK-QETPVT-PIns、pPK-QETAVT-PInsを用いて、WO2004/029254に記載のC. glutamicum YDK010株を形質転換した。得られた各形質転換体を、25 mg/lのカナマイシンを含むMM液体培地(グルコース 120 g、硫酸マグネシウム七水和物 3g、硫酸アンモニウム 30g、リン酸二水素カリウム 1.5g、硫酸鉄七水和物 0.03g、硫酸マンガン四水和物 0.03g、チアミン塩酸塩 0.45mg、ビオチン 0.45mg、DL-メチオニン0.15g、および炭酸カルシウム 50gを水で1LにしてpH7.0に調整)で30 ℃、72時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清を還元SDS-PAGEに供してからCBB R-250(バイオラッド社製)にて染色を行った。その結果、pPKK6PInsを導入した株と同様に、pPK-QETGTY-PIns、pPK-QETTVT-PIns、pPK-QETPVT-PIns、pPK-QETAVT-PInsのいずれのプラスミドを導入した株においても、明確な目的の分子量を有する融合タンパク質バンドが検出され、成熟CspBのN末端アミノ酸を融合させていないPInsを発現するpPKPIns導入株に比べて、有意に分泌量が向上している事が確認された。さらに、分泌量については、SDS-PAGEにて検出された目的の各タンパク質バンドについて、デンシトメーターを用いた定量を行った。その結果、PInsの分泌量は、成熟CspBのN末端アミノ酸を融合させていないPInsを発現するpPKPIns導入株に比べて、成熟CspBのN末端アミノ酸を融合させたPInsを発現するプラスミドを導入した全ての株で5倍以上に増加している事が確認された(表2)。一方、これら分泌量の向上が確認された各融合タンパク質のN末端アミノ酸配列をプロテインシークエンサーPPSQ-21A(島津製作所製)で決定しようと試みたところ、いずれもN末端アミノ酸残基が決定されなかった事から、後述する結果を考慮し、これら融合タンパク質のN末端アミノ酸残基はピログルタミン酸残基に変換されている事が確認された。
(1)CspB成熟タンパク質のN末端アミノ酸配列とプロインスリン配列との間にFactor XaプロテアーゼもしくはProTEVプロテアーゼの認識配列を挿入した融合プロインスリンの分泌発現プラスミドの構築
ある目的タンパク質を、当該目的タンパク質以外のアミノ酸配列と融合させた形で発現させる場合、目的タンパク質のアミノ酸配列と、融合させたアミノ酸配列との間に特定の基質特異性の高いプロテアーゼ認識配列を配位する事により、発現した融合タンパク質を特定のプロテアーゼで切断し、簡便に目的タンパク質を得る方法が広く知られている。一方、基質特異性の高いプロテアーゼとして、Factor XaプロテアーゼやProTEVプロテアーゼなどが知られており、それぞれタンパク質中のIle-Glu-Gly-Arg(=IEGR)(配列番号105)およびGlu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln(=ENLYFQ)(配列番号106)の配列を認識して各配列のC末端側を特異的に切断する。よって、例えば、CspB融合PInsにおいて、CspB成熟タンパク質のN末端アミノ酸残基をコードする塩基配列とプロインスリンをコードする塩基配列との間にFactor Xaプロテアーゼの認識配列(IEGR)もしくはProTEVプロテアーゼの認識配列(ENLYFQ)をコードする塩基配列を挿入した融合PIns遺伝子を構築し、融合PInsを分泌発現させる事によって、これらのプロテアーゼを用いて、簡便に融合PInsからPInsを得る事が可能となる。
実施例1(1)で構築した成熟CspBのN末端アミノ酸を融合していないプロインスリンの分泌発現プラスミドであるpPKPIns、実施例3(1)で構築したCspB成熟タンパク質のN末端アミノ酸残基(6, 17, 50アミノ酸残基)とプロインスリン配列との間にFactor Xaプロテアーゼの認識配列を挿入した融合プロインスリンの分泌発現プラスミドであるpPKK6Xa-PIns、pPKK17Xa-PIns、pPKK50Xa-PIns、および同じく実施例3(1)で構築したCspB成熟タンパク質のN末端アミノ酸残基(6アミノ酸残基)とプロインスリン配列との間にproTEVプロテアーゼの認識配列を挿入した融合プロインスリンの分泌発現プラスミドであるpPKK6TEV-PInsを用いて、WO2004/029254に記載のC. glutamicum YDK010株を形質転換した。得られた各形質転換体を、25 mg/lのカナマイシンを含むMM液体培地(グルコース 120 g、硫酸マグネシウム七水和物 3g、硫酸アンモニウム 30g、リン酸二水素カリウム 1.5g、硫酸鉄七水和物 0.03g、硫酸マンガン四水和物 0.03g、チアミン塩酸塩 0.45mg、ビオチン 0.45mg、DL-メチオニン0.15g、および炭酸カルシウム 50gを水で1LにしてpH7.0に調整)でそれぞれ30 ℃、72時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清を還元SDS-PAGEに供してからCBB R-250(バイオラッド社製)にて染色を行った。その結果、pPKK6Xa-PIns、pPKK17Xa-PIns、pPKK50Xa-PIns、pPKK6TEV-PInsのいずれのプラスミドを導入した株においても、目的の分子量を有する融合タンパク質バンドが検出され、成熟CspBのN末端アミノ酸を融合させていないPInsを発現するpPKPIns導入株に比べて、有意に分泌量が向上している事が確認された。さらに、デンシトメーターを用いて分泌量を定量したところ、PInsの分泌量は、成熟CspBのN末端アミノ酸を融合させていないPInsを発現するpPKPIns導入株に比べて、成熟CspBのN末端アミノ酸とプロテアーゼ認識配列を融合させたPInsを発現するプラスミドを導入した全ての株で増加している事が確認され、CspB成熟タンパク質のN末端アミノ酸残基の直後にプロテアーゼ認識配列を融合させても目的タンパク質の分泌量が向上する事が明らかとなった(表3)。一方、これら分泌量の向上が確認された各融合タンパク質のN末端アミノ酸配列をプロテインシークエンサーPPSQ-21A(島津製作所製)で決定しようと試みたところ、いずれもN末端アミノ酸残基が決定されなかった。さらに、このうちYDK010/pPKK6Xa-PIns株にて分泌生産された融合タンパク質を逆層HPLCにて分離精製後に質量分析計micrOTOF(Bruker Daltonics社製)にて分子量を決定した結果、理論分子量10514.69に対して測定値が10497となり、水分子相当の質量(約18)が減少している事が判明した。また、YDK010/pPKK6TEV-PIns株にて分泌生産された融合タンパク質について同様に質量分析計AXIMA-TOF2(島津製作所製)にて分子量を決定した結果、理論分子量の10854.02に対して測定値が10836.89となり、やはり水分子相当の質量(約18)が減少していた。これらと後述する結果から、これら融合タンパク質のN末端アミノ酸残基はピログルタミン酸残基に変換されている事が確認された。
実施例3(2)で得られたYDK010/pPKK6Xa-PIns、YDK010/pPKK17Xa-PIns、YDK010/pPKK50Xa-PInsの各培養液を遠心分離して得られた培養上清を基質として、Factor Xaプロテアーゼ(Novagen社製)を用いて、業者の推奨するプロトコルに従って切断反応を行い、反応後の溶液を還元SDS-PAGEに供してからCBB R-250(バイオラッド社製)にて染色を行った。その結果、いずれの株においても目的のPInsと同じ分子量を有するタンパク質バンドが検出された。これらのタンパク質バンドのN末端アミノ酸配列を、プロテインシークエンサーPPSQ-21A(島津製作所製)を用いて決定したところ、いずれもPInsのN末端配列が確認出来た事から、融合させたペプチドがFactor Xaプロテアーゼにより切断され目的のPInsが生成している事が確認出来た。
(1)ヒト成長ホルモンhGH遺伝子の全合成とCorynebacterium glutamicumにおけるヒト成長ホルモンhGH分泌発現プラスミドの構築
ヒト成長ホルモン(human growth hormone;hGH)のアミノ酸配列は既に決定されている(Genbank Accession No. CAA23779.1)。この配列のうちN末端のシグナル配列26残基を除いた成熟型hGHのアミノ酸配列とC. glutamicumのコドン使用頻度を考慮して、<配列番号52>〜<配列番号65>に示したDNAを合成した。これらのDNAを鋳型とし、別途合成した<配列番号66>と<配列番号67>に示したDNAをプライマーとして用いて、hGH遺伝子をPCR法によって増幅し、<配列番号68>に記した約0.6kbpのDNA断片を得た。このDNA断片をクローニングベクターpHSG398(タカラバイオ社製)のSmaI部位に挿入する事によりpHSG-hGHを得た。このpHSG-hGHを鋳型にして、<配列番号66>と<配列番号67>に示したDNAをプライマーとして用いて、hGH遺伝子領域をPCR法によって増幅し、約0.6kbpのhGH遺伝子断片を得た。次にWO01/23591記載のpPKSPTG1(pPKSPTG1は、プロトランスグルタミナーゼ(プロ構造部付きトランスグルタミナーゼ)の分泌発現用ベクターであって、C. glutamicum ATCC13869株由来のcspB遺伝子のプロモーター、同プロモーターの下流に発現可能に連結されたC. ammoniagenes (C. stationis) ATCC6872株由来のCspA(SlpA)<Genbank Accession No. BAB62413.1>のシグナルペプチド25アミノ酸残基をコードするDNA、および同シグナルペプチドをコードするDNAの下流に同シグナルペプチドとの融合タンパク質として発現するよう連結されたS. mobaraense由来のプロトランスグルタミナーゼ遺伝子を有する)、およびWO01/23591記載のpPKPTG1(C. glutamicum ATCC13869株由来のCspBのプロモーター領域とシグナルペプチドをコードするDNAを含む)を鋳型として、<配列番号12>と<配列番号69>、または<配列番号12>と<配列番号70>に示したプライマーを用いて、C. glutamicum ATCC13869由来CspBのプロモーター領域、およびC. ammoniagenes (C. stationis) ATCC6872株由来CspAまたはC. glutamicum ATCC13869株由来CspBのシグナルペプチドをコードする領域をPCR法にて増幅し、それぞれ約0.7kbpのDNA断片を得た。更に、増幅させた両DNA断片(hGH遺伝子断片と、CspBプロモーター領域および各シグナルペプチドをコードする領域の断片)を鋳型に、<配列番号12>と<配列番号67>に記載のDNAをプライマーとして用いたPCR法により、両DNA断片が融合したそれぞれ約1.2kbpのDNA断片を得た。なお、<配列番号12>と<配列番号67>のプライマーには制限酵素Kpn Iの認識配列がデザインされており、<配列番号69>、<配列番号70>の各プライマーは各シグナルペプチドをコードする領域とhGH遺伝子との融合遺伝子を構築するためのhGHのN末端アミノ酸残基をコードする配列がデザインされている。PCR反応にはPyrobest DNA polymerase(タカラバイオ社製)を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。これらのDNA断片を制限酵素Kpn I処理後に、特開平9-322774に記載のpPK4のKpn I部位に挿入することによって、それぞれpPS-hGH, pPK-hGHを得た。挿入断片の塩基配列決定の結果、予想通りの融合遺伝子が構築されていることを確認した。なお、全ての塩基配列の決定はBigDye(登録商標)Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(アプライドバイオシステムズ社製)と3130 ジェネティックアナライザ(アプライドバイオシステムズ社製)を用いて行った。
実施例3(1)で構築したpPKK6Xa-PIns、pPKK17Xa-PIns、pPKK50Xa-PInsのそれぞれを鋳型として、<配列番号12>と<配列番号71>、<配列番号12>と<配列番号72>、<配列番号12>と<配列番号73>のそれぞれに示した各合成DNAをプライマーとして、CspBプロモーター領域、ならびにCspBのN末端のシグナルペプチド30アミノ酸残基、CspB成熟タンパク質のN末端アミノ酸残基(6、17、50残基)、およびFactor Xaプロテアーゼ認識配列(IEGR)をコードする領域をPCR法にて増幅した。一方、実施例4(1)で構築したプラスミドpPS-hGHを鋳型とし、<配列番号66>と<配列番号67>に示した合成DNAをプライマーとして、hGH遺伝子領域をPCR法にて増幅した。更に、増幅させた両DNA断片(CspBプロモーター領域、ならびにCspBシグナルペプチド、成熟CspBのN末端アミノ酸残基、およびIEGRをコードする領域の各断片と、hGH遺伝子断片)を鋳型に、<配列番号12>と<配列番号67>に記載のDNAをプライマーとして用いたPCR法により、両DNA断片が融合したDNA断片を得た。なお、<配列番号12>と<配列番号67>のプライマーは制限酵素Kpn Iの認識配列がデザインされており、<配列番号71>、<配列番号72>、<配列番号73>の各プライマーはFactor Xaプロテアーゼ認識配列(IEGR)をコードする領域とhGH遺伝子との融合遺伝子を構築するためのhGHのN末端アミノ酸残基をコードする配列がデザインされている。PCR反応にはPyrobest DNA polymerase(タカラバイオ社製)を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。これらのDNA断片を制限酵素Kpn I処理後に、特開平9-322774に記載のpPK4のKpn I部位に挿入することによって、それぞれpPKK6Xa-hGH, pPKK17Xa-hGH, pPKK50Xa-hGHを得た。
実施例4(1)で構築したC. ammoniagenes (C. stationis) ATCC6872のCspAのシグナル配列もしくはC. glutamicum ATCC13869のCspBのシグナル配列をそれぞれ用いたヒト成長ホルモンhGHの分泌発現プラスミドであるpPS-hGHとpPK-hGH、実施例4(2)で構築したC. glutamicum ATCC13869のCspBのシグナル配列に接続したCspBの成熟タンパク質N末端アミノ酸残基を融合したhGHの分泌発現プラスミドであるpPKK6Xa-hGH、pPKK17Xa-hGH、pPKK50Xa-hGH、および実施例4(3)で構築したC. ammoniagenes (C. stationis) ATCC6872のCspAのシグナル配列に接続したCspBの成熟タンパク質N末端アミノ酸残基を融合したhGHの分泌発現プラスミドであるpPSK6Xa-hGH、pPSK17Xa-hGH、pPSK50Xa-hGHを用いて、WO2004/029254に記載のC. glutamicum YDK010株を形質転換した。得られた各形質転換体を、25 mg/lのカナマイシンを含むMM液体培地(グルコース 120 g、硫酸マグネシウム七水和物 3g、硫酸アンモニウム 30g、リン酸二水素カリウム 1.5g、硫酸鉄七水和物 0.03g、硫酸マンガン四水和物 0.03g、チアミン塩酸塩 0.45mg、ビオチン 0.45mg、DL-メチオニン0.15g、および炭酸カルシウム 50gを水で1LにしてpH7.0に調整)で30 ℃、72時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清を還元SDS-PAGEに供してからCBB R-250(バイオラッド社製)にて染色を行った。その結果、pPS-hGHならびにpPK-hGHを有する株では目的のタンパク質バンドが検出されなかったが、成熟CspBのN末端アミノ酸残基との融合hGH発現プラスミドであるpPKK6Xa-hGH, pPKK17Xa-hGH, pPKK50Xa-hGH, pPSK6Xa-hGH, pPSK17Xa-hGH, pPSK50Xa-hGHを有する YDK010株では、シグナル配列の違いに因らずに、いずれも目的の融合タンパク質のタンパク質バンドを検出する事ができた(図2、図3)。さらに、これら分泌量の向上が確認された各融合タンパク質のN末端アミノ酸残基配列をプロテインシークエンサーPPSQ-21A(島津製作所製)で決定しようと試みたところ、いずれもN末端アミノ酸残基が決定されなかった事から、後述する結果を考慮し、これら融合タンパク質のN末端アミノ酸残基残基はピログルタミン酸残基に変換されている事が確認された。
実施例4(1)で構築したC. glutamicum ATCC13869のCspBのシグナル配列を用いたヒト成長ホルモンhGHの分泌発現プラスミドであるpPK-hGH、および実施例4(2)で構築したC. glutamicum ATCC13869のCspBのシグナル配列に接続したCspBの成熟タンパク質N末端アミノ酸残基を融合したhGHの分泌発現プラスミドであるpPKK6Xa-hGHを用いて、C. glutamicum ATCC13869株およびC. ammoniagenes (C. stationis) ATCC6872株を形質転換した。得られた各形質転換体を、25 mg/lのカナマイシンを含むMM液体培地(グルコース 120 g、硫酸マグネシウム七水和物 3g、硫酸アンモニウム 30g、リン酸二水素カリウム 1.5g、硫酸鉄七水和物 0.03g、硫酸マンガン四水和物 0.03g、チアミン塩酸塩 0.45mg、ビオチン 0.45mg、DL-メチオニン0.15g、および炭酸カルシウム 50gを水で1LにしてpH7.0に調整)でそれぞれ30 ℃、72時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清を還元SDS-PAGEに供してからCBB R-250(バイオラッド社製)にて染色を行った。その結果、pPK-hGHを有する株では目的のタンパク質バンドが検出されなかったが、成熟CspBのN末端6アミノ酸残基との融合hGH発現プラスミドであるpPKK6Xa-hGHを有する株では、いずれの株においても目的の融合タンパク質のタンパク質バンドを検出する事ができた(図4)。さらに、これら分泌量の向上が確認された各融合タンパク質のN末端アミノ酸残基配列をプロテインシークエンサーPPSQ-21A(島津製作所製)で決定しようと試みたところ、いずれもN末端アミノ酸残基が決定されなかった事から、後述する結果を考慮し、これら融合タンパク質のN末端アミノ酸残基残基はピログルタミン酸残基に変換されている事が確認された。
C. ammoniagenes (C. stationis) ATCC6872の主要な細胞表層タンパク質であるCspAのアミノ酸配列は既に決定されている(Genbank Accession No. BAB62413.1)。実施例4(3)で構築したpPSK6Xa-hGHを鋳型として、<配列番号12>と<配列番号77>に示した合成DNAをプライマーとして、CspBプロモーター領域と、C. ammoniagenes (C. stationis) ATCC6872由来CspAのN末端のシグナルペプチド25アミノ酸残基をコードする領域をPCR法にて増幅した。一方、実施例4(1)で構築したプラスミドpPS-hGHを鋳型とし、<配列番号78>と<配列番号67>に示した合成DNAをプライマーとしてhGH遺伝子領域をPCR法にて増幅した。更に、増幅させた両DNA断片(CspBプロモーター領域およびCspAシグナルペプチドをコードする領域の断片と、hGH遺伝子断片)を鋳型に、<配列番号12>と<配列番号67>に記載のDNAをプライマーとして用いたPCR法により、両DNA断片が融合したDNA断片を得た。なお、<配列番号12>と<配列番号67>のプライマーは制限酵素Kpn Iの認識配列がデザインされている。また、<配列番号77>と<配列番号78>のプライマーは融合遺伝子を構築するための配列としてC. ammoniagenes (C. stationis)ATCC6872のCspA成熟タンパク質のN末端配列6アミノ酸残基をコードする配列がデザインされており、得られた融合DNA断片においては、CspAシグナルペプチドをコードする領域とhGH遺伝子との間にCspA成熟タンパク質のN末端配列6アミノ酸残基をコードする配列が挿入されている。なお、CspA成熟タンパク質のN末端6アミノ酸残基のアミノ酸配列は、Ala-Glu-Lys-Thr-Pro-Ala(AEKTPA)(配列番号107)であり、Gln-Glu-Thr(QET)を含まない。PCR反応にはPyrobest DNA polymerase(タカラバイオ社製)を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。これらのDNA断片を制限酵素Kpn I処理後に、特開平9-322774に記載のpPK4のKpn I部位に挿入することによって、pPSS6-hGHを得た。
(1)Corynebacterium glutamicum ATCC13869の細胞表層タンパク質CspBの成熟タンパク質N末端アミノ酸残基を融合したインスリン様成長因子hIGF-1の分泌発現プラスミドの構築
ヒトインスリン様成長因子(human insulin-like growth factor-1;hIGF-1)のアミノ酸配列は既に決定されている(J Biol Chem, 1978. 253(8): p.2769-76)。このhIGF-1のアミノ酸配列とC. glutamicumのコドン使用頻度を考慮して構築されたhIGF-1遺伝子が搭載された特開2008-271973記載のプラスミドpPSIGFmを鋳型とし、<配列番号79>と<配列番号80>に示した合成DNAをプライマーとして、hIGF-1遺伝子領域をPCR法にて増幅した。次に実施例1(2)で構築したpPKK6PInsを鋳型として、<配列番号12>と<配列番号81>に示した各合成DNAをプライマーとして、CspBプロモーター領域、ならびにCspBのN末端のシグナルペプチド30アミノ酸残基およびCspB成熟タンパク質のN末端6アミノ酸残基をコードする領域をPCR法にて増幅した。更に、増幅させた両DNA断片(hIGF-1遺伝子断片と、CspBプロモーター領域、ならびにCspBシグナルペプチドおよびCspBのN末端アミノ酸配列6残基をコードする領域の断片)を鋳型に、<配列番号12>と<配列番号80>に記載のDNAをプライマーとして用いたPCR法により、両DNA断片が融合したDNA断片を得た。なお、<配列番号12>と<配列番号80>のプライマーは制限酵素Kpn Iの認識配列がデザインされており、<配列番号79>と<配列番号81>のプライマーはCspB成熟タンパク質のN末端6アミノ酸残基をコードする配列とhIGF-1遺伝子との融合遺伝子を構築するための成熟CspBのN末端アミノ酸残基をコードする配列とhIGF-1のN末端アミノ酸残基をコードする配列がそれぞれデザインされている。PCR反応にはPyrobest DNA polymerase(タカラバイオ社製)を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。これらのDNA断片を制限酵素Kpn I処理後に、特開平9-322774に記載のpPK4のKpn I部位に挿入することによって、pPKK6IGFmを得た。
特開2008-271973 記載のインスリン様成長因子hIGF-1の分泌発現プラスミドであるpPSIGFmならびに、実施例5(1)で構築したCspBの成熟タンパク質N末端アミノ酸残基を融合したhIGF-1の分泌発現プラスミドであるpPKK6IGFm、pPSK6IGFmを用いて、WO2004/029254に記載のC. glutamicum YDK010株を形質転換した。得られた各形質転換体を、25 mg/lのカナマイシンを含むMM液体培地(グルコース 120 g、硫酸マグネシウム七水和物 3g、硫酸アンモニウム 30g、リン酸二水素カリウム 1.5g、硫酸鉄七水和物 0.03g、硫酸マンガン四水和物 0.03g、チアミン塩酸塩 0.45mg、ビオチン 0.45mg、DL-メチオニン0.15g、および炭酸カルシウム 50gを水で1LにしてpH7.0に調整)でそれぞれ30 ℃、72時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清を還元SDS-PAGEに供してからCBB R-250(バイオラッド社製)にて染色を行った。その結果、pPKK6IGFm、pPSK6IGFmいずれのプラスミドを導入した株においても、明確な目的の分子量を有する融合タンパク質バンドが検出され、成熟CspBのN末端アミノ酸を融合させていないhIGF-1を発現するpPSIGFm導入株に比べて、有意に分泌量が向上している事が確認された。さらに、デンシトメーターを用いて分泌量を定量したところ、hIGF-1の分泌量は、pPSIGFm導入株に比べて、成熟CspBのN末端アミノ酸を融合させたhIGF-1を発現するpPKK6IGFm、pPSK6IGFmいずれのプラスミドを導入した株でも増加している事が確認された(表4)。さらに、これら分泌量の向上が確認された各融合タンパク質のN末端アミノ酸配列をプロテインシークエンサーPPSQ-21A(島津製作所製)で決定しようと試みたところ、いずれもN末端アミノ酸残基が決定されなかった事から、後述する結果を考慮し、これら融合タンパク質のN末端アミノ酸残基はピログルタミン酸残基に変換されている事が確認された。
(1)生理活性ペプチドTeriparatideの全合成とCorynebacterium glutamicumにおける生理活性ペプチドTeriparatide分泌発現プラスミドの構築
ヒトの副甲状腺ホルモンPTHの成熟体のアミノ酸配列は既に決定されている(Genbank Accession No. AAA60215.1)。このヒトの副甲状腺ホルモンPTHのN末端1-34残基までのペプチドは、骨粗鬆薬としての生理活性を有するペプチドTeriparatideとして知られている。このTeriparatideのアミノ酸配列とC. glutamicumのコドン使用頻度を考慮して、<配列番号82>と<配列番号83>に示したDNAを合成した。このDNAを鋳型とし、別途合成した<配列番号84>と<配列番号85>に示したDNAをプライマーとして用いて、<配列番号86>に記したTeriparatide遺伝子をPCR法によって増幅した。このDNA断片をクローニングベクターpHSG398(タカラバイオ社製)のSma I部位に挿入する事によりpHSG-Teriを得た。このpHSG-Teriを鋳型にして、<配列番号84>と<配列番号85>に示したDNAをプライマーとして用いて、Teriparatide遺伝子領域をPCR法によって増幅した。次にWO01-23591記載のpPKSPTG1(C. glutamicum ATCC13869株由来のCspBのプロモーター領域と、C. ammoniagenes (C. stationis) ATCC6872株由来のCspA(SlpA)シグナルペプチドをコードするDNAを含む)、およびWO01/23591記載のpPKPTG1(C. glutamicum ATCC13869株由来のCspBのプロモーター領域とシグナルペプチドをコードするDNAを含む)を鋳型として、<配列番号12>と<配列番号87>もしくは<配列番号12>と<配列番号88>に示したプライマーを用いて、C. glutamicum ATCC13869由来CspBのプロモーター領域、およびC. ammoniagenes (C. stationis) ATCC6872株由来CspAまたはC. glutamicum ATCC13869株由来CspBのシグナルペプチドをコードする領域をPCR法にて増幅した。更に、増幅させた両DNA断片(Teriparatide遺伝子断片と、CspBプロモーター領域および各シグナルペプチドをコードする領域の断片)を鋳型に、<配列番号12>と<配列番号85>に記載のDNAをプライマーとして用いたPCR法により、両DNA断片が融合したそれぞれ約0.8kbpのDNA断片を得た。なお、<配列番号12>と<配列番号85>のプライマーには制限酵素Kpn Iの認識配列がデザインされており、<配列番号87>と<配列番号88>の各プライマーは各シグナルペプチドをコードする領域とTeriparatide遺伝子との融合遺伝子を構築するためのTeriparatideのN末端アミノ酸残基をコードする配列がデザインされている。PCR反応にはPyrobest DNA polymerase(タカラバイオ社製)を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。これらのDNA断片を制限酵素Kpn I処理後に、特開平9-322774に記載のpPK4のKpn I部位に挿入することによって、それぞれpPS-Teri, pPK-Teriを得た。
実施例6(1)で構築したC. ammoniagenes (C. stationis) ATCC6872のCspAのシグナル配列もしくはC. glutamicum ATCC13032のCspBのシグナル配列をそれぞれ用いた生理活性ペプチドTeriparatideの分泌発現プラスミドであるpPS-TeriとpPK-Teri、および実施例6(1)で構築したC. glutamicum ATCC13032のCspBのシグナル配列に接続したCspBの成熟タンパク質N末端アミノ酸6残基を融合したTeriparatideの分泌発現プラスミドであるpPKK6Xa-Teriを用いて、WO2004/029254に記載のC. glutamicum YDK010株を形質転換した。得られた各形質転換体を、25 mg/lのカナマイシンを含むMM液体培地(グルコース 120 g、硫酸マグネシウム七水和物 3g、硫酸アンモニウム 30g、リン酸二水素カリウム 1.5g、硫酸鉄七水和物 0.03g、硫酸マンガン四水和物 0.03g、チアミン塩酸塩 0.45mg、ビオチン 0.45mg、DL-メチオニン0.15g、および炭酸カルシウム 50gを水で1LにしてpH7.0に調整)でそれぞれ30 ℃、72時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清を還元SDS-PAGEに供してからCBB R-250(バイオラッド社製)にて染色を行った。その結果、pPS-TeriならびにpPK-Teriを有する株では目的のタンパク質バンドが検出されなかったが、CspBのN末端残基との融合Teriparatide発現プラスミドであるpPKK6Xa-Teriを有する YDK010株では、目的の融合タンパク質のタンパク質バンドを検出する事ができた(図5)。さらに、分泌量の向上が確認された融合タンパク質のN末端アミノ酸配列をプロテインシークエンサーPPSQ-21A(島津製作所製)で決定しようと試みたところ、N末端アミノ酸残基が決定されなかったが、ピログルタミン酸アミノペプチダーゼ処理を行った後にプロテインシークエンサーPPSQ-21A(島津製作所製)を用いてN末端アミノ酸配列を決定したところ、目的の融合タンパク質の2番目以降のN末端アミノ酸配列が解読できたことから、培養上清中に、N末端アミノ酸残基がピログルタミル化された目的の融合Teriparatideが分泌発現している事が確認出来た。
配列番号1〜8:プロインスリン全合成用DNAの塩基配列
配列番号9、10:プライマー
配列番号11:プロインスリン遺伝子の塩基配列
配列番号12〜51:プライマー
配列番号52〜65:ヒト成長ホルモンhGH全合成用DNAの塩基配列
配列番号66、67:プライマー
配列番号68:hGH遺伝子の塩基配列
配列番号69〜85:プライマー
配列番号86:Teriparatide遺伝子の塩基配列
配列番号87〜90:プライマー
配列番号91:C. glutamicum由来PS1のシグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号92:C. glutamicum由来PS2(CspB)のシグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号93:C. ammoniagenes (C. stationis)由来SlpA(CspA)のシグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号94:C.glutamicum ATCC13869のcspB遺伝子の塩基配列
配列番号95:C.glutamicum ATCC13869のCspBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号96:C.glutamicum ATCC13869のCspB成熟タンパク質のアミノ酸配列
配列番号97〜101:C.glutamicum由来CspBホモログの成熟タンパク質のN末端6アミノ酸残基のアミノ酸配列
配列番号102〜104:本発明で用いられる挿入配列の一態様のアミノ酸配列
配列番号105:Factor Xaプロテアーゼの認識配列
配列番号106:ProTEVプロテアーゼの認識配列
配列番号107:C. ammoniagenes (C. stationis) ATCC6872のCspA成熟タンパク質のN末端6アミノ酸残基のアミノ酸配列
Claims (9)
- 異種タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物を有するコリネ型細菌を培養し、分泌生産された異種タンパク質を回収することを含む、異種タンパク質の製造方法であって、
前記遺伝子構築物が、コリネ型細菌で機能するプロモーター配列、該プロモーター配列の下流に接続されたコリネ型細菌で機能するシグナルペプチドをコードする核酸配列、および該シグナルペプチドをコードする核酸配列の下流に接続されたGln-Glu-Thrを含むアミノ酸配列と異種タンパク質との融合タンパク質をコードする核酸配列を含み、
前記Gln-Glu-Thrを含むアミノ酸配列が、下記A〜Hのアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列である、方法(ただし、前記Gln-Glu-Thrを含むアミノ酸配列が、配列番号96の1〜14位または1〜38位のアミノ酸残基からなる配列である場合を除く):
(A)Gln-Glu-Thr
(B)Gln-Glu-Thr-Xaa1(配列番号102)
(C)Gln-Glu-Thr-Xaa1-Xaa2(配列番号103)
(D)Gln-Glu-Thr-Xaa1-Xaa2-Xaa3(配列番号104)
(E)Gln-Glu-Thrに成熟CspBの4〜7位のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列
(F)Gln-Glu-Thrに成熟CspBの4〜8位のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列
(G)Gln-Glu-Thrに成熟CspBの4〜17位のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列
(H)Gln-Glu-Thrに成熟CspBの4〜50位のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列
前記アミノ酸配列において、Xaa1はAsn、Gly、Thr、Pro、またはAlaであり、Xaa2はPro、Thr、またはValであり、Xaa3はThrまたはTyrである。 - 前記Gln-Glu-Thrを含むアミノ酸配列が、Gln-Glu-Thr-Asn-Pro-Thr(配列番号97)、Gln-Glu-Thr-Gly-Thr-Tyr(配列番号98)、Gln-Glu-Thr-Thr-Val-Thr(配列番号99)、Gln-Glu-Thr-Pro-Val-Thr(配列番号100)、およびGln-Glu-Thr-Ala-Val-Thr(配列番号101)からなる群より選択されるアミノ酸配列である、請求項1に記載の方法。
- 前記遺伝子構築物が、Gln-Glu-Thrを含むアミノ酸配列をコードする核酸配列と異種タンパク質をコードする核酸配列との間に、さらに、酵素的切断に使用されるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記酵素的切断に使用されるアミノ酸配列が、Factor Xaプロテアーゼの認識配列またはProTEVプロテアーゼの認識配列である、請求項3に記載の方法。
- 前記プロテアーゼの認識配列が、配列番号105または106に示すアミノ酸配列である、請求項4に記載の方法。
- 前記コリネ型細菌で機能するシグナルペプチドが、コリネ型細菌由来のCspBのシグナルペプチドである、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記CspBのシグナルペプチドが配列番号92に示すアミノ酸配列を有する、請求項6に記載の方法。
- 前記培養されるコリネ型細菌がコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属する細菌である、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記培養されるコリネ型細菌がコリネバクテリウム・グルタミカムまたはコリネバクテリウム・スタティオニスである、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
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