KR20050106502A

KR20050106502A - 미생물 트랜스글루타미나제의 제조방법

Info

Publication number: KR20050106502A
Application number: KR1020057016640A
Authority: KR
Inventors: 유키코 우메자와; 게이이치 요코야마; 요시미 기쿠치; 마사요 다테; 노리마사 오니시
Original assignee: 아지노모토 가부시키가이샤
Priority date: 2003-03-07
Filing date: 2004-03-05
Publication date: 2005-11-09
Also published as: US20100159560A1; JPWO2004078973A1; WO2004078973A1; CA2518049A1; RU2005127869A; ATE496995T1; CN1759180A; RU2316594C2; US8105802B2; JP4482938B2; ES2356149T3; EP1602722B1; EP1602722A4; DE602004031198D1; CN100381569C; CA2518049C; US7704707B2; DK1602722T3; EP1602722A1; US20060019367A1

Abstract

본 발명에 의해, 미생물 유래 프로트랜스글루타미나제의 프로 구조부를 선택적으로 절단하는, 방선균 유래 중성 메탈로프로테아제 및 이를 암호화하는 유전자가 제공된다. 본 발명의 방선균 유래 중성 메탈로프로테아제를 암호화하는 유전자를 도입하였다.

Description

미생물 트랜스글루타미나제의 제조방법{Process for producing microbial transglutaminase}

본 발명은, 방선균에 의해 생산되는 프로트랜스글루타미나제의 프로 구조부를 효율적으로 절단하여, 활성형 트랜스글루타미나제로 전환시키는 신규 프로테아제 및 이를 암호화하는 핵산 분자에 관한 것이다.

또한 본 발명은, 상기 프로테아제를 사용하여, 활성형 미생물 유래 트랜스글루타미나제를 제조하는 방법에 관한 것이다.

또한 본 발명은, 상기 중성 메탈로프로테아제의 제조법에 관한 것이다.

트랜스글루타미나제는 단백질의 펩티드 쇄내에 있는 γ-카복시아미드 그룹의 아실 전이반응을 촉매하는 효소이다. 본 효소를 단백질에 작용시키면, ε-(γ-Glu)-Lys 가교 형성 반응, Gln의 탈아미드화에 의한 Glu 잔기로의 전환 반응이 일어날 수 있다. 이러한 트랜스글루타미나제는, 젤리 등의 겔화 식품, 요구르트, 치즈 또는 겔상 화장품 등의 제조나 식육의 육질 개선 등에 이용되고 있다[참조: 일본 특허공보 제(평)1-50382호]. 또한, 열에 안정적인 미세캡슐의 소재, 고정화 효소의 담체 등의 제조에 이용되고 있는 등, 산업상 이용성이 높은 효소이다.

트랜스글루타미나제에는 활성 발현이 칼슘 의존성인 동물 유래 트랜스글루타미나제 및 칼슘 비의존성인 미생물 유래 트랜스글루타미나제(미생물 트랜스글루타미나제: 이하「MTG」라고 한다)가 공지되어 있다. MTG로서는, 지금까지 스트렙토베르티실리움속(Streptoverticillium)의 균으로부터 발견된 것이 공지되어 있다. 이러한 스트렙토베르티실리움속으로서는, 예를 들면, 스트렙토베르티실리움·그리세오카르늄(Streptoverticillium griseocarneum) IFO 12776, 스트렙토베르티실리움·신나모늄(Streptoverticillium cinnamoneum sub sp. cinnamoneum) IFO 12852, 스트렙토베르티실리움·모바라엔스(Streptoverticillium mobaraense, 이하, 에스. 모바라엔스라고 약칭하는 경우가 있다) IFO 13819 등이 예시되어 있다[참조: 일본 공개특허공보 제(소)64-27471호].

그러나 이들은 상기 균류 등의 배양물로부터 정제 작업을 거쳐 제조되어 있었기 때문에, 공급량, 효율 등의 점에서 문제가 있었다. 그래서, 이종 단백질을 효율적으로 분비하는 방법으로서, 숙주로서 코리네형 세균을 선택하고, 코리네형 세균 유래의 시그날 펩티드의 하류에 트랜스글루타미나제가 접합된 융합 단백질을 생성시키고, 이를 균체 외부로 효율적으로 분비시켜, 고수율의 트랜스글루타미나제를 수득하는 방법이 확립되었다[참조: WO 01/23591]. 여기서는, MTG에 프로 구조부가 부가된 불활성형의 프로트랜스글루타미나제(이하,「프로 MTG」라고 한다)의 형태로 분비시키고, 분비후 프로테아제에 의해서 프로 MTG의 프로 구조부를 절단시켜 활성을 갖는 트랜스글루타미나제로 전환시키는 방법 및 방선균 유래의 세린프로테아제인 SAM-P45를, 프로 MTG를 생산하는 코리네형 세균에 필요 충분량 공발현시킴으로써, 배양액 중에 직접 활성형의 트랜스글루타미나제를 생성시키는 방법이 개시되어 있다.

그러나, 코리네형 세균에서 프로 MTG와 이의 프로 구조부를 절단시키는 프로테아제를 동시-발현시켜 배양액에 직접 활성형의 트랜스글루타미나제를 생성시키는 방법은, 대단히 효율적인 트랜스글루타미나제 제조방법이 될 것으로 추정되지만, SAM-P45는 이의 기질 특이성이 엄격하지 않고, 프로 MTG의 프로 구조부뿐만 아니라, 트랜스글루타미나제 본체를 어느 정도 소화 분해하는 경우도 있기 때문에, 이의 취급은 반드시 간편하다고만은 할 수 없다. 따라서, SAM-P45를 사용하는 경우에는, 배양액 중에 생성된 트랜스글루타미나제의 분해가 일어나지 않도록, 트랜스글루타미나제 제조의 공정 관리를 엄밀하게 실시할 필요가 있다.

따라서, 활성형 트랜스글루타미나제를 유리하게 제조하기 위해서, 프로 MTG의 프로 구조부만을 선택적으로 분해하고, 트랜스글루타미나제 본체의 과분해를 가능한한 일으키지 않는 프로테아제에 대한 요구가 여전히 존재하고 있었다.

프로 MTG의 프로 구조부를 절단하는 효소로서는, SAM-P45 이외에는, 바실러스·폴리믹사(Bacillus polymyxa) 유래의 디스파제가 공지되어 있다[참조: Eur. J. Biochem., 257권, 570-576 페이지(1998년)]. 그러나, 프로 구조부의 절단에 대량의 효소가 필요하고, 트랜스글루타미나제 본체가 과분해될 우려가 있다. 또한, 디스파제는 세포 배양용 시약이고, 산업용 효소로서는 고가이다.

도 1은 SVP35 및 SVP70의 활성의 pH 의존성을 도시한 그래프이다.

도 2는 SVP35 및 SVP70의 pH 안정성을 도시한 그래프이다.

도 3은 SVP35 및 SVP70의 활성의 온도 의존성을 도시한 그래프이다.

도 4는 SVP35의 온도 안정성을 도시한 그래프이다.

도 5는 SVP35 및 SVP70의 활성에 대한 각종 화합물의 억제 활성을 도시한다.

도 6은 SVP35 및 SVP70에 의한, 프로 MTG의 활성형 MTG로의 전환의 경시 변화를 단백질량의 변화로서 각각 도시한 도면이다.

도 7은 SVP70 및 SAM-P45를 프로 MTG에 작용시킨 경우의, 트랜스글루타미나제 활성의 경시 변화를 도시한 그래프이다. (A): SVP70 첨가, ●: 기질에 대하여 1/200량을 첨가, ■: 기질에 대하여 1/500량을 첨가; (B): SAM-P45 첨가, ●: 기질에 대하여 1/10량을 첨가, ■: 기질에 대하여 1/50량을 첨가.

도 8은 SVP70 및 SAM-P45를 프로 MTG에 작용시킨 경우의, MTG 단백질량의 경시 변화를 도시한 그래프이다. (A): SVP70 첨가, ●: 기질에 대하여 1/200량을 첨가, ■: 기질에 대하여 1/500량을 첨가; (B): SAM-P45 첨가, ●: 기질에 대하여 1/10량을 첨가, ■: 기질에 대하여 1/50량을 첨가.

상술한 바과 같이, 활성형 트랜스글루타미나제를 유리하게 제조하기 위해서, 프로 MTG의 프로 구조부만을 선택적으로 분해하고, 트랜스글루타미나제 본체의 과분해를 가능한 한 일으키지 않는 프로테아제가 여전히 요망되고 있었다. 또한, 프로 MTG의 프로 구조부만을 선택적으로 분해하고, 트랜스글루타미나제 본체의 과분해를 가능한 한 일으키지 않는 프로테아제를 이용할 수 있는 경우, 활성형 트랜스글루타미나제의 제조에 유리할 것으로 생각되었다. 또한, 프로 MTG의 프로 구조부를 선택적으로 분해하는, 트랜스글루타미나제 제조에 유용한 프로테아제는, 코리네형 세균을 사용하여, 용이하게 균체 외부로 분비할 수 있는 것이면, 프로 MTG와 함께 공발현시킴으로써 배양액에 직접 활성형의 트랜스글루타미나제를 생성시킬 수 있기 때문에, 보다 바람직하다고 생각되었다.

따라서, 본 발명의 목적은, 프로 MTG의 프로 구조부를 선택적으로 절단하는, 트랜스글루타미나제 제조에 유용한 프로테아제를 제공하는 것이다.

특히, 본 발명의 목적은, 프로 MTG의 프로 구조부를 선택적으로 절단하는 프로테아제로서, 코리네형 세균을 숙주로서 생산할 수 있으며, 용이하게 균체 외부로 분비할 수 있는 프로테아제를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은, 상기 프로테아제를 암호화하는 핵산 분자를 제공하는 경우도 있다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 프로테아제를 사용하여 MTG를 효율적으로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

또한 본 발명은, 상기 프로테아제를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은, 프로 MTG의 프로 구조 부분을 선택적으로 분해하지만 트랜스글루타미나제 자체의 분해를 가능한 한 일으키지 않는 프로테아제를 탐색하여, 방선균으로부터 이러한 성질을 갖는 중성 메탈로프로테아제를 단리 정제할 수 있었다. 본 발명자들은 상기 프로테아제를 암호화하는 DNA도 수득하여, 이를 코리네형 세균에 도입하여, 코리네형 세균을 숙주로 한 분비 발현에 성공하였다. 또한 실제로 본 효소를 프로 MTG에 작용시키고 프로 구조부를 절단시켜 활성형 트랜스글타미나제를 회수할 수 있었다. 또한, 동등한 기능을 갖는 타 기원의 미생물 유래 중성 메탈로프로테아제를 밝혀내고, 마찬가지로 활성형 MTG의 제조에 유용한 것도 밝혀내어 본 발명을 완성하기 이르렀다.

즉, 본 발명은 방선균 유래의 프로 MTG 프로 구조부의 절단 선택성이 높은 중성 메탈로프로테아제 및 이들을 암호화하는 핵산 분자이다.

또한 본 발명은 중성 메탈로프로테아제에 의해 프로 MTG의 프로 구조 부분을 절단함을 특징으로 하는, 활성형 MTG의 제조방법이다.

또한, 본 발명은 상기 중성 메탈로프로테아제를 암호화하는 핵산 분자를 코리네형 세균에 도입하여, 상기 핵산 분자가 도입된 코리네형 세균을 배양하고, 이에 의해 상기 중성 메탈로프로테아제를 발현시켜 균체 외부로 분비된 상기 메탈로프로테아제를 회수함을 특징으로 하는, 상기 메탈로프로테아제 제조방법이기도 하다.

보다 구체적으로는, 본 발명은 이하의 성질을 갖는 방선균 유래의 중성 메탈로프로테아제 SVP35이다:

1) 분자량: 약 35,000(SDS-PAGE에 의한 측정)

2) 최적 pH: 6.0 내지 8.0, 보다 구체적으로는 6.5 내지 7.5, 특히 7.0 부근

3) pH 안정성: pH 4 내지 10

4) 최적 온도: 약 45℃

5) 온도 안정성: 약 50℃ 이하에서 안정

6) 메탈로프로테아제 억제제인 에틸렌디아민4아세트산, 1,10-페난트롤린 및 포스포르아미돈, 또한 방선균 유래 서브틸리신 억제 단백질(SSI)에 의해 강하게 억제된다.

또한, 본 발명은 이하의 성질을 갖는 방선균 유래의 중성 메탈로프로테아제 SVP70이다:

1) 분자량: 약 71,000(SDS-PAGE에 의한 측정)

2) 최적 pH: 6.0 내지 8.0의 범위, 보다 구체적으로는 6.5 내지 7.5, 특히 7.0 부근

3) pH 안정성: pH 5 내지 10

4) 최적 온도: 50 내지 55℃의 범위, 특히 55℃ 부근

5) 메탈로프로테아제 억제제인 에틸렌디아민4아세트산, 1,10-페난트롤린 및 포스포르아미돈, SH-환원제인 디티오트레이톨, 또한 방선균 유래의 서브틸리신 억제 단백질(SSI)에 의해 강하게 억제된다.

또한, 본 발명은 상기 SVP35 또는 SVP70을 암호화하는 핵산 분자이다.

또한, 본 발명은 상기 SVP35 또는 SVP70에 의해 프로 MTG의 프로 구조 부분을 절단함을 특징으로 하는, 활성형 MTG의 제조방법이다.

또한, 본 발명은 상기 SVP35 또는 SVP70을 암호화하는 핵산 분자를 코리네형 세균에 도입하고, 상기 핵산 분자가 도입된 코리네형 세균을 배양하여 균체 외부로 분비된 SVP35 또는 SVP70을 회수함을 특징으로 하는, SVP35 또는 SVP70의 제조방법이다.

일반적으로, 분비형 단백질은 프리펩티드 또는 프리프로펩티드로서 번역된 후, 시그날 펩티드(「프리 부분」)가 절단되어 성숙 펩티드 또는 프로펩티드로 전환되고, 프로펩티드는 프로테아제에 의해 추가로 프로 구조분이라고 불리는 영역이 절단되어 성숙 펩티드로 되는 것이 공지되어 있다. 본 명세서에 있어서, 분비형 단백질의 프로 구조 부분을 간단하게「프로 구조」라고 부르는 경우도 있다. 또한, 본 명세서에 있어서, 「시그날 서열」이란, 분비성 단백질 전구체의 N 말단에 존재하며, 천연의 성숙 단백질에는 존재하지 않는 서열을 말하며, 「시그날 펩티드」란 이와 같은 단백질 전구체로부터 절취되는 펩티드를 말한다. 일반적으로는 시그날 서열은 균체 외부로의 분비에 따라 프로테아제에 의해서 절단된다.

본 명세서에 있어서, 시그날 펩티드를 갖지 않지만, 프로 구조 부분을 갖는 단백질을 「프로단백질」, 예를 들면「프로트랜스글루타미나제」 또는「프로 MTG」라고 칭하는 경우가 있다. 본 명세서에 있어서, 분비형 단백질의 프로 구조 부분을 단순히「프로 구조」 또는「프로 구조부」라고 칭하는 경우가 있으며, 이러한 용어는 상호 교환적으로 사용된다.

본 발명자들은 우선 코리네형 세균에서 용이하게 발현할 수 있을 것으로 추정되는 프로테아제 중, 목적하는 기질 선택 특이성이 높은, 즉 프로 MTG의 프로 구조부를 선택적으로 분해하고, 트랜스글루타미나제 자체의 과분해를 가능한 한 일으키지 않는 프로테아제를 탐색하였다.

본래 방선균에 의해서 MTG가 균체 외부로 분비되는 경우, 우선 프로 MTG로서 분비되고, 분비후 프로 MTG의 프로 구조부가 절단되어 활성형 MTG로 되는 것으로 추정되고 있다[참조: Eur. J. Biochem. 257권, 570-576 페이지(1998년)]. 이로부터, 본 발명자들은 프로 MTG의 프로 구조부를 절단하는 프로테아제가 MTG 생산 방선균내에 존재하는 것으로 예상되었다. 당해 프로테아제는 본래 프로 구조부를 절단하는 프로테아제이기 때문에, 기질 선택성이 높고, 프로 구조부만을 절단하여 MTG 자체로의 작용은 적을 것으로 추정된다.

또한, 방선균 유래의 프로 MTG의 구조 유전자 및 프로테아제 SAM-P45의 구조 유전자 둘다 코리네형 세균에서 효과적으로 발현하고, 이들을 균체 외부로 분비시킬 수 있다. 이러한 정보에 근거하여, 방선균인 MTG 생산균으로부터 목적하는 프로테아제를 밝혀내기 위해 예의 검토한 결과, MTG 생산균 스트렙토베르티실리움·모바라엔스가 프로 MTG의 프로 구조부의 절단 선택성이 높고, 활성형 MTG 생산에 유용한 신규 중성 메탈로프로테아제도 생산하고 있는 것이 밝혀졌다. 본 발명자들은 이러한 중성 메탈로프로테아제를 분리 정제하고, 이의 효소학적 특성을 밝혔다. 또한 본 발명자들은, 당해 메탈로프로테아제의 N 말단 부분 아미노산 서열을 결정하고, 당해 메탈로프로테아제를 암호화하는 유전자를 수득하였다.

또한, 본 발명자들은 당해 효소 유전자를 코리네형 세균에 도입하고, 코리네형 세균을 숙주로서 사용한 시스템에서 발현시킨 결과, 효소를 균체 외부로 분비시킬 수 있었다. 또한 실제로 본 효소를 프로 MTG에 작용시킨 결과, 프로 구조부가 절단되어, 활성형 트랜스글루타미나제가 수득되었다. 또한, 동일한 기능을 갖는 다른 기원의 미생물 유래 중성 메탈로프로테아제도 밝혀졌고, 마찬가지로 활성형 MTG의 제조에 유용한 것이 밝혀졌다.

이하에, 보다 구체적인 본 발명의 실시의 양태를 예시적으로 나타낸다.

본 발명의 중성 메탈로프로테아제는, 스트렙토베르티실리움·모바라엔스, 스트렙토마이세스·그리세우스(Streptomyces griseus), 스트렙토마이세스·켈리칼라(Streptomyces coelicolor) 등의 방선균의 배양 균체 표층 및 배양 상등액으로부터 제조할 수 있다.

이하에서는, 우선, 스트렙토베르티실리움·모바라엔스 IFO13819로부터 신규로 밝혀낸 중성 프로테아제에 관해서 설명한다.

본 발명의 중성 프로테아제를 수득하기 위한 균, 예를 들면 상술한 방선균의 배양은, 방선균의 배양에 통상적으로 사용되는 방법에 따라서 실시할 수 있다. 즉, 배양하기 위한 배지로서는 통상의 탄소원, 질소원, 무기 이온 등을 함유하는 통상의 배지를 이용할 수 있다. 탄소원으로서는 글루코스, 전분, 슈크로스 및 기타를 사용할 수 있다. 질소원으로서는 펩톤, 효모 추출물, 고기 추출물, 맥아 추출물, 암모늄염 및 기타를 필요에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 배양은 호기 조건하에 pH 5.0 내지 8.5, 온도를 15 내지 37℃의 적당한 범위로 제어함으로써 실시할 수 있다. 본 발명의 중성 프로테아제의 제조를 위해서는, 목적하는 중성 메탈로프로테아제의 생산이 최대에 달할 때까지 배양을 계속한 후 정지시키는 것이 바람직하다. 적절한 배양 기간은 온도, pH, 배지에 따라 상이하지만, 일반적으로는 약 1 내지 12일이 바람직하다. 배양후, 원심분리조작 등에 의해 배양물을 균체와 배양 상등액으로 나눈다.

본 발명의 신규 중성 메탈로프로테아제는, 배양 상등액 및 회수한 균체, 특히 균체 표층으로부터 수득할 수 있다. 본 효소를 정제하기 위해서는, 통상적으로 효소를 정제하기 위해서 사용되는 모든 통상적인 방법, 예를 들면 염화암모늄 염석법, 겔 여과법, 이온 교환 크로마토그래피법, 소수성 크로마토그래피법 등을 채택할 수 있다. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 등을 사용함으로써, 더욱 효율적으로 프로테아제를 정제할 수 있다. 이렇게 하여 수득되는 중성 메탈로프로테아제의 효소 활성의 측정은, 프로트랜스글루타미나제의 프로 구조 부분과 성숙 트랜스글루타미나제의 접속 영역을 포함하는 펩티드, 예를 들면, 합성 펩티드 Glu-Pro-Ser-Phe-Arg-Ala-Pro-Asp-Ser(서열 번호 11)[참조: 펩티드켄큐쇼 제조]를 기질로 하여 효소와 반응시켜, 기질의 감소량을 산출함으로써 측정할 수 있다.

상술한 바와 같이, 회수한 균체, 특히 균체 표층 또는 배양 상등액으로부터 추출 정제된 본 발명의 중성 메탈로프로테아제는, 이어서, 기체상 단백질 시퀀서에 의해 N-말단의 아미노산 서열을 분석하여, 부분 아미노산 서열을 결정할 수 있다. 또한, 분리 정제한 중성 메탈로프로테아제의 효소 화학적 성질(최적 pH, pH 안정성, 최적 온도, 온도 안정성, 억제제의 영향 등)을 조사할 수 있다.

본 발명의 한 양태에서, 스트렙토베르티실리움·모바라엔스의 균체 표층으로부터 SVP35라고 명명한 중성 메탈로프로테아제가 수득되고, 배양 상등액으로부터 SVP70이라고 명명한 중성 메탈로프로테아제가 수득된다.

본 발명의 한 양태에서, 본 발명의 중성 메탈로프로테아제는 이하의 성질을 갖는 중성 메탈로프로테아제 SVP35이다:

1) 분자량: 약 35,000(SDS-PAGE에 의한 측정)

3) pH 안정성: pH 4 내지 10

4) 최적 온도: 약 45℃

5) 온도 안정성: 약 50℃ 이하에서 안정

6) 억제제: 메탈로프로테아제 억제제인 에틸렌디아민4아세트산, 1,10-페난트롤린 및 포스포르아미돈, 및 방선균 유래 서브틸리신 억제 단백질(SSI)에 의해 강하게 억제된다.

또한, 본 발명의 별도의 양태에서, 본 발명의 중성 메탈로프로테아제는 이하의 성질을 갖는 중성 메탈로프로테아제 SVP70이다:

1) 분자량: 약 71,000(SDS-PAGE에 의한 측정)

3) pH 안정성: pH 5 내지 10

4) 최적 온도: 50 내지 55℃의 범위, 특히 55℃ 부근

5) 억제제: 메탈로프로테아제 억제제인 에틸렌디아민4아세트산, 1,10-페난트롤린 및 포스포르아미돈, SH-환원제인 디티오트레이톨, 및 방선균 유래 서브틸리신 억제 단백질(SSI)에 의해 강하게 억제된다.

SVP35 및 SVP70은 둘다 프로 MTG에 작용시킨 경우, MTG의 프로 구조부의 선택적 절단 활성이 높다. 즉, 상기 효소 둘다 프로 MTG를 활성형의 MTG로 효율적으로 전환시키지만, 생성된 활성형 MTG 자체를 분해하는 활성은 낮다고 하는 특징으로 인하여, 이들 둘다 프로 MTG를 원료로 하여 활성형 MTG를 제조하는 데 적합한 효소이다. 한편, 이러한 신규 2종의 중성 메탈로프로테아제의 N 말단 아미노산 서열은, SVP35에 관해서는 서열 번호 1에, SVP7O에 관해서는 서열 번호 2에 제시되어 있고, 이들 서열 사이에는 상동성이 있다. 따라서, N-말단 아미노산 서열에서 이러한 프로테아제와 상동성을 갖는 것을 검색한 결과, 스트렙토마이세스·그리세우스 유래의 메탈로프로테아제 SGMP II[참조: J. Biochem. 110권, 339 내지 344 페이지, 1991년] 및 스트렙토마이세스·켈리칼라 유래의 3종의 메탈로프로테아제(GenBank/EMBL/DDBJ CAB76000, 동 CAB76001, 동 CAB69762) 등이 밝혀졌다. 이러한 프로테아제도 SVP35 및 SVP70과 마찬가지로, 프로 MTG의 프로 구조부의 선택적 절단에 사용할 수 있으며, 프로 MTG를 원료로서 사용하여 활성형 MTG을 제조하기 위해 사용할 수 있다.

다음에, 재조합 DNA 기술에 의해서 본 발명의 중성 메탈로프로테아제를 제조하는 방법에 관해서 설명한다.

재조합 DNA 기술을 이용하여 효소, 생리 활성 물질 등의 유용 단백질을 제조하는 예는 많이 공지되어 있다. 재조합 DNA 기술을 사용하는 것의 이점은, 천연에 미량으로 존재하는 유용 단백질을 대량 생산할 수 있는 것이다.

재조합 DNA 기술을 이용하여 본 발명의 중성 메탈로프로테아제를 제조하기 위해서는, 우선, 프로모터, 적절한 시그날 펩티드를 암호화하는 서열 및 본 발명의 중성 메탈로프로테아제를 암호화하는 핵산 단편, 및 코리네형 세균 중에서 중성 메탈로프로테아제 유전자를 발현시키기 위해서 필요한 제어 서열(오퍼레이터나 터미네이터 등)을 이들이 기능할 수 있도록 적절한 위치에 갖는 유전자 작제물을 제조한다. 본 발명의 중성 메탈로프로테아제는, N 말단에 프로 구조부를 갖고 있어도 양호하다. 이러한 작제물 제조를 위해 사용할 수 있는 벡터는 특별히 제한되지 않으며, 숙주 미생물, 바람직하게는 코리네형 세균 중에서 기능할 수 있는 것이면 가능하며, 예를 들면, 플라스미드와 같이 염색체 외부에서 자립 증식하는 것이라도 세균염색체에 도입되는 것이라면 가능하다. 숙주로서 코리네형 세균을 사용하는 경우, 코리네형 세균 유래의 플라스미드는 벡터로서 특히 바람직하다. 이들에는, 예를 들면 pHM1519[참조: Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984)], pAM330[참조: Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984)] 및 이들을 변형시킨 약제 내성 유전자를 갖는 플라스미드가 포함된다.

본 발명에 있어서 숙주균으로서 사용할 수 있는 코리네형 세균으로서는, L-글루탐산 생산균으로 대표되는 브레비박테리움·사카로리티쿰(Brevibacterium saccharolyticum) ATCC14066, 브레비박테리움·임마리오필룸(Brevibacterium immariophilum) ATCC14068, 브레비박테리움·락토퍼멘텀(Brevibacterium lactofermentum)(코리네박테리움·글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)) ATCC13869, 브레비박테리움·로제움(Brevibacterium roseum) ATCC13825, 브레비박테리움·플라밤(Brevibacterium flavum)(코리네박테리움·글루타미쿰) ATCC14067, 코리네박테리움·아세토아시도필룸(Corynebacterium acetoacidophilum) ATCC13870, 코리네박테리움·글루타미쿰 ATCC13032, 코리네박테리움·릴리움(Corynebacterium lilium)(코리네박테리움·글루타미쿰) ATCC15990, 브레비박테리움·암모니아게네스(Brevibacterium ammoniagenes)(코리네박테리움·암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) ATCC6871 등의 야생주 또는 이의 변이주로부터 유도되는 변이주이다.

본 발명에 있어서 사용되는 변이주로서는, 예를 들면 글루탐산 생산성을 잃은 변이주, 또는 라이신 등의 아미노산 생산 변이주, 이노신 등의 핵산과 같은 다른 물질을 생산하는 변이주도 포함된다. 이러한 변이주는, 자외선 조사 또는 N-메틸-N'-니트로소구아니딘 등의 화학 변이제로 처리한 후, 단백질의 분비 생산능이 높아진 균주를 선택함으로써 수득할 수 있다.

특히, 야생주 코리네박테리움·글루타미쿰(씨·글루타미쿰) ATCC13869로부터 스트렙토마이신(Sm) 내성 변이주로서 분리한 코리네박테리움·글루타미쿰AJ12036(FERM BP-734)(1984년 3월 26일 원기탁)(현, 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 니혼 츠쿠바시 히가시 1-1-1 중앙 제6, 우편번호 305-8566)은 이의 모 균주(야생주)와 비교하여, 단백질의 분비에 관계하는 기능 유전자에 변이가 존재할 것으로 예측되고, 이종 단백질의 분비 생산능이 최적 배양 조건하에서의 축적량으로서 약 2 내지 3배로 극히 높아 숙주균으로서 적합하다[참조: W0 제02/081694호]. 또한, 이러한 균주로부터 세포 표층 단백질을 생산하지 않도록 변형한 균주를 숙주로서 사용하면, 배지 중에 분비된 이종 단백질의 정제가 용이해져 특히 바람직하다. 이러한 변형은 돌연변이 또는 유전자 재조합법에 의해 염색체 상의 세포 표층 단백질 또는 이의 발현 조절 영역에 변이를 도입함으로써 실시할 수 있다.

코리네형 세균 유래의 프로모터로서는, 예를 들면, 세포 표층 단백질 PS1, PS2, 각종 아미노산 생합성계의 SlpA 유전자의 프로모터, 예를 들면 글루탐산 합성 효소 유전자, 라이신 생합성계의 아스파르트키나제 유전자의 프로모터 등을 들 수 있다.

본 발명에서 사용하는 시그날 펩티드는 숙주인 코리네형 세균의 분비성 단백질의 시그날 펩티드이고, 바람직하게는 코리네형 세균의 세포 표층 단백질의 시그날 펩티드이다. 코리네형 세균의 세포 표층 단백질로서는, 코리네박테리움·글루타미쿰(씨·글루타미쿰)에 유래하는 PS1 및 PS2[참조: 일본 국제공개특허공보 제(평)6-502548호], 및 코리네박테리움·암모니아게네스(씨·암모니아게네스)에 유래의 SlpA[참조: 일본 공개특허공보 제(평)10-108675호]를 들 수 있다.

재조합 DNA 기술을 이용하여 프로 MTG의 프로 구조부의 선택적 절단 활성이 강한 중성 메탈로프로테아제를 제조하기 위해서는, 당해 중성 메탈로프로테아제를 암호화하는 DNA가 필요하다.

본 발명의 한 양태에서, 재조합 DNA 기술을 이용하여 중성 메탈로프로테아제 SVP35가 제조된다. SVP35를 암호화하는 DNA는, 하기와 같이 수득할 수 있다.

먼저, 정제된 SVP35의 아미노산 서열을 결정한다. 에드만법[참조: Edman, P., Acta Chem. Scand. 4, 227(1950)]을 사용하여 아미노산 서열을 결정할 수 있다. 또한 Shimadzu Co. Ltd.사 제조 등의 기체상 단백질 시퀀서를 사용하여 아미노산 서열을 결정할 수 있다.

본 발명의 중성 메탈로프로테아제 SVP35에 관해서, N 말단으로부터의 20 잔기의 아미노산 서열을 결정한 결과, 서열 번호 1에 제시된 서열이 밝혀졌다.

이러한 서열 정보를 이용하여 적절한 PCR용 프라이머를 합성하고, 본 발명의 중성 메탈로프로테아제를 수득하기 위한 프로브를 제조할 수 있다. 예를 들면, N 말단 아미노산 서열의 상동성 검색 결과를 근거로 하여 상동성을 가질 것으로 예상되는 방선균 유래의 프로테아제 유전자, 예를 들면, 스트렙토마이세스·켈리칼라 유래의 메탈로프로테아제(GenBank/EMBL/DDBJ CAB76001) 유전자를 사이토우, 미우라법[참조: Biochem. Biophys. Acta., 72, 619(1963)]에 의해 제조한 방선균 DNA를 주형으로 하여 PCR을 실시하여 당해 프로테아제를 암호화하는 유전자의 단편을 증폭시킬 수 있다. 수득된 증폭 단편은 프로브로서 사용할 수 있다.

이어서, 사이토우, 미우라법에 의해 제조한 방선균 유래의 DNA, 예를 들면 스트렙토베르티실리움·모바라엔스 IFO13819의 염색체 DNA를, 적당한 여러 가지의 제한 효소, 예를 들면 6 염기 서열을 인식하는 각종 제한 효소로 분해한다. 상기 PCR에 의해서 수득된 ³²P-표지된 PCR 산물을 프로브로서 사용하여 문헌[참조: Molecular Cloning 2nd edition, J. Sambrook E. F. Fritsch and T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p9.31(1989)]에 기재된 서던블롯 하이브리드화 등의 당업자에게 공지된 방법에 의해, 분해된 방선균 염색체 DNA를 분석할 수 있다. 예를 들면 서던블롯에 의해 사용한 프로브와 높은 상동성을 갖는 것이 확인된 단편을 회수하여, 적절한 벡터중에 클로닝함으로써, 본 발명의 중성 메탈로프로테아제를 암호화하는 핵산 분자 또는 이의 일부를 클로닝할 수 있다. 이러한 유전자 클로닝에 필요한 기법은 당업자에게는 잘 공지된 것이다.[참조: Molecular Cloning 2nd edition , J. Sambrook E. F. Fritsch and T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p1.90(1989)].

본 발명의 한 양태에서, 스트렙토마이세스·켈리칼라 A3(2)의 염색체 DNA를 주형으로 하여 PCR을 실시하여 프로브가 제조된다. 또한, SphI로 분해된 스트렙토베르티실리움·모바라엔스 IFO13819 염색체 DNA의 분해 산물 중에, ³²P-표지된 프로브와 하이브리드화하는 약 8kb의 단일 밴드가 검출된다. 따라서, 상기의 방법에 의해 제조한 스트렙토베르티실리움·모바라엔스 IFO13819의 염색체 DNA를 SphI로 분해하여, 약 8kb의 단편을 아가로스겔 전기영동에 의해 회수하고, 회수된 단편을 pUC18의 SphI 부위에 삽입한 후, 에스케리키아 콜라이 JM109의 수용적격 세포에 도입하여 라이브러리가 작제된다. 작제된 라이브러리에 대하여, 합성 올리고뉴클레오티드를 프로브로서 사용하여, 문헌[참조: Molecular Cloning 2nd edition(상기 참조)]에 기재된 콜로니 하이브리드화 기술에 따라 스크리닝을 실시하고, 클로닝된 SVP35의 유전자 단편을 함유하는 플라스미드를 보유하는 균주를 선택함으로써 목적하는 클론이 수득된다. 이러한 균주로부터 회수한 플라스미드는 pVSV1이라고 명명되어 있다. pVSV1에 클로닝된 단편의 뉴클레오티드 서열을 분석하고, 아미노산의 1차 서열을 추정함으로써, 단편이 먼저 결정한 N-말단 부분 아미노산 서열을 암호화하고 있는지를 확인한다. 따라서, 수득된 유전자가 SVP35를 암호화하는 유전자인 것이 확인된다.

이어서, 수득된 메탈로프로테아제를 암호화하는 DNA를 포함하는 유전자 작제물을, 사용하는 숙주의 성질에 따라 적절한 벡터와 연결시켜 본 발명의 중성 메탈로프로테아제를 발현시키기 위한 재조합 핵산 분자를 작제할 수 있다. 이러한 재조합 핵산 분자로 숙주인 코리네형 세균 세포를 형질전환시킨다. 형질전환된 세포를 적절한 배지 중에서 배양하여, 배지중 및/또는 세포 중에 분비 또는 축적된 본 발명의 중성 메탈로프로테아제를 회수할 수 있다.

이어서, 중성 메탈로프로테아제를 사용하여 프로 MTG로부터 활성형 MTG를 제조하는 방법에 관해서 설명한다.

활성형 MTG 제조에 사용하는 중성 메탈로프로테아제는, 중성 메탈로프로테아제 생산균의 배양액으로부터 제조되는 중성 메탈로프로테아제 함유 분획물로서 프로 MTG에 작용시킬 수 있다. 또한, 추가로 고도로 정제된 비활성이 높은 중성 메탈로프로테아제로서 사용할 수도 있다. 또한, 후술한 바와 같이, 프로 MTG의 프로 구조부의 선택적 절단 활성이 강한 중성 메탈로프로테아제를 암호화하는 DNA와 벡터를 연결하여 수득되는 재조합 핵산 분자에 의해서 형질전환된 세포를 배양함으로써 수득되는 중성 메탈로프로테아제를 사용할 수도 있다.

MTG 제조에 사용하는 프로 MTG는, 프로 MTG 생산균의 배양액으로부터 제조되는 프로 MTG 함유 분획물일 수 있다. 또한, 추가로 고도로 정제된 프로 MTG를 사용할 수 있다. 반응 조건은, 프로 MTG에 대하여 중성 메탈로프로테아제의 첨가량을 질량으로 1/10 내지 1/500로 하고, 반응 온도를 15 내지 50℃, pH를 5.0 내지 9의 적당한 범위로 조정하여 실시할 수 있다.

또한, 전술한 바와 같이 작제한 본 발명의 중성 메탈로프로테아제를 암호화하는 DNA를 포함하는 유전자 작제물과 프로 MTG를 암호화하는 유전자 작제물을 갖는 미생물, 특히 코리네형 세균에 도입하여, 프로 MTG와 본 발명의 메탈로프로테아제를 1 균체에 의해 생성시켜 상기 조건하에서 프로 MTG를 성숙 MTG로 전환할 수도 있다. 프로 MTG를 코리네형 세균에서 효율적으로 생성시키기 위한 보다 상세한 방법, 이의 방법에 사용하는 유전자 작제물, 및 이와 같은 유전자 작제물이 도입된 코리네형 세균은, 예를 들면 W0 제01/23591호에 밝혀져 있다. 보다 구체적으로는, 예를 들면, 코리네형 세균 유래의 시그날 펩티드 도메인, 특히 세포 표층 단백질의 시그날 펩티드 도메인을 암호화하는 서열의 하류에 있는 프로 MTG를 암호화하는 서열을 적절한 프로모터의 하류에 연결하여 수득되는 유전자 작제물을 코리네형 세균에 도입하여, 프로 MTG 단백질을 균체 외부로 효율적으로 분비할 수 있는 코리네형 세균을 수득할 수 있다. 이러한 목적에 사용할 수 있는 시그날 펩티드, 프로모터 및 숙주는 본 발명의 메탈로프로테아제를 발현시키는 데 적합한 상술된 시그날 펩티드, 프로모터 및 숙주로부터 선택할 수 있다. 또한, 동일 균체 내에서 공존 가능한 벡터의 조합도 당업자에게는 잘 공지되어 있다. 따라서, 프로 MTG를 생성하는 코리네형 세균에 상술한 본 발명의 중성 메탈로프로테아제를 암호화하는 DNA를 포함하는 적절한 유전자 발현 작제물을 도입하거나, 또는 반대로 본 발명의 중성 메탈로프로테아제를 생성하는 코리네형 세균에 프로 MTG를 암호화하는 적절한 유전자 발현 작제물을 도입함으로써, 동일 균체 내에 프로 MTG 및 본 발명의 중성 메탈로프로테아제를 발현시킬 수 있는 유전자 작제물을 공존시키고, 당해 균을 배양하여, 상술한 바와 같은 본 발명의 중성 메탈로프로테아제가 활성을 갖는 적절한 조건하에서 성숙 MTG를 수득할 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 제조된 트랜스글루타미나제는, 당업자에게 잘 공지된 방법에 따라 반응액으로부터 분리 정제할 수 있다. 예를 들면, 균체를 원심분리 등에 의해 제거한 후, 염석, 에탄올 침전, 한외여과, 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 칼럼 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 중고압 액체 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피 등의 공지된 적절한 방법, 또는 이들을 조합함으로써 분리 정제할 수 있다.

다음에, 본 발명을 실시예에 의해 상세하게 설명한다. 또한, 본 발명은 실시예의 기재에 한정되지 않는다.

실시예

실시예 1. 스트렙토베르티실리움·모바라엔스 IFO13819가 생성하는 중성 메탈로프로테아제

(1) 스트렙토베르티실리움·모바라엔스 IFO13819가 생성하는 중성 메탈로프로테아제(SVP70)의 정제

ISP2 액체 배지(효모 추출물 4g, 맥아 추출물 10g, 글루코스 4g, 물로 1L로 하여 pH 7.3으로 조정)를 5L 판구 플라스크에 800mL 가득 채우고, 스트렙토베르티실리움·모바라엔스 IFO13819주를 플레이트로부터 접종하여 30℃에서 9일 동안 120rpm에서 진탕 배양하였다. 배양액을 원심분리하여, 배양 상등액을 회수하였다. 적층형 여과기(기공 크기 3㎛, Saltorius Co. Ltd.)를 사용하여 여과한 후, 기공 크기 10,000Da의 Sartocon Slice 막(Saltorius Co. Ltd.)을 사용하여 농축하였다. 농축액을 20mM 트리스-염산 완충액/5mM 염화칼슘(pH 7.5)으로 10배로 희석하여, FPLC(Amarsham Pharmacia Co. Ltd.)를 사용하여, 동 완충액으로 평형화한 DEAE-Sepharose FF(2.6φ× 10cm, Amarsham Pharmacia Co. Ltd.)의 칼럼에 통과시키고, 염화나트륨 0 내지 0.5M의 직선 농도 구배로 용출하였다. 활성 성분을 함유하는 분획을 회수하고, 1.5M 황산암모늄/20mM MES 완충액/5mM 염화칼슘(pH 6.0)으로 평형화한 페닐세팔로스 HP(1.6φ×10cm, Amarsham Pharmacia Co. Ltd.)의 칼럼에 통과시키고, 황산암모늄 1.5 내지 0M의 직선 농도 구배로 용출하여 활성 분획을 회수하였다. 수득된 활성 분획을 20mM MES 완충액/5mM 염화칼슘(pH 6.0)에 대해서 밤새 4℃에서 투석하여, 정제 효소액을 수득하였다.

각 단계에서의 효소 활성의 측정은 아래와 같이 실시하였다.

펩티드 GPSFRAPDS(Peptide Institute)(서열 번호 11)를 함유하는 20mM 인산나트륨 완충액에 효소 용액을 첨가하고, 총액량 170㎕에서 30℃, 10분 동안 반응시킨 후, 95℃에서 5분 동안 가열하여 반응을 정지시켰다. 이 중 80㎕를 이하의 조건으로 HPLC 분석하여, 기질의 감소량에 기초하여 활성을 산출하였다.

장치: HPLC L-6300 시스템(Hitachi Co. Ltd.)

칼럼: YMC-PACK 0DS 120A 4.6 ×150mm(YMC)

용출액: (A) 0.1% TFA (B) 80% 아세토니트릴/0.1% TFA

용출 조건: 아세토니트릴 12-16% 직선 농도 구배(15분간)

유속: 1.Oml/분

검출 파장: 220nm

이러한 조건에 있어서, 펩티드 GPSFRAPDS는, 체류 시간 13 내지 14분에, 분해물 FRAPDS는 체류 시간 7.5 내지 8.5분에 용출되었다.

효소 활성의 단위로서 1분 동안에 1nmol의 프로 MTG 분해를 촉매하는 효소량을 1U로 정의하였다.

(2) 스트렙토베르티실리움·모바라엔스 IFO13819가 생성하는 중성 메탈로프로테아제(SVP35)의 정제

ISP2 액체 배지를 5L 판구 플라스크에 800mL 가득 채우고, 스트렙토베르티실리움·모바라엔스 IFO13819주를 플레이트로부터 접종하여 30℃에서 48시간, 120rpm에서 진탕 배양하였다. 배양액을 원심분리하여 배양 상등액을 제거하고 균체를 회수하였다. 균체를 20mM 트리스-염산 완충액/30mM 염화나트륨(pH 7.5)에 현탁하여, 빙상에서 4시간 동안 진탕후, 원심분리에 의해 상등액을 회수하였다. 수득된 상등액을 적층형 여과기(기공 크기 0.22㎛, Saltorius Co. Ltd.)로 여과 멸균후, FPLC(Amarsham Pharmacia Co. Ltd.)를 사용하여, 5mM 염화칼슘 및 0.01mM 염화아연을 포함하는 20mM 트리스-염산 완충액(pH 7.5)으로 평형화한 CM-Sepharose FF(Amarsham Pharmacia Co. Ltd.)의 칼럼(1.6φ×10cm)에 통과시키고, 동 완충액중, 염화나트륨 0 내지 0.5M의 직선 농도 구배로 용출하였다. 활성 성분을 함유하는 분획을 회수하고, 또한 1.5M 황산암모늄, 5mM 염화칼슘 및 0.01mM 염화아연을 포함하는 20mM 트리스-염산 완충액(pH 7.5)으로 평형화한 페닐-Sepharose HP 칼럼(1mL, Amarsham Pharmacia Co. Ltd.)에 통과시키고, 황산암모늄 1.5 내지 0M의 직선 농도 구배로 용출하였다. 활성 분획을 회수하고, PD-10(Amarsham Pharmacia Co. Ltd.) 칼럼을 사용하여 5mM 염화칼슘 및 0.01mM 염화아연을 포함하는 20mM 트리스-염산 완충액(pH 7.5)으로 탈염하여, 부분 정제 효소액을 수득하였다.

각 단계에서의 효소 활성은 (1)과 마찬가지로, 펩티드 GPSFRAPDS를 기질로서 사용하여 측정하였다.

(3) 스트렙토베르티실리움·모바라엔스 IFO13819가 생산하는 중성 메탈로프로테아제(SVP35)의 특성 평가

i) 기질 특이성

5mM 염화칼슘 및 0.01mM 염화아연을 포함하는 20mM 트리스-염산 완충액(pH 7.5)으로 1mg/ml로 제조한 인슐린 B 용액 및 프로 MTG 용액을 기질로 하여, 효소 용액을 첨가하여 30℃, 2시간 동안 반응시킨 후, 이하의 조건의 HPLC에 의해 펩티드 단편을 분취하였다.

장치: L-7100/7200/7405/D-7600(Hitachi Co. Ltd.)

칼럼: VYDAC C18 4.6mm I.D.×250mm(VYDAC)

용출액: (A) 0.1% TFA (B) 80% 아세토니트릴/0.1% TFA

용출 조건: 아세토니트릴 4 내지 44% 직선 농도 구배

유속: 0.5ml/분

검출 파장: UV 220nm

수득된 펩티드 단편의 아미노산 서열을 PPSQ-10(Shimadzu Co. Ltd.)에 의해 분석하여, SVP35에 의한 절단점의 서열을 해석하였다. 그 결과, 특히 Phe, 종종 Leu, 때때로 Tyr, Trp, Ile, Val 앞(N-말단측)에서 절단되어 있고, SVP는 절단 부위의 P'1에 위치하는 방향족 아미노산 및 거대 측쇄의 소수성 아미노산을 인식하고 있는 것이 밝혀졌다.

ii) 최적 pH

pH 3 내지 10의 0.15M GTA 완충액(3,3-디메틸글루타르산, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄, 2-아미노-2-메틸-1,3-프로판디올에 의한 완충액) 중에서, Gly-Pro-Ser-Phe-Arg-Ala-Pro-Asp-Ser을 기질로서 30℃에서 10분 동안 SVP35를 작용시켰다. 그 결과, SVP35의 최적 pH는 7.0 부근이고, pH 7.0의 활성을 100%로 하면, pH 6.0 내지 8.0의 범위에서 70% 이상, pH 6.5 내지 7.5의 범위에서 80% 이상의 활성을 갖는 것이 밝혀졌다(도 1).

iii) pH 안정성

pH 3 내지 10의 0.15M GTA 완충액의 각 pH의 완충액 40㎕를 SVP35 정제 효소 용액 10㎕에 첨가하고, 4℃에서 밤새 정치한 후, 0.1M 인산나트륨 완충액(pH 7.0)으로 용액 용적을 400㎕로 맞추어, pH를 7.0으로 조정하였다. 당해 효소 용액에 Gly-Pro-Ser-Phe-Arg-Ala-Pro-Asp-Ser을 기질로서 첨가하고, pH 7.0, 30℃에서 10분 동안 반응시켰다. 그 결과, SVP35는 pH 4 내지 10의 범위에서 안정(pH 4.0에서의 활성을 100%로 하면, pH 4 내지 10에서 90% 이상의 활성을 갖는다)한 것으로 나타났다.(도 2).

iv) 최적 온도

5mM 염화칼슘 및 0.01mM 염화아연을 포함하는 20mM 트리스-염산 완충액(pH 7.5)으로 희석한 정제 효소 용액에 Gly-Pro-Ser-Phe-Arg-Ala-Pro-Asp-Ser을 첨가하고 pH 7.0, 5 내지 65℃에서 10분 동안 반응시켰다. 그 결과, SVP35의 최적 온도는 약 45℃이고, 40 내지 50℃의 범위에서 높은 활성을 갖는(45℃에서의 활성의 80% 이상의 활성을 갖는다)것이 나타났다(도 3).

v) 온도 안정성

정제 효소액 10㎕에 5mM 염화칼슘 및 0.01mM 염화아연을 포함하는 20mM 트리스-염산 완충액(pH 7.5)을 40㎕ 첨가하여, 4℃ 또는 30 내지 70℃에서 15분 동안 처리한 후, 빙냉하여 20mM 인산나트륨 완충액(pH 7.0)을 250㎕ 첨가하였다. 이러한 효소 용액에 Gly-Pro-Ser-Phe-Arg-Ala-Pro-Asp-Ser을 기질로서 첨가하고, 30℃에서 5분 동안 반응시켰다. 4℃에서 처리한 경우의 활성을 100%로 하여 각 온도에 있어서의 잔존 활성을 산출하였다. 그 결과, SVP35는 50℃에서는 80%의 활성을 유지하고 있지만, 60℃에서 활성을 잃는 것으로 나타났다(도 4).

vi) 억제제

각종 화합물을 도 5에 도시한 농도로 함유하는 20mM 인산나트륨 완충액(pH 7.0)에 정제 효소 용액을 첨가하고, 실온에서 60분 동안 정치시켰다. 그 후 기질로서 Gly-Pro-Ser-Phe-Arg-Ala-Pro-Asp-Ser을 첨가하여 30℃에서 10분 동안 반응시켰다. 화합물을 첨가하지 않은 경우의 Gly-Pro-Ser-Phe-Arg-Ala-Pro-Asp-Ser 절단 활성을 10O%로 하여, 각종 화합물을 첨가한 경우의 상대 활성을 산출하였다. 그 결과, 메탈로프로테아제 억제제인 에틸렌디아민4아세트산, 1,10-페난트롤린 및 포스포르아미돈, 또한 방선균 유래 서브틸리신 억제 단백질(SSI)에 의해서 SVP35는 강하게 억제된다(도 5).

(4) 스트렙토베르티실리움·모바라엔스 IFO13819가 생산하는 중성 메탈로프로테아제(SVP70)의 특성 평가

i) 기질 특이성

(3)-i)과 동일하게 하여 기질 특이성을 조사하였다.

그 결과, 기질은 특히 Phe, 종종 Leu, 때때로 Tyr, Trp, Ile, Val 앞(N-말단측)에서 절단되어 있고, SVP70은 절단 부위의 P'1에 위치하는 방향족 아미노산 및 거대 측쇄의 소수성 아미노산을 인식하고 있는 것이 밝혀졌다.

ii) 최적 pH

(3)-ii)와 동일하게 하여 SVP70의 최적 pH를 조사하였다. 그 결과, SVP70의 최적 pH는 7.0 부근이고, pH 7.0에 있어서의 활성을 100%로 하여 pH 6.0 내지 8.0에서 90% 이상, pH 6.5 내지 7.5의 범위에서 95% 이상의 활성을 갖는 것이 밝혀졌다(도 1).

iii) pH 안정성

(3)-iii)과 동일하게 하여 pH 안정성을 조사하였다. 그 결과, SVP70은 pH 5 내지 10의 범위에서 안정적이지만, SVP35에 비해 약간 알칼리측에서 안정성이 약한 것이 나타났다(도 2). 구체적으로는, pH 5에 있어서의 활성을 100%로 하면, pH 5 내지 7의 범위에서 90% 이상의 활성을 가지며, pH 7 내지 10의 범위에서도 약 80% 이상의 활성을 갖는 것으로 나타났다.

iv) 최적 온도

(3)-iv)와 동일하게 하여 SVP7O의 최적 온도를 조사하였다. 그 결과, SVP70의 최적 온도는 약 50 내지 55℃의 범위, 특히 55℃ 부근인 것으로 나타났다(도 3).

v) 억제제

(3)-v)와 동일하게 하여, 각종 화합물의 SVP70에 대한 억제 활성을 조사하였다.

그 결과, SVP70은, 메탈로프로테아제 억제제인 에틸렌디아민4아세트산, 1,10-페날트롤린 및 포스포르아미돈, 환원제 디티오트레이톨, 우레아 및 방선균 유래 서브틸리신 억제 단백질(SSI)에 의해서 강하게 억제된다(도 5).

(5) SVP35 및 SVP70의 N-말단 아미노산 서열 해석

(1), (2)에서 수득된 SVP35 및 SVP70의 정제 효소를 막 카트리지(Perkin Elmer Co. Ltd.)를 사용하여 폴리비닐리덴-디플루오라이드(PVDF) 막에 전사하고, 기체상 단백질 시퀀서 PPSQ-10(Shimadzu Co. Ltd.)에 의해 N-말단 아미노산 서열을 해석하였다. SVP35의 아미노산 서열을 서열 번호 1에, SVP70의 아미노산 서열을 서열 번호 2에 나타내었다. 여기에는 상동성이 확인된다.

따라서, 이러한 프로테아제와 N-말단 아미노산 서열에 상동성을 갖는 것을 방선균으로부터 검색한 결과, 스트렙토마이세스·그리세우스(Streptomyces griseus) 유래의 메탈로프로테아제 SGMP II[참조: J. Biochem. 110권, 339 내지 344 페이지, 1991년] 및 스트렙토마이세스·켈리칼라 유래의 3종의 메탈로프로테아제(GenBank/EMBL/DDBJ CAB76000, 동 CAB76001, 동 CAB69762) 등이 밝혀졌다. 이러한 프로테아제도, 프로 MTG의 프로 구조부를 선택적으로 절단하기 위해 사용할 수 있으며, 따라서, 본 발명에 의한 활성형 MTG의 제조에 사용할 수 있다.

(6) SVP35 유전자의 클로닝 및 코리네형 세균에서의 분비 발현

사이토우, 미우라법[참조: Biochem. Biophys. Acta, 72, 619(1963)]에 의해 스트렙토마이세스·켈리칼라 A3(2)의 염색체 DNA를 제조하였다. N-말단 아미노산 서열에 상동성을 갖는 스트렙토마이세스·켈리칼라 유래의 메탈로프로테아제(GenBank/EMBL/DDBJ CAB76001) 유전자의 서열을 참고하여, 서열 번호 3과 서열 번호 4에 나타낸 프라이머를 합성하였다. 전술한 스트렙토마이세스·켈리칼라 A3(2)의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열 번호 3과 서열 번호 4에 나타낸 프라이머를 사용하여 PCR을 실시하고, 메탈로프로테아제 유전자 중의 유전자 영역을 증폭시켰다. PCR 반응은 Pyrobest DNA 폴리머라제(Takarasyuzo Co. LTD.)를 사용하여, 반응 조건은 업자가 추천하는 프로토콜에 따랐다. 이러한 ³²P-표지된 PCR 산물을 프로브로 하여, 사이토우, 미우라법에 의해 제조한 스트렙토베르티실리움·모바라엔스 IF013819의 염색체 DNA를 6 염기 서열을 인식하는 각종 제한 효소로 소화한 시료를 사용하여, 문헌[참조: Molecular Cloning 2nd edition, J. Sambrook E. F. Fritsch and T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p9.31(1989)]기재의 서던블롯 하이브리드화에 의해 해석한 결과, SphI 절단에 의해 약 8kb의 단일 밴드가 검출되었다. 따라서, 상기 방법에 의해 제조한 스트렙토베르티실리움·모바라엔스 IFO13819의 염색체 DNA를 SphI에서 분해하고, 약 8kb의 단편을 EASYTRAP Ver.2(Takarasyuzo Co. LTD.)를 사용하여 아가로스겔 전기영동에 의해 회수하였다. 회수 단편을 pUC18의 SphI 부위에 삽입한 후, 에스케리키아 콜라이 JM109(Takarasyuzo Co. LTD.)의 수용적격 세포에 도입하여, 라이브러리를 제조하였다. 제조한 라이브러리에 대하여, 합성 올리고 뉴클레오티드를 프로브로서, 문헌[참조: Molecular Cloning 2nd edition, J. Sambrook E. F. Fritsch and T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p1.90(1989)] 기재된 콜로니 하이브리드화에 의해, SVP35의 유전자 단편이 클로닝된 플라스미드를 유지하는 균주를 스크리닝하였다.

수득된 균주에서 회수한 플라스미드를 pVSV1이라고 명명하였다. pVSV1에 클로닝되어 있는 단편의 뉴클레오티드 서열을 결정하였다. 당해 클로닝된 단편의 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 5에 나타내었다. 당해 유전자에 암호화되는 아미노산의 1차 서열을 추정한 결과, 먼저 결정한 N-말단 부분 아미노산 서열을 포함하는, SVP35의 시그날 서열 및 프로 구조로 추정되는 영역을 포함하는 전체 아미노산의 1차 서열을 결정하였다. SVP35의 전체 아미노산 서열을 서열 번호 6에 나타내었다. 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 36번 아미노산까지가 시그날 서열이고, 아미노산 번호 37 내지 216이 프로 구조부이고, 아미노산 217 내지 537번이 성숙 SVP35로 추정된다.

서열 번호 5의 서열을 참고하여, pVSV1을 주형으로 하여 서열 번호 7과 서열 번호 8에 나타낸 프라이머를 합성하여, SVP35의 프로 구조 부분 및 성숙 SVP35를 포함하는 유전자 영역을 PCR법으로 증폭시켰다. PCR 반응은 Pyrobest DNA 폴리머라제(Takarasyuzo Co. Ltd.)를 사용하고, 반응 조건은 업자가 추천하는 프로토콜에 따랐다.

다음에, WO 제01/23591호에 기재된 pPKSPTG1을 주형으로 하여, 서열 번호 9와 서열 번호 10의 올리고 뉴클레오티드의 조합에 의해, 씨. 글루타미쿰의 세포 표층 단백질인 PS2 유전자의 프로모터 영역을 포함하는 5'-상류역과 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질 SlpA의 시그날 서열을 포함하는 영역을 PCR법으로 증폭시켰다. 서열 번호 10에 나타낸 프라이머는 프로 구조 부착 SVP35의 N 말단측의 아미노산을 암호화하는 서열을 포함하고 있다.

다음에, 각각 증폭시킨 PCR 반응액 각 1㎕를 섞어 주형으로 하고, 서열 번호8과 서열 번호 9를 사용하여 크로스 오버 PCR을 실시하고, PS2 유전자의 프로모터 영역을 포함하는 5'-상류역과 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질 SlpA의 시그날 서열에 접속된 이종 융합 프리-프로 SVP35 유전자 단편을 증폭시켰다.

아가로스겔 전기영동에 의해, 약 2.3kb의 증폭 단편을 검출하였다. PCR 산물을 아가로스겔 전기영동에 제공하여 약 2.3kb의 단편을 회수하고, DNA 평활화 키트(Takarasyuzo Co. Ltd.)를 사용하여 말단을 평활화한 후, 일본 공개특허공보 제(평)9-070291에 기재된 pCV7의 SmaI 부위에 삽입함으로써, pVSV1을 수득하였다. 통상적인 방법에 따라서, 삽입 단편의 염기 서열을 결정하고, 예상대로의 융합 유전자가 작제되어 있는 것을 확인하였다.

작제된 플라스미드 pVSV1을 사용하여, C. glutamicum ATTC13869를 형질전환하여, 5mg/l의 클로람페니콜을 포함하는 CM2S(효모 추출물 10g, 트립톤 10g, 슈크로스 5g, NaCl 5g, 한천 15g, 물로 1L로 한다) 한천 배지에서 생육한 균주를 선택하였다. 다음에, 선택한 pVSV1을 갖는 씨. 글루타미쿰 ATTC13869를, 5mg/l의 클로람페니콜을 포함하는 MMTG 액체 배지(글루코스 60g, 황산마그네슘 7수화물 0.4g, 황산암모늄 30g, 인산2수소칼륨 1g, 황산철 7수화물 0.01g, 황산망간 5수화물 0.01g, 티아민염산염 450㎍, 비오틴 450㎍, DL-메티오닌 0.15g, 탄산칼슘 50g, 물로 1L로 하여 pH 7.5로 조정)에서 30℃, 30시간 동안 배양하였다. 당해 배양액 1ml를 원심분리에 의해 배양 상등액과 균체로 분리하였다. 배양 상등액에는, SVP35의 활성이 검출되고, Laemmli의 방법에 의한 SDS-PAGE[참조: Nature, 227, 680-685(1970)] 전기영동의 결과, 약 200mg/L의 SVP35가 분비 발현되고 있는 것이 확인되었다.

실시예 2. 스트렙토베르티실리움·모바라엔스 IFO13819가 생산하는 트랜스글루타미나제 전구체(프로 MTG)의 활성형으로의 전환

코리네박테리움 글루타미쿰에 의해 발현시킨 프로 MTG(1mg/ml)를 정제한 기질로서, 스트렙토베르티실리움·모바라엔스 유래 중성 프로테아제(SVP35, SVP70) 또는 방선균 스트렙토마이세스 그리세우스 유래 중성 메탈로프로테아제 SGMP II와 기질:효소= 200:1의 비율로 혼합하여, 30℃에서 반응시켰다. 경시적으로 0, 1, 2, 4, 7, 20시간 후에 반응 혼합물을 분취하고, 일부를 SDS-PAGE 샘플 완충제와 혼합하여 95℃, 3분 동안 가열한 후 Laemmli의 방법에 의한 SDS-PAGE[참조: Nature, 227, 680-685(1970)]에 제공하였다. 이의 결과를 도 6에 기재한다. 도 6에서 알 수 있는 바와 같이, 이러한 프로테아제를 반응시키면 프로 MTG는 성숙형으로 전환되고, 장시간 반응시킨 후에도 생성된 MTG는 감소되지 않았다. 또한, 분취한 분획의 트랜스글루타미나제(TG) 활성을 하이드록사메이트법으로 측정한 결과, 충분한 활성이 확인되었다. 또한, SGMP II는, 액티나제(Kakenseiyaku. Co. Ltd.)로부터 문헌[참조: J. Biochem. 110권, 339-344 페이지, 1991년]의 방법에 따라 정제하였다.

다음에, 스트렙토베르티실리움·모바라엔스 유래 중성 프로테아제 SVP70 및 대조로서, 세린프로테아제 SAM-P45(방선균 St. 알보그리세올루스(albogriseolus) 유래)를, 효소 첨가량을 증가시켜 프로 MTG에 첨가하고, 30℃, pH 7.0으로 반응시켰다. 경시적으로 1, 4, 7, 24시간 후에 분취하여, TG 활성을 하이드록사메이트법에 의해 측정하였다(도 7). 또한, TG의 단백질 농도를 역상 HPLC로 측정하였다(도 8). 그 결과, SVP는 기질에 대하여 1/500의 소량으로 프로 MTG를 효율적으로 활성형 MTG로 전환할 수 있는 것이 나타났다. SAM-P45는 기질에 대하여 1/50량으로도 트랜스글루타미나제 활성이 높아지지 않고, 활성형으로 완전히 전환되지 않는 것이 나타났다. 한편, SAM-P45를 기질에 대하여 1/10량 첨가한 경우, 활성형 MTG로의 전환이 보였지만, 계속해서 MTG 단백량의 감소 및 활성의 저하가 나타났다. 이것은 SAM-P45에 의한 성숙 MTG의 과분해가 일어나고 있는 것을 시사한다.

본 발명에 의해, 방선균 스트렙토베르티실리움·모바라엔스로부터 트랜스글루타미나제 전구체의 프로 구조 부분을 특이적으로 절단하여 활성화하는 신규 프로테아제 및 이의 유전자가 제공된다. 또한, 본 발명의 신규 프로테아제는 코리네형 세균에서 대량 발현시킬 수 있기 때문에, 이에 의해, 미생물 유래 트랜스글루타미나제를 효율적으로 제조하는 방법이 제공된다.

본 발명의 방선균 유래 중성 메탈로프로테아제를 활성형 MTG 제조에 사용하는 이점은, 프로 MTG의 프로 구조부의 선택적 절단 활성이 강한 동시에, 코리네형 세균에서 이러한 효소를 발현 분비시킬 수 있는 점이다.

방선균 유래의 프로 MTG는 코리네형 세균에서 효율적으로 발현시켜 분비시킬 수 있는 것을 알고 있기 때문에, 코리네형 세균에 프로 MTG와 중성 메탈로프로테아제를 공발현 및 분비시킴으로써, 1균체에서의 보다 효율적인 활성형 MTG의 제조가 가능해진다. 여기에서, 중성 메탈로프로테아제는 프로 MTG의 프로 구조부 절단에 필요 충분한 양을 발현시키는 것만으로 양호하다.

참고 문헌

1. 일본 특허공보 제(평)1-50382호

2. 일본 공개특허공보 제(소)64-27471호

3. 국제공개 제01/23591호 팜플렛

4. 일본 국제공개특허공보 제(평)6-502548호

5. 일본 공개특허공보 제(평)10-108675호

6. Eur. J. Biochem. 257권, 570-576 페이지, 1998년

7. J. Biochem. 110권, 339 내지 344 페이지, 1991년

<110> Ajinomoto Co., Inc. <120> Process for producing microbial transglutaminase <130> OP04093 <150> JP 2003-061623 <151> 2003-03-07 <160> 11 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> PRT <213> Streptoverticillium mobaraense <400> 1 Gly Thr Gly Thr Ser Thr Tyr Ser Gly Thr Val Pro Leu Thr Thr Thr 1 5 10 15 Lys Ser Gly Ser 20 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Streptoverticillium mobaraense <400> 2 Gly Thr Gly Asn Ser Gln Gly Ser Gly Gln Val 1 5 10 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 3 ggctccggca agagcctcta ctcgggcacg 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 4 tcagctcacg ttgatcgcgg tccaggaggc 30 <210> 5 <211> 1614 <212> DNA <213> Streptoverticillium mobaraense <220> <221> CDS <222> (1)..(1611) <400> 5 gtg ttg aga ctc acc gcc acc ccc cgc acc acg gcc ctg cgt gcc gcc 48 Val Leu Arg Leu Thr Ala Thr Pro Arg Thr Thr Ala Leu Arg Ala Ala 1 5 10 15 gcc ctc gtc gcc tcc gcg gcc atg gtc gtc gtc ggc gtg cag acg ggc 96 Ala Leu Val Ala Ser Ala Ala Met Val Val Val Gly Val Gln Thr Gly 20 25 30 agc gcg agc gcc tcg ggt gac cgt gac agc gga ggg ctg cca ctg acg 144 Ser Ala Ser Ala Ser Gly Asp Arg Asp Ser Gly Gly Leu Pro Leu Thr 35 40 45 ctc tcc gcg agc cag cgc acc gcc gcc atc cag gag gcc cag agc ggc 192 Leu Ser Ala Ser Gln Arg Thr Ala Ala Ile Gln Glu Ala Gln Ser Gly 50 55 60 gcg tcg gcg acc gcc gcc aag atc ggc ctg agc ggc aag gag aag ctg 240 Ala Ser Ala Thr Ala Ala Lys Ile Gly Leu Ser Gly Lys Glu Lys Leu 65 70 75 80 atc gcc cgc gac gtc gtc aag gac gcc gac ggc acc gtc cac acg cgc 288 Ile Ala Arg Asp Val Val Lys Asp Ala Asp Gly Thr Val His Thr Arg 85 90 95 tac gag cgc acc tac gac ggg ctg ccc gtg ctc ggc ggc gac ctg atc 336 Tyr Glu Arg Thr Tyr Asp Gly Leu Pro Val Leu Gly Gly Asp Leu Ile 100 105 110 gtc cac gag gcg aag gcc gga cgc tcg gtc acc aag gcg aac gac gcg 384 Val His Glu Ala Lys Ala Gly Arg Ser Val Thr Lys Ala Asn Asp Ala 115 120 125 acc ata gcc ctg ccc tcg acc gac gcc tcc ctg gcc ccg gcc gcg gcg 432 Thr Ile Ala Leu Pro Ser Thr Asp Ala Ser Leu Ala Pro Ala Ala Ala 130 135 140 aag aag tcg gcg ctg agc gcc gcc gcc gac cag aag acc gcc aag gcg 480 Lys Lys Ser Ala Leu Ser Ala Ala Ala Asp Gln Lys Thr Ala Lys Ala 145 150 155 160 gac ggc cag gcg ccg cgc aag gtc gtc tgg gcc gcg cag ggc aag ccg 528 Asp Gly Gln Ala Pro Arg Lys Val Val Trp Ala Ala Gln Gly Lys Pro 165 170 175 gtc ctg gcg tac gag acc gtg gtc acg ggc gtg cag aag gac ggc acc 576 Val Leu Ala Tyr Glu Thr Val Val Thr Gly Val Gln Lys Asp Gly Thr 180 185 190 ccg agc gag ctg cac gtg atc acc gac gcg gcg tcc ggc aag aag ctg 624 Pro Ser Glu Leu His Val Ile Thr Asp Ala Ala Ser Gly Lys Lys Leu 195 200 205 tac cag tac gag gcc atc gag acc ggt acc ggc acc agc acc tac agc 672 Tyr Gln Tyr Glu Ala Ile Glu Thr Gly Thr Gly Thr Ser Thr Tyr Ser 210 215 220 ggc acc gtg ccg ctg acc acc acc aag tcg ggc tcc cag tac cag ctc 720 Gly Thr Val Pro Leu Thr Thr Thr Lys Ser Gly Ser Gln Tyr Gln Leu 225 230 235 240 aac gac ggc gcg cgc ggc ggc cac aag acg tac gac ctc aac cag ggg 768 Asn Asp Gly Ala Arg Gly Gly His Lys Thr Tyr Asp Leu Asn Gln Gly 245 250 255 acg tcc ggc acc ggt tcg ctg ttc acc aac agc acc gac acc tgg ggc 816 Thr Ser Gly Thr Gly Ser Leu Phe Thr Asn Ser Thr Asp Thr Trp Gly 260 265 270 ggc ggc cgg cag acg gcc ggt gtc gac gcg cac tac ggc gcg gcc gtg 864 Gly Gly Arg Gln Thr Ala Gly Val Asp Ala His Tyr Gly Ala Ala Val 275 280 285 acc tgg gac ttc tac aag aac gtc ttc ggc cgc aac ggc atc cgc aac 912 Thr Trp Asp Phe Tyr Lys Asn Val Phe Gly Arg Asn Gly Ile Arg Asn 290 295 300 gac ggc aag gcc gcc tac tcc cgc gtc cac tac ggc aac agc tac gtg 960 Asp Gly Lys Ala Ala Tyr Ser Arg Val His Tyr Gly Asn Ser Tyr Val 305 310 315 320 aac gcc ttc tgg tcc gac tcc tgc ttc tgc atg acc tac ggc gac ggc 1008 Asn Ala Phe Trp Ser Asp Ser Cys Phe Cys Met Thr Tyr Gly Asp Gly 325 330 335 cag aac aac aag aac ccg ctc acc gcc ctc gac gtg gcg gcc cac gag 1056 Gln Asn Asn Lys Asn Pro Leu Thr Ala Leu Asp Val Ala Ala His Glu 340 345 350 atg agc cac ggc gtc acc gcc gcc acg gcc aag ctc gtg tac agc ggc 1104 Met Ser His Gly Val Thr Ala Ala Thr Ala Lys Leu Val Tyr Ser Gly 355 360 365 gag tcg ggc ggc ctc aac gag gcg acc agc gac atc ttc ggc acc gcc 1152 Glu Ser Gly Gly Leu Asn Glu Ala Thr Ser Asp Ile Phe Gly Thr Ala 370 375 380 gtc gag ttc tac gcc aac aac aag acc gac gtg ggc gac tac ctc atc 1200 Val Glu Phe Tyr Ala Asn Asn Lys Thr Asp Val Gly Asp Tyr Leu Ile 385 390 395 400 ggc gag aag atc aac atc tac ggc gac ggc aag ccg ctg cgc tac atg 1248 Gly Glu Lys Ile Asn Ile Tyr Gly Asp Gly Lys Pro Leu Arg Tyr Met 405 410 415 gac aag ccg agc aag gac ggc aag tcc aag gac agc tgg tac tcc ggc 1296 Asp Lys Pro Ser Lys Asp Gly Lys Ser Lys Asp Ser Trp Tyr Ser Gly 420 425 430 atc ggc ggg gtg gac gtc cac tac tcg tcc ggc ccg gcc aac cac ttc 1344 Ile Gly Gly Val Asp Val His Tyr Ser Ser Gly Pro Ala Asn His Phe 435 440 445 ttc tac ctg ctc tcc gag ggc agc ggg aag aag acg atc aac ggc gtg 1392 Phe Tyr Leu Leu Ser Glu Gly Ser Gly Lys Lys Thr Ile Asn Gly Val 450 455 460 gac tac gac agc ccg acc gcc gac ggg tcc aag gtc acc ggc atc ggc 1440 Asp Tyr Asp Ser Pro Thr Ala Asp Gly Ser Lys Val Thr Gly Ile Gly 465 470 475 480 cgg gac aag gcc cag aag atc tgg tac aag gcg ctg acc acg cag ttc 1488 Arg Asp Lys Ala Gln Lys Ile Trp Tyr Lys Ala Leu Thr Thr Gln Phe 485 490 495 acc tcg aac acc aac tac gcc aag gcg cgc acc ggc acc ctg aac gcc 1536 Thr Ser Asn Thr Asn Tyr Ala Lys Ala Arg Thr Gly Thr Leu Asn Ala 500 505 510 gcc gcg tcg ctc tac ggc aac aac agc gcg gag tac aag gcg gtg gcg 1584 Ala Ala Ser Leu Tyr Gly Asn Asn Ser Ala Glu Tyr Lys Ala Val Ala 515 520 525 gcg gcc tgg tcc gcc atc aac gtc aag tag 1614 Ala Ala Trp Ser Ala Ile Asn Val Lys 530 535 <210> 6 <211> 537 <212> PRT <213> Streptoverticillium mobaraense <400> 6 Val Leu Arg Leu Thr Ala Thr Pro Arg Thr Thr Ala Leu Arg Ala Ala 1 5 10 15 Ala Leu Val Ala Ser Ala Ala Met Val Val Val Gly Val Gln Thr Gly 20 25 30 Ser Ala Ser Ala Ser Gly Asp Arg Asp Ser Gly Gly Leu Pro Leu Thr 35 40 45 Leu Ser Ala Ser Gln Arg Thr Ala Ala Ile Gln Glu Ala Gln Ser Gly 50 55 60 Ala Ser Ala Thr Ala Ala Lys Ile Gly Leu Ser Gly Lys Glu Lys Leu 65 70 75 80 Ile Ala Arg Asp Val Val Lys Asp Ala Asp Gly Thr Val His Thr Arg 85 90 95 Tyr Glu Arg Thr Tyr Asp Gly Leu Pro Val Leu Gly Gly Asp Leu Ile 100 105 110 Val His Glu Ala Lys Ala Gly Arg Ser Val Thr Lys Ala Asn Asp Ala 115 120 125 Thr Ile Ala Leu Pro Ser Thr Asp Ala Ser Leu Ala Pro Ala Ala Ala 130 135 140 Lys Lys Ser Ala Leu Ser Ala Ala Ala Asp Gln Lys Thr Ala Lys Ala 145 150 155 160 Asp Gly Gln Ala Pro Arg Lys Val Val Trp Ala Ala Gln Gly Lys Pro 165 170 175 Val Leu Ala Tyr Glu Thr Val Val Thr Gly Val Gln Lys Asp Gly Thr 180 185 190 Pro Ser Glu Leu His Val Ile Thr Asp Ala Ala Ser Gly Lys Lys Leu 195 200 205 Tyr Gln Tyr Glu Ala Ile Glu Thr Gly Thr Gly Thr Ser Thr Tyr Ser 210 215 220 Gly Thr Val Pro Leu Thr Thr Thr Lys Ser Gly Ser Gln Tyr Gln Leu 225 230 235 240 Asn Asp Gly Ala Arg Gly Gly His Lys Thr Tyr Asp Leu Asn Gln Gly 245 250 255 Thr Ser Gly Thr Gly Ser Leu Phe Thr Asn Ser Thr Asp Thr Trp Gly 260 265 270 Gly Gly Arg Gln Thr Ala Gly Val Asp Ala His Tyr Gly Ala Ala Val 275 280 285 Thr Trp Asp Phe Tyr Lys Asn Val Phe Gly Arg Asn Gly Ile Arg Asn 290 295 300 Asp Gly Lys Ala Ala Tyr Ser Arg Val His Tyr Gly Asn Ser Tyr Val 305 310 315 320 Asn Ala Phe Trp Ser Asp Ser Cys Phe Cys Met Thr Tyr Gly Asp Gly 325 330 335 Gln Asn Asn Lys Asn Pro Leu Thr Ala Leu Asp Val Ala Ala His Glu 340 345 350 Met Ser His Gly Val Thr Ala Ala Thr Ala Lys Leu Val Tyr Ser Gly 355 360 365 Glu Ser Gly Gly Leu Asn Glu Ala Thr Ser Asp Ile Phe Gly Thr Ala 370 375 380 Val Glu Phe Tyr Ala Asn Asn Lys Thr Asp Val Gly Asp Tyr Leu Ile 385 390 395 400 Gly Glu Lys Ile Asn Ile Tyr Gly Asp Gly Lys Pro Leu Arg Tyr Met 405 410 415 Asp Lys Pro Ser Lys Asp Gly Lys Ser Lys Asp Ser Trp Tyr Ser Gly 420 425 430 Ile Gly Gly Val Asp Val His Tyr Ser Ser Gly Pro Ala Asn His Phe 435 440 445 Phe Tyr Leu Leu Ser Glu Gly Ser Gly Lys Lys Thr Ile Asn Gly Val 450 455 460 Asp Tyr Asp Ser Pro Thr Ala Asp Gly Ser Lys Val Thr Gly Ile Gly 465 470 475 480 Arg Asp Lys Ala Gln Lys Ile Trp Tyr Lys Ala Leu Thr Thr Gln Phe 485 490 495 Thr Ser Asn Thr Asn Tyr Ala Lys Ala Arg Thr Gly Thr Leu Asn Ala 500 505 510 Ala Ala Ser Leu Tyr Gly Asn Asn Ser Ala Glu Tyr Lys Ala Val Ala 515 520 525 Ala Ala Trp Ser Ala Ile Asn Val Lys 530 535 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 7 tcgggtgacc gtgacagcgg agggc 25 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 8 gcgagtagcc gaggtcgatc acgtc 25 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 9 aaattcctgt gaattagctg atttag 26 <210> 10 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 10 ctccgctgtc acggtcaccc gatgccgttg ccacaggtgc ggcc 44 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Streptoverticillium mobaraense <400> 11 Glu Pro Ser Phe Arg Ala Pro Asp Ser 1 5

Claims

방선균 유래 중성 메탈로프로테아제를 암호화하는 유전자를 도입한 미생물을 배양하여 방선균 유래 중성 메탈로프로테아제를 생산시키고, 미생물 유래 프로트랜스글루타미나제의 프로 구조부를 미생물이 생산한 방선균 유래 중성 메탈로프로테아제에 의해 절단함을 특징으로 하는, 미생물 유래 프로트랜스글루타미나제로부터 활성형 미생물 유래 트랜스글루타미나제를 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 방선균 유래 중성 메탈로프로테아제를 암호화하는 유전자를 도입한 미생물이 코리네형 세균인, 활성형 미생물 유래 트랜스글루타미나제를 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 방선균 유래 중성 메탈로프로테아제가 이하의 성질을 갖는, 활성형 미생물 유래 트랜스글루타미나제를 제조하는 방법:

1) 분자량이 약 35,000,

2) 최적 pH가 약 7.0,

3) pH 4 내지 10에서 안정적이고,

4) 최적 온도가 약 45℃,

5) 약 50℃ 이하에서 안정적이고,

6) 메탈로프로테아제 억제제인 에틸렌디아민4아세트산, 1,10-페난트롤린 및 포스포르아미돈, 및 방선균 유래 서브틸리신 억제 단백질(SSI)에 의해 강하게 억제된다.
제1항에 있어서, 방선균 유래 중성 메탈로프로테아제가 이하의 성질을 갖는 활성형 미생물 유래 트랜스글루타미나제를 제조하는 방법.

1) 분자량이 약 71,000,

2) 최적 pH가 약 7.0,

3) pH 5 내지 10에서 안정적이고,

4) 최적 온도가 약 55℃

5) 메탈로프로테아제 억제제인 에틸렌디아민4아세트산, 1,10-페난트롤린 및 포스포르아미돈, SH-환원제인 디티오트레이톨 및 방선균 유래 서브틸리신 억제 단백질(SSI)에 의해 강하게 억제된다.
이하의 성질을 갖는 방선균 유래 중성 메탈로프로테아제:

1) 분자량이 약 35,000,

2) 최적 pH가 약 7.0,

3) pH 4 내지 10에서 안정적이고,

4) 최적 온도가 약 45℃,

5) 약 50℃ 이하에서 안정적이고,

6) 메탈로프로테아제 억제제인 에틸렌디아민4아세트산, 1,10-페난트롤린 및 포스포르아미돈, 및 방선균 유래 서브틸리신 억제 단백질(SSI)에 의해 강하게 억제된다.
이하의 성질을 갖는 방선균 유래 중성 메탈로프로테아제:

1) 분자량이 약 71,OOO,

2) 최적 pH가 약 7.0,

3) pH 5 내지 10에서 안정적이고,

4) 최적 온도가 약 55℃

5) 메탈로프로테아제 억제제인 에틸렌디아민4아세트산, 1,10-페난트롤린 및 포스포르아미돈, SH-환원제인 디티오트레이톨, 및 방선균 유래 서브틸리신 억제 단백질(SSI)에 의해 강하게 억제된다.
제5항 또는 제6항에 따르는 방선균 유래 중성 메탈로프로테아제를 암호화하는 핵산 분자.
제7항에 따르는 핵산 분자가 도입된 코리네형 세균을 배양하여, 코리네형 세균의 균체 외부로 분비된 방선균 유래 중성 메탈로프로테아제를 회수함을 특징으로 하는, 방선균 유래 중성 메탈로프로테아제를 제조하는 방법.