KR101653555B1 - 단백질의 분비 생산 방법 - Google Patents

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Abstract

이종 단백질의 분비 생산방법은 분비 생산에 의해 이종 단백질을 생성하는 코리네형 세균(coryneform bacterium)의 능력을 개선하는 신규 기술을 개발함으로써 제공된다. 발현 숙주로서 페니실린-결합 단백질의 활성이 감소되도록 개질시켰고 세포 표면층 단백질의 활성이 감소된, 분비 생산에 의해 이종 단백질을 생성하는 능력을 갖는 코리네형 세균을 이용함으로써, 이종 단백질이 분비 생산에 의해 생성된다.

Description

단백질의 분비 생산 방법{METHOD FOR SECRETORY PRODUCTION OF PROTEIN}
본 발명은, 분비 생산(secretory production)에 의해 이종 단백질을 효율적으로 생산하는 코리네형 세균(coryneform bacterium) 및 이종 단백질의 분비 생산방법에 관한 것이다.
미생물에 의한 이종 단백질의 분비 생산으로서, 지금까지 바실러스 세균(Bacillus bacterium)(비특허문헌 1), 메탄올-동화(assimilating) 효모, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)(비특허문헌 2), 및 아스페르길루스 속(genus Aspergillus)의 사상 진균(비특허문헌 3 및 비특허문헌 4) 등에 의한 이종 단백질의 분비 생산이 보고되어 왔다.
또한, 코리네형 세균에 의한 이종 단백질의 분비 생산이 시도되고 있다. 코리네형 세균에 의한 이종 단백질의 분비 생산에 관해서, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)[이하에 씨. 글루타미쿰(C. glutamicum)으로서도 약기됨]에 의한 뉴클레아제 및 리파제의 분비(특허문헌 1, 비특허문헌 5), 서브틸리신(subtilisin)과 같은 프로테아제의 분비(비특허문헌 6), 코리네형 세균의 세포 표면층 단백질 PS1 및 PS2(CspB로서도 언급됨)의 신호 펩타이드를 사용한 단백질의 분비(특허문헌 2), PS2 (CspB)의 신호 펩타이드를 사용한 피브로넥틴-결합 단백질의 분비(비특허문헌 7), 코리네형 세균의 세포 표면층 단백질 PS2(CspB) 및 SlpA(CspA로서도 언급됨)의 신호 펩타이드를 사용한 프로트랜스글루타미나제의 분비(특허문헌 3), 변이체 형태의 분비 시스템을 사용한 단백질의 분비(특허문헌 4), 변이체 균주에 의한 프로트랜스글루타미나제의 분비(특허문헌 5) 및 Tat-의존성 신호 펩타이드를 사용한 단백질의 분비(특허문헌 6) 등이 보고되어 왔다.
분비 생산에 의해 생산되는 단백질로서 다양한 단백질들이 고려된다. 그러나, 코리네형 세균에 의한 이종 단백질의 분비 생산에 관해서, 복수의 서브유닛들로 이루어진 임의의 다합체 단백질, 예를 들면, 항체-관련 분자의 분비 생산은 보고되지 않았다.
페니실린-결합 단백질(penicillin-binding protein)(PBP)은 β-락탐 유형의 항생제와 결합하는 단백질의 총칭이고, 이 단백질의 효소적 기능은, β-락탐 유형의 항생제와의 결합에 의해 저해된다. PBP는 일반적으로 막-결합 단백질이고, 이들은 진정세균(eubacteria)의 세포벽 합성에 필수적인 것으로 여겨진다. PBP는 이의 분자량에 따라 고분자량 PBP(HMW-PBP) 및 저분자량 PBP(LMW-PBP)로 분류된다. 이들 중에서도, HMW-PBP는, 펩티도글리칸 모이어티(moiety)를 가교결합시키기 위한 트랜스펩티다제 활성을 갖는 트랜스펩티다제 활성 도메인 및 이당류로부터 다당류 쇄를 형성하기 위한 트랜스글리코실라제 활성을 갖는 트랜스글리코실라제 활성 도메인 둘 다를 갖는 클래스 A 고분자량 PBP(클래스 A HMW-PBP), 및 단지 트랜스펩티다제 활성 도메인만을 갖는 클래스 B 고분자량 PBP(클래스 B HMW-PBP)로 추가로 분류된다.
씨. 글루타미쿰의 PBP에 대한 발견은 비특허문헌 8 및 비특허문헌 9 등에 상세히 기술되어 있다. 씨. 글루타미쿰에서, 지금까지, 9개 이상의 PBP 동족체들이 발견되었다. 이들 중 5개는 2개의 클래스 A HMW-PBP(PBP1a, PBP1b) 및 3개의 클래스 B HMW-PBP(FtsI, PBP2a, PBP2b)를 포함하는 HMW-PBP이다. 씨. 글루타미쿰의 클래스 A HMW-PBP는 세포 확장에 관여하는 인자이고, 그룹 B HMW-PBP는 세포 분할시에 격벽의 펩티도글리칸의 형성에 관여하는 인자임이 공지되어 있다.
세포 표면층 단백질은, 세균 및 고세균의 세포 표면층(S-층)을 구성하는 단백질이다. 코리네형 세균의 세포 표면층 단백질로서, 씨. 글루타미쿰의 PS1 및 PS2(CspB)(비특허문헌 10), 및 씨. 스타티오니스(C. stationis)의 SlpA(CspA)(특허문헌 2) 등이 공지되어 있다. PS2 (CspB)에 관해서, 예를 들면, 씨. 글루타미쿰의 28개 균주의 CspB 동족체의 아미노산 서열이 보고되어 왔다(비특허문헌 11). 상기 기술한 바와 같이, 코리네형 세균의 세포 표면층 단백질의 신호 펩타이드가 단백질의 분비 생산에 이용된다(특허문헌 2 및 특허문헌 3 등).
그러나, 페니실린-결합 단백질의 활성의 감소 및/또는 세포 표면층 단백질의 활성의 감소와 이종 단백질의 분비 생산 사이의 관계는 알려져 있지 않다.
특허문헌 1: 미국 특허 제4,965,197호 특허문헌 2: 일본 특허 공개공보(Kohyo) 제6-502548호 특허문헌 3: 일본 특허 제4320769호 특허문헌 4: 일본 특허 공개 공보(Kokai) 제11-169182호 특허문헌 5: 일본 특허 제4362651호 특허문헌 6: 일본 특허 제4730302호
비특허문헌 1: Microbiol, rev., 57, 109-137 (1993) 비특허문헌 2: Biotechnol., 11, 905-910 (1993) 비특허문헌 3: Biotechnol., 6, 1419-1422 (1988) 비특허문헌 4: Biotechnol., 9, 976-981 (1991) 비특허문헌 5: J. Bacteriol., 174, 1854-1861 (1992) 비특허문헌 6: Appl. Environ. Microbiol., 61, 1610-1613 (1995) 비특허문헌 7: Appl. Environ. Microbiol., 63, 4392-4400 (1997) 비특허문헌 8: Mol. Microbiol., 66, 643-57 (2007) 비특허문헌 9: Antonie Van Leeuwenhoek, 94, 99-109 (2008) 비특허문헌 10: Mol. Microbiol., 9, 97-109 (1993) 비특허문헌 11: J Biotechnol., 112, 177-193 (2004)
본 발명의 요약
본 발명에 의해 달성되는 목적
본 발명의 목적은, 분비 생산에 의해 이종 단백질을 생산하기 위한 코리네형 세균의 능력을 개선하기 위한 신규 기술을 개발함으로써, 분비 생산에 의해 이종 단백질을 생산하는 코리네형 세균 및 상기 세균을 이용한 이종 단백질의 분비 생산방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위한 수단
본 발명의 본 발명자들은, 상기 언급한 목적을 달성하기 위하여 다양한 연구를 수행하였고, 그 결과, 본 발명자들은, 발현 숙주로서 코리네형 세균을 이용하는 이종 단백질의 생산 방법에서, 분비 생산에 의해 이종 단백질을 생산하는 코리네형 세균의 능력이 페니실린-결합 단백질 PBP1a를 암호화하는 유전자 및 코리네형 세균의 세포 표면층 단백질 CspB를 암호화하는 유전자를 결실시킴으로써 개선될 수 있음을 밝혀내어, 본 발명을 완성할 수 있었다.
따라서, 본 발명은 다음을 제공한다.
[1]
분비 생산(secretory production)에 의해 이종 단백질을 생산하는 능력을 갖는 코리네형 세균(coryneform bacterium)으로서,
상기 코리네형 세균은, 페니실린-결합 단백질의 활성이 감소되도록 개질되었고, 여기서, 세포 표면층 단백질의 활성이 감소되었으며,
여기서, 상기 페니실린-결합 단백질은, 이의 활성이 코리네형 세균에서 감소되는 경우, 분비 생산에 의해 생산되는 이종 단백질의 양이 비-개질된 균주에 대해 관찰되는 것과 비교하여 증가되는 특성을 갖는 단백질인,
분비 생산에 의해 이종 단백질을 생산하는 능력을 갖는 코리네형 세균.
[2]
상기 코리네형 세균은, 상기 페니실린-결합 단백질의 활성이, 페니실린-결합 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 약화시키거나 상기 유전자를 파괴함으로써 감소되도록, 개질된, 상기 언급된 코리네형 세균.
[3]
상기 페니실린-결합 단백질이 PBP1a인, 상기 언급된 코리네형 세균.
[4]
상기 페니실린-결합 단백질이, 하기 (A) 또는 (B)에 정의된 단백질인, 상기 언급된 코리네형 세균:
(A) 서열번호 82의 아미노산 서열을 갖는 단백질,
(B) 1 내지 10개 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입 또는 부가를 포함하는 서열번호 82의 아미노산 서열을 갖는 단백질로서,
상기 단백질의 활성이 코리네형 세균에서 감소되는 경우, 분비 생산에 의해 생산되는 이종 단백질의 양이 비-개질된 균주에 대해 관찰되는 것과 비교하여 증가되는 특성을 갖는 단백질.
[5]
상기 코리네형 세균은, 상기 세포 표면층 단백질의 활성이, 상기 세포 표면층 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 약화시키거나 상기 유전자를 파괴함으로써 감소되도록, 개질된, 상기 언급된 코리네형 세균.
[6]
상기 세포 표면층 단백질이 CspB인, 상기 언급된 코리네형 세균.
[7]
상기 세포 표면층 단백질이, 하기 (A) 또는 (B)에 정의된 단백질인, 상기 언급된 코리네형 세균:
(A) 서열번호 98의 아미노산 서열을 갖는 단백질,
(B) 1 내지 10개 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입 또는 부가를 포함하는 서열번호 98의 아미노산 서열을 갖는 단백질로서,
상기 단백질의 활성이 코리네형 세균에서 감소되는 경우, 분비 생산에 의해 생산되는 이종 단백질의 양이 비-개질된 균주에 대해 관찰되는 것과 비교하여 증가되는 특성을 갖는 단백질.
[8]
코리네박테리움(Corynebacterium) 또는 브레비박테리움(Brevibacterium) 속에 속하는 세균인, 상기 언급된 코리네형 세균.
[9]
코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)인, 상기 언급된 코리네형 세균.
[10]
상기 코리네형 세균이 상기 이종 단백질의 분비 발현을 위한 유전자 작제물(genetic construct)을 갖고,
여기서, 상기 유전자 작제물은 코리네형 세균에서 기능하는 프로모터 서열, 상기 프로모터 서열로부터 하류에 결찰되고 상기 코리네형 세균에서 기능하는 신호 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열, 및 상기 신호 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열로부터 하류에 결찰되고 상기 이종 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 상기 언급된 코리네형 세균.
[11]
상기 이종 단백질이 항체-관련 분자인, 상기 언급된 코리네형 세균.
[12]
상기 항체-관련 분자가, Fab, F(ab')2, Fc-융합 단백질, 및 scFv로부터 선택되는 하나 이상의 단백질로 이루어진, 상기 언급된 코리네형 세균.
[13]
상기 언급된 코리네형 세균을 배양하고, 분비 생산에 의해 생산되는 이종 단백질을 수집함을 포함하는, 이종 단백질의 생산 방법.
도 1은, 트라스투주맙(trastuzumab)의 Fab 단편의 H 쇄 영역이 YDK010 균주(모 균주) 및 YDKO1OΔPBP1a 균주에서 발현된 경우에 대해 수행되는 환원된 SDS-PAGE의 결과를 나타내는 사진이다.
도 2는, 트라스투주맙의 Fab 단편의 H 쇄 영역이 YDK010 균주(모 균주) 및 YDKO1OΔPBP1a 균주 및 YDKO1OΔPBP1b 균주에서 발현된 경우에 대해 수행되는 환원된 SDS-PAGE의 결과를 나타내는 사진이다.
도 3은, 트라스투주맙의 Fab 단편의 H 쇄 영역이 YDK010 균주(모 균주) 및 YDKO1OΔPBP1a 균주에서 발현된 경우에 대해 수행되는 환원된 SDS-PAGE의 결과를 나타내는 사진이다.
도 4는, 트라스투주맙의 Fab 단편의 L 쇄 영역이 YDK010 균주(모 균주) 및 YDKO1OΔPBP1a 균주에서 발현된 경우에 대해 수행되는 환원된 SDS-PAGE의 결과를 나타내는 사진이다.
도 5는, 트라스투주맙의 Fab 단편의 H 쇄 영역 및 L 쇄 영역이 YDK010 균주(모 균주) 및 YDKO1OΔPBP1a 균주에서 동시-발현된 경우에 대해 수행되는 비-환원된 SDS-PAGE의 결과를 나타내는 사진이다.
도 6은, 트라스투주맙의 F(ab')2 단편이 YDK010 균주(모 균주) 및 YDKO1OΔPBP1a 균주에서 발현된 경우에 대해 수행되는 웨스턴 블롯팅(Western blotting)의 결과를 나타내는 사진이다.
도 7은, 트라스투주맙의 Fc 단편이 YDK010 균주(모 균주) 및 YDKO1OΔPBP1a 균주에서 발현된 경우에 대해 수행되는 웨스턴 블롯팅의 결과를 나타내는 사진이다.
도 8은, YDK010 균주(모 균주) 및 YDKO1OΔPBP1a 균주에서 발현된 프로트랜스글루타미나제의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 9는, 항-디곡신 단일쇄 항체가 YDK010 균주(모 균주) 및 YDKO1OΔPBP1a 균주에서 발현된 경우에 대해 수행되는 환원된 SDS-PAGE의 결과를 나타내는 사진이다.
도 10은, 아달리무맙(adalimumab)의 Fab(H&L) 단편이 YDK010 균주(모 균주) 및 YDKO1OΔPBP1a 균주에서 발현된 경우에 대해 수행되는 비-환원된 SDS-PAGE의 결과를 나타내는 사진이다.
도 11은, 트라스투주맙의 Fab(H&L) 단편이 ATCC13869 균주(모 균주), ATCC13869ΔCspB 균주, ATCC13869ΔPBP1a 균주, 및 ATCC13869ΔCspBΔPBP1a 균주에서 발현된 경우에 대해 수행되는 비-환원된 SDS-PAGE의 결과를 나타내는 사진이다.
<1> 본 발명의 코리네형 세균
본 발명은, 페니실린-결합 단백질의 활성이 감소되도록 개질시켰고, 세포 표면층 단백질의 활성이 감소된, 분비 생산에 의해 이종 단백질을 생산하는 능력을 갖는 코리네형 세균을 제공한다(이하에는 "본 발명의 세균" 또는 "본 발명의 코리네형 세균"으로서도 언급됨).
본 발명에서, 단백질이 "분비된다"는 표현은 단백질이 세균 세포로부터 수송됨(세포외 수송)을 의미한다. 단백질이 "분비된다"는 표현은 물론 단백질의 모든 분자가 완전히 유리된 형태로 배지에 실제로 존재하는 경우를 포함하며, 또한 단백질의 모든 분자가 세포 표면층에 존재하는 경우, 및 단백질 분자의 일부가 배지에 존재하고, 분자의 나머지 부분은 세포 표면층에 존재하는 경우를 포함한다.
즉, 본 발명에서, "분비 생산에 의해 이종 단백질을 생산하는 능력"은 이종 단백질을 배지 또는 세포 표면층으로 분비하고, 세균이 배지에서 배양되는 경우에, 이종 단백질이 배지 또는 세포 표면층으로부터 수집될 수 있는 정도로 이종 단백질을 배지 또는 세포 표면층에 축적하는 본 발명의 세균의 능력을 의미한다. 축적량에 관해서, 예를 들면, 배지에서의 축적량은 바람직하게는 10㎍/L 이상, 보다 바람직하게는 1mg/L 이상, 특히 바람직하게는 100mg/L 이상, 더욱 바람직하게는 1g/L 이상일 수 있다. 또한, 축적량에 관해서, 예를 들면, 세포 표면층에서의 축적량은 세포 표면층의 이종 단백질이 배지와 동일한 액체 용적으로 수집되고 현탁된다면, 현탁액중 이종 단백질의 농도가 바람직하게는 10㎍/L 이상, 보다 바람직하게는 1mg/L 이상, 특히 바람직하게는 100mg/L 이상이 되도록 하는 정도일 수 있다. 또한, 본 발명에서, 용어 분비 생산에 의해 생산되는 "단백질"은 펩타이드 또는 폴리펩타이드라고 칭하는 것들을 포함하는 단백질의 개념을 의미한다.
본 발명에서, "이종 단백질(heterologous protein)"은 이종 단백질을 발현하고 분비하는 코리네형 세균을 위한 외인성 단백질을 의미한다. 이종 단백질은, 예를 들면, 미생물로부터 유도된 단백질, 식물로부터 유도된 단백질, 동물로부터 유도된 단백질, 바이러스로부터 유도된 단백질, 또는 심지어 아미노산 서열이 인공적으로 고안된 단백질일 수 있다. 이종 단백질은 단량체 단백질 또는 다합체 단백질일 수 있다. 다합체 단백질은, 둘 이상의 서브유닛으로 이루어진 다합체로서 존재할 수 있는 단백질을 의미한다. 다합체에서, 서브유닛은 공유 결합(예: 디설파이드 결합)에 의해 결합되거나, 비-공유 결합(예: 수소 결합 및 소수성 상호작용)에 의해 결합되거나, 이들의 조합에 의해 결합될 수 있다. 다합체는 바람직하게는 하나 이상의 분자간 디설파이드 결합을 포함한다. 다합체는 한 종류의 서브유닛으로 이루어진 동형-다합체(homo-multimer)이거나, 두 종류 이상의 서브유닛으로 이루어진 이형-다합체(hetero-multimer)일 수 있다. 다합체가 이형-다합체인 경우에, 이형-다합체를 구성하는 서브유닛으로부터 선택된 적어도 1개의 서브유닛이 이종 단백질인 것이 충분하다. 즉, 모든 서브유닛은 이종일 수 있거나, 서브유닛의 단지 일부만이 이종일 수 있다. 이종 단백질은 본래 분비 단백질일 수 있거나, 본래 비-분비 단백질일 수 있지만, 본래 분비 단백질인 것이 바람직하다. "이종 단백질"의 구체예는 이하에 언급될 것이다.
생산되는 이종 단백질은, 한 종류의 단백질, 또는 두 종류 이상의 단백질로 이루어질 수 있다. 또한, 이종 단백질이 이형-다합체인 경우에, 단지 한 종류의 서브유닛이 생산될 수 있거나, 두 종류 이상의 서브유닛이 생산될 수 있다. 즉, "이종 단백질의 분비 생산"은 표적 이종 단백질을 구성하는 서브유닛의 단지 일부의 분비 생산뿐만 아니라, 표적 이종 단백질을 구성하는 모든 서브유닛의 분비 생산도 포함한다.
본 발명에서, 코리네형 세균은 호기성 그램-양성 바실러스이고, 코리네박테리움 세균, 브레비박테리움 세균, 및 마이크로박테리움 세균 등을 포함한다. 코리네형 세균은, 기존에 브레비박테리움 속으로 분류되었지만 현재 코리네박테리움 속으로 통합된 세균을 포함한다(Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1991)). 코리네형 세균은, 또한, 이전에 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes)로 분류되었지만 현재 16S rRNA의 뉴클레오타이드 서열 분석 등에 의해 코리네박테리움 스타티오니스(Corynebacterium stationis)로 재분류된 세균을 포함한다(Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 60, 874-879 (2010)). 코리네형 세균들의 사용 이점은, 이들이, 단백질의 분비 생산에 통상 사용되는, 진균, 효모 및 바실러스 세균과 비교하여 본래 세포 밖으로 극소량의 단백질을 분비하므로, 분비 생산에 의해 생산되는 이종 단백질의 정제 공정이 단순화되거나 제거될 수 있다는 사실, 이들이, 사카라이드, 암모니아, 무기염 등을 함유하는 단순 배지에서 잘 성장할 수 있으므로, 이들은, 배지 비용, 배양법 및 배양 생산성 등의 관점에서 우수하다는 사실을 포함한다.
상기 코리네형 세균의 구체예는 다음 종을 포함한다:
코리네박테리움 아세토아시도필룸(Corynebacterium acetoacidophilum)
코리네박테리움 아세토글루타미쿰(Corynebacterium acetoglutamicum)
코리네박테리움 알카놀리티쿰(Corynebacterium alkanolyticum)
코리네박테리움 칼루나에(Corynebacterium callunae)
코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)
코리네박테리움 릴리움(Corynebacterium lilium)
코리네박테리움 멜라세콜라(Corynebacterium melassecola)
코리네박테리움 써모아미노게네스(Corynebacterium thermoaminogenes) (코리네박테리움 에피시엔스(Corynebacterium efficiens))
코리네박테리움 헤르큘리스(Corynebacterium herculis)
브레비박테리움 디바리카툼(Brevibacterium divaricatum)
브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum)
브레비박테리움 임마리오필룸(Brevibacterium immariophilum)
브레비박테리움 락토페르멘툼(Brevibacterium lactofermentum) (코리네박테리움 글루타미쿰)
브레비박테리움 로세움(Brevibacterium roseum)
브레비박테리움 사카롤리티쿰(Brevibacterium saccharolyticum)
브레비박테리움 티오게니탈리스(Brevibacterium thiogenitalis)
코리네박테리움 암모니아게네스 (코리네박테리움 스타티오니스)
브레비박테리움 알붐(Brevibacterium album)
브레비박테리움 세리눔(Brevibacterium cerinum)
마이크로박테리움 암모니아필룸(Microbacterium ammoniaphilum)
상기 코리네형 세균의 구체예는 다음 균주를 포함한다:
코리네박테리움 아세토아시도필룸 ATCC 13870
코리네박테리움 아세토글루타미쿰 ATCC 15806
코리네박테리움 알카놀리티쿰 ATCC 21511
코리네박테리움 칼루나에 ATCC 15991
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13020, ATCC 13032, ATCC 13060, ATCC 13869, FERM BP-734
코리네박테리움 릴리움 ATCC 15990
코리네박테리움 멜라세콜라 ATCC 17965
코리네박테리움 써모아미노게네스 AJ12340 (FERM BP-1539)
코리네박테리움 헤르큘리스 ATCC 13868
브레비박테리움 디바리카툼 ATCC 14020
브레비박테리움 플라붐 ATCC 13826, ATCC 14067, AJ12418 (FERM BP-2205)
브레비박테리움 임마리오필룸 ATCC 14068
브레비박테리움 락토페르멘툼 ATCC 13869
브레비박테리움 로세움 ATCC 13825
브레비박테리움 사카롤리티쿰 ATCC 14066
브레비박테리움 티오게니탈리스 ATCC 19240
코리네박테리움 암모니아게네스 (코리네박테리움 스타티오니스) ATCC 6871, ATCC 6872
브레비박테리움 알붐 ATCC 15111
브레비박테리움 세리눔 ATCC 15112
마이크로박테리움 암모니아필룸 ATCC 15354
이들 균주는, 예를 들면, ATCC(American Type Culture Collection)(주소: 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America)로부터 입수가능하다. 즉, 각각의 균주는 고유한 등록 번호(http://www.atcc.org/)로 제공되고, 이 등록 번호를 사용함으로써 주문할 수 있다. 각각의 균주의 등록 번호가 ATCC 카탈로그에 열거되어 있다.
특히, 스트렙토마이신(Sm) 내성 돌연변이 균주로서 야생 균주(wild strain) 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869로부터 단리된, 씨. 글루타미쿰 AJ12036 균주(FERM BP-734)는 단백질의 분비에 관여하는 기능성 유전자에 돌연변이를 갖는 것으로 예상되고, 최적의 배양 조건 하에 단백질의 축적량의 관점에서 모 균주(야생 균주)와 비교하여 약 2 내지 3배만큼 높은 단백질에 대한 매우 높은 분비 생산 능력을 보여주므로, 숙주 세균으로서 바람직하다. AJ12036 균주(FERM BP-734)는 국제 기탁으로서 1984년 3월 26일자로 더 내셔널 인스티튜트 오브 바이오사이언스 앤드 휴먼-테크놀로지, 에이전시 오브 인더스트리얼 사이언스 앤드 테크놀로지(the National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology)[현재, 더 인코포레이티드 어드미니스트러티브 에이전시, 내셔널 인스티튜트 오브 테크놀로지 앤드 이벨류에이션(the incorporated administrative agency, National Institute of Technology and Evaluation), 특허 생물 기탁 센터(International Patent Organism Depositary), AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan 소재]에 처음 기탁되었고, FERM BP-734의 기탁 번호로 부여되었다.
또한, 분비 생산에 의해 단백질을 생산하는 개선된 능력을 가진 균주는 돌연변이유발 방법 또는 유전자 재조합 방법을 사용하여 모 균주로서 상기 언급한 바와 같은 코리네형 세균으로부터 수득된 코리네형 세균으로부터 선택되어, 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 모 균주를 자외선 조사 또는 화학적 돌연변이 제제(예: N-메틸-N'-니트로소구아니딘)로 처리한 후, 분비 생산에 의해 단백질을 생산하는 개선된 능력을 가진 균주를 선택할 수 있다.
또한, 균주가 숙주로서 세포 표면층 단백질을 생산하지 않도록 상기 언급한 바와 같이 균주를 개질시켜 수득되는 경우, 배지에 분비된 이종 단백질의 정제가 용이해지므로, 특히 바람직하다. 상기 개질은, 돌연변이유발 또는 유전자 재조합에 의해 염색체 상의 세포 표면층 단백질의 암호화 영역 또는 이의 발현 제어 영역으로 돌연변이를 도입시켜 수행할 수 있다. 세포 표면층 단백질을 생산하지 않도록 개질된 코리네형 세균의 예로는 씨. 글루타미쿰 YDK010 균주(제W02004/029254호)가 포함되며, 이는 씨. 글루타미쿰 AJ12036 균주(FERM BP-734)의 세포 표면층 단백질 PS2 결핍 균주이다.
분비 생산에 의해 이종 단백질을 생산하는 능력을 가진 코리네형 세균은, 이종 단백질의 분비 발현을 위한 유전자 작제물을 상기 언급한 바와 같은 코리네형 세균으로 도입시킴으로써 작제물이 세균에 의해 하버링(harboring)되도록 하여 수득할 수 있다. 즉, 본 발명의 세균은 이종 단백질의 분비 발현을 위한 유전자 작제물을 갖는다. "이종 단백질의 분비 발현을 위한 유전자 작제물" 및 이의 도입 방법은 이하에 설명될 것이다.
본 발명의 세균은, 분비 생산에 의해 이종 단백질을 생산하는 능력을 갖는 코리네형 세균을, 페니실린-결합 단백질의 활성 및 세포 표면층 단백질의 활성이 감소되도록 개질시킴으로써, 수득할 수 있다. 대안으로, 본 발명의 세균은, 또한, 코리네형 세균을, 페니실린-결합 단백질의 활성 및 세포 표면층 단백질의 활성이 감소되도록 개질시킨 다음, 이것에 분비 생산에 의해 이종 단백질을 생산하는 능력을 부여함으로써 수득할 수 있다. 또한, 본 발명의 세균은, 코리네형 세균을, 이의 세포 표면층 단백질의 활성이 본질적으로 감소되어 세균이 이종 단백질을 생산하는 능력을 갖고, 페니실린-결합 단백질의 활성이 감소되도록 개질시킴으로써도 수득할 수 있다. 본 발명에서, 본 발명의 세균을 작제하는 능력의 개질 및 부여는 임의의 순서로 수행할 수 있다. 본 발명의 세균은, 페니실린-결합 단백질의 활성 및/또는 세포 표면층 단백질의 활성이 감소되도록 그것을 개질시키기 전에 분비 생산에 의해 이종 단백질을 생산할 수 있는 세균으로부터 수득된 세균일 수 있다. 또한, 본 발명의 세균은, 심지어 페니실린-결합 단백질의 활성 및/또는 세포 표면층 단백질의 활성이 감소되도록 그것을 개질시키기 전에 이종 단백질의 분비 발현을 위한 유전자 작제물을 갖는 경우에도, 분비 생산에 의해 이종 단백질을 생산할 수 없는 세균으로부터 수득된 세균일 수도 있고, 이는 페니실린-결합 단백질의 활성 및/또는 세포 표면층 단백질의 활성이 감소되도록 하는 개질의 결과로서 분비 생산에 의해 이종 단백질을 생산할 수 있게 된다. 또한, 본 발명의 세균은, 메탈로펩티다제를 암호화하는 유전자 또는 메탈로펩티다제의 모티프에 상동성인 영역을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자의 발현이 증가되도록 추가로 개질시킬 수 있다.
이하에, 페니실린-결합 단백질 및 이들을 암호화하는 유전자를 설명할 것이다.
일반적으로, 페니실린-결합 단백질(PBP)은 β-락탐 유형 항생제와 결합되는 단백질을 의미하며, 이의 효소적 기능은 β-락탐 유형 항생제와 결합됨으로써 저해된다. 페니실린-결합 단백질은 고분자량 PBP(HMW-PBP) 및 저분자량 PBP(LMW-PBP)를 포함한다. 고분자량 PBP는 클래스 A 고분자량 PBP(클래스 A HMW-PBP), 및 클래스 B 고분자량 PBP (클래스 B HMW-PBP)를 포함한다. 클래스 A HMW-PBP는 펩티도글리칸 모이어티를 가교결합시키는 트랜스펩티다제 활성을 갖는 트랜스펩티다제 활성 도메인 및 이당류로부터 다당류 쇄를 형성하는 트랜스글리코실라제 활성을 갖는 트랜스글리코실라제 활성 도메인 둘 다를 갖는다. 클래스 B HMW-PBP는 트랜스펩티다제 활성 도메인을 갖는다. 예를 들면, 씨. 글루타미쿰에 관해서, PBP1a 및 PBP1b가 클래스 A HMW-PBP로서 언급될 수 있다. 씨. 글루타미쿰에 관해서, FtsI, PBP2a, 및 PBP2b가 클래스 B HMW-PBP로서 언급될 수 있다.
본 발명에서, 페니실린-결합 단백질인 단백질로서, 이의 활성이 코리네형 세균에서 감소되는 경우, 분비 생산에 의해 생산되는 이종 단백질의 양이 비-개질된 균주에 대해 관찰된 것과 비교하여 증가되는 특성을 갖는 상기 단백질의 활성은 감소된다. 상기 페니실린-결합 단백질로서, 예를 들면, PBP1a, 클래스 B HMW-PBP, 및 LMW-PBP로부터 선택된 것이 바람직하고, PBP1a 및 클래스 B HMW-PBP로부터 선택된 것이 보다 바람직하며, PBP1a가 특히 바람직하다.
"단백질의 활성이 코리네형 세균에서 감소되는 경우, 분비 생산에 의해 생산되는 이종 단백질의 양은 비-개질된 균주에 대해 관찰된 것과 비교하여 증가되는 특성"은, 단백질의 활성이 코리네형 세균에서 감소되는 경우, 비-개질된 균주(예: 야생 균주 또는 모 균주)에 대해 관찰된 것보다 더 많은 양으로 분비 생산에 의해 이종 단백질을 생산하는 능력이 코리네형 세균에 부여되는 특성을 의미한다. 분비 생산에 의해 생산되는 이종 단백질 양의 증가 정도가, 분비 생산에 의해 생산되는 이종 단백질의 양이 비-개질된 균주에 대해 관찰된 것과 비교하여 증가되는 한 특별히 제한되지 않음에도 불구하고, 비-개질된 균주에 대해 관찰된 것보다 더 많은 양으로 분비 생산에 의해 이종 단백질을 생산함은, 예를 들면, 배지 및/또는 세포 표면층의 축적량의 관점에서, 바람직하게는 10% 이상, 보다 바람직하게는 20% 이상, 특히 바람직하게는 30% 이상, 더욱 바람직하게는 100% 이상 만큼 비-개질된 균주에 대해 관찰된 것보다 더 많은 양으로 분비 생산에 의해 이종 단백질을 생산함을 의미할 수 있다. 또한, 비-개질된 균주에 대해 관찰된 것보다 더 많은 양으로 분비 생산에 의해 이종 단백질을 생산함은, 이종 단백질이, 비-개질된 균주의 비-농축 배양 상청액을 SDS-PAGE에 적용시키고 CBB로 염색하는 경우에 검출될 수 없는 반면에, 이종 단백질이, 개질된 균주의 비-농축 상청액을 SDS-PAGE에 적용시키고 CBB로 염색하는 경우에 검출될 수 있음을 의미할 수 있다.
또한, 페니실린-결합 단백질에 대해 "단백질의 활성이 코리네형 세균에서 감소되는 경우, 분비 생산에 의해 생산되는 이종 단백질의 양이 비-개질된 균주에 대해 관찰된 것과 비교하여 증가되는 특성"은, 단백질의 활성이 세포 표면층 단백질의 활성이 감소되지 않는 균주에서 감소되는 경우, 분비 생산에 의해 이종 단백질을 생산하는 균주의 능력은 증가되지 않지만, 단백질의 활성이 세포 표면층 단백질의 활성이 감소되는 균주에서 감소되는 경우, 분비 생산에 의해 이종 단백질을 생산하는 균주의 능력은 증가되는 특성을 포함한다.
단백질의 활성이 코리네형 세균에서 감소되는 경우, 단백질이, 분비 생산에 의해 생산되는 이종 단백질의 양이 비-개질된 균주에 대해 관찰된 것과 비교하여 증가되는 특성을 단백질이 갖는지의 여부는 단백질의 활성이 감소되는 개질에 의해 코리네형 세균에 속하는 균주로부터 균주를 제조하고, 개질된 균주를 배지에서 배양하는 경우에 관찰되는 분비 생산에 의해 생산된 이종 단백질의 양을 정량화하고, 개질되지 않은 균주(비-개질 균주)를 배지에서 배양하는 경우에 분비 생산에 의해 생산된 이종 단백질의 양과 그 양을 비교함으로써 확인할 수 있다.
씨. 글루타미쿰 ATCC 13032의 PBP1a 단백질을 암호화하는 Cgl0278 유전자는 GenBank 수탁 BA000036(VERSION BA000036.3 GI: 42602314)으로서 NCBI 데이터베이스에 등록된 게놈 서열에서 294001 내지 296388번 위치의 서열에 상보성인 서열에 상응한다. 또한, 씨. 글루타미쿰 ATCC 13032의 PBP1a 단백질은 GenBank 수탁 MP_599531(version NP_599531.1 GI: 19551529, locus_tag="NCgl0274")로서 등록되어 있다. 씨. 글루타미쿰 ATCC 13032의 Cgl0278 유전자의 뉴클레오타이드 서열 및 이 유전자에 의해 암호화된 PBP1a 단백질의 아미노산 서열은 각각 서열번호 81 및 서열번호 82로서 나타낸다.
페니실린-결합 단백질을 암호화하는 유전자의 뉴클레오타이드 서열은, 코리네형 세균이 속하는 종 또는 균주에 따라 상이할 수 있으므로, 페니실린-결합 단백질을 암호화하는 유전자는, 유전자가, 단백질의 활성이 코리네형 세균에서 감소되는 경우, 분비 생산에 의해 생산되는 이종 단백질의 양이 비-개질된 균주에 대해 관찰된 것과 비교하여 증가되는 특성을 갖는 단백질을 암호화하는 한, 상기 언급된 뉴클레오타이드 서열의 변이체일 수 있다. 또한, Cgl0278 유전자의 변이체는 유전자의 동족체를 포함한다. Cgl0278 유전자의 동족체는 쿼리 서열(query sequence)로서 상기 언급된 씨. 글루타미쿰의 야생형 Cgl0278 유전자를 사용하는 BLAST 검색 또는 FASTA 검색에 의한 공용 데이터베이스로부터 용이하게 수득할 수 있고, 또한, 주형으로서 코리네형 세균의 염색체 및 프라이머로서 상기 언급된 것들과 같은 공지된 유전자 서열을 기반으로 하여 제조된 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 PCR에 의해서도 수득할 수 있다.
페니실린-결합 단백질을 암호화하는 유전자는, 유전자가, 단백질의 활성이 코리네형 세균에서 감소되는 경우, 분비 생산에 의해 생산되는 이종 단백질의 양이 비-개질된 균주에 대해 관찰된 것과 비교하여 증가되는 특성을 갖는 단백질을 암호화하는 한, 1개 또는 몇몇의 위치에서 1개 또는 몇몇의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입, 또는 부가를 포함하는 상기 언급된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자일 수 있다. 이러한 경우에, 1개 또는 몇몇의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입, 또는 부가가 도입되지 않은 단백질의 것을 기준으로 하여, 단백질의 활성이 코리네형 세균에서 감소되는 경우, 분비 생산에 의해 생산되는 이종 단백질의 양이 비-개질된 균주에 대해 관찰된 것에 비교하여 증가되는 특성의 대개 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상이 유지된다. "1 내지 몇몇의(one or several)" 아미노산 잔기의 수가 단백질의 아미노산 잔기의 3차원 구조 또는 형태에서 위치에 따라 상이할 수 있음에도 불구하고, 구체적으로, 바람직하게는 1 내지 20개, 보다 바람직하게는 1 내지 10개, 보다 더 바람직하게는 1 내지 5개이다.
상기 언급된 1개 또는 몇몇의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입, 또는 부가는 단백질의 정상적인 기능을 유지하는 보존적 돌연변이(conservative mutation)이다. 보존적 돌연변이의 통상적인 예는 보존적 치환이다. 보존적 치환은, 치환 부위가 방향족 아미노산인 경우, Phe, Trp, 및 Tyr 중에서; 이 치환 부위가 소수성 아미노산인 경우에는 Leu, Ile, 및 Val 중에; 그것이 극성 아미노산인 경우에는, Gln 및 Asn 사이에서; 치환 부위가 염기성 아미노산인 경우에는, Lys, Arg, 및 His 중에서; 치환 부위가 산성 아미노산인 경우에는, Asp 및 Glu 사이에서; 및 치환 부위가 하이드록실 그룹을 갖는 아미노산인 경우에는 Ser 및 Thr 사이에서 치환이 상호간에 발생하는 돌연변이이다. 보존적 치환으로서 고려되는 치환의 예로는, 구체적으로, Ala을 Ser 또는 Thr으로 치환, Arg을 Gln, His, 또는 Lys으로 치환, Asn을 Glu, Gln, Lys, His, 또는 Asp로 치환, Asp를 Asn, Glu, 또는 Gln으로 치환, Cys을 Ser 또는 Ala으로 치환, Gln을 Asn, Glu, Lys, His, Asp, 또는 Arg으로 치환, Glu을 Gly, Asn, Gln, Lys, 또는 Asp로 치환, Gly을 Pro으로 치환, His을 Asn, Lys, Gln, Arg, 또는 Tyr으로 치환, Ile을 Leu, Met, Val, 또는 Phe로 치환, Leu을 Ile, Met, Val, 또는 Phe로 치환, Lys을 Asn, Glu, Gln, His, 또는 Arg으로 치환, Met을 Ile, Leu, Val, 또는 Phe로 치환, Phe을 Trp, Tyr, Met, Ile, 또는 Leu으로 치환, Ser을 Thr 또는 Ala으로 치환, Thr을 Ser 또는 Ala으로 치환, Trp을 Phe 또는 Tyr으로 치환, Tyr을 His, Phe, 또는 Trp으로 치환, 및 Val을 Met, Ile, 또는 Leu으로 치환이 포함된다. 추가로, 상기 언급된 바와 같은 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입, 부가, 또는 전환 등은 유전자가 유도되는 세균의 개별 차이 또는 종의 차이에 기인하는 자연 발생 돌연변이(돌연변이체 또는 변이체)를 포함한다.
또한, 상기 언급한 바와 같은 보존적 돌연변이를 갖는 유전자는, 전체 암호화된 아미노산 서열에 대해 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 더 바람직하게는 97% 이상, 특히 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 나타내고, 단백질의 활성이 코리네형 세균에서 감소되는 경우, 분비 생산에 의해 생산되는 이종 단백질의 양이 비-개질된 균주에 대해 관찰된 것과 비교하여 증가되는 특성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자일 수 있다. 또한, 본 명세서에서, "상동성(homology)"은 "동일성(identity)"을 의미할 수 있다.
또한, 페니실린-결합 단백질을 암호화하고, 단백질의 활성이 코리네형 세균에서 감소되는 경우, 분비 생산에 의해 생산되는 이종 단백질의 양이 비-개질된 균주에 대해 관찰된 것과 비교하여 증가되는 특성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자는, 엄격한 조건 하에 공지된 유전자 서열, 예를 들면, 상기 언급된 뉴클레오타이드 서열의 일부 또는 모두에 대해 상보성인 서열로부터 제조될 수 있는 프로브와 하이브리드화될 수 있는 DNA일 수 있다. "엄격한 조건(stringent conditions)"은 소위 특이적 하이브리드가 형성되고, 비-특이적 하이브리드는 형성되지 않는 조건을 의미한다. 엄격한 조건의 예로는 고도로 상동성인 DNA가 서로 하이브리드화되는, 예를 들면, 80% 이상 상동성이고, 바람직하게는 90% 이상 상동성이며, 보다 바람직하게는 95% 이상 상동성이고, 보다 더 바람직하게는 97% 이상 상동성이며, 특히 바람직하게는 99% 이상 상동성인 DNA가 서로 하이브리드화되고, 상기보다 덜 상동성인 DNA는 서로 하이브리드화되지 않는 조건, 또는 통상적인 서던 하이브리드화(Southern hybridization)의 세척 조건, 즉 60℃에서 1 x SSC, 0.1% SDS, 바람직하게는 60℃에서 0.1 x SSC, 0.1% SDS, 보다 바람직하게는 68℃에서 0.1 x SSC, 0.1% SDS에 상응하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 바람직하게는 2 또는 3회의 세척 조건을 포함한다.
상기 언급된 하이브리드화에 사용되는 프로브(probe)는 상기 기술한 바와 같은 유전자에 상보성인 서열의 일부일 수 있다. 상기 프로브는 프라이머로서 공지의 유전자 서열을 기반으로 제조된 올리고뉴클레오타이드 및 주형으로서 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 DNA 단편을 사용하여 PCR에 의해 제조할 수 있다. 예를 들면, 길이가 약 300bp인 DNA 단편이 프로브로서 사용되는 경우에, 하이브리드화의 세척 조건은, 예를 들면, 50℃, 2 x SSC 및 0.1% SDS일 수 있다.
또한, 유전자 및 단백질의 변이체에 관한 상기 언급된 설명은 세포 표면층 단백질 및 본 발명에서 분비 생산에 의해 생산되는 이종 단백질과 같은 임의의 단백질 및 이들을 암호화하는 유전자에 대해 필요한 부분만 약간 수정하여 적용(applied mutatis mutandis)시킬 수 있다.
이하에, 세포 표면층 단백질들 및 이들을 암호화하는 유전자를 설명할 것이다.
세포 표면층 단백질은, 세균 및 고세균의 세포 표면층(S-층)을 구성하는 단백질이다. 코리네형 세균의 세포 표면층 단백질의 예로는 씨. 글루타미쿰의 PS1과 PS2(CspB로서도 언급됨) 및 씨. 스타티오니스의 SlpA(CspA로서도 언급됨)가 포함된다. 이들 중, PS2 단백질의 활성이 감소되는 것이 바람직하다.
씨. 글루타미쿰 ATCC 13869의 cspB 유전자의 뉴클레오타이드 서열 및 이 유전자에 의해 암호화된 PS2 단백질의 아미노산 서열은 각각 서열번호 97 및 서열번호 98로서 나타낸다.
또한, 예를 들면, 씨. 글루타미쿰의 28개 균주에 관한 CspB 동족체의 아미노산 서열이 보고되어 왔다(J Biotechnol., 112, 177-193 (2004)). 이들 씨. 글루타미쿰의 28개 균주 및 NCBI 데이터베이스로 cspB 유전자 동족체의 GenBank 수탁번호가 하기에 예시되어 있다(GenBank 수탁번호는 괄호 안에 나타낸다).
씨. 글루타미쿰 ATCC13058 (AY524990)
씨. 글루타미쿰 ATCC13744 (AY524991)
씨. 글루타미쿰 ATCC13745 (AY524992)
씨. 글루타미쿰 ATCC14017 (AY524993)
씨. 글루타미쿰 ATCC14020 (AY525009)
씨. 글루타미쿰 ATCC14067 (AY524994)
씨. 글루타미쿰 ATCC14068 (AY525010)
씨. 글루타미쿰 ATCC14747 (AY525011)
씨. 글루타미쿰 ATCC14751 (AY524995)
씨. 글루타미쿰 ATCC14752 (AY524996)
씨. 글루타미쿰 ATCC14915 (AY524997)
씨. 글루타미쿰 ATCC15243 (AY524998)
씨. 글루타미쿰 ATCC15354 (AY524999)
씨. 글루타미쿰 ATCC17965 (AY525000)
씨. 글루타미쿰 ATCC17966 (AY525001)
씨. 글루타미쿰 ATCC19223 (AY525002)
씨. 글루타미쿰 ATCC19240 (AY525012)
씨. 글루타미쿰 ATCC21341 (AY525003)
씨. 글루타미쿰 ATCC21645 (AY525004)
씨. 글루타미쿰 ATCC31808 (AY525013)
씨. 글루타미쿰 ATCC31830 (AY525007)
씨. 글루타미쿰 ATCC31832 (AY525008)
씨. 글루타미쿰 LP-6 (AY525014)
씨. 글루타미쿰 DSM20137 (AY525015)
씨. 글루타미쿰 DSM20598 (AY525016)
씨. 글루타미쿰 DSM46307 (AY525017)
씨. 글루타미쿰 22220 (AY525005)
씨. 글루타미쿰 22243 (AY525006)
세포 표면층 단백질을 암호화하는 유전자의 뉴클레오타이드 서열이 코리네형 세균이 속하는 종 또는 균주에 따라 상이할 수 있으므로, 세포 표면층 단백질을 암호화하는 유전자는, 유전자가, 단백질의 활성이 코리네형 세균에서 감소되는 경우, 분비 생산에 의해 생산되는 이종 단백질의 양이 비-개질된 균주에 대해 관찰된 것과 비교하여 증가되는 특성을 갖는 단백질을 암호화하는 한, 상기 언급된 뉴클레오타이드 서열의 변이체일 수 있다. 예를 들면, 세포 표면층 단백질을 암호화하는 유전자는, 유전자가, 단백질의 활성이 코리네형 세균에서 감소되는 경우, 분비 생산에 의해 생산되는 이종 단백질의 양이 비-개질된 균주에 대해 관찰된 것과 비교하여 증가되는 특성을 갖는 단백질을 암호화하는 한, 1개 또는 몇몇의 위치에서 1개 또는 몇몇의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입, 또는 부가를 포함하는 상기 언급된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자일 수 있다. 페니실린-결합 단백질 및 이를 암호화하는 유전자의 변이체에 관한 상기 언급된 설명은, 또한, 세포 표면층 단백질 및 이를 암호화하는 유전자의 변이체에 대해 필요한 부분만 약간 수정하여 적용시킬 수 있다.
또한, 세포 표면층 단백질에 관해 "단백질의 활성이 코리네형 세균에서 감소되는 경우, 분비 생산에 의해 생산되는 이종 단백질의 양이 비-개질된 균주에 대해 관찰된 것과 비교하여 증가되는 특성"은, 단백질의 활성이 페니실린-결합 단백질의 활성이 감소되지 않는 균주에서 감소되는 경우, 분비 생산에 의해 이종 단백질을 생산하는 균주의 능력은 증가되지 않지만, 단백질의 활성이 페니실린-결합 단백질의 활성이 감소되는 균주에서 감소되는 경우, 분비 생산에 의해 이종 단백질을 생산하는 균주의 능력은 증가되는 특성을 포함한다.
본 발명에서, 표현 "세포 표면층 단백질의 활성이 감소된다"는, 세포 표면층 단백질의 활성이 감소되도록 코리네형 세균이 개질된 경우 및 세포 표면층 단백질의 활성이 코리네형 세균에서 본질적으로 감소된 경우를 포함한다. "세포 표면층 단백질의 활성이 코리네형 세균에서 본질적으로 감소된 경우"는, 코리네형 세균이 본질적으로 세포 표면층 단백질이 결핍된 경우를 포함한다. 즉, 세포 표면층 단백질의 활성이 감소된 코리네형 세균의 예로는 세포 표면층 단백질이 본질적으로 결핍된 코리네형 세균이 포함된다. "코리네형 세균이 본질적으로 세포 표면층 단백질이 결핍된 경우"의 예로는 코리네형 세균이 세포 표면층 단백질을 암호화하는 유전자가 본질적으로 결핍된 경우가 포함된다. 표현 "코리네형 세균은 세포 표면층 단백질이 본질적으로 결핍됨"은, 코리네형 세균은 코리네형 세균이 속하는 종의 다른 균주(들)에서 발견된 세포 표면층 단백질(들)로부터 선택된 하나 이상의 단백질이 본질적으로 결핍됨을 의미할 수 있다. 예를 들면, "씨. 글루타미쿰은 본질적으로 세포 표면층 단백질이 결핍됨"은, 씨. 글루타미쿰 균주가 다른 씨. 글루타미쿰 균주(들)에서 발견된 세포 표면층 단백질(들)로부터 선택된 하나 이상의 단백질이 본질적으로 결핍된, 즉 예를 들면, PS1 및/또는 PS2 (CspB)가 결핍됨을 의미할 수 있다. 세포 표면층 단백질이 본질적으로 결핍된 코리네형 세균의 예로는 cspB 유전자가 본질적으로 결핍된, 씨. 글루타미쿰 ATCC 13032가 포함된다.
이하에, 단백질의 활성을 감소시키는 방법을 설명할 것이다.
표현 "단백질의 활성이 감소된다"는, 표적 단백질의 활성이, 활성이 완전히 사라지는 경우를 포함하는, 비-개질된 균주(예: 야생 균주 및 모 균주)의 활성과 비교하여 감소됨을 의미한다. 구체적으로, 표현 "단백질의 활성이 감소된다"는 세포당 단백질 분자수가 감소되고/되거나, 각각의 단백질 분자의 기능이 비-개질된 균주의 기능과 비교하여 감소됨을 의미한다. 즉, "단백질의 활성이 감소된다"는 표현에 관한 용어 "활성(activity)"은 단백질의 촉매적 활성뿐만 아니라, 단백질을 암호화하는 유전자의 전사량(mRNA의 양) 또는 단백질의 양을 의미할 수 있다. 추가로, "세포당 단백질 분자수가 감소되는" 경우는 단백질이 전혀 존재하지 않는 경우를 포함한다. 또한, "각각의 단백질 분자의 기능이 감소되는" 경우는 각각의 단백질 분자의 기능이 완전히 사라지는 경우를 포함한다.
단백질의 활성을 감소시키기 위한 개질은, 예를 들면, 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 감소시킴으로써 수득할 수 있다. "유전자 발현의 감소(reduction of gene expression)"는, 또한, "유전자 발현의 약화"로서도 언급된다. 유전자 발현의 감소는, 예를 들면, 전사 효율의 감소, 번역 효율의 감소, 또는 이들의 조합에 의해 유도될 수 있다. 유전자 발현의 감소는, 프로모터와 같은 유전자의 발현 제어 서열 및 샤인-달가르노(Shine-Dalgarno)(SD) 서열을 개질시켜 수득할 수 있다. 발현 제어 서열을 개질시킨 경우에, 발현 제어 서열의 바람직하게는 1개 이상의 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 2개 이상의 뉴클레오타이드, 특히 바람직하게는 3개 이상의 뉴클레오타이드가 개질된다. 또한, 발현 제어 서열 중 일부 또는 전부가 결실될 수 있다. 유전자 발현의 감소는, 또한, 예를 들면, 발현 제어에 관여하는 인자를 조작함으로써 수득할 수 있다. 발현 제어에 관여하는 인자의 예로는 전사 또는 번역 제어에 관여하는 저분자(인듀서, 억제제 등), 전사 또는 번역 제어에 관여하는 단백질(전사 인자 등) 및 전사 또는 번역 제어에 관여하는 핵산(siRNA 등) 등이 포함된다.
단백질의 활성을 감소시키기 위한 개질은, 또한, 예를 들면, 단백질을 암호화하는 유전자를 파괴함으로써 수득할 수 있다. 유전자의 파괴는, 예를 들면, 염색체 상의 유전자의 암호화 영역중 일부 또는 전부를 결실시켜 수득할 수 있다. 또한, 염색체 상의 상기 유전자로부터 상류 및 하류인 서열들을 포함하는 전체 유전자를 결실시킬 수 있다. 결실되는 영역은 단백질의 활성 감소를 수득하고자 하는 한, N-말단 영역, 내부 영역 또는 C-말단 영역과 같은 임의의 영역일 수 있다. 보다 긴 영역의 결실은 대개 유전자를 더욱 확실히 불활성화시킬 수 있다. 또한, 결실되는 영역으로부터 상류 및 하류인 서열의 판독 프레임은 동일하지 않은 것이 바람직하다.
유전자의 파괴는, 또한, 예를 들면, 염색체 상의 유전자 암호화 영역으로 1개 또는 2개의 뉴클레오타이드가 부가 또는 결실되는 아미노산 치환을 위한 돌연변이 (미스센스 돌연변이: missense mutation), 정지 코돈(넌센스 돌연변이) 또는 프레임 이동 돌연변이 등의 도입에 의해 수득할 수 있다(Journal of Biological Chemistry, 272:8611-8617 (1997); Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 95 5511-5515 (1998); Journal of Biological Chemistry, 26 116, 20833-20839 (1991)).
유전자의 파괴는, 또한, 예를 들면, 염색체 상의 유전자 암호화 영역으로 다른 서열을 삽입시켜 수득할 수 있다. 삽입 부위는 유전자의 임의의 영역일 수 있고, 보다 긴 영역의 삽입은 대개 유전자를 보다 확실히 불활성화시킬 수 있다. 삽입 부위로부터 상류 및 하류인 서열의 판독 프레임은 동일하지 않은 것이 바람직하다. 다른 서열은 암호화된 단백질의 활성을 감소시키거나 제거하는 서열이 선택되는 한, 특별히 제한되지 않으며, 그 예로는, 예를 들면, 항생제 내성 유전자 및 이종 단백질의 생산에 유용한 유전자 등과 같은 마커(marker) 유전자가 포함된다.
상기 기술한 바와 같은 염색체 상의 유전자의 개질은, 예를 들면, 유전자의 부분적인 서열이 결실됨으로써 정상적으로 기능할 수 있는 단백질을 생산할 수 없도록 하는 결핍형 유전자를 제조하고, 결핍형 유전자를 함유하는 재조합 DNA로 세균을 형질전환시켜 결핍형 유전자와 염색체 상의 유전자 사이에 상동성 재조합을 야기하고, 이에 의해 염색체 상의 유전자가 결핍형 유전자로 치환됨으로써 수득할 수 있다. 상기 경우에, 영양요구성(auxotrophy)과 같은 숙주의 특성에 따라 선택되는 마커 유전자가 재조합 DNA에 포함되는 경우, 작동은 용이해진다. 결핍형 유전자에 의해 암호화된 단백질은 심지어 생산되더라도, 야생형 단백질의 것과 상이한 입체구조를 가짐으로써, 이의 기능은 감소되거나 제거된다. 상동성 재조합을 이용하는 유전자 치환을 기반으로 하는 이러한 유전자 파괴가 이미 확립되었고, "레드 드리븐 인테그레이션(Red driven integration)"이라고 칭하는 방법(Datsenko, K.A, and Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:6640-6645 (2000)), λ 파지로부터 유도된 절제 시스템과 조합된 레드 드리븐 인테그레이션을 이용하는 방법과 같은 선형 DNA의 사용 방법(Cho, E.H., Gumport, R.I., Gardner, J.F., J. Bacteriol., 184:5200-5203 (2002)), 온도 감수성 복제 기원(temperature sensitive replication origin)을 함유하는 플라스미드의 사용 방법, 접합 전달할 수 있는 플라스미드의 사용 방법, 및 숙주에서 기능하는 복제 기원을 갖지 않는 자살 벡터(suicide vector)의 사용 방법(미국 특허 제6,303,383호, 일본 특허 공개 공보(Kokai) 제05-007491호) 등이 있다.
단백질의 활성을 감소시키기 위한 개질은, 또한, 예를 들면, 돌연변이유발 처리에 의해 수득할 수 있다. 돌연변이유발 처리의 예로는 X-선 또는 자외선의 조사와 같은 통상적인 돌연변이유발 처리 및 돌연변이 제제(예: N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(MNNG), 에틸 메탄설포네이트(EMS), 및 메틸 메탄설포네이트(MMS))에 의한 돌연변이유발 처리가 포함된다.
표적 단백질의 활성 감소는 단백질의 활성을 측정함으로써 확인할 수 있다. 페니실린-결합 단백질의 경우에, 단백질의 활성이 감소되었는지의 여부는, 예를 들면, 단백질이 속하는 클래스에 따라 트랜스펩티다제 활성 및/또는 트랜스글리코실라제 활성을 측정함으로써 확인할 수 있다. 트랜스펩티다제 활성 및/또는 트랜스글리코실라제 활성은, 예를 들면, 당해 분야의 숙련가에게 익히 공지된 방법에 의해 측정할 수 있다. 구체적으로, 예를 들면, PBP1a의 트랜스펩티다제 및 트랜스글리코실라제 활성은 글리칸 스트랜드에 지질 II를 올리고머화시키고 펩타이드 가교결합을 형성하는 반응을 측정함으로써 측정할 수 있다(Born P, et al., J Biol Chem. 2006 Sep 15; 281(37): 26985-93). 구체적으로, 단백질의 활성은, 예를 들면, 비-개질된 균주에서 관찰된 것의 50% 이하, 바람직하게는 20% 이하, 보다 바람직하게는 10% 이하, 보다 더 바람직하게는 5% 이하, 또는 특히 바람직하게는 0%로 감소된다.
표적 유전자의 발현 감소는, 유전자의 전사량 감소 또는 유전자로부터 발현되는 표적 단백질 양의 감소를 확인함으로써 확인할 수 있다.
표적 유전자의 전사량 감소는, 유전자로부터 전사된 mRNA의 양과 비-개질된 균주에서 관찰된 것을 비교함으로써 확인할 수 있다. mRNA의 양을 측정하는 방법의 예로는 노던 하이브리드화(Northern hybridization) 및 RT-PCR 등을 포함한다(Molecular Cloning, Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001). mRNA의 양은 바람직하게는 비-개질된 균주에서 관찰된 것의 50% 이하, 20% 이하, 10% 이하, 5% 이하 또는 0%로 감소된다.
표적 단백질 양의 감소는 단백질에 결합된 항체를 사용하는 웨스턴 블롯팅에 의해 확인할 수 있다(Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA) 2001). 단백질의 양은 바람직하게는 예를 들면, 비-개질된 균주에서 관찰된 것의 50% 이하, 20% 이하, 10% 이하, 5% 이하 또는 0%로 감소된다.
표적 유전자의 파괴는, 파괴를 위해 사용되는 수단에 따라 유전자의 일부 또는 전부, 또는 유전자의 전장 등의 뉴클레오타이드 서열 또는 제한 효소 맵을 결정함으로써 확인할 수 있다.
단백질의 활성을 감소시키기 위해 상기 언급된 방법은, 또한, 페니실린-결합 단백질의 활성 감소 및 세포 표면층 단백질의 활성 감소뿐만 아니라, 임의의 단백질 및 그들을 암호화하는 유전자에 대해 필요한 부분만 약간 수정하여 적용시킬 수 있다.
이하에, "이종 단백질의 분비 발현을 위한 유전적 작제물" 및 이를 도입시키는 방법을 설명할 것이다.
분비 단백질은 일반적으로 프리단백질(프리펩타이드로서도 언급함) 또는 프리프로단백질(프리프로펩타이드로서도 언급함)로서 번역된 다음, 프로세싱을 통해 성숙 단백질이 된다고 공지되어 있다. 구체적으로, 분비 단백질은 일반적으로 프리단백질 또는 프리프로단백질로서 번역된 다음, 프리-부분으로서의 신호 펩타이드는 프로테아제(일반적으로 신호 펩티다제로 칭함)에 의해 절단되고, 분비 단백질은 이에 의해 성숙 단백질 또는 프로단백질로 전환된다. 프로단백질에 관해서, 이의 프로-부분은 프로테아제에 의해 추가로 절단되고, 프로단백질은 이에 의해 성숙 단백질이 된다. 따라서, 본 발명의 방법에서, 이종 단백질의 분비 생산을 위해 신호 펩타이드를 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명에서, 분비 단백질의 프리단백질 및 프리프로단백질은 "분비 단백질 전구체"로서 총괄적으로 언급될 수 있다. 본 발명에서, "신호 펩타이드"("신호 서열"로서도 언급됨)는 분비 단백질 전구체의 N-말단에 존재하는 아미노산 서열을 의미하며, 대개 천연 성숙 단백질에 존재하지 않는다.
본 발명에 사용되는 유전자 작제물은, 이종 단백질의 분비 생산이 수득되는 한 특별히 제한되지 않음에도 불구하고, 바람직하게는 코리네형 세균에서 기능하는 프로모터 서열, 상기 프로모터 서열로부터 하류에 결찰되고 코리네형 세균에서 기능하는 신호 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열, 및 상기 신호 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열로부터 하류에 결찰되고 상기 이종 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 함유한다. 신호 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은, 신호 펩타이드가 프로모터에 의한 제어 하에 발현되도록 프로모터 서열로부터 하류에 결찰될 수 있다. 이종 단백질을 암호화하는 핵산 서열은, 이종 단백질이 신호 펩타이드와의 융합 단백질로서 발현되도록 신호 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열로부터 하류에 결찰될 수 있다. 본 발명에 사용되는 유전자 작제물은, 또한, 이것이 기능할 수 있는 적절한 위치에서 코리네형 세균에서 이종 단백질 유전자의 발현에 효과적인 제어 서열(작동인자, 종결인자 등)을 함유할 수 있다.
본 발명에 사용되는 프로모터는, 코리네형 세균에서 기능하는 프로모터가 선택되는 한 특별히 제한되지 않으며, 코리네형 세균으로부터 유도된 프로모터 또는 이종 프로모터일 수 있다. "코리네형 세균에서 기능하는 프로모터"는, 코리네형 세균에서 프로모터 활성을 나타내는 프로모터를 의미한다. 이종 프로모터의 구체예로는, 예를 들면, 이. 콜라이(E. coli)로부터 유도된 프로모터(예: tac 프로모터, lac 프로모터, trp 프로모터 및 araBAD 프로모터)가 포함된다. 이들 중, 잠재적 프로모터(예: tac 프로모터)가 바람직하고, 또한, 유도성 프로모터(예: araBAD 프로모터)도 바람직하다.
코리네형 세균으로부터 유도된 프로모터의 예로는, 예를 들면, 세포 표면층 단백질 PS1, PS2(CspB로서도 언급됨), 및 SlpA(CspA로서도 언급됨)의 프로모터, 및 다양한 아미노산 생합성 시스템 유전자의 프로모터가 포함된다. 다양한 아미노산 생합성 시스템 유전자의 프로모터의 구체예로는, 예를 들면, 글루탐산 생합성 시스템의 글루타메이트 데하이드로게나제 유전자, 글루타민 생합성 시스템의 글루타민 신테타제 유전자, 리신 생합성 시스템의 아스파르토키나제 유전자, 트레오닌 생합성 시스템의 호모세린 데하이드로게나제 유전자, 이소류신 및 발린 생합성 시스템의 아세토하이드록시산 신테타제 유전자, 류신 생합성 시스템의 2-이소프로필말레이트 신테타제 유전자, 프롤린 및 아르기닌 생합성 시스템의 글루타메이트 키나제 유전자, 히스티딘 생합성 시스템의 포스포리보실-ATP 피로포스포릴라제 유전자, 방향족 아미노산 생합성 시스템(예: 트립토판, 티로신 및 페닐알라닌의 것)의 데옥시아라비노헵툴로소네이트 포스페이트 (DAHP) 신테타제 유전자, 핵산 생합성 시스템(예: 이노신산 및 구아닐산의 것들)의 포스포리보실 피로포스페이트(PRPP) 아미도트랜스퍼라제 유전자, 이노신산 데하이드로게나제 유전자, 및 구아닐산 신테타제 유전자의 프로모터가 포함된다.
프로모터로서, 고활성 유형의 기존 프로모터는 다양한 리포터 유전자를 사용하여 수득하고 사용할 수 있다. 예를 들면, 컨센서스 서열에 근접한 프로모터 영역에 -35 및 -10 영역들을 만듦으로써, 프로모터의 활성은 개선될 수 있다(국제 특허 공보 제WO00/18935호). 프로모터의 강도를 평가하는 방법 및 강한 프로모터의 예는 골드스타인 등(Goldstein et al.)의 논문(Prokaryotic promoters in biotechnology, Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)) 등에 기술되어 있다. 추가로, 리보솜-결합 부위(RBS)와 번역 개시 코돈 사이의 스페이서 영역에, 특히, 개시 코돈으로부터 바로 하류의 서열(5'-UTR)에서의 몇몇의 뉴클레오타이드의 치환, 삽입, 또는 결실은 mRNA의 안정성 및 mRNA의 번역 효율에 상당한 영향을 미치므로, 이 서열은 개질될 수 있음이 공지되어 있다.
본 발명에 사용된 신호 펩타이드는, 코리네형 세균에서 기능하는 신호 펩타이드가 선택되는 한 특별히 제한되지 않으며, 코리네형 세균으로부터 유도된 신호 펩타이드일 수 있거나, 이종 신호 펩타이드일 수 있다. "코리네형 세균에서 기능하는 신호 펩타이드"는, 이것이 목적하는 단백질의 N-말단에 결찰되는 경우에, 코리네형 세균이 단백질을 분비하도록 하는 펩타이드를 의미한다. 신호 펩타이드는 바람직하게는 숙주로서 코리네형 세균의 분비 단백질의 신호 펩타이드이고, 보다 바람직하게는 코리네형 세균의 세포 표면층 단백질의 신호 펩타이드이다. 코리네형 세균의 세포 표면층 단백질의 예로는 씨. 글루타미쿰으로부터 유도된 PS1 및 PS2(CspB)(일본 특허 공개 공보(Kohyo) 제6-502548호), 및 씨. 암모니아게네스(씨. 스타티오니스)로부터 유도된 SlpA(CspA)(일본 특허 공개 공보(Kokai) 제10-108675호)가 포함된다. PS1의 신호 펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 83으로서 나타내고, PS2(CspB)의 신호 펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 84로서 나타내며, SlpA (CspA)의 신호 펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 85로서 나타낸다. 또한, 미국 특허 제4,965,197호는, 코리네형 세균으로부터 유도된 DNase에 대한 신호 펩타이드가 존재하며, 상기 신호 펩타이드는 또한 본 발명에 사용될 수 있다고 기술하고 있다.
신호 펩타이드가 생물학적 종에 대해 통상적인 소정 서열 특징을 가짐에도 불구하고, 소정 생물학적 종에서 분비 기능을 나타내는 신호 펩타이드는 다른 생물학적 종에서 반드시 분비 기능을 나타내는 것은 아니다. 따라서, 이종 신호 펩타이드가 사용되는 경우에, 코리네형 세균에서 기능하는 신호 펩타이드가 적절히 선택될 수 있다. 소정 신호 펩타이드가 코리네형 세균에서 기능하는지의 여부는, 예를 들면, 이 신호 펩타이드와의 융합 단백질로서 목적하는 단백질을 발현시키고, 단백질이 분비되거나 그렇지 않은지의 여부를 확인함으로써 확인할 수 있다.
신호 펩타이드는 신호 펩타이드가 유도된 분비 단백질의 N-말단 아미노산 서열의 일부를 가질 수 있다. 신호 서열은 일반적으로 번역 생성물이 세포로부터 분비되는 경우에, 신호 펩티다제에 의해 절단된다. 또한, 신호 펩타이드를 암호화하는 유전자로서, 천연 발생 유전자가 그 자체로 사용될 수 있음에도 불구하고, 이것이 사용되는 숙주에서 코돈 출현빈도에 따라 최적의 코돈을 갖도록 개질시킬 수 있다.
본 발명의 방법에 의한 분비 생산에 의해 생산되는 이종 단백질의 예로는, 예를 들면, 생체 활성(bioactive) 단백질, 수용체 단백질, 백신으로서 사용되는 항원성 단백질 및 효소가 포함된다. 효소의 예로는, 예를 들면, 트랜스글루타미나제, 프로테아제, 엔도펩티다제, 엑소펩티다제, 아미노펩티다제, 카복시펩티다제, 콜라게나제, 및 키티나제 등이 포함된다.
생체 활성 단백질의 예로는, 예를 들면, 성장 인자, 호르몬, 사이토카인, 항체-관련 분자가 포함된다.
성장 인자의 구체예로는, 예를 들면, 상피 성장 인자(EGF), 인슐린-유사(insulin-like) 성장 인자(IGF), 형질전환 성장 인자(TGF), 신경 성장 인자 (NGF), 뇌-유도된 신경 영양 인자(BDNF), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 과립구-콜로니 자극 인자(G-CSF), 과립구-대식세포-콜로니 자극 인자(GM-CSF), 혈소판-유도된 성장 인자(PDGF), 에리트로포이에틴(EPO), 트롬보포이에틴(TPO), 산성 섬유아세포 성장 인자(aFGF 또는 FGF1), 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF 또는 FGF2), 케라틴세포 성장 인자(KGF-1 또는 FGF7, 및 KGF-2 또는 FGF10), 및 간세포 성장 인자(HGF)가 포함된다.
호르몬의 구체예로는, 예를 들면, 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴(somatostatin), 사람 성장 호르몬(hGH), 부갑상선 호르몬(PTH) 및 칼시토닌이 포함된다.
사이토카인의 구체예로는, 예를 들면, 인터류킨, 인터페론, 종양 괴사 인자(TNF)가 포함된다.
성장 인자, 호르몬 및 사이토카인은 서로 엄격히 구별되지 않을 수도 있다. 예를 들면, 생체 활성 단백질은, 성장 인자, 호르몬 및 사이토카인으로부터 선택되는 단일 그룹에 속하는 단백질일 수 있거나, 이들로부터 선택된 복수의 그룹에 속하는 단백질일 수 있다.
생체 활성 단백질은 온전한 단백질이거나, 단백질의 일부일 수 있다. 단백질의 일부의 예로는, 예를 들면, 생리학적 활성을 갖는 일부가 포함된다. 생리학적 활성을 갖는 일부의 구체예로는, 예를 들면, 부갑상선 호르몬 (PTH)의 N-말단의 34개 아미노산 잔기로 이루어진 생체 활성 펩타이드인, 테리파라타이드가 포함된다.
항체-관련 분자는, 단일 도메인 또는 완전 항체를 구성하는 도메인으로부터 선택되는 둘 이상의 도메인의 조합으로 이루어진 분자 종을 포함하는 단백질을 의미한다. 완전 항체를 구성하는 도메인의 예로는 중쇄의 도메인인, VH, CH1, CH2, 및 CH3과, 경쇄의 도메인인 VL 및 CL이 포함된다. 항체-관련 분자는, 상기 언급된 분자 종을 포함하는 한, 단량체 단백질 또는 다합체 단백질일 수 있다. 항체-관련 분자가 다합체 단백질인 경우에, 항체-관련 분자는 한 종류의 서브유닛으로 이루어진 동종-다합체일 수 있거나, 두 종류 이상의 서브유닛으로 이루어진 이종-다합체일 수 있다. 항체-관련 분자의 구체예로는, 예를 들면, 완전 항체, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fc, 중쇄(H 쇄) 및 경쇄(L 쇄)로 이루어진 이합체, Fc-융합 단백질, 중쇄(H 쇄), 경쇄(L 쇄), 단일쇄 Fv(scFv), sc(Fv)2, 디설파이드-결합된 Fv(sdFv), 및 디아바디(diabody)가 포함된다.
수용체 단백질은 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, 생체 활성 단백질 및 다른 생체 활성 단백질 중 임의의 것에 대한 수용체 단백질일 수 있다. 다른 생체 활성 물질의 예로는, 예를 들면, 신경전달물질(예: 도파민)이 포함된다. 또한, 수용체 단백질도 희귀 수용체(orphan receptor)일 수 있고, 이의 리간드는 확인되지 않았다.
백신으로서 사용되는 항원성 단백질은, 이것이 면역 반응을 야기하는 단백질인 한 특별히 제한되지 않으며, 항원성 단백질은 면역 반응의 의도하는 표적에 따라 적절히 선택될 수 있다.
단량체 단백질의 구체예로는, 예를 들면, 트랜스글루타미나제 및 인슐린-유사 성장 인자 1(IGF-1)이 포함된다. 트랜스글루타미나제 유전자의 예로는 방선균의 분비 트랜스글루타미나제의 유전자, 예를 들면, 스트렙토베르티실리움 모바렌세(Streptoverticillium mobaraense) IFO 13819, 스트렙토베르티실리움 신나모네움(Streptoverticillium cinnamoneum) IFO 12852, 스트렙토베르티실리움 그리세오카르네움(Streptoverticillium griseocarneum) IFO 12776, 스트렙토마이세스 리디쿠스(Streptomyces lydicus) [WO9606931] 및 사상 진균(예: 난균류) [W096/22366] 등을 포함한다. 또한, 단량체 단백질의 구체예로는 항체-관련 분자, 예를 들면, 중쇄(H 쇄), 경쇄(L 쇄), scFv, 및 sdFv와 같은 단량체 단백질이 추가로 포함된다.
추가로, 다합체 단백질의 구체예로는, 예를 들면, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 인슐린, 인터류킨-5, 인터페론-γ, 종양 괴사 인자(TNF)가 포함된다. 또한, 다합체 단백질의 구체예로는 항체-관련 분자, 예를 들면, 완전 항체, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fc, 중쇄(H 쇄) 및 경쇄(L 쇄)로 이루어진 이합체, Fc-융합 단백질, sc(Fv)2 및 디아바디와 같은 다합체 단백질이 추가로 포함된다. 이들 중, Fab, F(ab')2, 및 Fc-융합 단백질이 바람직하다.
Fab(단편, 항원 결합)는 H 쇄의 Fc 영역을 제외하고는 완전 항체의 일부이고, 이것은 단지 항원-결합 영역으로 이루어진 항체 단편이다. Fab는 H 쇄의 Fab 모이어티의 한 분자 및 L 쇄의 한 분자로 이루어진 이합체이고, 이들은 C-말단에서 디설파이드 결합에 의해 응집된다. 완전 항체는 H2L2 사합체이고, 약 150kDa의 거대한 분자량을 갖고, 반면에 Fab는 50kDa의 소분자량을 가지므로, Fab는 목적하는 조직에 대해 우수한 침투성을 나타낼 것으로 여겨진다. Fab는 Fc 영역을 갖지 않으므로, 이것은 보체 활성도 결정화 능력도 갖지 않지만, 이것은 항원-결합 능력을 가지므로, 항원 중화의 목적으로 주로 사용된다. 항체 약물 중에, Fab는 특히 최근에 주목을 받고 있다.
F(ab')는 H 쇄의 Fc' 영역을 제외하고는 완전 항체의 일부이다. F(ab')는 H 쇄의 F(ab') 모이어티의 한 분자 및 L 쇄의 한 분자로 이루어진 이합체이고, 이들은 C-말단에서 디설파이드 결합에 의해 응집된다. F(ab')에서 H 쇄의 나머지 모이어티는 Fab의 H 쇄의 나머지 모이어티보다 길고, 이에 따라, F(ab')에서, H 쇄에 결합되는 디설파이드 결합 모이어티가 잔류한다. 따라서, F(ab')의 두 분자는 디설파이드 결합에 의해 F(ab')2를 형성할 수 있다. F(ab') 및 F(ab')2는 또한 Fab 단편과 같이 항체 약물로서 사용될 수 있다.
Fc (단편, 결정화가능)는, 보체 활성 및 결정화 능력에 참여하는 Fc 영역만으로만 이루어진 항체 단편이다. 서로 융합된 H 쇄의 Fc 영역으로 이루어진 단백질 및 다른 기능성 단백질은 Fc-융합 단백질이라 칭한다.
이들 단백질을 암호화하는 유전자는, 사용되는 숙주에 따라, 그리고 원하는 활성을 수득하기 위해 개질시킬 수 있다. 예를 들면, 이들 단백질을 암호화하는 유전자는, 단백질이 1개 또는 몇몇의 아미노산 잔기의 부가, 결실, 또는 치환 등을 포함하도록 개질시킬 수 있다. 상기 언급된 페니실린-결합 단백질 및 이들을 암호화하는 유전자의 변이체에 관한 설명은, 또한, 본 발명의 방법에 의한 분비 생산에 의해 생산되는 이종 단백질 및 이를 암호화하는 유전자에 필요한 부분은 약간 수정하여 적용시킬 수 있다. 추가로, 이들 단백질을 암호화하는 유전자에서, 임의의 코돈은 이의 코돈 등가물로 대체할 수 있다. 예를 들면, 이들 단백질을 암호화하는 유전자에서, 코돈은 숙주에서 관찰되는 코돈 출현빈도에 따라 요구되는 바와 같이 최적화시킬 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 실제로 수득되는 이종 단백질의 N-말단 영역은 천연 단백질의 것과 동일할 수 있거나, 천연 단백질의 것과 동일하지 않을 수 있다. 예를 들면, 실제로 수득된 이종 단백질의 N-말단 영역은 1개 또는 몇몇의 아미노산 잔기의 부가 또는 결실을 포함하는 천연 단백질의 N-말단 영역일 수 있다. "1개 또는 몇몇의" 아미노산 잔기의 수가 목적하는 이종 단백질의 전장 또는 구조에 따라 상이할 수 있음에도 불구하고, 구체적으로, 바람직하게는 1 내지 20개, 보다 바람직하게는 1 내지 10개, 보다 더 바람직하게는 1 내지 5개이다.
또한, 분비 생산에 의해 생산되는 이종 단백질은 프로-구조 부분을 함유하는 단백질(프로단백질)일 수 있다. 분비 생산에 의해 생산되는 이종 단백질이 프로단백질인 경우에, 실제로 수득된 이종 단백질은 프로단백질일 수 있거나, 프로단백질이 아닐 수 있다. 즉, 프로단백질은 프로-구조 부분의 절단에 의해 성숙 단백질로 제조될 수 있다. 절단은, 예를 들면, 프로테아제에 의해 수득할 수 있다. 프로테아제가 사용되는 경우에, 실제로 수득될 단백질의 활성의 관점에서, 프로단백질은 일반적으로 바람직하게는 천연 단백질의 것과 실질적으로 동일한 위치에서, 또는 보다 바람직하게는 천연 성숙 단백질과 동일한 성숙 단백질을 수득하기 위하여 천연 단백질의 것과 정확히 동일한 위치에서 절단된다. 따라서, 천연 발생 성숙 단백질과 동일한 단백질이 생성되도록 하는 위치에서 프로단백질을 절단하는 특정 프로테아제가 가장 바람직하다. 그러나, 실제로 수득되는 이종 단백질의 N-말단 영역은 상기 기술한 바와 같이 천연 단백질의 것과 동일하지 않을 수 있다. 예를 들면, 생산되는 이종 단백질의 유형, 사용 목적 등에 따라, 천연 단백질과 비교하여 1개 또는 몇몇의 아미노산 잔기에 의해 더 길거나 더 짧은 N-말단을 갖는 단백질이 보다 적절한 활성을 가질 수 있다. 본 발명에 유용한 프로테아제는, 예를 들면, 미생물의 배양 브로쓰(culture broth)로부터 수득할 수 있는 것(예: 방선균의 배양 브로쓰)뿐만 아니라, 디스파제(Dispase)(제조원: Boehringer Mannheim)와 같은 시판중인 프로테아제를 포함한다. 상기 프로테아제는 비-정제된 상태로 사용될 수 있거나, 또한, 필요에 따라 적절한 순도로 정제 후에 사용될 수 있다.
본 발명에 사용되는 유전자 작제물을 코리네형 세균으로 도입시키는 방법은 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 세균에서, 본 발명에 사용되는 유전자 작제물은 플라스미드와 같이 염색체로부터 가자 복제하는 벡터 상에 존재할 수 있거나, 염색체로 포함될 수 있다. 또한, 상기 기술한 바와 같이, 본 발명의 세균을 작제하기 위하여, 본 발명을 위해 사용되는 유전자 작제물의 도입, 분비 생산에 의해 단백질을 생산하는 능력의 부여 또는 개선, 페니실린-결합 단백질의 활성 감소, 및 세포 표면층 단백질의 활성 감소와 같은 개질이 임의의 순서로 수행될 수 있다.
본 발명을 위해 사용되는 유전자 작제물은, 예를 들면, 유전자 작제물을 함유하는 벡터를 사용하여 숙주로 도입시킬 수 있다. 벡터는 코리네형 세균에서 자가 복제될 수 있는 벡터가 선택되는 한 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, 세균성 플라스미드로부터 유도된 벡터, 효모 플라스미드로부터 유도된 벡터, 박테리오파지로부터 유도된 벡터, 코스미드(cosmid), 또는 파지미드(phagemid) 등일 수 있다. 벡터로서, 예를 들면, 코리네형 세균으로부터 유도된 플라스미드가 바람직하다. 코리네형 세균에서 자가 복제될 수 있는 벡터의 구체예로는 pHM1519(Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984)); pAM330(Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984)); 이들을 개선하고 약물 내성 유전자를 가짐으로써 수득되는 플라스미드; 일본 특허 공개 공보(Kokai) 제3-210184호에 기술된 플라스미드 pCRY30; 일본 특허 공개 공보(Kokai) 제2-72876호 및 미국 특허 제5,185,262호에 기술된 플라스미드 pCRY21, pCRY2KE, pCRY2KX, pCRY31, pCRY3KE, 및 pCRY3KX; 일본 특허 공개 공보(Kokai) 제1-191686호에 기술된 플라스미드 pCRY2 및 pCRY3; 일본 특허 공개 공보(Kokai) 제58-192900호에 기술된 pAJ655, pAJ611, 및 pAJ1844; 일본 특허 공개 공보(Kokai) 제57-134500호에 기술된 pCG1; 일본 특허 공개 공보(Kokai) 제58-35197호에 기술된 pCG2; 일본 특허 공개 공보(Kokai) 제57-183799호에 기술된 pCG4 및 pCG11; 일본 특허 공개 공보(Kokai) 제10-215883호에 기술된 pVK7; 및 일본 특허 공개 공보(Kokai) 제9-070291호에 기술된 pVC7 등이 포함된다.
또한, 인공 트랜스포손(transposon) 등도 사용될 수 있다. 트랜스포손이 사용되는 경우에, 이종 단백질 유전자는 트랜스포손 자체의 상동성 재조합 또는 전좌(translocation) 능력에 의해 염색체로 도입된다. 상동성 재조합을 이용하는 도입 방법의 다른 예로는, 예를 들면, 선형 DNA, 온도 감수성 복제 기원을 갖는 플라스미드, 접합 전달할 수 있는 플라스미드, 및 숙주에서 기능하는 복제 기원을 갖지 않는 자살 벡터 등을 이용한 방법이 포함된다. 또한, 이종 단백질 유전자가 염색체로 도입되는 경우에, 본 발명을 위해 사용되는 유전자 작제물이 염색체 상에 구성되는 한, 프로모터 서열 및 유전자 작제물에 함유된 신호 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열 중 하나 또는 둘 다는 숙주 염색체에 본래 존재하는 것 또는 존재하는 것들일 수 있다. 구체적으로, 예를 들면, 숙주 염색체에 본래 그대로 존재하는 프로모터 서열 및 프로모터 서열로부터 하류에 결찰되고 신호 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 사용하고, 핵산 서열로부터 하류에 결찰되고 단지 신호 펩타이드를 암호화하는 유전자만을 목적하는 이종 단백질 유전자로 대체함으로써, 본 발명에 사용되는 유전자 작제물이 또한 염색체 상에 구성되며, 본 발명의 세균은 이에 의해 작제될 수 있다.
또한, 두 종류 이상의 단백질이 발현되는 경우에, 단백질의 분비 발현을 위한 유전자 작제물이 본 발명의 세균에 의해 하버링되어, 표적 이종 단백질(들)의 분비 발현이 수득될 수 있도록 할 수 있다. 구체적으로, 예를 들면, 단백질의 분비 발현을 위한 유전자 작제물의 전부가 단일 벡터 상에 하버링될 수 있거나, 염색체 상에 하버링될 수 있다. 추가로, 단백질의 분비 발현을 위한 유전자 작제물은 복수의 벡터 상에 하버링될 수 있거나, 단일 또는 복수의 벡터 및 염색체 상에 별도로 하버링될 수 있다. "두 종류 이상의 단백질이 발현되는 경우"는, 예를 들면, 두 종류 이상의 이종 단백질이 분비 생산에 의해 생산되는 경우, 또는 이종-다합체 단백질이 분비 생산에 의해 생산되는 경우를 포함한다.
본 발명에 사용되는 유전자 작제물을 코리네형 세균으로 도입시키는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 일반적으로 사용되는 방법, 예를 들면, 프로토플라스트법(protoplast method)(Gene, 39, 281-286 (1985)) 및 전기천공 방법(electroporation method) (Bio/Technology, 7, 1067-1070 (1989)) 등이 사용될 수 있다.
<2> 본 발명의 이종 단백질의 생산 방법
본 발명은, 본 발명의 세균을 배양하고, 분비 생산에 의해 생산된 이종 단백질을 수집함을 포함하는 이종 단백질의 생산 방법(이후에 "본 발명의 방법" 또는 "본 발명의 이종 단백질의 생산 방법"으로서도 언급됨)을 제공한다.
본 발명의 세균은 대개 사용되는 방법 및 조건에 따라 배양할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 세균은 탄소원, 질소원 및 무기 이온을 함유하는 통상적인 배지에서 배양시킬 수 있다. 더 높은 증식을 수득하기 위하여, 유기 미량영양소(예: 비타민 및 아미노산)가 또한 필요에 따라 부가될 수 있다.
탄소원으로서, 탄수화물(예: 글루코스 및 슈크로스), 유기산(예: 아세트산), 및 알콜 등이 사용될 수 있다. 질소원으로서, 암모니아 기체, 기체상 암모니아, 및 암모늄염 등이 사용될 수 있다. 무기 이온으로서, 칼슘 이온, 마그네슘 이온, 인산염 이온, 칼륨 이온, 및 철 이온 등이 필요에 따라 적절히 사용된다. 배양은 호기성 조건 하에 1 내지 7일 동안 pH 5.0 내지 8.5 및 15 내지 37℃의 적절한 범위 내에서 수행한다. 추가로, 코리네형 세균에 의한 L-아미노산 생산을 위한 배양 조건 및 Sec 유형 또는 Tat 유형의 신호 펩타이드를 사용하는 단백질의 생산 방법에 기술된 다른 조건이 사용될 수 있다(제WO01/23591호 및 제W02005/103278호 참조). 추가로, 유도성 프로모터가 이종 단백질의 발현을 위해 사용되는 경우에, 배양은 또한 프로모터-유도제를 배지에 가하면서 수행할 수 있다. 상기 조건 하에 본 발명의 세균을 배양함으로써, 다량의 목적하는 단백질이 세포에서 생산되고, 세로포부터 효율적으로 분비된다. 또한, 본 발명의 방법에 따라, 생산된 이종 단백질이 세포로부터 분비되므로, 미생물 세포에 다량으로 축적되는 경우, 치명적일 수 있는 단백질(예: 트랜스글루타미나제)이 또한 치명적인 효과없이 계속해서 생산될 수도 있다.
본 발명의 방법에 따라 배지에 분비된 단백질은 당해 분야의 숙련가에게 익히 공지된 방법에 의해 배양 후 배지로부터 분리 및 정제할 수 있다. 예를 들면, 세포를 원심분리 등에 의해 제거한 후, 단백질은 공지의 적절한 방법, 예를 들면, 염석(salting out), 에탄올 침전, 한외여과, 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 칼럼 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 중압 또는 고압 액체 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피 및 소수성 크로마토그래피, 또는 이들의 조합에 의해 분리 및 정제할 수 있다. 추가로, 소정 경우에, 배양액 또는 배양 상청액은 그 자체로 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에 따라 세포 표면층에서 분비되는 단백질도 또한 염 농도의 증가 및 계면활성제의 사용과 같은 당해 분야의 숙련가에게 익히 공지된 방법에 의해 이것을 가용화시킨 후, 단백질이 배지에서 분비되는 경우에 대한 것과 동일한 방법으로 분리 및 정제할 수 있다. 추가로, 소정 경우에, 세포 표면층에 분비된 단백질은, 예를 들면, 이를 가용화시키지 않고, 고정화 효소로서 사용할 수 있다.
목적하는 이종 단백질의 분비 생산은, 샘플로서 세포 표면층을 함유하는 배양 상청액 및/또는 분획에 대해 SDS-PAGE를 수행하고, 이에 의해 분리된 단백질 밴드의 분자량을 확인함으로써 확인할 수 있다. 또한, 목적하는 이종 단백질의 분비 생산은, 샘플로서 세포 표면층을 함유하는 배양 상청액 및/또는 분획에 대해 항체를 사용하는 웨스턴 블롯팅을 수행함으로써 확인할 수 있다(Molecular Cloning, Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001). 추가로, 목적하는 이종 단백질의 분비 생산은 단백질 서열분석기를 사용하는 N-말단 아미노산 서열의 측정에 의해 확인할 수 있다. 또한, 목적하는 이종 단백질의 분비 생산은 질량 분광계를 사용하여 이의 질량을 측정함으로써 확인할 수 있다. 또한, 목적하는 이종 단백질이, 측정될 수 있는 일부 종류의 생체 활성을 갖는 효소 또는 단백질인 경우에, 목적하는 이종 단백질의 분비 생산은 샘플로서 세포 표면층을 함유하는 배양 상청액 및/또는 분획에서 효소 활성 또는 생체 활성을 측정함으로써 확인할 수 있다.
실시예
본 발명은, 하기 실시예를 참조하여 추가로 구체적으로 설명될 것이다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명의 범위를 임의의 의미로 제한하는 것으로 이해되지 않아야 한다.
실시예 1: 페니실린-결합 단백질 PBP1a 및 PBP1b가 각각 결핍된 코리네박테리움 글루타미쿰의 작제
(1) PBP1a를 암호화하는 Cgl0278 유전자를 결실시키기 위한 벡터 pBSΔCgl0278의 작제
씨. 글루타미쿰 ATCC13032의 게놈 서열 및 페니실린-결합 단백질 PBP1a를 암호화하는 Cgl0278 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 이미 결정되어 있다(Genbank 수탁번호 BA000036, NCBI 유전자 도입번호 NCgl0274). 이 서열을 참조하여, 서열번호 01, 서열번호 02, 서열번호 03 및 서열번호 04로서 나타낸 프라이머를 합성하였다. 주형으로서 통상적인 방식(Saito 및 Miura의 방법 [Biochim. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)])으로 제조된 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869 균주의 염색체 DNA 및 서열번호 01과 서열번호 02, 및 서열번호 03과 서열번호 04의 프라이머를 사용하는 PCR에 의해, PBP1a를 암호화하는 Cgl0278의 약 1kbp의 5'측 상류 영역 및 PBP1a를 암호화하는 Cgl0278의 약 1 kbp의 3'측 하류 영역을 각각 증폭시켰다. 그 다음에, 주형으로서 증폭된 DNA 단편 및 프라이머로서 서열번호 01 및 서열번호 04로 나타낸 DNA 둘 다를 사용하는 PCR에 의해, 서로에 융합된 두 단편으로 이루어진 약 2kbp의 DNA 단편을 수득하였다. 서열번호 01과 서열번호 04의 프라이머에서, 제한 효소 BamH I 및 Xba I에 대한 인식 서열을 각각 고안하였다. PCR을 위해, 파이로베스트(Pyrobest) DNA 폴리머라제(제조원: Takara Bio)가 사용되었고, 반응 조건은 제조업자가 권고한 프로토콜의 조건들이었다. 이 DNA 단편은 제한 효소 BamH I 및 Xba I로 처리하였고, 제W02005/113744호에 기술된 pBS4의 BamH I-Xba I 부위로 삽입시켜 Cgl0278 유전자를 결실시키기 위한 벡터 pBSΔCgl0278을 수득하였다. 결찰 반응을 위해, DNA 결찰 키트 Ver. 2.1(제조원: Takara Bio)이 사용되었고, 반응 조건은 제조업자가 권고한 프로토콜의 조건들이었다.
(2) PBP1b를 암호화하는 Cgl2986 유전자를 결실시키기 위한 벡터 pBSΔCgl2986의 작제
씨. 글루타미쿰 ATCC13032의 게놈 서열 및 페니실린-결합 단백질 PBP1b를 암호화하는 Cgl2986 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 이미 결정되어 있다(Genbank 수탁번호 BA000036, NCBI 유전자 도입번호 NCgl2884). Cg10278에 대한 것과 동일한 방식으로, 이 서열을 참조하여, 서열번호 05, 서열번호 06, 서열번호 07 및 서열번호 08로서 나타낸 프라이머를 합성하였다. 주형으로서 제조된 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869 균주의 염색체 DNA 및 서열번호 05와 서열번호 06, 및 서열번호 07과 서열번호 08의 프라이머를 사용하는 PCR에 의해, PBP1b를 암호화하는 Cgl2986의 약 1.3kbp의 5'측 상류 영역 및 약 1.1kbp의 3'측 하류 영역을 각각 증폭시켰다. 그 다음에, 주형으로서 증폭된 DNA 단편 및 프라이머로서 서열번호 05와 서열번호 08로 나타낸 DNA 둘 다를 사용하는 PCR에 의해, 서로에 융합된 두 단편으로 이루어진 약 2.4kbp의 DNA 단편을 수득하였다. 약 2.4kbp의 수득된 DNA 단편은 제한 효소 Pst I에 대한 하나의 인식 서열 및 제한 효소 Sal I에 대한 하나의 인식 서열을 함유하였다. PCR을 위해, 파이로베스트 DNA 폴리머라제(제조원: Takara Bio)가 사용되었고, 반응 조건은 제조업자가 권고한 프로토콜의 조건들이었다. 상기 DNA 단편을 제한 효소 Pst I 및 Sal I로 처리함으로써 수득한 약 2.2kbp의 단편을 제W02006/057450호에 기술된 pBS5T의 Pst I-Sal I 부위에 삽입하여, Cgl2986 유전자를 결실시키기 위한 벡터 pBSΔCgl2986을 수득하였다.
(3) PBP1a-결핍 균주 및 PBP1b-결핍 균주의 작제
이어서, 제WO2004/029254호에 기술된 씨. 글루타미쿰 YDK010 균주를 각각의 작제된 pBSΔCgl0278 및 pBSΔCgl2986으로 형질전환시켰다. 씨. 글루타미쿰 YDK010 균주는 씨. 글루타미쿰 AJ12036 균주의 세포 표면층 단백질 PS2 결핍 균주(FERM BP-734)(제WO2004/029254호)이다. 균주는, Cgl0278 유전자가 결핍된 YDK010ΔPBP1a 균주 및 Cgl2986 유전자가 결핍된 YDK010ΔPBP1b 균주를 수득하기 위하여 제WO2005/113744호 및 제WO2006/057450호에 기술된 방법에 따라 수득된 형질전환체로부터 선택되었다.
실시예 2: 페니실린-결합 단백질 PBP1a 및 PBP1b가 각각 결핍되도록 제조된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 사용한 항체 트라스투주맙의 Fab 단편의 H 쇄 영역의 분비 발현
(1) 항체 트라스투주맙의 Fab 단편의 H 쇄 영역의 분비 발현을 위한 플라스미드의 작제
유방암 세포 특이적 항체, 트라스투주맙에서 H 쇄 가변 영역의 유전자 서열은 이미 결정되어 있다(Genbank 수탁번호 AK513484). 이 서열 및 통상의 항체의 H 쇄의 비-가변 영역의 서열을 참조하여, 씨. 글루타미쿰에서 코돈 출현빈도를 고려하여 서열번호 09 및 서열번호 42로 나타낸 DNA를 합성하였다. 트라스투주맙의 전장 H 쇄 영역은 주형으로서 상기 DNA 및 프라이머로서 서열번호 43와 서열번호 44로 나타낸 별도로 합성된 DNA를 사용하는 PCR에 의해 증폭시켜 서열번호 45로서 나타낸 약 1.4kbp의 DNA 단편을 수득하였다. 서열번호 45의 DNA에 의해 암호화된 항체 트라스투주맙의 H 쇄의 아미노산 서열은 서열번호 86으로 나타내었다.
그 다음에, 주형으로서 제WO01/23591호에 기술된 pPKSPTG1[pPKSPTG1은, 프로트랜스글루타미나제(프로-구조 부분을 함유하는 트랜스글루타미나제)의 분비 발현을 위한 벡터이고, 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869 균주의 PS2 유전자로부터 유도된 프로모터, 상기 프로모터로부터 하류에 표현가능하게 결찰되고 씨. 암모니아게네스(씨. 스타티오니스)의 SlpA로부터 유도된 신호 펩타이드를 암호화하는 DNA, 및 단백질이 상기 신호 펩타이드와의 융합 단백질로서 발현되도록 결찰된 스트렙토베르티실리움 모바라엔세로부터 유도된 프로트랜스글루타미나제 유전자를 함유한다] 및 서열번호 46 및 서열번호 47로서 나타낸 프라이머를 사용함으로써, 상기 언급된 프로모터 영역 및 상기 언급된 신호 펩타이드 영역을 포함하는 영역을 PCR에 의해 증폭시켜 약 0.7kbp의 DNA 단편을 수득하였다.
이어서, 주형으로서 증폭된 DNA 단편(트라스투주맙의 전장 H 쇄 영역을 포함하는 단편 및 프로모터 영역과 신호 펩타이드 영역을 포함하는 단편) 및 프라이머로서 서열번호 44 및 서열번호 46으로서 나타낸 DNA 둘 다를 사용하는 PCR에 의해, 서로에 융합된 두 DNA 단편으로 이루어진 약 2.0kbp의 DNA 단편을 수득하였다.
그 다음에, 주형으로서 이 융합 DNA 단편 및 프라이머로서 서열번호 46과 서열번호 48, 서열번호 46과 서열번호 49, 서열번호 46과 서열번호 50, 서열번호 46과 서열번호 51, 서열번호 46과 서열번호 52, 서열번호 46과 서열번호 53, 및 서열번호 46과 서열번호 54로서 나타낸 DNA를 사용하는 PCR에 의해, 각각 약 1.4kbp의 DNA 단편을 수득하였다. 서열번호 46의 프라이머에서, 제한 효소 Kpn I에 대한 인식 서열을 고안하였다. 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53 및 서열번호 54의 각각의 프라이머에서, 정지 코돈 및 제한 효소 Kpn I에 대한 인식 서열을 고안하였다. PCR을 위해, 파이로베스트 DNA 폴리머라제(제조원: Takara Bio)를 사용하였고, 반응 조건은 제조업자가 권고한 프로토콜의 조건들이었다. 이들 DNA 단편은 제한 효소 Kpn I로 처리하였고, 각각은 일본 특허 공개 공보(Kokai) 제9-322774호에 기술된 pPK4의 Kpn I 부위에 삽입하여 트라스투주맙, pPKStrast-FabH(1-223C), pPKStrast-FabH(1-228T), pPKStrast-FabH(1-229C), pPKStrast-FabH(1-230P), pPKStrast-FabH(1-231P), pPKStrast-FabH(1-232C), 및 pPKStrast-FabH(1-233P)의 Fab 모이어티의 H 쇄 영역의 분비 발현을 가능하게 하는 플라스미드를 수득하였다. 구체적으로, 이들 플라스미드를 이용하여, 제1 아미노산 잔기로부터 223번째, 228번째, 229번째, 230번째, 231번째, 232번째 또는 233번째 아미노산 잔기의 트라스투주맙의 H 쇄의 아미노산 서열이 발현될 수 있다(발현가능한 아미노산 잔기의 번호가 플라스미드 명칭에 포함되어 있다). 삽입된 단편의 뉴클레오타이드 서열을 결정함으로써, 예상 유전자가 작제된 것이 확인되었다. 뉴클레오타이드 서열은 BigDye® Terminator v3.1 사이클 서열분석 키트(Cycle Sequencing Kit)(제조원: Applied Biosystems), 및 3130 유전자 분석기(Genetic Analyzer)(제조원: Applied Biosystems)를 사용하여 결정하였다.
(2) 페니실린-결합 단백질 PBP1a-결핍 균주 및 및 PBP1b-결핍 균주를 사용한 항체 트라스투주맙의 Fab 단편의 H 쇄 영역의 분비 발현
실시예 2 (1)에서 작제된 항체 트라스투주맙, pPKStrast-FabH(1-229C)의 Fab 단편의 H 쇄 영역의 분비 발현을 위한 플라스미드를 사용함으로써, 각각의 YDK010 균주, YDKO1OΔPBP1a 균주, 및 YDKO1OΔPBP1b 균주를 형질전환시켰다. 각각의 수득된 형질전환체는 30℃에서 72시간 동안 25mg/l의 카나마이신을 함유하는 MM 액체 배지(물과 함께 1L 용적 중 글루코스 120g, 황산 마그네슘 칠수화물 3g, 황산 암모늄 30g, 인산이수소 칼륨 1.5g, 황산철 칠수화물 0.03g, 황산망간 오수화물 0.03g, 티아민 하이드로클로라이드 450μg, 비오틴 450μg, DL-메티오닌 0.15g, 및 탄산 칼슘 50g, pH 7.0으로 조정됨)에서 배양하였다. 배양의 완료 후, 각각의 배양 브로쓰(culture broth)를 원심분리시켜 수득된 배양 상청액은, 환원된 SDS-PAGE에 적용시킨 다음, SYPRO 오렌지(제조원: Invitrogen)로 염색하였다. 그 결과, 목적하는 단백질의 밴드는 모 균주 YDK010 및 YDKO1OΔPBP1b 균주에서 검출되지 않았고, 반면에 항체 트라스투주맙의 Fab 단편의 목적하는 H 쇄의 것과 동일한 분자량의 단백질 밴드는 단지 YDKO1OΔPBP1a 균주에 대해서만 검출되었다(도 1 및 도 2). 이 밴드의 단백질의 N-말단 서열을, 단백질 서열분석기 PPSQ-21A(제조원: Shimadzu)를 사용하여 측정한 경우, 서열은 항체 트라스투주맙의 Fab 단편의 목적하는 H 쇄의 N-말단 서열과 일치하므로, 배양 상청액에서 항체 트라스투주맙의 Fab 단편의 H 쇄의 분비 발현을 확인할 수 있었다.
그 다음에, 실시예 2 (1)에서 작제된 각각의 항체 트라스투주맙, pPKStrast-FabH(1-223C), pPKStrast-FabH(1-228T), pPKStrast-FabH(1-229C), pPKStrast-FabH(1-230P), pPKStrast-FabH(1-231P), pPKStrast-FabH(1-232C), 및 pPKStrast-FabH(1-233P)의 Fab 단편의 H 쇄 영역의 분비 발현을 위한 플라스미드를 사용함으로써, 각각의 YDK010 균주 및 YDKO1OΔPBP1a 균주를 형질전환시켰다. 각각의 수득된 형질전환체는 30℃에서 72시간 동안 25mg/l의 카나마이신을 함유하는 MM 액체 배지(물과 함께 1L 용적 중 글루코스 120g, 황산 마그네슘 칠수화물 3g, 황산 암모늄 30g, 인산이수소 칼륨 1.5g, 황산철 칠수화물 0.03g, 황산 망간 오수화물 0.03g, 티아민 하이드로클로라이드 450μg, 비오틴 450μg, DL-메티오닌 0.15g, 및 탄산 칼슘 50g, pH 7.0으로 조정됨)에서 배양하였다. 배양 완료 후, 각각의 배양 브로쓰를 원심분리하여 수득된 배양 상청액은, 환원된 SDS-PAGE에 적용시킨 다음, SYPRO 오렌지(제조원: Invitrogen)로 염색하였다. 그 결과, 심지어 분비 발현 플라스미드 중 임의의 하나가 사용된 경우에도, 목적하는 단백질의 밴드는 모 균주 YDK010에 대해 검출되지 않았고, 반면에 목적하는 항체 트라스투주맙의 Fab 단편의 H 쇄의 것과 동일한 분자량의 단백질 밴드는 단지 YDKO1OΔPBP1a 균주에 대해서만 검출되었다(도 3).
실시예 3: 페니실린-결합 단백질 PBP1a가 결핍되도록 제조된 코리네박테리움 글루타미쿰을 사용한 항체 트라스투주맙의 Fab 단편의 L 쇄 영역의 분비 발현
(1) 항체 트라스투주맙의 Fab 단편의 L 쇄 영역의 분비 발현을 위한 플라스미드의 작제
유방암 세포 특이적 항체, 트라스투주맙에서 L 쇄 가변 영역의 유전자 서열은 이미 결정되어 있다(Genbank 수탁번호 AY513485). 이 서열 및 통상의 항체의 L 쇄 비-가변 영역의 서열을 참조하여, 씨. 글루타미쿰에서 코돈 출현빈도를 고려하여 서열번호 55 내지 서열번호 70으로서 나타낸 DNA를 합성하였다. 트라스투주맙의 전장 L 쇄 영역은 주형으로서 상기 DNA 및 프라이머로서 서열번호 71 및 서열번호 72로서 나타낸 별도로 합성된 DNA를 사용하는 PCR에 의해 증폭시켜 서열번호 73으로서 나타낸 약 0.6kbp의 DNA 단편을 수득하였다. 서열번호 73의 DNA에 의해 암호화된 항체 트라스투주맙의 L 쇄의 아미노산 서열은 서열번호 87로 나타내었다. 그 다음에, 주형으로서 제WO01/23591호에 기술된 pPKSPTG1[씨. 글루타미쿰 ATCC 13869 균주로부터 유도된 프로모터 및 씨. 암모니아게네스(씨. 스타티오니스) ATCC 6872 균주로부터 유도된 신호 펩타이드 영역을 함유함] 및 서열번호 74 및 서열번호 75로서 나타낸 프라이머를 사용함으로써, 상기 언급된 프로모터 영역 및 상기 언급된 신호 펩타이드 영역을 포함하는 영역은 PCR에 의해 증폭시켜 약 0.7kbp의 DNA 단편을 수득하였다. 이어서, 주형으로서 증폭된 DNA 단편(트라스투주맙의 L 쇄 영역을 포함하는 단편, 및 프로모터 영역과 신호 펩타이드 영역을 포함하는 단편) 및 프라이머로서 서열번호 74 및 서열번호 76으로서 나타낸 DNA 둘 다를 사용하는 PCR에 의해, 서로에 융합된 두 DNA 단편으로 이루어진 약 1.3kbp의 DNA 단편을 수득하였다. 서열번호 74 및 서열번호 76의 프라이머에서, 제한 효소 BamH I에 대한 인식 서열을 고안하였다. PCR을 위해, 파이로베스트 DNA 폴리머라제(제조원: Takara Bio)를 사용하였고, 반응 조건은 제조업자가 권고한 프로토콜의 조건들이었다. 이 융합 DNA 단편은 제한 효소 BamH I로 처리하였고, 일본 특허 공개 공보(Kokai) 제9-322774호에 기술된 pPK4의 BamH I 부위로 삽입하여 트라스투주맙, pPKStrast-FabL의 Fab 모이어티의 L 쇄 영역의 분비 발현을 가능하게 하는 플라스미드를 수득하였다. 삽입된 단편의 뉴클레오타이드 서열을 측정함으로써, 예상 유전자가 작제된 것이 확인되었다. 뉴클레오타이드 서열은 BigDye® Terminator v3.1 사이클 서열분석 키트(제조원: Applied Biosystems), 및 3130 유전자 분석기(제조원: Applied Biosystems)를 사용하여 측정하였다.
(2) 페니실린-결합 단백질 PBP1a-결핍 균주를 사용한 항체 트라스투주맙의 Fab 단편의 L 쇄 영역의 분비 발현
실시예 3 (1)에서 작제된 항체 트라스투주맙, pPKStrast-FabL의 Fab 단편의 L 쇄 영역의 분비 발현을 위한 플라스미드를 사용함으로써, 각각의 YDK010 균주 및 YDKO1OΔPBP1a 균주를 형질전환시켰다. 각각의 수득된 형질전환체는 30℃에서 72시간 동안 25mg/l의 카나마이신을 함유하는 MM 액체 배지(물과 함께 1L 용적 중 글루코스 120g, 황산 마그네슘 칠수화물 3g, 황산 암모늄 30g, 인산이수소 칼륨 1.5g, 황산철 칠수화물 0.03g, 황산 망간 오수화물 0.03g, 티아민 하이드로클로라이드 450μg, 비오틴 450μg, DL-메티오닌 0.15g, 및 탄산 칼슘 50g, pH 7.0으로 조정됨)에서 배양하였다. 배양 완료 후, 각각의 배양 브로쓰를 원심분리하여 수득된 배양 상청액은 환원된 SDS-PAGE에 적용시킨 다음, CBB R250(제조원: Bio-Rad)으로 염색하였다. 그 결과, 목적하는 항체 트라스투주맙의 Fab 단편의 L 쇄의 것과 동일한 분자량의 단백질 밴드는 모 균주 YDK010에 대해 관찰된 강도의 적어도 2배보다 큰 밴드 강도를 가지면서 YDKO1OΔPBP1a 균주에 대해서 검출되었다(도 4). 이 밴드 단백질의 N-말단 서열을 단백질 서열분석기 PPSQ-21A(제조원: Shimadzu)를 사용하여 결정한 경우에, 서열은 목적하는 항체 트라스투주맙의 Fab 단편의 L 쇄의 N-말단 서열과 일치하므로, 배양 상청액에서 항체 트라스투주맙의 Fab 단편의 L 쇄의 분비 발현을 확인할 수 있었다.
실시예 4: 페니실린-결합 단백질 PBP1a가 결핍되도록 제조된 코리네박테리움 글루타미쿰을 사용한 항체 트라스투주맙의 Fab(H&L) 단편의 분비 발현
(1) 항체 트라스투주맙의 Fab(H&L) 단편의 분비 발현을 위한 플라스미드의 작제
실시예 2 (1)에서 작제된 항체 트라스투주맙의 Fab 단편의 H 쇄 영역에 대한 발현 플라스미드를 제한 효소 Kpn I로 분해시켜 수득된 각각의 약 1.4kbs의 DNA 단편을, 실시예 3 (1)에서 작제된 항체 트라스투주맙의 Fab 단편의 L 쇄 영역에 대한 발현 플라스미드인 pPKStrast-FabL의 Kpn I 부위로 삽입시킴으로써, 트라스투주맙, pPKStrast-FabH(1-223C)+L, pPKStrast-FabH(1-228T)+L, pPKStrast-FabH(1-229C)+L, pPKStrast-FabH(1-230P)+L, pPKStrast-FabH(1-231P)+L, pPKStrast-FabH(1-232C)+L, 및 pPKStrast-FabH(1-233P)+L의 Fab 단편의 H 쇄 영역 및 L 쇄 영역의 동시-발현을 위한 플라스미드를 수득하였다.
(2) 페니실린-결합 단백질 PBP1a 결핍 균주를 사용한 항체 트라스투주맙의 Fab(H&L) 단편의 분비 발현
실시예 4 (1)에서 작제된 항체 트라스투주맙, PKStrast-FabH(1-223C)+L, pPKStrast-FabH(1-228T)+L, pPKStrast-FabH(1-229C)+L, pPKStrast-FabH(1-230P)+L, pPKStrast-FabH(1-231P)+L, pPKStrast-FabH(1-232C)+L, 및 pPKStrast-FabH(1-233P)+L의 Fab(H&L) 단편의 분비 발현을 위한 플라스미드를 사용함으로써, 각각의 YDK010 균주 및 YDKO1OΔPBP1a 균주를 형질전환시켰다. 각각의 수득된 형질전환체는 30℃에서 96시간 동안 25mg/l의 카나마이신을 함유하는 MM 액체 배지(물과 함께 1L 용적 중 글루코스 120g, 황산 마그네슘 칠수화물 3g, 황산 암모늄 30g, 인산이수소 칼륨 1.5g, 황산철 칠수화물 0.03g, 황산 망간 오수화물 0.03g, 티아민 하이드로클로라이드 450μg, 비오틴 450μg, DL-메티오닌 0.15g, 및 탄산 칼슘 50g, pH 7.0으로 조정됨)에서 배양시켰다. 배양 완료 후, 각각의 배양 브로쓰를 원심분리하여 수득된 배양 상청액은 비-환원 SDS-PAGE에 적용시킨 다음, SYPRO 오렌지(제조원: Invitrogen)로 염색하였고, 항체 트라스투주맙의 Fab(H&L) 단편의 분비량을 비교하였다. 그 결과, 심지어 분비 발현 플라스미드 중 임의의 하나가 사용된 경우에도, 항체 트라스투주맙의 Fab(H&L) 단편의 분비량은 모 균주 YDK010에 대해 관찰된 것에 비하여 YDKO1OΔPBP1a 균주에서 유의하게 개선되었다(도 5). pPKStrast-FabH(1-229C)+L을 사용하여 YDKO1OΔPBP1a 균주로부터 수득된 형질전환체에 대해 검출된 밴드에서 Fab(H&L) 단백질의 N-말단 서열이 단백질 서열분석기 PPSQ-21A(제조원: Shimadzu)에 의해 측정된 경우에, 목적하는 항체 트라스투주맙의 Fab 단편의 H 쇄의 N-말단 서열 및 L 쇄의 N-말단 서열 둘 다를 포함함으로써, 항체 트라스투주맙의 Fab(H&L) 단편이 발현되고 분비되어 배양 상청액에서 응집체를 형성한 것을 확인할 수 있었다.
(3) 페니실린-결합 단백질 PBP1a 결핍 균주를 사용한 항체 트라스투주맙의 F(ab')2 단편의 분비 발현
실시예 4 (2)에서 수득된 각각의 배양 상청액을 비-환원된 SDS-PAGE에 적용시킨 다음, 단백질은 iBlot® 겔 전달 스택(Gel Transfer Stacks) PVDF, Mini(제조원: Invitrogen) 및 iBlot™ 겔 전달 시스템(Gel Transfer System)(제조원: Invitrogen)을 사용하여 PVDF 멤브레인 상에 이동시켰다. 알칼리성 포스파타제-표지된 항-사람 IgG [H&L] 항체(제조원: ROCKLAND) 및 알칼리성 포스파타제 접합체 기질 키트(Alkaline Phosphatase Conjugate Substrate Kit)(제조원: Bio-Rad)를 사용하여 이 PVDF 멤브레인에 대해 웨스턴 블롯팅을 수행하여 항체 트라스투주맙의 F(ab')2를 검출하였다. 그 결과, 항체 트라스투주맙의 F(ab')2 단편의 것과 동일한 분자량의 단백질 밴드가, H 쇄 및 L 쇄 영역을 결합시키는 디설파이드 결합을 형성하는 Cys 잔기를 포함하는 H 쇄 영역의 동시-발현을 위한 플라스미드인 각각의 pPKStrast-FabH(1-229C)+L, pPKStrast-FabH(1-230P) +L, pPKStrast-FabH(1-231P)+L, pPKStrast-FabH(1-232C)+L, 및 pPKStrast-FabH(1-233P)+L을 하버링하는 형질전환체의 배양 상청액에 대해 검출되었다. 또한, 심지어 이들 분비 발현 플라스미드 중 임의의 것이 사용된 경우에도, 항체 트라스투주맙의 F(ab')2 단편의 것과 동일한 분자량의 단백질 밴드의 강도가 모 균주 YDK010에 대해 관찰된 것과 비교하여 YDKO1OΔPBP1a 균주에서 유의하게 개선되었다(도 6).
실시예 5: 페니실린-결합 단백질 PBP1a가 결핍되도록 제조된 코리네박테리움 글루타미쿰을 사용한 항체 트라스투주맙의 Fc 단편의 분비 발현
(1) 항체 트라스투주맙의 Fc 단편의 분비 발현을 위한 플라스미드의 작제
트라스투주맙의 H 쇄의 Fc 영역은, 주형으로서 실시예 2 (1)에서 합성된 트라스투주맙의 전장 H 쇄 영역을 함유하는 서열번호 45로서 나타낸 DNA, 및 프라이머로서 서열번호 77과 서열번호 78, 및 서열번호 77과 서열번호 79로서 나타낸 별도로 합성된 DNA를 사용한 PCR에 의해 증폭시켜, 각각 약 0.7kbp의 DNA 단편을 수득하였다. 그 다음에, 주형으로서 제WO01/23591호에 기술된 pPKSPTG1(씨. 글루타미쿰 ATCC 13869 균주로부터 유래된 프로모터 영역 및 씨. 암모니아게네스 (씨. 스타티오니스) ATCC 6872 균주로부터 유래된 신호 펩타이드 영역을 함유함) 및 서열번호 46 및 서열번호 80으로서 나타낸 프라이머를 사용함으로써, 상기 언급된 프로모터 영역 및 상기 언급된 신호 펩타이드 영역을 포함하는 영역은 PCR에 의해 증폭시켜 약 0.7kbp의 DNA 단편을 수득하였다. 이어서, 주형으로서 증폭된 DNA 단편 (트라스투주맙의 H 쇄 영역의 Fc 영역을 포함하는 단편 및 프로모터 영역과 신호 펩타이드 영역을 포함하는 단편 각각) 및 프라이머로서 서열번호 46 및 서열번호 77로서 나타낸 DNA 둘 다를 사용하는 PCR에 의해, 서로에 융합된 두 DNA 단편으로 각각 이루어진 약 1.4 kbp의 DNA 단편을 수득하였다. 서열번호 46 및 서열번호 77의 프라이머에서, 제한 효소 Kpn I에 대한 인식 서열을 고안하였다. PCR을 위해, 파이로베스트 DNA 폴리머라제(제조원: Takara Bio)를 사용하였고, 반응 조건은 제조업자가 권고한 프로토콜의 조건들이었다. 이들 DNA 단편은 제한 효소 Kpn I로 처리한 다음, 일본 특허 공개 공보(Kokai) 제9-322774호에 기술된 pPK4의 Kpn I 부위로 각각 삽입하여 트라스투주맙, pPKStrast-Fc(H224D-450) 및 pPKStrast-Fc(H2331P-450)의 H 쇄 영역의 Fc 영역의 분비 발현을 가능하게 하는 플라스미드를 수득하였다. 구체적으로, 224번째 또는 231번째 아미노산 잔기로부터 450번째 아미노산 잔기의 트라스투주맙의 H 쇄의 아미노산 서열이 발현될 수 있다(발현가능한 아미노산 잔기의 번호가 플라스미드 명칭에 포함되어 있다). 삽입된 단편의 뉴클레오타이드 서열을 측정함으로써, 예상 유전자가 작제된 것이 확인되었다. 뉴클레오타이드 서열은 BigDye® Terminator v3.1 사이클 서열분석 키트(제조원: Applied Biosystems), 및 3130 유전자 분석기(제조원: Applied Biosystems)를 사용하여 측정하였다.
(2) 페니실린-결합 단백질 PBP1a-결핍 균주를 사용한 항체 트라스투주맙의 Fc 단편의 분비 발현
실시예 5 (1)에서 작제된 항체 트라스투주맙의 Fc 단편, pPKStrast-Fc(H224D-450) 및 pPKStrast-Fc(H231P-450)의 분비 발현을 위한 플라스미드를 사용함으로써, 각각의 YDK010 균주 및 YDKO1OΔPBP1a 균주를 형질전환시켰다. 각각의 수득된 형질전환체는 30℃에서 72시간 동안 25mg/l의 카나마이신을 함유하는 MM 액체 배지(물과 함께 1L 용적 중 글루코스 120g, 황산 마그네슘 칠수화물 3g, 황산 암모늄 30g, 인산이수소 칼륨 1.5g, 황산철 칠수화물 0.03g, 황산 망간 오수화물 0.03g, 티아민 하이드로클로라이드 450μg, 비오틴 450μg, DL-메티오닌 0.15g, 및 탄산 칼슘 50g, pH 7.0으로 조정됨)에서 배양하였다. 배양 완료 후, 각각의 배양 브로쓰를 원심분리하여 수득된 배양 상청액은 환원된 SDS-PAGE에 적용시킨 다음, 단백질은 iBlot® 겔 전달 스택 PVDF, Mini(제조원: Invitrogen) 및 iBlot™ 겔 전달 시스템(제조원: Invitrogen)을 사용하여 PVDF 멤브레인 상으로 이동시켰다. 알칼리성 포스파타제-표지된 항-사람 IgG [H&L] 항체(제조원: ROCKLAND) 및 알칼리성 포스파타제 접합체 기질 키트(제조원: Bio-Rad)를 사용하여 이 PVDF 멤브레인에 대해 웨스턴 블롯팅을 수행하여 항체 트라스투주맙의 Fc 단편의 분비량을 비교하였다. 그 결과, 심지어 분비 발현 플라스미드 중 임의의 것이 사용된 경우에도, 항체 트라스투주맙의 Fc 단편의 분비량은 모 균주 YDK010에 대해 관찰된 것과 비교하여 YDKO1OΔPBP1a 균주에서 유의하게 개선되었다(도 7).
실시예 6: 페니실린-결합 단백질 PBP1a가 결핍되도록 제조된 코리네박테리움 글루타미쿰을 사용한 프로트랜스글루타미나제의 분비 발현
(1) 페니실린-결합 단백질 PBP1a-결핍 균주를 사용한 프로트랜스글루타미나제의 분비 발현
씨. 글루타미쿰을 사용한 프로트랜스글루타미나제의 분비 발현 시스템은 이미 보고되어 있다(제WO01/23591호). 이어서, 제WO01/23591호에 기술된 프로트랜스글루타미나제의 분비 발현을 위한 플라스미드 벡터 pPKSPTG1을 사용함으로써, 각각의 YDK010 균주 및 YDKO1OΔPBP1a 균주를 형질전환시켰다. 각각의 수득된 형질전환체는 30℃에서 72시간 동안 25mg/l의 카나마이신을 함유하는 MM 액체 배지(물과 함께 1L 용적 중 글루코스 120g, 황산 마그네슘 칠수화물 3g, 황산 암모늄 30g, 인산이수소 칼륨 1.5g, 황산철 칠수화물 0.03g, 황산망간 오수화물 0.03g, 티아민 하이드로클로라이드 450μg, 비오틴 450μg, DL-메티오닌 0.15g, 및 탄산 칼슘 50g, pH 7.0으로 조정됨)에서 배양하였다. 배양 완료 후, 각각의 배양 브로쓰를 원심분리하여 수득된 배양 상청액은 환원된 SDS-PAGE에 적용시킨 다음, CBB R250(제조원: Bio-Rad)으로 염색하였다. 프로트랜스글루타미나제의 분비량은 이전의 리포터(Protein Expr. Purif., 26:329-335)에 따라 측정하였고, 그 양을 비교하였다. 그 결과, 프로트랜스글루타미나제의 분비량은 모 균주 YDK010에 대해 관찰된 것과 비교하여 YDKO1OΔPBP1a 균주에서 유의하게 개선되었다(도 8).
실시예 7: 페니실린-결합 단백질 PBP1a가 결핍되도록 제조된 코리네박테리움 글루타미쿰을 사용한 항-디곡신 단일쇄 항체(scFv)의 분비 발현
(1) 항-디곡신 단일쇄 항체(scFv)의 분비 발현을 위한 플라스미드의 작제
항-디곡신 scFv의 유전자 서열은 이미 측정되어 있고, 바실러스 서브틸리스를 사용한 이의 발현은 설명되어 있다(Biotechnology (N Y)., 11(1) : 71-76 (1993)). 이 서열을 참조하여, 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869 균주의 PS2 유전자로부터 유도된 프로모터, 상기 프로모터로부터 하류에 발현가능하게 결찰되고 씨. 암모니아게네스(씨. 스타티오니스) ATCC 6872 균주의 SlpA로부터 유도된 신호 펩타이드를 암호화하는 DNA, 및 단백질이 상기 신호 펩타이드와 융합 단백질로서 발현되도록 결찰된 항-디곡신 scFv를 암호화하는 DNA를 포함하는 서열번호 88로 나타낸 DNA 단편이 전적으로 합성되었다. 서열번호 88의 합성된 DNA는 5' 말단 및 3' 말단에 제한 효소 Xba I의 인식 부위를 포함한다. 합성된 DNA에서 항-디곡신 scFv를 암호화하는 DNA는 씨. 글루타미쿰의 코돈 사용 빈도의 관점에서 고안하였다. 합성된 DNA에서 항-디곡신 scFv를 암호화하는 DNA의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 89로 나타내었고, 항-디곡신 scFv의 아미노산 서열은 서열번호 90으로 나타내었다. 전적으로-합성된 DNA 단편은 제한 효소 Xba I로 분해하여, JP 제9-322774A호에 기술된 pPK4의 Xba I 부위로 삽입하였고, 이에 의해 항-디곡신 scFv, pPKSSCA1의 발현을 가능하게 하는 플라스미드를 수득하였다.
(2) 페니실린-결합 단백질 PBP1a-결핍 균주를 사용한 항-디곡신 단일쇄 항체(scFv)의 분비 발현
실시예 7 (1)에서 작제된 항-디곡신 scFv의 분비 발현을 위한 플라스미드를 사용함으로써, 각각의 YDK010 균주 및 YDKO1OΔPBP1a 균주를 형질전환시켰다. 각각의 수득된 형질전환체는 30℃에서 72시간 동안 25mg/l의 카나마이신을 함유하는 MM 액체 배지(물과 함께 1L 용적 중 글루코스 120g, 황산 마그네슘 칠수화물 3g, 황산 암모늄 30g, 인산이수소 칼륨 1.5g, 황산철 칠수화물 0.03g, 황산 망간 오수화물 0.03g, 티아민 하이드로클로라이드 450μg, 비오틴 450μg, DL-메티오닌 0.15g, 및 탄산 칼슘 50g, pH 7.0으로 조정됨)에서 배양하였다. 배양 완료 후, 각각의 배양 브로쓰를 원심분리하여 수득된 배양 상청액은, 환원된 SDS-PAGE에 적용시킨 다음, SYPRO 오렌지(제조원: Invitrogen)로 염색하였다. 그 결과, 목적하는 항-디곡신 scFv의 것과 동일한 분자량의 단백질 밴드가 모 균주 YDK010에 대해 관찰된 강도의 적어도 2배보다 큰 밴드 강도를 갖는 YDKO1OΔPBP1a 균주에 대해 검출되었다(도 9). 이 밴드 단백질의 N-말단 서열이 단백질 서열분석기 PPSQ-21A(제조원: Shimadzu)를 사용함으로써 측정되는 경우에, 서열은 목적하는 항-디곡신 scFv의 N-말단 서열과 일치하므로, 배양 상청액에서 항-디곡신 scFv의 분비 발현을 확인할 수 있었다.
실시예 8: 페니실린-결합 단백질 PBP1a가 결핍되도록 제조된 코리네박테리움 글루타미쿰을 사용한 항체 아달리무맙의 Fab(H&L) 단편의 분비 발현
(1) 항체 아달리무맙의 Fab(H&L) 단편의 분비 발현을 위한 플라스미드의 작제
종양 괴사 인자-α(TNF-α) 특이적 항체, 아달리무맙의 아미노산 서열은 이미 측정되어 있다(2008년 2월 14일자 평가 리포트, Pharmaceuticals and Medical Devices Agency). 이 서열을 참조하여, 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869 균주의 PS2 유전자로부터 유도된 프로모터, 상기 프로모터로부터 하류에 발현가능하게 결찰되고 씨. 암모니아게네스(씨. 스타티오니스) ATCC 6872 균주의 SlpA로부터 유도된 신호 펩타이드를 암호화하는 DNA, 및 단백질이 상기 신호 펩타이드와 융합 단백질로서 발현되도록 결찰되고 아달리무맙 의 H 쇄의 1번 위치로부터 230번 위치에서의 Cys 잔기까지의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA를 포함하고, 이의 하류에 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869 균주의 PS2 유전자로부터 유도된 프로모터, 상기 프로모터로부터 하류에 발현가능하게 결찰되고 씨. 암모니아게네스(씨. 스타티오니스) ATCC 6872 균주의 SlpA로부터 유도된 신호 펩타이드를 암호화하는 DNA, 및 단백질이 상기 신호 펩타이드와 융합 단백질로서 발현되도록 결찰되고 아달리무맙의 L 쇄를 암호화하는 DNA를 추가로 포함하는, 서열번호 91로 나타낸 DNA 단편이 전적으로 합성되었다. 유사하게, 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869 균주의 PS2 유전자로부터 유도된 프로모터, 상기 프로모터로부터 하류에 발현가능하게 결찰되고 씨. 암모니아게네스(씨. 스타티오니스) ATCC 6872 균주의 SlpA로부터 유도된 신호 펩타이드를 암호화하는 DNA, 및 단백질이 상기 신호 펩타이드와 융합 단백질로서 발현되도록 결찰되고 아달리무맙의 L 쇄를 암호화하는 DNA를 포함하고, 이의 하류에 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869 균주의 PS2 유전자로부터 유도된 프로모터, 상기 프로모터로부터 하류에 발현가능하게 결찰되고 씨. 암모니아게네스(씨. 스타티오니스) ATCC 6872 균주의 SlpA로부터 유도된 신호 펩타이드를 암호화하는 DNA, 및 단백질이 상기 신호 펩타이드와 융합 단백질로서 발현되도록 결찰되고 아달리무맙의 H 쇄의 1번 위치로부터 230번 위치에서의 Cys 잔기까지의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA를 추가로 포함하는, 서열번호 92로 나타낸 DNA 단편이 전적으로 합성되었다. 서열번호 91 및 서열번호 92의 각각의 합성된 DNA는 5' 말단에 제한 효소 BamH I의 인식 부위 및 3' 말단에 제한 효소 Xba I의 인식 부위를 포함한다. 합성된 DNA에서 아달리무맙의 H 쇄 및 L 쇄를 암호화하는 DNA는 씨. 글루타미쿰의 코돈 사용 빈도의 관점에서 고안하였다. 합성된 DNA에서 아달리무맙의 H 쇄의 1번 위치 내지 230번 위치의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 93으로 나타내었고, 아미노산 서열은 서열번호 94로 나타내었다. 또한, 합성된 DNA에서 아달리무맙의 L 쇄를 암호화하는 DNA의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 95로 나타내었고, 아달리무맙의 L 쇄의 아미노산 서열은 서열번호 96으로 나타내었다. 약 2.7kbp의 전적으로-합성된 각각의 DNA 단편은 제한 효소 BamH I 및 Xba I로 분해하여, JP 제9-322774A호에 기술된 pPK4의 BamH I-Xba I 부위로 삽입하였고, 이에 의해 아달리무맙, pPKSada-FabHL 및 pPKSada-FabLH의 H 쇄(1-230C) 및 L 쇄의 동시-발현을 가능하게 하는 플라스미드를 수득하였다. 각각의 플라스미드의 명칭에서 "FabHL" 및 "FabLH"는 발현 플라스미드에서 아달리무맙의 H 쇄 유전자 및 L 쇄 유전자의 포함 순서를 나타낸다.
(2) 페니실린-결합 단백질 PBP1a-결핍 균주를 사용한 항체 아달리무맙의 Fab(H&L) 단편의 분비 발현
실시예 8 (1)에서 작제된 항체 아달리무맙, pPKSada-FabHL 및 pPKSada-FabLH의 Fab(H&L) 단편의 분비 발현을 위한 플라스미드를 사용함으로써, 각각의 YDK010 균주 및 YDKO1OΔPBP1a 균주를 형질전환시켰다. 각각의 수득된 형질전환체는 30℃에서 96시간 동안 25mg/l의 카나마이신을 함유하는 MM 액체 배지(물과 함께 1L 용적 중 글루코스 120g, 황산 마그네슘 칠수화물 3g, 황산 암모늄 30g, 인산이수소 칼륨 1.5g, 황산철 칠수화물 0.03g, 황산 망간 오수화물 0.03g, 티아민 하이드로클로라이드 450μg, 비오틴 450μg, DL-메티오닌 0.15g, 및 탄산 칼슘 50g, pH 7.0으로 조정됨)에서 배양하였다. 배양 완료 후, 각각의 배양 브로쓰를 원심분리하여 수득된 배양 상청액은 비-환원된 SDS-PAGE에 적용시킨 다음, SYPRO 오렌지(제조원: Invitrogen)로 염색하였고, 항체 아달리무맙의 Fab(H&L) 단편의 분비량을 비교하였다. 그 결과, 심지어 분비 발현 플라스미드중 임의의 것이 사용된 경우에도, 항체 아달리무맙의 Fab(H&L) 단편의 분비량은 모 균주 YDK010에 대해 관찰된 것과 비교하여 YDKO1OΔPBP1a 균주에서 유의하게 개선되었다(도 10). pPKSada-FabHL를 사용하여 YDKO1OΔPBP1a 균주로부터 수득된 형질전환체에 대해 검출된 밴드에서 Fab(H&L) 단백질의 N-말단 서열이 단백질 서열분석기 PPSQ-21A(제조원: Shimadzu)에 의해 측정된 경우에, 목적하는 항체 아달리무맙의 Fab 단편의 H 쇄의 N-말단 서열 및 L 쇄의 N-말단 서열의 두 서열이 모두 포함되었고, 따라서, 항체 아달리무맙의 Fab(H&L) 단편이 발현되고 분비되어 배양 상청액에서 응집체를 형성하였음을 확인할 수 있었다. 따라서, 항체 Fab(H&L) 단편의 분비량은 트라스투주맙의 Fab(H&L) 단편을 발현시키는 경우에서 뿐만 아니라, 아달리무맙의 Fab(H&L) 단편을 발현시키는 경우에서 페니실린-결합 단백질 PBP1a 결핍 균주를 사용함으로써 개선될 수 있었음이 밝혀졌다.
실시예 9: 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869의 페니실린-결합 단백질 PBP1a 결핍 균주의 작제 및 항체 트라스투주맙의 Fab(H&L) 단편의 분비 발현
(1) 씨. 글루타미쿰 ATCC13869ΔPBP1a의 작제
씨. 글루타미쿰 ATCC13869 균주는, 실시예 1 (1)에서 작제된 페니실린-결합 단백질 PBP1a의 유전자를 결실시키기 위한 벡터인, pBSΔCgl0278로 형질전환시켰다. 균주는 Cgl0278 유전자가 결핍된 ATCC13869ΔPBP1a 균주를 수득하기 위하여 제W02005/113744호에 기술된 방법에 따라 수득된 형질전환체로부터 선택하였다.
(2) 씨. 글루타미쿰 ATCC13869ΔPBP1a에 의한 항체 트라스투주맙의 Fab(H&L) 단의 분비 발현
실시예 4 (1)에서 작제된 항체 트라스투주맙의 Fab(H&L) 단편의 분비 발현을 위한 플라스미드, pPKStrast-FabH(1-229C)+L를 사용함으로써, ATCC13869 균주 및 ATCC13869ΔPBP1a 균주 각각을 형질전환시켰다. 각각의 수득된 형질전환체는 30℃에서 96시간 동안 25mg/l의 카나마이신을 함유하는 MM 액체 배지(물과 함께 1L 용적 중 글루코스 120g, 황산 마그네슘 칠수화물 3g, 황산 암모늄 30g, 인산이수소 칼륨 1.5g, 황산철 칠수화물 0.03g, 황산 망간 오수화물 0.03g, 티아민 하이드로클로라이드 450μg, 비오틴 450μg, DL-메티오닌 0.15g, 및 탄산 칼슘 50g, pH 7.0으로 조정됨)에서 배양하였다. 배양 완료 후, 각각의 배양 브로쓰를 원심분리하여 수득된 배양 상청액은 비-환원된 SDS-PAGE에 적용시킨 다음, SYPRO 오렌지(제조원: Invitrogen)로 염색하였고, 항체 트라스투주맙의 Fab(H&L) 단편의 분비량을 비교하였다. 그 결과, 발현 숙주로서 YDK010 균주를 사용하는 경우와 대조적으로, 항체 트라스투주맙의 Fab(H&L) 단편의 분비량은 심지어 발현 숙주로서 ATCC13869 균주를 사용하는 경우에 페니실린-결합 단백질 PBP1a 결핍 균주를 사용함으로써도 개선되지 않았다(도 11의 레인 3 및 레인 5).
실시예 10: 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869의 세포 표면층 단백질 CspB 및 페니실린-결합 단백질 PBP1a 이중-결핍 균주의 작제 및 항체 트라스투주맙의 Fab(H&L) 단편의 분비 발현
씨. 클루타미쿰 YDK010 균주의 단백질 분비량이 페니실린-결합 단백질 PBP1a의 결핍으로 인하여 개선된 씨. 글루타미쿰 YDK010 균주는, 씨. 글루타미쿰 AJ12036 균주의 세포 표면층 단백질 PS2 (CspB) 결핍 균주이다(FERM BP-734)(제WO2004/029254호). 따라서, ATCC13869의 CspB 결핍 균주 및 ATCC13869의 CspB와 PBP1a 이중-결핍 균주가 작제되었고, 항체 트라스투주맙의 Fab(H&L) 단편의 분비 발현을 수행하였다. ATCC13869 균주의 CspB를 암호화하는 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 97로 나타내었고, ATCC13869 균주의 CspB의 아미노산 서열은 서열번호 98로 나타내었다.
(1) 씨. 글루타미쿰 ATCC13869ΔCspB 및 ATCC13869ΔCspBΔPBP1a의 작제
주형으로서 통상적인 방식(Saito 및 Miura의 방법[Biochim. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)])으로 제조된 씨. 글루타미쿰 YDK010 균주의 염색체 DNA, 및 프라이머로서 서열번호 99 및 서열번호 100의 DNA를 사용하는 PCR에 의해, 이의 CspB를 암호화하는 유전자가 결핍되도록 제조된 영역을 포함하는 약 2.0kbp의 DNA 단편을 증폭시켰다. PCR을 위해, 파이로베스트 DNA 폴리머라제(제조원: Takara Bio)를 사용하였고, 반응 조건은 제조업자가 권고한 프로토콜의 조건들이었다. 이 DNA 단편은 제W02006/057450호에 기술된 pBS5T의 Sma I 부위로 삽입시켜 cspB 유전자를 결실시키기 위한 벡터 pBS5T-ΔcspB를 수득하였다.
그 다음에, 씨. 글루타미쿰 ATCC13869 균주는 작제된 pBS5T-ΔcspB로 형질전환시켰다. 균주는 cspB 유전자가 결핍된 ATCC13869ΔCspB 균주를 수득하기 위하여 제WO2006/057450호에 기술된 방법에 따라 수득된 형질전환체로부터 선택하였다.
이어서, 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869ΔCspB 균주는 실시예 1 (1)에서 작제된 페니실린-결합 단백질 PBP1a의 유전자를 결실시키기 위한 벡터인, pBSΔCgl0278로 형질전환시켰다. 균주는 cspB 유전자 및 Cgl0278 유전자 둘 다가 결핍된 ATCC13869ΔCspBΔPBP1a 균주를 수득하기 위하여 제WO2005/113744호에 기술된 방법에 따라 수득된 형질전환체로부터 선택하였다.
(2) ATCC13869ΔCspB 및 ATCC13869ΔCspBΔPBP1a에 의한 항체 트라스투주맙의 Fab(H&L) 단편의 분비 발현
실시예 4 (1)에서 작제된 항체 트라스투주맙의 Fab(H&L) 단편의 분비 발현을 위한 플라스미드, pPKStrast-FabH(1-229C)+L을 사용함으로써, 각각의 ATCC13869ΔCspB 균주 및 ATCC13869ΔCspBΔPBP1a 균주를 형질전환시켰다. 각각의 수득된 형질전환체는 30℃에서 96시간 동안 25mg/l의 카나마이신을 함유하는 MM 액체 배지(물과 함께 1L 용적 중 글루코스 120g, 황산 마그네슘 칠수화물 3g, 황산 암모늄 30g, 인산이수소 칼륨 1.5g, 황산철 칠수화물 0.03g, 황산 망간 오수화물 0.03g, 티아민 하이드로클로라이드 450μg, 비오틴 450μg, DL-메티오닌 0.15g, 및 탄산 칼슘 50g, pH 7.0으로 조정됨)에서 배양하였다. 배양 완료 후, 각각의 배양 브로쓰를 원심분리하여 수득된 배양 상청액은 비-환원된 SDS-PAGE에 적용시킨 다음, SYPRO 오렌지(제조원: Invitrogen)로 염색하였고, 항체 트라스투주맙의 Fab(H&L) 단편의 분비량을 비교하였다. 그 결과, 항체 트라스투주맙의 Fab(H&L) 단편의 분비량은 모 균주 ATCC13869에 대해 관찰된 것과 비교하여, CspB 또는 PBP1a의 단일 결핍 균주인 ATCC13869ΔCspB 균주 또는 ATCC13869ΔPBP1a 균주에서 개선되지 않았지만, 항체 트라스투주맙의 Fab(H&L) 단편의 분비량은 이중-결핍 균주인 ATCC13869ΔCspBΔPBP1a 균주에서는 유의하게 개선되었다(도 11). 따라서, 항체 Fab(H&L) 단편의 분비량은 세포 표면층 단백질 CspB 및 페니실린-결합 단백질 PBP1a의 이중-결핍 균주를 사용함으로써 개선될 수 있었음이 밝혀졌다.
산업적 이용가능성
본 발명에 따르면, 분비 발현에 의해 이종 단백질을 효율적으로 생산할 수 있는 코리네형 세균이 제공될 수 있다. 추가로, 발현 숙주로서 본 발명에 의해 제공되는 코리네형 세균을 사용함으로써, 산업적으로 유용한 단백질과 같은 이종 단백질이 분비 생산에 의해 효율적으로 생산될 수 있다.
서열목록의 설명
서열번호 01 내지 서열번호 08: 프라이머
서열번호 09 내지 서열번호 42: 트라스투주맙의 H 쇄의 전적 합성을 위한 DNA의 뉴클레오타이드 서열
서열번호 43 및 서열번호 44: 프라이머
서열번호 45: 트라스투주맙의 H 쇄를 암호화하는 유전자의 뉴클레오타이드 서열
서열번호 46 내지 서열번호 54: 프라이머
서열번호 55 내지 서열번호 70: 트라스투주맙의 L 쇄의 전체 합성을 위한 DNA의 뉴클레오타이드 서열
서열번호 71 및 서열번호 72: 프라이머
서열번호 73: 트라스투주맙의 L 쇄를 암호화하는 유전자의 뉴클레오타이드 서열
서열번호 74 내지 서열번호 80: 프라이머
서열번호 81: 씨. 글루타미쿰 ATCC13032의 Cgl0278 유전자의 뉴클레오타이드 서열
서열번호 82: 씨. 글루타미쿰 ATCC13032의 Cgl0278 유전자에 의해 암호화된 단백질의 아미노산 서열
서열번호 83: 씨. 글루타미쿰의 PS1의 단일 펩타이드의 아미노산 서열
서열번호 84: 씨. 글루타미쿰의 PS2 (CspB)의 단일 펩타이드의 아미노산 서열
서열번호 85: 씨. 암모니아게네스(씨. 스타티오니스)의 SlpA (CspA)의 단일 펩타이드의 아미노산 서열
서열번호 86: 트라스투주맙의 H 쇄의 아미노산 서열
서열번호 87: 트라스투주맙의 L 쇄의 아미노산 서열
서열번호 88: 항-디곡신 단일쇄 항체의 발현을 위한 전적으로 합성된 DNA의 뉴클레오타이드 서열
서열번호 89: 항-디곡신 단일쇄 항체를 암호화하는 유전자의 뉴클레오타이드 서열
서열번호 90: 항-디곡신 단일쇄 항체의 아미노산 서열
서열번호 91 및 서열번호 92: 아달리무맙의 Fab(H&L) 단편의 발현을 위한 전적으로 합성된 DNA의 뉴클레오타이드 서열
서열번호 93: 아달리무맙의 H 쇄를 암호화하는 유전자의 뉴클레오타이드 서열(1-230C의 암호화 영역)
서열번호 94: 아달리무맙의의 H 쇄의 아미노산 서열(1-230C)
서열번호 95: 아달리무맙의 L 쇄를 암호화하는 유전자의 뉴클레오타이드 서열
서열번호 96: 아달리무맙의의 L 쇄의 아미노산 서열
서열번호 97: 씨. 글루타미쿰 ATCC13869의 cspB 유전자의 뉴클레오타이드 서열
서열번호 98: 씨. 글루타미쿰 ATCC13869의 cspB 유전자에 의해 암호화되는 단백질의 아미노산 서열
서열번호 99 및 서열번호 100: 프라이머
통상 산업성 공업 기술원 미생물 공업 기술 연구소 FERMBP-734 19840326
SEQUENCE LISTING <110> AJINOMOTO CO., INC. <120> METHOD FOR SECRETORY PRODUCTION OF PROTEIN <130> D312-11154 <150> RU 2011144497 <151> 2011-11-02 <150> JP 2011-240745 <151> 2011-11-02 <160> 100 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gtcggatccg cccccctgag ccaaatattc 30 <210> 2 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tttctagcgg aagaactggt tgatggcgtc gagctttgtc agagaattcg tggt 54 <210> 3 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gtgtccacca cgaattctct gacaaagctc gacgccatca accagttctt cc 52 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 agtatctaga ttcgagtcgc ttttggttgg c 31 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 cggcgaactc aaaaacagca t 21 <210> 6 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ggatagtcag ccccggcagg atccttttgc cactgctctt tttg 44 <210> 7 <211> 43 <212> DNA 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Sequence <220> <223> L chain <400> 59 gcgcaccgtc gccgccccct ccgtcttcat tttcccacca tctgacgaac agctgaaatc 60 <210> 60 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L chain <400> 60 gcctgttgaa caacttttac ccccgcgagg caaaagtgca atggaaggtc gataacgcac 60 <210> 61 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L chain <400> 61 gagtccgtga ccgaacagga ctccaaggat tctacctact ccctcagctc caccctcacc 60 <210> 62 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L chain <400> 62 gaaacacaag gtctatgcct gcgaggtgac ccaccagggc ctttcctctc ccgtgaccaa 60 <210> 63 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L chain <400> 63 tcagcattcg ccgcggttaa aggacttggt cacgggagag gaaag 45 <210> 64 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L chain <400> 64 aggcatagac cttgtgtttc tcgtagtccg ccttggagag ggtgagggtg gagctgaggg 60 <210> 65 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L chain <400> 65 tcctgttcgg tcacggactc ttgggaatta ccggattgca gtgcgttatc gaccttccat 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Sequence <220> <223> primer <400> 75 ctctgggtca tttgaatatc tgccgttgcc acaggtgcgg 40 <210> 76 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 76 tcgtcgtcgt cgtcggatcc tcagcattcg ccgcggttaa 40 <210> 77 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 77 tcgtcgtcgt cgtcggtacc tcacttgcct ggggaaaggg 40 <210> 78 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 78 ccgcacctgt ggcaacggca gataaaactc acacctgccc 40 <210> 79 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 79 ccgcacctgt ggcaacggca ccgtgccccg ctcccgaact 40 <210> 80 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 80 tgccgttgcc acaggtgcgg ccagc 25 <210> 81 <211> 2388 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 81 gtgtccacca cgaattctct gacaaagctc gttgcatcta cagtcgccgc tggcgtcctt 60 ggtgcgctcg cacttgtgcc tttcgctagt ctttctggcg ttgcggttgc gcgtaccaat 120 gacacgatgc agaccaacct ttcagatctg acggatggtc gcgggccggg cgtcacgacg 180 attactgatt ccactgacca gccgattgct tatatttatg cgcagcggcg gtttgaggtt 240 gggggtgatc agatttctac gtcgatgaag gatgcgatcg tttcgattga ggatcgcagg 300 ttctatgagc atgatggtgt ggatttgcag ggctttggtc gtgcaatcct gacgaacctg 360 gctgcgggtg gcgtggagca gggtgcttcg acgattaacc agcagtatgt gaagaacttc 420 ttgctgttgg tggaagctga tgatgaggcg gagcaggctg ctgctgtgga aacctccatc 480 cctcgtaagc tccgtgagat gaagatggcg tctgatttgg aaaagacgtt gtcgaaggat 540 gagattctga ctcgttatct caacattgtt ccttttggta atggtgctta tggtgttgag 600 gctgcggcgc ggacgtattt cggtacgtcg gctgccgagt taaccattcc acagtctgcg 660 atgctcgcgg gcattgtgca gtcttcgtct tatctcaatc catacaccaa tcacgatgct 720 gtgtttgagc gtcgtaatac tgttttgggc gctatggctg atgctggcgc gatttcccca 780 gacgaggctt cggctttcca gcaggaacct ttgggtgtcc tggaaacccc gcaaggctta 840 tccaatggtt gtatcggcgc tggcgatcgt ggtttcttct gcgattacgc tctgcaatat 900 ctttctgagc agggaatcac ccaagatatg ctggcgaagg actcctacac catcaaattg 960 actttggatc cagatgttca ggatgcagcg cacaatgcgg tgtcctccca cgttgatcca 1020 accaccccag gtgtcgctga agttgtgaac gtcattgagc ctggcgagaa ctcccgcgat 1080 attttggcta ttacttcttc ccgcaactac ggccttgacc tggatgctgg tgaaacgatg 1140 ctgcctcagg caacgtcccg tgtgggtaat ggtgccggtt ccattttcaa gatctttacc 1200 gccgctgcag ccattcagca gggcgctggc ctagacacca tgttggatgt tccttctcga 1260 tatgaggtca agggcatggg ctccggcggt gccgcgaact gtcccgcaaa tacttactgc 1320 gtggaaaacg caggatccta cgcgcctcgc atgactctgc aggacgctct cgcgcagtcc 1380 cccaacactg cattcgttga aatgatcgag caggttggcg tggacaccgt tgtggatctt 1440 tcagtaaagc tgggcctgcg aagctacacc gatgaaggtt ccttcgacgg cgaaagctca 1500 atcgcggact acatgaagga caacaacctc ggttcttaca ctcttggacc taccgctgtt 1560 aaccctcttg aattgtccaa tgttgctgca accattgcat ccggtggcat gtggtgcgaa 1620 cccaatccca tcgccagcgt ccatgaccgt gaaggcaacg aagtctacat tgaccgccct 1680 gcatgtgagc gcgccatcga tgccgaaacg gcttcagctt tggccgtcgg catgagcaag 1740 gatacggtca gcggaactgc ggcctctgca gccagcatgt acggatggtc cttgccaacc 1800 gcagcgaaga ccggtaccac cgagtccaac cagtcctcag catttatggg cttcaacagc 1860 aactttgccg cagctccata catctacaat gacggcacct ccaccacccc actgtgcagc 1920 ggccccgtcc gccagtgcag cagcggtaac ctcttcggcg gtaacgaacc agctcaaaca 1980 tggtttaaca tggcaagcaa cgtccccgca gcttcgcaag gaacactgcc atccagcagc 2040 gattcattcc gcctcggcac ttccggcgaa ctcctcaacc aggttgtcgg ccaaagcgaa 2100 gcctccgctc gacgcaccct cgaagccaaa ggctacaagg tcaccacgcg ttcagtctcc 2160 ggcgccggca gcgcgcgcgg caccgtagtc agcgcaaccc ctcagggtgc agtgcttatc 2220 gacggtggaa ccgtcatttt ggacatctcc gacggcacaa gccctgcccc cgctgccacc 2280 aacaatgatg acagcgacga tggagacacc cctgctccat caacaaacaa ccgcggaaca 2340 accattgaag acgccatcaa tgacgccatc aaccagttct tccgctag 2388 <210> 82 <211> 795 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 82 Met Ser Thr Thr Asn Ser Leu Thr Lys Leu Val Ala Ser Thr Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Val Leu Gly Ala Leu Ala Leu Val Pro Phe Ala Ser Leu Ser 20 25 30 Gly Val Ala Val Ala Arg Thr Asn Asp Thr Met Gln Thr Asn Leu Ser 35 40 45 Asp Leu Thr Asp Gly Arg Gly Pro Gly Val Thr Thr Ile Thr Asp Ser 50 55 60 Thr Asp Gln Pro Ile 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Corynebacterium ammoniagenes <400> 85 Met Lys Arg Met Lys Ser Leu Ala Ala Ala Leu Thr Val Ala Gly Ala 1 5 10 15 Met Leu Ala Ala Pro Val Ala Thr Ala 20 25 <210> 86 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H chain of Trastuzumab <400> 86 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 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gaaacagttt 360 gtactcaggt ttgaagcatt ttctccgatt cgcctggcaa aaatctcaat tgtcgcttac 420 agtttttctc aacgacaggc tgctaagctg ctagttcggt ggcctagtga gtggcgttta 480 cttggataaa agtaatccca tgtcgtgatc agccattttg ggttgtttcc atagcaatcc 540 aaaggtttcg tctttcgata cctattcaag gagccttcgc ctctatgaaa cgcatgaaat 600 cgctggctgc ggcgctcacc gtcgctgggg ccatgctggc cgcacctgtg gcaacggcag 660 atgttgtcat gacccagacc cccctcagcc tcccggtgag cctcggcgac caagcatcta 720 tttcttgccg ctcttcccaa tccttggtgc actctaacgg aaatacctat cttaactggt 780 acctccaaaa agctggccaa tccccgaagc tgttgatcta taaggtctcc aaccgctttt 840 ctggtgttcc tgatcgcttc tccggctccg gctctggtac cgacttcacc ttgaaaatct 900 ctcgcgtcga agcggaggac ctcggcatct acttctgttc ccagaccacc cacgtgcccc 960 caaccttcgg cggcggtacc aagctggaaa tcaagcgcgg cggatccggt tccggcggat 1020 ctggatccgg tggttccggc tccgaggttc agcttcagca aagcggtcca gaacttgtca 1080 aacccggtgc aagcgtgcgc atgtcctgca agtcctctgg ctacatcttt actgatttct 1140 atatgaactg ggtgcgccaa tcccacggta agtccctcga ctacatcggt tacatctccc 1200 catattccgg cgtcaccggt tacaaccaga aatttaaagg caaggccacc cttaccgtgg 1260 ataaatcttc ctccaccgcg tatatggaac tgcgctccct cacttccgag gactccgcag 1320 tctactattg tgcaggttcc tctggcaaca agtgggccat ggattactgg ggccacggtg 1380 cgtccgtcac tgttagctct taatagtcta ga 1412 <210> 89 <211> 744 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti- Digoxin scFv <400> 89 gatgttgtca tgacccagac ccccctcagc ctcccggtga gcctcggcga ccaagcatct 60 atttcttgcc gctcttccca atccttggtg cactctaacg gaaataccta tcttaactgg 120 tacctccaaa aagctggcca atccccgaag ctgttgatct ataaggtctc caaccgcttt 180 tctggtgttc ctgatcgctt ctccggctcc ggctctggta ccgacttcac cttgaaaatc 240 tctcgcgtcg aagcggagga cctcggcatc tacttctgtt cccagaccac ccacgtgccc 300 ccaaccttcg gcggcggtac caagctggaa atcaagcgcg gcggatccgg ttccggcgga 360 tctggatccg gtggttccgg ctccgaggtt cagcttcagc aaagcggtcc agaacttgtc 420 aaacccggtg caagcgtgcg catgtcctgc aagtcctctg gctacatctt tactgatttc 480 tatatgaact gggtgcgcca atcccacggt aagtccctcg actacatcgg ttacatctcc 540 ccatattccg gcgtcaccgg 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actccctctc ctccgtggtc accgtcccta gctcctccct gggcacccag 1260 acctacatct gcaacgtgaa ccacaagcct tccaacacca aggttgataa gaaggtggag 1320 ccgaagtcct gcgacaagac ccacacctgc taacaaattc ctgtgaagta gctgatttag 1380 tacttttcgg aggtgtctat tcttaccaaa tcgtcaagtt gtgggtagag tcacctgaat 1440 attaattgca ccgcacgggt gatatatgct tatttgctca agtagttcga ggttaagtgt 1500 attttaggtg aacaaatttc agcttcgggt agaagacttt cgatgcgctt cagagcttct 1560 attgggaaat ctgacaccac ttgattaaat agcctacccc cgaattgggg gattggtcat 1620 tttttgctgt gaaggtagtt ttgatgcata tgacctgcgt ttataaagaa atgtaaacgt 1680 gatcagatcg atataaaaga aacagtttgt actcaggttt gaagcatttt ctccgattcg 1740 cctggcaaaa atctcaattg tcgcttacag tttttctcaa cgacaggctg ctaagctgct 1800 agttcggtgg cctagtgagt ggcgtttact tggataaaag taatcccatg tcgtgatcag 1860 ccattttggg ttgtttccat agcaatccaa aggtttcgtc tttcgatacc tattcaagga 1920 gccttcgcct ctatgaaacg catgaaatcg ctggctgcgg cgctcaccgt cgctggggcc 1980 atgctggccg cacctgtggc aacggcagat atccagatga cccagtcccc atcctccctg 2040 tccgcttccg ttggtgaccg cgtgaccatc acctgccgtg catcccaggg catccgcaac 2100 tacctggctt ggtatcagca gaagccgggc aaggccccaa agctgctcat ctacgcagct 2160 tccaccctcc agtccggcgt gccttcccgt ttctccggct ccggttccgg caccgatttc 2220 accctgacca tctcctccct ccagcctgaa gatgtggcga cctactactg ccagcgttac 2280 aaccgtgcac cgtacacctt cggtcagggc accaaggttg aaatcaagcg taccgtggcc 2340 gcgccatccg tcttcatctt cccaccttcc gatgagcagc tgaagtccgg caccgcatcc 2400 gtggtctgcc tgctcaacaa cttctaccct cgcgaggcga aggtccagtg gaaggttgac 2460 aacgcactgc agtccggcaa ctcccaggaa tccgtgaccg agcaggattc caaggactcc 2520 acctactccc tctcctccac cctgaccctc tccaaggctg attacgaaaa gcacaaggtt 2580 tacgcctgcg aggtgaccca ccagggtctc tcctccccag tcaccaagtc cttcaaccgc 2640 ggcgaatgct aatctaga 2658 <210> 92 <211> 2658 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized DNA <400> 92 ggatcccaaa ttcctgtgaa gtagctgatt tagtactttt cggaggtgtc tattcttacc 60 aaatcgtcaa gttgtgggta gagtcacctg aatattaatt gcaccgcacg ggtgatatat 120 gcttatttgc tcaagtagtt cgaggttaag tgtattttag gtgaacaaat ttcagcttcg 180 ggtagaagac tttcgatgcg cttcagagct tctattggga aatctgacac cacttgatta 240 aatagcctac ccccgaattg ggggattggt cattttttgc tgtgaaggta gttttgatgc 300 atatgacctg cgtttataaa gaaatgtaaa cgtgatcaga tcgatataaa agaaacagtt 360 tgtactcagg tttgaagcat tttctccgat tcgcctggca aaaatctcaa ttgtcgctta 420 cagtttttct caacgacagg ctgctaagct gctagttcgg tggcctagtg agtggcgttt 480 acttggataa aagtaatccc atgtcgtgat cagccatttt gggttgtttc catagcaatc 540 caaaggtttc gtctttcgat acctattcaa ggagccttcg cctctatgaa acgcatgaaa 600 tcgctggctg cggcgctcac cgtcgctggg gccatgctgg ccgcacctgt ggcaacggca 660 gatatccaga tgacccagtc cccatcctcc ctgtccgctt ccgttggtga ccgcgtgacc 720 atcacctgcc gtgcatccca gggcatccgc aactacctgg cttggtatca gcagaagccg 780 ggcaaggccc caaagctgct catctacgca gcttccaccc tccagtccgg cgtgccttcc 840 cgtttctccg gctccggttc cggcaccgat ttcaccctga ccatctcctc cctccagcct 900 gaagatgtgg cgacctacta ctgccagcgt tacaaccgtg caccgtacac cttcggtcag 960 ggcaccaagg ttgaaatcaa gcgtaccgtg gccgcgccat ccgtcttcat cttcccacct 1020 tccgatgagc agctgaagtc cggcaccgca tccgtggtct gcctgctcaa caacttctac 1080 cctcgcgagg cgaaggtcca gtggaaggtt gacaacgcac tgcagtccgg caactcccag 1140 gaatccgtga ccgagcagga ttccaaggac tccacctact ccctctcctc caccctgacc 1200 ctctccaagg ctgattacga aaagcacaag gtttacgcct gcgaggtgac ccaccagggt 1260 ctctcctccc cagtcaccaa gtccttcaac cgcggcgaat gctaacaaat tcctgtgaag 1320 tagctgattt agtacttttc ggaggtgtct attcttacca aatcgtcaag ttgtgggtag 1380 agtcacctga atattaattg caccgcacgg gtgatatatg cttatttgct caagtagttc 1440 gaggttaagt gtattttagg tgaacaaatt tcagcttcgg gtagaagact ttcgatgcgc 1500 ttcagagctt ctattgggaa atctgacacc acttgattaa atagcctacc cccgaattgg 1560 gggattggtc attttttgct gtgaaggtag ttttgatgca tatgacctgc gtttataaag 1620 aaatgtaaac gtgatcagat cgatataaaa gaaacagttt gtactcaggt ttgaagcatt 1680 ttctccgatt cgcctggcaa aaatctcaat tgtcgcttac agtttttctc aacgacaggc 1740 tgctaagctg ctagttcggt ggcctagtga gtggcgttta cttggataaa agtaatccca 1800 tgtcgtgatc agccattttg ggttgtttcc atagcaatcc aaaggtttcg tctttcgata 1860 cctattcaag gagccttcgc ctctatgaaa cgcatgaaat cgctggctgc ggcgctcacc 1920 gtcgctgggg ccatgctggc cgcacctgtg gcaacggcag aagttcagct ggttgagtcc 1980 ggcggtggcc tggttcagcc aggtcgctcc ctgcgtctct cctgcgcagc ttccggcttc 2040 accttcgatg actacgcaat gcactgggtt cgtcaggctc ctggcaaggg cctggaatgg 2100 gtgtccgcaa tcacctggaa ctccggtcac atcgattacg ctgactccgt cgagggccgc 2160 ttcaccatct cccgtgataa cgctaagaac tccctgtacc tccagatgaa ctccctccgt 2220 gcagaagaca ccgctgtcta ctactgcgca aaggtttcct acctgtccac cgcttcctcc 2280 ctcgattact ggggtcaggg caccctggtt accgtgtcct ccgcctccac caagggtcca 2340 tccgtgttcc cgctcgcacc atcctccaag tccacctccg gtggcaccgc cgcgctgggt 2400 tgcctcgtca aggactactt cccagaacct gtcaccgttt cctggaactc cggtgccctg 2460 acctccggtg tgcacacctt cccagcggtc ctccagtcct ccggtctgta ctccctctcc 2520 tccgtggtca ccgtccctag ctcctccctg ggcacccaga cctacatctg caacgtgaac 2580 cacaagcctt ccaacaccaa ggttgataag aaggtggagc cgaagtcctg cgacaagacc 2640 cacacctgct aatctaga 2658 <210> 93 <211> 693 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H chain of Adalimumab <400> 93 gaagttcagc tggttgagtc cggcggtggc ctggttcagc caggtcgctc cctgcgtctc 60 tcctgcgcag cttccggctt caccttcgat gactacgcaa tgcactgggt tcgtcaggct 120 cctggcaagg gcctggaatg ggtgtccgca atcacctgga actccggtca catcgattac 180 gctgactccg tcgagggccg cttcaccatc tcccgtgata acgctaagaa ctccctgtac 240 ctccagatga actccctccg tgcagaagac accgctgtct actactgcgc aaaggtttcc 300 tacctgtcca ccgcttcctc cctcgattac tggggtcagg gcaccctggt taccgtgtcc 360 tccgcctcca ccaagggtcc atccgtgttc ccgctcgcac catcctccaa gtccacctcc 420 ggtggcaccg ccgcgctggg ttgcctcgtc aaggactact tcccagaacc tgtcaccgtt 480 tcctggaact ccggtgccct gacctccggt gtgcacacct tcccagcggt cctccagtcc 540 tccggtctgt actccctctc ctccgtggtc accgtcccta gctcctccct gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa ccacaagcct tccaacacca aggttgataa gaaggtggag 660 ccgaagtcct gcgacaagac ccacacctgc taa 693 <210> 94 <211> 230 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H chain of Adalimumab <400> 94 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys 225 230 <210> 95 <211> 645 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L chain of Adalimumab <400> 95 gatatccaga tgacccagtc cccatcctcc ctgtccgctt ccgttggtga ccgcgtgacc 60 atcacctgcc gtgcatccca gggcatccgc aactacctgg cttggtatca gcagaagccg 120 ggcaaggccc caaagctgct catctacgca gcttccaccc tccagtccgg cgtgccttcc 180 cgtttctccg gctccggttc cggcaccgat ttcaccctga ccatctcctc cctccagcct 240 gaagatgtgg cgacctacta ctgccagcgt tacaaccgtg caccgtacac cttcggtcag 300 ggcaccaagg ttgaaatcaa gcgtaccgtg gccgcgccat ccgtcttcat cttcccacct 360 tccgatgagc agctgaagtc cggcaccgca tccgtggtct gcctgctcaa caacttctac 420 cctcgcgagg cgaaggtcca gtggaaggtt gacaacgcac tgcagtccgg caactcccag 480 gaatccgtga ccgagcagga ttccaaggac tccacctact ccctctcctc caccctgacc 540 ctctccaagg ctgattacga aaagcacaag gtttacgcct gcgaggtgac ccaccagggt 600 ctctcctccc cagtcaccaa gtccttcaac cgcggcgaat gctaa 645 <210> 96 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L chain of Adalimumab <400> 96 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 97 <211> 1500 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum ATCC13869 <400> 97 atgtttaaca accgtatccg cactgcagct ctcgctggtg caatcgcaat ctccaccgca 60 gcttccggcg tagctatccc agcattcgct caggagacca acccaacctt caacatcaac 120 aacggcttca acgatgctga tggatccacc atccagccag ttgagccagt taaccacacc 180 gaggaaaccc tccgcgacct gactgactcc accggcgctt acctggaaga gttccagtac 240 ggcaacgttg aggaaatcgt tgaagcatac ctgcaggttc aggcttccgc agacggattc 300 gatccttctg agcaggctgc ttacgaggct ttcgaggctg ctcgcgttcg tgcatcccag 360 gagctcgcgg cttccgctga gaccatcact aagacccgcg agtccgttgc ttacgcactc 420 aaggctgacc gcgaagctac cgcagctttc gaggcttacc tcagcgctct tcgtcaggtt 480 tcagtcatca acgatctgat cgctgatgct aacgccaaga acaagactga ctttgcagag 540 atcgagctct acgatgttct ttacaccgac gccgacatct ctggcgatgc tccacttctt 600 gctcctgcat acaaggagct gaaggacctt caggctgagg ttgacgcaga cttcgagtgg 660 ttgggcgagt tcgcaattga taacaatgaa gacaactacg tcattcgtac tcacatccct 720 gctgtagagg cactcaaggc agcgatcgat tcactggtcg acaccgttga gccacttcgt 780 gcagacgcta tcgctaagaa catcgaggct cagaagtctg acgttctggt tccccagctc 840 ttcctcgagc gtgcaactgc acagcgcgac accctgcgtg ttgtagaggc aatcttctct 900 acctctgctc gttacgttga actctacgag aacgtcgaga acgttaacgt tgagaacaag 960 acccttcgcc agcactactc ttccctgatc cctaacctct tcatcgcagc ggttggcaac 1020 atcaacgagc tcaacaatgc agatcaggct gcacgtgagc tcttcctcga ttgggacacc 1080 gacctcacca ccaacgatga ggacgaagct tactaccagg ctaagctcga cttcgctatc 1140 gagacctacg caaagatcct gatcaacggt gaagtttggc aggagccact cgcttacgtc 1200 cagaacctgg atgcaggcgc acgtcaggaa gcagctgacc gcgaagcaga gcgcgcagct 1260 gacgcagcat accgcgctga gcagctccgc atcgctcagg aagcagctga cgctcagaag 1320 gctctcgctg aggctcttgc taatgcaggc aacaacgaca acggtggcga caactcctcc 1380 gacgacaagg gaaccggttc ttccgacatc ggaacctggg gacctttcgc agcaattgca 1440 gctatcatcg cagcaatcgc agctatcttc ccattcctct ccggtatcgt taagttctaa 1500 <210> 98 <211> 499 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum ATCC13869 <400> 98 Met Phe Asn Asn Arg Ile Arg Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ile Ala 1 5 10 15 Ile Ser Thr Ala Ala Ser Gly Val Ala Ile Pro Ala Phe Ala Gln Glu 20 25 30 Thr Asn Pro Thr Phe Asn Ile Asn Asn Gly Phe Asn Asp Ala Asp Gly 35 40 45 Ser Thr Ile Gln Pro Val Glu Pro Val Asn His Thr Glu Glu Thr Leu 50 55 60 Arg Asp Leu Thr Asp Ser Thr Gly Ala Tyr Leu Glu Glu Phe Gln Tyr 65 70 75 80 Gly Asn Val Glu Glu Ile Val Glu Ala Tyr Leu Gln Val Gln Ala Ser 85 90 95 Ala Asp Gly Phe Asp Pro Ser Glu Gln Ala Ala Tyr Glu Ala Phe Glu 100 105 110 Ala Ala Arg Val Arg Ala Ser Gln Glu Leu Ala Ala Ser Ala Glu Thr 115 120 125 Ile Thr Lys Thr Arg Glu Ser Val Ala Tyr Ala Leu Lys Ala Asp Arg 130 135 140 Glu Ala Thr Ala Ala Phe Glu Ala Tyr Leu Ser Ala Leu Arg Gln Val 145 150 155 160 Ser Val Ile Asn Asp Leu Ile Ala Asp Ala Asn Ala Lys Asn Lys Thr 165 170 175 Asp Phe Ala Glu Ile Glu Leu Tyr Asp Val Leu Tyr Thr Asp Ala Asp 180 185 190 Ile Ser Gly Asp Ala Pro Leu Leu Ala Pro Ala Tyr Lys Glu Leu Lys 195 200 205 Asp Leu Gln Ala Glu Val Asp Ala Asp Phe Glu Trp Leu Gly Glu Phe 210 215 220 Ala Ile Asp Asn Asn Glu Asp Asn Tyr Val Ile Arg Thr His Ile Pro 225 230 235 240 Ala Val Glu Ala Leu Lys Ala Ala Ile Asp Ser Leu Val Asp Thr Val 245 250 255 Glu Pro Leu Arg Ala Asp Ala Ile Ala Lys Asn Ile Glu Ala Gln Lys 260 265 270 Ser Asp Val Leu Val Pro Gln Leu Phe Leu Glu Arg Ala Thr Ala Gln 275 280 285 Arg Asp Thr Leu Arg Val Val Glu Ala Ile Phe Ser Thr Ser Ala Arg 290 295 300 Tyr Val Glu Leu Tyr Glu Asn Val Glu Asn Val Asn Val Glu Asn Lys 305 310 315 320 Thr Leu Arg Gln His Tyr Ser Ser Leu Ile Pro Asn Leu Phe Ile Ala 325 330 335 Ala Val Gly Asn Ile Asn Glu Leu Asn Asn Ala Asp Gln Ala Ala Arg 340 345 350 Glu Leu Phe Leu Asp Trp Asp Thr Asp Leu Thr Thr Asn Asp Glu Asp 355 360 365 Glu Ala Tyr Tyr Gln Ala Lys Leu Asp Phe Ala Ile Glu Thr Tyr Ala 370 375 380 Lys Ile Leu Ile Asn Gly Glu Val Trp Gln Glu Pro Leu Ala Tyr Val 385 390 395 400 Gln Asn Leu Asp Ala Gly Ala Arg Gln Glu Ala Ala Asp Arg Glu Ala 405 410 415 Glu Arg Ala Ala Asp Ala Ala Tyr Arg Ala Glu Gln Leu Arg Ile Ala 420 425 430 Gln Glu Ala Ala Asp Ala Gln Lys Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Asn 435 440 445 Ala Gly Asn Asn Asp Asn Gly Gly Asp Asn Ser Ser Asp Asp Lys Gly 450 455 460 Thr Gly Ser Ser Asp Ile Gly Thr Trp Gly Pro Phe Ala Ala Ile Ala 465 470 475 480 Ala Ile Ile Ala Ala Ile Ala Ala Ile Phe Pro Phe Leu Ser Gly Ile 485 490 495 Val Lys Phe <210> 99 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 99 agctcgtgcg cacctatccg ctgga 25 <210> 100 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 100 ggtcaacgca gcgggttccg cgcca 25

Claims (13)

  1. 분비 생산(secretory production)에 의해 이종 단백질을 생산하는 능력을 갖는 코리네형 세균(coryneform bacterium)으로서, 상기 코리네형 세균이,
    페니실린-결합 단백질 PBP1a을 암호화하는 유전자의 발현을 약화시키거나 상기 유전자를 파괴함으로써 페니실린-결합 단백질 PBP1a의 활성이 감소되도록 개질되고,
    세포 표면층 단백질 CspB을 암호화하는 유전자의 발현을 약화시키거나 상기 유전자를 파괴함으로써 또는 세포 표면층 단백질 CspB이 본래 결핍됨으로써 세포 표면층 단백질 CspB의 활성이 감소되도록 개질되고,
    코리네박테리움(Corynebacterium) 또는 브레비박테리움(Brevibacterium) 속에 속하는 세균
    임을 특징으로 하는 코리네형 세균.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 페니실린-결합 단백질이, 하기 (A)에 정의된 단백질인, 코리네형 세균:
    (A) 서열번호 82의 아미노산 서열로 이루어진 단백질.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 상기 세포 표면층 단백질이, 하기 (A)에 정의된 단백질인, 코리네형 세균:
    (A) 서열번호 98의 아미노산 서열로 이루어진 단백질.
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)인, 코리네형 세균.
  10. 제1항에 있어서, 상기 코리네형 세균이 상기 이종 단백질의 분비 발현을 위한 유전자 작제물(genetic construct)을 갖고,
    여기서, 상기 유전자 작제물은 코리네형 세균에서 기능하는 프로모터 서열, 상기 프로모터 서열의 하류에 결찰(ligation)되고 상기 코리네형 세균에서 기능하는 신호 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열, 및 상기 신호 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열의 하류에 결찰되고 상기 이종 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 코리네형 세균.
  11. 제1항에 있어서, 상기 이종 단백질이 중쇄, 경쇄, 단일쇄 Fv(scFv), 디설파이드-결합된 Fv(sdFv), 완전 항체, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fc, 중쇄 및 경쇄로 이루어진 이합체, Fc-융합 단백질, sc(Fv)2 및 디아바디(diabody)로부터 선택되는, 코리네형 세균.
  12. 제1항에 있어서, 상기 이종 단백질이 Fab, F(ab')2, Fc-융합 단백질, 및 scFv로부터 선택되는, 코리네형 세균.
  13. 제1항, 제4항, 제7항 및 제9항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 따르는 코리네형 세균을 배양하고, 분비 생산에 의해 생산되는 이종 단백질을 수집함을 포함하는, 이종 단백질의 생산 방법.
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