JP6020581B2 - タンパク質の分泌生産法 - Google Patents
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Description
いる。PS2(CspB)については、例えば、28株のC. glutamicumのCspBホモログのアミノ酸配列が報告されている(非特許文献11)。コリネ型細菌の細胞表層タンパク質のシグナルペプチドは、上述の通り、タンパク質の分泌生産に利用されている(特許文献2、3等)。
[1]
異種タンパク質を分泌生産する能力を有するコリネ型細菌であって、
ペニシリン結合タンパク質の活性が低下するように改変され、且つ、細胞表層タンパク質の活性が低下しており、
前記ペニシリン結合タンパク質は、コリネ型細菌で活性を低下させたときに異種タンパク質の分泌生産量を非改変株と比べて上昇させる性質を有するタンパク質である、コリネ
型細菌。
[2]
ペニシリン結合タンパク質をコードする遺伝子の発現が弱化されることにより、または該遺伝子が破壊されることにより、ペニシリン結合タンパク質の活性が低下するように改変された、前記コリネ型細菌。
[3]
前記ペニシリン結合タンパク質がPBP1aである、前記コリネ型細菌。
[4]
前記ペニシリン結合タンパク質が、下記(A)または(B)に示すタンパク質である、前記コリネ型細菌。
(A)配列番号82に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
(B)配列番号82に示すアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、コリネ型細菌で活性を低下させたときに異種タンパク質の分泌生産量を非改変株と比べて上昇させる性質を有するタンパク質。
[5]
細胞表層タンパク質をコードする遺伝子の発現が弱化されることにより、または該遺伝子が破壊されることにより、細胞表層タンパク質の活性が低下するように改変された、前記コリネ型細菌。
[6]
前記細胞表層タンパク質がCspBである、前記コリネ型細菌。
[7]
前記細胞表層タンパク質が、下記(A)または(B)に示すタンパク質である、前記コリネ型細菌。
(A)配列番号98に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
(B)配列番号98に示すアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、コリネ型細菌で活性を低下させたときに異種タンパク質の分泌生産量を非改変株と比べて上昇させる性質を有するタンパク質。
[8]
前記コリネ型細菌が、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属する細菌である、 前記コリネ型細菌。
[9]
前記コリネ型細菌が、コリネバクテリウム・グルタミカムである、前記コリネ型細菌。[10]
前記コリネ型細菌が異種タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物を有し、
前記遺伝子構築物が、コリネ型細菌で機能するプロモーター配列、該プロモーター配列の下流に接続されたコリネ型細菌で機能するシグナルペプチドをコードする核酸配列、および該シグナルペプチドをコードする核酸配列の下流に接続された前記異種タンパク質をコードする核酸配列を含む、前記コリネ型細菌。
[11]
前記異種タンパク質が抗体関連分子である、前記コリネ型細菌。
[12]
前記抗体関連分子が、Fab、F(ab’)2、Fc融合タンパク質、およびscFvから選ばれる1またはそれ以上のタンパク質である、前記コリネ型細菌。
[13]
前記コリネ型細菌を培養し、分泌生産された異種タンパク質を回収することを含む、異種タンパク質の製造方法。
本発明は、異種タンパク質を分泌生産する能力を有するコリネ型細菌であって、ペニシリン結合タンパク質の活性が低下するように改変され、且つ、細胞表層タンパク質の活性が低下している、コリネ型細菌(以下、「本発明の細菌」または「本発明のコリネ型細菌」ともいう)を提供する。
う。異種タンパク質は、例えば、微生物由来のタンパク質であってもよく、植物由来のタンパク質であってもよく、動物由来のタンパク質であってもよく、ウィルス由来のタンパク質であってもよく、さらには人工的にアミノ酸配列をデザインしたタンパク質であってもよい。異種タンパク質は、単量体タンパク質であってもよく、多量体(multimer)タンパク質であってもよい。多量体タンパク質とは、2またはそれ以上のサブユニットからなる多量体として存在しうるタンパク質をいう。多量体において、各サブユニットは、ジスルフィド結合等の共有結合で連結されていてもよく、水素結合や疎水性相互作用等の非共有結合で連結されていてもよく、それらの組み合わせにより連結されていてもよい。多量体においては、1またはそれ以上の分子間ジスルフィド結合が含まれるのが好ましい。多量体は、単一の種類のサブユニットからなるホモ多量体であってもよく、2またはそれ以上の種類のサブユニットからなるヘテロ多量体であってもよい。なお、多量体タンパク質がヘテロ多量体である場合には、多量体を構成するサブユニットの内、少なくとも1つのサブユニットが異種タンパク質であればよい。すなわち、全てのサブユニットが異種由来であってもよく、一部のサブユニットのみが異種由来であってもよい。異種タンパク質は、天然で分泌性であるタンパク質であってもよく、天然では非分泌性であるタンパク質であってもよいが、天然で分泌性であるタンパク質であるのが好ましい。「異種タンパク質」の具体例は後述する。
41, 255(1991))も含まれる。また、コリネ型細菌には、従来コリネバクテリウム・アンモニアゲネス(Corynebacterium ammoniagenes)に分類されていたが、16S rRNAの塩基配列解析等によりコリネバクテリウム・スタティオニス(Corynebacterium stationis)に再分類されたものも含まれる(Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 60, 874-879(2010))。コリネ型細菌を使用することの利点としては、従来異種タンパク質の分泌生産に利用されている糸状菌、酵母、Bacillus属細菌等と比べ、もともと菌体外に分泌されるタンパク質が極めて少なく、異種タンパク質を分泌生産した場合の精製過程の簡略化や省略化が期待できること、また、糖、アンモニア、および無機塩等を含有するシンプルな培地で良く生育し、培地代や培養方法、培養生産性で優れていること、等が挙げられる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム(Corynebacterium acetoacidophilum)
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム(Corynebacterium acetoglutamicum)
コリネバクテリウム・アルカノリティカム(Corynebacterium alkanolyticum)
コリネバクテリウム・カルナエ(Corynebacterium callunae)
コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)
コリネバクテリウム・リリウム(Corynebacterium lilium)
コリネバクテリウム・メラセコーラ(Corynebacterium melassecola)
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス(コリネバクテリウム・エフィシエンス)(Corynebacterium thermoaminogenes (Corynebacterium efficiens))
コリネバクテリウム・ハーキュリス(Corynebacterium herculis)
ブレビバクテリウム・ディバリカタム(Brevibacterium divaricatum)
ブレビバクテリウム・フラバム(Brevibacterium flavum)
ブレビバクテリウム・イマリオフィラム(Brevibacterium immariophilum)
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(コリネバクテリウム・グルタミカム)(Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum))
ブレビバクテリウム・ロゼウム(Brevibacterium roseum)
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム(Brevibacterium saccharolyticum)
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス(Brevibacterium thiogenitalis)
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス(コリネバクテリウム・スタティオニス)(Corynebacterium ammoniagenes(Corynebacterium stationis))
ブレビバクテリウム・アルバム(Brevibacterium album)
ブレビバクテリウム・セリナム(Brevibacterium cerinum)
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム(Microbacterium ammoniaphilum)
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806
Corynebacterium alkanolyticum ATCC 21511
Corynebacterium callunae ATCC 15991
Corynebacterium glutamicum ATCC 13020, ATCC 13032, ATCC 13060,ATCC 13869,FERM BP-734
Corynebacterium lilium ATCC 15990
Corynebacterium melassecola ATCC 17965
Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340 (FERM BP-1539)
Corynebacterium herculis ATCC 13868
Brevibacterium divaricatum ATCC 14020
Brevibacterium flavum ATCC 13826, ATCC 14067, AJ12418(FERM BP-2205)
Brevibacterium immariophilum ATCC 14068
Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869
Brevibacterium roseum ATCC 13825
Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066
Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240
Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis) ATCC 6871, ATCC 6872
Brevibacterium album ATCC 15111
Brevibacterium cerinum ATCC 15112
Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354
盤機構 AIST特許生物寄託センター、日本国茨城県つくば市東1−1−1 中央第6、郵便番号305-8566)に国際寄託として原寄託され、受託番号FERM BP-734が付与されている。
W-PBPs)が挙げられる。class A HMW-PBPsは、細胞壁を構成するペプチドグリカン部分への架橋を行うペプチド転移活性を有するtranspeptidase活性ドメインと二糖類から多糖鎖を形成する糖転移活性を有するtransglycosylase活性ドメインの両方を有する。class B HMW-PBPsは、transpeptidase活性ドメインを有する。例えば、C. glutamicumにおいては、class A HMW-PBPsとしては、PBP1aやPBP1bが挙げられる。C. glutamicumにおいては、class B HMW-PBPsとしては、FtsI、PBP2a、およびPBP2bが挙げられる。
ATCC 13032のCgl0278遺伝子の塩基配列および同遺伝子がコードするPBP1aタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号81および82に示す。
アントであってもよい。なお、Cgl0278遺伝子のバリアントには、同遺伝子のホモログが含まれる。Cgl0278遺伝子のホモログは、上記のC.glutamicumの野生型Cgl0278遺伝子を問い合わせ配列として用いたBLAST検索やFASTA検索によって公開データベースから容易に取得することができ、また、コリネ型細菌の染色体を鋳型にして、これら公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたPCRにより取得することができる。
形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1% SDS、好ましくは60℃、0.1×SSC、0.1% SDS、より好ましくは、68℃、0.1×SSC、0.1% SDSに相当する塩濃度および温度で、1回、好ましくは2〜3回洗浄する条件を挙げることができる。
C. glutamicum ATCC13058(AY524990)
C. glutamicum ATCC13744(AY524991)
C. glutamicum ATCC13745(AY524992)
C. glutamicum ATCC14017(AY524993)
C. glutamicum ATCC14020(AY525009)
C. glutamicum ATCC14067(AY524994)
C. glutamicum ATCC14068(AY525010)
C. glutamicum ATCC14747(AY525011)
C. glutamicum ATCC14751(AY524995)
C. glutamicum ATCC14752(AY524996)
C. glutamicum ATCC14915(AY524997)
C. glutamicum ATCC15243(AY524998)
C. glutamicum ATCC15354(AY524999)
C. glutamicum ATCC17965(AY525000)
C. glutamicum ATCC17966(AY525001)
C. glutamicum ATCC19223(AY525002)
C. glutamicum ATCC19240(AY525012)
C. glutamicum ATCC21341(AY525003)
C. glutamicum ATCC21645(AY525004)
C. glutamicum ATCC31808(AY525013)
C. glutamicum ATCC31830(AY525007)
C. glutamicum ATCC31832(AY525008)
C. glutamicum LP-6(AY525014)
C. glutamicum DSM20137(AY525015)
C. glutamicum DSM20598(AY525016)
C. glutamicum DSM46307(AY525017)
C. glutamicum 22220(AY525005)
C. glutamicum 22243(AY525006)
い。
ーターとして、具体的には、例えば、グルタミン酸生合成系のグルタミン酸脱水素酵素遺伝子、グルタミン合成系のグルタミン合成酵素遺伝子、リジン生合成系のアスパルトキナーゼ遺伝子、スレオニン生合成系のホモセリン脱水素酵素遺伝子、イソロイシンおよびバリン生合成系のアセトヒドロキシ酸合成酵素遺伝子、ロイシン生合成系の2-イソプロピルリンゴ酸合成酵素遺伝子、プロリンおよびアルギニン生合成系のグルタミン酸キナーゼ遺伝子、ヒスチジン生合成系のホスホリボシル-ATPピロホスホリラーゼ遺伝子、トリプトファン、チロシンおよびフェニルアラニン等の芳香族アミノ酸生合成系のデオキシアラビノヘプツロン酸リン酸(DAHP)合成酵素遺伝子、イノシン酸およびグアニル酸のような核酸生合成系におけるホスホリボシルピロホスフェート(PRPP)アミドトランスフェラーゼ遺伝子、イノシン酸脱水素酵素遺伝子、およびグアニル酸合成酵素遺伝子のプロモーターが挙げられる。
factor;EGF)、インスリン様成長因子(Insulin-like growth factor;IGF)、トランスフォーミング成長因子(Transforming growth factor;TGF)、神経成長因子(Nerve growth factor;NGF)、脳由来神経栄養因子(Brain-derived neurotrophic factor;BDNF)、血管内皮細胞増殖因子(Vesicular endothelial growth factor;VEGF)、顆粒球コロニー刺激因子(Granulocyte-colony stimulating factor;G-CSF)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(Granulocyte-macrophage-colony stimulating factor;GM-CSF)、血小板由来成長因子(Platelet-derived growth factor;PDGF)、エリスロポエチン(Erythropoietin;EPO)、トロンボポエチン(Thrombopoietin;TPO)、酸性線維芽細胞増殖因子(acidic fibroblast growth factor;aFGFまたはFGF1)、塩基性線維芽細胞増殖因子(basic fibroblast growth factor;bFGFまたはFGF2)、角質細胞増殖因子(keratinocyto growth factor;KGF-1またはFGF7, KGF-2またはFGF10)、肝細胞増殖因子(Hepatocyte growth factor;HGF)が挙げられる。
体、Fc融合タンパク質、重鎖(H鎖)、軽鎖(L鎖)、単鎖Fv(scFv)、sc(Fv)2、ジスルフィド結合Fv(sdFv)、Diabodyが挙げられる。
を得るために改変することができる。例えば、これらのタンパク質をコードする遺伝子は、これらのタンパク質に1又は数個のアミノ酸の付加、欠失、置換などが含まれるよう改変されてもよい。上述のペニシリン結合タンパク質およびそれをコードする遺伝子のバリアントに関する記載は、本発明の方法により分泌生産される異種タンパク質およびそれをコードする遺伝子にも準用できる。また、これらのタンパク質をコードする遺伝子は、任意のコドンをそれと等価のコドンに置換したものであってもよい。例えば、これらのタンパク質をコードする遺伝子は、必要により宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンに変換してもよい。
CRY2KX、pCRY31、pCRY3KE及びpCRY3KX;特開平1-191686号公報に記載のプラスミドpCRY2およびpCRY3;特開昭58-192900号公報に記載のpAJ655、pAJ611及びpAJ1844;特開昭57-134500号公報に記載のpCG1;特開昭58-35197号公報に記載のpCG2;特開昭57-183799号公報に記載のpCG4およびpCG11;特開平10-215883号公報に記載のpVK7、特開平9-070291号公報に記載のpVC7等が挙げられる。
本発明は、本発明の細菌を培養し、分泌生産された異種タンパク質を回収することを含む、異種タンパク質の製造方法(以下、「本発明の方法」または「本発明の異種タンパク質の製造方法」ともいう)を提供する。すなわち、上記のようにして得られる本発明の細菌を培養し、異種タンパク質を発現させることにより、菌体外に分泌された多量の異種タンパク質が得られる。
て適宜使用する。培養はpH5.0〜8.5、15℃〜37℃の適切な範囲にて好気的条件下で行い、1〜7日間程度培養する。また、コリネ型細菌のL−アミノ酸生産における培養条件や、その他Sec系、Tat系のシグナルペプチドを用いたタンパク質の製造法に記載の条件を用いることが出来る(WO01/23591、WO2005/103278参照)。また、異種タンパク質の発現のために誘導型プロモーターを用いた場合は、培地にプロモーター誘導剤を添加して培養を行うこともできる。このような条件下で本発明の細菌を培養することにより、目的タンパク質は菌体内で多量に生産され効率よく菌体外に分泌される。なお、本発明の方法によれば、生産された異種タンパク質は菌体外に分泌されるため、例えばトランスグルタミナーゼ等の微生物の菌体内で多量に蓄積すると一般に致死的であるタンパク質も、致死的影響を受けることなく連続的に生産できる。
(1)PBP1aをコードするCgl0278遺伝子欠損用ベクターpBSΔCgl0278の構築
C. glutamicum ATCC13032株のゲノム配列および、ペニシリン結合タンパク質PBP1aをコードするCgl0278遺伝子の塩基配列は既に決定されている(Genbank Accession No. BA000036, NCBI gene entry NCgl0274)。この配列を参考にして<配列番号01>、<配列番号02>、<配列番号03>、および<配列番号04>に記載のプライマーを合成した。常法に従って(斉藤、三浦の方法[Biochim. Biophys. Acta, 72, 619(1963)])調製したC. glutamicum ATCC13869株の染色体DNAを鋳型として、<配列番号01>と<配列番号02>のプライマーを用いてPBP1aをコードするCgl0278の5’側上流約1kbpを、<配列番号03>と<配列番号04>のプライマーを用いて3’側下流約1kbpの領域を、それぞれPCR法によって増幅した。次に、増幅
した両DNA断片を鋳型に、<配列番号01>と<配列番号04>に示すDNAをプライマーとして用いたPCR法により両DNA断片が融合した約2kbpのDNA断片を得た。<配列番号01>と<配列番号04>のプライマーにはそれぞれ制限酵素Bam HIとXba Iの認識配列がデザインしてある。PCRにはPyrobest DNA polymerase(タカラバイオ社製)を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。このDNA断片を制限酵素Bam HIおよびXba Iで処理し、WO2005/113744に記載のpBS4のBam HI-Xba I部位に挿入することによって、Cgl0278遺伝子欠損用のベクターpBSΔCgl0278を得た。ライゲーション反応にはDNA Ligation Kit Ver.2.1(タカラバイオ社製)を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。
C. glutamicum ATCC13032株のゲノム配列および、ペニシリン結合タンパク質PBP1bをコードするCgl2986遺伝子の塩基配列は既に決定されている(Genbank Accession No. BA000036, NCBI gene entry NCgl2884)。Cgl0278の場合と同様に、この配列を参考にして<配列番号05>、<配列番号06>、<配列番号07>、および<配列番号08>に記載のプライマーを合成した。調製したC. glutamicum ATCC13869株の染色体DNAを鋳型として、<配列番号05>と<配列番号06>のプライマーを用いてPBP1bをコードするCgl2986の5’側上流約1.3kbpを、<配列番号07>と<配列番号08>のプライマーを用いて3’側下流約1.1kbpの領域を、それぞれPCR法によって増幅した。次に、増幅した両DNA断片を鋳型に、<配列番号05>と<配列番号08>に示すDNAをプライマーとして用いたPCR法により両DNA断片が融合した約2.4kbpのDNA断片を得た。得られた約2.4kbpのDNA断片中には制限酵素Pst IおよびSal Iの認識配列がそれぞれ一箇所ずつ含まれている。PCRにはPyrobest DNA polymerase(タカラバイオ社製)を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。このDNA断片を制限酵素Pst
IおよびSal Iで処理して得られた約2.2kbpの断片を、WO2006/057450に記載のpBS5TのPst
I-Sal I部位に挿入することによって、Cgl2986遺伝子欠損用のベクターpBSΔCgl2986を得た。
次に、構築したpBSΔCgl0278およびpBSΔCgl2986でWO2004/029254に記載のC. glutamicum YDK010株をそれぞれ形質転換した。なお、C. glutamicum YDK010株は、C. glutamicum
AJ12036(FERM BP-734)の細胞表層タンパク質PS2の欠損株である(WO2004/029254)。得られた形質転換体からWO2005/113744およびWO2006/057450記載の方法に従って菌株の選択を行い、Cgl0278遺伝子が欠損したYDK010ΔPBP1a株およびCgl2986遺伝子が欠損したYDK010ΔPBP1b株を得た。
(1)抗体トラスツズマブのFab断片のH鎖領域の分泌発現プラスミドの構築
乳癌細胞特異的な抗体トラスツズマブのH鎖の可変領域の遺伝子配列は既に決定されている(Genbank Accession No.AY513484)。この配列と一般的な抗体H鎖の不可変領域の配列を参考にし、C. glutamicumのコドン使用頻度を考慮して<配列番号09>〜<配列番号42>に示したDNAを合成した。これらのDNAを鋳型とし、別途合成した<配列番号43>と<配列番号44>に示したDNAをプライマーとして用いて、トラスツズマブの完全長H鎖領域をPCR法によって増幅し、約1.4kbpの<配列番号45>に示したDNA断片を得た。<配列番号45>に示したDNAにコードされる抗体トラスツズマブのH鎖のアミノ酸配列を<配列番号86>に示した。
obaraense由来のプロトランスグルタミナーゼ遺伝子を有する)を鋳型に、<配列番号46>と<配列番号47>に示したプライマーを用いて、上記プロモーター領域と上記シグナルペプチド領域とを含む領域をPCR法にて増幅し、約0.7kbpのDNA断片を得た。
実施例2(1)で構築した抗体トラスツズマブのFab断片のH鎖領域の分泌発現プラスミドであるpPKStrast-FabH(1-229C)を用いて、YDK010株、YDK010ΔPBP1a株、およびYDK010ΔPBP1b株のそれぞれを形質転換した。得られた各形質転換体を、25 mg/lのカナマイシンを含むMM液体培地(グルコース 120 g、硫酸マグネシウム七水和物 3 g、硫酸アンモニウム 30 g、リン酸二水素カリウム 1.5 g、硫酸鉄七水和物 0.03 g、硫酸マンガン五水和物
0.03 g、チアミン塩酸塩 450 μg、ビオチン 450 μg、DL−メチオニン0.15 g、炭酸カルシウム 50 gを水で1LにしてpH7.0に調整)でそれぞれ30 ℃、72時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清を還元SDS-PAGEに供してからSYPRO Orange(インビトロジェン社製)にて染色を行った。その結果、親株のYDK010株およびYDK010ΔPBP1b株では目的のタンパク質バンドが検出されなかったが、YDK010ΔPBP1a株でのみ、目的の抗体トラスツズマブのFab断片のH鎖と同じ分子量のタンパク質バンドが検出された(図1、図2)。このタンパク質バンドのN末端配列をプロテインシークエンサーPPSQ-21A(島津製作所製)を用いて決定したところ、目的の抗体トラスツズマブのFab断片のH鎖のN末端配列と一致した事から、培養上清中に抗体トラスツズマブのFab断片のH鎖が分泌発現している事が確認できた。
PKStrast-FabH(1-233P) を用いて、YDK010株およびYDK010ΔPBP1a株のそれぞれを形質転換した。得られた各形質転換体を、25 mg/lのカナマイシンを含むMM液体培地(グルコース 120 g、硫酸マグネシウム七水和物 3 g、硫酸アンモニウム 30 g、リン酸二水素カリウム 1.5 g、硫酸鉄七水和物 0.03 g、硫酸マンガン五水和物 0.03 g、チアミン塩酸塩 450 μg、ビオチン 450 μg、DL−メチオニン0.15 g、炭酸カルシウム 50 g、水で1LにしてpH7.0に調整)でそれぞれ30 ℃、72時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清を還元SDS-PAGEに供してからSYPRO Orange(インビトロジェン社製)にて染色を行った。その結果、いずれの分泌発現プラスミドを用いた場合にも、親株のYDK010株では目的のタンパク質バンドが検出されなかったが、YDK010ΔPBP1a株でのみ、目的の抗体トラスツズマブのFab断片のH鎖と同じ分子量のタンパク質バンドが検出された(図3)。
(1)抗体トラスツズマブのFab断片のL鎖領域の分泌発現プラスミドの構築
乳癌細胞特異的な抗体トラスツズマブのL鎖の可変領域の遺伝子配列は既に決定されている(Genbank Accession No. AY513485)。この配列と一般的な抗体L鎖の不可変領域の配列を参考にし、C. glutamicumのコドン使用頻度を考慮して<配列番号55>〜<配列番号70>に示したDNAを合成した。これらのDNAを鋳型とし、別途合成した<配列番号71>と<配列番号72>に示したDNAをプライマーとして用いて、トラスツズマブの完全長L鎖領域をPCR法によって増幅し、約0.6kbpの<配列番号73>に示したDNA断片を得た。<配列番号73>に示したDNAにコードされる抗体トラスツズマブのL鎖のアミノ酸配列を<配列番号87>に示した。次にWO01/23591記載のpPKSPTG1(C. glutamicum ATCC13869株由来のプロモーター領域とC. ammoniagenes (C. stationis)ATCC6872株由来のシグナルペプチド領域を含む)を鋳型に、<配列番号74>と<配列番号75>に示したプライマーを用いて、上記プロモーター領域と上記シグナルペプチド領域とを含む領域をPCR法にて増幅し、約0.7kbpのDNA断片を得た。次に増幅した両DNA断片(トラスツズマブのL鎖領域を含む断片と、プロモーター領域及びシグナルペプチド領域を含む断片)を鋳型に、<配列番号74>と<配列番号76>に記載のDNAをプライマーとして用いたPCR法により、両DNA断片が融合した約1.3kbpのDNA断片を得た。<配列番号74>と<配列番号76>のプライマーにはそれぞれ制限酵素BamH Iの認識配列がデザインしてある。PCRにはPyrobest DNA polymerase(タカラバイオ社製)を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。この融合DNA断片を制限酵素BamH I処理し、特開平9-322774記載のpPK4のBamH I部位に挿入することによって、トラスツズマブのFab部分のL鎖領域を分泌発現させるプラスミドpPKStrast-FabLを得た。挿入断片の塩基配列決定の結果、予想通りの遺伝子が構築されていることを確認した。尚、塩基配列の決定はBigDye(R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(アプライドバイオシステムズ社製)と3130 ジェネティックアナライザ(アプライドバイオシステムズ社製)を用いて行った。
実施例3(1)で構築した抗体トラスツズマブのFab断片のL鎖領域の分泌発現プラスミドpPKStrast-FabLを用いて、YDK010株およびYDK010ΔPBP1a株のそれぞれを形質転換した。得られた各形質転換体を、25 mg/lのカナマイシンを含むMM液体培地(グルコース 120 g、硫酸マグネシウム七水和物 3 g、硫酸アンモニウム 30 g、リン酸二水素カリウム 1.5
g、硫酸鉄七水和物 0.03 g、硫酸マンガン五水和物 0.03 g、チアミン塩酸塩 450 μg、ビオチン 450 μg、DL−メチオニン0.15 g、炭酸カルシウム 50 gを水で1LにしてpH7.0に調整)でそれぞれ30 ℃、72時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清を還元SDS-PAGEに供してからCBB R250(バイオラッド社製)にて染色を行った。その結果、YDK010ΔPBP1a株においては、親株のYDK010株と比較して少なくとも2倍以上のバンド強度で、目的の抗体トラスツズマブのFab断片のL鎖と同じ分子量のタンパク質バ
ンドが検出された(図4)。このタンパク質バンドのN末端配列をプロテインシークエンサーPPSQ-21A(島津製作所製)を用いて決定したところ、目的の抗体トラスツズマブのFab断片のL鎖のN末端配列と一致した事から、培養上清中に抗体トラスツズマブのFab断片のL鎖が分泌発現している事が確認できた。
(1)抗体トラスツズマブのFab(H&L)断片の分泌発現プラスミドの構築
実施例2(1)で構築した抗体トラスツズマブのFab断片のH鎖領域の各発現プラスミドを制限酵素Kpn Iで消化することにより得られたそれぞれ約1.4kbのDNA断片を、実施例3(1)で構築した抗体トラスツズマブのFab断片のL鎖領域の発現プラスミドであるpPKStrast-FabLのKpn I部位に挿入することによって、トラスツズマブのFab断片のH鎖領域とL鎖領域を共発現させるプラスミドpPKStrast-FabH(1-223C)+L、pPKStrast-FabH(1-228T)+L、pPKStrast-FabH(1-229C)+L、pPKStrast-FabH(1-230P)+L、 pPKStrast-FabH(1-231P)+L、pPKStrast-FabH(1-232C)+L、pPKStrast-FabH(1-233P)+Lを得た。
実施例4(1)で構築した抗体トラスツズマブのFab(H&L)断片の分泌発現プラスミドpPKStrast-FabH(1-223C)+L、pPKStrast-FabH(1-228T)+L、pPKStrast-FabH(1-229C)+L、pPKStrast-FabH(1-230P)+L、 pPKStrast-FabH(1-231P)+L、pPKStrast-FabH(1-232C)+L、pPKStrast-FabH(1-233P)+Lを用いて、YDK010株およびYDK010ΔPBP1a株のそれぞれを形質転換した。得られた各形質転換体を、25 mg/lのカナマイシンを含むMM液体培地(グルコース 120 g、硫酸マグネシウム七水和物 3 g、硫酸アンモニウム 30 g、リン酸二水素カリウム 1.5 g、硫酸鉄七水和物 0.03 g、硫酸マンガン五水和物 0.03 g、チアミン塩酸塩 450 μg、ビオチン 450 μg、DL-メチオニン0.15 g、炭酸カルシウム 50 gを水で1LにしてpH7.0に調整)でそれぞれ30 ℃、96時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清を非還元SDS-PAGEに供してからSYPRO Orange(インビトロジェン社製)にて染色を行い、抗体トラスツズマブのFab(H&L)断片の分泌量の比較を行った。その結果、いずれの分泌発現プラスミドを用いた場合でも、親株のYDK010株と比較してYDK010ΔPBP1a株では、有意に抗体トラスツズマブのFab(H&L)断片の分泌量が向上していた(図5)。YDK010ΔPBP1a株におけるpPKStrast-FabH(1-229C)+Lを用いた形質転換株のFab(H&L)タンパク質バンドのN末端配列をプロテインシークエンサーPPSQ-21A(島津製作所製)を用いて決定したところ、目的の抗体トラスツズマブのFab断片のH鎖のN末端配列とL鎖のN末端配列の両方の配列が含まれていた事から、培養上清中に抗体トラスツズマブのFab(H&L)断片が分泌発現して会合体を形成している事が確認できた。
実施例4(2)で得られた各培養上清を非還元SDS-PAGEに供してからiBlot(R) Gel Transfer Stacks PVDF, Mini(インビトロジェン社製)とiBlotTMゲルトランスファーシステム(インビトロジェン社製)を用いてPVDF膜に転写した。このPVDF膜に対してアルカリフォスファターゼ標識抗ヒトIgG[H&L]抗体(ROCKLAND社製)とAlkaline Phosphatase Conjugate Substrate Kit(バイオラッド社製)を用いたウェスタンブロッティングを行い、抗体トラスツズマブのF(ab’)2の検出を行った。その結果、H鎖同士をつなぐジスルフィド結合を形成するシステイン残基が含まれているH鎖遺伝子とL鎖遺伝子を共発現するプラスミドであるpPKStrast-FabH(1-229C)+L、pPKStrast-FabH(1-230P)+L、 pPKStrast-FabH(1-231P)+L、pPKStrast-FabH(1-232C)+L、pPKStrast-FabH(1-233P)+Lを有する形質転換体の培養上清において、抗体トラスツズマブのF(ab’)2の分子量のタンパク質バンドが検出された。さらに、これらいずれの分泌発現プラスミドを用いた場合にも、親株
のYDK010株と比較してYDK010ΔPBP1a株では、有意に抗体トラスツズマブのF(ab’)2の分子量のタンパク質バンドが増加していた(図6)。
(1)抗体トラスツズマブのFc断片の分泌発現プラスミドの構築
実施例2(1)で合成したトラスツズマブの完全長H鎖領域を含む<配列番号45>に示したDNAを鋳型とし、別途合成した<配列番号77>と<配列番号78>、<配列番号77>と<配列番号79>に示したDNAをプライマーとして用いて、トラスツズマブのH鎖のFc領域をPCR法によって増幅し、それぞれ約0.7kbpのDNA断片を得た。次にWO01/23591記載のpPKSPTG1(C. glutamicum ATCC13869株由来のプロモーター領域とC. ammoniagenes (C. stationis) ATCC6872株由来のシグナルペプチド領域を含む)を鋳型に、<配列番号46>と<配列番号80>に示したプライマーを用いて、上記プロモーター領域と上記シグナルペプチド領域とを含む領域をPCR法にて増幅し、約0.7kbpのDNA断片を得た。次に、増幅した両DNA断片(トラスツズマブのH鎖のFc領域を含む断片のそれぞれと、プロモーター領域及びシグナルペプチド領域を含む断片)を鋳型に、<配列番号46>と<配列番号77>に記載のDNAをプライマーとして用いたPCR法により、両DNA断片が融合したそれぞれ約1.4kbpのDNA断片を得た。<配列番号46>と<配列番号77>のプライマーにはそれぞれ制限酵素Kpn Iの認識配列がデザインしてある。PCRにはPyrobest DNA polymerase(タカラバイオ社製)を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。これらのDNA断片を制限酵素Kpn I処理後に、特開平9-322774記載のpPK4のKpn I部位に挿入することによって、トラスツズマブのH鎖のFc領域を分泌発現させるプラスミドpPKStrast-Fc(H224D-450)、pPKStrast-Fc(H231P-450)を得た。具体的には、これらのプラスミドにより、プラスミド名に含まれる数字に従って、トラスツズマブのH鎖の224または231番目のアミノ酸残基から、450番目のアミノ酸残基までを発現させることができる。挿入断片の塩基配列決定の結果、予想通りの遺伝子が構築されていることを確認した。尚、塩基配列の決定はBigDye(R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(アプライドバイオシステムズ社製)と3130 ジェネティックアナライザ(アプライドバイオシステムズ社製)を用いて行った。
実施例5(1)で構築した抗体トラスツズマブのFc断片の分泌発現プラスミドであるpPKStrast-Fc(H224D-450)、pPKStrast-Fc(H231P-450)を用いて、YDK010株およびYDK010ΔPBP1a株のそれぞれを形質転換した。得られた各形質転換体を、25 mg/lのカナマイシンを含むMM液体培地(グルコース 120 g、硫酸マグネシウム七水和物 3 g、硫酸アンモニウム 30 g、リン酸二水素カリウム 1.5 g、硫酸鉄七水和物 0.03 g、硫酸マンガン五水和物 0.03 g、チアミン塩酸塩 450 μg、ビオチン 450 μg、DL−メチオニン 0.15 g、炭酸カルシウム 50 gを水で1LにしてpH7.0に調整)でそれぞれ30 ℃、72時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清を還元SDS-PAGEに供してからiBlot(R) Gel Transfer Stacks PVDF, Mini(インビトロジェン社製)とiBlotTMゲルトランスファーシステム(インビトロジェン社製)を用いてPVDF膜に転写した。このPVDF膜に対してアルカリフォスファターゼ標識抗ヒトIgG[H&L]抗体(ROCKLAND社製)とAlkaline Phosphatase Conjugate Substrate Kit(バイオラッド社製)を用いたウェスタンブロッティングを行い、抗体トラスツズマブのFc断片の分泌量の比較を行った。その結果、いずれの分泌発現プラスミドを用いた場合でも、親株のYDK010株と比較してYDK010ΔPBP1a株では、有意に抗体トラスツズマブのFc断片の分泌量が向上していた(図7)。
(1)ペニシリン結合タンパク質PBP1a欠損株を用いたプロトランスグルタミナーゼの分
泌発現
C. glutamicumを用いたプロトランスグルタミナーゼの分泌発現系は既に報告されている(WO01/23591)。そこでWO01/23591記載のプロトランスグルタミナーゼ分泌発現用プラスミドベクターpPKSPTG1を用いて、YDK010株およびYDK010ΔPBP1a株のそれぞれを形質転換した。得られた各形質転換体を、25 mg/lのカナマイシンを含むMM液体培地(グルコース 120 g、硫酸マグネシウム七水和物 3 g、硫酸アンモニウム 30 g、リン酸二水素カリウム 1.5 g、硫酸鉄七水和物 0.03 g、硫酸マンガン五水和物 0.03 g、チアミン塩酸塩 450 μg、ビオチン 450 μg、DL-メチオニン0.15 g、炭酸カルシウム 50 gを水で1LにしてpH7.0に調整)でそれぞれ30 ℃、72時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清を還元SDS-PAGEに供してからCBB R250(バイオラッド社製)にて染色を行い、プロトランスグルタミナーゼの分泌量を既報([Protein Expr Purif 26:329-335])に従って比較定量を行った。その結果、親株のYDK010株と比較してYDK010ΔPBP1a株では、有意にプロトランスグルタミナーゼの分泌量が向上していた(図8)。
(1)抗ジゴキシン単鎖抗体(scFv)の分泌発現プラスミドの構築
抗ジゴキシン単鎖抗体の遺伝子配列は既に決定されており、Bacillus subtilisを用いた発現検討が実施されている(Biotechnology (N Y)., 11(1): 71-76(1993))。この配列を参考にし、C. glutamicum ATCC13869株のPS2遺伝子由来のプロモーター、同プロモーターの下流に発現可能に連結されたC. ammoniagenes (C. stationis) ATCC6872株のSlpA由来のシグナルペプチドをコードするDNA、および同シグナルペプチドとの融合タンパク質として発現するよう連結された抗ジゴキシン単鎖抗体をコードするDNAを含む、<配列番号88>に示すDNA断片を全合成した。<配列番号88>の合成DNAには5’末端と3’末端に制限酵素Xba Iの認識配列が含まれている。なお、合成DNA中の抗ジゴキシン単鎖抗体をコードするDNAは、C. glutamicumのコドン使用頻度を考慮して設計した。合成DNA中の抗ジゴキシン単鎖抗体をコードするDNAの塩基配列を<配列番号89>、抗ジゴキシン単鎖抗体のアミノ酸配列を<配列番号90>に示した。全合成したDNA断片を制限酵素Xba Iで消化し、特開平9-322774に記載のpPK4のXba I部位に挿入することによって、抗ジゴキシン単鎖抗体を発現させるプラスミドpPKSSCA1を得た。
実施例7(1)で構築したscFvの分泌発現プラスミドであるpPKSSCA1を用いて、YDK010株およびYDK010ΔPBP1a株のそれぞれを形質転換した。得られた各形質転換体を、25 mg/lのカナマイシンを含むMM液体培地(グルコース 120 g、硫酸マグネシウム七水和物 3 g、硫酸アンモニウム 30 g、リン酸二水素カリウム 1.5 g、硫酸鉄七水和物 0.03 g、硫酸マンガン五水和物 0.03 g、チアミン塩酸塩 450 μg、ビオチン 450 μg、DL−メチオニン0.15 g、炭酸カルシウム 50 gを水で1LにしてpH7.0に調整)でそれぞれ30 ℃、72時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清を還元SDS-PAGEに供してからSYPRO Orange(インビトロジェン社製)にて染色を行った。その結果、YDK010ΔPBP1a株においては、親株のYDK010株と比較して少なくとも2倍以上のバンド強度で、目的の抗ジゴキシンscFvと同じ分子量のタンパク質バンドが検出された(図9)。このタンパク質バンドのN末端配列をプロテインシークエンサーPPSQ-21A(島津製作所製)を用いて決定したところ、目的の抗ジゴキシン単鎖抗体のN末端配列と一致した事から、培養上清中に抗ジゴキシンscFvが分泌発現している事が確認できた。
(1)抗体アダリムマブのFab(H&L)断片の分泌発現プラスミドの構築
腫瘍壊死因子α(tumor necrosis factor-α;TNF-α)特異的な抗体アダリムマブのアミノ酸配列は既に決定されている(独立行政法人医薬品医療機器総合機構審査報告書(平成20年2月14日))。この配列を参考にし、C. glutamicum ATCC13869株のPS2遺伝子由来のプロモーター、同プロモーターの下流に発現可能に連結されたC. ammoniagenes (C. stationis) ATCC6872株のSlpA由来のシグナルペプチドをコードするDNA、および同シグナルペプチドとの融合タンパク質として発現するよう連結されたアダリムマブのH鎖の1番目から230番目のシステイン残基までのアミノ酸配列をコードするDNA、その下流にさらにC. glutamicum ATCC13869株のPS2遺伝子由来のプロモーター、同プロモーターの下流に発現可能に連結されたC. ammoniagenes (C. stationis)ATCC6872株のSlpA由来のシグナルペプチドをコードするDNA、および同シグナルペプチドとの融合タンパク質として発現するよう連結されたアダリムマブのL鎖をコードするDNAを含む、<配列番号91>に示すDNA断片を全合成した。同様に、C. glutamicum ATCC13869株のPS2遺伝子由来のプロモーター、同プロモーターの下流に発現可能に連結されたC. ammoniagenes (C. stationis)ATCC6872株のSlpA由来のシグナルペプチドをコードするDNA、および同シグナルペプチドとの融合タンパク質として発現するよう連結されたアダリムマブのL鎖をコードするDNA、その下流にさらにC. glutamicum ATCC13869株のPS2遺伝子由来のプロモーター、同プロモーターの下流に発現可能に連結されたC. ammoniagenes (C. stationis) ATCC6872株のSlpA由来のシグナルペプチドをコードするDNA、および同シグナルペプチドとの融合タンパク質として発現するよう連結されたアダリムマブのH鎖の1番目から230番目のシステイン残基までのアミノ酸配列をコードするDNAを含む、<配列番号92>に示すDNA断片を全合成した。<配列番号91>、<配列番号92>の合成DNAにはそれぞれ5’末端に制限酵素BamH I、3’末端に制限酵素Xba
Iの認識配列が含まれている。なお、合成DNA中のアダリムマブのH鎖およびL鎖をコードするDNAは、C. glutamicumのコドン使用頻度を考慮して設計した。合成DNA中のアダリムマブのH鎖の1番目から230番目のアミノ酸配列をコードするDNA配列を<配列番号93>、同アミノ酸配列を<配列番号94>に示した。また、合成DNA中のアダリムマブのL鎖をコードするDNA配列を<配列番号95>、アダリムマブのL鎖のアミノ酸配列を<配列番号96>に示した。全合成したそれぞれ約2.7kbpのDNA断片を制限酵素BamH IおよびXba Iで消化し、特開平9-322774に記載のpPK4のBamH I-Xba I部位に挿入することによって、抗体アダリムマブのFab断片のH鎖(1-230C)とL鎖を共発現させるプラスミドpPKSada-FabHLおよびpPKSada-FabLHを得た。それぞれのプラスミド名中の「FabHL」および「FabLH」は、発現プラスミド中のアダリムマブのH鎖遺伝子およびL鎖遺伝子の搭載順序を示している。
実施例8(1)で構築した抗体アダリムマブのFab(H&L)断片の分泌発現プラスミドpPKSada-FabHLおよびpPKSada-FabLHを用いて、YDK010株およびYDK010ΔPBP1a株のそれぞれを形質転換した。得られた各形質転換体を、25 mg/lのカナマイシンを含むMM液体培地(グルコース 120 g、硫酸マグネシウム七水和物 3 g、硫酸アンモニウム 30 g、リン酸二水素カリウム 1.5 g、硫酸鉄七水和物 0.03 g、硫酸マンガン五水和物 0.03 g、チアミン塩酸塩 450 μg、ビオチン 450 μg、DL-メチオニン0.15 g、炭酸カルシウム 50 gを水で1LにしてpH7.0に調整)でそれぞれ30 ℃、96時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清を非還元SDS-PAGEに供してからSYPRO Orange(インビトロジェン社製)にて染色を行い、抗体アダリムマブのFab(H&L)断片の分泌量の比較を行った。その結果、いずれの分泌発現プラスミドを用いた場合でも、親株のYDK010株と比較してYDK010ΔPBP1a株では、有意に抗体アダリムマブのFab(H&L)断片の分泌量が向上していた(図10)。YDK010ΔPBP1a株におけるpPKSada-FabHLを用いた形質転換株のFab(H&L)タンパク質バンドのN末端配列をプロテインシークエンサーPPSQ-21A(島津製作所製)を用いて決定したところ、目的の抗体アダリムマブのFab断片のH鎖のN末端配列とL鎖のN末端配列の両方の配列が含まれていた事から、培養上清中に抗体アダリムマブのFab(H&L)断片が分泌発現して会合体を形成している事が確認できた。このことから、トラスツズマブのFab(H&L)
断片を発現させた場合に限られず、アダリムマブのFab(H&L)断片を発現させた場合でも、ペニシリン結合タンパク質PBP1a欠損株を発現宿主として用いることで抗体Fab(H&L)断片の分泌量が向上することが明らかとなった。
(1)C. glutamicum ATCC13869ΔPBP1a株の構築
実施例1(1)で構築したペニシリン結合タンパク質PBP1aの遺伝子欠損用ベクターであるpBSΔCgl0278を用いて、C. glutamicum ATCC13869株を形質転換した。得られた形質転換体からWO2005/113744記載の方法に従って菌株の選択を行い、Cgl0278遺伝子が欠損したATCC13869ΔPBP1a株を得た。
実施例4(1)で構築した抗体トラスツズマブのFab(H&L)断片の分泌発現プラスミドpPKStrast-FabH(1-229C)+Lを用いて、ATCC13869株およびATCC13869ΔPBP1a株のそれぞれを形質転換した。得られた各形質転換体を、25 mg/lのカナマイシンを含むMM液体培地(グルコース 120 g、硫酸マグネシウム七水和物 3 g、硫酸アンモニウム 30 g、リン酸二水素カリウム 1.5 g、硫酸鉄七水和物 0.03 g、硫酸マンガン五水和物 0.03 g、チアミン塩酸塩 450 μg、ビオチン 450 μg、DL-メチオニン0.15 g、炭酸カルシウム 50 gを水で1LにしてpH7.0に調整)でそれぞれ30 ℃、96時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清を非還元SDS-PAGEに供してからSYPRO Orange(インビトロジェン社製)にて染色を行い、抗体トラスツズマブのFab(H&L)断片の分泌量の比較を行った。その結果、YDK010株を発現宿主として用いた場合とは異なり、ATCC13869株を発現宿主として用いた場合は、ペニシリン結合タンパク質PBP1a欠損株を用いても抗体トラスツズマブのFab(H&L)断片の分泌量は向上しなかった(図11、レーン3および5)。
ペニシリン結合タンパク質PBP1aの欠損によってタンパク質分泌量が向上したC. glutamicum YDK010株は、C. glutamicum AJ12036(FERM BP-734)の細胞表層タンパク質PS2(CspB)の欠損株である(WO2004/029254)。そこで、ATCC13869株におけるCspB欠損株と、CspBおよびPBP1aの二重欠損株を構築して、抗体トラスツズマブのFab(H&L)断片の分泌発現を行った。ATCC13869株のCspBをコードする遺伝子の塩基配列を<配列番号97>、ATCC13869株のCspBのアミノ酸配列を<配列番号98>に示した。
<配列番号99>および<配列番号100>に記載のDNAをプライマーとして用い、常法に従って(斉藤、三浦の方法[Biochim. Biophys. Acta, 72, 619(1963)])調製したC. glutamicum
YDK010株の染色体DNAを鋳型として、CspBをコードする遺伝子が欠損化された領域を含む約2.0kbpのDNA断片をPCR法によって増幅した。PCRにはPyrobest DNA polymerase(タカラバイオ社製)を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。このDNA断片を、WO2006/057450に記載のpBS5TのSma I部位に挿入することによって、cspB遺伝子欠損用のベクターpBS5T-ΔcspBを得た。
実施例4(1)で構築した抗体トラスツズマブのFab(H&L)断片の分泌発現プラスミドpPKStrast-FabH(1-229C)+Lを用いて、ATCC13869ΔCspB株およびATCC13869ΔCspBΔPBP1a株のそれぞれを形質転換した。得られた各形質転換体を、25 mg/lのカナマイシンを含むMM液体培地(グルコース 120 g、硫酸マグネシウム七水和物 3 g、硫酸アンモニウム 30 g、リン酸二水素カリウム 1.5 g、硫酸鉄七水和物 0.03 g、硫酸マンガン五水和物 0.03 g、チアミン塩酸塩 450 μg、ビオチン 450 μg、DL-メチオニン0.15 g、炭酸カルシウム 50 gを水で1LにしてpH7.0に調整)でそれぞれ30 ℃、96時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清を非還元SDS-PAGEに供してからSYPRO Orange(インビトロジェン社製)にて染色を行い、抗体トラスツズマブのFab(H&L)断片の分泌量の比較を行った。その結果、CspBもしくはPBP1aそれぞれの単独欠損株であるATCC13869ΔCspB株およびATCC13869ΔPBP1a株では、親株であるATCC13869株と比較して、抗体トラスツズマブのFab(H&L)断片の分泌量が向上しなかったが、二重欠損株であるATCC13869ΔCspBΔPBP1a株では有意に抗体トラスツズマブのFab(H&L)断片の分泌量が向上していた(図11)。このことから、細胞表層タンパク質CspBおよびペニシリン結合タンパク質PBP1aの二重欠損株を発現宿主として用いることによって、抗体Fab(H&L)断片の分泌量が向上することが明らかとなった。
配列番号1〜8:プライマー
配列番号9〜42:トラスツズマブのH鎖全合成用DNAの塩基配列
配列番号43、44:プライマー
配列番号45:トラスツズマブのH鎖遺伝子の塩基配列
配列番号46〜54:プライマー
配列番号55〜70:トラスツズマブのL鎖全合成用DNAの塩基配列
配列番号71、72:プライマー
配列番号73:トラスツズマブのL鎖遺伝子の塩基配列
配列番号74〜80:プライマー
配列番号81:C. glutamicum ATCC13032のCgl0278遺伝子の塩基配列
配列番号82:C. glutamicum ATCC13032のCgl0278遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列
配列番号83:C. glutamicum由来PS1のシグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号84:C. glutamicum由来PS2(CspB)のシグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号85:C. ammoniagenes (C. stationis)由来SlpA(CspA)のシグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号86:トラスツズマブのH鎖のアミノ酸配列
配列番号87:トラスツズマブのL鎖のアミノ酸配列
配列番号88:抗ジゴキシン単鎖抗体発現用全合成DNAの塩基配列
配列番号89:抗ジゴキシン単鎖抗体遺伝子の塩基配列
配列番号90:抗ジゴキシン単鎖抗体のアミノ酸配列
配列番号91、92:アダリムマブのFab(H&L)断片発現用全合成DNAの塩基配列
配列番号93:アダリムマブのH鎖遺伝子(1-230Cコード領域)の塩基配列
配列番号94:アダリムマブのH鎖(1-230C)のアミノ酸配列
配列番号95:アダリムマブのL鎖遺伝子の塩基配列
配列番号96:アダリムマブのL鎖のアミノ酸配列
配列番号97:C. glutamicum ATCC13869のcspB遺伝子の塩基配列
配列番号98:C. glutamicum ATCC13869のcspB遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列
配列番号99、100:プライマー
Claims (8)
- 異種タンパク質を分泌生産する能力を有するコリネ型細菌であって、
ペニシリン結合タンパク質をコードする遺伝子が破壊されることにより該ペニシリン結合タンパク質の活性が低下するように改変され、
細胞表層タンパク質をコードする遺伝子が破壊されることにより該細胞表層タンパク質の活性が低下するように改変されているか、あるいは、もともと前記細胞表層タンパク質を有しておらず、
前記ペニシリン結合タンパク質がPBP1aであり、
前記細胞表層タンパク質がCspBであり、且つ、
コリネバクテリウム属に属する細菌である、コリネ型細菌。 - 前記ペニシリン結合タンパク質が、下記(A)または(B)に示すタンパク質である、請求項1に記載のコリネ型細菌。
(A)配列番号82に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
(B)配列番号82に示すアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、コリネ型細菌で活性を低下させたときに異種タンパク質の分泌生産量を非改変株と比べて上昇させる性質を有するタンパク質。 - 前記細胞表層タンパク質が、下記(A)または(B)に示すタンパク質である、請求項1または2に記載のコリネ型細菌。
(A)配列番号98に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
(B)配列番号98に示すアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、コリネ型細菌で活性を低下させたときに異種タンパク質の分泌生産量を非改変株と比べて上昇させる性質を有するタンパク質。 - 前記コリネ型細菌が、コリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項1〜3のいずれか1項に記載のコリネ型細菌。
- 前記コリネ型細菌が異種タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物を有し、
前記遺伝子構築物が、コリネ型細菌で機能するプロモーター配列、該プロモーター配列の下流に接続されたコリネ型細菌で機能するシグナルペプチドをコードする核酸配列、および該シグナルペプチドをコードする核酸配列の下流に接続された前記異種タンパク質をコードする核酸配列を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載のコリネ型細菌。 - 前記異種タンパク質が抗体関連分子である、請求項1〜5のいずれか1項に記載のコリネ型細菌。
- 前記抗体関連分子が、Fab、F(ab’)2、Fc融合タンパク質、およびscFvから選ばれる1またはそれ以上のタンパク質である、請求項6に記載のコリネ型細菌。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載のコリネ型細菌を培養し、分泌生産された異種タンパク質を回収することを含む、異種タンパク質の製造方法。
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