JP6136930B2 - タンパク質の分泌生産法 - Google Patents

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本発明は、異種タンパク質を効率よく分泌生産するコリネ型細菌および異種タンパク質の分泌生産方法に関するものである。具体的には、本発明において分泌生産される異種タンパク質は多量体タンパク質（multimer protein）である。

微生物による異種タンパク質の分泌生産としては、これまでに、バチルス属細菌（非特許文献１）、メタノール資化性酵母Pichia pastoris（非特許文献２）、およびAspergillus属糸状菌（非特許文献３、４）等による異種タンパク質の分泌生産が報告されている。

また、コリネ型細菌により異種タンパク質を分泌生産する試みもなされている。コリネ型細菌による異種タンパク質の分泌生産については、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）（以後、C. glutamicumと略すことがある）によるヌクレアーゼ(nuclease)やリパーゼ（lipase）の分泌（特許文献１、非特許文献５）、サチライシン等のプロテアーゼの分泌（非特許文献６）、コリネ型細菌の細胞表層タンパク質PS1やPS2（CspBともいう）のシグナルペプチドを利用したタンパク質の分泌（特許文献２）、PS2（CspB）のシグナルペプチドを利用したフィブロネクチン結合タンパク質の分泌（非特許文献７）、コリネ型細菌の細胞表層タンパク質PS2（CspB）やSlpA（CspAともいう）のシグナルペプチドを利用したプロトランスグルタミナーゼの分泌（特許文献３）、変異型分泌装置を利用したタンパク質の分泌（特許文献４）、変異株によるプロトランスグルタミナーゼの分泌（特許文献５）、Tat系依存シグナルペプチドを利用したタンパク質の分泌（特許文献６）等の報告がある。

分泌生産されるタンパク質としては種々のものが想定されるが、コリネ型細菌による異種タンパク質の分泌生産において、複数のサブユニットからなる多量体タンパク質、例えば抗体関連分子の分泌生産については報告がない。

メタロペプチダーゼ（metallopeptidase）はプロテアーゼの一つで、活性化に亜鉛イオンやカルシウムイオン等の種々の金属イオンを要求し、種々のタンパク質を分解する活性を有する。メタロペプチダーゼの内、M23/M37ファミリーに属するメタロペプチダーゼ（M23/M37メタロペプチダーゼともいう）は、亜鉛イオンを要求するメタロエンドペプチダーゼである。C.glutamicumのCgl0858遺伝子は、配列情報から、M23/M37メタロペプチダーゼが有するモチーフと相同な領域を含むタンパク質をコードする遺伝子であることが分かっている。しかしながら、Cgl0858遺伝子にコードされるタンパク質のC. glutamicumにおける機能は未知である。また、いかなる生物種においても、このM23/M37メタロペプチダーゼが有するモチーフと相同な領域を含むタンパク質をコードする遺伝子の高発現によって目的とする異種タンパク質の生産量を向上させた知見は得られていない。

ペニシリン結合タンパク質(Penicillin-binding proteins；PBPs)とは、βラクタム系抗生物質と結合するタンパク質であって、その酵素機能がβラクタム系抗生物質との結合により阻害されるタンパク質の総称である。一般に、PBPsは、膜結合タンパク質で、真正細菌の細胞壁合成に必須であると考えられている。PBPsは、その分子量により、高分子量型（HMW-PBPs）と低分子量型（LMW-PBPs）とに分類される。このうち、HMW-PBPsについては、細胞壁を構成するペプチドグリカン部分への架橋を行うペプチド転移活性を有するtranspeptidase活性ドメインと二糖類から多糖鎖を形成する糖転移活性を有するtransglycosylase活性ドメインの両方を持つ高分子量のPBPsクラスA (class A HMW-PBPs)、およびtranspeptidase活性ドメインのみを持つ高分子量のPBPsクラスB (class B HMW-PBPs)に分類される。

C. glutamicumのPBPsに関する知見は、非特許文献８、９等に詳しい。C. glutamicumにおいては、これまで少なくとも9つのPBPsホモログが見いだされている。うち5つはHMW-PBPsで、その内訳は2つのclass A HMW-PBPs (PBP1a, PBP1b)と、3つのclass B HMW-PBPs (FtsI, PBP2a, PBP2b)である。C. glutamicumのclass A HMW-PBPsは細胞伸張に関わる因子、classB HMW-PBPsは細胞分裂の際の隔壁のペプチドグリカンの形成に関わる因子である事が知られている。

しかしながら、ペニシリン結合タンパク質と、異種タンパク質の分泌生産との関係は知られていない。

米国特許4965197 特表平6-502548 特許第4320769号 特開平11-169182 特許第4362651号 特許第4730302号

Microbiol. rev., 57, 109-137(1993) Biotechnol., 11, 905-910(1993) Biotechnol., 6, 1419-1422(1988) Biotechnol., 9, 976-981(1991) J. Bacteriol., 174, 1854-1861(1992) Appl. Environ. Microbiol., 61, 1610-1613(1995) Appl. Environ. Microbiol., 63, 4392-4400(1997) Mol. Microbiol., 66, 643-57(2007) Antonie Van Leeuwenhoek, 94, 99-109(2008)

本発明は、コリネ型細菌の多量体タンパク質分泌生産能を向上させる新規な技術を開発し、多量体タンパク質を分泌生産するコリネ型細菌、および同細菌による多量体タンパク質の分泌生産法を提供することを課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、コリネ型細菌を発現ホスト（expression host）として利用する異種タンパク質の生産法において、メタロペプチダーゼをコードする遺伝子の発現が上昇するようにコリネ型細菌を改変することによって多量体タンパク質の分泌生産能が向上することを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]多量体タンパク質を分泌生産する能力を有し、かつ、メタロペプチダーゼをコードする遺伝子の発現が上昇するように改変されたコリネ型細菌。
[２]前記遺伝子のコピー数を高めること、または、前記遺伝子の発現調節配列を改変することにより、前記遺伝子の発現が上昇した、前記コリネ型細菌。
[３]前記メタロペプチダーゼがM23/M37メタロペプチダーゼ、またはM23/M37メタロペプチダーゼが有するモチーフと相同な領域を含むタンパク質である、前記コリネ型細菌。
[４]前記メタロペプチダーゼが、下記（Ａ）または（Ｂ）に示すタンパク質である、前記コリネ型細菌。
（Ａ）配列番号４に示すアミノ酸を有するタンパク質、
（Ｂ）配列番号４に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、コリネ型細菌で発現を上昇させたときに多量体タンパク質の分泌生産量を非改変株と比べて上昇させる性質を有するタンパク質。
[５]さらに、ペニシリン結合タンパク質の活性が低下するように改変されている、前記コリネ型細菌。
[６]細胞表層タンパク質の活性が低下している、前記コリネ型細菌。
[７]前記コリネ型細菌が、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属する細菌である、前記コリネ型細菌。
[８]前記コリネ型細菌がコリネバクテリウム・グルタミカムである、前記コリネ型細菌。
[９]前記コリネ型細菌が多量体タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物を有し、
前記遺伝子構築物が、コリネ型細菌で機能するプロモーター配列、該プロモーター配列の下流に接続されたコリネ型細菌で機能するシグナルペプチドをコードする核酸配列、および該シグナルペプチドをコードする核酸配列の下流に接続された前記多量体タンパク質をコードする核酸配列を含む、前記コリネ型細菌。
[１０]前記多量体タンパク質が抗体関連分子である、前記コリネ型細菌。
[１１]前記抗体関連分子がＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）₂、およびＦｃ融合タンパク質から選ばれる１またはそれ以上のタンパク質である、前記コリネ型細菌。
[１２]前記多量体タンパク質が血管内皮細胞増殖因子−Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）である、前記コリネ型細菌。
[１３]前記コリネ型細菌を培養し、分泌生産された多量体タンパク質を回収することを含む、多量体タンパク質の製造方法。

図１は、C. glutamicum ATCC13032のCgl0858がコードするタンパク質とC. glutamicum ATCC13869のCgl0858ホモログがコードするタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す図である。 図２は、C. glutamicum YDK010株およびそのメタロペプチダーゼ発現増強株で、トラスツズマブのFab断片のH鎖領域とL鎖領域を共発現させた際の非還元SDS-PAGEの結果を示す写真である。 図３は、C. glutamicum YDK010株およびそのメタロペプチダーゼ発現増強株で、トラスツズマブのＦ（ａｂ’）₂断片を発現させた際のウェスタンブロッティングの結果を示す写真である。 図４は、C. glutamicum YDK010株およびそのメタロペプチダーゼ発現増強株、ならびにC. glutamicum YDK010ΔPBP1a株のメタロペプチダーゼ発現増強株で、トラスツズマブのFab断片のH鎖領域とL鎖領域を共発現させた際の非還元SDS-PAGEの結果を示す写真である。 図５は、C. glutamicum YDK010株およびそのメタロペプチダーゼ発現増強株で、血管内皮細胞増殖因子-A（VEGF-A）を発現させた際の非還元SDS-PAGEの結果を示す写真である。 図６は、C. glutamicum YDK010ΔPBP1a株およびそのメタロペプチダーゼ発現増強株で、アダリムマブのFab(H&L)断片を発現させた際の非還元SDS-PAGEの結果を示す写真である。 図７は、C. glutamicum ATCC13869株（野生株）およびそのメタロペプチダーゼ発現増強株で、トラスツズマブのFab(H&L)断片を発現させた際の非還元SDS-PAGEの結果を示す写真である。

＜１＞本発明のコリネ型細菌
本発明は、多量体タンパク質（multimer protein）を分泌生産する能力を有するコリネ型細菌であって、メタロペプチダーゼをコードする遺伝子の発現が上昇するように改変された、コリネ型細菌（以下、「本発明の細菌」または「本発明のコリネ型細菌」ともいう）を提供する。

本発明において、タンパク質が「分泌」されるとは、タンパク質が細菌菌体外（細胞外）に移送されることをいう。タンパク質が「分泌」されることには、最終的にそのタンパク質の全分子が培地中に完全に遊離状態におかれる場合はもちろん、そのタンパク質の全分子が菌体表層に存在している場合や、そのタンパク質の一部の分子が培地中に存在し、残りの分子が菌体表層に存在している場合も含まれる。

すなわち、本発明において、「多量体タンパク質を分泌生産する能力」とは、本発明の細菌を培地中で培養したときに、培地中または菌体表層に多量体タンパク質を分泌し、培地中または菌体表層から回収できる程度に蓄積する能力をいう。蓄積量は、例えば、培地中での蓄積量として、好ましくは10 μg/L以上、より好ましくは1 mg/L以上、特に好ましくは100 mg/L、さらに好ましくは1 g/L以上であってよい。また、蓄積量は、例えば、菌体表層での蓄積量として、菌体表層の多量体タンパク質を回収し培地と同量の液体に懸濁した場合に懸濁液中での多量体タンパク質濃度が好ましくは10 μg/L以上、より好ましくは1 mg/L以上、特に好ましくは100 mg/L以上となるような量であってよい。なお、本発明において分泌生産される「タンパク質」とは、ペプチドあるいはポリペプチドと呼ばれる態様をも含む概念である。

本発明において分泌生産される多量体タンパク質は、多量体の異種タンパク質である限り特に制限されない。本発明において、「異種タンパク質」（heterologous protein）とは、同タンパク質を発現および分泌させるコリネ型細菌にとって外来性（exogenous）であるタンパク質をいう。異種タンパク質は、例えば、微生物由来のタンパク質であってもよく、植物由来のタンパク質であってもよく、動物由来のタンパク質であってもよく、ウィルス由来のタンパク質であってもよく、さらには人工的にアミノ酸配列をデザインしたタンパク質であってもよい。多量体タンパク質とは、２またはそれ以上のサブユニットからなる多量体として存在しうるタンパク質をいう。多量体において、各サブユニットは、ジスルフィド結合等の共有結合で連結されていてもよく、水素結合や疎水性相互作用等の非共有結合で連結されていてもよく、それらの組み合わせにより連結されていてもよい。多量体においては、１またはそれ以上の分子間ジスルフィド結合が含まれるのが好ましい。多量体は、単一の種類のサブユニットからなるホモ多量体であってもよく、２またはそれ以上の種類のサブユニットからなるヘテロ多量体であってもよい。なお、多量体タンパク質がヘテロ多量体である場合には、多量体を構成するサブユニットの内、少なくとも１つのサブユニットが異種タンパク質であればよい。すなわち、全てのサブユニットが異種由来であってもよく、一部のサブユニットのみが異種由来であってもよい。多量体タンパク質は、天然で分泌性であるタンパク質であってもよく、天然では非分泌性であるタンパク質であってもよいが、天然で分泌性であるタンパク質であるのが好ましい。「多量体タンパク質」の具体例は後述する。

本発明において分泌生産される多量体タンパク質は、１種類のみであってもよく、２またはそれ以上の種類であってもよい。なお、多量体タンパク質がヘテロ多量体である場合には、ヘテロ多量体を構成する全てのサブユニットが分泌生産される。

本発明において、コリネ型細菌とは好気性のグラム陽性かん菌であり、コリネ型細菌としては、コリネバクテリウム属細菌、ブレビバクテリウム属細菌、およびミクロバクテリウム属細菌等が挙げられる。なお、コリネ型細菌には、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが、現在コリネバクテリウム属に統合された細菌（Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255(1991)）も含まれる。また、コリネ型細菌には、従来コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）に分類されていたが、16S rRNAの塩基配列解析等によりコリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）に再分類されたものも含まれる（Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 60, 874-879(2010)）。コリネ型細菌を使用することの利点としては、従来異種タンパク質の分泌生産に利用されている糸状菌、酵母、Bacillus属細菌等と比べ、もともと菌体外に分泌されるタンパク質が極めて少なく、異種タンパク質を分泌生産した場合の精製過程の簡略化や省略化が期待できること、また、糖、アンモニア、および無機塩等を含有するシンプルな培地で良く生育し、培地代や培養方法、培養生産性で優れていること、等が挙げられる。

コリネ型細菌としては、具体的には、下記のような種が挙げられる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Corynebacterium acetoacidophilum）
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（Corynebacterium acetoglutamicum）
コリネバクテリウム・アルカノリティカム（Corynebacterium alkanolyticum）
コリネバクテリウム・カルナエ（Corynebacterium callunae）
コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）
コリネバクテリウム・リリウム（Corynebacterium lilium）
コリネバクテリウム・メラセコーラ（Corynebacterium melassecola）
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（コリネバクテリウム・エフィシエンス）（Corynebacterium thermoaminogenes (Corynebacterium efficiens)）
コリネバクテリウム・ハーキュリス（Corynebacterium herculis）
ブレビバクテリウム・ディバリカタム（Brevibacterium divaricatum）
ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）
ブレビバクテリウム・イマリオフィラム（Brevibacterium immariophilum）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）（Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum)）
ブレビバクテリウム・ロゼウム（Brevibacterium roseum）
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Brevibacterium saccharolyticum）
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス（Brevibacterium thiogenitalis）
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテリウム・スタティオニス）（Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis)）
ブレビバクテリウム・アルバム（Brevibacterium album）
ブレビバクテリウム・セリナム（Brevibacterium cerinum）
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム（Microbacterium ammoniaphilum）

コリネ型細菌としては、具体的には、下記のような菌株が挙げられる。
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806
Corynebacterium alkanolyticum ATCC 21511
Corynebacterium callunae ATCC 15991
Corynebacterium glutamicum ATCC 13020, ATCC 13032, ATCC 13060，ATCC 13869，FERM BP-734
Corynebacterium lilium ATCC 15990
Corynebacterium melassecola ATCC 17965
Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340 (FERM BP-1539)
Corynebacterium herculis ATCC 13868
Brevibacterium divaricatum ATCC 14020
Brevibacterium flavum ATCC 13826, ATCC 14067, AJ12418(FERM BP-2205)
Brevibacterium immariophilum ATCC 14068
Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869
Brevibacterium roseum ATCC 13825
Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066
Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240
Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis) ATCC 6871, ATCC 6872
Brevibacterium album ATCC 15111
Brevibacterium cerinum ATCC 15112
Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354

これらの菌株は、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）より分譲を受けることができる。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることができる（http://www.atcc.org/参照）。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。

とりわけ、野生株コリネバクテリウム・グルタミカム（C. glutamicum）ATCC13869よりストレプトマイシン(Sm)耐性変異株として分離したコリネバクテリウム・グルタミカムAJ12036(FERM BP-734)は、その親株（野生株）に比べ、タンパク質の分泌に関わる機能遺伝子に変異が存在することが予測され、異種タンパク質の分泌生産能が至適培養条件下での蓄積量としておよそ２〜３倍と極めて高く、宿主菌として好適である。AJ12036は、昭和59年3月26日に工業技術院 生命工学工業技術研究所（現、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター、日本国茨城県つくば市東１−１−１ 中央第６、郵便番号305-8566）に国際寄託として原寄託され、受託番号FERM BP-734が付与されている。

また、上述したようなコリネ型細菌を親株として、突然変異法や遺伝子組換え法を利用してタンパク質の分泌生産能が高まった株を選抜し、宿主として利用してもよい。例えば、紫外線照射またはN-メチル-N'-ニトロソグアニジン等の化学変異剤による処理を行なった後、タンパク質の分泌生産能が高まった株を選抜することができる。

さらに、このような菌株から細胞表層タンパク質を生産しないように改変した菌株を宿主として使用すれば、培地中または菌体表層に分泌された異種タンパク質の精製が容易となり、特に好ましい。そのような改変は、突然変異法または遺伝子組換え法により染色体上の細胞表層タンパク質のコード領域またはその発現調節領域に変異を導入することにより行うことができる。細胞表層タンパク質を生産しないように改変されたコリネ型細菌としては、C. glutamicum AJ12036(FERM BP-734)の細胞表層タンパク質PS2（CspB）の欠損株であるC. glutamicum YDK010株（WO2004/029254）が挙げられる。

多量体タンパク質を分泌生産する能力を有するコリネ型細菌は、上述したようなコリネ型細菌に、多量体タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物（genetic construct）を導入し保持させることにより得ることができる。すなわち、本発明の細菌は、多量体タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物を有する。「多量体タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物」やその導入法については後述する。

本発明の細菌は、メタロペプチダーゼをコードする遺伝子の発現が上昇するように改変されている。本発明の細菌は、多量体タンパク質を分泌生産する能力を有するコリネ型細菌を、メタロペプチダーゼをコードする遺伝子の発現が上昇するように改変することによって得ることができる。また、本発明の細菌は、メタロペプチダーゼをコードする遺伝子の発現が上昇するようにコリネ型細菌を改変した後に、多量体タンパク質を分泌生産する能力を付与することによっても得ることができる。本発明において、本発明の細菌を構築するための改変は、任意の順番で行うことができる。なお、本発明の細菌は、メタロペプチダーゼをコードする遺伝子の発現が上昇するように改変される前から多量体タンパク質を分泌生産できた株から得られたものであってよい。また、本発明の細菌は、メタロペプチダーゼをコードする遺伝子の発現が上昇するように改変される前には多量体タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物を有していても多量体タンパク質を分泌生産することができなかった株から得られたものであって、メタロペプチダーゼをコードする遺伝子の発現が上昇するように改変されることにより多量体タンパク質を分泌生産できるようになったものであってもよい。

以下に、メタロペプチダーゼおよびそれをコードする遺伝子について説明する。

メタロペプチダーゼ（metallopeptidase）はプロテアーゼの一つで、活性化に亜鉛イオンやカルシウムイオン等の種々の金属イオンを要求し、種々のタンパク質を分解する活性を有する。本発明において、当該活性をメタロペプチダーゼ活性ともいう。本発明において発現が増強されるメタロペプチダーゼは特に限定されないが、M23/M37メタロペプチダーゼであるのが好ましい。M23/M37メタロペプチダーゼは、亜鉛イオンを要求するメタロエンドペプチダーゼである。M23/M37メタロペプチダーゼとして、具体的には、例えば、Staphylococcus capitis EPK1株のale-1遺伝子にコードされるタンパク質が挙げられる。

また、本発明において発現が増強されるメタロペプチダーゼは、上記のようなメタロペプチダーゼが有するモチーフと相同な領域を含むタンパク質であってもよい。例えば、本発明において発現が増強されるメタロペプチダーゼは、M23/M37メタロペプチダーゼが有するモチーフと相同な領域を含むタンパク質であるのが好ましい。M23/M37メタロペプチダーゼが有するモチーフと相同な領域を含むタンパク質として、具体的には、例えば、C. glutamicum ATCC13032のCgl0858遺伝子にコードされるタンパク質や、C.glutamicum ATCC13869のCgl0858ホモログ遺伝子にコードされるタンパク質が挙げられる。また、M23/M37メタロペプチダーゼが有するモチーフと相同な領域を含むタンパク質として、具体的には、例えば、Escherichia coli (E. coli) K12 MG1655株のnlpD遺伝子にコードされるタンパク質が挙げられる。

本発明において発現が増強されるメタロペプチダーゼは、コリネ型細菌で発現を上昇させたときに多量体タンパク質の分泌生産量を非改変株と比べて上昇させる性質を有する。なお、本発明において発現が増強されるメタロペプチダーゼは、メタロペプチダーゼ活性を有していてもよく、有していなくともよい。

「コリネ型細菌で発現を上昇させたときに多量体タンパク質の分泌生産量を非改変株と比べて上昇させる性質」とは、コリネ型細菌で発現を上昇させたときに非改変株、例えば野生株または親株よりも多い量の多量体タンパク質を分泌生産する能力を付与する性質をいう。非改変株よりも多い量の多量体タンパク質を分泌生産するとは、多量体タンパク質の分泌生産量が非改変株と比較して増大する限り特に制限されないが、例えば、培地中および／または菌体表層での蓄積量として、非改変株と比較して好ましくは10 %以上、より好ましくは20 %以上、特に好ましくは30 %以上、さらに好ましくは100 %以上多い量の多量体タンパク質を分泌生産することであってよい。また、非改変株よりも多い量の多量体タンパク質を分泌生産するとは、濃縮していない非改変株の培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供しＣＢＢで染色した際には多量体タンパク質を検出できないが、濃縮していない改変株の培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供しＣＢＢで染色した際には多量体タンパク質を検出できることであってもよい。

コリネ型細菌で発現を上昇させたときに多量体タンパク質の分泌生産量を非改変株と比べて上昇させる性質を有するかどうかは、コリネ型細菌に属する菌株を基にその遺伝子の発現が上昇するよう改変された株を作製し、該改変株を培地で培養した際に分泌生産される多量体タンパク質の量を定量し、改変前の株（非改変株）を培地で培養した際に分泌生産される多量体タンパク質の量と比較することで確認することができる。ここでいう非改変株としては、例えば、多量体タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物を有するコリネ型細菌を用いることができる。非改変株として、具体的には、例えば、C. glutamicum AJ12036(FERM BP-734)またはC. glutamicum YDK010株に多量体タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物を導入した株を用いることができる。

また、本発明において、メタロペプチダーゼが有する「コリネ型細菌で発現を上昇させたときに多量体タンパク質の分泌生産量を非改変株と比べて上昇させる性質」とは、具体的には、メタロペプチダーゼ活性であってもよい。

メタロペプチダーゼ活性を有するかどうかは、同活性を測定することにより確認できる。メタロペプチダーゼ活性は、当業者に良く知られた方法で測定することができる。メタロペプチダーゼ活性は、具体的には、例えば、メタロプロテアーゼアッセイキット（Oxford Biomedical Research社製）等によって測定することができる。

Staphylococcus capitis (S. capitis) EPK1株のale-1遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースにGenBank accession BAA13069 (VERSION BAA13069.1 GI:1890068)として登録されている。

C. glutamicum ATCC13032のCgl0858遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースにGenBank accession BA000036 (VERSION BA000036.3 GI:42602314)として登録されているゲノム配列中、916,967〜917,680位の配列の相補配列に相当する。C. glutamicum ATCC13032のCgl0858遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号９８に示す。また、C.glutamicum ATCC13869のCgl0858ホモログ遺伝子の塩基配列および同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３および４に示す。

Escherichia coli (E. coli) K12 MG1655株のnlpD遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースにGenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、2,865,636〜2,866,775位の配列の相補配列に相当する。E. coli K12 MG1655株のnlpD遺伝子は、ECK2737、JW2712と同義である。

細菌が属する属、種、又は菌株によって、メタロペプチダーゼをコードする遺伝子の塩基配列に差異が存在することがあるため、メタロペプチダーゼをコードする遺伝子は、コリネ型細菌で発現を上昇させたときに多量体タンパク質の分泌生産量を非改変株と比べて上昇させる性質を有するタンパク質をコードする限り、上記塩基配列のバリアントであってもよい。なお、Cgl0858遺伝子、nlpD遺伝子、またはale-1遺伝子のバリアントには、同遺伝子のホモログが含まれる。Cgl0858遺伝子、nlpD遺伝子、またはale-1遺伝子のホモログは、上記のC.glutamicumの野生型Cgl0858遺伝子、E. coliの野生型nlpD遺伝子、またはS. capitisの野生型ale-1遺伝子を問い合わせ配列として用いたBLAST検索やFASTA検索によって公開データベースから容易に取得することができ、また、腸内細菌科に属する細菌やコリネ型細菌等の微生物の染色体を鋳型にして、これら公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲにより取得することができる。

メタロペプチダーゼをコードする遺伝子は、コリネ型細菌で発現を上昇させたときに多量体タンパク質の分泌生産量を非改変株と比べて上昇させる性質を有するタンパク質をコードする限りにおいて、上記アミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であっても良い。この場合、コリネ型細菌で発現を上昇させたときに多量体タンパク質の分泌生産量を非改変株と比べて上昇させる性質は、１又は数個の置換、欠失、挿入又は付加される前のタンパク質に対して、通常７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上が維持される。なお上記「１又は数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、具体的には好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個を意味する。

上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加は、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、遺伝子が由来する細菌の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。

さらに、上記のような保存的変異を有する遺伝子は、コードされるアミノ酸配列全体に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有し、かつ、コリネ型細菌で発現を上昇させたときに多量体タンパク質の分泌生産量を非改変株と比べて上昇させる性質を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。尚、本明細書において、「相同性」（homology）は、「同一性」（identity）を指すことがある。

また、メタロペプチダーゼをコードする遺伝子は、公知の遺伝子配列から調製され得るプローブ、例えば上記塩基配列の全体または一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、コリネ型細菌で発現を上昇させたときに多量体タンパク質の分泌生産量を非改変株と比べて上昇させる性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、好ましくは６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、より好ましくは、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳに相当する塩濃度および温度で、１回、好ましくは２〜３回洗浄する条件を挙げることができる。

上述の通り、上記ハイブリダイゼーションに用いるプローブは、遺伝子の相補配列の一部であってもよい。そのようなプローブは、公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、これらの塩基配列を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。例えば、プローブとして、300 bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件としては、50℃、2×SSC、0.1% SDSが挙げられる。

また、メタロペプチダーゼをコードする遺伝子は、天然型のままでも使用できるが、任意のコドンをそれと等価のコドンに置換したものであってもよい。例えば、メタロペプチダーゼをコードする遺伝子は、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変してもよい。

なお、上記の遺伝子やタンパク質のバリアントに関する記載は、細胞表層タンパク質、ペニシリン結合タンパク質、および本発明において分泌生産される多量体タンパク質等の任意のタンパク質、およびそれらをコードする遺伝子にも準用できる。

以下に、遺伝子の発現を上昇させる手法について説明する。

本発明において、「遺伝子の発現が上昇する」とは、標的の遺伝子の発現が野生株又は親株等の非改変株に対して上昇していることを意味する。遺伝子の発現は、非改変株と比較して上昇していれば特に制限されないが、非改変株と比較して好ましくは１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは３倍以上に上昇する。また、「遺伝子の発現が上昇する」とは、もともと標的の遺伝子が発現している菌株において同遺伝子の発現量を上昇させることだけでなく、もともと標的の遺伝子が発現していない菌株において、同遺伝子を発現させることを含む。すなわち、「遺伝子の発現が上昇する」とは、例えば、標的の遺伝子を保持しない菌株に同遺伝子を導入し、同遺伝子を発現させることを含む。

遺伝子の発現の上昇は、例えば、遺伝子のコピー数を増加させることにより達成できる。

遺伝子のコピー数の増加は、宿主微生物への染色体上へ標的の遺伝子を導入することにより達成できる。染色体への遺伝子の導入は、トランスポゾンやMini-Muを用いて染色体上にランダムに導入する方法（特開平2-109985号公報、US5,882,888 EP805867B1）や、染色体DNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えを行うことにより達成できる。染色体DNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA（repetitive DNA）、トランスポゾンの両端に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、Redドリブンインテグレーション法(WO2005/010175)を使用することにより、遺伝子を染色体上に導入することも可能である。また、ファージを用いたtransductionや、接合伝達ベクターにより、遺伝子を染色体上に導入することも可能である。また、WO03/040373に記載されているように、染色体上の異種タンパク質の分泌生産に不要な遺伝子を標的にして遺伝子を導入することも可能である。このような方法で標的配列に、遺伝子を１コピー又は多コピー導入することができる。

染色体上に標的遺伝子が導入されたことの確認は、同遺伝子の全部又は一部と相補的な配列を持つプローブを用いたサザンハイブリダイゼーション、又は同遺伝子の配列に基づいて作成したプライマーを用いたPCR等によって確認できる。

また、遺伝子のコピー数の増加は、標的遺伝子を含むベクターを宿主細菌に導入することによっても達成できる。例えば、標的遺伝子を含むＤＮＡ断片を、宿主細菌で機能するベクターと連結して同遺伝子の発現ベクターを構築し、当該発現ベクターで宿主細菌を形質転換することにより、同遺伝子のコピー数を増加させることができる。ベクターとしては、宿主細菌の細胞内において自律複製可能なベクターを用いることができる。ベクターは、マルチコピーベクターであるのが好ましい。また、形質転換体を選択するために、ベクターは抗生物質耐性遺伝子などのマーカーを有することが好ましい。ベクターは、例えば、細菌プラスミド由来のベクター、酵母プラスミド由来のベクター、バクテリオファージ由来のベクター、コスミド、またはファージミド等であってよい。コリネ型細菌で自律複製可能なベクターとして、具体的には、pHM1519(Agric, Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984))；pAM330（Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984)）；これらを改良した薬剤耐性遺伝子を有するプラスミド；特開平3-210184号公報に記載のプラスミドpCRY30；特開平2-72876号公報及び米国特許5,185,262号明細書公報に記載のプラスミドpCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE及びpCRY3KX；特開平1-191686号公報に記載のプラスミドpCRY2およびpCRY3；特開昭58-67679号公報に記載のpAM330；特開昭58-77895号公報に記載のpHM1519；特開昭58-192900号公報に記載のpAJ655、pAJ611及びpAJ1844；特開昭57-134500号公報に記載のpCG1；特開昭58-35197号公報に記載のpCG2；特開昭57-183799号公報に記載のpCG4およびpCG11；特開平10-215883号公報に記載のpVK7、特開平9-070291号公報に記載のpVC7等が挙げられる。

また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の転写効率を向上させることにより達成できる。遺伝子の転写効率の向上は、例えば、染色体上の遺伝子のプロモーターをより強力なプロモーターに置換することにより達成できる。「より強力なプロモーター」とは、遺伝子の転写が、もともと存在している野生型のプロモーターよりも向上するプロモーターを意味する。より強力なプロモーターとしては、例えば、公知の高発現プロモーターであるＴ７プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、およびＰＬプロモーター等を用いることができる。また、より強力なプロモーターとしては、各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターの高活性型のものを取得してもよい。例えば、プロモーター領域内の−３５、−１０領域をコンセンサス配列に近づけることにより、プロモーターの活性を高めることができる（国際公開第００／１８９３５号）。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)）等に記載されている。

また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の翻訳効率を向上させることにより達成できる。遺伝子の翻訳効率の向上は、例えば、染色体上の遺伝子のシャインダルガノ（ＳＤ）配列（リボソーム結合部位（ＲＢＳ）ともいう）をより強力なＳＤ配列に置換することにより達成できる。「より強力なＳＤ配列」とは、ｍＲＮＡの翻訳が、もともと存在している野生型のＳＤ配列よりも向上するＳＤ配列を意味する。より強力なＳＤ配列としては、例えば、ファージＴ７由来の遺伝子１０のＲＢＳが挙げられる(Olins P. O. et al, Gene, 1988, 73, 227-235)。さらに、ＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域、特に開始コドンのすぐ上流の配列(5'-UTR)における数個のヌクレオチドの置換、あるいは挿入、あるいは欠失がｍＲＮＡの安定性および翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することによっても遺伝子の翻訳効率を向上させることができる。

本発明においては、プロモーター、ＳＤ配列、およびＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域等の遺伝子の発現に影響する部位を総称して「発現調節領域」ともいう。発現調節領域は、プロモーター検索ベクターやＧＥＮＥＴＹＸ等の遺伝子解析ソフトを用いて決定することができる。これら発現調節領域の改変は、例えば、温度感受性ベクターを用いた方法や、Ｒｅｄドリブンインテグレーション法（WO2005/010175）により行うことができる。

また、遺伝子の発現の上昇は、標的遺伝子の発現を上昇させるようなレギュレーターを増幅すること、または、標的遺伝子の発現を低下させるようなレギュレーターを欠失または弱化させることによっても達成できる。

上記のような遺伝子の発現を上昇させる手法は、単独で用いてもよく、任意の組み合わせで用いてもよい。

形質転換の方法は特に限定されず、従来知られた方法を用いることができる。例えば、エシェリヒア・コリ K-12について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してDNAの透過性を増す方法（Mandel, M. and Higa, A.,J. Mol. Biol. 1970, 53, 159-162）や、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してDNAを導入する方法（Duncan, C. H., Wilson, G. A. and Young, F. E.., 1997. Gene 1: 153-167）を用いることができる。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類、及び酵母について知られているような、DNA受容菌の細胞を、組換えDNAを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えDNAをDNA受容菌に導入する方法（Chang, S.and Choen, S.N., 1979.Mol. Gen. Genet. 168: 111-115; Bibb, M. J., Ward, J. M. and Hopwood, O. A. 1978.Nature 274: 398-400; Hinnen, A., Hicks, J. B. and Fink, G. R. 1978. Proc. Natl.Acad. Sci. USA 75: 1929-1933）も応用できる。また、電気パルス法（特開平2-207791号公報）によっても、コリネ型細菌の形質転換を行うことができる。

標的の遺伝子の発現が上昇したことは、例えば、同遺伝子から発現する標的のタンパク質の活性が上昇したことを確認することにより確認できる。標的のタンパク質の活性が上昇したことは、同タンパク質の活性を測定することにより確認できる。タンパク質の活性は、非改変株と比較して、例えば、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇しているのが好ましい。メタロペプチダーゼ活性は、当業者に良く知られた方法で測定することができるが、具体的には、例えば、メタロプロテアーゼアッセイキット（Oxford Biomedical Research社製）等によって測定することができる。

また、標的の遺伝子の発現が上昇したことは、例えば、同遺伝子の転写量が上昇したことを確認することや、同遺伝子から発現する標的のタンパク質の量が上昇したことを確認することにより確認できる。

標的の遺伝子の転写量が上昇したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を野生株または親株等の非改変株と比較することによって行うことができる。mRNAの量を評価する方法としてはノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCR等が挙げられる(Sambrook, J., et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual/Third Edition, Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001）。mRNAの量は、非改変株と比較して、例えば、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇しているのが好ましい。

標的のタンパク質の量が上昇したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことができる（Molecular cloning(Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001)）。タンパク質の量は、非改変株と比較して、例えば、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇しているのが好ましい。

本発明の細菌は、さらに、異種タンパク質の分泌生産能を向上させる特徴を有していてもよい。例えば、本発明の細菌は、ペニシリン結合タンパク質の活性が低下するように改変されていてよい。また、例えば、本発明の細菌は、細胞表層タンパク質の活性が低下しているものであってよい。

以下に、ペニシリン結合タンパク質およびそれをコードする遺伝子について説明する。

ペニシリン結合タンパク質(Penicillin-binding proteins；PBPs)とは、一般的に、βラクタム系抗生物質と結合するタンパク質であって、その酵素機能がβラクタム系抗生物質との結合により阻害されるものをいう。ペニシリン結合タンパク質としては、高分子量のPBPs（HMW-PBPs）や低分子量のPBPs（LMW-PBPs）が挙げられる。高分子量のPBPsとしては、クラスAの高分子量PBPs（class A HMW-PBPs）やクラスBの高分子量PBPs（class B HMW-PBPs）が挙げられる。class A HMW-PBPsは、細胞壁を構成するペプチドグリカン部分への架橋を行うペプチド転移活性を有するtranspeptidase活性ドメインと二糖類から多糖鎖を形成する糖転移活性を有するtransglycosylase活性ドメインの両方を有する。class B HMW-PBPsは、transpeptidase活性ドメインを有する。例えば、C. glutamicumにおいては、class A HMW-PBPsとしては、PBP1aやPBP1bが挙げられる。C. glutamicumにおいては、class B HMW-PBPsとしては、FtsI、PBP2a、およびPBP2bが挙げられる。

本発明においてペニシリン結合タンパク質の活性を低下させる場合には、ペニシリン結合タンパク質であって、コリネ型細菌で活性を低下させたときに異種タンパク質の分泌生産量を非改変株と比べて上昇させる性質を有するタンパク質の活性を低下させる。そのようなペニシリン結合タンパク質としては、例えば、PBP1a、class B HMW-PBPs、およびLMW-PBPsから選択されるものが好ましく、PBP1aおよびclass B HMW-PBPsから選択されるものがより好ましく、PBP1aが特に好ましい。

「コリネ型細菌で活性を低下させたときに異種タンパク質の分泌生産量を非改変株と比べて上昇させる性質」とは、コリネ型細菌で活性を低下させたときに非改変株、例えば野生株または親株よりも多い量の異種タンパク質を分泌生産する能力をコリネ型細菌に付与する性質をいう。非改変株よりも多い量の異種タンパク質を分泌生産するとは、異種タンパク質の分泌生産量が非改変株と比較して増大する限り特に制限されないが、例えば、培地中および／または菌体表層での蓄積量として、非改変株と比較して好ましくは10 %以上、より好ましくは20 %以上、特に好ましくは30 %以上、さらに好ましくは100 %以上多い量の異種タンパク質を分泌生産することであってよい。また、非改変株よりも多い量の異種タンパク質を分泌生産するとは、濃縮していない非改変株の培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供しＣＢＢで染色した際には異種タンパク質を検出できないが、濃縮していない改変株の培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供しＣＢＢで染色した際には異種タンパク質を検出できることであってもよい。

コリネ型細菌で活性を低下させたときに異種タンパク質の分泌生産量を非改変株と比べて上昇させる性質を有するかどうかは、コリネ型細菌に属する菌株を基にそのタンパク質の活性が低下するよう改変された株を作製し、該改変株を培地で培養した際に分泌生産される異種タンパク質の量を定量し、改変前の株（非改変株）を培地で培養した際に分泌生産される異種タンパク質の量と比較することで確認することができる。

C.glutamicum ATCC 13032のPBP1aタンパク質をコードするCgl0278遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースにGenBank accession BA000036 (VERSION BA000036.3 GI:42602314)として登録されているゲノム配列中、294001〜296388位の配列の相補配列に相当する。また、C.glutamicum ATCC 13032のPBP1aタンパク質は、GenBank accession NP_599531 (version NP_599531.1 GI:19551529、locus_tag="NCgl0274")として登録されている。C.glutamicum ATCC 13032のCgl0278遺伝子の塩基配列および同遺伝子がコードするPBP1aタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号９９および１００に示す。

コリネ型細菌が属する種又は菌株によって、ペニシリン結合タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列に差異が存在することがあるため、ペニシリン結合タンパク質をコードする遺伝子は、コリネ型細菌で活性を低下させたときに異種タンパク質の分泌生産量を非改変株と比べて上昇させる性質を有するタンパク質をコードする限り、上記塩基配列のバリアントであってもよい。例えば、ペニシリン結合タンパク質をコードする遺伝子は、コリネ型細菌で活性を低下させたときに異種タンパク質の分泌生産量を非改変株と比べて上昇させる性質を有するタンパク質をコードする限りにおいて、上記アミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。ペニシリン結合タンパク質およびそれをコードする遺伝子のバリアントについては、上述したメタロペプチダーゼおよびそれをコードする遺伝子のバリアントに関する記載を準用できる。

以下に、細胞表層タンパク質およびそれをコードする遺伝子について説明する。

細胞表層タンパク質は、細菌や古細菌の細胞表層（Ｓ層）を構成するタンパク質である。コリネ型細菌の細胞表層タンパク質としては、C. glutamicumのPS1およびPS2（CspBともいう）、ならびにC. stationisのSlpA（CspAともいう）が挙げられる。これらの中では、PS2タンパク質の活性を低下させるのが好ましい。

C. glutamicum ATCC13869のcspB遺伝子の塩基配列および同遺伝子がコードするPS2タンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１１４および１１５に示す。

また、例えば、28株のC. glutamicumについて、CspBホモログのアミノ酸配列が報告されている（J Biotechnol., 112, 177-193(2004)）。これら28株のC. glutamicumとcspB遺伝子ホモログのＮＣＢＩデータベースのGenBank accessionナンバーを以下に例示する（カッコ内がGenBank accessionナンバーを示す）。
C. glutamicum ATCC13058（AY524990）
C. glutamicum ATCC13744（AY524991）
C. glutamicum ATCC13745（AY524992）
C. glutamicum ATCC14017（AY524993）
C. glutamicum ATCC14020（AY525009）
C. glutamicum ATCC14067（AY524994）
C. glutamicum ATCC14068（AY525010）
C. glutamicum ATCC14747（AY525011）
C. glutamicum ATCC14751（AY524995）
C. glutamicum ATCC14752（AY524996）
C. glutamicum ATCC14915（AY524997）
C. glutamicum ATCC15243（AY524998）
C. glutamicum ATCC15354（AY524999）
C. glutamicum ATCC17965（AY525000）
C. glutamicum ATCC17966（AY525001）
C. glutamicum ATCC19223（AY525002）
C. glutamicum ATCC19240（AY525012）
C. glutamicum ATCC21341（AY525003）
C. glutamicum ATCC21645（AY525004）
C. glutamicum ATCC31808（AY525013）
C. glutamicum ATCC31830（AY525007）
C. glutamicum ATCC31832（AY525008）
C. glutamicum LP-6（AY525014）
C. glutamicum DSM20137（AY525015）
C. glutamicum DSM20598（AY525016）
C. glutamicum DSM46307（AY525017）
C. glutamicum 22220（AY525005）
C. glutamicum 22243（AY525006）

コリネ型細菌が属する種又は菌株によって、細胞表層タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列に差異が存在することがあるため、細胞表層タンパク質をコードする遺伝子は、コリネ型細菌で活性を低下させたときに異種タンパク質の分泌生産量を非改変株と比べて上昇させる性質を有するタンパク質をコードする限り、上記塩基配列のバリアントであってもよい。例えば、細胞表層タンパク質をコードする遺伝子は、コリネ型細菌で活性を低下させたときに異種タンパク質の分泌生産量を非改変株と比べて上昇させる性質を有するタンパク質をコードする限りにおいて、上記アミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。細胞表層タンパク質およびそれをコードする遺伝子のバリアントについては、上記メタロペプチダーゼおよびそれをコードする遺伝子のバリアントに関する記載を準用できる。

本発明において、「細胞表層タンパク質の活性が低下している」ことには、細胞表層タンパク質の活性が低下するようにコリネ型細菌が改変された場合、および、コリネ型細菌においてもともと細胞表層タンパク質の活性が低下している場合が含まれる。「コリネ型細菌においてもともと細胞表層タンパク質の活性が低下している場合」には、コリネ型細菌がもともと細胞表層タンパク質を有さない場合が含まれる。すなわち、細胞表層タンパク質の活性が低下しているコリネ型細菌としては、例えば、もともと細胞表層タンパク質を有さないコリネ型細菌が挙げられる。「コリネ型細菌がもともと細胞表層タンパク質を有さない場合」としては、例えば、コリネ型細菌がもともと細胞表層タンパク質をコードする遺伝子を有さない場合が挙げられる。なお、「コリネ型細菌がもともと細胞表層タンパク質を有さない」とは、コリネ型細菌が、当該コリネ型細菌が属する種の他の株に見出される細胞表層タンパク質から選択される１またはそれ以上のタンパク質をもともと有さないことであってよい。例えば、「C. glutamicumがもともと細胞表層タンパク質を有さない」とは、C. glutamicum株が、他のC. glutamicum株に見出される細胞表層タンパク質から選択される１またはそれ以上のタンパク質、すなわち、例えばPS1および／またはPS2（CspB）、をもともと有さないことであってよい。もともと細胞表層タンパク質を有さないコリネ型細菌としては、例えば、もともとcspB遺伝子を有さないC. glutamicum ATCC 13032が挙げられる。

以下に、タンパク質の活性を低下させる手法について説明する。

「タンパク質の活性が低下する」とは、標的のタンパク質の活性が野性株や親株等の非改変株と比較して減少していることを意味し、活性が完全に消失している場合を含む。「タンパク質の活性が低下する」とは、具体的には、非改変株と比較して、同タンパク質の細胞当たりの分子数が低下していること、および／または、同タンパク質の分子当たりの機能が低下していることをいう。すなわち、「タンパク質の活性が低下する」という場合の「活性」とは、タンパク質の触媒活性に限られず、タンパク質をコードする遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）またはタンパク質の量を意味してもよい。なお、「タンパク質の細胞当たりの分子数が低下している」ことには、同タンパク質が全く存在していない場合が含まれる。また、「タンパク質の分子当たりの機能が低下している」ことには、同タンパク質の分子当たりの機能が完全に消失している場合が含まれる。

タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子の発現を低下させることにより達成される。なお、「遺伝子の発現が低下する」ことを、「遺伝子の発現が弱化される」ともいう。遺伝子の発現の低下は、例えば、転写効率の低下によるものであってもよく、翻訳効率の低下によるものであってもよく、それらの組み合わせによるものであってもよい。遺伝子の発現の低下は、例えば、遺伝子のプロモーターやシャインダルガノ（ＳＤ）配列等の発現調節配列を改変することにより達成できる。発現調節配列を改変する場合には、発現調節配列は、好ましくは１塩基以上、より好ましくは２塩基以上、特に好ましくは３塩基以上が改変される。また、発現調節配列の一部または全部を欠失させてもよい。また、遺伝子の発現の低下は、例えば、発現制御に関わる因子を操作することによっても達成できる。発現制御に関わる因子としては、転写や翻訳制御に関わる低分子（誘導物質、阻害物質など）、タンパク質（転写因子など）、核酸（siRNAなど）等が挙げられる。

また、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子を破壊することにより達成できる。遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域の一部又は全部を欠損させることにより達成できる。さらには、染色体上の遺伝子の前後の配列を含めて、遺伝子全体を欠失させてもよい。タンパク質の活性の低下が達成できる限り、欠失させる領域は、Ｎ末端領域、内部領域、Ｃ末端領域等のいずれの領域であってもよい。通常、欠失させる領域は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、欠失させる領域の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。

また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、終止コドンを導入すること（ナンセンス変異）、あるいは１〜２塩基を付加または欠失するフレームシフト変異を導入すること等によっても達成できる（Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617（1997） Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95 5511-5515(1998), Journal of Biological Chemistry 26 116, 20833-20839(1991)）。

また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域に他の配列を挿入することによっても達成できる。挿入部位は遺伝子のいずれの領域であってもよいが、挿入する配列は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、挿入部位の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。他の配列としては、コードされるタンパク質の活性を低下又は消失させるものであれば特に制限されないが、例えば、抗生物質耐性遺伝子等のマーカー遺伝子や異種タンパク質生産に有用な遺伝子が挙げられる。

染色体上の遺伝子を上記のように改変することは、例えば、遺伝子の部分配列を欠失し、正常に機能するタンパク質を産生しないように改変した欠失型遺伝子を作製し、該欠失型遺伝子を含む組換えＤＮＡで細菌を形質転換して、欠失型遺伝子と染色体上の遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の遺伝子を欠失型遺伝子に置換することによって達成できる。その際、組換えＤＮＡには、宿主の栄養要求性等の形質にしたがって、マーカー遺伝子を含ませておくと操作がしやすい。欠失型遺伝子によってコードされるタンパク質は、生成したとしても、野生型タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失する。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は既に確立しており、「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組み合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法などがある（米国特許第6303383号、特開平05-007491号）。

また、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、突然変異処理により行ってもよい。突然変異処理としては、Ｘ線もしくは紫外線の照射、またはＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、メチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤による通常の変異処理が挙げられる。

標的のタンパク質の活性が低下したことは、同タンパク質の活性を測定することで確認できる。ペニシリン結合タンパク質の場合は、例えば、同タンパク質が属するクラスに応じて、transpeptidase活性および／またはtransglycosylase活性を測定することにより、同タンパク質の活性が低下したかどうかを確認できる。transpeptidase活性および／またはtransglycosylase活性は、例えば、当業者に良く知られた方法で測定することができる。具体的には、例えば、PBP1aのtranspeptidaseおよびtransglycosylase活性は、lipid IIを多糖鎖（glycan strand）に重合しペプチド架橋を生成する反応を測定することにより測定することができる（Born P, et al., J Biol Chem. 2006 Sep 15; 281(37): 26985-93.）。タンパク質の活性は、具体的には、例えば、非改変株と比較して、５０％以下、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下、さらに好ましくは５％以下、特に好ましくは０％に低下する。

標的の遺伝子の発現が低下したことは、同遺伝子の転写量が低下したことを確認することや、同遺伝子から発現する標的のタンパク質の量が低下したことを確認することにより確認できる。

標的の遺伝子の転写量が低下したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を非改変株と比較することによって行うことが出来る。mRNAの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT−PCR等が挙げられる（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。mRNAの量は、非改変株と比較して、例えば、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下しているのが好ましい。

標的のタンパク質の量が低下したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことが出来る（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。タンパク質の量は、非改変株と比較して、例えば、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下しているのが好ましい。

標的の遺伝子が破壊されたことは、破壊に用いた手段に応じて、同遺伝子の一部または全部の塩基配列、制限酵素地図、または全長等を決定することで確認できる。

なお、上記のようなタンパク質の活性を低下させる手法は、ペニシリン結合タンパク質および細胞表層タンパク質の活性低下に加えて、任意のタンパク質、およびそれらをコードする遺伝子にも準用できる。

以下に、「多量体タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物」やその導入法について説明する。なお、同遺伝子構築物を「本発明に用いられる遺伝子構築物」ともいう。

分泌性タンパク質（secretory protein）は、一般に、プレタンパク質（プレペプチドともいう）またはプレプロタンパク質（プレプロペプチドともいう）として翻訳され、その後、プロセッシングにより成熟タンパク質（mature protein）になることが知られている。具体的には、分泌性タンパク質は、一般に、プレタンパク質またはプレプロタンパク質として翻訳された後、プレ部分であるシグナルペプチドがプロテアーゼ（一般にシグナルペプチダーゼと呼ばれる）によって切断されて成熟タンパク質またはプロタンパク質に変換され、プロタンパク質はプロテアーゼによってさらにプロ部分が切断されて成熟タンパク質になる。よって、本発明の方法においては、多量体タンパク質の分泌生産にシグナルペプチドを利用するのが好ましい。なお、本発明において、分泌型タンパク質のプレタンパク質およびプレプロタンパク質を総称して「分泌型タンパク質前駆体」という場合がある。本発明において、「シグナルペプチド」（「シグナル配列」ともいう）とは、分泌性タンパク質前駆体のN末端に存在し、かつ、通常、天然の成熟タンパク質には存在しないアミノ酸配列をいう。

本発明に用いられる遺伝子構築物は、多量体タンパク質の分泌発現が達成できる限り特に制限されないが、好ましくは、コリネ型細菌で機能するプロモーター配列、同プロモーター配列の下流に接続されたコリネ型細菌で機能するシグナルペプチドをコードする核酸配列、および同シグナルペプチドをコードする核酸配列の下流に接続された多量体タンパク質をコードする核酸配列を含む。シグナルペプチドをコードする核酸配列は、プロモーター配列の下流に、同プロモーターによる制御を受けてシグナルペプチドが発現するよう連結されていればよい。多量体タンパク質をコードする核酸配列は、シグナルペプチドをコードする核酸配列の下流に、同シグナルペプチドとの融合タンパク質として多量体タンパク質が発現するよう連結されていればよい。また、本発明に用いられる遺伝子構築物は、コリネ型細菌で多量体タンパク質遺伝子を発現させるために有効な制御配列（オペレーターやターミネーター等）を、それらが機能し得るように適切な位置に有していてもよい。

本発明で使用されるプロモーターは、コリネ型細菌で機能するプロモーターである限り特に限定されず、コリネ型細菌由来のプロモーターであってもよく、異種由来のプロモーターであってもよい。「コリネ型細菌で機能するプロモーター」とは、コリネ型細菌においてプロモーター活性を有するプロモーターをいう。異種由来のプロモーターとして、具体的には、例えば、tacプロモーター、lacプロモーター、trpプロモーター、araBADプロモーター等のE.coli由来のプロモーターが挙げられる。その中で、tacプロモーター等の強力なプロモーターが好ましく、araBADプロモーター等の誘導型のプロモーターも好ましい。

コリネ型細菌由来のプロモーターとしては、例えば、細胞表層タンパク質のPS1、PS2（CspBともいう）、SlpA（CspAともいう）をコードする各遺伝子のプロモーター、各種アミノ酸生合成系遺伝子のプロモーターが挙げられる。各種アミノ酸生合成系遺伝子のプロモーターとして、具体的には、例えば、グルタミン酸生合成系のグルタミン酸脱水素酵素遺伝子、グルタミン合成系のグルタミン合成酵素遺伝子、リジン生合成系のアスパルトキナーゼ遺伝子、スレオニン生合成系のホモセリン脱水素酵素遺伝子、イソロイシンおよびバリン生合成系のアセトヒドロキシ酸合成酵素遺伝子、ロイシン生合成系の2-イソプロピルリンゴ酸合成酵素遺伝子、プロリンおよびアルギニン生合成系のグルタミン酸キナーゼ遺伝子、ヒスチジン生合成系のホスホリボシル-ATPピロホスホリラーゼ遺伝子、トリプトファン、チロシンおよびフェニルアラニン等の芳香族アミノ酸生合成系のデオキシアラビノヘプツロン酸リン酸（DAHP）合成酵素遺伝子、イノシン酸およびグアニル酸のような核酸生合成系におけるホスホリボシルピロホスフェート(PRPP)アミドトランスフェラーゼ遺伝子、イノシン酸脱水素酵素遺伝子、およびグアニル酸合成酵素遺伝子のプロモーターが挙げられる。

プロモーターとしては、各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターの高活性型のものを取得し利用してもよい。例えば、プロモーター領域内の−３５、−１０領域をコンセンサス配列に近づけることにより、プロモーターの活性を高めることができる（国際公開第００／１８９３５号）。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)）等に記載されている。さらに、リボソーム結合部位（RBS）と開始コドンとの間のスペーサー領域、特に開始コドンのすぐ上流の配列(5’-UTR)における数個のヌクレオチドの置換、あるいは挿入、あるいは欠失がmRNAの安定性および翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することも可能である。

本発明で使用されるシグナルペプチドは、コリネ型細菌で機能するシグナルペプチドである限り特に限定されず、コリネ型細菌由来のシグナルペプチドであってもよく、異種由来のシグナルペプチドであってもよい。「コリネ型細菌で機能するシグナルペプチド」とは、目的のタンパク質のＮ末端に連結した際に、コリネ型細菌が当該タンパク質を分泌することができるペプチドをいう。シグナルペプチドは、宿主であるコリネ型細菌の分泌性タンパク質のシグナルペプチドであるのが好ましく、コリネ型細菌の細胞表層タンパク質のシグナルペプチドであるのがより好ましい。コリネ型細菌の細胞表層タンパク質としては、C. glutamicumに由来するPS1及びPS2（CspB）（特表平６−５０２５４８）、及びC. ammoniagenes (C. stationis)に由来するSlpA（CspA）（特開平１０−１０８６７５）が挙げられる。PS1のシグナルペプチドのアミノ酸配列を配列番号１０１に、PS2（CspB）のシグナルペプチドのアミノ酸配列を配列番号１０２に、SlpA（CspA）のシグナルペプチドのアミノ酸配列を配列番号１０３に示す。また、米国特許4965197によれば、コリネ型細菌由来のDNaseにもシグナルペプチドがあると言われており、そのようなシグナルペプチドも本発明に利用することができる。

シグナルペプチドは生物種を越えて一定の共通した配列上の特徴を有するが、ある生物種で分泌機能を示すシグナルペプチドが他の生物種においても必ずしも分泌機能を発揮するわけではない。よって、異種由来のシグナルペプチドを利用する場合には、適宜、コリネ型細菌で機能するものを選択すればよい。あるシグナルペプチドがコリネ型細菌で機能するかどうかは、例えば、目的のタンパク質を当該シグナルペプチドと融合させて発現させ、当該タンパク質が分泌されるかを確認することで確認できる。

シグナルペプチドには、それが由来する分泌性タンパク質のＮ末端アミノ酸配列の一部が付加されていてもよい。シグナル配列は、一般に、翻訳産物が菌体外に分泌される際にシグナルペプチダーゼによって切断される。なお、シグナルペプチドをコードする遺伝子は、天然型のままでも使用できるが、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変してもよい。

本発明の方法により分泌生産される多量体タンパク質としては、例えば、生理活性タンパク質、レセプタータンパク質、ワクチンとして使用される抗原タンパク質、および酵素であって、多量体タンパク質であるものが挙げられる。生理活性タンパク質としては、例えば、成長因子（増殖因子）、ホルモン、サイトカイン、抗体関連分子が挙げられる。

抗体関連分子とは、完全抗体を構成するドメインから選択される単一のドメインもしくは２またはそれ以上のドメインの組合せからなる分子種を含むタンパク質をいう。完全抗体を構成するドメインとしては、重鎖のドメインであるＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３、ならびに軽鎖のドメインであるＶＬおよびＣＬが挙げられる。抗体関連分子は、上述の分子種を含む限り、単量体タンパク質であってもよく、多量体タンパク質であってもよい。なお、抗体関連分子が多量体タンパク質である場合には、単一の種類のサブユニットからなるホモ多量体であってもよく、２またはそれ以上の種類のサブユニットからなるヘテロ多量体であってもよい。抗体関連分子として、具体的には、例えば、完全抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆｃ、重鎖（Ｈ鎖）と軽鎖（Ｌ鎖）からなる二量体、Ｆｃ融合タンパク質、重鎖（Ｈ鎖）、軽鎖（Ｌ鎖）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）₂、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、Ｄｉａｂｏｄｙが挙げられる。

多量体タンパク質である抗体関連分子としては、例えば、完全抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆｃ、重鎖（Ｈ鎖）と軽鎖（Ｌ鎖）からなる二量体、Ｆｃ融合タンパク質、ｓｃ（Ｆｖ）₂、Ｄｉａｂｏｄｙが挙げられる。これらの中では、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）₂、およびＦｃ融合タンパク質が好ましい。

Ｆａｂ（fragment, antigen binding）とは、完全抗体からＨ鎖のＦｃ領域を除いた部分であり、抗原結合領域のみの抗体断片である。Ｆａｂは、１分子のＨ鎖のＦａｂ部分と１分子のＬ鎖からなる二量体であり、Ｃ末端のジスルフィド結合により会合している。完全抗体がＨ２Ｌ２の四量体であり分子量は約１５０ｋＤａと巨大あるのに対し、Ｆａｂは分子量約５０ｋＤａと小さく、そのためＦａｂは目的組織への透過性に優れると考えられている。ＦａｂはＦｃ領域を持たないため、補体活性や結晶化能などは持たないが、抗原への結合能は保持しているため主に抗原の中和の目的で用いられる。抗体医薬の中でも、近年はＦａｂが着目されている。

Ｆ（ａｂ’）とは、完全抗体からＨ鎖のＦｃ’領域を除いた部分である。Ｆ（ａｂ’）は、１分子のＨ鎖のＦ（ａｂ’）部分と１分子のＬ鎖からなる二量体であり、Ｃ末端のジスルフィド結合により会合している。Ｆ（ａｂ’）におけるＨ鎖の残存部分はＦａｂにおけるＨ鎖の残存部分よりも長く、Ｈ鎖同士をつなぐジスルフィド結合部分が残存している。そのため、２分子のＦ（ａｂ’）はジスルフィド結合によりＦ（ａｂ’）₂を形成できる。Ｆ（ａｂ’）やＦ（ａｂ’）₂も、Ｆａｂ断片と同様に抗体医薬として利用できる。

Ｆｃ（fragment, crystallizable）は、補体活性や結晶化能に関与するＦｃ領域のみの抗体断片である。Ｈ鎖のＦｃ領域と他の機能性タンパク質を融合させたタンパク質をＦｃ融合タンパク質という。

多量体タンパク質である成長因子（増殖因子）として、具体的には、例えば、血管内皮細胞増殖因子（vascular endothelial growth factor；ＶＥＧＦ）が挙げられる。

多量体タンパク質であるホルモンとして、具体的には、例えば、インスリンが挙げられる。

多量体タンパク質であるサイトカインとして、具体的には、例えば、インターロイキン-5、インターフェロン-γ、腫瘍壊死因子（Tumor Necrosis Factor；TNF）が挙げられる。

なお、成長因子（増殖因子）、ホルモン、およびサイトカインは互いに厳密に区別されなくともよい。例えば、生理活性タンパク質は、成長因子（増殖因子）、ホルモン、およびサイトカインから選択されるいずれか１つのグループに属するものであってもよく、それらから選択される複数のグループに属するものであってもよい。

レセプタータンパク質は、多量体タンパク質であれば特に制限されず、例えば、生理活性タンパク質やその他の生理活性物質に対するレセプタータンパク質であってよい。その他の生理活性物質としては、例えば、ドーパミン等の神経伝達物質が挙げられる。また、レセプタータンパク質は、対応するリガンドが知られていないオーファン受容体であってもよい。

ワクチンとして使用される抗原タンパク質は、免疫応答を惹起できる多量体タンパク質であれば特に制限されず、想定する免疫応答の対象に応じて適宜選択すればよい。

多量体タンパク質である酵素として、具体的には、例えば、逆転写酵素が挙げられる。

これらのタンパク質をコードする遺伝子は、使用する宿主に応じて、および望みの活性を得るために改変することができる。例えば、これらのタンパク質をコードする遺伝子は、これらのタンパク質に１又は数個のアミノ酸の付加、欠失、置換などが含まれるよう改変されてもよい。上述のメタロペプチダーゼおよびそれをコードする遺伝子のバリアントに関する記載は、本発明の方法により分泌生産される多量体タンパク質およびそれをコードする遺伝子にも準用できる。また、これらのタンパク質をコードする遺伝子は、任意のコドンをそれと等価のコドンに置換したものであってもよい。例えば、これらのタンパク質をコードする遺伝子は、必要により宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンに変換してもよい。

本発明の方法により最終的に得られる多量体タンパク質のＮ末端領域は、天然のタンパク質と同一であってもよく、天然のタンパク質と同一でなくてもよい。例えば、最終的に得られる多量体タンパク質のＮ末端領域は、天然のタンパク質と比較して、１又は数個のアミノ酸を余分に付加された、あるいは欠失したものであってもよい。なお上記「１又は数個」とは、目的の多量体タンパク質の全長や構造等によっても異なるが、具体的には好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個を意味する。

また、分泌生産される多量体タンパク質は、プロ構造部が付加したタンパク質（プロタンパク質）であってもよい。分泌生産される多量体タンパク質がプロタンパク質である場合、最終的に得られる多量体タンパク質はプロタンパク質であってもよく、そうでなくてもよい。すなわち、プロタンパク質はプロ構造部を切断されて成熟タンパク質になってもよい。切断は、例えば、プロテアーゼにより行うことができる。プロテアーゼを使用する場合は、最終的に得られるタンパク質の活性という観点から、プロタンパク質は一般には天然のタンパク質とほぼ同じ位置で切断されることが好ましく、天然のタンパク質と完全に同じ位置で切断され天然のものと同一の成熟タンパク質が得られるのがより好ましい。従って、一般には、天然に生じる成熟タンパク質と同一のタンパク質を生じる位置でプロタンパク質を切断する特異的プロテアーゼが最も好ましい。しかしながら、上述の通り、最終的に得られる多量体タンパク質のＮ末端領域は、天然のタンパク質と同一でなくてもよい。例えば、生産される多量体タンパク質の種類や使用目的等によっては、天然のタンパク質に比較してＮ末端がアミノ酸１〜数個分長いあるいは短いタンパク質がより適切な活性を有することがある。本発明において使用できるプロテアーゼには、Dispase（ベーリンガーマンハイム社製）のような商業的に入手できるものの他、微生物の培養液、例えば放線菌の培養液等から得られるものが含まれる。そのようなプロテアーゼは未精製状態で使用することもでき、必要に応じて適当な純度まで精製した後に使用してもよい。

本発明に用いられる遺伝子構築物をコリネ型細菌に導入する手法は特に制限されない。本発明の細菌において、本発明に用いられる遺伝子構築物は、プラスミドのように染色体外で自律増殖するベクター上に存在していてもよく、染色体上に組み込まれていてもよい。なお、上述の通り、本発明の細菌を構築するに当たり、本発明に用いられる遺伝的構築物の導入、タンパク質の分泌生産能の付与または増強、メタロペプチダーゼをコードする遺伝子の発現上昇、ペニシリン結合タンパク質の活性の低下、細胞表層タンパク質の活性の低下等の改変は、任意の順番で行うことができる。

本発明に用いられる遺伝子構築物は、例えば、同遺伝子構築物を含むベクターを用いて宿主に導入できる。ベクターは、コリネ型細菌で自律複製可能なものであれば特に制限されず、例えば、細菌プラスミド由来のベクター、酵母プラスミド由来のベクター、バクテリオファージ由来のベクター、コスミド、またはファージミド等であってよい。ベクターとしては、例えば、コリネ型細菌由来のプラスミドが好ましい。コリネ型細菌で自律複製可能なベクターとして、具体的には、pHM1519(Agric, Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984))；pAM330（Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984)）；これらを改良した薬剤耐性遺伝子を有するプラスミド；特開平3-210184号公報に記載のプラスミドpCRY30；特開平2-72876号公報及び米国特許5,185,262号明細書公報に記載のプラスミドpCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE及びpCRY3KX；特開平1-191686号公報に記載のプラスミドpCRY2およびpCRY3；特開昭58-192900号公報に記載のpAJ655、pAJ611及びpAJ1844；特開昭57-134500号公報に記載のpCG1；特開昭58-35197号公報に記載のpCG2；特開昭57-183799号公報に記載のpCG4およびpCG11；特開平10-215883号公報に記載のpVK7、特開平9-070291号公報に記載のpVC7等が挙げられる。

また、人工トランスポゾン等も利用することができる。トランスポゾンが使用される場合は相同組換えまたはそれ自身の転移能によって多量体タンパク質遺伝子が染色体上に導入される。その他、相同組換えを利用する導入法としては、例えば、直鎖状ＤＮＡ、温度感受性複製起点を含むプラスミド、接合伝達可能なプラスミド、または宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクター等を用いる方法が挙げられる。なお、多量体タンパク質遺伝子が染色体上に導入される場合には、本発明に用いられる遺伝子構築物が染色体上に構成される限り、同遺伝子構築物に含まれるプロモーター配列およびシグナルペプチドをコードする核酸配列のいずれかまたは両方は宿主の染色体上にもともと存在するものであってもよい。具体的には、例えば、宿主の染色体上にもともと存在するプロモーター配列と同プロモーター配列の下流に接続されたシグナルペプチドをコードする核酸配列をそのまま利用し、同シグナルペプチドをコードする核酸配列の下流に接続された遺伝子のみを目的の多量体タンパク質遺伝子に置換することによっても、染色体上に本発明に用いられる遺伝子構築物が構成され、本発明の細菌を構築できる。

なお、２またはそれ以上の種類のサブユニットを発現する場合、各サブユニットの分泌発現用の遺伝子構築物は、目的の多量体タンパク質の分泌発現が達成できるように本発明の細菌に保持されていればよい。具体的には、例えば、各サブユニットの分泌発現用の遺伝子構築物は、全てが単一の発現ベクター上に保持されていてもよく、全てが染色体上に保持されていてもよい。また、各サブユニットの分泌発現用の遺伝子構築物は、複数の発現ベクター上に別々に保持されていてもよく、単一または複数の発現ベクター上と染色体上とに別々に保持されていてもよい。「２またはそれ以上の種類のサブユニットを発現する場合」とは、例えば、２またはそれ以上の種類の多量体タンパク質が分泌生産される場合や、ヘテロ多量体タンパク質が分泌生産される場合をいう。

本発明に用いられる遺伝子構築物のコリネ型細菌への導入方法は特に限定されず、一般に使用される方法、例えば、プロトプラスト法(Gene, 39, 281-286(1985))、エレクトロポレーション法(Bio/Technology, 7, 1067-1070)(1989))等を使用することができる。

＜２＞本発明の多量体タンパク質の製造方法
本発明は、本発明の細菌を培養し、分泌生産された多量体タンパク質を回収することを含む、多量体タンパク質の製造方法（以下、「本発明の方法」または「本発明の多量体タンパク質の製造方法」ともいう）を提供する。すなわち、上記のようにして得られる本発明の細菌を培養し、多量体タンパク質を発現させることにより、菌体外に分泌された多量の多量体タンパク質が得られる。

本発明の細菌は通常用いられる方法および条件に従って培養することができる。例えば、本発明の細菌は炭素源、窒素源、無機イオンを含有する通常の培地で培養することができる。さらに高い増殖を得るために、ビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養素を必要に応じて添加することもできる。

炭素源としてはグルコースおよびシュークロースのような炭水化物、酢酸のような有機酸、アルコール類、その他を使用することができる。窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩、その他が使用できる。無機イオンとしては、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、リン酸イオン、カリウムイオン、鉄イオン等を必要に応じて適宜使用する。培養はpH5.0〜8.5、15℃〜37℃の適切な範囲にて好気的条件下で行い、１〜７日間程度培養する。また、コリネ型細菌のＬ−アミノ酸生産における培養条件や、その他Sec系、Tat系のシグナルペプチドを用いたタンパク質の製造法に記載の条件を用いることが出来る（WO01/23591、WO2005/103278参照）。また、多量体タンパク質の発現のために誘導型プロモーターを用いた場合は、培地にプロモーター誘導剤を添加して培養を行うこともできる。このような条件下で本発明の細菌を培養することにより、目的タンパク質は菌体内で多量に生産され効率よく菌体外に分泌される。なお、本発明の方法によれば、生産された多量体タンパク質は菌体外に分泌されるため、微生物の菌体内で多量に蓄積すると一般に致死的であるタンパク質も、致死的影響を受けることなく連続的に生産できる。

本発明の方法によって培地中に分泌されたタンパク質は、当業者によく知られた方法に従って培養後の培地から分離精製することができる。例えば、菌体を遠心分離等により除去した後、塩析、エタノール沈殿、限外濾過、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニーティークロマトグラフィー、中高圧液体クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー等の既知の適切な方法、またはこれらを組み合わせることにより分離精製することができる。また、ある場合には、培養物や培養上清をそのまま使用してもよい。本発明の方法によって菌体表層に分泌されたタンパク質も当業者によく知られた方法、例えば塩濃度の上昇、界面活性剤の使用等によって可溶化した後に、培地中に分泌された場合と同様にして分離精製することができる。また、ある場合には、菌体表層に分泌されたタンパク質を可溶化せずに、例えば固定化酵素として使用しても良い。

目的の多量体タンパク質が分泌生産されたことは、培養上清および／または菌体表層を含む画分を試料として、SDS-PAGEを行い、分離されたタンパク質バンドの分子量を確認することにより確認することができる。また、培養上清および／または菌体表層を含む画分を試料として、抗体を用いたウェスタンブロットによって確認できる（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。また、プロテインシークエンサーを用いて目的の多量体タンパク質の構成成分のN末端アミノ酸配列を決定することによって確認出来る。また、質量分析計を用いて、目的の多量体タンパク質の構成成分の質量を決定することによって確認出来る。また、目的の多量体タンパク質が酵素や何らかの測定可能な生理活性を有するものである場合には、培養上清および／または菌体表層を含む画分を試料として、目的の多量体タンパク質の酵素活性または生理活性を測定することにより目的の多量体タンパク質が分泌生産されたことを確認できる。

本発明は以下の実施例によって、更に具体的に説明されるが、これらはいかなる意味でも本発明を限定するものと解してはならない。

参考例１：ペニシリン結合タンパク質PBP1aを欠損させたCorynebacterium glutamicumの構築
（１）PBP1aをコードするCgl0278遺伝子欠損用ベクターpBSΔCgl0278の構築
C. glutamicum ATCC13032株のゲノム配列および、ペニシリン結合タンパク質PBP1aをコードするCgl0278遺伝子の塩基配列は既に決定されている（GenBank Accession No. BA000036, NCBI gene entry NCgl0274）。この配列を参考にして<配列番号26>、<配列番号27>、<配列番号28>、および<配列番号29>に記載のプライマーを合成した。常法に従って（斉藤、三浦の方法[Biochim. Biophys. Acta, 72, 619(1963)]）調製したC. glutamicum ATCC13869株の染色体DNAを鋳型として、<配列番号26>と<配列番号27>のプライマーを用いてPBP1aをコードするCgl0278の5'側上流約1kbpを、<配列番号28>と<配列番号29>のプライマーを用いて3'側下流約1kbpの領域を、それぞれPCR法によって増幅した。次に、増幅した両DNA断片を鋳型に、<配列番号26>と<配列番号29>に示すDNAをプライマーとして用いたPCR法により両DNA断片が融合した約2kbpのDNA断片を得た。<配列番号26>と<配列番号29>のプライマーにはそれぞれ制限酵素Bam HIとXba Iの認識配列がデザインしてある。PCRにはPyrobest DNA polymerase（タカラバイオ社製）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。このDNA断片を制限酵素Bam HIおよびXba Iで処理し、WO2005/113744に記載のpBS4のBam HI-Xba I部位に挿入することによって、Cgl0278遺伝子欠損用のベクターpBSΔCgl0278を得た。ライゲーション反応にはDNA Ligation Kit Ver.2.1（タカラバイオ社製）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。

（２）PBP1a欠損株の構築
次に、構築したpBSΔCgl0278でWO2004/029254に記載のC. glutamicum YDK010株を形質転換した。なお、C. glutamicum YDK010株は、C. glutamicum AJ12036(FERM BP-734)の細胞表層タンパク質PS2の欠損株である（WO2004/029254）。得られた形質転換体からWO2005/113744およびWO2006/057450記載の方法に従って菌株の選択を行い、Cgl0278遺伝子が欠損したYDK010ΔPBP1a株を得た。

実施例１：C. glutamicum ATCC13869由来のメタロエンドペプチダーゼ様遺伝子Cgl0858ホモログのクローン化
C. glutamicum ATCC13032のゲノム配列および、メタロエンドペプチダーゼ様タンパク質をコードするCgl0858遺伝子の塩基配列は既に決定されている（GenBank Accession No. BA000036, NCBI gene entry NCgl0824）。この配列を参考にして<配列番号01>および<配列番号02>に記載のプライマーを合成した。常法に従って（斉藤、三浦の方法[Biochim. Biophys. Acta, 72, 619(1963)]）調製したC. glutamicum ATCC13869株の染色体DNAを鋳型として、<配列番号01>および<配列番号02>のプライマーを用いて、メタロエンドペプチダーゼ様タンパク質をコードするCgl0858ホモログを含む約1.1kbpの領域をPCR法によって増幅した。PCR反応にはPyrobest DNA polymerase（タカラバイオ社製）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。

次に増幅した約1.1kbpのDNA断片をWizard（登録商標） SV Gel and PCR Clean-Up System（プロメガ社製）を用いてアガロースゲル電気泳動により回収した。回収した断片を特開平9-070291に記載のpVC7（大腸菌およびコリネ型細菌の両方で複製可能なシャトルベクター）のSma I部位に挿入した後、Escherichia coli JM109（タカラバイオ社製）のコンピテントセルに導入した。Cgl0858ホモログがクローン化されたプラスミドを保持する菌株を取得し、これよりプラスミドを回収し、pVMEP1と名付けた。pVMEP1にクローン化されている断片の塩基配列の決定はBigDye（登録商標） Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオシステムズ社製）と3130 ジェネティックアナライザ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて行った。塩基配列決定の結果、クローン化されたC. glutamicum ATCC13869のCgl0858ホモログの塩基配列は、C. glutamicum ATCC13032のCgl0858の塩基配列と一部異なっていることが判明した。C. glutamicum ATCC13869由来のCgl0858ホモログの塩基配列を<配列番号03>に、コードされる全アミノ酸配列を<配列番号04>に示した。図１にC. glutamicum ATCC13032のCgl0858がコードするタンパク質とATCC13869のCgl0858ホモログがコードするタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示した。ATCC13032のCgl0858がコードするタンパク質とATCC13869のCgl0858ホモログがコードするタンパク質間のホモロジーはアミノ酸配列全長に対して97.9%であった。アライメントの作成および相同性の計算は、Genetyx_Version9（ゼネティックス社製）を用いて行った。

実施例２：Cgl0858ホモログの発現を増強させたC. glutamicumを用いた抗体トラスツズマブのFab(H&L)断片の分泌発現
（１）抗体トラスツズマブのFab断片のH鎖領域の分泌発現プラスミドの構築
乳癌細胞特異的な抗体トラスツズマブのH鎖の可変領域の遺伝子配列は既に決定されている（GenBank Accession No.AY513484）。この配列と一般的な抗体H鎖の不可変領域の配列を参考にし、C. glutamicumのコドン使用頻度を考慮して<配列番号30>〜<配列番号63>に示したDNAを合成した。これらのDNAを鋳型とし、別途合成した<配列番号64>と<配列番号65>に示したDNAをプライマーとして用いて、トラスツズマブの完全長H鎖領域をPCR法によって増幅し、約1.4kbpの<配列番号66>に示したDNA断片を得た。<配列番号66>に示したDNAにコードされる抗体トラスツズマブのH鎖のアミノ酸配列を<配列番号104>に示した。

次にWO01/23591に記載のpPKSPTG1（pPKSPTG1は、プロトランスグルタミナーゼ（プロ構造部付きトランスグルタミナーゼ）の分泌発現用ベクターであって、C. glutamicum ATCC13869株のPS2遺伝子由来のプロモーター、同プロモーターの下流に発現可能に連結されたC. ammoniagenes ATCC6872株のSlpA由来のシグナルペプチドをコードするDNA、および同シグナルペプチドとの融合タンパク質として発現するよう連結されたS.mobaraense由来のプロトランスグルタミナーゼ遺伝子を有する）を鋳型に、<配列番号67>と<配列番号68>に示したプライマーを用いて、上記プロモーター領域と上記シグナルペプチド領域とを含む領域をPCR法にて増幅し、約0.7kbpのDNA断片を得た。

次に、増幅した両DNA断片（トラスツズマブの完全長H鎖領域を含む断片と、プロモーター領域及びシグナルペプチド領域を含む断片）を鋳型に、<配列番号65>と<配列番号67>に記載のDNAをプライマーとして用いたPCR法により、両DNA断片が融合した約2.0kbpのDNA断片を得た。

次にこの融合DNA断片を鋳型とし、<配列番号67>と<配列番号69>、<配列番号67>と<配列番号70>、<配列番号67>と<配列番号71>、<配列番号67>と<配列番号72>、<配列番号67>と<配列番号73>、<配列番号67>と<配列番号74>、<配列番号67>と<配列番号75>に記載のDNAをそれぞれプライマーとして用いたPCR法により、それぞれ約1.4kbpのDNA断片を得た。<配列番号67>のプライマーには制限酵素Kpn Iの認識配列がデザインしてあり、<配列番号69>、<配列番号70>、<配列番号71>、<配列番号72>、<配列番号73>、<配列番号74>、<配列番号75>のプライマーにはそれぞれストップコドンと制限酵素Kpn Iの認識配列がデザインしてある。PCRにはPyrobest DNA polymerase（タカラバイオ社製）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。これらのDNA断片を制限酵素Kpn Iで処理し、特開平9-322774に記載のpPK4のKpn I部位に挿入することによって、トラスツズマブのFab部分のH鎖領域を分泌発現させるプラスミドpPKStrast-FabH(1-223C)、pPKStrast-FabH(1-228T)、pPKStrast-FabH(1-229C)、pPKStrast-FabH(1-230P)、pPKStrast-FabH(1-231P)、pPKStrast-FabH(1-232C)、pPKStrast-FabH(1-233P)を得た。具体的には、これらのプラスミドにより、プラスミド名に含まれる数字に従って、トラスツズマブのH鎖の1番目のアミノ酸残基から、223、228、229、230、231、232、233番目のいずれかのアミノ酸残基までを発現させることができる。それぞれの挿入断片の塩基配列決定の結果、予想通りの遺伝子が構築されていることを確認した。尚、塩基配列の決定はBigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオシステムズ社製）と3130 ジェネティックアナライザ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて行った。

（２）抗体トラスツズマブのFab断片のL鎖領域の分泌発現プラスミドの構築
乳癌細胞特異的な抗体トラスツズマブのL鎖の可変領域の遺伝子配列は既に決定されている（GenBank Accession No. AY513485）。この配列と一般的な抗体L鎖の不可変領域の配列を参考にし、C. glutamicumのコドン使用頻度を考慮して<配列番号76>〜<配列番号91>に示したDNAを合成した。これらのDNAを鋳型とし、別途合成した<配列番号92>と<配列番号93>に示したDNAをプライマーとして用いて、トラスツズマブの完全長L鎖領域をPCR法によって増幅し、約0.6kbpの<配列番号94>に示したDNA断片を得た。<配列番号94>に示したDNAにコードされる抗体トラスツズマブのL鎖のアミノ酸配列を<配列番号105>に示した。次にWO01/23591記載のpPKSPTG1（C. glutamicum ATCC13869株由来のプロモーター領域とC. ammoniagenes ATCC6872株由来のシグナルペプチド領域を含む）を鋳型に、<配列番号95>と<配列番号96>に示したプライマーを用いて、上記プロモーター領域と上記シグナルペプチド領域とを含む領域をPCR法にて増幅し、約0.7kbpのDNA断片を得た。次に増幅した両DNA断片（トラスツズマブのL鎖領域を含む断片と、プロモーター領域及びシグナルペプチド領域を含む断片）を鋳型に、<配列番号95>と<配列番号97>に記載のDNAをプライマーとして用いたPCR法により、両DNA断片が融合した約1.3kbpのDNA断片を得た。<配列番号95>と<配列番号97>のプライマーにはそれぞれ制限酵素BamH Iの認識配列がデザインしてある。PCRにはPyrobest DNA polymerase（タカラバイオ社製）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。この融合DNA断片を制限酵素BamH I処理し、特開平9-322774記載のpPK4のBamH I部位に挿入することによって、トラスツズマブのFab部分のL鎖領域を分泌発現させるプラスミドpPKStrast-FabLを得た。挿入断片の塩基配列決定の結果、予想通りの遺伝子が構築されていることを確認した。尚、塩基配列の決定はBigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオシステムズ社製）と3130 ジェネティックアナライザ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて行った。

（３）抗体トラスツズマブのFab(H&L)断片の分泌発現プラスミドの構築
実施例２（１）で構築した抗体トラスツズマブのFab断片のH鎖領域の各発現プラスミドを制限酵素Kpn Iで消化することにより得られたそれぞれ約1.4kbのDNA断片を、実施例２（２）で構築した抗体トラスツズマブのFab断片のL鎖領域の発現プラスミドであるpPKStrast-FabLのKpn I部位に挿入することによって、トラスツズマブのFab断片のH鎖領域とL鎖領域を共発現させるプラスミドpPKStrast-FabH(1-223C)+L、pPKStrast-FabH(1-228T)+L、pPKStrast-FabH(1-229C)+L、pPKStrast-FabH(1-230P)+L、 pPKStrast-FabH(1-231P)+L、pPKStrast-FabH(1-232C)+L、pPKStrast-FabH(1-233P)+Lを得た。

（４）Cgl0858ホモログの発現を増強させたC. glutamicumを用いた抗体トラスツズマブのFab(H&L)断片の分泌発現
実施例１で構築したCgl0858ホモログの発現プラスミドpVMEP1と、実施例２（３）で構築した各抗体トラスツズマブのFab(H&L)断片の分泌発現プラスミドpPKStrast-FabH(1-223C)+L、pPKStrast-FabH(1-228T)+L、pPKStrast-FabH(1-229C)+L、pPKStrast-FabH(1-230P)+L、pPKStrast-FabH(1-231P)+L、pPKStrast-FabH(1-232C)+L、pPKStrast-FabH(1-233P)+Lを用いて、WO2004/029254に記載のC. glutamicum YDK010株を形質転換した。得られた各形質転換体を、5 mg/lのクロラムフェニコールと25 mg/lのカナマイシンを含むMM液体培地（グルコース 120 g、硫酸マグネシウム七水和物 3 g、硫酸アンモニウム 30 g、リン酸二水素カリウム 1.5 g、硫酸鉄七水和物 0.03 g、硫酸マンガン五水和物 0.03 g、チアミン塩酸塩 450 μg、ビオチン 450 μg、DL-メチオニン 0.15 g、炭酸カルシウム 50 g、水で1LにしてpH7.0に調整）でそれぞれ30 ℃、96時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清を非還元SDS-PAGEに供してからSYPRO Orange（インビトロジェン社製）にて染色を行い、抗体トラスツズマブのFab(H&L)断片の分泌量の比較を行った。その結果、いずれの抗体トラスツズマブのFab(H&L)断片分泌発現プラスミドを用いた場合でも、pVC7を導入した対照株と比較して、pVMEP1を導入した株では、ヘテロダイマーである抗体トラスツズマブのFab(H&L)断片の分泌量が有意に向上していた（図２）。

（５）Cgl0858ホモログの発現を増強させたC. glutamicumを用いた抗体トラスツズマブのＦ（ａｂ’）₂の分泌発現
実施例２（４）で得られた各培養上清を非還元SDS-PAGEに供してからiBlot（登録商標）Gel Transfer Stacks PVDF, Mini（インビトロジェン社製）とiBlot^TMゲルトランスファーシステム（インビトロジェン社製）を用いてPVDF膜に転写した。このPVDF膜に対してアルカリフォスファターゼ標識抗ヒトIgG[H&L]抗体（ROCKLAND社製）とAlkaline Phosphatase Conjugate Substrate Kit（バイオラッド社製）を用いたウェスタンブロッティングを行い、抗体トラスツズマブのＦ（ａｂ’）₂の検出を行った。その結果、H鎖同士をつなぐジスルフィド結合を形成するシステイン残基が含まれているH鎖遺伝子とL鎖遺伝子を共発現するプラスミドであるpPKStrast-FabH(1-229C)+L、pPKStrast-FabH(1-230P)+L、 pPKStrast-FabH(1-231P)+L、pPKStrast-FabH(1-232C)+L、pPKStrast-FabH(1-233P)+Lを有する形質転換体の培養上清において、抗体トラスツズマブのＦ（ａｂ’）₂の分子量のタンパク質バンドが検出された。さらに、これらいずれの分泌発現プラスミドを用いた場合にも、pVC7を導入した対照株と比較して、pVMEP1を導入した株では、ヘテロ四量体であるＦ（ａｂ’）₂の分子量のタンパク質バンドが有意に向上していた（図３）。

（６）Cgl0858ホモログの発現を増強させ、かつ、PBP1aを欠損したC. glutamicumを用いた抗体トラスツズマブのFab(H&L)断片の分泌発現
実施例１で構築したCgl0858ホモログの発現プラスミドpVMEP1と、実施例２（３）で構築した各抗体トラスツズマブのFab(H&L)断片の分泌発現プラスミドpPKStrast-FabH(1-223C)+L、pPKStrast-FabH(1-228T)+L、pPKStrast-FabH(1-229C)+L、pPKStrast-FabH(1-230P)+L、pPKStrast-FabH(1-231P)+L、pPKStrast-FabH(1-232C)+L、pPKStrast-FabH(1-233P)+Lを用いて、参考例１で構築したC. glutamicum YDK010ΔPBP1a株を形質転換した。得られた各形質転換体を、5mg/lのクロラムフェニコールと25 mg/lのカナマイシンを含むMM液体培地（グルコース 120 g、硫酸マグネシウム七水和物 3 g、硫酸アンモニウム 30 g、リン酸二水素カリウム 1.5 g、硫酸鉄七水和物 0.03 g、硫酸マンガン五水和物 0.03 g、チアミン塩酸塩 450 μg、ビオチン 450 μg、DL-メチオニン 0.15 g、炭酸カルシウム 50 g、水で1LにしてpH7.0に調整）でそれぞれ30 ℃、96時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して培養上清を得た。

次に、実施例２（４）と実施例２（６）で得られた培養上清サンプルを、同一ゲルを用いて非還元SDS-PAGEに供してからCBB-R250（バイオラッド社製）にて染色を行い、抗体トラスツズマブのFab(H&L)断片の分泌生産量の比較を行った。その結果、Cgl0858ホモログの発現増強が単独でなされた株と比較して、Cgl0858ホモログの発現増強とPBP1aの欠損を組み合わせた株では、ヘテロダイマーである抗体トラスツズマブのFab(H&L)断片の分泌生産量がさらに相乗的に向上していることが確認された（図４）。具体的には、Cgl0858ホモログの発現増強が単独でなされた株では、バンドの検出に検出感度の高いSYPRO Orangeを用いるのが好ましかったが、Cgl0858ホモログの発現増強とPBP1aの欠損を組み合わせた株では、検出感度の低いCBB-R250染色によって容易にバンドが検出可能となるレベルの発現量であった。

実施例３：Cgl0858ホモログの発現を増強させたCorynebacterium glutamicumを用いたVEGF-Aの分泌発現
（１）VEGF-Aの分泌発現プラスミドの構築
血管内皮細胞増殖因子-A（vascular endothelial growth factor-A；VEGF-A）の遺伝子配列は既に決定されている（GenBank Accession No. NP_001165097）。この配列と、C. glutamicumのコドン使用頻度を考慮して、<配列番号05>〜<配列番号18>に示したDNAを合成した。これらのDNAを鋳型とし、別途合成した<配列番号19>と<配列番号20>に示したDNAをプライマーとして用いて、VEGF-A遺伝子配列の全長をPCR法によって増幅し、約0.6kbpの<配列番号21>に示したDNA断片を得た。次にこのDNA断片を鋳型とし、<配列番号22>と<配列番号23>に示したDNAをプライマーとして用いて、成熟型VEGF-A遺伝子配列をPCR法によって増幅し、約0.5kbpのDNA断片を得た。<配列番号21>に示したDNAにコードされるＶＥＧＦ−Ａの全長のアミノ酸配列を<配列番号106>に、成熟型ＶＥＧＦ−Ａのアミノ酸配列を<配列番号107>に示した。次にWO01/23591記載のpPKSPTG1（C. glutamicum ATCC13869株由来のCspB（PS2）のプロモーター領域と、C. ammoniagenes ATCC6872株由来のCspA（SlpA）シグナルペプチドをコードするDNAを含む）を鋳型として、<配列番号24>と<配列番号25>に示したプライマーを用いて、プロモーター領域とシグナルペプチド領域をPCR法にて増幅し、約0.7kbpのDNA断片を得た。次に増幅させた両DNA断片（成熟型VEGF遺伝子配列の断片と、プロモーター領域及びシグナルペプチド領域の断片）を鋳型に、<配列番号24>と<配列番号23>に記載のDNAをプライマーとして用いたPCR法により、両DNA断片が融合した約1.2kbpのDNA断片を得た。<配列番号24>と<配列番号23>のプライマーにはそれぞれ制限酵素Kpn IおよびXba Iの認識配列がデザインしてある。PCR反応にはPrimeSTAR（登録商標） HS DNA polymerase（タカラバイオ社製）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。この融合DNA断片を制限酵素Kpn I及びXba I処理後に、特開平9-322774記載のpPK4のKpn I-Xba I部位に挿入することによって、VEGF-Aを発現させるプラスミドpPKSVEGFを得た。挿入断片の塩基配列決定の結果、予想通りの遺伝子が構築されていることを確認した。尚、塩基配列の決定はBigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオシステムズ社製）と3130 ジェネティックアナライザ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて行った。

（２）Cgl0858ホモログの発現を増強させたC. glutamicumを用いたVEGF-Aの分泌発現
実施例１（１）で構築したCgl0858ホモログの発現プラスミドpVMEP1と実施例３（１）で構築したVEGF-Aの分泌発現プラスミドpPKSVEGFを用いて、WO2004/029254に記載のC. glutamicum YDK010株を形質転換した。得られた形質転換体を、5mg/lのクロラムフェニコールと25 mg/lのカナマイシンを含むMM液体培地（グルコース 120 g、硫酸マグネシウム七水和物 3 g、硫酸アンモニウム 30 g、リン酸二水素カリウム 1.5 g、硫酸鉄七水和物 0.03 g、硫酸マンガン五水和物 0.03 g、チアミン塩酸塩 450 μg、ビオチン 450 μg、DL-メチオニン 0.15 g、炭酸カルシウム 50 g、水で1LにしてpH7.0に調整）でそれぞれ30 ℃、96時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清を非還元SDS-PAGEに供してからSYPRO Orange（インビトロジェン社製）にて染色を行い、VEGF-Aの分泌量の比較を行った。その結果、pVC7を導入した対照株と比較して、pVMEP1を導入した株では、目的のVEGF-Aのホモダイマーと同じ分子量のタンパク質バンドの強度が増加していた（図５）。このタンパク質バンドのN末端配列をプロテインシークエンサーPPSQ-21A（島津製作所製）を用いて決定したところ、VEGF-AのN末端配列と一致した事から、培養上清中にVEGF-Aのホモダイマーが分泌発現している事が確認できた。以上の通り、Cgl0858ホモログの発現を上昇させることで、VEGF-Aのホモダイマーの分泌生産量を向上させることができた。

実施例４： Cgl0858ホモログの発現を増強させたC. glutamicumを用いた抗体アダリムマブのFab(H&L)断片の分泌発現
（１）抗体アダリムマブのFab(H&L)断片の分泌発現プラスミドの構築
腫瘍壊死因子α（tumor necrosis factor-α；TNF-α）特異的な抗体アダリムマブのアミノ酸配列は既に決定されている（独立行政法人医薬品医療機器総合機構審査報告書(平成20年2月14日)）。この配列を参考にし、C. glutamicum ATCC13869株のPS2遺伝子由来のプロモーター、同プロモーターの下流に発現可能に連結されたC. stationis ATCC6872株のSlpA由来のシグナルペプチドをコードするDNA、および同シグナルペプチドとの融合タンパク質として発現するよう連結されたアダリムマブのH鎖の1番目から230番目のシステイン残基までのアミノ酸配列をコードするDNA、その下流にさらにC. glutamicum ATCC13869株のPS2遺伝子由来のプロモーター、同プロモーターの下流に発現可能に連結されたC. stationis ATCC6872株のSlpA由来のシグナルペプチドをコードするDNA、および同シグナルペプチドとの融合タンパク質として発現するよう連結されたアダリムマブのL鎖をコードするDNAを含む、<配列番号108>に示すDNA断片を全合成した。同様に、C. glutamicum ATCC13869株のPS2遺伝子由来のプロモーター、同プロモーターの下流に発現可能に連結されたC. stationis ATCC6872株のSlpA由来のシグナルペプチドをコードするDNA、および同シグナルペプチドとの融合タンパク質として発現するよう連結されたアダリムマブのL鎖をコードするDNA、その下流にさらにC. glutamicum ATCC13869株のPS2遺伝子由来のプロモーター、同プロモーターの下流に発現可能に連結されたC. stationis ATCC6872株のSlpA由来のシグナルペプチドをコードするDNA、および同シグナルペプチドとの融合タンパク質として発現するよう連結されたアダリムマブのH鎖の1番目から230番目のシステイン残基までのアミノ酸配列をコードするDNAを含む、<配列番号109>に示すDNA断片を全合成した。<配列番号108>、<配列番号109>の合成DNAにはそれぞれ5'末端に制限酵素BamH I、3'末端に制限酵素Xba Iの認識配列が含まれている。なお、合成DNA中のアダリムマブのH鎖およびL鎖をコードするDNAは、C. glutamicumのコドン使用頻度を考慮して設計した。合成DNA中のアダリムマブのH鎖の1番目から230番目のアミノ酸配列をコードするDNA配列を<配列番号110>、同アミノ酸配列を<配列番号111>に示した。また、合成DNA中のアダリムマブのL鎖をコードするDNA配列を<配列番号112>、アダリムマブのL鎖のアミノ酸配列を<配列番号113>に示した。全合成したそれぞれ約2.7kbpのDNA断片を制限酵素BamH IおよびXba Iで消化し、特開平9-322774に記載のpPK4のBamH I-Xba I部位に挿入することによって、抗体アダリムマブのFab断片のH鎖(1-230C)とL鎖を共発現させるプラスミドpPKSada-FabHLおよびpPKSada-FabLHを得た。それぞれのプラスミド名中の「FabHL」および「FabLH」は、発現プラスミド中のアダリムマブのH鎖遺伝子およびL鎖遺伝子の搭載順序を示している。

（２）Cgl0858ホモログの発現を増強させたC. glutamicumを用いた抗体アダリムマブのFab(H&L)断片の分泌発現
実施例１で構築したCgl0858ホモログの発現プラスミドpVMEP1と、実施例４（１）で構築した抗体アダリムマブのFab(H&L)断片の分泌発現プラスミドpPKSada-FabHLおよびpPKSada-FabLHを用いて、参考例１で構築したYDK010ΔPBP1a株を形質転換した。得られた各形質転換体を、5 mg/lのクロラムフェニコールと25 mg/lのカナマイシンを含むMM液体培地（グルコース 120 g、硫酸マグネシウム七水和物 3 g、硫酸アンモニウム 30 g、リン酸二水素カリウム 1.5 g、硫酸鉄七水和物 0.03 g、硫酸マンガン五水和物 0.03 g、チアミン塩酸塩 450 μg、ビオチン 450 μg、DL-メチオニン 0.15 g、炭酸カルシウム 50 gを水で1LにしてpH7.0に調整）でそれぞれ30 ℃、96時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清を非還元SDS-PAGEに供してからCBB-R250（バイオラッド社製）にて染色を行い、抗体アダリムマブのFab(H&L)断片の分泌量の比較を行った。その結果、いずれの分泌発現プラスミドを用いた場合でも、pVC7を導入した対照株と比較して、pVMEP1を導入した株では、ヘテロダイマーである抗体アダリムマブのFab(H&L)断片の分泌量が有意に向上していた（図６）。このことから、トラスツズマブのFab(H&L)断片を発現させた場合に限られず、アダリムマブのFab(H&L)断片を発現させた場合でも、Cgl0858ホモログの発現を増強させることによって、抗体Fab(H&L)断片の分泌量が向上することが明らかとなった。

実施例５：Cgl0858ホモログの発現を増強させたC. glutamicum ATCC13869株における抗体トラスツズマブのFab(H&L)断片の分泌発現
実施例１で構築したCgl0858ホモログの発現プラスミドpVMEP1と、実施例２（３）で構築した抗体トラスツズマブのFab(H&L)断片の分泌発現プラスミドpPKStrast-FabH(1-229C)+Lを用いて、YDK010株（C. glutamicum AJ12036(FERM BP-734)の細胞表層タンパク質PS2(CspB)の欠損株(WO2004/029254)）の野生株であるC. glutamicum ATCC13869株を形質転換した。得られた各形質転換体を、25 mg/lのカナマイシンを含むMM液体培地（グルコース 120 g、硫酸マグネシウム七水和物 3 g、硫酸アンモニウム 30 g、リン酸二水素カリウム 1.5 g、硫酸鉄七水和物 0.03 g、硫酸マンガン五水和物 0.03 g、チアミン塩酸塩 450 μg、ビオチン 450 μg、DL-メチオニン 0.15 g、炭酸カルシウム 50 gを水で1LにしてpH7.0に調整）でそれぞれ30 ℃、96時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清を非還元SDS-PAGEに供してからSYPRO Orange（インビトロジェン社製）にて染色を行い、抗体トラスツズマブのFab(H&L)断片の分泌量の比較を行った。その結果、pVC7を導入した対照株と比較して、pVMEP1を導入した株では、ヘテロダイマーである抗体トラスツズマブのFab(H&L)断片の分泌量が有意に向上していた（図７）。このことから、野生株であるATCC13869株を発現宿主として用いた場合でも、Cgl0858ホモログの発現を増強させることによって、抗体Fab(H&L)断片の分泌量が向上した。

本発明により、多量体タンパク質を効率よく分泌生産できるコリネ型細菌を提供できる。また、本発明により提供されるコリネ型細菌を発現ホストとして用いることにより、多量体タンパク質、例えば産業上有用な多量体タンパク質、を効率よく分泌生産することができる。

〔配列表の説明〕
配列番号１、２：プライマー
配列番号３：C. glutamicum ATCC13869のCgl0858ホモログの塩基配列
配列番号４：C. glutamicum ATCC13869のCgl0858ホモログがコードするタンパク質のアミノ酸配列
配列番号５〜１８：ＶＥＧＦ−Ａ全合成用ＤＮＡの塩基配列
配列番号１９、２０：プライマー
配列番号２１：ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子の塩基配列
配列番号２２〜２５：プライマー
配列番号２６〜２９：プライマー
配列番号３０〜６３：トラスツズマブのＨ鎖全合成用ＤＮＡの塩基配列
配列番号６４、６５：プライマー
配列番号６６：トラスツズマブのＨ鎖遺伝子の塩基配列
配列番号６７〜７５：プライマー
配列番号７６〜９１：トラスツズマブのＬ鎖全合成用ＤＮＡの塩基配列
配列番号９２、９３：プライマー
配列番号９４：トラスツズマブのＬ鎖遺伝子の塩基配列
配列番号９５〜９７：プライマー
配列番号９８：C. glutamicum ATCC13032のCgl0858がコードするタンパク質のアミノ酸配列
配列番号９９：C. glutamicum ATCC13032のCgl0278の塩基配列
配列番号１００：C. glutamicum ATCC13032のCgl0278がコードするタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１０１：C. glutamicum由来PS1のシグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号１０２：C. glutamicum由来PS2（CspB）のシグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号１０３：C. ammoniagenes由来SlpA（CspA）のシグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号１０４：トラスツズマブのＨ鎖のアミノ酸配列
配列番号１０５：トラスツズマブのＬ鎖のアミノ酸配列
配列番号１０６：ＶＥＧＦ−Ａのアミノ酸配列
配列番号１０７：成熟型ＶＥＧＦ−Ａのアミノ酸配列
配列番号１０８、１０９：アダリムマブのＦａｂ（Ｈ＆Ｌ）断片発現用全合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号１１０：アダリムマブのＨ鎖遺伝子（1-230Cコード領域）の塩基配列
配列番号１１１：アダリムマブのＨ鎖（1-230C）のアミノ酸配列
配列番号１１２：アダリムマブのＬ鎖遺伝子の塩基配列
配列番号１１３：アダリムマブのＬ鎖のアミノ酸配列
配列番号１１４：C. glutamicum ATCC13869のcspB遺伝子の塩基配列
配列番号１１５：C. glutamicum ATCC13869のcspB遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列

Claims (9)

1. 多量体タンパク質を分泌生産する能力を有し、かつ、メタロペプチダーゼをコードする遺伝子の発現が、遺伝子のコピー数を高めること、及び／又は遺伝子の発現調節配列を改変することにより上昇するように改変されたコリネ型細菌であって、
   前記コリネ型細菌が多量体タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物を有し、
   前記遺伝子構築物が、コリネ型細菌で機能するプロモーター配列、該プロモーター配列の下流に接続されたコリネ型細菌で機能するシグナルペプチドをコードする核酸配列、および該シグナルペプチドをコードする核酸配列の下流に接続された前記多量体タンパク質をコードする核酸配列を含み、
   前記メタロペプチダーゼが、下記（Ａ）または（Ｂ）に示すタンパク質である、コリネ型細菌。
   （Ａ）配列番号４に示すアミノ酸を有するタンパク質、
   （Ｂ）配列番号４に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、コリネ型細菌で発現を上昇させたときに多量体タンパク質の分泌生産量を非改変株と比べて上昇させる性質を有するタンパク質。
2. さらに、ペニシリン結合タンパク質をコードする遺伝子の発現を低下させること、又は該遺伝子を破壊することにより、該ペニシリン結合タンパク質の活性が低下するように改変されている、請求項１に記載のコリネ型細菌。
3. 細胞表層タンパク質をコードする遺伝子の発現を低下させること、又は該遺伝子を破壊することにより、該細胞表層タンパク質の活性が低下しているか、あるいは、もともと前記細胞表層タンパク質を有していない、請求項１又は２に記載のコリネ型細菌。
4. 前記コリネ型細菌が、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属する細菌である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のコリネ型細菌。
5. 前記コリネ型細菌がコリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のコリネ型細菌。
6. 前記多量体タンパク質が抗体関連分子である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のコリネ型細菌。
7. 前記抗体関連分子がＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）₂、およびＦｃ融合タンパク質から選ばれる１またはそれ以上のタンパク質である、請求項６に記載のコリネ型細菌。
8. 前記多量体タンパク質が血管内皮細胞増殖因子−Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のコリネ型細菌。
9. 請求項１〜８のいずれか１項に記載のコリネ型細菌を培養し、分泌生産された多量体タンパク質を回収することを含む、多量体タンパク質の製造方法。