CN102089437B - 生产氨基羟基苯甲酸盐类化合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种通过培养具有编码经突变而消除了反馈抑制的天冬氨酸激酶,并用组入有下述DNA的重组载体转化的棒杆菌有效地产生3-氨基-4-羟基苯甲酸类化合物的方法,所述DNA编码具有从磷酸二羟丙酮和天冬氨酸半醛形成3-氨基-4-羟基苯甲酸活性的蛋白质。

Description

生产氨基羟基苯甲酸盐类化合物的方法
技术领域
本发明涉及产生氨基羟基苯甲酸类化合物的方法。更具体而言,本发明涉及方便并廉价地生产可用作染料、农药、药物和其他合成有机化合物中间体,以及用作高性能耐热聚合物聚苯并噁唑的单体的氨基羟基苯甲酸类化合物的方法。具体而言,本发明提供使用具有使用磷酸二羟丙酮和天冬氨酸半醛作为底物形成3-氨基-4-羟基苯甲酸类化合物的酶活性的棒状杆菌型细菌来产生3-氨基-4-羟基苯甲酸类化合物的方法。
本发明进一步涉及从氨基羟基苯甲酸类化合物产生聚苯并噁唑聚合物的方法。
背景技术
传统上,作为可用作染料、农药、药物和其他合成有机化合物中间物,以及聚苯并噁唑的单体的氨基羟基苯甲酸类化合物的生产方法,当所述氨基羟基苯甲酸类化合物是3-氨基-4-羟基苯甲酸类化合物时,一种已知的方法包括将作为原料的4-羟基苯甲酸或其酯用硝酸硝化以制备3-硝基-4-羟基苯甲酸或其衍生物,随后将该中间体的硝基用还原剂(如钯/碳)还原,作为磷酸盐加以分离(参见专利文献1)。此外,当使用4-卤代苯甲酸或其酯作为原料时,一种已知方法包括将其用硝酸硝化以获得3-硝基-4-氯代苯甲酸,然后用碱金属氢氧化物处理所述卤素基团以制备3-硝基-4-羟基苯甲酸,再将其还原(参见专利文献2)。
然而,在这些方法中,需要多个分离、纯化等反应步骤以避免在硝化时产生的多硝基化合物的危险性并提高产物的纯度,从而导致费用高昂。另一个问题是由于异构体的产生,产率大幅度下降。
已知氨基羟基苯甲酸类化合物产物中杂质的存在会阻碍聚合物的形成反应。
众所周知聚苯并噁唑是具有高强度的刚性聚合物,并被意图用于印刷线路板用的薄膜和半导体元件的保护薄膜。然而,产生聚苯并噁唑的常规方法使用化学催化剂,是使用危险的催化剂的剧烈反应,且并无可用的方法来廉价地产生高纯度的单体前体。这些因素导致了这些聚合物应用的滞后。
已报道了多种3-氨基-4-羟基苯甲酸的化学合成方法。合成法需要多步反应,且费用高昂,因止此并不适用。
通常,通过生物合成来生产物质与化学合成相比具有许多优点。例如,可使用廉价而可再生的原材料,且生物合成可在温和的反应条件下进行。
利用生物合成反应在微生物中产生氨基羟基苯甲酸类化合物的方法是已知的。例如,已有报道称放线菌生物合成3-氨基-4-羟基苯甲酸(参见非专利文献1)。然而,该3-氨基-4-羟基苯甲酸在弱酸性到弱碱性附近的条件下不稳定,因此很容易在培养基中氧化并二聚化,而产率变低。通过放线菌培养获得2-氨基-3-羟基苯甲酸(3-羟基邻氨基苯甲酸)也是已知的(例如,参见专利文献3)。在此情况下,2-氨基-3-羟基苯甲酸并不直接由培养产生,而是通过培养获得2,3-二羟基-3-邻氨基苯甲酸,再将其用钯/碳催化剂脱氢以产生2-氨基3-羟基苯甲酸。所用的钯/碳催化剂价格不菲,且反应高效进行需要大量催化剂。因此该方法在产业上不适用。
最近,在放线菌中发现了一种参与3-氨基-4-羟基苯甲酸生物合成的基因,且阐明了其生物合成途径。具体而言,发现了3-氨基-4-羟基苯甲酸是用磷酸二羟丙酮和天冬氨酸半醛作为底物,在GriI和GriH作用下通过两步反应而生物合成的,其中GriI是催化在具有氨基基团的C4化合物与C3或C4化合物之间发生碳-碳结合反应的酶,GriH是催化C7化合物或C8化合物脱羧同时环化的酶(非专利文献2)。还已知用组入有griI基因和griH基因的重组载体转化的一种放线菌——浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans),可产生3-氨基-4-羟基苯甲酸(参见专利文献4)。然而,尽管对产生培养基的组成和培养方法进行了研究,但其产率最高仅为5g/L培养基,就实际生产而言仍存在许多问题。所得的3-氨基-4-羟基苯甲酸产物是与其在生物合成过程中产生的乙酰基形式所成的混合物,不可避免地要进行脱乙酰处理。由于这些问题,还不能说有效的通过生物合成的产生方法已经确立。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:特许第3354568号
专利文献2:特公平8-11745号公报
专利文献3:特开平7-309946号公报
专利文献4:特开2004-283163号公报
非专利文献
非专利文献1:YongfuLi等,Tetrahedron Letters,41,p5181-5185(2000)
非专利文献2:J.Biol.Chem.,281,48,36944-36951,2006.
发明内容
本发明需要解决的问题
本发明是考虑了常规技术的实际现状而作出的,且本发明的目标是提供一种方便而廉价地生产氨基羟基苯甲酸类化合物,如3-氨基-4-羟基苯甲酸的方法。
解决问题的手段
本发明人以解决上述问题为主要目的进行了深入研究。结果,本发明人发现了通过培养具有编码消除了反馈抑制的突变型天冬氨酸激酶的基因、并且用组入有griI和griH基因的重组载体所转化过的棒状杆菌型细菌,来大量生产未乙酰化的3-氨基-4-羟基苯甲酸的方法,从而完成了本发明。
即,本发明提供下述发明:
1.一种生产3-氨基-4-羟基苯甲酸类化合物的方法,该方法包括培养具有编码消除了反馈抑制的突变型天冬氨酸激酶的基因、且用组入有编码具有从磷酸二羟丙酮和天冬氨酸半醛形成3-氨基-4-羟基苯甲酸的活性的蛋白质的DNA的重组载体转化过的棒状杆菌型细菌。
2.依照(1)的方法,其中所述棒状杆菌型细菌是增强了编码突变天冬氨酸激酶的基因的表达的棒状杆菌型细菌。
3.依照(1)或2的方法,其中所述棒状杆菌型细菌是增强了丙酮酸羧化酶基因表达的棒状杆菌型细菌。
4.依照(1)-(3)任一项所述的方法,其中所述DNA包含griI基因和griH基因。
5.依照(1)-(4)任一项所述的方法,其中所述griI基因和griH基因来源于放线菌。
6.依照(1)-(5)任一项所述的方法,其中所述棒状杆菌型细菌是谷氨酸棒杆菌。
7.一种生产聚苯并噁唑聚合物的方法,该方法包括使通过(1)-(6)任一项所述的方法生产的3-氨基-4-羟基苯甲酸类化合物聚合。
附图简述
图1是显示griI基因同源物和共有序列的图。
图2是显示griI基因同源物和共有序列比对的图(续)。
图3是显示griH基因同源物和共有序列的图。
图4是显示griH基因同源物和共有序列比对的图(续)。
图5是显示由谷氨酸棒杆菌产生3-氨基-4-羟基苯甲酸的图。
具体实施方式
下文将详细描述本发明。
本发明涉及通过培养用组入有下述DNA的重组载体转化过的棒状杆菌型细菌来生产3-氨基-4-羟基苯甲酸类化合物的方法,所述DNA编码具有从磷酸二羟丙酮和天冬氨酸半醛形成3-氨基-4-羟基苯甲酸的活性的蛋白质。
3-氨基-4-羟基苯甲酸类化合物在本发明中包括具有下述结构的3-氨基-4-羟基苯甲酸(在下文中有时简称“3,4-AHBA”),及其衍生物和其盐。
所述衍生物包括,例如,通过将3-氨基-4-羟基苯甲酸中的羧基基团醛化而获得的3-氨基-4-羟基苯甲醛等。所述盐包括羧酸的碱式盐,如碱金属(钠、钾和锂)盐和碱土金属(钙和镁)盐,以及酸加成盐,如盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐和磷酸盐。
<1>编码具有形成3-氨基-4-羟基苯甲酸类化合物的活性的蛋白质的DNA
用于本发明的DNA包括参与3-氨基-4-羟基苯甲酸类化合物生物合成的基因。换言之,所述DNA包括具有恢复、赋予、促进或调节所述3-氨基-4-羟基苯甲酸类化合物生物合成的功能的基因。
具体而言,用于本发明的DNA包括编码具有从磷酸二羟丙酮和天冬氨酸半醛形成3-氨基-4-羟基苯甲酸类化合物的活性(在下文中有时也称作“3,4-AHBA形成活性”)的蛋白质的DNA。所述DNA包括编码具有催化磷酸二羟丙酮和天冬氨酸半醛之间形成碳-碳键的酶活性的蛋白质的基因,以及编码具有催化由磷酸二羟丙酮和天冬氨酸半醛之间形成碳-碳键而获得的C7化合物发生环化的酶活性的蛋白质的基因(参见专利文献4)。在下文中,这两种酶的活性有时统称为3,4-AHBA生物合成能力。
编码催化磷酸二羟丙酮和天冬氨酸半醛之间碳-碳键形成的酶活性的基因包括来源于灰色链霉菌(Streptomyces griseus)的griI基因(SEQ ID NO:8和9),以及griI基因同源物。griI基因同源物是指来源于其他微生物,与上述来源于灰色链霉菌的基因具有高同源性,并编码具有相同酶活性的蛋白质的基因。上述具有高同源性的基因可通过使用SEQ ID NO:8和9进行Blast检索来检索。举例而言,所述基因可包括来源于弗兰克氏菌属菌种(Frankia sp.)的果糖二磷酸醛缩酶基因(登录号YP_483282,SEQ ID NOS:10和11),来源于弗兰克氏菌属菌种的果糖二磷酸醛缩酶基因(登录号YP_481172,SEQ IDNOS:12和13),来源于疮痂链霉菌(Streptomyces scabies)的果糖二磷酸醛缩酶基因(http://www.sanger.ac.uk/cgi-bin/blast/submitblast/s_scabies,SEO IDNOS:14和15),来源于伯克霍尔德氏菌菌种(Burkholderia sp.)383的果糖二磷酸醛缩酶基因(登录号Q39NQ9,SEQ ID NOS:和17),来自詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)的果糖二磷酸醛缩酶基因(登录号NP_247374,SEQ ID NOS:18和19),以及来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的dhnA基因(登录号NC_000913,SEQ ID NOS:20和21)(Journal of Biochemistry vol.281,NO.48,pp.36944-36951,补充数据)。
编码具有催化通过在磷酸二羟丙酮和天冬氨酸半醛之间形成碳-碳键而获得的C7化合物发生环化的酶活性的蛋白质的基因包括来源于灰色链霉菌的griH基因(SEQ ID NOS:22和23)以及griH基因同源物。griH基因同源物是指来源于其他微生物,与上述来源于灰色链霉菌的基因具有高同源性,并编码具有相同酶活性的蛋白质的基因。上述具有高同源性基因可通过使用SEQ ID NOS:22和23的序列进行Blast检索来检索。举例而言,所述基因可包括来源于弗兰克氏菌属菌种的3-脱氢奎宁酸合酶(3-dehydroquinate synthase)基因(登录号YP_483283,SEQ ID NOS:24和25),来源于弗兰克氏菌属的3-脱氢奎宁酸合酶基因(登录号YP_481171,SEQ ID NOS:26和27),来源于伯克霍尔德氏菌属菌种的3-脱氢奎宁酸合酶基因(登录号YP_366552,SEQ ID NOS:28和29),来源于伯克霍尔德氏菌属菌种的3-脱氢奎宁酸合酶基因(登录号YP_366553,SEQ ID NOS:30和31),来源于疮痂链霉菌的3-脱氢奎宁酸合酶基因(http://www.sanger.ac.uk/cgi-bin/blast/submitblast/s_scabi es,SEQ ID NOS:32和33),以及来源于詹氏甲烷球菌的3-脱氢奎宁酸合酶基因(登录号NP_248244,SEQ ID NOS:34和35)(Journal of Biochemistryvol.281,NO.48,pp.36944-36951,补充数据)。
此外,griI基因同源物包括与SEQ ID NO:9、11、13、15、17、19或21的氨基酸序列具有90%或更高,优选95%或更高,更优选98%或更高,特别优选99%或更高的同源性,并编码具有前述酶活性的蛋白质者。griI基因同源物包括与SEQ ID NO:23、25、27、29、31、33或35的氨基酸序列具有90%或更高,优选95%或更高,更优选98%或更高,特别优选99%或更高的同源性,并编码具有前述酶活性的蛋白质者。氨基酸序列和核苷酸序列的同源性可使用,例如,由Karlin和Altschul的算法BLAST(Pro.Natl.Acad.Sci.USA,90,5873(1993))或FASTA(Methods Enzymol.,183,63(1990))来确定。基于该算法BLAST,已经开发了称作BLASTIN和BLASTX的程序(参见<http://www.ncbi.nlm.nih.govbi.nlm.nih.gov>)。
SEQ ID NO:9、11、13、15、17、19和21的氨基酸序列的比对示于图1和2,而SEQ ID NO:23、25、27、29、31、33和35的氨基酸序列的比对示于图3和4。此外,其共同序列示于SEQ ID NO:36和37。上述griI基因同源物包括编码SEQ ID NO:36氨基酸序列的基因,且所述griH基因同源物包括编码SEQ ID NO:37氨基酸序列的基因。
如上所述,已经知晓了griI基因和griH基因的数种序列,因此可使用基于其核苷酸序列而制备的引物来获得griI基因和griH基因。举例而言,通过PCR方法(PCR:聚合酶链式反应,参见White,T.J.等,Trends Genet.5,185(1989)),以灰色链霉菌的染色体DNA作为模板,使用示于SEQ ID NOS:1和2的引物,可同时获得来源于灰色链霉菌的griI和griH的编码区及其两侧区域,包括其调节区。灰色链霉菌的具体实例包括IFO13350(NRBC13350)菌株。该菌株可从Biological Resource Center,National Institute of Technologyand Evaluation(http://www.nbrc.nite.go.jp/e/gene-e.html)获得。可类似地获得来源于其他微生物的griI或griH的同源物。
取决于微生物的菌种和菌株,griI具有或griH基因的核苷酸序列可以有所不同。用于获得本发明方法使用的棒状杆菌型细菌的griI基因和griH基因并不分别限于SEQ ID NO:9、11、13、15、17、19或21和SEQ ID NO:23、25、27、29、31、33或35氨基酸序列的编码基因。只要在棒状杆菌型细菌中通过共表达所述基因,优选提高所述基因的表达,能够改善产生3,4-AHBA的能力,则所述基因可为编码具有分别在SEQ ID NO:9、11、13、15、17、19或21和SEQ ID NO:23、25、27、29、31、33或35的氨基酸序列中一个或多个位置上取代、缺失、插入或添加一个或几个氨基酸而成的序列的蛋白质的突变型基因或人工修饰型基因。在此,“几个氨基酸”中的“几个”因蛋白质三维结构中氨基酸残基的位置和种类不同而有所不同,优选1到50个,更优选1到20个,还更优选1到10个,特别优选1到5个氨基酸。上述取代、缺失、插入、添加或倒位包括天然出现的突变体或变体,例如,由于携带griI基因或griH基因的微生物个体差异或种间差异而产生的那些突变体或变体。
上述取代优选为保守取代,即不发生功能性改变的中性突变。当需取代的氨基酸为芳族氨基酸时,所述保守取代为Phe、Trp和Try之间的取代。当需取代的氨基酸为疏水氨基酸时,所述保守取代为Leu、Ile和Val之间的取代。当需取代的氨基酸为极性氨基酸时,所述保守取代为Gln和Asn之间的取代。当需取代的氨基酸为碱性氨基酸时,所述保守取代为Lys、Arg和His之间的取代。当需取代的氨基酸为酸性氨基酸时,所述保守取代为Asp和Glu之间的取代。而当需取代的氨基酸为带羟基的氨基酸时,所述保守取代为Ser和Thr之间的取代。更具体而言,所述保守取代包括从Ala到Ser或Thr的取代,从Arg到Gln、His或Lys的取代,从Asn到Glu、Gln、Lys、His或Asp的取代,从Asp到Asn、Glu或Gln的取代,从Cys到Ser或Ala的取代,从Gln到Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg的取代,从Glu到Gly、Asn、Gln、Lys或Asp的取代、从Gly到Pro的取代,从His到Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr的取代,从Ile到Leu、Met、Val或Phe的取代,从Lys到Asn、Glu、Gln、His或Arg的取代,从Met到Ile、Leu、Val或Phe的取代,从Phe到Trp、Tyr、Met、Ile或Leu的取代,从Ser到Thr或Ala的取代,从Thr到Ser或Ala的取代,从Trp到Phe或Tyr的取代,从Tyr到His、Phe或Trp的取代和从Val到Met、Ile或Leu的取代。
此外,由于遗传密码的简并性取决于griI基因和griH基因引入的宿主而有所不同,可以通过替换密码子使其能够在引入griI基因和griH基因的宿主中方便地应用。同样,只要所述griI基因和griH基因在棒状杆菌型细菌中具有通过增强两种基因的表达而促进3,4-AHBA产生的活性的功能,这些基因可编码在N端侧或C端侧有延伸或缺失的蛋白质。举例而言,延伸或缺失的氨基酸残基的长度为50个或更少、优选20个或更少、更优选10个或更少,最优选5个或更少氨基酸的长度。更优选地,所述griI基因和griH基因可以是这样的基因,其编码从N端起延伸或缺失50到5个氨基酸或从C端起延伸或缺失由5到50个氨基酸的蛋白质。
上述与griI和griH基因同源的基因可通过借助定位诱变修饰编码SEQID NO:9、11、13、15、17、19或21和SEQ ID NO:23、25、27、29、31、33或35的氨基酸序列的基因,使得在所编码的蛋白质的特定位置包含取代、缺失、插入或添加而获得。所述同源基因还可通过通常已知的诱变处理来获得。所述诱变处理包括用羟胺等在体外处理griI基因或griH基因的方法,和用诱变剂处理携带所述基因的微生物(例如棒状杆菌型细菌)的方法,所述诱变剂如通常用于诱变处理的紫外线、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或甲磺酸乙酯(EMS))。此外,编码所述具有高活性酶的基因还可通过使用易错PCR(Cadwell,R.C.PCR Meth.Appl.2,28(1992))、DNA改组(Stemmer,W.P.Nature 370,389(1994))或StEP-PCR(Zhao,H.Nature Biotechnol.16,258(1998))通过基因重组将所述突变人工引入griI基因或griH基因来获取。
所述griI基因和griH基因还包括在严格条件下与互补于SEQ ID No:8、10、12、14、16、18或20和SEQ ID NO:22、24、26、28、30、32或34的核苷酸序列、或者可从上述序列制备的探针杂交,并编码具有在棒状杆菌型细菌中通过表达该两个基因而促进3,4-AHBA生物合成的能力的蛋白质的DNA。在此,“严格条件”指所谓特异性杂合体形成但非特异性杂合体不形成的条件。举例而言,其实例包括这样的条件,在此条件下成对的具有高同源性的DNA,例如,具有80%或更高,优选90%或更高,更优选95%或更高,特别优选97%或更高同源性的DNA之间发生杂交,而同源性较上述为低的DNA不杂交;或者这样的条件:在通常的Southern的洗涤条件(即,在等同于1x SSC和0.1%SDS在60℃,优选0.1x SSC和0.1%SDS在60℃,且更优选0.1x SSC和0.1SDS在68℃的盐浓度)下洗涤一次,优选两次到三次。
作为探针,可使用互补于SEQ ID No:8、10、12、14、16、18或20,或者SEQ ID NO:22、24、26、28、30、32或34的核苷酸序列的部分序列。这样的探针可用包含该序列的DNA片段作为模板,使用基于这些核苷酸序列制备的寡核苷酸作为引物进行PCR来制备。举例而言,当长度约300bp的DNA片段用作探针时,杂交的洗涤条件包括在50℃用2×SSC和0.1%SDS的条件。
关于上述基因同源物和保守突变的描述同样也适用于其他本文描述的基因。
这些griI和griH同源基因是否编码促进产生3,4-AHBA能力的蛋白质,可通过将这些基因引入具有突变而消除了反馈抑制的天冬氨酸激酶编码基因的棒状杆菌型细菌(例如,甘氨酸棒状菌AJ110135菌株,见特开2004-261150号公报),并检查形成3,4-AHBA的能力是否得到促进来验证。在此情况下,通过根据Suzuki等的方法(J.Bio.Chem.,281,823-833(2006))使用反相色谱对3,4-AHBA定量可明确地验证其效果。
<2>重组载体
用于本发明的重组载体可通过将用于本发明的DNA引入作为表达载体的质粒来获得。可包含于用于本发明使用的DNA中的griI和griH可携带在不同的重组载体上用于转化,或可通过合适的间隔物(spacer)连接并携带在同一个重组载体上用于转化,只要它们以可表达的状态包含于转化体中。griI和griH可为来源于同一微生物的基因或可为来源于不同类型微生物的基因。当griI和griH是来源于同一微生物的基因,并在染色体上的位置彼此接近时,可将包含griI和griH两者的部分DNA切出并携带于所述载体。
用于本发明的重组载体通常具有:启动子;前述本发明的DNA,例如,griI和griH;以及需用于在棒状杆菌型细菌中表达所述基因的调节区(操纵子和终止子),它们处于合适的位置使得它们能够起作用。
可用作重组载体的表达载体并无特别的限制,可以是能在棒状杆菌型细菌中起作用的载体。其可在染色体外独立复制,如质粒,或可整合入细菌染色体。来源于棒状杆菌型细菌的质粒是特别优选的。这样的质粒包括,例如,pHM1519(Agric,Biol.Chem.,48,2901-2903(1984),pAM330(Agric,Biol.Chem.,48,2901-2903(1984))和对它们改良而得到的具有抗药性基因的质粒。
可用于本发明的启动子并无特别的限制,通常可使用能在棒状杆菌型细菌的微生物细胞中起作用的启动子。所述启动子可为来源于其他菌种的启动子,例如,来源于大肠杆菌的启动子,如tac启动子。
来源于棒状杆菌型细菌的启动子包括编码细胞表层蛋白PS1、PS2和SlpA的基因的启动子,以及各种氨基酸生物合成系统中的基因的启动子。
<3>转化体
用于本发明的棒状杆菌型细菌并无特别的限制,只要该棒状杆菌型细菌具有编码消除了反馈抑制的突变型天冬氨酸激酶的基因,并且通过用组入有编码具有从磷酸二羟丙酮和天冬氨酸半醛形成3-氨基-4-羟基苯甲酸类化合物的活性的蛋白质的重组载体转化该细菌,可赋予其产生3-氨基-4-羟基苯甲酸的能力。作为亲本株的棒状杆菌型细菌包括通常归类为短杆菌属(Brevibacterium)但现在整合入棒杆菌属(Corynebacterium)的细菌(Int.J.Syst.Bacteriol.,41,255(1991)),以及属于与棒杆菌属非常接近的短杆菌属的细菌。具体而言,可举出以下为例:
嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidfilum)
醋谷棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)
Corynebacterium alkanoliticum
美棒杆菌(Corynebacterium callunae)
谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)
百合花棒杆菌(Corynebacterium lilium)(谷氨酸棒杆菌)
栖糖蜜棒杆菌(Corynebacterium melasecola)
嗜热产氨棒杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)
力士棒杆菌(Corynebacterium herculis)
二歧短杆菌(Brevibacterium divaricatum)(谷氨酸棒杆菌)
黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)(谷氨酸棒杆菌)
Brevibacterium immariophilum
乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)(谷氨酸棒杆菌)
玫瑰色短杆菌(Brevibacterium roseum)
解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolticum)
生硫短杆菌(Brevibacterium thiogenitalis)
白色短杆菌(Brevibacterium album)
蜡状短杆菌(Brevibacterium selinum)和
嗜氨微杆菌(Microbacterium ammoniaphilum)
作为亲本株的棒状杆菌型细菌优选为这样的细菌菌株,其可高效地供应作为3-氨基-4-羟基苯甲酸类化合物的生物合成底物的磷酸二羟丙酮和天冬氨酸半醛。棒状杆菌型细菌中的天冬氨酸激酶本来受赖氨酸和苏氨酸的协同反馈抑制,特别优选具有突变而基本上消除所述反馈抑制的天冬氨酸半醛激酶的棒状杆菌型细菌。
棒状杆菌型细菌中的天冬氨酸激酶是由α-亚基和β-亚基组成的异质蛋白(heteroprotein),α-亚基和β-亚基的编码区在基因上部分重叠。来源于谷氨酸棒杆菌(乳发酵短杆菌)ATCC13869的野生型天冬氨酸激酶α-亚基序列示于SEQ ID NO:38。通过引入从N端起279位的丙氨酸残基由苏氨酸残基取代的突变,或从N端起311位的苏氨酸残基由异亮氨酸残基取代的突变,或从N端起301位的丝氨酸残基由酪氨酸残基取代的突变,或从N端起380位的苏氨酸残基由异亮氨酸残基取代的突变,或从N端起308位的苏氨酸残基由异亮氨酸残基取代的突变,或从N端起320位的精氨酸残基由甘氨酸残基取代,或从N端起345位的甘氨酸残基由天冬氨酸残基取代的突变(WO94/25605公开小册子、WO00/63388公开小册子、美国专利6,844,176号、WO01/049854公开小册子等)消除对天冬氨酸激酶反馈抑制。野生型的天冬氨酸激酶甚至还可以是等位变体,其中取决于天冬氨酸激酶所来源的棒状杆菌型细菌种类和菌株的不同,与示于SEQ ID NO:38的序列相比具有几个氨基酸残基的差异。这样的突变的定义与前述对于griI和griH的定义相同。可通过进行本领域技术人员公知的序列比对来鉴定消除所述反馈抑制所需要修饰的位点。消除所述对天冬氨酸激酶反馈抑制的修饰可通过本领域技术人员公知的方法实现,例如,获得对赖氨酸类似物(如2-氨基乙基半胱氨酸)具有抗性的突变体菌株并利用同源重组通过基因替换进行定点诱变。具有经突变而消除反馈抑制的天冬氨酸激酶活性增强的棒状杆菌型细菌可通过用包含所述经突变而消除反馈抑制的天冬氨酸激酶的编码基因的质粒转化所述棒状杆菌型细菌而获得。在实施例中,使用具有下述天冬氨酸激酶的谷氨酸棒杆菌AJ110135菌株(特开2004-261150号公报),其中通过将天冬氨酸激酶中从N端起第279位的丙氨酸残基取代为苏氨酸残基而消除了所述反馈抑制。所述AJ110135缺失了编码赖氨酸通透酶(lysine permease)的基因lysI。
所述具有经突变而消除了反馈抑制的天冬氨酸激酶的棒状杆菌型细菌可以是进一步增强了丙酮酸羧化酶基因表达的棒状杆菌型细菌。
作为亲本株的棒状杆菌型细菌可使用任何菌株,只要该菌株可有效地供应磷酸二羟丙酮和天冬氨酸半醛。
可以依照本领域公知的方法用组入有编码具有从磷酸二羟丙酮和天冬氨酸半醛形成3-氨基-4-羟基苯甲酸活性的蛋白质的DNA的重组载体来转化棒状杆菌型细菌。举例而言,可使用原生质体方法(Gene,39,281-286(1985)),电穿孔方法(Bio/Technology,7,1067-1070(1989))等。当进行消除对天冬氨酸激酶的反馈抑制的转化时,赋予形成3,4-AHBA的转化和消除对天冬氨酸激酶的抑制的转化二者谁先进行都是可以的。
<4>生产3-氨基-4-羟基苯甲酸类化合物的方法
所述3-氨基-4-羟基苯甲酸类化合物可通过培养上述获得的棒状杆菌型细菌转化体并回收在培养基中产生的3-氨基-4-羟基苯甲酸类化合物来产生。
培养所述转化体的培养基并无特别的限制,只要宿主细胞生长即可;所述转化体可根据本领域公知的方法培养。举例而言,转化体可在包含碳源、单元和无机离子的常规培养基中培养。如有需要,可添加有机微量营养物如维生素和氨基酸以获得高增殖。培养温度通常为25-34℃,最好控制pH于6.5-7.5。培养时间通常为20-90小时。
需要在控制氧供应的条件下进行所述转化体的培养。具体而言,当细菌生长变为对数生长期时,最好保持氧为2.0ppm或更少。
从培养基中回收和纯化3-氨基-4-羟基苯甲酸类化合物的步骤中使用的回收方法可从公知方法中适当选取。举例而言,优选将培养基pH调整为所述3-氨基-4-羟基苯甲酸类化合物具有高溶解度的酸性pH,然后通过离心或膜过滤去除微生物细胞,从所得培养基上清进行回收。从去除了微生物细胞的培养基上清回收3-氨基-4-羟基苯甲酸的方法可包括:利用多孔吸附剂纯化、结晶、和沉淀。
用于本发明的多孔吸附剂是具有大表面积的多孔固体吸附剂,并具体包括亲水吸附剂,典型地如硅胶、矾土、沸石、铁矾土(bauxite)、氧化镁(magnesia)、活性白土(activated white earth)和丙烯酸合成吸附剂,以及疏水吸附剂,典型地如木炭(vegetable charcoal)、骨炭(bone charcoal)、活性炭和芳族合成吸附剂。在本发明中,可使用任何吸附剂,而无特别的限制,只要通过吸附杂质可提高3-氨基-4-羟基苯甲酸类化合物的纯度即可。然而,对于这一点,被所述多孔吸附剂吸收的杂质含有大量主要在生物化学合成过程中产生的芳族化合物。因此,可容易地吸附这些化合物的疏水吸附剂,典型地如活性炭和芳族合成吸附剂,适用于本发明。这些疏水吸附剂可单独使用,或两种或更多种组合使用。
当使用活性炭时,其原材料并无特别的限制,可包括但不仅限于,植物原材料如木粉(vegetable powder)和椰子壳(palm shell),基于煤/石油的原材料如无烟煤、石油沥青和焦炭,基于合成树脂的原材料如丙烯酸树脂、酚树脂、环氧树脂和聚酯树脂。所述活性炭的形状包括粉状、粒状和纤维状,以及二次加工所得的制品,如过滤器和筒(cartridge)状等,可适当选择容易操作者。
同时,当使用芳族合成吸附剂时,其原材料并无特别的限制,例如,可使用多孔树脂,如1)未取代的芳族树脂,2)具有疏水取代基的芳族树脂,和3)通过对未取代的芳族树脂进行特别处理所得的芳族树脂。具体的化合物可包括,例如,基于苯乙烯和二乙烯基苯的树脂。
如上所述,使培养基中的3-氨基-4-羟基苯甲酸类化合物与多孔吸附剂相接触的目的,是使杂质吸附至所述多孔吸附剂以提高所述3-氨基-4-羟基苯甲酸类化合物的纯度。然而,在一些情况下,作为目标产物的3-氨基-4-羟基苯甲酸也有不少与杂质一起被吸附到所述多孔吸附剂。因此,也可通过使培养基中的3-氨基-4-羟基苯甲酸类化合物与多孔吸附剂相接触,然后使所述多孔吸附剂与极性有机溶剂相接触以将所述3-氨基-4-羟基苯甲酸类化合物解离并溶解至极性有机溶剂中,来分离并回收所述3-氨基-4-羟基苯甲酸类化合物。用于本发明的极性有机溶剂指由具有高介电常数的极性分子组成的有机溶剂,且其使用并无特别的限制,只要所述3-氨基-4-羟基苯甲酸可从所述多孔吸附剂上解离,并所述3-氨基-4-羟基苯甲酸类化合物可溶解于所述极性有机溶剂。所述极性有机溶剂可单独使用或以所需的比例两种或更多种组合使用。
本发明中结晶或沉淀指通过将溶解了目标物质的溶剂蒸发浓缩,或降低温度,或向溶解了目标物质的溶剂添加不良溶剂,使得浓度高于饱和溶解度以产生结晶或沉淀的操作,且没有特别的限制,包括常规的和公知的方法。产生的晶体或沉淀可通过沉淀、过滤、离心等进行分离。
供在本发明中产生聚苯并噁唑聚合物的方法,是包括使由前述本发明方法获得的3-氨基-4-羟基苯甲酸类化合物聚合的步骤的生产方法。对于如上所述从本发明的棒状杆菌型细菌的培养基中使用多孔吸附剂或通过结晶、沉淀等提高了纯度的3-氨基-4-羟基苯甲酸类化合物,通过在非氧化性溶剂酸(如甲磺酸或聚磷酸)中高温下的缩合聚合来进行聚合(参见专利文献1)。聚合的方法通过应用多种公知方法加以实施(美国专利5,142,021号,美国专利5,219,981号和美国专利5,422,416号)。
实施例
在下文中,将更加具体地描述本发明。
[实施例1]用于表达来源于灰色链霉菌IFO13350的3,4-AHBA合成酶基因的质粒的构建
(1)来源于灰色链霉菌IFO13350的3,4-AHBA合成酶基因的获得。
已经确定了来源于灰色链霉菌IFO13350的griI和griH基因的序列(在下文中,两个基因一起称作3,4-AHBA合成酶基因)(J.Bio.Chem.,281,823-833(2006))。参照该序列合成示于SEQ ID NOS:1和2的引物,并从根据标准方法制备灰色链霉菌IFO13350染色体DNA通过PCR扩增了编码3,4-AHBA基因序列的区域(Saito和Miura的方法[Biochem.Biophys.Acta.,72,619(1963)])。PCR使用Pyrobest DNA聚合酶(由Takara Shuzo Co.,Ltd.提供),反应在生产商推荐的实验方法的条件下进行。
其结果,通过PCR扩增获得了约2.1kb的片段。确定了该片段的核苷酸序列,且确证了该片段是包含所述griH基因的片段。核苷酸序列的测定使用Dye Terminator Cycle Sequencing Kit(由PE Applied Biosystems供应)和DNA测序仪373A(由PE Applied Biosystems供应)。gri IH基因的序列示于SEQ ID NO:7。
(2)3,4-AHBA合成酶基因的启动子区的转换。
需要在棒状杆菌型细菌中有效地表达来源于灰色链霉菌IFO13350的3,4-AHBA合成酶基因。因此,将来自谷氨酸棒杆菌PS2编码基因的启动子引入所述gri IH基因的上游。PS2是谷氨酸棒杆菌中的一种细胞表层蛋白,其编码基因的序列已经确定(Mol.Microbiol.,9,97-109(1993))。参照该序列合成了示于SEQ ID NOS:3和4的引物,并从谷氨酸棒杆菌ATCC13869的染色体DNA通过PCR扩增包括位于所述PS2蛋白的基因起始密码子5’上游区域的启动子在内的区域。PCR使用Pyrobest DNA聚合酶(由Takara Shuzo Co.,Ltd.提供),反应在生产商推荐的实验方法的条件下进行。
结果,通过PCR扩增获得了约0.5kb的片段。确定了该片段的核苷酸序列,且确证了该片段包括含有所述PS2蛋白的基因起始密码子5’上游区中的启动子的区域。核苷酸序列是根据前述方法确定的。
示于SEQ ID NO:6的引物是基于实施例1(1)中确定的griH基因的序列而合成的,示于SEQ ID NO:5的引物是基于含有所述PS2蛋白的基因的起始密码子5’上游区启动子的区域的核苷酸序列合成的。示于SEQ ID NOS:5和6的引物是KpnI的盒引物(cassette primer)
接着,将包含来自谷氨酸棒杆菌ATCC13869的PS2基因启动子的区域的扩增片段与1μL gri IH基因区的扩增片段的PCR溶液混合用作模板。使用SEQ ID NOS:5和6的引物进行交换PCR(crossover PCR)以扩增与包含来自谷氨酸棒杆菌ATCC13869的细胞表层蛋白基因的启动子的区域连接的融合gri IH基因。在琼脂糖胶电泳上确定了约2.6kb的扩增片段。使用EASYTRAPVer.2(由Takara Shuzo Co.,Ltd.供应)从所述琼脂糖胶回收该片段,并插入质粒pPK4(特开平9-322774-A中记载)中的KpnI位点,以构建质粒pPK4griIH。根据前述方法确定插入片段的核苷酸序列,确证融合基因的构建一如预期。
[实施例2]使用编码来源于灰色链霉菌IFO13350的gri IH基因的融合基因,通过谷氨酸棒杆菌产生3,4-AHBA
(1)使用编码来源于灰色链霉菌IFO13350的griIH基因的融合基因转化谷氨酸棒杆菌
用实施例1中构建的质粒pPK4griIH转化谷氨酸棒杆菌野生型、谷氨酸棒杆菌ATCC13869或谷氨酸棒杆菌AJ110135(启动子来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13869的PS基因,而griH基因来源于灰色链霉菌IFO13350)。将生长的细菌菌株在包含25mg/L卡那霉素的CM2G琼脂培养基(酵母提取物10g,胰蛋白胨10g,葡萄糖5g,NaCl 5g以及琼脂15g配于1L水中,然后在120℃灭菌20分钟)上进行选择。在谷氨酸棒杆菌AJ110135菌株中,通过如特开2004-261150所述引入将279位的丙氨酸残基用苏氨酸残基取代的突变使天冬氨酸激酶脱敏,并缺失了赖氨酸通透酶。该细菌菌株可从谷氨酸棒杆菌ATCC13869通过描述于特开2004-261150中的方法来构建。
(2)使用烧瓶通过谷氨酸棒杆菌生产3,4-AHBA
将在实施例2(1)中选择的具有pPK4griIH的谷氨酸棒杆菌ATCC13869或具有pPK4griIH的谷氨酸棒杆菌AJ110135在烧瓶评价培养基(100g葡萄糖,1g七水合硫酸镁,55g硫酸铵,1g磷酸二氢钾,0.01g七水合硫酸铁,0.01g五水合硫酸锰,2mg硫胺素盐酸盐,0.5mg生物素,5mg烟酰胺,1.05g大豆浓缩物(水解的大豆蛋白,基于总氮量)和50g碳酸钙在1L水中调为pH7.2,并在115℃灭菌15分钟)中在30℃以120rpm培养71小时。作为对照实验,还培养了未引入pPK4griIH的谷氨酸棒杆菌ATCC13869。当培养具有pPK4griIH的谷氨酸棒杆菌ATCC13869菌落或具有pPK4griIH的谷氨酸棒杆菌AJ110135的菌落时,将卡那霉素以终浓度25mg/L添加至所述烧瓶评价培养基。在培养71小时后,在所有条件下葡萄糖已经完全耗尽。具有pPK4griIH的谷氨酸棒杆菌ATCC13869和具有pPK4griIH的谷氨酸棒杆菌AJ110135分别积累了0.7g/L和1.4g/L的3,4-AHBA(表1)。同时,不具有pPK4griIH的谷氨酸棒杆菌ATCC13869未产生3,4-AHBA。3,4-AHBA根据Suzuki等的方法(J.Bio.Chem.,281,823-833(2006))使用反相色谱来定量。上述结果显示3,4-AHBA可通过将来源于灰色链霉菌IFO13350的griIH基因引入谷氨酸棒杆菌来产生。与野生型谷氨酸棒杆菌相比,具有消除了反馈抑制的突变型天冬氨酸激酶的谷氨酸棒杆菌AJ110135由于引入了pPK4griIH而积累了更多的3,4-AHBA。
表1
(3)使用小型发酵罐通过谷氨酸棒杆菌产生3,4-AHBA
下述实验使用实施例2(1)中得到的具有pPK4griIH的谷氨酸棒杆菌AJ110135来进行。
将每个坂口烧瓶分配50mL由5g葡萄糖,10g聚胨,10g酵母提取物,5gNaCl,0.2gDL-甲硫氨酸和1000mL蒸馏水(pH7.2)制成的培养基,然后在120℃灭菌20分钟。将具有pPK4griIH的谷氨酸棒杆菌AJ110135接种于该培养基,并在30℃振荡培养24小时。
由40g葡萄糖,0.4g七水合硫酸镁和100mL蒸馏水制成的培养基A,和由1.2g硫酸铵,0.4g磷酸二氢钾,4mg七水合硫酸铁,4mg五水合硫酸锰,800μg硫胺素盐酸盐,20μg生物素,200μg烟酰胺,0.42g大豆浓缩物(水解的大豆蛋白,基于总氮量),40μL GD-113K和260mL蒸馏水制成的培养基B在120℃灭菌20分钟。将经灭菌的培养基A和培养基B置于同样在120℃灭菌了20分钟的1.5L小型发酵罐中并混合,并以终浓度25mg/L添加卡那霉素。将40mL经上述培养的培养基接种在该混合培养基中,并以下述条件进行培养。即在以0.5vvm的速率供应空气的同时,在30℃、pH7.2、以600rpm搅拌、恒定供氧控制条件下进行培养管理。当混合培养基中的葡萄糖几乎完全耗尽时,开始添加70%葡萄糖溶液,并手动控制流速使得葡萄糖浓度为10g/L至30g/L。当大约添加了180mL的70%葡萄糖溶液时,停止添加。从所述培养基适当地等分取样。将等分试样用0.1N HCl稀释100倍,并离心(14000rpm,5分钟,4℃)以得到培养上清。根据实施例2(2)中的方法分析培养上清中3,4-AHBA的浓度。结果,在具有pPK4griIH的谷氨酸棒杆菌AJ110135培养87小时获得的组织上清中,积聚了约17.7g/L的3,4-AHBA(图5)。
[实施例3]消除了反馈抑制的突变型天冬氨酸激酶基因的表达增强,或丙酮酸羧化酶基因表达增强对谷氨酸棒杆菌AJ110135中3,4-AHBA形成的促进作用的确认
(1)表达来源于谷氨酸棒杆菌AJ110135的消除了反馈抑制的突变型天冬氨酸激酶基因的质粒的构建
已经确定了来源于谷氨酸棒杆菌AJ110135的消除了反馈抑制的突变型天冬氨酸激酶基因的序列(在下文中称作AKfbr),且阐明了其突变位点(特开2004-261150)。参照该序列合成了示于SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40的引物,并从根据标准方法制备的谷氨酸棒杆菌AJ110135的染色体DNA通过PCR扩增了包含所述AKfbr基因起始密码子5’上游区中的启动子的区域。PCR使用Pyrobest DNA聚合酶(由Takara Shuzo Co.,Ltd.提供),反应在生产商推荐的实验方法的条件下进行。
其结果,通过PCR扩增获得了约1.8kb的片段。确定了该片段的核苷酸序列,且确证该片段是包括所述AKfbr基因的片段。使用Dye Terminator CycleSequencing Kit(由PE Applied Biosystems提供)和DNA测序仪373A(由PEApplied Biosystems提供)确定了核苷酸序列。AKfbr基因的核苷酸序列和相应的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42。使用EASYTRAPVer.2(由Takara Shuzo Co.,Ltd.提供)从琼脂糖凝胶回收该片段,并将其插入质粒pVC7(特开平-9-070291-A所述的)的SmaI位点以构建质粒pVC7AKfbr。插入片段的核苷酸序列根据前述的方法确定,且确证了所述融合基因的构建一如预期。
(2)使用编码来源于谷氨酸棒杆菌AJ110135的AKfbr基因的融合基因转化谷氨酸棒杆菌
用在实施例3(1)中构建的质粒pVC7AKfbr转化谷氨酸棒杆菌AJ110135菌株。经过培养的细菌菌株(具有增强的AKfbr基因的谷氨酸棒杆菌AJ110135)在含25mg/L卡那霉素和5.0mg/L氯霉素的CM2G琼脂培养基(酵母提取物10g,胰蛋白胨10g,葡萄糖5g,NaCl 5g和琼脂15g配于1L水中)中进行选择。
(3)表达来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13869的丙酮酸羧化酶基因的质粒的构建
已经确定了来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13869的丙酮酸羧化酶基因(在下文中称作PC基因)的序列(Appl.Microbiol.Biotechnol.,50,346-352(1998))。参照该序列合成了示于SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44的引物,且从根据标准方法制备的谷氨酸棒杆菌ATCC13869的染色体DNA通过PCR扩增包含所述PC基因起始密码子5’上游区中的启动子的区域。PCR使用PyrobestDNA聚合酶(由Takara Shuzo Co.,Ltd.提供),反应在生产商推荐的实验方法的条件下进行。
其结果,通过PCR扩增获得了约4.1kb的片段。确定了该片段的核苷酸序列,且确证了该片段是包括所述PC基因的片段。使用Dye Terminator CycleSequencing Kit(由PE Applied Biosystems提供)和DNA测序仪373A(由PEApplied Biosystems提供)确定了核苷酸序列。PC基因的核苷酸序列和相应的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46。使用EASYTRAP Ver.2(由Takara Shuzo Co.,Ltd.提供)从琼脂糖凝胶回收该片段,并将其插入特开平-9-070291-A所述的质粒pVC7的SmaI位点,以构建质粒pVC7PC。根据前述的方法确定了插入片段的核苷酸序列,且确证了所述融合基因的构建一如预期。
(4)使用编码来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13869的PC基因的融合基因转化谷氨酸棒杆菌
用在实施例3(3)中构建的质粒pVC7PC转化谷氨酸棒杆菌AJ110135菌株。经过培养的细菌菌株(具有增强的PC基因的谷氨酸棒杆菌AJ110135)在含25mg/L卡那霉素和5.0mg/L氯霉素的CM2G琼脂培养基(酵母提取物10g,胰蛋白胨10g,葡萄糖5g,NaCl 5g和琼脂糖15g配于1L水中)中进行选择。
(5)确证具有增强的AKfbr基因的谷氨酸棒杆菌AJ110135和具有增强的PC基因的谷氨酸棒杆菌AJ110135对促进3,4-AHBA形成的效果
将分别在实施例3(2)和(3)中选择的具有增强的AKfbr基因的谷氨酸棒杆菌AJ110135和具有增强的PC基因的谷氨酸棒杆菌AJ110135在烧瓶评价培养基(100g葡萄糖,1g七水合硫酸镁,55g硫酸铵,1g磷酸二氢钾,0.01g七水合硫酸铁,0.01g五水合硫酸锰,2mg硫胺素盐酸盐,0.5mg生物素,5mg烟酰胺,1.05g大豆浓缩物(水解的大豆蛋白,基于总氮量)和50g碳酸钙在1L水中调为pH7.2,并以终浓度25mg/L添加卡那霉素及以终浓度5.0mg/L添加氯霉素)中在30℃以120rpm培养71小时。作为对照实验,还在上述的具有终浓度25mg/L卡那霉素的烧瓶评价培养基中将引入了pVC7的谷氨酸棒杆菌AJ110135培养71小时。其结果,在所有实验中,葡萄糖已经完全耗尽。具有增强的AKfbr基因的谷氨酸棒杆菌AJ110135的培养物中积累了1.0g/L 3,4-AHBA,而具有增强的PC基因的谷氨酸棒杆菌AJ110135的培养物中积累了0.6g/L的3,4-AHBA(表2)。同时,作为对照实验的引入了pVC7的谷氨酸棒杆菌ATCC13869积累了0.5g/L的3,4-AHBA。从上述结果可见,与作为对照的谷氨酸棒杆菌AJ110135相比,在具有增强的AKfbr基因的谷氨酸棒杆菌AJ110135和具有增强的PC基因的谷氨酸棒杆菌AJ110135中形成AHBA的能力得到改善。
表2
[序列表描述]
SEQ ID NO:1用于扩增包含griIH基因的DNA片段的引物
SEQ ID NO:2用于扩增包含griIH基因的DNA片段的引物
SEQ ID NO:3用于扩增包含PS2蛋白的基因的启动子区的DNA片段的引物
SEQ ID NO:4用于扩增包含PS2蛋白的基因的启动子区的DNA片段的引物
SEQ ID NO:5用于扩增包含PS2蛋白的基因启动子区以及griIH基因的DNA片段的引物
SEQ ID NO:6用于扩增包含PS2蛋白的基因的启动子区以及griIH基因的DNA片段的引物
SEQ ID NO:7griIH基因
SEQ ID NO:8来源于灰色链霉菌的griI基因的序列
SEQ ID NO:9来源于灰色链霉菌的griI的氨基酸序列
SEQ ID NO:10来源于弗兰克氏菌属菌种的griI基因的序列
SEQ ID NO:11来源于弗兰克氏菌属菌种的griI的氨基酸序列
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SEQ ID NO:16来源于伯克霍尔德菌属菌种383的griI基因的序列
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SEQ ID NO:20来源于大肠杆菌的dhnA基因的序列
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SEQ ID NO:46来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13869的PC蛋白的氨基酸序列
产业应用性
根据本发明,可方便并廉价地生产可用作染料、农药、药物和其他合成有机化合物的中间体,以及作为高性能耐热聚合物聚苯并噁唑的单体的氨基羟基苯甲酸类化合物。因此,举例而言,通过使由本发明获得的3-氨基-4-羟基苯甲酸聚合来获得聚苯并噁唑(PBO),由此使得廉价地提供具有高强度、高弹性模量和高耐热性的PBO成为可能。因为作为原材料的3-氨基-4-羟基苯甲酸类化合物可通过生物合成来生产,本发明的方法作为对环境压力小的工艺,是对地球环境友好的方法。

Claims (5)

1.一种生产3-氨基-4-羟基苯甲酸或其盐的方法,该方法包括培养具有griI基因和griH基因的重组载体转化过的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。 
2.依照权利要求1的方法,其中所述谷氨酸棒杆菌是增强了编码突变天冬氨酸激酶的基因的表达的谷氨酸棒杆菌。 
3.依照权利要求1的方法,其中所述谷氨酸棒杆菌是增强了丙酮酸羧化酶基因的表达的谷氨酸棒杆菌。 
4.依照权利要求1所述的方法,其中所述griI基因和griH基因来源于放线菌。 
5.一种生产聚苯并噁唑聚合物的方法,该方法包括 
(a)通过权利要求1-4任一项所述的方法生产3-氨基-4-羟基苯甲酸或其盐, 
(b)使所述3-氨基-4-羟基苯甲酸或其盐聚合。 
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