WO2010005099A1 - アミノヒドロキシ安息香酸類の製造方法 - Google Patents

アミノヒドロキシ安息香酸類の製造方法 Download PDF

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WO2010005099A1
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bacterium
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鈴木基孝
横山敬一
菊池慶実
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味の素株式会社
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    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/008—Preparation of nitrogen-containing organic compounds containing a N-O bond, e.g. nitro (-NO2), nitroso (-NO)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)

Definitions

  • the present invention relates to the method of aminooxybenzoic acids. More specifically, the present invention relates to a method for easily preparing aminooxy benzoic acids useful as intermediates in foods, agricultural chemicals, pharmaceutical products and their products, and as a high-performance thermomolecular polybenzozol. Specifically, the present invention provides a method for producing 3-amino-4-xylbones by using a fungus having an enzymatic property to synthesize 3-amino-4-oxybenzoic acids using phosphorous asparagine semialdehyde.
  • the present invention relates to a method for producing polybenzozolpoly from aminooxybenzoic acids.
  • aminobenzoic acid which is useful as an intermediate between foods, agricultural chemicals, pharmaceutical products and products, and polybenzoic acid
  • aminooxybenzoic acid is a 3-amino-4-oxybenzoic acid.
  • the 4-nitrobenzoic acid and its ester as raw materials are converted into 3-nitro-4-xybenzoic acid and its conductor, and the intermediary nitro group is isolated as phosphorus with a raw material such as radium carbon. Method) is known.
  • isolation, purification, etc. are performed in several steps and at a high cost in order to avoid the steepness of nitro compounds produced during troduction and to improve the degree of production. There is a problem of becoming. In addition, there is a problem that the yield is low due to isomer formation.
  • Polybenzozoles are well known as poly having a certain degree of properties, and applications such as print films and semiconductor film are considered. However, it is the cause of the delay in the use of these poly- mers because they are chemical and radical reactions that have been used in the past and are not expensive.
  • a method for producing aminobenzoic acids by utilizing the synthesis of organisms is known. For example, it has been reported to biosynthesize 3 ami-4-xybenzoic acid (). However, since this 3-amino-4 xybenzoic acid is weakly acidic and unstable in the vicinity of alkali, there is a problem that it is easily converted into a nutrient solution and the yield is lowered. In addition, if it is known that 2-amino-3-xybenzoic acid (3 cyantra) can be obtained by the method, Patent 3). This does not produce 2-amino-3-xybenzoic acid directly, but rather produces it by cultivating 23 xylene-3 anthranoic acid and hydrogenating it with radium carbon. The radium carbon used here is expensive and requires a large amount of chemicals to carry out the reaction efficiently.
  • Xylbenzoic acid is a mixture of C 4 compound with amino group and C 3 or C 4 compound.
  • 3 provides a method for easily producing aminooxybenzoic acids such as aminobenzoic acid.
  • Et al. Debated for the main purpose of solving the above problem.
  • the gene that codes for the aspartokinase that eliminated the damage of the fiedatta was replaced by a gr gene and a kuta incorporating the gr gene.
  • fungi we found a method for mass production of non-acetylated 3-amino-4-xybenzoic acid, and came to complete the light.
  • the fungus is a fungus that enhances the expression of the rubin-silase gene (or (in 2Z).
  • A includes the gr gene and the gr gene.
  • the g and g genes are ordinary (described in any one of (4).
  • g Indicates the alignment of common sequences in gene logs.
  • the present invention relates to a method for producing perfume acids.
  • the 3 amino-4-xybenzoic acids in Ming include 3 amino-4-xybenzoic acid (hereinafter sometimes referred to as 3 4 A BA) having the following structure, and its conductors and salts.
  • Examples of conductors include: 3-amino-4 aldehyde with a 3-amino-4-oxybenzoic acid group. Examples thereof include arbonium, potassium, and lithium), alkaryl, and calcium salts of rubonic acid, and hydrochloride, acid salt, phosphorus salt, and the like.
  • the DA used for clarity includes genes involved in the synthesis of 3-amino-4-xybenzoates.
  • it is A that contains a gene that has the function of restoring, imparting, and regulating the synthesis of 3-amino-4-xybenzoic acids.
  • a used for clarity is a DA that codes for a protein having an activity to produce 3 amino-4-oxybenzoic acids (hereinafter also referred to as 3 4 A BA) from phosphorous asparagine semialdehyde.
  • 3 4 A BA 3 amino-4-oxybenzoic acids
  • Including. A includes a gene that encodes white matter with the enzymatic property to form phosphorous asparagine semialdehyde, and a combination of phosphorous asparagine semialdehyde.
  • genes that code for the white matter having an enzymatic property include the gr gene (8, 9) or the gr gene derived from Streptococcus griseus.
  • the gr gene is a gene that is derived from another microorganism and shows high homology with the above-mentioned gene derived from Streptomyces griseus and encodes a protein with sex.
  • Such genes can be searched for genes with no homology by performing t-searches using sequences 8 and 9. For example, Franchi Aespi's Fru t b ph ph t a o (cc jonno
  • the gr gene (( ⁇ ) or ⁇
  • the gr gene is a gene that is derived from other microorganisms, shows a high degree of similarity to the above-mentioned gene derived from Streptomyces griseus, and encodes a sex protein.
  • Such genes can be searched for homologous genes by performing a t-search using a sequence of sequences, for example d hydr qu nt yntha nn hy r qu nt from Francia Esp ⁇ . ynth (jnn 11 1) Bataria Espi hy rtnt ynth cnn
  • the gr gene has a homology of 90, preferably 95, more preferably 98, particularly preferably 99, with respect to the sequences 9, 11,, 11, or amino sequences. And those that encode the above-described properties of the protein.
  • the g gene has a homology of 90, preferably 95, more preferably 98, particularly preferably 99 with respect to the sequence VI, ⁇ or the amino sequence of It can be used to code a protein with the following properties.
  • the homology of amino and base sequences is, for example, determined by the algo X L r at a c U by r n n t hu
  • F th n y • () can be used to determine.
  • L programs called L and L have been developed (http n n n h n n h o?).
  • Fig. 2 shows the alignment of amino sequences of sequences VI, VI, ⁇ , and 34. These consensus columns are shown in the array,.
  • the gr gene contains the gene that codes the amino sequence of the sequence
  • the gr H gene contains the gene that codes the amino sequence of the sequence.
  • the gr gene and the gr gene have already been clarified in several lines as described above, and can be obtained using plies made based on their base sequences. For example, using the Bry shown in 2, Pyh nr ct nht, ⁇ ⁇ t ⁇ , rnnt ⁇ , 1 (), which is modeled on the Streptomyces griseus color, The code area of gr 1 and gr and the area including the area can be acquired at the same time. As an example of Streptomyces Griseus, F
  • the gr gene used to obtain the fungus used in the Ming Act is a 9-, 1-, or gr gene. Is the array ⁇ ⁇
  • genes that code for critical amino acid sequences can be improved by co-expressing it, preferably by enhancing its expression.
  • Substituting, missing, or adding several amino acids or multiple amino acids in the sequence 9, 1, ⁇ , 1 or 1, respectively, or in sequences ⁇ , 1, ⁇ , or Mutant that encodes a protein with a sequence It may be an artificial variant.
  • amino acid substitutions, deletions, insertions, additions, or mutations that occur due to differences in the species of microorganisms that carry 9 or gr genes, etc.
  • Mutation refers to ph t when the substitution position is amino acid, between u V when the substitution position is amino acid, and gnn when the substitution position is polar amino acid.
  • basic amino acid between y and y rg h
  • gnn when the substitution position is polar amino acid.
  • it is a mutation that replaces each other More specifically, as a conservative substitution, it is changed from r to thr or thr from rg to gnh or y, and from n to gugnyh X is converted from p to p from ngu or from gn to y Or or gn to ngu yhp or rg conversion, 9 to gngny or p conversion, y to p "conversion h to nyg rg or ty" conversion to tv or ph conversion, u to
  • the gr gene and the gr gene have different genes depending on the host into which they are introduced, and may be easily replaced in the host into which gr and grt are introduced. As long as the gr gene and the gr gene have the function to improve the production capacity of both BAs by enhancing the expression of both genes, the long tatter or the tampered tatter quality is coded. It may be a gene.
  • the length to be divided is below amino, preferably below, more preferably below 1, particularly preferably below. More specifically, it may be a gene that codes for a protein in which amino acid is deleted from amino acid or amino acid is deleted from C amino acid.
  • Such a gene homologous to the g and gr H genes can be represented by sequences 9, 11 including, for example, substitutions or additions of amino acids at specific positions of the protein to be encoded by site mutations. Or, and can be obtained by modifying a gene that codes for the sequence ⁇ , ⁇ , or mucosal amino acid sequence. It can also be obtained by the following mutation method. As a matter of fact, gr or g
  • microorganisms treatments with microorganisms, etc., and microorganisms that retain genes, such as coli, with ultraviolet rays or mutations commonly used such as methyl nitronitrodine or tilmethane sine E) , A, th,) h ff ng (tr ur (1) t (0, tur
  • the gr and gr H genes are sequence 8 or the base sequence complementary to the sequence or the base sequence of the sequence, and can be prepared from these sequences.
  • DA that codes for a protein that has the function of improving the ability to synthesize both 34A A by expressing both.
  • the stringent condition refers to a condition in which a so-called unique hybrid is formed and no hybrid is formed.
  • the stringent condition is a condition in which a so-called unique hybrid is formed and no hybrid is formed.
  • a high degree of homology for example, top A, preferably top 0, more preferably top, particularly preferably top A, who has high homology, and low DA, which has lower homology.
  • Such a probe can also be used as a ply of oligonucleotides prepared on the basis of these base sequences. It can be prepared by PCR using a piece as a mold. For example, in the case where an A piece of 300 degrees is used as a probe, 50 C 2 X S S C 0 S S without hybridization is mentioned.
  • Whether these 9 and gr genes express the protein that improves the production capacity of 3, 4 BA is determined by whether or not these genes are encoded by aspartokinase that eliminates the damage of the fed grasshopper. For example, it is introduced into C ⁇ gac A 035 (11) etc., which has a gene. It can be confirmed by checking whether the ABA property improves. In that case, for example, the o C, 28 823 833 2006], 34 A BA of Ki et al. Can be verified more clearly by using a chromograph.
  • the data used for light can be obtained.
  • a and G which may be included in A used for clarity, may be used as separate structors, respectively, and g and gr
  • the same tata may be used for transformation by linking with an appropriate spacer.
  • g and gr may be genes derived from the same organism or genes derived from different organisms. In the case where gr and are present at close positions on the chromophore, DA may be excised with inclusion of g and g to make a solid.
  • the data used for this purpose are the promoter, the above-mentioned A, such as g and gr, and the control necessary to express the gene (operator terminator) so that they can function. It is in an appropriate position.
  • Expression that can be used as Tata Tata is not particularly limited.
  • Any vector may be used as long as it is capable of functioning, and it may be self-supporting outside the chromosome, such as plus, or it may be incorporated into the bacterial chromophore.
  • the next brass is especially preferred. These include, for example, 5 9 A c B o C e 48 2 90 2 9 0 3 984) A 3 30 A co C e ⁇ 48 2 90 2 9 0 3 9 8 4)) and improvements Includes a plus with a gene.
  • the promoter that can be used clearly is not particularly limited, and can be generally used as long as it can function, and it may be a different type of promoter such as an aC promoter.
  • a cellular protein PS PS2SPA gene promoters and various amino-synthetic gene promoters.
  • the strain is preferably a strain that can efficiently supply phosphorous asparagine semialdehyde, which is the synthesis of 3-amino-4-xybenzoic acid.
  • Aspartokinase is inherently affected by lyonin's concerted fibbatta, but a bacterium having an aspartokinase gene having a mutation that substantially eliminates fiddatta damage is particularly preferred.
  • Aspartokinase is a white matter composed of nittosubunits, and is a code part on the nitton gene r n ba t r g t c r v b ct 1 r
  • the array of conventional Asparto Kinets is shown in the array.
  • the position on the nit represents the alanine onine from the end, or the onion soleucine from the end to the eleven, or from the end to the serine from the end, or from the end. This is accomplished by introducing a mutation that converts the onion leucine of the eye, or the olcine glycine of the end or eye of the eye, or the glycine asparagine of the end or third argine glycine, or the end of the eye.
  • aspartokinase has several amino acid differences compared to the sequence shown in the sequence depending on the type and strain that comes even in the wild. Also good. These mutations are synonymous with those described above for gr and gr, and identify the place to respond by implementing an alignment for those skilled in the art to eliminate the feedback damage. be able to. Aspartokinase's fed-batter damages can be eliminated by those skilled in the art, for example, analogs such as 2 aminocysteine 3 This can be achieved by site mutation by gene recombination using homologous combinations of sexual mutations.
  • the J035 strain has y, which is a gene that codes for lysine pemia.
  • Any stock can be used as long as it can efficiently supply the phosphorus asparagine semialdehyde.
  • the 3-amino-4-xybenzoic acid can be produced by cultivating the transformant obtained as described above and recovering the 3-amino-4-xybenzoic acid produced in the ground.
  • It is used in the light of the surface area. Specifically, it is silica gel, alumina, oleite, gnesia, activated clay, hydrophilicity represented by talyl, charcoal, bone charcoal, activated carbon. And typified by,. In the light, it can be used without particular limitation as long as it can improve the degree of 3-amino-4-xybenzoic acid by adsorbing impurities. However, since the impurities attached by are mostly compounds produced in the course of biochemical synthesis, it is clear that these compounds are easily adsorbed by these compounds.
  • charcoal there is no particular limitation on the material, for example, material such as coconut shell, smokeless oil pitch, coal such as cocos, oil, oil, acrylic fat, phenol fat, poxy fat And synthetic resin materials such as polyester and fat.
  • the activated carbon is in the form of granules, fibers, filter cartridges, etc., but there is no particular limitation and it should be easy to handle.
  • the purpose of the contact is to adsorb a large amount of impurities, 3 amino 4
  • the purpose is to improve the degree of xybenzoic acids, but the impureness and the target 3-amino-4 xybenzoic acids may also be worn. Therefore, the nutrient solution 3 amino 4 xy benzoic acid was contacted, followed by polar contact with
  • concentration or concentration is higher than the saturation solution by adding, and is not particularly limited, including conventional methods. Also, the generated crystals or sedimentation, excess, centrifugation It can be separated by separation.
  • the process for producing benzozolpoly in Ming is a process that includes the step of polymating 3-amino-4-xybenzoic acids obtained by the above-mentioned Ming method.
  • the S ⁇ g se s O 3350 and g genes (below, both genes are called 34 AA genes.
  • S. g se s O 3350 color body DA made from Fuji and Miura's oc o s Ac a ⁇ 72 6 9 963 3 4 A BA
  • the region where the gene sequence was coded was amplified by the PC method. Py obes DA oase () was used for PCR, and the protocol of the reaction supplier was followed. As a result, a PCR fragment of about 2 b was obtained, and when the base sequence of this fragment was determined, it was confirmed to be a fragment containing the g gene. It was carried out using an iterator of the nucleotide sequence and a scintillation kit (PE Applied Biosystems and DA 373A PE Applied Biosystems). The sequence of g genes is shown in array 7.
  • the amplified C ⁇ gae ATCC 3869 PS2 gene promoter and the amplified g gene region PCR were mixed to form a template, and loss over PCR was performed using sequence 56.
  • the g gene connected to the region containing the C-ac ATCC 3869 protein gene promoter was amplified.
  • a piece of 2 ⁇ 6b was detected with a galose gel. This piece was collected from the glass using EASYTRAP Ve 2) and inserted into the site of plus P 4 on 9 322774 to construct plus pP 4. According to the above method, the base sequence of the piece was determined and it was confirmed that the gene was expected.
  • Brass pP 4g (Promoter is C ⁇ ac ATCC 3869 PS2 and gene is S ⁇ g se s FO 3530)
  • C ⁇ gae AJ 035 is an asthma by introducing a mutation that replaces the alanine onine of the eye as described in 2004 2650. It desensitizes Paltokinase and is missing the Zimpa Miaze gene. It can be constructed from C ⁇ gac ATCC 3869 by the method described in US Pat.
  • C ⁇ gac ATCC 3869 with P 4g was loaded with 84 g A BA and 4 g of C gac A 0 35 34 AA with 0 7 PP 4g.
  • C ⁇ gac ATCC 3869 without pP 4g did not produce 34A A.
  • 3 4A A Suzuki et al. [BoCe ⁇ 28 823833 (2006, by rotography. From the above result, the S ⁇ g se s F 3350 g gene was introduced into Colladium thallium. As a result, it was shown that it is capable of producing 8,4 A BA, and C ⁇ gac has an aspartokinase gene that has been released from wild-type C ⁇ gac ATCC 3869 Z.
  • a 035 was loaded with 8 4 A BA more by introducing P 4g. CO ⁇ D AH A Ly ⁇
  • Dalcos 40, G and A of 0:00 A and Ammonium 29, Phosphorus hydrogen 0, 49, 4m, Ngan 4 g Thiamate 8009, Biotin 209, Cotinamide 200, B) of 042 g Gn 40 260 was treated as 20 and 20 respectively. A and ground are also 20. 20 I put it in a 5 volume jamentor and mixed to add a kanaisin level of 25 g. The above nutrient solution was 40 in this area, and the following conditions were applied. While supplying air at a rate of 0.5 V, the operation was performed under the conditions of 30, 30 and 60, 60 p.
  • the region including the promoter of the basin of the C ⁇ g ac A 035 color body DA to f b gene initiation prepared by synthesizing the brie shown in 40 was amplified by the PC method.
  • the PCR reaction was performed according to the protocol of the reaction supplier using the PCR DA oease (. As a result, a PCR fragment of about 8 b was obtained, and the base sequence of this fragment was determined. ⁇ It was confirmed that the base sequence was damaged using a digital sequence and a DA sequencer 373A (PE Applied Biosystems) A fb Gene base sequence 4 and corresponding amino acid sequence 42.
  • a PCR fragment of about 4 b was obtained, and when the base sequence of this fragment was determined, it was confirmed to be a fragment containing the PC gene.
  • the base sequence of the PC gene performed using the Itaita Cytal Cyclic Thing Kit (PE Applied Biosystems and DA 373A PE Applied Biosystems) is shown in Sequence 45. Is shown in Arrangement 46. Brass pVC7PC was constructed by recovering this piece from glass using EASYTRAP Ve 2 and entering the SA site of the plus VC7 on the 970,029. According to the above method, the base sequence of each piece was determined, and it was confirmed that the expected gene was transmitted.
  • benzozol PBO
  • 3-amino-4-xybenzoic acids obtained by Ming. It is possible to provide it.
  • 3-amino-4-xybenzoic acids since it is possible to produce 3-amino-4-xybenzoic acids as raw materials by biosynthesis, it is a clear environmental process and is a production method that is friendly to the global environment.

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Abstract

フィードバック阻害を解除した変異型アスパルトキナーゼをコードする遺伝子を有し、ジヒドロキシアセトンリン酸とアスパラギン酸セミアルデヒドから３－アミノ－４－ヒドロキシ安息香酸を生成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターで形質転換したコリネ型細菌を培養することにより、３－アミノ－４－ヒドロキシ安息香酸類を効率的に製造する方法を提供する。

Description

アミ ノ キシ 息香酸類の
術分野
本 、 アミ ノ キシ 息香酸類の 法に関する。 さ らに詳しくは、 料、 農薬、 医薬品その 成品の 間体や、 高性能 熱性 分子ポリベンゾ ゾ ルの ノ として有用な、 アミ ノ キシ 息香酸類を簡便 価に 造す る方法に関する。 体的には、 ンリ ン アスパラギン セミア ルデヒ ドを として、 3 アミ 4 キシ 息香酸類を合成する酵素 性 を有する 菌を用いて、 3 アミ ノ 4 キシ ルボン 類を 製造する方法を提供する。
、 さ らに、 アミ ノ キシ 息香酸類から、 ポリベンゾ ゾールポリ を製造する方法に関する。 来、 料、 農薬、 医薬品その 成品の 間体や、 ポリベンゾ ツ ルの ノ として有用であるアミ ノ キシ 息香酸類の 法としては、アミ ノ キシ 息香酸類が 3 アミ ノ 4 キシ 息香酸の 合、原料である 4 キシ 息香酸やそのエステルを トロ して 3 ニトロ 4 キシ 息香酸やその 導体とし、 その 、 間体のニトロ基を ラジウムカーボンなどの 元剤で リ ン として単離する方法 ) が知られている。 ま た原料として 4 息香酸やその ステルをもちいた場合、 トロ して 3 トロ_4 息香酸を得た後、 基をアルカリ 酸化物で処理して 3 ニ トロー4 キシ 息香酸としこれを 元する方法 ( 2 ) も知ら れている。
しかしながら、これらの 法ではいずれも トロ化の際に生成する ニトロ 物の 険性を回避するため、 また生成 の 度を向上させるために単離、 精製などの 作が数 階におよびコス ト高になるという問題がある。また異性体 成による収率の 幅な 下と った問題点もある。
また、 アミ ノ キシ 息香酸類中の の 、 ポリ 応を妨げる ことが知られて る。
ポリベンゾ ゾ ル類は、 度の 性を有する ポリ としてよく知られ ており、プリ ン ト フィルム、半導体 子の 膜などの用途が考えられている。 しかし、 化学 用いた従来の 危険な 用いた過激な反応であり・ し かも ノ の 度の い安価な 法がないことが、これらポリ の 用 化を遅らせて る原因となって る。
3 アミ ノ 4 キシ 息香酸について・ 種の 学合成法が報告されて る 成法では多段階の 応が必要となるためコス ト となり、 製造に不適である。
般に、化学的合成法に比 て生合成による物慣 は くつかの 点が挙げられる えば、 安価で再生 能な原料の 用、 温和な反応 件下で合成が可能であることであ る。
生物 の 合成 応を利用し、アミ ノ キシ 息香酸類を生産する方法が知ら れている。 えば、 3 アミ 4 キシ 息香酸を生合成することが 報告されて る ( ) 。 しかしながら、 この 3 アミ ノー 4 キ シ 息香酸は弱酸性からアルカリ 近にお て不安定であるため、 養液中で 化さ れ イ しやすく 、 収率が低くなるという問題がある。 また、 2 アミ ノ 3 キシ 息香酸 ( 3 シアントラ ) も の により得られるこ とが知られている えば、 特許 3 ) 。 この によって2 アミ ノ ー 3 キシ 息香酸が直接 産されるのではなく、 2 3 キシー 3 ア ントラ 酸を培 により得て・それを ラジウムカ ボン により 水素 させ ることにより製造するものである。ここで使用される ラジウムカ ボン 高価で あり、 しかも反応を 率的に行うには多く の が必要となることから、 工業的には 不適である。
近、 3 アミ ノ 4 キシ 息香酸類の 合成に関与する遺伝子が放 よ り見出され、 その 合成 路が明らかにされた。 体的には 3 アミ ノ 4
キシ 息香酸は、 ンリ ン アスパラギン セミ を として、アミ ノ基を持ったC 4 合物と C 3ある はC 4 物との
応を する酵素である r と C 7 合物の あるいはC 化合物の 酸を伴 った環化を する酵素である r とによって 2 階で生合成されることが解明さ れた ( 2 ) 。 また、 gr 伝子を組み込んだ タタ を用いて 換した の 種である、 ス トレプト イセス リ ビダンスが、 3 アミ ノ 4 キシ 息香酸を生産することも知られている ( 4 )。 しかしながら、 生産 地の 成 の 討にも関わらず、 その 産性は、 あたり最高でも 5 と、 実用 産には 題が多 。 また、 得られた 3 アミ ノ 4 キシ 息香酸は、 生合成の 程でできる チル 体との 合物であり、 アセチル 理が不可避であった。 これらの 題点により、 生合成法による効率的な プロセスが確立されたとは言えない状況である。
術文献 3 3 545 6 8
2 8 745
3 7 3 ０ 9 9 46
4 2 ０ ０4 2 8 3 6 3 Y o e a e a e o e c S 4 5 8 5 8 5 2 ０ ０ ０ )
2 J o C e 2 8 48 3 6 944 3 6 9 5 2 ０ ０ 6
明の
明が解決しようとする課題
、 かかる 術の 状に みてなされたものであり、 3 アミ ノ キシ 息香酸などのアミ ノ キシ 息香酸類を簡便 価に 造する方法を提 供す
ることを目的とするものである。
題を解決するための
らは、 上記 題を解決することを主な目的とし 討を重ねた。その 果、フィ ドバッタ 害を解除した アスパルトキナ ゼをコ ドする遺伝子を有 し gr 伝子と gr 伝子を組み込んだ クタ で 換した 菌を することにより アセチル されていない 3 アミ ノ 4 キシ 息 香酸を大量生産する方法を見出し、 明を完成するにいたった。
すなわち 、 以下の 明を提供するものである。
( フィ ドバッタ 害を解除した アスパルトキナ ゼをコ ドする遺伝子 を有し、 ンリ ン アスパラギン セミアルデヒ ドから 3 アミ ノ 4 キシ 息香酸を生成する活性を有するタン ク質をコ ドする A を組み込んだ タタ で 換した 菌を する工程を含む、 3 アミ ノ 4 キシ 息香酸類の 。
( 2 コ リ 菌が、 変異 アスパルトキナ ゼをコ ドする遺伝子の 現が 強化された 菌である、 に記載の 。
3 ) コ リ 菌が ルビン シラ ゼ 伝子の 現を強化した 菌である、 ( 又は ( 2 Z 載の 。
(4) Aが gr 伝子および gr 伝子を含む、 ) 3 ) のいずれ かに記載の 。
5 ) g 伝子および g 伝子が放 来である、 ( ( 4 のい ずれかに記載の 。
( 6 コリ 菌が、 コリ バタ リ ウム・グルタミ である、 ～ ( 5 ) のいずれかに記載の 。
7 ) ) ～ 6 ) のいずれかに記載の 法により製造した 3 アミ ノ 4 キシ 息香酸類をポリ する工程を有する、 ポリベンゾ ゾ ルポリ の製 。
面の 単な説明
g 伝子 ログ びに共通配列のアライ ンメントを示す 。
2 伝子 ログ びに共通配列のアラインメントを示す ( )。 3 g 伝子 ログ びに共通配列のアラインメン トを示す 。
4 g 伝子 ログ びに共通配列のアラインメン トを示す ( 。 5 バタ リウム ・ ダルタミ による アミ ノ 4 キシ 息 香酸の 産を示す図である。
明を実施するための 下 本 明を詳細に説明する。
ンリ ン アスパラギン セミアルデヒ ドから、 3 アミ ノ 4 キシ 息香酸を生成する活性を有するタンパタ質をコ ドするD Aを組み込んだ クタ を用 て 換したコ リ 菌を すること によって 3 アミ ノ 4 キシ 息香酸類を製造する方法に係るものである。
明における 3 アミ ノ 4 キシ 息香酸類には、以下の 造を有する 3 アミ ノ 4 キシ 息香酸 ( 下、 3 4 A BA すことがある) びにその 導体およびその塩が含まれる。
Figure imgf000006_0001
導体としては、 例えば・ 3 アミ ノ 4 キシ 息香酸の 基が ヒド された 3 アミ ノ 4 アルデヒ ドなども含まれる。 としては、 ルボン酸のアル ナト リ ウム、 カリウム、 リチウム) 、 アル カリ ルシウム、 グネシウム) 塩などの および塩酸塩、 酸塩、 、 リ ン 塩などの 例示される。
3 アミ ノ 4 キシ 息香酸類を生成する活性を有するタンパタ質を コ ドする A
明に用いるD Aは、 3 アミ ノ 4 キシ 息香酸類 合成に関与する 遺伝子を含む。 言すると 3 アミ ノ 4 キシ 息香酸類の 合成を回復、 付与、 調節する機能を有する遺伝子を含む Aである。
体的には、 明に用いる Aは、 ンリ ン アスパラギン セミアルデヒ ドから、 3 アミ ノ 4 キシ 息香酸類を生成する活性( 下、 3 4 A BA ともいう。 ) を有するタンパク質をコ ドするD Aを 含む。 Aには、 ンリ ン アスパラギン セミアルデヒド の 成を する酵素 性を有する 白質をコ ドする遺伝子、および ンリ ン アスパラギン セミアルデヒドの 合を形 させることによって得られたC 7 合物の 化を する酵素 性を有する 白質 をコ ドする遺伝子が含まれる ( 4 ) 。 下、 両 性をあ せて、 3， 4 A BA 合成能ともいう ことがある。
ンリ ン アスパラギン セミアルデヒ ドの
成を する酵素 性を有する 白質をコ ドする遺伝子としては、ス トレプト イセ ス・グリセウス 来のgr 伝子 ( 8、 9 ) 、 又は、 gr 伝子 が挙 げられる。 gr 伝子 としては、 他の微生物に由来し、 上記ス トレプト イセ ス・グリセウス 来の 伝子と高 相同性を示し、 性を有するタンパク質をコ ドする遺伝子を う。 そのよ な遺伝子は、 配列 8、 9 の 列を用いて t 索を行う ことにより、 相同性の い遺伝子を探索することもできる。 えば、 フランキ ア・ エスピ 来のFru t b ph ph t a o ( cc jonno
０ 1 ) Fru t b ph phat do n n 4 11 1 1 、 ス トレプト イセス・スカ ス 来の ruct b ph ph t
http ng r c uk cg b n b a t b b a t
1
)、 バ タ ルデリア・エスピ 来のf uct b ph phat c n n 1 1 ) th n coccu jann ch 来のfru ph ph t a a c n n 、 配列 1 1 ) 、 シ リ ヒア・コ リ 来の dhn 伝子 ( cc n n 1 、 配列 、 1) などが挙げられる ( urn f h try V pp 1 up nt ry d t )
ンリ ン アスパラギン セミアルデヒ ドの 合を 形成させることによって得られた C 7 合物の 化を する酵素 性を有する 質をコ ドする遺伝子としては、ス トレプト イセス・グリセウス 来のgr 伝子( ㈲ 又は・ gr 伝子 が挙げられる。 gr 伝子 として は 他の微生物に由来し、 上記ス トレプト イセス・グリセウス 来の 伝子と高い相 同性を示し、 性を有するタンパタ質をコ ドする遺伝子をいう。そのよ な遺 伝子は、 配列 の 列を用いて t 索を行うことにより 相同性の い遺 伝子を探索することもできる。 えば、 フランキア・エスピ 来の d hydr qu n t yntha n n hy r qu n t ynth ( j n n 11 1。 ) バ タ リア・エスピ hy r t n t ynth c n n
d y r n t ynth cc n n ) ス トレプ ト イセス・スカ エス 来の hy r qu n t ynth
( (http: ang r c uk cg b n b a t ub tb a t ab )
) th n u nn h hydr u n t ynth n n 的などが挙げられる( urn f ch try 1 4 p 4 1 upp nt y t )
また、 gr 伝子 としては、 配列 9、 11、 、 巧、 1 1 又は アミ ノ 列に対して、 9 ０ 上、 好ましく 9 5 上 より好ましくは 9 8 、 特に好 ましくは9 9 上の相同性を有し、 かつ、 前述の 性を有するタンパタ質をコ ドするものが挙げられる。 g 伝子 としては、 配列 Ⅵ、 ㍊又は のアミ ノ 列に対して、 9 ０ 上、 好ましくは 9 5 上、 より好ましく は 9 8 、 特に好ましくは 9 9 上の相同性を有し かつ、 前述の 性を有する タンパタ質をコ ドするものが挙げられる。 アミ ノ および塩基配列の 同性は、 例えば r n n t hu によるアルゴ X L r at a c U
(1 )) F th n y ・， ( ) を用いて決定することが できる。 このアルゴリズム L に基づいて、 L や L とよばれるプログラムが 開発されている ( http n n n h n n h o?) 。
9、 11 および のアミ ノ 列のアラインメントを
2 に、 配列 、 Ⅵ、 ㌍および のアミ ノ 列のアラインメント を 3 4に示す。 また、 これらのコンセンサス 列を配列 、 に示す。 gr 伝子 には、配列 のアミ ノ 列をコ ドする遺伝子、 gr H 伝子 には配列 のアミ ノ 列をコ ドする遺伝子を含む。
gr 伝子およびgr 伝子は、 上記のとおり 既にいくつかの 列が明らかにされ ているので それらの 基配列に基づいて作製したプライ を用いて得るこ とができ る。 えば 2に示すブライ を用いて、 ス トレプト イセス・グリ セウスの 色体 を 型とする P y h nr ct n h t ， ・ ・ t ・， r n n t・ ， 1 ( ) によって、 ス トレプト イセス グリセ のgr 1およびgr のコ ド 域と、その 域を含む 域を同時に取得する ことができる。 ス トレプト イセス ・ グリセウスの 体例としては、 F
( 1 ) 株が挙げられる。 、 独立 政法人 品評価 バイオロ ジカルリソ スセンタ から入手することができる
(httD n n t g g n h ) 。 他の微生物に由来する または gr Hの も、 同様にして取得され得る。
生物の 株によってgr 伝子やgr 伝子の 基配列に差異が存在するこ とがあるため、 明の 法に用 る 菌を得るために使用するgr 伝子は 配 9、 1 もしくは gr 伝子は、 配列 ㍊・
、 もしくは批のアミ ノ 列をコ ドする遺伝子に限られず、 コ リ で共 に発現することにより、 好ましくは発現を増強することにより、 コ リ 3 4 A BAの 産能を向上させることができる限り、 それぞれ、 配列 9、 1、 ㍑、 1 もしくは 1、 配列 ㍊、 1、 ㍊もしくは のアミ ノ 列に おいて、 しくは複数の 置での しくは数個のアミ ノ酸の置換、 欠 、 付加 列を有するタン ク質をコ ドする変異体 人為的な改変体であっ てもよ 。 ここで、 とは、 アミ ノ タンパタ質の立体構造における 置 や 類によっても異なるが、好まし は から 5 ０ 、さ らに好ましくは から 2 ０ 、 より好ましくは から ０ 、 特に好ましくは から 5個である。 また、 このようなア ミ ノ酸の置換、 欠 、 入、 付加、 または には、 9 伝子もし はgr 伝子 を保持する微生物の 、 種の違 に基づく 合などの 然に生じる変異
v nt) によって生じるものも含まれる。
機能的に変化しない中性 である保存 換が好ましい。 変異と は、 置換 位が アミ ノ酸である場合には、 ph t「p yr間で 置換 位が アミ ノ酸である場合には u V 間で、 極性アミ ノ酸である場合には、 g n n 間で、 塩基性アミ 酸である場合にほ・ y rg h 間で、 酸性アミ ノ酸である場合に は p g u間で、 ヒ ド 基を持つアミ ノ酸である場合には、 「 t 間でお互い に置換する変異である。 より具体的には、 保存 換としては から r又はthr の 換 rgからg n h 又は y の 換、 nからg u g n y h Xは p の 換 pから n g u又はg n の 換 y から r又は の 換、 g nから n g u y h p又は rg の 換、 9 からg n g n y 又は p の 換、 yか らp「 の 換 h から n y g rg又はty「 の 換、 から t v 又はph の 換、 uから t V ph への 換、 y から g g n h 又は g の 換、 から Va 又はph の 換、 ph から trp ty「 t 又は u の 換、 rから t r又は の 換、 thrから r又は a の 換、 trpから 又はtyr の 換、 ty「からh Ph 又はtrp の 換、 、 v から t 又は u の 換が挙げられる。
さらに、 gr 伝子およびgr 伝子は それぞれ 入する宿主により、 遺伝子の が異なるので、それぞれgr およびgrt が導入される宿主で使用しやす に 置換したものでもよい。 様にgr 伝子およびgr 伝子は、 双方の 伝子の 現を 増強することにより 3 4 BA 産能を向上させる機能を有する 限り、 、 長したタンパタ 、 ある は削られて るタンパタ質を コ ドする遺伝子でもよい。 えば ・ 除する長さは、 アミ ノ 下、 好 ましくは 下、 より好ましくは1 下、 特に好ましくは 下である。 より具体的に は、 アミ ノ酸から アミ ノ 、 又はC アミ ノ酸から アミ ノ酸が 削除されたタンパタ質をコ ドする遺伝子でもよい。
このようなg 伝子およびgr H 伝子と相同な遺伝子は、 例えば、 部位 変異 によって、 コ ドされるタンパタ質の特定の 位のアミ ノ が置換 欠 、 または付加を含 よ に配列 9、 11 もしくは ・ および、 配列 ㍊、 、 Ⅵ もしくは粘のアミ ノ 列をコ ドする遺伝子を改変するこ とによって取得することができる。 また、 以下のような られて る変異 理によ っても取得され得る。 理としては、 gr 伝子もしくはg 伝子を
ミ ン等でインビ 理する方法、 および 伝子を保持する微生物、 例えばコ リ 菌を、 紫外線または メチル ニ トロ ニトロ ニジン もしくは チルメタンス ネ ト E ) 等の通 理に用 られている変異 によっ て処理する方法、 エラ a ， ・ th・ ・ ， ) h ff ng( t r ・ ur (1 ) t ( ０， tur
te hn ) よって、 遺伝子組 えにより人工的にgr 伝子もしく はg tH 伝子に変異を導入して活性の 素をコ ドする遺伝子を取得することが 来る。
また、 gr 伝子およびgr H 伝子は、 配列 8、 もしくは および、 配列 もしくは の 基配列に相補 な 基配列 はこれらの 列から調製され得るプロ プ ス トリ ンジ ン な条件下で イブリ 、 かつ、 双方を発現することにより 3 4A A 合成能を向上さ せる機能を有するタンパタ質をコ ドするD Aが挙げられる。 ここで、 ス ト リ ンジ ン な条件 とは、 いわゆる特異 なハイブリッ ドが形成され、 な イブリ ッ ドが形成されな 条件を う。 ス トリ ンジ ン な条件 とは、 いわゆる特異 な ハイブリッドが形成され、 なハイブリッ ドが形成されな 条件をいう。 例を 示せば、 相同性が高 士、 例えば 上、 好ましくは ０ 上、 より好まし は 上、特に好ましくは 上の相同性を有する A 士がハイ リ 、 それよ り相同性が低いD A 士がハイブリ しない条件、 あるいは通常のサ ザンハイブリダイゼ ショ ンの の 件である X S S C， ・ S S ましくは、 0 X S S C、 ・ SDS さらに好ましくは、 6 8 、 0・ X S S C、 ・ S Sに相当する ・ 度で、 より好ましくは 2～3 する条件が挙げられる。
プロ ブとして、 配列 8、 1 4 もしくは 、 または 配列
4 、 ㍊もしくは 4の 基配列に相補 な 基配列の 部の 列を用いるこ ともできる そのようなプロ ブは、 これらの 基配列に基づいて作製したオリゴ ク レオ をプライ とし これらの 列を含む A 片を 型とする P C Rによっ て作製することができる。 えば、 プロ ブとして、 3 ０ ０ 度の さの A 片を用いる場合には、 ハイブリダイゼ ショ ンの いの 、 5 ０ C 2 X S S C 0 S Sが挙げられる。
伝子 ログ 変異に関する記載は、本明細書に記載された他の遺伝 子についても同様に適用される。
これらの9 およびgr 同遺伝子が発現することにより 3， 4 BA 産能を 向上させるタンパタ質をコ ドしているか否かは、 これらの 伝子をフィ ドバッタ 害を解除した アスパルトキナ ゼをコ ドする遺伝子を有する 、例 えばC・g a c A ０ 35 ( 11 ) 等に導入し、 3， 4 A BA 性が向上するかどうかを調 ることにより、 確かめることができる。 その 合、 例えば 木らの o C ， 28 823 833 2００6 ] 、 3 4 A BA を クロ トグラフ により することでより明確に効果を検証することがで きる。
2 タタ
明に用いるD Aを、 発現 タタ であるプラス に導入することによって、 明に用いる タタ を得ることができる。 明に用いる Aに含まれて もよい、 g およびg 、 それぞれ 現可能な状態で 換体に含まれる限り、 そ れぞれ別の組 クタ に して 換に用いても良いし、g とgr を適当な スペ サ により 結して、同一の タタ に 、形質 換に用いても良い。 また、 g とgr は同 の 生物に由来する遺伝子であってもよいし、 異種 生物に由 来する遺伝子であってもよ 。 の 生物に由来する遺伝子であり、 gr および は 色体上の近接した位置に存在する場合は g およびg の 方を含 位におい てD Aを切り出し、 ベタタ に しても良い。
明に使用する タタ は、 般にプロモ タ 、 前述の 明の A えばg およびgr 、および 伝子を発現させるために必要な制 御 (オペレ タ タ ミネ タ ) を、 それらが機能し得るように適切な位置に 有するものである。
タタ として使用できる発現 タタ は特に制限されず、コ リ
能し得るべクタ であればよく、プラス のように染色体外で自立 するもので あっても細菌 色体に組み込まれるものであってもよい。 来のブラス は特に好まし 。 これらには 例えば 5 9 A c B o C e 48 2 9 ０ 2 9 ０ 3 9 84) A 3 3 ０ A c o C e ・ 48 2 9 ０ 2 9 ０ 3 9 8 4) ) およびこれらを改良した 伝子を有するプラス が含まれる。
明に使用できるプロモ タ は特に限定されず、コリ の 能し 得るプロモ タ であれば 般に使用でき、 更に異種 来の 例えば a C プロモ タ 等の大 来のプロモ タ であってもよい。
来のプロモ タ としては・ えば、 細胞 タンパタ質の P S P S 2 S PAの 伝子のプロモ タ 、 各種アミ ノ 合成系の 伝子のプロモ タ が挙げられる。
3 換体
明に用いるコ リ フィードバツ 害を解除した アスパルトキ ナ ゼをコ ドする遺伝子を有し ンリ ン アスパラギン セミ アルデヒ ドから 3 アミ ノ 4 キシ 息香酸類を生成する活性を有するタン パタ質をコ ドするD Aを組み込んだ タタ で 換することによ り 3 アミ ノ 4 キシ 息香酸 産能が付与される 菌であれば特に制 限されない。 株となる としては、 従来ブレ リ ウム属に分類され て たが現在コ リ リウム属に統合された細菌を含み ( ・ S s ac e o ・ 4 255 99 ・ リ ウム 非常に近縁な リウム 菌 を含み、 具体的には以下のものが例示される。
リ ウム・ アセ ドフィ ラム
コ リ ウム ・ アセトグルタミ
リウム・アルカノ リティカ
コ リ バタ リ ウム・ ルナ
リウム ・ グルタミ
リウム・ リウム (コ リ リ ウム・ダルタミカム)
コ リ リ ウム ・ メラセコ ラ
リウム ・サ モアミ ノ ネス
コ リ リ ウム・ キ リス
ブレ リウム ・ ディバリカタム コ リ リ ウム グルタミ
ブレ リ ウム・フラバム (コ リ リ ウム ・ ダルタミカム)
ブレ リ ウム ・イン リオフィラ
リウム・ラク トファ メンタム コリ リウム グルタミカム) ブレ リウム ・
リ ウム・ カロ リティカ
リウム ・ ニタ リ ス
ブレ リウム ・ アルバム 2 バクテリウム ・セリ
バクテリ ウム ・ アンモニアフィラム
株となる 、 3 アミ ノ 4 キシ 息香酸類の 合成の となる ンリ ン アスパラギン セミアルデヒ ドを 率的に供 給できる 株であることが好ましい。 アスパルトキナ ゼは、 本来、 リジ オニンによる協奏 フィ ドバッタ 害を受けるが、 フィ ドバッタ 害を実質的に解除する変異を持ったアスパルトキナ ゼ 伝子を有する 菌 が特に好ましい。
アスパルトキナ ゼは ニッ ト サブ ニッ トからなる 白質であり、 ニッ ト ニッ トの 伝子上のコ ド 部 している r n ba t r g t c r v b ct 1 r
来のアスパルトキナ ゼ ット の 列を配列 に示 す。 アスパルトキナ ゼのフィ ドバッタ 害を解除するには、 ニッ ト上の 位置で表すと、 端から 目のアラニン オニン 、 あるいは 端から 11 目の オニン ソロイシン 、 あるいは 端から 目のセリ ン シン 、 あるいは 端から 目の オニン ソロイシン 、 あるいは 端から 目の オ ン ソロイシ ン 、 あるいは 端か 3 目のアルギ ン グリ シン 、 あるい は 端から 4 目のグリ シン アスパラギン 、 それぞれ 換するよ うな変異を導入することにより 成される (WO 94 2 5 6 ０ 5 パンフレッ ト、 ０ ０ 3 3 8 B パンフレット、 米国 6 844 6 報、 W ０ 49 8 54 パンフレッ ト等) 。 なお、 アスパルトキナーゼは、 野生 であってもその 来する の 類や株によって配列 に示した配 列 比較して数個のアミ ノ の 違があるものがあり、 このようなアレル 異体 であってもよい。 このよ な変異の 、 前述の gr および gr について述 た ものと同義であり、 前記フィ ドバッ 害を解除するための 、 当業者に とって の アライ ンメン トを実施することにより 応する 所を特定すること ができる。 アスパルトキナ ゼのフィ ドバッタ 害を解除するための 、 当業 者にとって の 法、 例えば、 2 アミ ノ ルシステイ ン等の アナログに 3 性を有する変異 の 相同組 えを利用した遺伝子 換による部位 変異 入によって 成できる。 また、 フィ ドバッタ 害を解除した アスパルトキ ナ ゼをコ ドする遺伝子を含むブラス を用いて 菌を形質 換するこ とによっても、 イ ドバッタ 害を解除した アスパルトキナーゼの 性を強 化した 菌を得ることができる。 なお、 実施 においては、 端から 目のアラニン オニン に置換することにより フィ ドバッタ 害が解 除された リウム・グルタミカムA J ０ 3 5 ( 2 ０ ０4
5 ０ ) を使用した。 また、 J ０ 3 5株は、 リジンパ ミア を コ ドする遺伝子である y を している。
また、 イ ドバッタ 害を解除した アスパルトキナ ゼ 伝子を有する 、 さ らに ルビン シラ ゼ 伝子の 現を強化した
菌であってもよい。
株となる 、 ンリ ン アスパラギン セミ ア ルデヒ ドを 率的に供給できる 株であればいずれも使用 能である。
ンリ ン アス ラギン セミ アルデヒ ドから 3 アミ ノ 4 キシ 息香酸を生成する活性を有するタンパタ質をコー ドする Aを組み 込んだ タタ を用いた上記コ リ の 、 術分野で公 の って行う ことができる。 えば、 プロ トプラス ト G e e 3 9 2 8 2 8 6 9 8 5 、 エレ トロポレ ショ ン ( O e c o O 7 ０ 6 7 ０ 7 ０ 9 8 9 ) ) 等を使用することができる。 アスパルトキナ ゼの イ ドバッ 害を解除するための 換を行う場合、 3， 4 A 性を付与するための 換とアスパルトキナ ゼのフィ ドバッタ 害を解除す るための 換のいずれを先に行っても良い。
4 3 アミ ノ 4 キシ 息香酸類の
前 のようにして得た の 換体を 養し、 地中で生産される 3 アミ ノ 4 キシ 息香酸類を回収することによって・ 3 アミ ノ 4 キシ 息香酸類を製造することができる。
換体を するための 、 生育する 地であれば特に制限 はなく 術分野で公 の 法に従って培養することができる。 えば、 炭素 、 無機イオンを含有する通常の 地で することができる。 さらに高 増殖 を得るために、 ビタミ ン、 アミ ノ の 機微量 を必要に応じて 加すること もできる。 、 通常、 で～ でであり、 P は ・ ・ Z 御することが 望ましい。 間ほ、 通常、 ～ 間である。
換体の 酸素 件下で行う ことが望ましい。 体的には 育が対数増殖 に移行した段階で ・ pp 下に保持されることが望ましい。
養液から 3 アミ ノ 4 キシ 息香酸類を回収・ する工程で用 る 回収方法は。 の 法から 択すればよい。 えば、 養液を 3 アミ ノ 4
キシ 息香酸類の 解性の に調整してから、 を遠心 の 法により除去した 養液上清から回収することが好ましい。 を除去した 養液上清からからの 3 アミ ノ 4 キシ 息香酸の 収方法としては
による精製、 、 化などが挙げられる。
明にお て使用される とは、表面積の きな の で あり 具体的には、 シリカゲル アルミナ、 オライ ト キサイ ト、 グネシア、 活性白土、 アタ リル系 に代表される親水性 、 木炭、 骨炭、 活性炭、 に代表される が挙げられる。 明においては、 不 純 を吸着することよって 3 アミ ノ 4 キシ 息香酸類の 度を向上でき るものであれば特に限定なく使用できる。 ただし、 によって 着される不 純 とは、主として生化学的合成の 程において生産される 合物が多く 有 されるので、 明にお てはこれらの 合物が吸着しやすい 性炭
に代表される が好適に用 られる。これら 単独で使用 してもよいし、 2 上を組み合わせて使用してもよい。
性炭が使用される場合には、 その 料としては特に限定はなく 、 例えば 、 ヤシ 殻などの 料、 無煙 石油ピッチ、 コ タス等の石炭、 石油 料、 アク リル 脂 フ ノ ル 脂、 ポキシ 脂、 ポリエステル 脂などの 成樹脂 料などが挙 げられる。 また活性炭の 状としては 、 粒状、 繊維 、 フィルタ カ ト リ ッ ジ状の二 工品等があるが特に限定はな り扱いやすいものを選択すればよ い。
方、 が使用される場合には、その 料としては特に限定はない が、 例えば ) の 脂、 2 ) を有する 脂、 3 ) に特殊 理を施した の 使用できる。 体的 合物としては、 例えば レン ンゼン系 が挙げられる。
述したように 養液 3 アミ ノ 4 キシ 息香酸類を多
に接触させる目的は、 不純 を多 に吸着せしめ、 3 アミ ノ 4
キシ 息香酸類の 度を向上させることにあるが、不純 と同時に目的 である 3 アミ ノ 4 キシ 息香酸類も に少なからず 着されてしま う場合がある。そこで 養液 3 アミ ノ 4 キシ 息香酸類を接触させ た後、 に極性 接触させ、 剤から 3 アミ ノ 4
キシ 息香酸類を脱 、極性 に溶離させることでも 3 アミ ノ ー 4 キシ 息香酸類を単離、 回収することが可能である。 明において使用さ れる とは高い をもつ 性分子からなる有機 のことをいい、上記 したように、 剤から 3 アミ ノ 4 キシ 息香酸類を脱 、 ， 3 アミ ノ 4 キシ 息香酸類を 離させることができるもの であれば特に限定されることなく使用できる。 単独で使用しても わな し、 2 上を所望の で組み合わせて使用しても良 。
明における または とは、目的 質が溶解している 発させて したり、 あるいは温度を下げたり、 あるい 質が溶解している
加えたりすることによって 飽和 解度より も濃度を高くすることにより結晶または を生じさせる 作のことを言 、従来 の 法を含め特に限定されるものではない また生成した結晶または 、 沈降、 過、 遠心 離などによって分離することがで きる。
明における ベンゾ ゾ ルポリ の製 法とは、前述の 明の 法により得られる 3 アミ ノ 4 キシ 息香酸類をポリ する工程を含 む 法であって、 前述したよう に、 明の の 養液中から
を用いて、 あるいは、 、 化などによって 度を向上させた 3 アミ ノ 4 キシ 息香酸類を 高温においてメタンスルフォン 、 もしくは ポリ リ ン酸 のような 合によって重合することによってポリ される ( ) 。 ポリ 化の方 の の 法を適用することによって 能である ( 5 2 ０ 2 報、 米国 5 2 9 8 報、 米国 542 24 ) 。 以下、 本 明を実施 によりさ らに 体的に説明する。
S g se s O 335０ 34 A A 伝子 プラス の
) S g se s O 335０ 3 4 A BA 伝子の
S・ g se s O 335０ 伝子及び g 伝子 ( 下、 両 伝子 あわせ て 34 A A 伝子という。 の 列は既に決定されている[ Bo C e ・ 28 823 833(2００6 。 この 列を参考にして、 配列 2に示したブラ イ を合成し、 常法に従って 藤、 三浦の oc o sAc a・ 72 6 9 963 製した S・ g se s O 335０の 色体 D Aから 3 4 A BA
伝子配列をコ ドする 域を PC 法にて増幅した。 PCR 応にほ Py obes D A o e ase( )を用い、 反応 業者の するプロ ト に従った。 その 果、 約 2 bの PCR 片が得られ この 片の 基配列を決定したと ころ、 g 伝子を含む 片であることが確認された。 、 塩基配列の イ タ ミネータ サイタルシ ンシングキッ ト(PEアプライ ドバイオシステムズ と D Aシ タ ンサ 373A PEアプライ ドバイオシステムズ )を用いて行っ た。 g 伝子の 列を配列 7 に示す。
(2 3 A BA 伝子プロモ タ 域の
S・ g se s O 335０ 3 4 A BA 伝子を リ ウムで効果 的に発現させる必要がある。 そのため、 コ リ バタ リ ウム・グルタミ の PS2の 伝子のプロモ タ を g 伝子の 流に導入することにした。 C・ g a c の タ ンパタ質であ る PS2 の 伝子の 列は既に決定されている [ o c ob o ・， 9， 97 ０9( 993 。 この 列を参考にして配列 8 4に示し たプライ を合成し、 常法に従って調製した C・g a c ATCC 3869の 色体 D Aから PS2タン タ 伝子のイニシエ ショ ン の 流域のプロモ タ を含む 域を PCR法にて増幅した。PCR 応には P obes D APo y e ase
を用い、 反応 業者の するプロ ト に従った。 その 果、 約 0・5 b の PC 片が得られ、 この 片の 基配列を決定したと ころ、 PS2 タンパタ 伝子のイニシ ーショ ン の 5 流域のプロモ タ を含む 域を含む 片であることが確認された。 基配列の 前述の 法に従っ た。
( で決定した g の 伝子配列をもとに配列 6、 PS2タンパク 伝子のイニシ ショ ン の 5 流域のプロモ タ を含む 域の 基配列を もとに配列 5 に示したブライ をそれぞれ合成した。 5 6 は のカセットプライ である。
次に、 増幅させた C・g a e ATCC 3869の PS2 伝子のプロモ タ を 域と、 やはり増幅させた g 伝子 域の PCR を混ぜて 型とし、 配列 5 6 を用いて ロスオ バ PCR を行い・ C・ a c ATCC 3869 の タンパク 伝子のプロモ タ を含む 域に接続された g の 伝子を増幅させた。 ガロ スゲル により、 2・6 bの 片を検出した。 この 片を EASYTRAP Ve 2 )を用いて ガロ ス から回収し、 9 322774 載のプラス P 4の 部位に 入することに よって、 プラス pP 4 を構築した。 の 法に従って、 片の 基 配列の 定を行い、 予想通りの 伝子が されていることを確認した。
2 S g se s O 335０ 伝子をコードする 伝子を用 いた リウム ・ ダルタミ による 3 4A Aの
( S se s 335０ g 伝子をコ ドする 伝子を用 た
リウム・グルタミ の
にて構築されたブラス pP 4g (プロモ タ は C・ a c ATCC 3869の PS2 来で 伝子は S・ g se s FO 335０ で
リ ウム ・ グルタ ミ C・g a ATCC 3869 あ る いは C g a A ０ 35を形質 換し 2 5 g のカナ イシンを含む C 2G キス トラク ０9、 ト リ プトン ０9、 グルコ ス 5 a 5 、 寒 天 5 9、 水で に調整し、 ０ 、 2０ で生育した 株を選択した。 なお・ C・g a e AJ ０ 35は 2００4 26 5０ に記載されて るように 目のアラニン オニン に置換させるよ な変異を導入することでアス パルトキナ ゼを脱感作し ジンパ ミア ゼ 伝子を欠損させている。 、 2００4 26 5０に記載された方法により、 C・g a c ATCC 3869より 築することができる。
2 フラスコを用 た バタ リ ウム・グルタミ による 3 4 A BAの
2( で選択した pP 4g を有する C・g a c ATCC 3869 あるいは pP 4g を有する C・g a c A ０ 35をフラスコ グルコ ス ００9 マグネシウム 9、 アンモ ウム 55 、 リ ン 水素 リ ウム
0０ 9、 ンガン ０・０ 9、 チアミン 酸塩 2 ビオ チン ０・5mg コチンアミ ド 5mg、 大 水分解 、 トータル 有 量として) ０59、炭酸 ルシウム 5０9、水で にして 72 Z 整し 5C 5 )でそれぞれ 3０ 7 間、 2０ で 養した。 験として P 4g を導入して ない C・g a c ATCC 3869 の 実施した。 pP 4g を有する C g a c ATCC 3869 ある は P 4g を有する C・g a c A ０ 35を する際には カナ イシン 度が 25 Zなるよ うフラスコ 地に添加した。 7 養した結果、 す ての 件で ルコ スは 完全に消費されていた。 P 4g を導入した C・g a c ATCC 3869 は 84 A BAを 0 7 PP 4g を導入した C g a c A ０ 35 34 A A を ・4 g それぞれ 積 した 。 方、 pP 4g を導入 していな C・g a c ATCC 3869では 34A Aを生成しなかった。 、 3 4A Aの 鈴木らの [ B o C e ・ 28 823833(2００6 に 、 ロ トグラフィー により した。 上の結 より、 コ リ バタ リウム グルタミ に S・ g se s F 335０ g 伝子を導入することで、 8，4 A BAを生産 能であることが 示された。 また、 野生 である C・g a c ATCC 3869 Zく ら 、 フィ ドバッ タ 害を解除した アスパル トキナ ゼ 伝子を有する C・g a c A ０ 35 のほうが P 4g を導入することで 8 4 A BAをより多く 積した。 C O・D AH A Ly ・
H 60 60nm L
2256 49 ND ・5 ND
22569「lH 7 ・56 069 3 ND
2256Clg H 7 42 39 80 ND 3 ジャ フ ァ メ ンタ を用いた リ ウム ・ グルタミ による 4A BAの
2 で得られた P 4g を有する C・g c AJ ０ 35を用いて以下 の 験を行った。
ダルコ ス 5 、 ポリ プトン ０ キス ０9 a 59 D オ ン 0・2 ０００ P 72)の 地を 5０ ずつ フラスコに分注
2 理した。 この 地に P 4g を有する C g a c A ０ 5 を に 24 とう 養した。
ダルコ ス 4０ 、 グネシウム 0・ ００ の A 地 と アンモニウム ・29、 リ ン 水素カリ ウム 0・49、 4m 、 ンガン 4 g チアミ ン 酸塩 8００ 9、 ビオチン 2０ 9、 コチンア ミ ド 2００ 、 (大 水分解 、 ト タル 有量として) ０42 g Gn 4０ 26０ の B 地をそれぞれ 2０ 、 2０ 理 した。 A および 地を 同じく 2０ 。 2０ 理した ・5 容 のジャ ファ メンタ に入れて混合し カナ イシン 度が 25 g になるよう に添加した。 この 地に上記 養液を 4０ 、 以下の 件で 養を実施 した。 ０・5 v の 度で空気を供給しながら 3０で、 p 72、 6００ 定の 件下で 理を行った。 地中の ルコ スがほぼ された 段階で、 グルコ ス 液の流 を開始し、 グルコ ス 度が ０ から 3０ なるように流速を手動で制御した。 グルコ ス 7０ 液を約 8０m 加した時点で流 を停止した。 養中に適 サンプリ ングを実施した。サンプリ ングした 養液を 0 1 で ００倍に希釈し、 遠心 4０００ p 5 。 4 して得られた 上 中の 3 4A A 度を分析した。 実施 2 2 の 法に従った。 その 果、 P 4g を有する C・g a c m A ０ 35 を 87 養した 上 には 2０ 34A BAが 77 g 積していた( 5
3 フィ ドバッタ 害を解除した アス ルトキナ ゼ 伝子の 現を強化あるいは ルビン シラ ゼ 伝子の 現を強化する ことによる C・ a c A ０ 35の 3 A A 上効果の
( C am c A ０ 35 フィ ドバッタ 害を解除した アスパルトキ ナ ゼ 伝子 プラス の
C g a c A ０ 35 フィ ドバッタ 害を解除した アスパルトキ ナ ゼ 伝子 、 f b 「 伝子と記述する の 列は既に決定され、 変異 も明 らかにされている ( 2００4 26 5０ 。 この 列を参考にして配列 3 9
4 ０に示したブライ を合成し・ 法に従って調製した C・g a c A ０ 35 の 色体 D Aから f b 伝子のイニシエ ショ ン の 流域 のプロモ タ を含む 域を PC 法にて増幅した。 PCR 応には P obes D A o e ase( を用 、 反応 業者の するプロ ト に従った。 その 果、 約 ・8 bの PCR 片が得られ、 この 片の 基配列を決定したと ころ、 A 伝子を含む 片であることが確認された。 ・ 基配列の イタ ミネ タ サイタルシ タ ンシングキット PEアプライ ドバイオシステムズ と D Aシ タ ンサ 373A (PEアプライ ドバイオシステムズ )を用いて行 った。 A f b 伝子の 基配列を配列 4 、 対応するアミ ノ 列を配列 42 。 この 片を EASYTRAP Ve を用いて ガロ ス か ら回収し、 9 ０ 7 ０ 2 9 載のプラス VC7 の S a 部位に 入する ことによって、 プラス VC7 b「を構築した。 の 法に従って、 片の 基配列の 定を行い、予想通りの 伝子が されていることを確認した。 2) C a c A ０ 35 A 伝子をコ ドする 伝子を用いた リウム・ グルタミ の
3( にて構築されたブラス VC b C・g a c A ０ 35 を形質 換し 25 g几 のカナ イシン、 5・０ g几 の ラムフ ニコ ルを含む C 2G ( キス トラ ０9、 トリプトン ０9、 グルコ ス a 9、 寒天 5 9 水で Zする)で生育した f b 「 伝子を増強した C g a c A ０ 35 を選択した。 (3 C a c ATCC 3869 ピルビン シラ ゼ 伝子 ブラス の
C・g a c ATCC 3869 ピルビン シラ ゼ 伝子 ( 下、 P C 伝子と記述する の 列は既に決定されて る Ap c ob o o ec o ・ 5０ 346352( 998 。 この 列を参考にして配列 43 44に示したプライ ーを合成し、常法に従って調製した C・g a c ATCC 3869の 色体 D Aから P C 伝子のイニシエ ション の 5 流域のプロモ タ を含む 域を PCR 法にて増幅した。 PCR 応には Py obes D APo e ase を用い、 反応 業者の するプロ ト に従った。
その 果、 約 4 bの PCR 片が得られ この 片の 基配列を決定したと ころ、 P C 伝子を含む 片であることが確認された。 基配列の イタ ミ タ サイタルシ タ ンシングキッ ト (PE アプライ ドバイオシステムズ と D Aシ タ ンサ 373A PEアプライ ドバイオシステムズ )を用いて行っ た P C 伝子の 基配列を配列 4 5 に、 対応するアミ ノ 列を配 46 に示す。 この 片を EASYTRAP Ve 2 を用いて ガロ ス から回収 し、 9 ０ 7 ０ 2 9 載のプラス VC7の S a 部位に 入することに よって、 ブラス pVC7P Cを構築した。 の 法に従って、 片の 基配 列の 定を行い、 予想通りの 伝子が されていることを確認した。
4 C g a c ATCC 3869 P C 伝子をコ ドする 伝子を用いたコ リ バタ リウム・グルタミ の
3(3 にて構築されたブラス VC7P CでC・g a c A ０ 35を形質 換し、 25 mg のカナ イシン、 5・０ g の ラムフ コ ルを含む C 2 キス トラク ０9 トリ プトン ０9、 グルコ ス 59 a 59 5 9、 水で にする で生育した (P C 伝子を増強した C・g a c m A ０ 35 を選択した。
(5 フラスコを用いたA r 伝子を増強した C・g a c A ０ 35 と P C 伝 子を増強した C・g am c A ０ 35の 3 4A A 上効果の
32 および 3 で選択した A 伝子を増強した C g a c A ０ 35 C 伝子を増強した C・g a c A ０ 35を用い、 フラスコ (グルコ ス ００ 9、 ダ シウム 9、 アンモニウム 55 9、 リ ン 水素カリ ウム 9、 ０・０ 9 ンガン ０・０ 9、 チ アミ ン 酸塩 2 g、 ビオチン 0・5 g、 コチンアミ ド 5 (大 水 分解 、 ト タル 有量として) ０59、 炭酸 ルシウム 5０9、 水で にし て p 7・2 に調整し、 カナ イシン 度が 25 g ラムフ ニコ ル 度が 5・０ g になるよう )でそれぞれ 3０C 7 間、 で 養した。 また、 対 照 験として、pVC7を導入した C・g a c A ０ 35 も上記フラスコ 地に カナ イシン 度が 25 g になるように添加し 養を実施した。 7 養した 結果、 す ての 件で ルコ スは完全に消費されていた。 A 伝子を増強し た C g a c A ０ 35 は 84 A BA を ・０ g P 伝子を増強した C・g a c A ０ 35は 34A A を ０・6 それぞれ 積していた( 2 。 方、 対照 験として行った VC7を導入した C・g a c AJ ０ 35 t 3 A BA を 0・5 g 積していた 上の結 より、 A b 伝子を増強した C・g a c A ０ 35 P C 伝子を増強した C・g a c A ０ 35 では、 対照である C・g a c A ０ 35にく ら A A 成能が向上した。
2 C O・D AH A Ly ・
H 6０ 6 n L L L
2256C r H VC7 7 32 ０5 25g ND・
2256C r H Akb 36 ０ 186 N・D・
2256C r H C 7 126 ０6 322 ND・
の )
伝子を含む D A プライ
2 g 伝子を含む D A プライ
3 PS2 タンパタ 伝子のプロモ タ 域を含む D A プラ イ
4 PS2 タンパタ 伝子のプロモ タ 域を含む D A プラ イ
5 PS2タンパタ 伝子のプロモ タ 域及び g 伝子を含む D A PC プライ
6 PS2タンパタ 伝子のプロモ タ 域及び g 伝子を含む D A プライ
7 g 伝子
配列 8 S ep o ces g se s g 伝子配列
9 S ep o yceS g se s g アミ ノ
０ a k a s ・ g 伝子
F a a Sp・ g アミ ノ
2 F a a Sp g 伝子配列
3 a a Sp・ アミ ノ
4 S ep o ces Scab es 伝子配列
5 S e o ces Scab es g アミ
6 B o de a S 383 g 伝子配列
7 B o de a S 383 g アミ ノ
8 e ococc s a asc 伝子配列
9 e a ococc s a asc g アミ ノ
2 ０ Esc e c a Co d A 伝子配列
2 Esc e c a Co d Aアミ ノ
2 2 S e o yces g se s 伝子配列
2 3 S e o ces g se s g アミ ノ
24 a a S ・ g 伝子配列
2 5 a a Sp・ g アミ ノ
2 6 a k a S ・ g 伝子配列
2 7 Ta a S ・ g アミ ノ
2 8 k o de a Sp 383 g 伝子配列
2 9 B k o de a Sp 383 アミ ノ
3 ０ k o de a S 383 伝子配列
3 o de a S 383 g アミ ノ
3 2 S ep o yces Scab es g 伝子配列 3 3 S ep o ces Scab es g アミ ノ
34 e a ococc s a asc g 伝子配列
3 5 e a ococc s a asc ア ノ
3 6 g コ ンセンサス
3 7 g コンセンサス
3 8 Co y ebac e g a c ATCC 3869 アスパルトキナ ゼ ットアミ ノ
3 9 A 「 伝子を含む D A プライ
4０ A 伝子を含むD A プライ
4 Co ebac e g a c ATCC 3869 f b 伝子の 基配列
42 Co ebac e g a c ATCC 3869 A f b タンパタ質 のアミ ノ
43 P C 伝子を含む D A プライ
44 P C 伝子を含む D A プライ
4 5 Co ebac e g a c ATCC 3869 P C 伝子の 基配 列
46 Co y ebac e a c ATCC 3869 P Cタンパク質のア ミ ノ
上の利用 能性
明によって 料、 、 医薬品その 成品の 間体や ベンゾ ゾ ルの ノ として有用であるア ノ キシ 息香酸類を簡便 価に 造す ることができる。 よって、 例えば、 明によって得られた 3 アミ ノ 4 キ シ 息香酸を重合することで ベンゾ ゾ ル (PBO) が得られ、 これにより 度、 高 、 熱性を有する PBO 維やPBOフィル などを安価に提供す ることが可能となる。 また、 原料である 3 アミ ノ 4 キシ 息香酸類を生合 成によって製造することが可能であることから、 明の 環境 プロセ スとなり、 地球環境に対して優し 製造 法である。

Claims

求の
・ フィ ドバック 害を解除した アスパルトキナ ゼをコ ドする遺伝子を 有し、 ンリ ン アスパラギン セミ から 3 アミ ノ
4 キシ 息香酸を生成する活性を有するタンパタ質をコ ドするD Aを 組み込んだ タタ で 換したコ リ 菌を する工程を含む、 3 アミ ノ 4 キシ 息香酸類の 。
2 コ リ 菌が、 変異 アスパルトキナ ゼをコー ドする遺伝子の 現が強 化された 菌である、 請求 に記載の 。
3・ コ リ 菌が、 ルビン シラ ゼ 伝子の 現を強化した 菌である、 請求 又は 2に記載の 。
4・ Aが gr 伝子および gr H 伝子を含む、 請求 3の ずれかに 記載の 。
5・ gr 伝子および gr 伝子が放 来である、 請求 ～4のいずれ かに記載の 。
6・ コ リ 菌が、 コ リ リウム・ グルタミ である、 請求 ～5 の ずれかに記載の 。
7・ ～6のいずれかに記載の 法により製造した アミ ノ 4 キ シ 息香酸類をポリ する工程を有する ポリベンゾ ゾ ルポリ の製 。
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