CN103695364B - 通过弱化5‑氨基乙酰丙酸脱水酶活性获得5‑氨基乙酰丙酸高产菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种构建5‑氨基乙酰丙酸(ALA)生产菌株的方法，即弱化所述ALA生产菌株中5‑氨基乙酰丙酸脱水酶的活性。本发明还公开了利用所述方法构建的ALA生产菌株和利用所述菌株制备ALA的方法。利用本发明的菌株无需添加外源5‑氨基乙酰丙酸脱水酶抑制剂即可高产量、低成本产生ALA及其下游产物。本发明的方法还可与现有技术中其它构建ALA生产菌株的方法联用，从而进一步提高ALA的产量。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程和微生物发酵技术领域。具体地说，本发明涉及利用5-氨基乙酰丙酸脱水酶活性弱化的细菌提高5-氨基乙酰丙酸产量的方法和应用，以及5-氨基乙酰丙酸脱水酶活性弱化的生产菌株。
背景技术
5-氨基乙酰丙酸(5-minolevulinic acid，ALA)是生物体合成血红素、叶绿素、VB12等四吡咯化合物的前体，广泛存在于动物、植物和微生物中。ALA在医药和农业领域的应用非常广泛，在医药上ALA可以作为光敏剂用于癌症治疗和肿瘤诊断，在农业上ALA既可以作为植物生长调节剂促进作物生长，又可以作为生物农药用作杀虫剂和除草剂。ALA可以通过化学合成法和生物发酵法制备，而清洁高效的生物发酵法逐步成为研究和开发的重点，并已经得到了产业化应用。
目前ALA的生产菌株主要是通过诱变育种或基因工程改造获得，现有文献报道的基因工程改造的研究大多集中在强化ALA的合成途径上，例如增强ALA合成途径关键酶的表达，而对ALA的下游代谢途径的改造较少。
5-氨基乙酰丙酸脱水酶(ALAD)是由hemB基因编码，催化两分子ALA缩合形成一分子胆色素原(PBG)，进一步通过多步酶促反应合成终产物血红素等四吡咯化合物。而血红素等下游代谢产物的生成不但降低ALA的积累，对目的产物的分离提取亦造成很大的麻烦。因此，在ALA工程菌株构建及发酵过程中为了避免合成的ALA过多地代谢合成血红素等副产物，对ALAD活性的控制非常关键。但由于四吡咯化合物参与多种基础生命活动，因此hemB基因缺失使得菌体生长受到很大影响，甚至无法生长。为了降低ALA的下游代谢，现有研究中常用的方法是在发酵后期添加乙酰丙酸、D-葡萄糖、D-木糖等抑制剂抑制ALAD的活性，以增强ALA的积累(Nishikawa等,J Biosci Bioeng,1999.87(6):798-804；Liu等,Appl BiochemBiotechnol,2010.160(3):822-830；EP718405； WO9854297；CN101041839)。然而，上述在发酵后期添加ALAD抑制剂的方法不仅造成发酵工艺复杂，生产成本提高，而且不利于后续产物的分离提取，因此，这种外源添加ALAD抑制剂的方法不利于ALA的大规模工业化生产。此外，有报道也曾尝试将胞内合成的ALAD快速降解，但ALAD的降解不但没有引起预期的ALA产量的提高，反而造成其产量的下降(王阳，山东大学硕士毕业论文，2012)。而在基因水平上，Xie等(Xie等,Biotechnol Lett,2003.25(20):1751-1755)研究发现以hemB基因发生突变的CGSC4676菌为宿主菌表达外源ALA合成酶，ALA的产量与野生菌相比没有明显提高；专利EP718405公开了一种用于ALA生产的类球红细菌CR-520，该菌株中ALAD突变降低了抑制剂的添加浓度，虽然该方法提高了ALA的产量，但突变的目的在于增强抑制剂乙酰丙酸的抑制效果，降低乙酰丙酸的添加量，发酵过程仍然没有摆脱对抑制剂添加的依赖。
综上所述，本领域急需开发高产量、低成本、简单的ALA制备方法。
发明内容
本发明的主旨在于提供5-氨基乙酰丙酸高产菌株的构建方法以及5-氨基乙酰丙酸的高产菌株。
在第一方面，本发明提供一种5-氨基乙酰丙酸生产菌株的构建方法，所述方法包括：弱化所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中5-氨基乙酰丙酸脱水酶的活性。
在优选的实施方式中，所述弱化是将5-氨基乙酰丙酸脱水酶的活性降低但不完全丧失。
在另一实施方式中，所述弱化是将所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中5-氨基乙酰丙酸脱水酶的活性降低至原始活性的0.5%-50%，优选降低至原始活性的0.5%-30%。
在优选的实施方式中，所述弱化通过以下方法之一或组合实现：部分敲除5-氨基乙酰丙酸脱水酶的编码基因hemB、5-氨基乙酰丙酸脱水酶编码基因突变引起氨基酸残基变化、改变5-氨基乙酰丙酸脱水酶编码基因启动子、翻译调控区或编码区密码子令其转录或翻译弱化、改变5-氨基乙酰丙酸脱水酶编码基因序列使其mRNA稳定性减弱或酶结构不稳定等。
在优选的实施方式中，所述弱化通过5-氨基乙酰丙酸脱水酶编码基因突变 实现。
在优选的实施方式中，所述基因突变是通过易错PCR实现。
在优选的实施方式中，所述构建方法是在hemB缺失的菌株中回补催化活性降低的5-氨基乙酰丙酸脱水酶突变基因。
在优选的实施方式中，所述构建方法是在hemB缺失的菌株中通过质粒和/或染色体整合回补催化活性降低的5-氨基乙酰丙酸脱水酶突变基因。
在优选的实施方式中，所述构建方法是在hemB基因缺失的菌株中通过质粒回补酶活性降低的5-氨基乙酰丙酸脱水酶突变基因。
在优选的实施方式中，所述构建方法是在hemB基因缺失的菌株中通过染色体整合回补酶活性降低的5-氨基乙酰丙酸脱水酶突变基因。
在优选的实施方式中，所述酶活性降低的5-氨基乙酰丙酸脱水酶突变基因如SEQID NO:1-4中任一项所示。
在另一实施方式中，所述方法还包括：强化所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中5-氨基乙酰丙酸合成的相关酶。
在优选的实施方式中，所述强化是在所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中表达外源性ALA合成酶，例如沼泽红假单胞菌ALA合成酶。
在优选的实施方式中，所述强化是在所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中表达外源性ALA合成酶和碳四回补途径关键酶，如磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。
在优选的实施方式中，所述菌株为大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)等。
在优选的实施方式中，所述细菌优选埃希氏菌属细菌，更优选大肠杆菌。
在第二方面，本发明提供一种5-氨基乙酰丙酸生产菌株，所述菌株中5-氨基乙酰丙酸脱水酶的活性得到弱化。
在另一实施方式中，所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中5-氨基乙酰丙酸脱水酶的活性降低至原始活性的0.5%-50%，优选降低至原始活性的0.5%-30%。
在另一实施方式中，所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中5-氨基乙酰丙酸脱水酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:5-8中任一项所示。
在优选的实施方式中，所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中包含5-氨基乙酰丙酸脱水酶的编码基因，所述编码基因如SEQ ID NO:1-4中任一项所示。
在优选的实施方式中，所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株无需添加外源性5-氨基乙酰丙酸脱水酶抑制剂而高水平地产生5-氨基乙酰丙酸。
在优选的实施方式中，所述菌株产生5-氨基乙酰丙酸的产量高于7g/L。
在优选的实施方式中，所述菌株为大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)等。
在优选的实施方式中，所述菌株优选埃希氏菌属细菌，更优选大肠杆菌。
在第三方面，本发明提供一种产生5-氨基乙酰丙酸的方法，所述方法包括：
1)培养本发明第二方面所述的5-氨基乙酰丙酸生产菌株，从而得到5-氨基乙酰丙酸；和
2)从1)的发酵培养体系中获得5-氨基乙酰丙酸。
在优选的实施方式中，所述方法获得的5-氨基乙酰丙酸的产量高于7g/L。
在优选的实施方式中，所述方法在不外源性添加5-氨基乙酰丙酸脱水酶抑制剂的情况下实现5-氨基乙酰丙酸的高产。
在第四方面，本发明提供本发明第二方面所述的5-氨基乙酰丙酸生产菌株的用途，所述菌株用于产生5-氨基乙酰丙酸和/或产生以5-氨基乙酰丙酸为前体的下游产物。
在优选的实施方式中，所述下游产物是以ALA为前体的血红素或维生素B12。
在第五方面，本发明提供一种多核苷酸，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ IDNO:1-4中任一条所示。
在第六方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体包含本发明第五方面所述的多核苷酸。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了不同hemB基因突变株的生长情况。
图2显示了不同hemB基因突变株ALA产量的情况
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现通过弱化ALA生产菌株的ALAD活性能够大幅提高ALA的产量，从而实现了ALA产量的提高以及改造ALA生产菌株的方法。在此基础上完成了本发明。
术语定义
本文所用的术语“弱化”是指降低、削弱、减小某种蛋白，例如酶的活性，但不能使得该酶的活性完全丧失。在具体的实施方式中，本发明方法弱化5-氨基乙酰丙酸生产菌株中5-氨基乙酰丙酸脱水酶的活性。
在具体的实施方式中，弱化5-氨基乙酰丙酸脱水酶的活性可以通过部分或全部敲除酶的编码基因、基因突变失活或部分失活、基因启动子或翻译调控区改变令其转录或翻译弱化、改变基因序列使其mRNA稳定性减弱或酶结构不稳定等方法或其组合来实现。在优选的实施方式中，所述弱化通过5-氨基乙酰丙酸脱水酶编码基因突变实现。在进一步优选的实施方式中，所述基因突变是通过易错PCR实现。
在具体的实施方式中，本发明方法将获得的5-氨基乙酰丙酸生产菌株中5-氨基乙酰丙酸脱水酶的活性降低至原始活性的0.5%-50%。在优选的实施方式中，本发明方法将获得的5-氨基乙酰丙酸生产菌株中5-氨基乙酰丙酸脱水酶的活性降低至原始活性的0.5%-30%。
本文所用的术语“外源性”是指某体系中包含了原来不存在的物质。例如，通过转化等方式在某菌株中引入该菌株中原本不存在的酶的编码基因，从而在 该菌株中表达该酶，则该酶对于该菌株是“外源性”的。
本文所用的术语“强化”是指增加、提高、增大或升高某种蛋白，例如酶的活性。鉴于本发明的教导和现有技术，本领域技术人员也不难理解本文所用的“强化”还应包括通过表达酶的异源编码基因而增强其活性。在具体的实施方式中，强化酶的活性可以通过表达酶的内源或异源性编码基因，和/或增加所述编码基因的拷贝数，和/或改造所述编码基因的启动子以增强转录启动速度，和/或修改携带有所述编码基因的信使RNA的翻译调控区以增强翻译强度，和/或修改编码基因本身以增强mRNA稳定性、蛋白质稳定性、解除蛋白质的反馈抑制等方法来实现。
本文所用的术语“5-氨基乙酰丙酸合成的相关酶”表示微生物中涉及产生5-氨基乙酰丙酸的各种酶，包括但不限于，例如5-氨基乙酰丙酸合成酶、谷氨酰-tRNA合成酶、谷氨酰-tRNA还原酶或谷氨酸-1-半醛氨基转移酶，等等。类似地，本文所用的术语“强化5-氨基乙酰丙酸合成的相关酶”是指微生物中涉及5-氨基乙酰丙酸合成的酶，例如5-氨基乙酰丙酸合成酶、谷氨酰-tRNA合成酶、谷氨酰-tRNA还原酶或谷氨酸-1-半醛氨基转移酶的活性得到强化。在优选的实施方式中，所述酶是来源于沼泽红假单胞菌的5-氨基乙酰丙酸合成酶。
本发明的5-氨基乙酰丙酸高产菌株
本发明提供了一种5-氨基乙酰丙酸生产菌株，所述菌株中5-氨基乙酰丙酸脱水酶的活性得到弱化。在具体的实施方式中，本发明菌株中5-氨基乙酰丙酸脱水酶的活性降低至原始活性的0.5%-50%。在优选的实施方式中，本发明菌株中5-氨基乙酰丙酸脱水酶的活性降低至原始活性的0.5%-30%。
在具体的实施方式中，本发明菌株中5-氨基乙酰丙酸脱水酶的编码基因序列如SEQ ID NO:1-4中任一项所示。在另一具体的实施方式中，本发明菌株中5-氨基乙酰丙酸脱水酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:5-8中任一项所示。
本发明菌株能够在不添加外源性5-氨基乙酰丙酸脱水酶抑制剂的条件下高水平地产生5-氨基乙酰丙酸。本发明菌株产生5-氨基乙酰丙酸的产量高于7g/L。
本领域技术人员鉴于本发明的教导和现有技术的知识可以知晓，无论是ALA的低产还是高产菌株，只要通过本发明的方法进行改造，都能使得ALA的产量得到提高。
本领域技术人员还知道，许多菌株可以用于产生5-氨基乙酰丙酸。这些菌株虽然不同，但它们合成5-氨基乙酰丙酸的合成体系、途径却是类似的。因此，鉴于本发明的教导和现有技术，本领域普通技术人员可以明白，本发明的菌株可以是任何可用于产生5-氨基乙酰丙酸的菌株，包括但不限于，大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)等。在优选的实施方式中，本发明的菌株优选埃希氏菌属细菌，更优选大肠杆菌。
本发明菌株无需外源性添加5-氨基乙酰丙酸脱水酶即可高产量地产生5-氨基乙酰丙酸。在具体的实施方式中，5-氨基乙酰丙酸的产量高于7g/L。
因此，本发明的菌株可以更低的成本、方便地制备5-氨基乙酰丙酸。
5-氨基乙酰丙酸高产菌株的构建方法
本发明提供了一种5-氨基乙酰丙酸生产菌株的构建方法，所述方法包括：弱化所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中5-氨基乙酰丙酸脱水酶的活性。例如，将所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中5-氨基乙酰丙酸脱水酶的活性降低至原始活性的0.5%-50%，更优选降低至原始活性的0.5%-30%。
本领域技术人员鉴于本发明的内容和现有技术的知识可以了解各种实现上述弱化的技术手段。例如，在具体的实施方式中，所述弱化通过以下方法之一或组合实现：部分敲除5-氨基乙酰丙酸脱水酶的编码基因、5-氨基乙酰丙酸脱水酶编码基因突变引起氨基酸残基变化、改变5-氨基乙酰丙酸脱水酶编码基因启动子、翻译调控区或编码区密码子令其转录或翻译弱化、改变5-氨基乙酰丙酸脱水酶编码基因序列使其mRNA稳定性减弱或酶结构不稳定等。在优选的实施方式中，所述弱化通过5-氨基乙酰丙酸脱水酶编码基因突变实现。在优选的实施方式中，所述基因突变是通过易错PCR实现。
在具体的优选实施方式中，所述构建方法是在hemB缺失的菌株中回补催化活性降低的ALAD突变基因。具体地说，可以在hemB缺失的菌株中通过质粒和 /或染色体整合回补催化活性降低的ALAD突变基因；可以在hemB基因缺失的菌株中通过质粒回补酶活性降低的ALAD突变基因；也可以在hemB基因缺失的菌株中通过染色体整合回补酶活性降低的ALAD突变基因。
在另一优选的实施方式中，所述酶活性降低的ALAD突变基因如SEQ ID NO:1-4中任一项所示。
在弱化5-氨基乙酰丙酸生产菌株中5-氨基乙酰丙酸脱水酶的活性来提高5-氨基乙酰丙酸产量的基础上，本发明人进一步发现，本发明的方法还可与现有技术中其它提高5-氨基乙酰丙酸产量的方法相结合。例如，在具体的实施方式中，弱化5-氨基乙酰丙酸生产菌株中5-氨基乙酰丙酸脱水酶的活性可与强化5-氨基乙酰丙酸生产菌株中5-氨基乙酰丙酸合成途径相关酶的技术手段相结合来进一步提高ALA产量。
本文所用的术语“5-氨基乙酰丙酸合成途径”是指微生物中产生5-氨基乙酰丙酸的具体途径，其中包括各种酶，例如5-氨基乙酰丙酸合成酶、谷氨酰-tRNA合成酶、谷氨酰-tRNA还原酶或谷氨酸-1-半醛氨基转移酶，等等。类似地，本文所用的术语“5-氨基乙酰丙酸合成途径增强”是指涉及5-氨基乙酰丙酸合成途径的相关酶，例如5-氨基乙酰丙酸合成酶、谷氨酰-tRNA合成酶、谷氨酰-tRNA还原酶或谷氨酸-1-半醛氨基转移酶的活性增强。在优选的实施方式中，所述酶是来源于沼泽红假单胞菌的5-氨基乙酰丙酸合成酶。
本领域技术人员知晓“强化5-氨基乙酰丙酸生产菌株中5-氨基乙酰丙酸合成途径相关酶”可以通过各种技术手段实现，包括但不限于以下方法之一或它们的组合：表达所述酶的编码基因，和/或增加菌株中所述编码基因的拷贝数，和/或改造所述编码基因的启动子以增强转录启动速度，和/或修改携带有所述编码基因的信使RNA的翻译调控区以增强翻译强度。
在优选的实施方式中，所述“强化5-氨基乙酰丙酸生产菌株中5-氨基乙酰丙酸合成途径相关酶”是在所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中表达外源性ALA合成酶，例如沼泽红假单胞菌ALA合成酶。
在进一步的优选实施方式中，本发明的方法还包括在构建5-氨基乙酰丙酸生产菌株后测定所得菌株的5-氨基乙酰丙酸产量。
本发明的5-氨基乙酰丙酸高产菌株的用途
本领域技术人员应明白，本发明的5-氨基乙酰丙酸高产菌株可用于产生5-氨基乙酰丙酸，还可用于产生以5-氨基乙酰丙酸为前体的衍生物，例如血红素或维生素B12。
5-氨基乙酰丙酸的生产方法
在本发明方法以及获得的菌株的基础上，本发明进一步提供了产生5-氨基乙酰丙酸的方法，所述方法包括：1)培养本发明的菌株，从而得到5-氨基乙酰丙酸；和2)从1)的发酵培养体系中获得5-氨基乙酰丙酸。
在优选的实施方式中，所述方法获得的5-氨基乙酰丙酸的产量高于7g/L。在另一优选的实施方式中，所述方法无需额外添加外源性5-氨基乙酰丙酸脱水酶的抑制剂。
本发明的优点：
1.本发明的菌株提高了ALA的产量；
2.利用本发明菌株制备ALA无需外源性添加ALAD抑制剂，大大降低了生产成本。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员通常理解的意义相同。虽然可利用与本文所述相似或等价的任何方法和材料来实施或检验本发明，但优选本文所述的方法和材料。
材料与方法
本发明实施例所用的DNA聚合酶购自北京全式金公司的Fastpfu；限制性内切酶及DNA连接酶等均购自Fermentas公司；
酵母粉和蛋白胨购自英国Oxoid公司产品；甘氨酸和IPTG购自Promega公司；5-ALA和对二甲氨基苯甲醛等购自Sigma公司；琼脂粉和抗生素购自北京索来宝；葡萄糖、冰醋酸、高氯酸、三氯乙酸、乙酰丙酮、氯仿以及其他常用化学试剂均购自国药。
质粒提取试剂盒和琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒均购自上海生工生物工程股份有限公司，相关操作均严格按照说明书执行；
质粒构建测序验证由华大基因完成；
DH5α感受态细胞购自北京全式金公司。
LB培养基成分：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl10g/L，固体培养基中添加2%的琼脂粉。
抗生素浓度为：氨苄青霉素100μg/mL，氯霉素30μg/mL。
ALA的检测方法：200μL稀释的发酵液加入100μL pH4.6乙酸钠缓冲液，然后加入5μL乙酰丙酮，100℃水浴温育15min，冷却至室温后加入等体积的Ehrlish’s试剂(42mL冰醋酸，8mL70%高氯酸，1g二甲氨基苯甲醛)混匀，显色10min后测定553nm波长下的吸光度。
ALA脱水酶酶活检测方法：取150μL粗酶液加入终浓度为5mM的ALA，37℃反应1h，加入等体积10%TCA(三氯乙酸)终止反应，对照组加入ALA后立即加TCA终止反应；12000rpm离心10min，取上清，加入等体积的Ehrlich’s试剂，反应15min，用酶联免疫检测仪在555nm下测定吸光值。按产物胆色素原的生成计算粗酶液中ALA脱水酶的活力，并将酶活力单位定义为：37℃条件下，每分钟产生1nmol PBG所需的酶量定义为一个酶活力单位(1U)，得到不同突变酶的比活力。
葡萄糖分析方法采用山东科学院生产的SBA-40D生物传感分析仪进行检测。
实施例1.hemB基因突变降低ALA脱水酶活性
根据NCBI公布的大肠杆菌MG1655的基因组序列设计引物hemB-F1和 hemB-R1(hemB-F1：TTTATAGCAGCGCAACCAAACTCC，SEQ ID NO:9；hemB-R1：GATTTGGGATAACCGCGTGACC，SEQ ID NO:10)，以大肠杆菌MG1655基因组为模板PCR扩增得到带有自身启动子的hemB基因片段，PCR扩增参数为94℃2min；94℃20s，60℃20s，72℃1.5min，循环30次；72℃延伸5min。hemB基因片段回收后用Pvu I处理，同时将质粒pWSK29也用该酶处理，载体和片段回收后用T4连接酶连接，转化DH5α感受态细胞，涂布含有氨苄抗性的LB平板，挑取阳性克隆提取质粒并进行酶切验证，测序正确的重组质粒命名为pZGA1。
以pZGA1为模板，按照用试剂盒GeneMorph II EZClone Domain Mutagenesis Kit说明书及其提供的试剂，利用引物hemB-F1和hemB-R1进行易错PCR，获得引入随机突变的DNA片段。然后再以pZGA1为模板，hemB随机突变片段为引物，PCR得到整个质粒，经过DpnI处理消化模板，产物转化hemB基因缺失的大肠杆菌ZSEc2(ZSEc2构建参考文献：尚柯等，现代食品科技,27(7):742-746)感受态细胞，涂布氨苄抗性平板，37℃培养20h后，得到生长与ZSEc2相比明显增强的约150个转化子。
分别将上述菌株转接LB液体培养基，测定不同菌株的生长曲线。由于大部分hemB片段未发生突变或突变部位没有使酶活严重下降，因此大部分的菌落生长都能恢复，通过对菌株库的筛选得到生长与对照菌株相比有一定减弱的多个菌株，分别为ZSEc2/pZGA2、ZSEc2/pZGA5、ZSEc2/pZGA8和ZSEc2/pZGA9，相应的ALAD编码基因序列如SEQ ID NO:1-4所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:5-8所示。对上述四种菌株及带有野生型hemB基因的对照菌株ZSEc2/pZGA1收集菌体，测定各菌株粗酶液中ALA脱水酶的活性，结果显示突变酶比活力大幅降低，残留的ALA脱水酶的活性约为野生型酶的0.5%-30%(表1)。
表1不同hemB基因突变株ALA脱水酶比活力
实施例2.MG1655/pZPA6菌株的构建
2.1磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc和ALA合成酶共表达质粒的构建
根据NCBI公布的大肠杆菌MG1655的基因组序列设计引物ppc-F(CCGCAAGCTTTATCCGACCTACACCTTTGG，SEQ ID NO:11)和ppc-R(CCGCAAGCTTGGACTTCTGTGGAATGCATAGT，SEQ ID NO:12)，以大肠杆菌MG1655基因组为模板PCR扩增得到带有自身启动子的ppc基因片段，PCR扩增参数为94℃2min；94℃20s，60℃20s，72℃1.5min，循环30次；72℃延伸5min。ppc基因片段回收后用Hind III处理，同时将携带有ALA合成酶的质粒pZGA24(pZGA24构建参见参考文献：郭小飞等，天津科技大学学报，2012,27(4)：1-6)也用该酶处理，载体和片段回收后用T4连接酶连接，转化DH5α感受态细胞，涂布含有Amp的LB平板，挑取阳性克隆提取质粒并进行酶切验证，测序正确的重组质粒命名为pZPA6。
2.2.重组菌株MG1655/pZPA6的构建
将上述构建的重组质粒pZPA6转化野生型大肠杆菌MG1655，涂布Amp抗性LB平板，过夜培养后挑取阳性克隆提取质粒验证，获得重组菌株MG1655/pZPA6。
实施例3.质粒回补活性降低的ALA脱水酶的效果验证一
根据NCBI公布的大肠杆菌MG1655的基因组序列设计引物hemB-F2和hemB-R2(hemB-F2：5’-TTCCTCTAGATTTATAGCAGCGCAACCAAACTCC-3’，SEQ ID NO:11；hemB-R2：5'-TTGCTCTAGACGTGACCCAGCACTATGCCA-3’，SEQ ID NO:12)，分别扩增pZGA1、pZGA2、pZGA5和pZGA8载体上的hemB基因片段，PCR扩增参数为94℃2min；94℃20s，60℃20s，72℃1.5min，循环30次；72℃延伸5min。片段回收后用Xba I处理，同时将质粒pZCA9也用该酶处理，载体和片段回收后用T4连接酶连接，转化DH5α感受态细胞，涂布氨苄抗性平板，挑取阳性克隆提取质粒并进行酶切验证，测序正确的重组质粒分别命名为pZGA20、pZGA21、pZGA22和pZGA23。
将上述构建载体和重组载体pZPA6共转化ZDEc2菌株，感受态细胞制备和转化过程参考J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》。涂布氨苄抗性和氯霉素抗性的LB平板，过夜培养后挑取阳性克隆提取质粒验证，获得具有ALA高产性能的重组菌株ZSEc2/pZPA6/pZGA20、ZDEc2/pZPA6/pZGA21、ZSEc2/pZPA6/pZGA22和ZSEc2/pZPA6/pZGA23。
将上述重组菌单菌落分别接种5mL含有氨苄青霉素和氯霉素的LB液体培养基，37℃，220rpm培养12h。按照初始OD为0.05转接装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶，37℃，220rpm培养2.5h后加入终浓度为50μM的IPTG，诱导培养19h后收集发酵液，检测ALA的浓度。其中发酵培养基为添加了少量酵母粉的M9培养基，主要成分为：Na2HPO4·12H2O17.1g/L，KH2PO43.0g/L，NaCl0.5g/L，NH4Cl1.0g/L，MgSO42mM，CaCl20.1mM，葡萄糖10g/L，酵母粉2g/L，甘氨酸4g/L。ALA的检测方法如“材料与方法”部分所述。
各重组菌发酵结果显示对照菌株ZSEc2/pZPA6/pZGA20中ALA的产量为2.61g/L，而ALA脱水酶活性降低的菌株ZSEc2/pZPA6/pZGA21、ZSEc2/pZPA6/pZGA22和ZSEc2/pZPA6/pZGA23中ALA的产量分别为3.27g/L、2.93g/L和3.14g/L，分别比对照菌株提高了25.27%、12.53%和20.28%。在对菌体生长和产物合成更为有利的5L发酵罐中，产量最高的ZSEc2/pZPA6/pZGA22菌株ALA的产量更是达到7.17g/L，是对照菌株ALA产量(1.28g/L)的5.6倍(如图2所示)。表明利用ALA脱水酶活性降低的大肠杆菌可以进一步提高ALA高产菌株中目的产物的产量。
实施例4.质粒回补活性降低的ALA脱水酶的效果验证二
将上述构建载体pZGA20、pZGA21、pZGA22和pZGA23分别与pZGA24载体共转化ZSEc2菌株，涂布氨苄抗性和氯霉素抗性的LB平板，过夜培养后挑取阳性克隆提取质粒验证，获得重组菌株：获得具有一定ALA生产能力的重组菌株ZSEc2/pZGA24/pZGA20、ZDEc2/pZGA24/pZGA21、ZSEc2/pZGA24/pZGA22和ZSEc2/pZGA24/pZGA23。
将上述重组菌单菌落分别接种5mL含有氨苄青霉素和氯霉素的LB液体培养基，37℃，220rpm培养12h。按照初始OD为0.05转接装有50mL发酵培养基 的250mL三角瓶，37℃，220rpm培养2.5h后加入终浓度为50μM的IPTG，诱导培养17h后收集发酵液，检测ALA的浓度。其中发酵培养基为含有10g/L琥珀酸和4g/L甘氨酸的LB培养基。ALA的检测方法如“材料与方法”部分所述。
各重组菌ALA发酵结果显示对照菌株ZSEc2/pZGA24/pZGA20中ALA的产量仅为0.96g/L，而ALA脱水酶活性降低的菌株ZDEc2/pZGA24/pZGA21、ZSEc2/pZGA24/pZGA22和ZSEc2/pZGA24/pZGA23中ALA的产量分别为1.18g/L、1.02g/L和1.19mg/L，分别比对照菌株提高了23%、6%和25%，表明在低产ALA的体系中利用ALA脱水酶活性降低的大肠杆菌也能够提高ALA的产量。
实施例4.染色体回补活性降低的ALA脱水酶的效果验证
大肠杆菌基因整合采用经典的Red重组方法，参考相关文献进行，具体操作如下：首先根据NCBI公布的大肠杆菌MG1655的基因组序列及hemB弱化突变基因的序列设计引物hemB-F3和hemB-R3(hemB-F3：CAAACCAGATAAATATCCTATGAATATGCAACAAAGTTTTAATTATTCAATTTATAGCAGCGCAACCAAA，SEQ ID NO:13；hemB-R3：GGAGTTTCAGGTGCGCTGGCGCTGGCAACCAAATGATATTGCGATTTGGGATAACCGCGTGACCCAGCAC，SEQ ID NO:14)，并以pZGA9载体为模板PCR扩增得到带有突变的hemB基因及其上下游同源臂的基因片段。PCR扩增参数为94℃2min；94℃20s，64℃20s，72℃1.5min，循环30次；72℃延伸5min。PCR产物胶回收后电转化ZSEc2/pKD46菌株，感受态细胞制备和转化过程参考J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》。转化子根据生长恢复情况进行筛选，发生整合的菌株生长能够得到一定程度的恢复，而未发生整合的菌株生长非常缓慢。将生长恢复的克隆测序并将正确菌株并命名为ZDEcA8。
分别将质粒pZGA24和pZPA6电转化ZDEcA8菌株，感受态细胞制备和转化过程参考J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》。涂布氨苄青霉素抗性的LB平板，过夜培养后挑取阳性克隆提取质粒验证，获得重组菌株ZDEcA8/pZGA24和ZDEcA8/pZPA6。
将上述重组菌株及相应的对照菌株MG1655/pZGA24(用质粒pZGA24转化野生型大肠杆菌MG1655获得，质粒pZGA24的构建参见郭小飞等，天津科技大 学学报，2012,27(4)：1-6)和MG1655/pZPA6(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC No.6588)单菌落分别接种5mL LB液体培养基，37℃，220rpm培养12h。按照初始OD为0.05转接装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶，37℃，220rpm培养2.5h后加入终浓度为50μM的IPTG，诱导培养17h后收集发酵液，检测ALA的浓度。其中发酵培养基为含有10g/L琥珀酸和2g/L甘氨酸的LB培养基。ALA的检测方法如“材料与方法”部分所述。
重组菌摇瓶发酵结果显示对照菌株MG1655/pZGA24和MG1655/pZPA6在添加甘氨酸和琥珀酸的LB培养基中ALA的产量分别为0.8g/L和1.36g/L，而ALA脱水酶弱化的ZDEcA8/pZGA24和ZDEcA8/pZPA6菌株中ALA的产量分别达到0.94g/L和1.57g/L，分别比对照菌株提高了17.5和15.1%，表明利用ALA脱水酶活性降低的大肠杆菌能够提高ALA的产量。
讨论：现有技术的文献指出，5-氨基乙酰丙酸脱水酶(ALAD)的下游产物参与多种基础生命活动，对于微生物的存活和生长至关重。而其编码基因，hemB基因缺失使得菌体的生长受到很大影响，甚至无法生长。因此，现有技术采用在ALA发酵生产后期添加外源性ALAD抑制剂来提高ALA产量。现有文献中也没有利用ALAD活性降低的细菌发酵生产ALA的研究。而本发明人的前期研究亦发现，ALAD缺失的菌株仅能够在丰富培养基中微弱生长，因此其没有实际应用价值。然而，发明人通过创造性的劳动发现，将ALAD活性弱化到一定程度，反而能提高ALA的产量。而且该方法还可以与现有强化ALA合成途径的方法叠加，从而在实践上用于细菌发酵生产ALA。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (5)
1.一种5-氨基乙酰丙酸生产菌株的构建方法，所述方法包括：
弱化所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中5-氨基乙酰丙酸脱水酶的活性；
所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中弱化的5-氨基乙酰丙酸脱水酶的氨基酸序列如SEQID NO:5-8中任一项所示。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
强化所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中5-氨基乙酰丙酸合成的相关酶。
3.一种5-氨基乙酰丙酸生产菌株，所述菌株中5-氨基乙酰丙酸脱水酶的活性得到弱化，所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中弱化的5-氨基乙酰丙酸脱水酶的氨基酸序列如SEQ IDNO:5-8中任一项所示。
4.一种产生5-氨基乙酰丙酸的方法，所述方法包括：
1)培养权利要求3所述的5-氨基乙酰丙酸生产菌株，从而得到5-氨基乙酰丙酸；和
2)从1)的发酵培养体系中获得5-氨基乙酰丙酸。
5.权利要求3所述的5-氨基乙酰丙酸生产菌株的用途，所述菌株用于产生5-氨基乙酰丙酸和/或产生以5-氨基乙酰丙酸为前体的下游产物。
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