KR20230005137A - 헤파로산의 제조 방법 및 헤파로산 생산능을 갖는 에스케리키아 속의 세균 - Google Patents
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Abstract
본 발명의 목적은 헤파로산 생산능을 갖는 에스케리키아(Escherichia) 속의 세균의 유전자 변형을 통해 헤파로산 생산능을 개선하여 헤파로산을 효율적으로 제조하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명은 kpsS 유전자의 발현을 증가시키는 유전자 변형을 갖고 헤파로산 생산능을 갖는 에스케리키아 속의 세균; 및 상기 세균을 이용하여 헤파로산을 제조하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 에스케리키아(Escherichia) 속 세균의 협막 다당류인 N-아세틸헤파로산(이하, 헤파로산으로 지칭)을 세균을 이용한 발효적 생산에 의해 제조하는 방법에 관한 것이다.
황산화된 다당류인 헤파린은 항응고제이며 혈전색전증 및 파종성 혈관내 응고 증후군의 치료용 및 인공 투석 동안 및 체외 순환 시 응고 등의 예방용으로 사용된다. 산업적으로, 사용되는 대부분의 헤파린은 돼지의 장 점막으로부터 추출 및 정제된다.
2008년에 돼지 유래의 헤파린이 불순물로 오염됨으로 인해 발생한 사망 사고 이후, 비동물성 기반의 생산-관리/품질-관리된 유도된 헤파린에 대한 연구개발이 요구되어 왔다. 구체적 예로서, 그람-음성 미생물의 협막 다당류인 발효적으로 생산 및 정제된 N-아세틸헤파로산을 화학적으로 N-탈아세틸화 및 N-황산화한 후, 효소적 에피머화 및 황산화하여, 돼지로부터 유래된 것과 동일한 구조 및 항응고 활성을 갖는 헤파린을 산출하는 방법이 있다(NPL 1 및 2).
상기 방법에서, 기본 구조로서의 헤파로산은 글루쿠론산(GlcA)과 N-아세틸 D-글루코사민(GlcNAc)의 반복 이당류 구조로 구성된 당 사슬이다. 헤파로산의 생산을 위해, 본래 헤파로산 생산능을 갖는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) K5 균주를 사용하는 방법(PTL 1 및 NPL 1), 헤파로산 생산능도 함께 갖는 에스케리키아 콜라이 니슬(Nissle) 1917 균주를 사용하는 방법(NPL 2) 및 본래 헤파로산 생산능을 갖지 않는 에스케리키아 콜라이를 사용하는 방법(PTL 4 및 NPL 3, 4)이 보고되었다.
헤파로산은 2군 협막 다당류로 분류되며, 게놈 상에서 클러스터를 형성하는 영역 I, 영역 II, 영역 III의 유전자 군이 에스케리키아 콜라이 K5 균주에서 헤파로산의 합성 및 수송에 관여한다는 것이 알려져 있다(NPL 4).
이들 유전자 군에 의해 코딩되는 단백질 중에서, KpsS 및 KpsC는 복수의 3-데옥시-D-만노-옥툴로손산(Kdo) 잔기가 내막의 포스파티딜글리세롤로 전이될 수 있도록 하고 글리코실트랜스퍼라제 KfiA 및 KfiC는 전구체 당 뉴클레오티드를 첨가하고 이로써 헤파로산의 합성이 진행된다고 한다(NPL 5 및 6).
또한, KfiD는 전구체 UDP-GlcA의 합성에 관여하고; KpsF 및 KpsU는 Kdo 링커 합성을 위한 기질인 CMP-Kdo의 합성에 관여하고; KpsM, KpsT, KpsE 및 KpsD는 내막에서 합성된 헤파로산을 세균 세포의 외부로 수송하는 데 관여한다(NPL 6).
숙주로서 헤파로산 생산능을 갖지 않는 에스케리키아 콜라이의 BL21 균주 및 K-12 균주를 사용하여 헤파로산 발효를 수행하는 방법으로서, 에스케리키아 콜라이 K5 균주로부터 유래된 영역 II의 KfiABCD 유전자 클러스터를 숙주 내로 도입하는 방법이 알려져 있다. 또한, rfaH, nusG 및 rpoE와 같은 헤파로산 생산을 개선하는 유전자들이 보고되었다(PTL 4, NPL 3 및 4).
NPL 1: Biotechnology and Bioengineering 107 (2010) 964-973
NPL 2: Applied Microbiology and Biotechnology 103 (2019) 6771-6782
NPL 3: Metabolic Engineering 14 (2012) 521-527
NPL 4: Carbohydrate Research 360 (2012) 19-24
NPL 5: Proceedings of the National Academy of Sciences of USA 110 (2013) 20753-20758
NPL 6: Carbohydrate Research 378 (2013) 35-44
상술한 바와 같이, 생산-관리 및 품질-관리된 비동물 유래의 헤파린을 제조하기 위한 연구개발이 이루어지고 있으나, 종래의 제조 방법은 효율성이 불충분하였다. 한편, 영역 I, II 및 III에 의해 코딩되는 각 유전자가 헤파로산 생산능을 갖는 에스케리키아 속의 세균에 의한 헤파로산 생산에 어떻게 영향을 미치는가는 현재까지 알려져 있지 않다.
따라서, 본 발명의 목적은 헤파로산을 생산하는 능력을 갖는 에스케리키아 속의 세균의 유전자 변형을 통해 헤파로산 생산 효율을 개선하여 헤파로산을 효율적으로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 발명자들은 특정 유전자 변형을 갖고 헤파로산 생산능을 갖는 에스케리키아 속의 세균을 사용함으로써 헤파로산 생산 효율이 개선된다는 것을 밝혀내어 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명은 다음과 같다.
1. 하기 유전자 변형 (1)을 갖고 헤파로산 생산능을 갖는 에스케리키아 속의 세균을 배지에서 배양하여 배지에서 헤파로산을 생산하는 단계를 포함하는, 헤파로산의 제조 방법:
(1) kpsS 유전자의 발현을 증가시키는 유전자 변형.
2. 1에 있어서, 에스케리키아 속의 세균이 하기 유전자 변형 (2) 및 (3) 중 적어도 하나를 추가로 갖는, 헤파로산의 제조 방법:
(2) kfiA 유전자, kfiB 유전자, kfiC 유전자 및 kfiD 유전자로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 발현을 증가시키는 유전자 변형 및
(3) yhbJ 유전자의 기능 상실을 유발하는 유전자 변형.
3. 1 또는 2에 있어서, 유전자 변형 (1)이 kpsS 유전자의 발현 제어 영역의 변형 및 kpsS 유전자의 카피수 증가 중 적어도 하나인, 헤파로산의 제조 방법.
4. 2 또는 3에 있어서, 유전자 변형 (2)가 kfiA 유전자, kfiB 유전자, kfiC 유전자 및 kfiD 유전자로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 발현 제어 영역의 변형 및 kfiA 유전자, kfiB 유전자, kfiC 유전자 및 kfiD 유전자로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 카피수 증가 중 적어도 하나인, 헤파로산의 제조 방법.
5. 2 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 유전자 변형 (3)이 yhbJ 유전자의 결실인, 헤파로산의 제조 방법.
6. 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 에스케리키아 속의 세균이 에스케리키아 콜라이인, 헤파로산의 제조 방법.
7. 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, kpsS 유전자가 서열번호 33에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA, 또는 서열번호 33에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 헤파로산 생산능을 갖는 에스케리키아 속의 세균에서 발현 수준이 증가될 때 상기 세균의 헤파로산 생산능을 증가시키는 특성을 갖는 DNA인, 헤파로산의 제조 방법.
8. 2 내지 7 중 어느 하나에 있어서,
kfiA 유전자가 서열번호 34에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA, 또는 서열번호 34에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 헤파로산 생산능을 갖는 에스케리키아 속의 세균에서 발현 수준이 증가될 때 상기 세균의 헤파로산 생산능을 증가시키는 특성을 갖는 DNA이고,
kfiB 유전자가 서열번호 35에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA, 또는 서열번호 35에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 헤파로산 생산능을 갖는 에스케리키아 속의 세균에서 발현 수준이 증가될 때 상기 세균의 헤파로산 생산능을 증가시키는 특성을 갖는 DNA이고,
kfiC 유전자가 서열번호 36에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA, 또는 서열번호 36에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 헤파로산 생산능을 갖는 에스케리키아 속의 세균에서 발현 수준이 증가될 때 상기 세균의 헤파로산 생산능을 증가시키는 특성을 갖는 DNA이고,
kfiD 유전자가 서열번호 37에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA, 또는 서열번호 37에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 헤파로산 생산능을 갖는 에스케리키아 속의 세균에서 발현 수준이 증가될 때 상기 세균의 헤파로산 생산능을 증가시키는 특성을 갖는 DNA인, 헤파로산의 제조 방법.
9. 2 내지 8 중 어느 하나에 있어서, yhbJ 유전자가 서열번호 38에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA, 또는 서열번호 38에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 헤파로산 생산능을 갖는 에스케리키아 속의 세균에서 발현 수준이 감소될 때 상기 세균의 헤파로산 생산능을 증가시키는 특성을 갖는 DNA인, 헤파로산의 제조 방법.
10. 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 에스케리키아 속의 세균이 하기 유전자 변형 (4)를 갖지 않는, 헤파로산의 제조 방법:
(4) kpsC 유전자의 발현을 증가시키는 유전자 변형.
11. 헤파로산 생산능을 갖고 하기 유전자 변형 (1)을 갖는 에스케리키아 속의 세균:
(1) kpsS 유전자의 발현을 증가시키는 유전자 변형.
12. 11에 있어서, 하기 유전자 변형 (2) 및 (3) 중 적어도 하나를 추가로 갖는 에스케리키아 속의 세균:
(2) kfiA 유전자, kfiB 유전자, kfiC 유전자 및 kfiD 유전자로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 발현을 증가시키는 유전자 변형 및
(3) yhbJ 유전자의 기능 상실을 유발하는 유전자 변형.
13. 11 또는 12에 있어서, 하기 유전자 변형 (4)를 갖지 않는 에스케리키아 속의 세균:
(4) kpsC 유전자의 발현을 증가시키는 유전자 변형.
본 발명의 헤파로산의 제조 방법에 따르면, 특정 유전자 변형을 갖고 헤파로산 생산능을 갖는 에스케리키아 속의 세균을 이용함으로써 비동물 유래의 헤파로산을 우수한 생산 효율로 제조할 수 있다.
[도 1] 도 1은 에스케리키아 콜라이 K5 균주의 염색체 상의 헤파로산 합성 유전자 클러스터의 개략도를 도시한다.
[도 2] 도 2는 헤파로산 생산에 관여하는 효소의 개략도를 도시한다.
[도 3] 도 3은 헤파로산 생합성 경로의 개략도를 도시한다.
[도 2] 도 2는 헤파로산 생산에 관여하는 효소의 개략도를 도시한다.
[도 3] 도 3은 헤파로산 생합성 경로의 개략도를 도시한다.
이하, 본 명세서에서 사용되는 용어는 달리 특정되지 않는 한 해당 분야에서 일반적으로 사용되는 의미를 갖는다.
<본 발명의 세균>
본 발명의 헤파로산의 제조 방법에서, 하기 유전자 변형 (1)을 갖고 헤파로산 생산능을 갖는 에스케리키아 속의 세균(이하, 본 발명의 세균으로 약칭함)이 사용된다:
(1) kpsS 유전자의 발현을 증가시키는 유전자 변형.
본 발명의 세균은 바람직하게는 하기 유전자 변형 (2) 및 (3) 중 적어도 하나를 추가로 갖는다:
(2) kfiA 유전자, kfiB 유전자, kfiC 유전자 및 kfiD 유전자로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 발현을 증가시키는 유전자 변형, 및
(3) yhbJ 유전자의 기능 상실을 유발하는 유전자 변형.
따라서, 에스케리키아 속의 세균에서 유전자 변형의 예는 상술한 (1) 및 (2), 상술한 (1) 및 (3), 및 상술한 (1) 내지 (3)을 포함한다.
본 발명의 세균은 바람직하게는 하기 유전자 변형 (4)를 갖지 않는다:
(4) kpsC 유전자의 발현을 증가시키는 유전자 변형.
에스케리키아 속의 세균의 예로서, 도 1은 에스케리키아 콜라이 K5 균주의 염색체 상의 헤파로산 합성 유전자 클러스터의 개략도를 나타낸다[J. Nzakizwanayo et al., PLOS ONE, (2015)]. 또한, 도 2는 헤파로산 생산에 관여하는 효소의 개략도를 나타낸다.
도 1에 도시된 바와 같이, kpsS 및 kpsC는 영역 I, 영역 II 및 영역 III의 유전자 군 중 영역 I에 의해 코딩되는 유전자이다. 도 2에 도시된 바와 같이, kpsS 및 kpsC는 헤파로산 합성의 개시에 관여한다. 헤파로산 생산에서, kpsS는, kpsC와 함께, 내막의 포스파티딜글리세롤에 다수의 Kdo 링커를 첨가하는 역할을 한다.
kpsS 유전자로서, 에스케리키아 속으로부터 유래된 kpsS 유전자가 바람직하다. 이의 구체적 예는 에스케리키아 콜라이 K5 균주의 kpsS 유전자를 포함한다. 에스케리키아 콜라이 K5 균주의 kpsS 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 이 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 취득할 수 있다. 에스케리키아 콜라이 K5 균주의 kpsS 유전자는 진뱅크(GenBank) 수탁번호 CAA52659.1로 등록되어 있다.
kpsS 유전자의 예는 서열번호 33에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA, 또는 서열번호 33에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 헤파로산 생산능을 갖는 에스케리키아 속의 세균에서 발현 수준이 증가될 때 상기 세균의 헤파로산 생산능을 증가시키는 특성을 갖는 DNA를 포함한다.
도 1에 도시된 바와 같이, kfiA, kfiB, kfiC 및 kfiD는 영역 I, 영역 II 및 영역 III의 유전자 군 중 영역 II에 의해 코딩되는 유전자이다. 도 2에 도시된 바와 같이, kfiA, kfiB, kfiC 및 kfiD는 헤파로산의 합성에 관여하며, 당류를 첨가하여 헤파로산을 합성하는 역할을 한다.
kfiA, kfiB, kfiC 또는 kfiD 유전자로서, 에스케리키아 속으로부터 유래된 kfiA, kfiB, kfiC 또는 kfiD 유전자가 바람직하다. 이의 구체적 예는 에스케리키아 콜라이 K5 균주의 kfiA, kfiB, kfiC 또는 kfiD 유전자를 포함한다. 에스케리키아 콜라이 K5 균주의 kfiA, kfiB, kfiC 또는 kfiD 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 이 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 취득할 수 있다. kfiA는 진뱅크 수탁번호 CAA54711.1로 등록되어 있고; kfiB는 진뱅크 수탁번호 CAE55824.1로 등록되어 있고; kfiC는 진뱅크 수탁번호 CAA54709.1로 등록되어 있고; kfiD는 진뱅크 수탁번호 CAA54708.1로 등록되어 있다.
kfiA 유전자의 예는 서열번호 34에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA, 또는 서열번호 34에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 헤파로산 생산능을 갖는 에스케리키아 속의 세균에서 발현 수준이 증가될 때 상기 세균의 헤파로산 생산능을 증가시키는 특성을 갖는 DNA를 포함한다.
kfiB 유전자의 예는 서열번호 35에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA, 또는 서열번호 35에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 헤파로산 생산능을 갖는 에스케리키아 속의 세균에서 발현 수준이 증가될 때 상기 세균의 헤파로산 생산능을 증가시키는 특성을 갖는 DNA를 포함한다.
kfiC 유전자의 예는 서열번호 36에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA, 또는 서열번호 36에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 헤파로산 생산능을 갖는 에스케리키아 속의 세균에서 발현 수준이 증가될 때 상기 세균의 헤파로산 생산능을 증가시키는 특성을 갖는 DNA를 포함한다.
kfiD 유전자의 예는 서열번호 37에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA, 또는 서열번호 37에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 헤파로산 생산능을 갖는 에스케리키아 속의 세균에서 발현 수준이 증가될 때 상기 세균의 헤파로산 생산능을 증가시키는 특성을 갖는 DNA를 포함한다.
도 3은 헤파로산 생합성 경로의 개략도를 도시한다. 도 3에 도시된 바와 같이, GlmS는 헤파로산의 전구체인 UDP-N-아세틸글루코사민 공급 경로의 제1 효소이며 프럭토스-6-포스페이트에서 글루코사민-6-포스페이트로의 반응을 촉매하는 효소이다. YhbJ는 GlmS를 음성적으로 조절하는 효소이다.
yhbJ 유전자로서, 에스케리키아 속으로부터 유래된 yhbJ 유전자가 바람직하다. 이의 구체적 예는 에스케리키아 콜라이 K-12 균주의 yhbJ 유전자를 포함한다. 에스케리키아 콜라이 K-12 균주의 yhbJ 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 이 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 취득할 수 있다. 에스케리키아 콜라이 K-12 균주의 yhbJ 유전자는 진뱅크 수탁번호 BAE77249.1로 등록되어 있다.
yhbJ 유전자의 예는 서열번호 38에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA, 또는 서열번호 38에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 헤파로산 생산능을 갖는 에스케리키아 속의 세균에서 발현 수준이 감소될 때 상기 세균의 헤파로산 생산능을 증가시키는 특성을 갖는 DNA를 포함한다.
상기 (1) 내지 (3)의 각 유전자는 예를 들어 상술한 각 유전자의 뉴클레오티드 서열을 사용하는 BLAST 검색 또는 FASTA 검색에 의해 공개 데이터베이스로부터 용이하게 취득할 수 있다. 또한, 예를 들어 세균과 같은 미생물의 염색체를 주형으로서 사용하고 이들 공지된 유전자 서열에 기초하여 제조된 올리고뉴클레오티드를 프라이머로서 사용하는 PCR에 의해 각 유전자의 상동체를 수득할 수 있다.
상기 (1) 내지 (3)의 각 유전자는, 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 본래 기능(예를 들어, 활성 또는 특성)이 유지되는 한, 유전자의 변이체일 수 있다. 유전자의 변이체에 의해 코딩되는 단백질이 이의 본래 기능을 유지하는지 여부를 확인할 수 있다; 구체적으로, 예를 들어 본래 기능이 헤파로산 생산 능력을 향상시키는 것인 경우, 유전자의 변이체를 헤파로산 생산능을 갖는 원핵생물에 속하는 미생물에 도입함으로써 확인할 수 있다.
상기 (1) 내지 (3)의 각 유전자의 변이체는 코딩된 단백질의 특정 위치에 있는 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입 또는 첨가되도록 유전자의 코딩 영역을 변형시킴으로써 부위 지향적 돌연변이유발 방법에 따라 수득될 수 있다. 또한, 상기 (1) 내지 (3)의 각 유전자의 변이체는 예를 들어 돌연변이 처리에 의해서도 수득될 수 있다.
상기 유전자 (1) 내지 (3) 각각은 이들의 본래 기능이 유지되는 한, 하나 또는 수개의 위치에 있는 하나 또는 수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 첨가된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자일 수 있다. 예를 들어, 코딩된 단백질에서 이의 N-말단 및/또는 C-말단은 연장되거나 단축될 수 있다. 어구 "하나 또는 수개"는 단백질의 3차원 구조에서 아미노산 잔기의 위치와 유형에 따라 상이하다. 이의 구체적 예는 1 내지 50개, 1 내지 40개, 1 내지 30개를 포함하고, 바람직하게는 1 내지 20개, 보다 바람직하게는 1 내지 10개, 보다 더욱 바람직하게는 1 내지 5개, 특히 바람직하게는 1 내지 3개이다.
상술한 바와 같은 하나 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 또는 첨가는 단백질의 기능이 정상적으로 유지시키는 보존적 돌연변이이다. 보존적 돌연변이의 대표는 보존적 치환이다. 보존적 치환은 치환 부위가 방향족 아미노산인 경우에 Phe, Trp, Tyr 사이에 치환이 발생하고, 치환 부위가 소수성 아미노인 경우에 Leu, Ile, Val 사이에 치환이 발생하고, 치환 부위가 극성 아미노산인 경우에 Gln 및 Asn 사이에 치환이 발생하고, 치환 부위가 염기성 아미노산인 경우에 Lys, Arg 및 His 사이에 치환이 발생하고, 치환 부위가 산성 아미노산인 경우에 Asp 및 Glu 사이에 치환이 발생하고, 치환 부위가 하이드록실 기를 갖는 아미노산인 경우에 Ser 및 Thr 사이에 치환이 발생하는 돌연변이이다. 보존적 치환으로 고려되는 치환의 특정 예는 Ala의 Ser 또는 Thr로의 치환; Arg의 Gln, His 또는 Lys로의 치환; Asn의 Glu, Gln, Lys, His 또는 Asp로의 치환; Asp의 Asn, Glu 또는 Gln으로의 치환; Cys의 Ser 또는 Ala로의 치환; Gln의 Asn, Glu, Lys, His, Asp 또는 Arg로의 치환; Glu의 Gly, Asn, Gln, Lys 또는 Asp로의 치환; Gly의 Pro로의 치환; His의 Asn, Lys, Gln, Arg 또는 Tyr로의 치환; Ile의 Leu, Met, Val 또는 Phe로의 치환; Leu의 Ile, Met, Val 또는 Phe로의 치환; Lys의 Asn, Glu, Gln, His 또는 Arg로의 치환; Met의 Ile, Leu, Val 또는 Phe로의 치환; Phe의 Trp, Tyr, Met, Ile 또는 Leu로의 치환; Ser의 Thr 또는 Ala로의 치환; Thr의 Ser 또는 Ala로의 치환; Trp의 Phe 또는 Tyr로의 치환; Tyr의 His, Phe 또는 Trp로의 치환; 및 Val의 Met, Ile 또는 Leu로의 치환을 포함한다. 또한, 상술한 바와 같은 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 첨가, 이의 역전 등은 유전자가 유래된 유기체에서의 개체 차이 또는 종 차이에 기초한 돌연변이와 같은 천연 발생 돌연변이에 의해 유발되는 치환, 결실, 삽입 및 첨가, 역전 등(돌연변이체 또는 변이체)을 포함한다.
또한, 상기 (1) 내지 (3)의 각 유전자는 이들의 본래 기능이 유지되는 한, 전체 아미노산 서열과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 97% 이상, 특히 바람직하게는 99% 이상의 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자일 수 있다.
또한, 상기 (1) 내지 (3)의 각 유전자는 이들의 본래 기능이 유지되는 한, 뉴클레오티드 서열의 전체 또는 일부에 상보적인 서열과 같은 공지된 유전자 서열로부터 제조될 수 있는 프로브와 엄격한 조건 하에 혼성화하는 DNA일 수 있다. 용어 "엄격한 조건"은 소위 특이적 하이브리드가 형성되고 비특이적 하이브리드가 형성되지 않는 조건을 지칭한다. 이의 예는 보다 높은 수준에서 서로 동일성을 갖는 DNA, 예를 들어 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 97% 이상, 특히 바람직하게는 99% 이상의 동일성을 갖는 DNA가 서로 혼성화하고 보다 낮은 수준에서 서로 동일성을 갖는 DNA는 서로 혼성화하지 않는 조건; 또는 세척이 60℃, 1 x SSC 및 0.1% SDS, 바람직하게는 60℃, 0.1 x SSC 및 0.1% SDS, 보다 바람직하게는 68℃, 0.1 x SSC 및 0.1% SDS에 상응하는 염 농도 및 온도에서 1회, 바람직하게는 2 내지 3회 수행되는, 표준 서던 혼성화에서 세척을 위한 조건인 조건을 포함한다.
상기 혼성화에 사용되는 프로브는 각 유전자의 상보적 서열의 일부분일 수 있다. 이러한 프로브는 공지된 유전자 서열에 기초하여 제조된 올리고뉴클레오티드를 프라이머로서 사용하고 상기 (1) 내지 (3)의 각 유전자를 함유하는 DNA 단편을 주형으로서 사용하는 PCR에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 약 300bp 길이를 갖는 DNA 단편이 프로브로서 사용될 수 있다. 약 300bp 길이를 갖는 DNA 단편이 프로브로서 사용되는 경우, 혼성화에서 세척을 위한 조건의 예는 50℃, 2 x SSC 및 0.1% SDS의 조건을 포함한다.
또한, 코돈 축퇴성은 숙주에 따라 상이하기 때문에, 상기 (1) 내지 (3)의 각 유전자는 이들의 본래 기능이 유지되는 한, 임의의 코돈을 동등한 코돈으로 치환하여 수득한 유전자일 수 있다. 예를 들어, 표 1 내지 3의 유전자는 사용되는 숙주의 코돈 사용 빈도에 따라 최적의 코돈을 갖도록 변형될 수 있다.
돌연변이 처리의 예는 상기 (1) 내지 (3)의 각 유전자의 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 분자를 하이드록실아민 등으로 시험관내 처리하는 방법; 상기 (1) 내지 (3)의 각 유전자를 보유하는 미생물을 X선, 자외선, 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG), 에틸 메탄설포네이트(EMS) 및 메틸 메탄설포네이트(MMS)와 같은 돌연변이원으로 처리하는 방법 등을 포함한다.
<<유전자 발현 수준을 증가시키기 위한 유전자 변형>>
어구 "유전자 발현의 증가"는 유전자의 발현이 비변형 균주의 것과 비교하여 상승되는 것을 의미한다. 유전자의 발현을 증가시키는 일 양상의 예는 유전자의 발현이 비변형 균주의 것에 비해 바람직하게는 1.5배 이상 증가되고, 보다 바람직하게는 2배 이상 증가되고, 보다 더욱 바람직하게는 3배 이상 증가되는 양상을 포함한다.
또한, 어구 "유전자 발현이 증가된다"는 표적 유전자가 본래 발현되는 균주에서의 표적 유전자의 발현 증가뿐만 아니라, 표적 유전자가 본래 발현되지 않는 균주에서 표적 유전자가 발현되는 것을 의미한다. 즉, 어구 "유전자 발현이 증가된다"는 예를 들어 표적 유전자를 갖지 않는 균주 내로 표적 유전자가 도입되고 그 안에서 표적 유전자가 발현되는 경우를 포함한다. 또한, 어구 "유전자 발현이 증가된다"는 어구 "유전자 발현이 향상된다" 및 "유전자 발현이 상승된다"로도 지칭된다.
유전자 발현의 증가는 예를 들어 유전자의 카피수를 증가시킴으로써 달성될 수 있다. 유전자의 카피수를 증가시키는 것은 유전자를 숙주의 염색체 내로 도입함으로써 달성될 수 있다. 염색체 내로의 유전자 도입은 예를 들어 상동 재조합을 사용하여 수행될 수 있다(Miller I, J.H. Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory). 유전자의 하나의 카피만이 도입될 수 있거나, 이의 2개 이상의 카피가 도입될 수 있다.
예를 들어, 염색체 상에 다수의 카피를 갖는 서열을 표적화하면서 상동 재조합을 수행함으로써 유전자의 다수의 카피를 염색체 내로 도입할 수 있다. 염색체 상에 다수의 카피를 갖는 서열의 예는 반복 DNA 서열(반복 DNA) 및 트랜스포존의 양 말단에 존재하는 역 반복체를 포함한다.
대안적으로, 상동 재조합은 표적 물질의 생산에 불필요한 유전자와 같은 염색체 상의 적절한 서열을 표적화하면서 수행될 수 있다. 상동 재조합은 예를 들어 선형 DNA를 사용하는 방법, 감온성 복제 기점을 함유하는 플라스미드를 사용하는 방법, 접합 전달이 가능한 플라스미드를 사용하는 방법, 숙주에서 기능하는 복제 기점을 갖지 않는 자살 벡터를 사용하는 방법 또는 파지를 사용한 형질도입 방법에 의해 수행될 수 있다. 또한, 유전자는 트랜스포존 또는 Mini-Mu를 사용하여 염색체 내로 무작위로 도입될 수도 있다(JP-A-H2-109985).
표적 유전자가 염색체 내로 도입되었는지 여부는 유전자의 전체 또는 일부에 상보적인 서열을 갖는 프로브를 사용한 서던 혼성화, 유전자의 서열에 기초하여 생성된 프라이머를 사용한 PCR 등에 의해 확인할 수 있다.
또한, 유전자의 카피수는 유전자를 함유하는 벡터를 숙주 내로 도입함으로써 증가시킬 수도 있다. 예를 들어, 표적 유전자를 함유하는 DNA 단편을 숙주에서 기능하는 벡터에 라이게이션(ligating)하여 유전자에 대한 발현 벡터를 작제하고 숙주를 이 발현 벡터로 형질전환함으로써 유전자의 카피수를 증가시킬 수 있다. 표적 유전자를 함유하는 DNA 단편은, 예를 들어 표적 유전자를 갖는 미생물의 게놈 DNA를 주형으로서 사용하는 PCR에 의해 수득할 수 있다. 형질전환 방법은 특별히 제한되지 않고, 종래에 공지된 방법을 사용할 수 있다.
벡터로서, 숙주 세포에서 자가 복제할 수 있는 벡터가 사용될 수 있다. 벡터는 바람직하게는 다중카피 벡터이다. 또한, 형질전환체를 선택하기 위해 벡터는 바람직하게는 문헌[Karl Friehs, Plasmid Copy Number and Plasmid Stability, Adv Biochem Engin/Biotechnol 86: 47-82 (2004)]에 설명된 항생제 내성 유전자 또는 다른 유전자와 같은 마커를 갖는다. 또한, 벡터는 삽입된 유전자를 발현하기 위해 프로모터 또는 터미네이터를 가질 수 있다. 벡터의 예는 세균 플라스미드로부터 유래된 벡터, 효모 플라스미드로부터 유래된 벡터, 박테리오파지로부터 유래된 벡터, 코스미드, 파지미드 등을 포함한다.
에스케리키아 콜라이와 같은 엔테로박테리아세애(Enterobacteriaceae)의 세균에서 자가 복제할 수 있는 벡터의 구체적 예는 pUC19, pUC18, pHSG299, pHSG399, pHSG398, pBR322 및 pSTV29(모두 Takara Bio Inc. 유래), pACYC184, pMW219, pMW118 및 pMW119(모두 Nippon Gene 유래), pTrc99A(Pharmacia), pPROK 벡터(Clontech), pKK233-2(Clontech), pET 벡터(Novagen), pQE 벡터(Qiagen) 및 넓은 숙주 범위 벡터 RSF1010를 포함한다.
유전자를 도입하는 경우, 본 발명에서 유전자 변형을 갖는 에스케리키아 속의 세균에 유전자가 보유되면 충분하다. 구체적으로, 본 발명의 세균에서 기능하는 프로모터 서열의 제어 시 발현되도록 유전자가 도입되면 충분하다. 프로모터는 숙주로부터 유래된 프로모터 또는 이종 프로모터일 수 있다. 프로모터는 도입될 유전자의 내인성 프로모터 또는 다른 유전자의 프로모터일 수 있다. 프로모터로서, 예를 들어 후술하는 보다 강력한 프로모터를 사용할 수 있다.
전사를 종결시키기 위한 터미네이터는 유전자의 하류에 배치될 수 있다. 터미네이터는 본 발명의 세균에서 기능하는 한 특별히 제한되지 않는다. 터미네이터는 숙주로부터 유래된 터미네이터 또는 이종 터미네이터일 수 있다. 터미네이터는 도입될 유전자에 특이적인 터미네이터일 수 있거나 다른 유전자의 터미네이터일 수 있다. 터미네이터의 구체적 예는 T7 터미네이터, T4 터미네이터, fd 파지 터미네이터, tet 터미네이터 및 trpA 터미네이터를 포함한다.
다양한 미생물에서 사용될 수 있는 벡터, 프로모터, 터미네이터는 예를 들어 문헌["Basic Lecture 8 on Microbiology, Gene Engineering, KYORITSU SHUPPAN, 1987"]에 상세히 설명되어 있으며, 이들을 사용할 수 있다.
또한, 2개 이상의 유전자가 도입된 경우, 각 유전자가 본 발명의 세균에서 발현 가능한 방식으로 유지되면 충분하다. 예를 들어, 각 유전자는 단일 발현 벡터에 모두 보유될 수 있거나 염색체 상에 모두 보유될 수 있다. 또한, 각 유전자는 복수의 발현 벡터 상에 개별적으로 보유될 수 있거나, 단일 또는 복수의 발현 벡터 및 염색체 상에 개별적으로 보유될 수 있다. 또한, 2개 이상의 유전자가 오페론을 형성하여 도입될 수 있다. "2개 이상의 유전자가 도입되는 경우"의 예는 2개 이상의 효소를 각각 코딩하는 유전자가 도입되는 경우, 단일 효소를 형성하는 2개 이상의 서브유닛을 각각 코딩하는 유전자가 도입되는 경우 및 이들의 조합을 포함한다.
도입될 유전자는 숙주에서 기능하는 단백질을 코딩하는 한 특별히 제한되지 않는다. 도입될 유전자는 숙주로부터 유래된 유전자 또는 이종 유전자일 수 있다. 도입될 유전자는 예를 들어 유전자의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 설계된 프라이머를 사용하고 유전자를 갖는 유기체의 게놈 DNA 또는 유전자를 보유하는 플라스미드 등을 주형으로서 사용하는 PCR에 의해 수득될 수 있다. 또한, 도입될 유전자는 예를 들어 유전자의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 전체적으로 합성될 수 있다[Gene, 60 (1), 115-127 (1987)].
또한, 유전자의 전사 효율을 향상시킴으로써 유전자 발현의 증가가 달성될 수 있다. 유전자의 전사 효율을 개선하는 것은 예를 들어 염색체 상의 유전자의 프로모터를 보다 강력한 프로모터로 치환함으로써 달성될 수 있다. "보다 강력한 프로모터"는 천연 발생 야생형 프로모터에 비해 유전자 전사를 향상시키는 프로모터를 지칭한다.
"보다 강력한 프로모터"의 예는 uspA 프로모터, T7 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, thr 프로모터, tac 프로모터, trc 프로모터, tet 프로모터, araBAD 프로모터, rpoH 프로모터, PR 프로모터 및 PL 프로모터와 같은 공지된 고발현 프로모터를 포함한다.
또한, 보다 강력한 프로모터로서, 종래의 고활성 유형의 프로모터를 다양한 리포터 유전자를 이용하여 수득할 수 있다. 예를 들어, 프로모터 영역의 -35 및 -10 영역을 컨센서스 서열(consensus sequence)에 더 가깝게 함으로써 프로모터의 활성을 증가시킬 수 있다(WO2000/18935).
고활성 유형 프로모터의 예는 다양한 tac-유사 프로모터(Katashkina JI et al. 러시아 연방 특허출원 2006134574) 및 pnlp8 프로모터(WO2010/027045)를 포함한다. 프로모터 강도를 평가하는 방법 및 강력한 프로모터의 예는 공지된 문헌[Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995) 등]에 설명되어 있다.
또한, 유전자 발현 수준의 증가는 유전자의 번역 효율을 향상시킴으로써 달성될 수 있다. 유전자의 번역 효율의 개선은 예를 들어 염색체 상의 유전자의 샤인-달가노(Shine-Dalgarno: SD) 서열(리보솜 결합 부위(RBS)로도 불림)을 보다 강력한 SD 서열로 치환함으로써 달성될 수 있다.
"보다 강력한 SD 서열"은 mRNA 번역이 천연 발생 야생형 SD 서열보다 개선된 SD 서열을 지칭한다. 보다 강력한 SD 서열의 예는 파지 T7의 유전자 10의 RBS를 포함한다(Olins P.O. et al, Gene, 1988, 73, 227-235). 또한, RBS와 개시 코돈 사이의 스페이서 영역, 특히 개시 코돈(5'-UTR)의 바로 상류 서열에서의 수개 뉴클레오티드의 치환, 삽입 또는 결실은 mRNA의 안정성 및 번역 효율에 상당한 영향을 미치는 것으로 알려져 있으며, 따라서 유전자의 번역 효율은 이들을 변형함으로써 향상될 수 있다.
본 발명에서, 프로모터, SD 서열 및 RBS와 개시 코돈 사이의 스페이서 영역과 같이 유전자의 발현에 영향을 미치는 부위는 "발현 제어 영역"으로도 총칭된다. 발현 제어 영역은 프로모터 검색 벡터 또는 GENETYX와 같은 유전자 검색 소프트웨어를 사용하여 결정될 수 있다. 이들 발현 제어 영역의 변형은 예를 들어 감온성 벡터를 사용한 방법 또는 Red 구동 통합(Red driven integration) 방법(WO2005/010175)에 의해 수행될 수 있다.
유전자 번역 효율의 개선은 또한, 예를 들어 코돈 변형에 의해 달성될 수 있다. 구체적으로, 예를 들어, 유전자의 이종 발현이 수행되는 경우 등에서, 유전자의 번역 효율은 유전자에 존재하는 희귀 코돈을 보다 빈번하게 사용되는 동의 코돈(synonymous codon)으로 대체함으로써 개선될 수 있다.
코돈 치환은 예를 들어 표적 돌연변이를 DNA의 표적 부위 내로 도입하는 부위 지향적 돌연변이유발 방법에 의해 수행될 수 있다. 부위 지향적 돌연변이유발 방법의 예는 PCR을 이용한 방법[Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H.A. Eds., Stockton press (1989); Carter, P., Meth. In Enzymol., 154, 382 (1987)] 및 파지를 이용한 방법[Kramer, W. and Frits, H.J., Meth. In Enzymol., 154, 350 (1987); Kunkel, T.A. et al., Meth. In Enzymol., 154, 367 (1987)]을 포함한다. 대안적으로, 코돈이 치환된 유전자 단편이 전체적으로 합성될 수도 있다. 다양한 유기체에서 코돈 사용 빈도는 "코돈 사용 데이터베이스" [http://www.kazusa.or.jp/codon; Nakamura, Y. et al, Nucl. Acids Res., 28, 292 (2000)]에 설명되어 있다.
또한, 유전자의 발현은 유전자의 발현을 증가시키는 조절인자를 증폭시키거나 유전자의 발현을 감소시키는 조절인자를 결실 또는 약화시킴으로써 증가될 수도 있다. 상술한 바와 같은 이러한 유전자의 발현을 증가시키는 기술은 단독으로 사용될 수 있거나 임의의 조합으로 사용될 수 있다.
유전자의 발현 증가는 예를 들어 유전자의 전사량 증가를 확인하거나 유전자로부터 발현되는 단백질 양의 증가를 확인함으로써 확인될 수 있다. 또한, 유전자의 발현 증가는 예를 들어 그 유전자로부터 발현되는 단백질의 활성 증가를 확인함으로써 확인될 수 있다.
유전자 전사량의 증가를 확인하는 것은 유전자로부터 전사된 mRNA의 양을 야생 균주 또는 모 균주와 같은 비변형 균주와 비교함으로써 수행될 수 있다. mRNA의 양을 평가하는 방법의 예는 노던 하이브리드화, RT-PCR 등을 포함한다[Sambrook, J., et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual/Third Edition, Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001]. mRNA 양의 증가는 예를 들어 mRNA 양이 비변형 균주의 것에 비해 바람직하게는 1.5배 이상 증가, 보다 바람직하게는 2배 이상 증가, 보다 더욱 바람직하게는 3배 이상 증가한 경우를 지칭한다.
단백질 양의 증가는 예를 들어 항체를 사용한 웨스턴 블롯에 의해 확인될 수 있다. 단백질 양의 증가는 예를 들어 단백질 양이 비변형 균주의 것에 비해 바람직하게는 1.5배 이상 증가, 보다 바람직하게는 2배 이상 증가, 보다 더욱 바람직하게는 3배 이상 증가한 경우를 지칭한다.
단백질 활성의 증가는 예를 들어 단백질 활성을 측정함으로써 확인될 수 있다. 단백질 활성의 증가는 예를 들어 단백질 활성이 비변형 균주의 것에 비해 바람직하게는 1.5배 이상 증가, 보다 바람직하게는 2배 이상 증가, 보다 더욱 바람직하게는 3배 이상 증가한 경우를 지칭한다.
상술한 유전자의 발현을 증가시키는 기술은 상기 유전자 (1) 및 (2) 각각의 발현을 향상시키기 위해 사용될 수 있다.
kpsS 유전자의 발현을 증가시키는 유전자 변형은 바람직하게는 kpsS 유전자의 발현 제어 영역의 변형 및 카피수를 증가시키는 유전자 변형 중 적어도 하나이다. kpsFEDUCS 유전자는 헤파로산 생산 유전자 군으로서 존재하지만, 실시예에서 후술하는 바와 같이, 본 발명의 발명자들은 그 중에서도 kpsS 유전자만의 발현을 증가시킴으로써 헤파로산 생산을 특히 개선하는 효과가 수득된다는 것을 밝혀냈다. 따라서, kpsS 유전자의 발현을 증가시키는 유전자 변형으로서, kpsS 유전자의 카피수를 증가시키는 유전자 변형이 특히 바람직하다.
본 발명의 세균은 kpsS 유전자의 발현을 증가시키는 유전자 변형을 갖지만, 본 발명의 세균은 바람직하게는 kpsC 유전자의 발현을 증가시키는 유전자 변형을 갖지 않고, 보다 바람직하게는 kpsC 유전자, 및 kpsF, kpsE, kpsD 및 kpsU 유전자로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 발현을 증가시키는 유전자 변형을 갖지 않고, 가장 바람직하게는 모든 kpsC, kpsF, kpsE, kpsD 및 kpsU 유전자의 발현을 증가시키는 유전자 변형을 갖지 않는다.
kfiA, kfiB, kfiC 및 kfiD 유전자로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 발현을 증가시키는 유전자 변형은 바람직하게는 kfiA, kfiB, kfiC 및 kfiD 유전자로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 발현 제어 영역의 변형 및 상기 유전자들의 카피수 증가 중 적어도 하나이다. kfiA, kfiB, kfiC 및 kfiD 유전자는 도 1에 도시된 바와 같이 오페론을 구성한다. kfiA, kfiB, kfiC 및 kfiD 유전자로 구성된 전체 오페론을 향상시키는 유전자 변형이 바람직하고, kfiA, kfiB, kfiC 및 kfiD 유전자의 발현 제어 영역의 변형이 보다 바람직하다.
<<유전자 기능 상실을 유발하는 유전자 변형>>
상기 (3)의 yhbJ 유전자의 기능 상실을 유발하는 유전자 변형의 예는 yhbJ 유전자의 기능 상실을 유발하는 yhbJ에 상응하는 부분에 의해 코딩되는 단백질의 기능이 숙주로서 에스케리키아 속의 세균의 게놈 DNA 내의 yhbJ에 상응하는 부분을 코딩하는 DNA를 변형시킴으로써 감소되거나 완전히 정지되는 유전자 변형을 포함한다.
본 발명의 방법에서, yhbJ에 상응하는 부분을 코딩하는 DNA에 첨가되는 변형의 형태는 yhbJ에 상응하는 부분에 의해 코딩되는 단백질의 기능이 감소되거나 완전히 정지되는 한 특별히 제한되지 않고, 공지된 방법이 적절히 사용될 수 있다.
yhbJ에 상응하는 부분에 의해 코딩되는 단백질의 기능을 감소시키거나 완전히 정지시키는 형태의 예는 하기 변형 (a) 내지 (c) 중 어느 하나를 포함한다:
(a) yhbJ에 상응하는 부분을 코딩하는 DNA의 전부 또는 일부가 제거된다,
(b) 하나 또는 수개의 치환, 결실 또는 첨가가 yhbJ에 상응하는 부분을 코딩하는 DNA에 대해 이루어진다, 및
(c) yhbJ에 상응하는 부분을 코딩하는 DNA가 변형 전에 DNA 서열과 80% 미만의 동일성을 갖는 DNA 서열로 치환된다.
yhbJ 유전자의 기능 상실의 예는 yhbJ 유전자의 활성이 비변형 균주의 것에 비해 바람직하게는 20% 이하, 보다 바람직하게는 10% 이하, 보다 더욱 바람직하게는 5% 이하인 경우를 포함한다. yhbJ의 활성은 노던 블로팅 방법, 웨스턴 블로팅 방법 등에 의해 glmS의 발현 수준을 조사함으로써 확인할 수 있다[Kalamorz F. et al, (2007) "Feedback control of glucosamine-6-phosphate synthase GlmS expression depends on the small RNA GlmZ and involves the novel protein YhbJ in Escherichia coli." Mol Microbiol. 65 (6):1518-33].
<<에스케리키아 속의 세균>>
에스케리키아 속에 속하는 세균은 특별히 제한되지 않고, 이의 예는 미생물학의 전문가에게 알려진 분류에 의해 에스케리키아 속으로 분류된 세균을 포함한다. 에스케리키아 속에 속하는 세균의 예는 문헌[Backmann, B.J. 1996. Derivations and Genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, p. 2460-2488. Table 1. In F.D. Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, DC]에 기재된 세균을 포함한다.
에스케리키아 속에 속하는 세균의 예는 에스케리키아 콜라이를 포함한다. 에스케리키아 콜라이의 예는 W3110 균주(ATCC 27325) 및 MG1655 균주(ATCC 47076)와 같은 에스케리키아 콜라이 K-12 균주; 에스케리키아 콜라이 K5 균주(ATCC 23506); BL21(DE3) 균주와 같은 에스케리키아 콜라이 B 균주; 에스케리키아 콜라이 니슬 1917 균주(DSM 6601); 및 이들의 유도체 균주를 포함한다.
이들 균주는 예를 들어 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(주소: 미국 메릴랜드주 20852 록빌 파크론 드라이브 12301, 사서함 1549, 버지니아주 20108 마나사스)에서 주문할 수 있다. 즉, 각 균주마다 등록번호가 부여되고, 이 등록번호를 이용하여 균주를 주문할 수 있다(https://www.atcc.org/ 참조). 각 균주에 해당하는 등록 번호는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션의 카탈로그에 설명되어 있다. 또한, BL21(DE3) 균주는 예를 들어 라이프 테크놀로지스(Life Technologies)(제품 번호 C6000-03)로부터 입수할 수 있다.
본 발명의 세균은 본래 헤파로산 생산능을 가질 수 있거나, 헤파로산 생산능을 갖도록 변형될 수 있다. 헤파로산 생산능을 갖는 세균은 예를 들어 상기 언급한 세균에 헤파로산 생산능을 부여함으로써 수득될 수 있다.
헤파로산 생산능은 문헌[Metabolic Engineering 14 (2012) 521-527, Carbohydrate Research 360 (2012) 19-24, 미국 특허 제9,975,928호] 등을 참고하여 헤파로산 생산에 관여하는 단백질을 코딩하는 유전자를 도입함으로써 부여할 수 있다. 헤파로산 생산에 관여하는 단백질의 예는 글리코실트랜스퍼라제 및 헤파로산-유출 운반체 단백질을 포함한다. 본 발명에서, 1종의 유전자가 도입될 수 있거나, 2종 이상의 유전자가 도입될 수 있다. 유전자의 도입은 상술한 유전자의 카피수를 증가시키는 방법과 동일한 방식으로 수행될 수 있다.
<헤파로산의 제조 방법>
본 발명의 헤파로산의 제조 방법은 본 발명의 세균을 배지에서 배양하여 배지에 헤파로산을 생산 및 축적하는 단계를 포함한다. 본 발명의 헤파로산의 제조 방법은 필요에 따라 배지로부터 헤파로산을 수집하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
사용되는 배지는 본 발명의 세균이 성장할 수 있고 헤파로산이 생산 및 축적될 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 배지로서, 예를 들어 세균 배양을 위해 사용되는 통상의 배지를 사용할 수 있다. 배지의 예는 LB 배지(루리아 베르타니 (Luria-Bertani) 배지)를 포함하지만, 예가 이에 제한되는 것은 아니다. 배지로서, 예를 들어 탄소 공급원, 질소 공급원, 포스페이트 공급원, 황 공급원 및 기타 다양한 유기 성분 및 무기 성분으로부터 선택된 성분을 필요에 따라 함유하는 배지를 사용할 수 있다. 당업자는 배지 성분의 유형 및 농도를 적절히 설정할 수 있다.
탄소 공급원은 본 발명의 세균에 의해 이용되어 헤파로산이 생산될 수 있도록 하는 것이라면 특별히 제한되지 않는다. 탄소 공급원의 예는 글루코스, 프럭토스, 수크로스, 락토스, 갈락토스, 자일로스, 아라비노스, 당밀, 전분 가수분해물 및 바이오매스 가수분해물과 같은 당, 아세트산, 푸마르산, 시트르산, 석신산 및 말산과 같은 유기산, 글리세롤, 조 글리세롤 및 에탄올과 같은 알코올, 및 지방산을 포함한다. 탄소 공급원으로서, 1종의 탄소 공급원이 사용될 수 있거나, 2종 이상의 탄소 공급원이 조합될 수 있다.
질소 공급원의 예는 황산암모늄, 염화암모늄 및 인산암모늄과 같은 암모늄 염, 펩톤, 효모 추출물, 육류 추출물 및 대두 단백 분해 산물과 같은 유기 질소 공급원, 암모니아 및 요소를 포함한다. 질소 공급원으로서, 1종의 질소 공급원이 사용될 수 있거나, 2종 이상의 질소 공급원이 조합될 수 있다.
포스페이트 공급원의 예는 인산이수소칼륨 및 인산수소이칼륨과 같은 포스페이트, 및 피로인산과 같은 인산 중합체를 포함한다. 포스페이트 공급원으로서, 1종의 포스페이트 공급원이 사용될 수 있거나, 2종 이상의 포스페이트 공급원이 조합될 수 있다.
황 공급원의 예는 설페이트, 티오설페이트 및 설파이트와 같은 무기 황 화합물, 및 시스테인, 시스틴 및 글루타티온과 같은 황 함유 아미노산을 포함한다. 황 공급원으로서, 1종의 황 공급원이 사용될 수 있거나, 2종 이상의 황 공급원이 조합될 수 있다.
기타 다양한 유기 성분 및 무기 성분의 구체적 예는 염화나트륨 및 염화칼륨과 같은 무기 염; 철, 망간, 마그네슘 및 칼슘과 같은 미량 금속; 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 니코틴산, 니코틴아미드 및 비타민 B12와 같은 비타민; 아미노산; 핵산; 펩톤, 카사미노산, 효모 추출물 및 대두 단백 분해 산물과 같은, 이들을 함유하는 유기 성분을 포함한다. 기타 다양한 유기 성분 및 무기 성분으로서, 1종의 성분이 사용될 수 있거나, 2종 이상의 성분이 조합될 수 있다.
또한, 성장을 위해 아미노산 등을 필요로 하는 영양요구성 돌연변이체가 사용되는 경우, 배지에 필요한 영양소를 보충하는 것이 바람직하다. 게다가, 항생제 내성 유전자를 보유한 벡터를 이용하여 유전자를 도입할 때, 해당 항생제를 배지에 첨가하는 것이 바람직하다.
배양 조건은 본 발명의 세균이 성장할 수 있고 헤파로산이 생산 및 축적될 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 배양은 예를 들어 세균 배양에 사용되는 통상의 조건 하에 수행될 수 있다. 배양 조건은 당업자에 의해 적절히 설정될 수 있다.
배양은 호기적으로, 예를 들어, 통기 배양 또는 액체 배지를 사용한 진탕 배양에 의해 수행될 수 있다. 배양 온도는 예를 들어 30℃ 내지 37℃일 수 있다. 배양 기간은 예를 들어 16시간 내지 72시간일 수 있다. 배양은 회분식 배양, 유가식 배양, 연속 배양 또는 이들의 조합에 의해 수행될 수 있다. 또한, 배양은 전배양 및 본배양으로 나뉠 수 있다. 전배양은 예를 들어 플레이트 배지 또는 액체 배지를 사용하여 수행될 수 있다.
상술한 바와 같은 본 발명의 세균을 배양함으로써, 헤파로산이 배지에 축적된다.
배양액으로부터 헤파로산을 수집하는 방법은 헤파로산이 수집될 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 배양액으로부터 헤파로산을 수집하는 방법의 예는 실시예에 기재된 방법을 포함한다. 구체적으로, 예를 들어 배양액으로부터 배양 상청액을 분리하고, 다음으로 상청액 중의 헤파로산을 에탄올 침전에 의해 침전시킬 수 있다. 첨가되는 에탄올 양은 예를 들어 상청액 양의 2.5배 내지 3.5배일 수 있다. 헤파로산의 침전을 위해, 에탄올뿐만 아니라 임의로 물과 혼화성인 유기 용매도 사용할 수 있다.
유기 용매의 예는 에탄올, 메탄올, n-프로판올, 이소프로판올, n-부탄올, t-부탄올, sec-부탄올, 프로필렌 글리콜, 아세토니트릴, 아세톤, DMF, DMSO, N-메틸피롤리돈, 피리딘, 1,2-디메톡시에탄, 1,4-디옥산 및 THF를 포함한다.
배양액으로부터 헤파로산을 수집하는 방법의 추가 예는 헤파로산의 말단에 존재하는 Kdo를 표적화하여 헤파로산을 정제하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다.
침전된 헤파로산은 예를 들어 본래 상청액 양의 2배인 물에 용해될 수 있다. 수집된 헤파로산은 헤파로산 이외에도, 세균 세포, 배지 성분, 수분 및 세균의 대사 부산물과 같은 성분을 함유할 수 있다. 헤파로산은 원하는 정도로 정제할 수 있다. 헤파로산의 순도는 예를 들어 30%(w/w) 이상, 50%(w/w) 이상, 70%(w/w) 이상, 80%(w/w) 이상, 90%(w/w) 이상, 또는 95%(w/w) 이상일 수 있다.
헤파로산의 검출 및 정량화는 공지된 방법으로 수행할 수 있다. 구체적으로, 예를 들어 실시예에서 후술하는 바와 같은 카바졸 방법에 의해 헤파로산을 검출 및 정량화할 수 있다. 카바졸 방법은 우론산을 정량화하는 방법으로서 널리 사용되는 방법이며, 헤파로산을 황산의 존재 하에 카바졸과 열 반응시키고 생성된 착색 물질에 의해 530 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 헤파로산을 검출 및 정량화할 수 있다[Bitter T. and Muir H.M., (1962) "A modified uronic acid carbazole reaction." Analytical Biochemistry, 4 (4):330-334]. 또한, 예를 들어 헤파로산을 헤파로산-분해 효소인 헤파리나제 III로 처리하고 이당류 조성 분석을 수행함으로써 헤파로산을 검출 및 정량화할 수 있다.
실시예
하기에 실시예를 나타내지만, 본 발명은 다음의 실시예로 제한되지 않는다.
실시예 1
유전자-결실된 균주의 작제
(a) 유전자 결실을 위한 마커 유전자 단편의 작제
상동 재조합을 이용한 에스케리키아 콜라이의의 유전자 결실을 위한 마커 유전자로서 사용된 클로람페니콜 내성 유전자(cat) 및 레반수크라제 유전자(sacB)를 함유하는 DNA 단편은 다음과 같이 제조하였다.
서열번호 1 및 2에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 이루어진 합성 DNA를 프라이머 세트로서 사용하고 플라스미드 pHSG396(Takara Bio Inc.)을 주형으로서 사용하여 PCR을 수행하고, 이를 통해 cat 유전자를 포함하는 DNA 단편을 수득하였다. PCR은 사용 매뉴얼의 설명에 따라 PrimeSTAR Max DNA 폴리머라제(Takara Bio Inc.)를 사용하여 수행하였다. 또한, 서열번호 3 및 4에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 이루어진 합성 DNA를 프라이머 세트로서 사용하고 pMOB3(ATCC 77282 유래)를 주형으로서 사용하여 PCR을 수행하고, 이를 통해 sacB 유전자를 포함하는 DNA 단편을 수득하였다.
cat 유전자를 포함하는 DNA 단편 및 sacB 유전자를 포함하는 DNA 단편을 정제한 후, DNA 단편을 SalI로 절단하였다. 페놀/클로로포름 처리 및 에탄올 침전을 수행하고, 두 단편을 등몰비로 혼합하고 DNA 연결 키트 Ver.2(Takara Bio Inc.)를 사용하여 라이게이션(ligation)하였다. 라이게이션 반응 용액을 페놀/클로로포름 처리하고 에탄올 침전에 의해 정제하고, 이렇게 수득된 산물을 주형으로서 사용하고 서열번호 5 및 6에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 이루어진 합성 DNA를 프라이머 세트로서 사용하여 PCR을 수행하였다. 생성된 증폭된 DNA를 Qiaquick PCR 정제 키트(Qiagen)를 이용하여 정제하고, 이를 통해 cat 유전자 및 sacB 유전자를 포함하는 DNA 단편(cat-sacB 단편)을 수득하였다.
(b) yhbJ -결핍 균주의 작제
서열번호 7 및 8에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 이루어진 합성 DNA와 서열번호 9 및 10에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 이루어진 합성 DNA를 프라이머 세트로서 사용하고 종래의 방법에 의해 제조된 에스케리키아 콜라이 니슬 1917 균주[DSM 6601, Mutaflor(Pharma-Zentrale GmbH), 이하 니슬 균주로 약칭]의 게놈 DNA를 주형으로서 사용하여 1차 PCR을 수행하였다. 그 결과, yhbJ 유전자의 개시 코돈 부근으로부터 상류 1000 bp 및 yhbJ 유전자의 정지 코돈 부근으로부터 하류 약 1000 bp를 각각 포함하는 DNA 단편을 수득하였다. PCR은 사용 매뉴얼의 설명에 따라 PrimeSTAR Max DNA 폴리머라제(Takara Bio Inc.)를 사용하여 수행하였다.
QIAquick PCR 정제 키트(Qiagen 제조)를 사용하여 정제된 증폭된 산물과 cat-sacB 단편을 등몰비로 혼합하여 수득한 혼합물을 주형으로서 사용하여 2차 PCR을 수행하였다. PCR은 사용 매뉴얼의 설명에 따라 PrimeSTAR GXL DNA 폴리머라제(Takara Bio Inc.)를 사용하여 수행하였다. 프라이머 세트의 경우, 서열번호 7 및 10에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 이루어진 합성 DNA를 사용하였다. 증폭된 산물을 아가로스 겔 전기영동하여 약 4.6 kbp의 DNA 단편을 분리하고, 이를 통해 cat-sacB 단편이 삽입된 yhbJ 주변 영역을 포함하는 DNA 단편을 수득하였다.
또한, 서열번호 7 및 11에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 이루어진 합성 DNA와 서열번호 12 및 10에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 이루어진 합성 DNA를 프라이머 세트로서 사용하고 에스케리키아 콜라이 니슬 균주의 게놈 DNA를 주형으로서 사용하여 1차 PCR을 수행하였다. 그 결과, yhbJ 유전자의 개시 코돈 부근으로부터 상류 1000 bp 및 yhbJ 유전자의 정지 코돈 부근으로부터 하류 약 1000 bp를 각각 포함하는 DNA 단편을 수득하였다.
정제된 증폭 산물을 등몰비로 혼합하여 수득한 혼합물을 주형으로서 사용하여 2차 PCR을 수행하였다. 프라이머 세트의 경우, 7 및 10에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 이루어진 합성 DNA를 사용하였다. 증폭된 산물을 아가로스 겔 전기영동하여 약 2.0kbp의 DNA 단편을 분리하고, 이를 통해 yhbJ 유전자가 결핍된 yhbJ 주변 영역을 포함하는 DNA 단편을 수득하였다.
다음으로, pKD46을 보유하는 에스케리키아 콜라이 니슬 균주(니슬/pKD46 균주)를 LB 배지[10 g/L 박토트립톤(Difco 제조), 5 g/L 효모 추출물(Difco 제조) 및 5 g/L 염화나트륨]에서 15 g/L의 L-아라비노스 및 100 mg/L의 암피실린 존재 하에 배양하였다. 플라스미드 pKD46은 람다 Red 재조합효소 유전자를 갖고 있고, 따라서 L-아라비노스에 의해 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 따라서, L-아라비노스의 존재 하에 성장한 pKD46을 보유하는 에스케리키아 콜라이를 선형 DNA를 이용하여 형질전환시켰을 때, 상동 재조합이 높은 빈도로 일어난다. 또한, pKD46은 감온성 복제 기점을 갖고 있기 때문에, 42℃에서 pKD46을 성장시킴으로써 플라스미드가 쉽게 탈락될 수 있다. 니슬/pKD46 균주의 적격 세포(competent cell)를 생성하고, 상기에서 수득된 cat-sacB 단편이 삽입된 yhbJ 주변 영역을 포함하는 DNA 단편을 전기천공법에 의해 여기에 도입하였다.
수득된 형질전환체를 15 mg/L의 클로람페니콜 및 100 mg/L의 암피실린을 함유하는 LB 한천 배지(LB + 클로람페니콜 + 암피실린)에 적용하고 배양하여, 클로람페니콜 내성 콜로니를 선택하였다. 상동 재조합이 일어난 균주는 클로람페니콜에 내성이고 수크로스에 민감성이기 때문에, 선택된 콜로니를 10% 수크로스 및 100 mg/L의 암피실린을 함유하는 LB 한천 배지, 및 LB + 클로람페니콜 + 암피실린(LB + 수크로스 + 암피실린)에서 복제하고, 이를 통해 클로람페니콜 내성 및 수크로스 민감성을 나타내는 균주를 선택하였다.
서열번호 13 및 10에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 이루어진 합성 DNA를 프라이머 세트로서 사용하여 선택된 균주에 대하여 콜로니 PCR을 수행하고, cat-sacB 단편이 yhbJ 유전자의 위치에 삽입되었음을 확인하였다. cat-sacB 단편이 yhbJ 유전자 위치에 삽입된 균주를 상술한 바와 동일한 방식으로 배양하여 적격 세포를 생성하고, 상기에서 수득된, yhbJ 유전자가 결핍된 yhbJ 주변 영역을 포함하는 DNA 단편을 전기천공법에 의해 여기에 도입하였다.
수득된 형질전환체를 LB + 수크로스 한천 배지에서 배양하고, 수크로스 내성 콜로니를 선택하였다. 상동 재조합을 거친 균주는 cat-sacB 단편을 함유하지 않고 따라서 클로람페니콜에 민감성이고 수크로스에 내성이기 때문에, 선택된 콜로니를 LB + 클로람페니콜 한천 배지 및 LB + 수크로스 한천 배지에서 복제하고, 이를 통해 클로람페니콜 민감성 및 수크로스 내성을 나타내는 균주를 선택하였다.
서열번호 13 및 10에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 이루어진 합성 DNA를 프라이머 세트로서 사용하여 선택된 균주에 대하여 콜로니 PCR을 수행하고, yhbJ 유전자가 결실된 것을 확인하였다. yhbJ 유전자가 결실된 것으로 확인된 균주를 LB 한천 배지에 적용하고 42℃에서 배양한 다음, 암피실린 민감성을 나타내는 균주, 즉 pKD46이 탈락된 균주를 선택하였다.
yhbJ 유전자가 결핍된 균주를 상술한 바와 같이 수득하고 에스케리키아 콜라이 NY 균주로 지정하였다.
실시예 2
유전자-향상된 균주의 작제
kfiA 유전자의 프로모터-영역-치환된 균주를 다음의 방법으로 작제하였다. 서열번호 14 및 15에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 이루어진 합성 DNA와 서열번호 16 및 17에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 이루어진 합성 DNA를 프라이머 세트로서 사용하고 일반적인 방법으로 제조한 에스케리키아 콜라이 니슬 균주의 게놈 DNA를 주형으로서 사용하여 1차 PCR을 수행하였다. 그 결과, kfiA 유전자의 개시 코돈의 약 100 bp 상류로부터 상류 약 1000 bp 및 kfiA 유전자의 개시 코돈 부근으로부터 하류 약 1000 bp를 각각 포함하는 DNA 단편이 수득되었다.
QIAquick PCR 정제 키트(Qiagen사 제조)를 사용하여 정제된 증폭된 산물과 cat-sacB 단편을 등몰비로 혼합하여 수득한 혼합물을 주형으로서 사용하여 2차 PCR을 수행하였다. 프라이머 세트의 경우, 서열번호 14 및 17에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 이루어진 합성 DNA를 사용하였다. 증폭된 산물을 아가로스 겔 전기영동하여 약 4.6kbp의 DNA 단편을 분리하고, 이를 통해 cat-sacB 단편이 삽입된 kfiA 유전자의 프로모터 주변 영역을 포함하는 DNA 단편을 수득하였다.
서열번호 14 및 18에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 이루어진 합성 DNA와 서열번호 19 및 17에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 이루어진 합성 DNA를 프라이머 세트로서 사용하고 일반적으로 방법으로 제조한 에스케리키아 콜라이 니슬 균주의 게놈 DNA를 주형으로서 사용하여 1차 PCR을 수행하였다. 그 결과, kfiA 유전자의 개시 코돈의 약 100 bp 상류로부터 상류 1000 bp 및 kfiA 유전자의 개시 코돈 부근으로부터 하류 약 1000 bp를 각각 포함하는 DNA 단편을 수득하였다.
또한, 서열번호 20 및 21에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 이루어진 합성 DNA를 프라이머 세트로서 사용하고 일반적인 방법으로 제조한 에스케리키아 콜라이 W 균주(ATCC 9637)의 게놈 DNA를 주형으로서 사용하여 PCR을 수행하고, 이를 통해 uspA 프로모터를 포함하는 약 300bp의 DNA 단편을 수득하였다.
정제된 증폭된 산물을 등몰비로 혼합하여 수득한 혼합물을 주형으로서 사용하여 2차 PCR을 수행하였다. 프라이머 세트의 경우, 14 및 17에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 이루어진 합성 DNA를 사용하였다. 증폭된 산물을 아가로스 겔 전기영동하여 약 2.3kbp의 DNA 단편을 분리하고, 이를 통해 kfiA 프로모터 주변 영역으로부터 kfiA 프로모터 영역이 결핍되었지만 대신 uspA 프로모터를 포함하는 DNA 단편을 수득하였다.
다음으로, 감마 Red 재조합효소를 코딩하는 유전자를 함유하는 플라스미드 pKD46을 보유하는 에스케리키아 콜라이 니슬 균주(니슬/pKD46 균주) 및 실시예 1에서 작제된 에스케리키아 콜라이 NY 균주(NY/pKD46 균주)를 15g/L의 L-아라비노스 및 100mg/L의 암피실린의 존재 하에 배양하였다. 두 균주 모두의 적격 세포를 생성하고, 상기에서 수득된 cat-sacB 단편이 삽입된 kfiA 프로모터 주변 영역을 포함하는 DNA 단편을 전기천공법에 의해 여기에 도입하였다.
수득된 형질전환체를 LB + 클로람페니콜 + 암피실린 한천 배지에서 배양하고, 클로람페니콜-내성 콜로니를 선택하였다. 클로람페니콜 내성 및 수크로스 민감성을 나타내는 균주를 선택된 콜로니로부터 추가로 선택하였다.
서열번호 22 및 17에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 이루어진 합성 DNA를 프라이머 세트로서 사용하여 선택된 균주에 대하여 콜로니 PCR을 수행하고, cat-sacB 단편이 kfiA 프로모터 영역에 삽입되었음을 확인하였다.
cat-sacB 단편이 kfiA 프로모터 영역에 삽입된 균주를 상술한 바와 동일한 방식으로 배양하여 적격 세포를 생성하고, 상기에서 수득된, kfiA 프로모터 주변 영역으로부터 kfiA 프로모터 영역이 결핍되었지만 대신 uspA 프로모터를 포함하는 DNA 단편을 전기천공법에 의해 여기에 도입하였다.
수득된 형질전환체를 LB + 수크로스 한천 배지에서 배양하고 수크로스 내성 콜로니를 선택하였다. 클로람페니콜 민감성 및 수크로스 내성을 나타내는 균주를 선택된 콜로니로부터 추가로 선택하였다.
서열번호 22 및 17에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 이루어진 합성 DNA를 프라이머 세트로서 사용하여 선택된 균주에 대하여 콜로니 PCR을 수행하고, uspA 프로모터가 kfiA 프로모터 영역에 삽입었다는 것을 확인하였다. uspA 프로모터가 kfiA 프로모터 영역에 삽입된 것으로 확인된 균주를 LB 한천 배지에 적용하고 42℃에서 배양한 다음, 암피실린 민감성을 나타내는 균주, 즉 pKD46이 탈락된 균주를 선택하였다.
상술한 바와 같이 uspA 프로모터가 kfiA 프로모터 영역에 삽입된 균주를 수득하고 각각 에스케리키아 콜라이의 NA 균주 및 NYA 균주로 지정하였다.
실시예 3
NY 균주, NA 균주 및 NYA 균주를 이용한 헤파로산 생산 시험
(a) 헤파로산-생산 균주의 배양
실시예 1에서 수득된 yhbJ-결핍 돌연변이 NY 균주, 실시예 2에서 수득된 kfiA-프로모터-치환된 균주 NA 균주 및 kfiA-프로모터-치환된 yhbJ-결핍 균주 NYA 균주, 및 모 균주인 니슬 균주를 LB 한천 배지에서 30℃에서 24시간 동안 배양하고, 330 ml의 전배양 배지[10 g/L 대두 펩티드(Hinute AM; Fuji Oil Co., Ltd. 제조), 5 g/L 염화나트륨, 5 g/L 효모 추출물 분말(AY-80; Asahi Food and Healthcare Co., Ltd. 제조)를 pH가 pH 7.2가 되도록 수산화나트륨으로 조정하였다]를 함유하는 2 L 배플에 각각 접종하고 30℃에서 18시간 동안 배양하였다.
760 mL의 본배양 배지[여기서 20 g/L 글루코스, 13.5 g/L 인산이수소칼륨, 4 g/L 인산이암모늄, 1.7 g/L 시트르산, 1.7 g/L 황산마그네슘 칠수화물, 10 mg/L 티아민 하이드로클로라이드 및 10 mL/L 미량 미네랄 용액을 5mol/L의 수산화나트륨으로 pH가 pH 6.7이 되도록 조정하고, 오토클레이브 멸균(120℃에서 20분 동안) 후 글루코스 및 황산마그네슘 칠수화물을 개별적으로 첨가하였다]를 함유하는 자 발효기(jar fermenter)에 40 mL의 수득된 전배양물을 접종하고 37℃에서 72시간 동안 800 rpm의 교반 속도 및 1.5 L/분의 통기 속도에서 배양하였다.
미량 미네랄 용액은 10 g/L 황산철 칠수화물, 2 g/L 염화칼슘, 2.2 g/L 황산아연 칠수화물, 0.5 g/L 황산망간 사수화물, 1 g/L 황산구리 오수화물, 0.1 g/L 헵타몰리브덴산헥사암모늄 사수화물 및 0.02 g/L 사붕산나트륨 십수화물을 5 mol/L 염산에 용해시켰다.
배양액 중의 글루코스 농도가 0 g/L(0시간)이 된 시점부터 72시간까지, 피드 용액(feed solution)[500g/L 글루코스, 33.6g/L 인산이수소칼륨, 14.3g/L 황산마그네슘, 0.4g/L 티아민 히드로클로라이드, 및 14.3mL/L 미량 미네랄 용액]을 7.0 mL/시간으로 첨가하였다. 배양 종료 시까지 첨가된 피드 용액의 양은 약 450mL였다.
(b) 헤파로산-생산 균주 배양액으로부터 헤파로산의 부분 정제
증류수로 10배 희석된 배양액을 100℃에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 세균 세포를 원심분리하여 배양액으로부터 제거하고, 200 마이크로리터의 수득된 상청액을 1.5 mL 에펜도르프 튜브로 옮겼다. 0.5 mol/L의 황산나트륨 수용액 40 마이크로리터를 첨가하고 혼합한 후, 염화헥사데실피리디늄의 10 g/L 수용액 400 마이크로리터를 첨가하고 전도 혼합하고, 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 정치시켰다.
용액을 원심분리하여 침전물을 형성하고, 상청액을 제거하였다. 침전물을 증류수로 세척한 후, 100 마이크로리터의 용액[0.5 mol/L 염화나트륨 및 4%(v/v) 에탄올을 함유하는 수용액]을 첨가하여 침전물을 용해시켰다. 추가로 4℃에서 밤새 정치시킨 후, 0.25 mol/L의 염화나트륨 수용액 900 마이크로리터를 첨가하고 혼합하고, 이를 통해 조 헤파로산 용액을 수득하였다. 200 마이크로리터의 본배양 배지를 동일한 방법으로 처리하여 블랭크(blank)를 또한 제조하였다.
(c) 카바졸-황산법에 의한 축적된 헤파로산 양의 측정
20 마이크로리터의 조 헤파로산 용액을 빙냉시키면서, 100 마이크로리터의 황산 용액[9.5 g/L 사붕산나트륨 십수화물이 농축 황산에 용해된 용액]을 첨가하고 혼합한 후, 100℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 용액을 다시 빙냉시키면서, 4 마이크로리터의 카바졸 용액[1.25 g/L 카바졸이 100% 에탄올에 용해된 용액]을 여기에 첨가하고 혼합하고 100℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다.
용액을 다시 빙냉시킨 후, 온도를 실온으로 되돌리고 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 530 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 검량선에 대해 0, 0.1 및 0.2 g/L 글루쿠론산나트륨 일수화물을 사용하여, 수평축을 글루쿠론산 농도(g/L)로 하고 수직축을 530nm에서의 흡광도로 하여 검량선을 작성하였다.
헤파로산 농도는 하기 기재된 계산식에 따라 계산하였다. 여기서, 원하는 헤파로산 농도는 H(g/L)를 나타내고, 수득된 검량선은 y = ax + b를 나타내고, 조 헤파로산 샘플의 A530 측정값은 h를 나타내고, 블랭크 A530 측정값은 k를 나타내고, 최종 희석비는 n을 나타낸다. 0.5387은 헤파로산 중의 글루쿠론산 함량을 나타내고, 216/234는 글루쿠론산나트륨 일수화물 중의 글루쿠론산나트륨 함량을 나타낸다.
(d) 축적된 헤파로산 양의 측정 결과
표 1은 상기 방법으로 측정될 때 축적된 헤파로산 양을 나타낸다.
표 1에 나타낸 바와 같이, yhbJ가 결핍된 NY 균주에 축적된 헤파로산 양은 모 균주 니슬의 것에 비해 2배 이상 높았다. 또한, kfiA 프로모터가 uspA 프로모터로 치환된 NA 균주에서도, 축적된 헤파로산 양은 모 균주 니슬의 것에 비해 증가되었다. 이들 두 돌연변이가 조합된 NYA 균주는 훨씬 더 높은 헤파로산 생산성을 나타냈다.
실시예 4
헤파로산 생산에 관여하는 유전자를 발현하는 플라스미드의 작제
에스케리키아 콜라이 니슬 균주의 염색체 DNA를 주형으로서 사용하고 서열번호 23 및 24에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 이루어진 합성 DNA를 프라이머 세트로서 사용하여 PCR 반응을 수행하고, 이를 통해 kpsC 및 kpsS 유전자 영역을 함유하는 약 3.3kbp의 DNA 단편(이하 kpsCS 유전자 증폭된 단편으로 지칭)을 수득하였다.
pMW118 벡터를 주형으로서 사용하고 서열번호 25 및 26에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 이루어진 합성 DNA를 프라이머 세트로서 사용하여 PCR 반응을 수행하고, 이를 통해 약 4kbp의 pMW118 선형 DNA 단편을 수득하였다. 또한, 에스케리키아 콜라이 W 균주(ATCC 9637)의 염색체 DNA를 주형으로서 사용하고 서열번호 20 및 21에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 이루어진 합성 DNA를 프라이머 세트로서 사용하여 PCR 반응을 수행하고, 이를 통해 uspA 프로모터 영역을 포함하는 약 300bp의 DNA 단편을 수득하였다.
상기와 같이 수득된 pMW118 선형 DNA 단편, uspA 프로모터 영역을 함유하는 DNA 단편 및 kpsCS 유전자 증폭된 단편을 In-Fusion HD 클로닝 키트(Takara Bio Inc.)를 사용하여 혼합 및 라이게이션하였다.
수득된 라이게이션된 DNA를 이용하여 에스케리키아 콜라이 DH5 알파 균주를 형질전환시키고, 암피실린 내성을 지표로서 사용하여 형질전환체를 선택하였다. 플라스미드를 공지된 방법에 따라 형질전환체로부터 추출하고, 서열번호 27 및 24에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 이루어진 합성 DNA를 프라이머 세트로서 사용하여 PCR 반응을 수행하고, 이를 통해 유전자 발현 플라스미드가 수득되었음을 확인하고, 이를 pMW118-kpsCS로 지정하였다.
또한, 에스케리키아 콜라이 니슬 균주의 염색체 DNA를 주형으로서 사용하고 서열번호 28 및 24에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 이루어진 합성 DNA와 서열번호 29 및 24에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 이루어진 합성 DNA를 프라이머 세트로서 사용하여 PCR 반응을 수행하고, 이를 통해 kpsS 유전자 영역을 함유하는 약 1.2 kbp의 DNA 단편(이하 kpsS 유전자 증폭된 단편으로 지칭) 및 kbp kpsF, kpsE, kpsD, kpsU, kpsC 및 kpsS 유전자 영역을 함유하는 약 7.9 kbp의 DNA 단편(이하 kpsFEDUCS 유전자 증폭된 단편으로 지칭)을 각각 수득하였다.
또한, 상기에서 수득된 플라스미드 pMW118-kpsCS를 주형으로서 사용하고 서열번호 25 및 21에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 이루어진 합성 DNA를 프라이머 세트로서 사용하여 PCR 반응을 수행하고, 이를 통해 uspA 프로모터 서열을 함유하는 약 4.3 kbp의 pMW118 선형 DNA 단편을 수득하였다.
상기에서 수득된, uspA 프로모터 서열을 함유하는 pMW118 선형 DNA 단편과 kpsS 유전자 증폭된 단편을 In-Fusion HD 클로닝 키트(Takara Bio Inc.)를 사용하여 혼합하고 라이게이션하였다. 동일한 방식으로, uspA 프로모터 서열을 포함하는 pMW118 선형 DNA 단편과 kpsFEDUCS 유전자 증폭된 단편을 혼합하고 라이게이션하였다.
에스케리키아 콜라이 DH5 알파 균주를 수득된 각각의 라이게이션된 DNA를 사용하여 형질전환시키고, 암피실린 내성을 지표로서 사용하여 형질전환체를 선택하였다. 플라스미드를 공지된 방법에 따라 형질전환체로부터 추출하고, 서열번호 20 및 24에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 이루어진 합성 DNA를 kpsS 유전자 증폭된 단편이 라이게션된 플라스미드를 위한 프라이머 세트로서 사용하고 서열번호 27 및 30에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 이루어진 합성 DNA와 서열번호 31 및 32에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 이루어진 합성 DNA를 kpsFEDUCS 유전자 증폭된 단편이 라이게이션된 플라스미드를 위한 프라이머 세트로서 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 따라서, 해당 유전자를 발현하는 플라스미드가 각각 수득되었음을 확인하고, 이를 각각 pMW118-kpsS 및 pMW118-kpsFEDUCS로 지정하였다.
실시예 5
유전자 발현 플라스미드를 보유한 균주를 이용한 헤파로산 생산 시험 - 1
pMW118 플라스미드, 및 실시예 4에서 수득된 pMW118-PuspA-kpsS, pMW118-PuspA-kpsCS 및 pMW118-PuspA-kpsFEDUCS를 실시예 1에서 수득된 NY 균주로 각각 형질전환시켰다. 수득된 형질전환체를 각각 NY/pMW118 균주, NY/pMW118-PuspA-kpsS 균주, NY/pMW118-PuspA-kpsCS 균주 및 NY/pMW118-PuspA-kpsFEDUCS 균주로 지정하였다.
상기에서 수득된 형질전환체를 100 mg/L의 암피실린을 함유하는 5 mL의 LB 배지를 함유하는 대형 시험관에 접종하고 37℃에서 15시간 동안 배양하였다. 1% 배양액을 100 mg/L의 암피실린을 함유하는 5 mL의 R 배지[여기서 20 g/L의 글루코스, 13.5 g/L의 인산이수소칼륨, 4 g/L의 인산이암모늄, 1.7 g/L 시트르산, 1 g/L 황산마그네슘 칠수화물, 10 mg/L 티아민 하이드로클로라이드 및 10 mL/L 미량 미네랄 용액을 5mol/L의 수산화나트륨으로 pH가 pH 6.8이 되도록 조정하고, 오토클레이브 멸균(120℃에서 20분 동안) 후 글루코스 및 황산마그네슘 칠수화물을 개별적으로 첨가하였다]를 함유하는 시험관에 접종하고, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 또한, NY 균주에 대해서도 암피실린이 함유되지 않은 조건 하에 동일한 조작을 수행하였다.
수득된 배양액을 실시예 3에 기재된 방법으로 처리하고, 배양액에 축적된 헤파로산 양을 측정하였다. 결과는 표 2에 나타낸다.
표 2에 나타낸 바와 같이, kpsS를 발현하는 NY/pMW118-PuspA-kpsS 균주에서, 축적된 헤파로산 양은 모 균주 NY, 및 pMW118 벡터만을 보유하는 NY/pMW118 균주의 것에 비해 명백히 증가되었다.
한편, kpsC 및 kpsS를 발현하는 NY/pMW118-PuspA-kpsCS 균주 및 kpsF, kpsE, kpsD, kpsU, kpsC 및 kpsS를 발현하는 NY/pMW118-PuspA-kpsFEDUCS 균주가 NY/pMW118-PuspA-kpsS 균주와 거의 동일한 헤파로산 생산성을 보였다는 결과에 기반하여, kpsFEDUCS에서 헤파로산 생산 유전자 군인 kpsS만의 발현을 향상시킴으로써 헤파로산 생산능을 개선하는 효과가 충분히 수득된다는 것이 밝혀졌다.
실시예 6
유전자 발현 플라스미드를 보유한 균주를 이용한 헤파로산 생산 시험 - 2
pMW118 플라스미드, 및 실시예 4에서 수득된 pMW118-PuspA-kpsS, pMW118-PuspA-kpsCS 및 pMW118-PuspA-kpsFEDUCS를 각각 에스케리키아 콜라이 니슬의 야생형 균주로 형질전환시켰다. 수득된 형질전환체를 각각 N/pMW118 균주, N/pMW118-PuspA-kpsS 균주, N/pMW118-PuspA-kpsCS 균주 및 N/pMW118-PuspA-kpsFEDUCS 균주로 지정하였다.
상기에서 수득된 형질전환체를 100 mg/L의 암피실린을 함유하는 5 mL의 LB 배지를 함유하는 대형 시험관에 접종하고 37℃에서 15시간 동안 배양하였다. 1% 배양액을 100 mg/L의 암피실린을 함유하는 5 mL의 R 배지[여기서 20 g/L 글루코스, 13.5 g/L 인산이수소칼륨, 4 g/L 인산이암모늄, 1.7 g/L 시트르산, 1 g/L 황산마그네슘 칠수화물, 10 mg/L 티아민 하이드로클로라이드 및 10 mL/L 미량 미네랄 용액을 5mol/L의 수산화나트륨으로 pH가 pH 6.8이 되도록 조정하고, 오토클레이브 멸균(120℃에서 20분 동안) 후 글루코스 및 황산마그네슘 칠수화물을 개별적으로 첨가하였다]를 함유하는 시험관에 접종하고 37℃에서 24시간 배양하였다. 또한, 야생형 니슬 균주에 대해서도 암피실린이 함유되지 않은 조건 하에 동일한 조작을 수행하였다.
수득된 배양액을 실시예 3에 기재된 방법으로 처리하고, 배양액에 축적된 헤파로산 양을 측정하였다. 결과는 표 3에 나탄내다.
표 3에 나타낸 바와 같이, kpsS를 발현하는 N/pMW118-PuspA-kpsS 균주에서, 축적된 헤파로산 양은 모 야생형 니슬 균주 및 pMW118 벡터만을 보유하는 N/pMW118 균주의 것에 비해 3배 이상 증가되었다.
한편, kpsC 및 kpsS를 발현하는 N/pMW118-PuspA-kpsCS 균주, 및 kpsF, kpsE, kpsD, kpsU, kpsC 및 kpsS를 발현하는 N/pMW118-PuspA-kpsFEDUCS 균주에서는, 역가가 모 균주의 최대 1.8배 개선되었다. 이와 관련하여, 헤파로산-생산 유전자 군 kpsFEDUCS 중 kpsS만의 발현을 향상시킴으로써 헤파로산 생산능을 개선하는 효과가 충분히 수득되고, kpsC 및 kpsFEDU의 발현이 향상되기보다는 향상되지 않았을 때 헤파로산 생산능이 더 높아졌다는 것이 밝혀졌다.
본 발명이 상세히 그리고 이의 구체적 실시양태를 참조하여 설명되었지만, 본 발명의 사상 및 범주로부터 벗어나지 않으면서 다양한 변경 및 변형이 이루어질 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 본원에 인용된 모든 참고문헌은 그 전체가 통합된다. 본 출원은 2020년 4월 3일에 출원된 국제출원 제PCT/JP2020/015384호에 기초하며, 이의 전체 내용은 본원에 참조로 통합된다.
SEQUENCE LISTING
<110> Rensselaer Polytechnic Institute
Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc
KYOWA HAKKO BIO CO.,LTD.
<120> Method for producing heparosan and bacterium of
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<130> W528319
<160> 38
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 42
<212> DNA
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<223> Synthesized oligonucleotide for primer
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<212> DNA
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<223> Synthesized oligonucleotide for primer
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caacagtttg cttgacgggt actgtttctc ctcacaacg 39
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<212> DNA
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<220>
<223> Synthesized oligonucleotide for primer
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ctttatggaa ggagtaacac tatgattggc atttactcgc ctgg 44
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<212> DNA
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<220>
<223> Synthesized oligonucleotide for primer
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized oligonucleotide for primer
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ggcactggcc gtcgttttac aacgtc 26
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized oligonucleotide for primer
<400> 26
gcgctttctc atagctcacg ctg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized oligonucleotide for primer
<400> 27
caccgaactg agatacctac agc 23
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<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized oligonucleotide for primer
<400> 28
ctttatggaa ggagtaacac tatgcaaggt aatgcactaa ccg 43
<210> 29
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized oligonucleotide for primer
<400> 29
caactttatg gaaggagtaa cactatgtct gaaagacatt tacc 44
<210> 30
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized oligonucleotide for primer
<400> 30
gttgcgcgtc atgatggctt tcc 23
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized oligonucleotide for primer
<400> 31
gaagtttggg tggcaacaga cgatc 25
<210> 32
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized oligonucleotide for primer
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cagggttttc ccagtcacga cgttg 25
<210> 33
<211> 1170
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 33
atgcaaggta atgcactaac cgttttatta tccggtaaaa aatatctgct attgcagggg 60
ccaatgggac cctttttcag tgatgttgcc gagtggctag agtcattagg tcgtaacgct 120
gtgaatgttg tattcaacgg tggggatcgt ttttactgcc gccatcgaca atacctagct 180
tactaccaga caccgaaaga gtttcccgga tggttacggg atctccaccg gcaatatgac 240
tttgacacaa tcctctgctt tggcgactgc cgcccattgc ataaagaagc aaaacgctgg 300
gcaaagtcga aagggatccg cttcctggca tttgaagaag gatatttacg cccgcaattt 360
attaccgttg aagaaggcgg agtgaacgca tattcatcgc taccgcgcga tccggatttt 420
tatcgtaagt taccagatat gcctacgccg cacgttgaga acttaaaacc ttcaacgatg 480
aaacgtatag gccatgctat gtggtattac ctgatgggct ggcattaccg tcatgagttt 540
cctcgctacc gccaccacaa atcattttcc ccctggtatg aagcacgttg ctgggttcgt 600
gcatactggc gcaagcaact ttacaaggta acacagcgta aggtattacc gaggttaatg 660
aacgaactgg accagcgtta ttatcttgct gttttgcagg tgtataacga tagccagatt 720
cgtaaccaca gcagttataa cgatgtgcgt gactatatta atgaagtcat gtactcattt 780
tcgcgtaaag cgccgaaaga aagttatttg gtgatcaaac atcatccgat ggatcgtggt 840
cacagactct atcgaccatt aattaaacgg ttgagtaagg aatatggctt aggtgagcga 900
atcctttatg tgcacgatct cccgatgccg gaattattac gccatgcaaa agcggtggtg 960
acgattaaca gtacggcggg gatctctgcg ctgattcata acaaaccact caaagtgatg 1020
ggcaatgccc tgtacgacat caagggcttg acgtatcaag ggcatttgca ccagttctgg 1080
caggctgatt ttaaaccaga tatgaaactg tttaagaagt ttcgtgggta tttattggtg 1140
aagacgcagg ttaatgcggt ttattattaa 1170
<210> 34
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<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 34
atgattgttg caaatatgtc atcataccca cctcgaaaaa aagagttggt gcattctata 60
caaagtttac atgctcaagt agataaaatt aatctttgcc tgaatgagtt tgaagaaatt 120
cctgaggaat tagatggttt ttcaaaatta aatccagtta ttccagataa agattataag 180
gatgtgggca aatttatatt tccttgcgct aaaaatgata tgatcgtact tacagatgat 240
gatattattt accctcccga ttatgtagaa aaaatgctca atttttataa ttcctttgca 300
atattcaatt gcattgttgg gattcatggc tgtatataca tagatgcatt tgatggagat 360
cagtctaaaa gaaaagtatt ttcatttact caagggctat tgcgaccgag agttgtaaat 420
caattaggta cagggactgt ttttcttaag gcagatcaat taccatcttt aaaatatatg 480
gatggttctc aacgattcgt cgatgttaga ttttctcgct atatgttaga gaatgaaatt 540
ggtatgatat gtgttcccag agaaaaaaac tggctaagag aggtctcatc aggttcaatg 600
gaaggacttt ggaacacatt tacaaaaaaa tggcctttag acatcataaa agaaacacaa 660
gcaatcgcag gatattcaaa acttaacctc gaattagtgt ataatgtgga agggtaa 717
<210> 35
<211> 1689
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 35
atgaataaat tagtgctagt cggacatcct ggctcaaagt atcagatagt tgaacatttt 60
ttgaaagaaa ttggcatgaa ctcaccaaat tattctacaa gtaataaaat ttccccagaa 120
tatatcaccg cttcattatg tcaattttat caaacaccag aagttaatga tgtagtagat 180
gagagagaat tctcagctgt tcaagtctca accatgtggg atagcatggt tcttgaacta 240
atgatgaaca atctaaataa caaactttgg gggtgggcag atccatctat aatatttttt 300
cttgattttt ggaaaaatat agataaaagc ataaaattca tcatgatata tgatcaccct 360
aaatataatt taatgcgttc agtaaataat gcccctctct ctttaaatat aaataatagt 420
gtagataact ggattgcata taataaaaga ttgcttgatt tttttttgga gaataaagaa 480
cgatgtgtgt tgattaattt tgaggcgttt caaagcaata agaaaaatat tataaagcca 540
ttgagtaata ttataaaaat agataatcta atgtctgcgc attacaaaaa ttcaatattg 600
tttgatgtgg ttgagaataa tgattataca aaatcaaatg aaattgccct gcttgaaaaa 660
tatacaactt tattttcttt aagtgcaaat gagactgaaa ttacatttaa tgatacaaag 720
gttagtgagt acttagtatc tgaattaata aaagaaagaa ccgaggttct gaagctttat 780
aatgagttac aagcctatgc aaacctacct tatatagaaa catcgaaaga taacgtttcg 840
gctgaggctg cattatggga ggtagtcgaa gagagaaatt ctatcttcaa tattgtatct 900
catttggtgc aagagtcaaa aaagaaggat gcagatattg aattgactaa atctatattt 960
aagaaaagac aatttttatt attgaacagg attaatgagc taaaaaaaga aaaggaagag 1020
gtaattaaac tttcaaaaat aaatcacaac gatgttgtga gacaagaaaa atatccagat 1080
gatattgaaa aaaaaataaa tgacatacag aaatatgaag aagagataag cgaaaaagaa 1140
tcaaaactca ctcaggcaat atcagaaaaa gaacagattt taaaacaatt gcataaatat 1200
gaagaagaga taagcgaaaa agaatcaaaa ctcactcagg caatatcaga aaaagaacag 1260
attttaaaac aattgcatat agtgcaagag cagttggaac actattttat agaaaatcag 1320
gaaattaaaa agaaacttcc acctgtgcta tatggagcag ctgagcagat aaaacaagag 1380
ttaggttatc gacttggtta tattatagtc tcgtattcta aatccctcaa ggggattatt 1440
accatgccat ttgcacttat ccgtgagtgt gtttttgaaa aaaaacgtaa gaagagttat 1500
ggcgttgatg tgccactcta tttatatgct gatgctgata aggctgaaag agttaagaaa 1560
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ggctgttaa 1689
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<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 36
atgaacgcag aatatataaa tttagttgaa cgtaaaaaga aattagggac aaatattggt 60
gctcttgatt ttttattatc aattcataag gagaaagttg atcttcaaca taaaaactcg 120
cctttaaaag gtaacgataa ccttattcac aaaagaataa acgaatacga caatgtactt 180
gaactatcta agaatgtatc agctcagaat tctggcaatg agttttctta tttattggga 240
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gaaagtattg taagattact gcagccattg atattggggt tatggggaga ctccggactt 1380
accaggaata aaggaacaga agctctacct gatggatata tatcacaatc tcgaagagaa 1440
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<212> DNA
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atgttcggaa cactaaaaat aactgtttca ggcgctggtt acgttgggct ttcaaatgga 60
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<212> DNA
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atggtactga tgatcgtcag cggacgttca ggttcaggta aatctgtcgc cctgcgtgcg 60
ctggaagata tgggttttta ctgcgtggat aaccttcccg tagtgttgtt acccgatctg 120
gctcgaactc tggccgatcg agagatttct gccgccgtca gcattgatgt tcgtaatatg 180
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caactactgt tcctggatgc cgaccgtaat accttaattc gtcgttacag tgacacgcgc 300
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Claims (13)
- 하기 유전자 변형 (1)을 갖고 헤파로산 생산능을 갖는 에스케리키아(Escherichia) 속의 세균을 배지에서 배양하여 배지에서 헤파로산을 생산하는 단계를 포함하는, 헤파로산의 제조 방법:
(1) kpsS 유전자의 발현을 증가시키는 유전자 변형. - 제1항에 있어서, 에스케리키아 속의 세균이 하기 유전자 변형 (2) 및 (3) 중 적어도 하나를 추가로 갖는, 헤파로산의 제조 방법:
(2) kfiA 유전자, kfiB 유전자, kfiC 유전자 및 kfiD 유전자로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 발현을 증가시키는 유전자 변형 및
(3) yhbJ 유전자의 기능 상실을 유발하는 유전자 변형. - 제1항 또는 제2항에 있어서, 유전자 변형 (1)이 kpsS 유전자의 발현 제어 영역의 변형 및 kpsS 유전자의 카피수 증가 중 적어도 하나인, 헤파로산의 제조 방법.
- 제2항 또는 제3항에 있어서, 유전자 변형 (2)가 kfiA 유전자, kfiB 유전자, kfiC 유전자 및 kfiD 유전자로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 발현 제어 영역의 변형 및 kfiA 유전자, kfiB 유전자, kfiC 유전자 및 kfiD 유전자로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 카피수 증가 중 적어도 하나인, 헤파로산의 제조 방법.
- 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 변형 (3)이 yhbJ 유전자의 결실인, 헤파로산의 제조 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 에스케리키아 속의 세균이 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)인, 헤파로산의 제조 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, kpsS 유전자가 서열번호 33에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA, 또는 서열번호 33에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 헤파로산 생산능을 갖는 에스케리키아 속의 세균에서 발현 수준이 증가될 때 상기 세균의 헤파로산 생산능을 증가시키는 특성을 갖는 DNA인, 헤파로산의 제조 방법.
- 제2항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
kfiA 유전자가 서열번호 34에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA, 또는 서열번호 34에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 헤파로산 생산능을 갖는 에스케리키아 속의 세균에서 발현 수준이 증가될 때 상기 세균의 헤파로산 생산능을 증가시키는 특성을 갖는 DNA이고,
kfiB 유전자가 서열번호 35에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA, 또는 서열번호 35에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 헤파로산 생산능을 갖는 에스케리키아 속의 세균에서 발현 수준이 증가될 때 상기 세균의 헤파로산 생산능을 증가시키는 특성을 갖는 DNA이고,
kfiC 유전자가 서열번호 36에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA, 또는 서열번호 36에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 헤파로산 생산능을 갖는 에스케리키아 속의 세균에서 발현 수준이 증가될 때 상기 세균의 헤파로산 생산능을 증가시키는 특성을 갖는 DNA이고,
kfiD 유전자가 서열번호 37에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA, 또는 서열번호 37에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 헤파로산 생산능을 갖는 에스케리키아 속의 세균에서 발현 수준이 증가될 때 상기 세균의 헤파로산 생산능을 증가시키는 특성을 갖는 DNA인, 헤파로산의 제조 방법. - 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, yhbJ 유전자가 서열번호 38에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA, 또는 서열번호 38에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 헤파로산 생산능을 갖는 에스케리키아 속의 세균에서 발현 수준이 감소될 때 상기 세균의 헤파로산 생산능을 증가시키는 특성을 갖는 DNA인, 헤파로산의 제조 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 에스케리키아 속의 세균이 하기 유전자 변형 (4)를 갖지 않는, 헤파로산의 제조 방법:
(4) kpsC 유전자의 발현을 증가시키는 유전자 변형. - 헤파로산 생산능을 갖고 하기 유전자 변형 (1)을 갖는 에스케리키아 속의 세균:
(1) kpsS 유전자의 발현을 증가시키는 유전자 변형. - 제11항에 있어서, 하기 유전자 변형 (2) 및 (3) 중 적어도 하나를 추가로 갖는 에스케리키아 속의 세균:
(2) kfiA 유전자, kfiB 유전자, kfiC 유전자 및 kfiD 유전자로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 발현을 증가시키는 유전자 변형 및
(3) yhbJ 유전자의 기능 상실을 유발하는 유전자 변형. - 제11항 또는 제12항에 있어서, 하기 유전자 변형 (4)를 갖지 않는 에스케리키아 속의 세균:
(4) kpsC 유전자의 발현을 증가시키는 유전자 변형.
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