JP2024052596A - プリン系物質の製造法 - Google Patents

Abstract

【課題】イノシン等のプリン系物質の製造法を提供する。【解決手段】下記（A）～（C）の改変から選択される１つまたはそれ以上の改変を有するように改変されたプリン系物質生産能を有する腸内細菌科に属する細菌を培地で培養し、該培地および／または該細菌の菌体よりプリン系物質を採取することにより、プリン系物質を製造する：（A）PAJ_3461タンパク質の活性が低下する改変；（B）PAJ_3462タンパク質の活性が低下する改変；（C）PAJ_3463タンパク質の活性が低下する改変。【選択図】なし

Description

本発明は、細菌を用いた発酵法によるイノシン等のプリン系物質の製造法に関する。プリン系物質は、調味料原料等として産業上有用である。

プリン系物質は、例えば、プリン系物質生産能を有する細菌等の微生物を用いた発酵法により工業生産されている。そのような微生物としては、例えば、自然界から分離した菌株やそれらの変異株が用いられている。また、組換えＤＮＡ技術により微生物のプリン系物質生産能を向上させることができる。

PAJ_3461遺伝子、PAJ_3462遺伝子、およびPAJ_3463遺伝子にコードされるPAJ_3461タンパク質、PAJ_3462タンパク質、およびPAJ_3463タンパク質は、それぞれ、グルコン酸－２－デヒドロゲナーゼ（gluconate 2-dehydrogenase）を構成するサブユニットとして知ら
れている。

本発明は、細菌のプリン系物質生産能を向上させる新規な技術を開発し、効率的なプリン系物質の製造法を提供することを課題とする。

本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、下記（A）～（C）の改変から選択される１つまたはそれ以上の改変を有するように腸内細菌科（Enterobacteriaceae）に属する細菌を改変することにより同細菌のプリン系物質生産能を向上させることができることを見出し、本発明を完成させた：
（A）PAJ_3461タンパク質の活性が低下する改変；
（B）PAJ_3462タンパク質の活性が低下する改変；
（C）PAJ_3463タンパク質の活性が低下する改変。

すなわち、本発明は以下の通り例示できる。
［１］
プリン系物質の製造方法であって、
プリン系物質生産能を有する腸内細菌科（Enterobacteriaceae）に属する細菌を培地で培養し、該培地中および／または該細菌の菌体内にプリン系物質を蓄積すること、および
前記培地および／または前記菌体より前記プリン系物質を採取すること、
を含み、
前記細菌が、下記（A）～（C）の改変から選択される１つまたはそれ以上の改変を有する、方法：
（A）PAJ_3461タンパク質の活性が低下する改変；
（B）PAJ_3462タンパク質の活性が低下する改変；
（C）PAJ_3463タンパク質の活性が低下する改変。
［２］
前記プリン系物質が、プリンヌクレオシドおよびプリンヌクレオチドからなる群より選択される、前記（具体的には、［１］に記載の）方法。
［３］
前記プリン系物質が、イノシン、キサントシン、グアノシン、およびアデノシンからなる群より選択される、前記（具体的には、［１］または［２］に記載の）方法。
［４］
前記プリン系物質が、イノシン酸、キサンチル酸、グアニル酸、およびアデニル酸からなる群より選択される、前記（具体的には、［１］～［３］のいずれかに記載の）方法。［５］
プリンヌクレオチドの製造方法であって、
プリンヌクレオシド生産能を有する腸内細菌科（Enterobacteriaceae）に属する細菌を培地で培養し、該培地中および／または該細菌の菌体内にプリンヌクレオシドを蓄積すること、
前記プリンヌクレオシドをリン酸化しプリンヌクレオチドを生成すること、および
前記プリンヌクレオチドを採取すること、
を含み、
前記細菌が、下記（A）～（C）の改変から選択される１つまたはそれ以上の改変を有する、方法：
（A）PAJ_3461タンパク質の活性が低下する改変；
（B）PAJ_3462タンパク質の活性が低下する改変；
（C）PAJ_3463タンパク質の活性が低下する改変。
［６］
前記プリンヌクレオシドが、イノシン、キサントシン、グアノシン、およびアデノシンからなる群より選択される、前記（具体的には、［５］に記載の）方法。
［７］
前記プリンヌクレオチドが、イノシン酸、キサンチル酸、グアニル酸、およびアデニル酸からなる群より選択される、前記（具体的には、［５］または［６］に記載の）方法。［８］
前記細菌が、前記（A）～（C）の改変を有する、前記（具体的には、［１］～［７］のいずれかに記載の）方法。
［９］
前記（具体的には、［１］～［８］のいずれかに記載の）方法であって、
前記PAJ_3461タンパク質の活性が、PAJ_3461遺伝子の発現を低下させることにより、または該遺伝子を破壊することにより、低下し；
前記PAJ_3462タンパク質の活性が、PAJ_3462遺伝子の発現を低下させることにより、または該遺伝子を破壊することにより、低下し；且つ／又は
前記PAJ_3463タンパク質の活性が、PAJ_3463遺伝子の発現を低下させることにより、または該遺伝子を破壊することにより、低下した、方法。
［１０］
前記（具体的には、［７］に記載の）方法であって、
前記PAJ_3461遺伝子の発現が、PAJ_3461遺伝子の発現調節配列の改変により、低下し；
前記PAJ_3462遺伝子の発現が、PAJ_3462遺伝子の発現調節配列の改変により、低下し；且つ／又は
前記PAJ_3463遺伝子の発現が、PAJ_3463遺伝子の発現調節配列の改変により、低下した、方法。
［１１］
前記（具体的には、［１］～［１０］のいずれかに記載の）方法であって、
前記PAJ_3461タンパク質の活性が、PAJ_3461遺伝子の欠失により、低下し；
前記PAJ_3462タンパク質の活性が、PAJ_3462遺伝子の欠失により、低下し；且つ／又は
前記PAJ_3463タンパク質の活性が、PAJ_3463遺伝子の欠失により、低下した、方法。
［１２］
前記（具体的には、［１］～［１１］のいずれかに記載の）方法であって、
前記PAJ_3461タンパク質が、下記（１ａ）、（１ｂ）、または（１ｃ）に記載のタンパク質であり：
（１ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（１ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、グルコン酸－２－デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質；
（１ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、グルコン酸－２－デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質；
前記PAJ_3462タンパク質が、下記（２ａ）、（２ｂ）、または（２ｃ）に記載のタンパク質であり：
（２ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（２ｂ）配列番号４に示すアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、グルコン酸－２－デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質；
（２ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、グルコン酸－２－デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質；且つ／又は
前記PAJ_3463タンパク質が、下記（３ａ）、（３ｂ）、または（３ｃ）に記載のタンパク質である、方法：
（３ａ）配列番号６に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（３ｂ）配列番号６に示すアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、グルコン酸－２－デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質；
（３ｃ）配列番号６に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、グルコン酸－２－デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質；
［１３］
前記細菌が、パントエア（Pantoea）属細菌である、前記（具体的には、［１］～［１
２］のいずれかに記載の）方法。
［１４］
前記細菌が、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）である、前記（具体的には、［１］～［１３］のいずれかに記載の）方法。
［１５］
前記リン酸化が、前記プリンヌクレオシドおよびリン酸供与体にプリンヌクレオチドを生成する能力を有する微生物またはリン酸化酵素を作用させることにより実施される、前記（具体的には、［５］～［１４］のいずれかに記載の）方法。

本発明によれば、細菌のプリン系物質生産能を向上させることができ、プリン系物質を効率よく製造することができる。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明の方法の一態様は、プリン系物質生産能を有する腸内細菌科（Enterobacteriaceae）に属する細菌を培地で培養し、該培地中および／または該細菌の菌体内にプリン系物質を蓄積すること、および前記培地および／または前記菌体より前記プリン系物質を採取すること、を含むプリン系物質の製造方法であって、前記細菌が特定の性質を有するように改変されている、方法である。同態様を、「本発明のプリン系物質の製造方法」ともいう。同方法に用いられる細菌を、「本発明の細菌」ともいう。

本発明の細菌がプリン系物質生産能としてプリンヌクレオシド生産能を有する場合、本発明の細菌によりプリンヌクレオシドを製造し、さらに該プリンヌクレオシドからプリンヌクレオチドを製造することができる。すなわち、本発明の方法の別態様は、プリンヌクレオシド生産能を有する腸内細菌科（Enterobacteriaceae）に属する細菌を培地で培養し
、該培地中および／または該細菌の菌体内にプリンヌクレオシドを蓄積すること、前記プリンヌクレオシドをリン酸化しプリンヌクレオチドを生成すること、および前記プリンヌクレオチドを採取すること、を含むプリンヌクレオチドの製造方法であって、前記細菌が特定の性質を有するように改変されている、方法である。同態様を、「本発明のプリンヌクレオチドの製造方法」ともいう。

＜１＞本発明の細菌
本発明の細菌は、特定の性質を有するように改変された、プリン系物質生産能を有する腸内細菌科に属する細菌である。

＜１－１＞プリン系物質生産能を有する細菌
本発明において、「プリン系物質生産能を有する細菌」とは、培地で培養したときに、目的とするプリン系物質を生成し、回収できる程度に培地中および／または菌体内に蓄積する能力を有する細菌をいう。プリン系物質生産能を有する細菌は、非改変株よりも多い量の目的とするプリン系物質を培地中および／または菌体内に蓄積することができる細菌であってよい。「非改変株」とは、特定の性質を有するように改変されていない対照株をいう。すなわち、非改変株としては、野生株や親株が挙げられる。また、プリン系物質生産能を有する細菌は、好ましくは０．５ｇ／Ｌ以上、より好ましくは１．０ｇ／Ｌ以上の量の目的とするプリン系物質を培地に蓄積することができる細菌であってもよい。

プリン系物質としては、プリンヌクレオシドおよびプリンヌクレオチドが挙げられる。プリンヌクレオシドとしては、イノシン、グアノシン、キサントシン、およびアデノシンが挙げられる。プリンヌクレオチドとしては、プリンヌクレオシドの５’－リン酸エステルが挙げられる。プリンヌクレオシドの５’－リン酸エステルとしては、イノシン酸（イノシン－５’－リン酸エステル；ＩＭＰ）、グアニル酸（グアノシン－５’－リン酸エステル；ＧＭＰ）、キサンチル酸（キサントシン－５’－リン酸エステル；ＸＭＰ）、およびアデニル酸（アデノシン－５’－リン酸エステル；ＡＭＰ）が挙げられる。本発明の細菌は、１種のプリン系物質の生産能を有していてもよく、２種またはそれ以上のプリン系物質の生産能を有していてもよい。本発明の細菌は、例えば、１種またはそれ以上のプリンヌクレオシドの生産能を有していてもよい。本発明の細菌は、例えば、１種またはそれ以上のプリンヌクレオチドの生産能を有していてもよい。

プリン系物質が塩を形成し得る物質（例えば、プリンヌクレオチド）である場合、本発明において、「プリン系物質」という用語は、特記しない限り、フリー体のプリン系物質、その塩、またはそれらの混合物を意味する。塩については後述する。

腸内細菌科に属する細菌としては、エシェリヒア（Escherichia）属、エンテロバクタ
ー（Enterobacter）属、パントエア（Pantoea）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、セ
ラチア（Serratia）属、エルビニア（Erwinia）属、フォトラブダス（Photorhabdus）属
、プロビデンシア（Providencia）属、サルモネラ（Salmonella）属、モルガネラ（Morganella）等の属に属する細菌が挙げられる。具体的には、NCBI（National Center for Biotechnology Information）のデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347）で用いられている分類法により腸内細菌科に分類されている細菌を用いることができる。

エシェリヒア属細菌としては、特に制限されないが、微生物学の専門家に知られている分類によりエシェリヒア属に分類されている細菌が挙げられる。エシェリヒア属細菌としては、例えば、Neidhardtらの著書（Backmann, B. J. 1996. Derivations and Genotypes
of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, p. 2460-2488. Table 1. In F. D. Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Bi
ology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.
）に記載されたものが挙げられる。エシェリヒア属細菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）が挙げられる。エシェリヒア・コリとして、具体的には、例えば、W3110株（ATCC 27325）やMG1655株（ATCC 47076）等のエシェリヒア・コリK-12株
；エシェリヒア・コリK5株（ATCC 23506）；BL21(DE3)株等のエシェリヒア・コリB株；およびそれらの派生株が挙げられる。

エンテロバクター属細菌としては、特に制限されないが、微生物学の専門家に知られている分類によりエンテロバクター属に分類されている細菌が挙げられる。エンテロバクター属細菌としては、例えば、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）やエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）が挙げられる。エンテロバクター・アグロメランスとして、具体的には、例えば、エンテロバクター・アグロメランスATCC12287株が挙げられる。エンテロバクター・アエロゲネスとして、具体的
には、例えば、エンテロバクター・アエロゲネスATCC13048株、NBRC12010株（Biotechonol Bioeng. 2007 Mar 27; 98(2) 340-348）、AJ110637株（FERM BP-10955）が挙げられる
。また、エンテロバクター属細菌としては、例えば、欧州特許出願公開EP0952221号明細
書に記載されたものが挙げられる。なお、Enterobacter agglomeransには、Pantoea agglomeransと分類されているものも存在する。

パントエア属細菌としては、特に制限されないが、微生物学の専門家に知られている分類によりパントエア属に分類されている細菌が挙げられる。パントエア属細菌としては、例えば、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）、パントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）、パントエア・シトレア（Pantoea citrea）が挙げられる。パントエア・アナナティスとして、具体的には、例えば、パントエア・アナナティスLMG20103株、AJ13355株（FERM BP-6614
）、AJ13356株（FERM BP-6615）、AJ13601株（FERM BP-7207）、SC17株（FERM BP-11091
）、SC17(0)株（VKPM B-9246）、及びSC17sucA株（FERM BP-8646）が挙げられる。なお、エンテロバクター属細菌やエルビニア属細菌には、パントエア属に再分類されたものもある（Int. J. Syst. Bacteriol., 39, 337-345 (1989); Int. J. Syst. Bacteriol., 43, 162-173 (1993)）。例えば、エンテロバクター・アグロメランスのある種のものは、最近、16S rRNAの塩基配列分析等に基づき、パントエア・アグロメランス、パントエア・アナナティス、パントエア・ステワルティイ等に再分類された（Int. J. Syst. Bacteriol., 39, 337-345 (1989)）。本発明において、パントエア属細菌には、このようにパントエア属に再分類された細菌も含まれる。

エルビニア属細菌としては、エルビニア・アミロボーラ（Erwinia amylovora）、エル
ビニア・カロトボーラ（Erwinia carotovora）が挙げられる。クレブシエラ属細菌としては、クレブシエラ・プランティコーラ（Klebsiella planticola）が挙げられる。

なお、腸内細菌科に属する細菌は、近年、包括的な比較ゲノム解析により複数の科に再分類されている（Adelou M. et al., Genome-based phylogeny and taxonomy of the ‘Enterobacteriales’: proposal for Enterobacterales ord. nov. divided into the families Enterobacteriaceae, Erwiniaceae fam. nov., Pectobacteriaceae fam. nov., Yersiniaceae fam. nov., Hafniaceae fam. nov., Morganellaceae fam. nov., and Budviciaceae fam. nov., Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2016, 66:5575-5599）。しかし、本明細書においては、従来腸内細菌科に分類されていた細菌は、腸内細菌科に属する細菌として取り扱うものとする。すなわち、Pantoea属細菌等の上記例示した細菌は、現在の
分類に拠らず、腸内細菌科に属する細菌として取り扱うものとする。

これらの菌株は、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所1230
1 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）より分譲を受けることができる。すなわち各菌株に対応する
登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることができる（http://www.atcc.org/参照）。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。また、これらの菌株は、例えば、各菌株が寄託された寄託機関から入手することができる。

本発明の細菌は、本来的にプリン系物質生産能を有するものであってもよく、プリン系物質生産能を有するように改変されたものであってもよい。プリン系物質生産能を有する細菌は、例えば、上記のような細菌にプリン系物質生産能を付与することにより、または、上記のような細菌のプリン系物質生産能を増強することにより、取得できる。

プリン系物質生産能の付与または増強は、従来、バチルス属細菌やエシェリヒア属細菌等のプリン系物質生産菌の育種に採用されてきた方法により行うことができる。

例えば、プリン系物質生産能は、アデニン要求性等の栄養要求性を付与することにより、またはさらにプリンアナログやスルファグアニジン等の薬剤に対する耐性を付与することにより、付与または増強することができる（特公昭38-23099、特公昭54-17033、特公昭55-45199、特公昭57-14160、特公昭57-41915、特開昭59-42895、US2004-0166575A参照）
。プリン系物質生産能を有する栄養要求性株や薬剤耐性株等の変異株は、親株または野生株を突然変異処理に供し、適当な選択培地を用いて所望の表現型を有する変異株を選択することにより取得できる。突然変異処理としては、例えば、Ｘ線の照射、紫外線の照射、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、メチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤による処理が挙げられる。

また、プリン系物質生産能は、プリン系物質の生合成に関与する酵素の活性を増強することにより、付与または増強することができる。１種の酵素の活性を増強してもよく、２種またはそれ以上の酵素の活性を増強してもよい。酵素活性の増強は、例えば、同酵素をコードする遺伝子の発現が増強されるように細菌を改変することにより行うことができる。遺伝子の発現を増強する手法は、WO00/18935やEP1010755A等に記載されている。酵素活性を増強する手法については後述する。

プリンヌクレオチドは、ホスホリボシルピロリン酸（phosphoribosylpyrophosphate；
ＰＲＰＰ）を中間体として生合成される。プリンヌクレオシドは、プリンヌクレオチドが脱リン酸化されることにより生合成される。これらプリン系物質の生合成に関与する酵素としては、例えば、ＰＲＰＰシンセターゼ（PRPP synthetase）（prs）やプリンオペロンにコードされるタンパク質が挙げられる。なお、カッコ内は、その酵素をコードする遺伝子の略記号である（以下の記載においても同様）。ただし、遺伝子名（遺伝子の略記号）は一例であり、生物種によっては、遺伝子名が異なる場合や、該当する遺伝子を有していない場合があり得る。

プリンオペロンとしては、例えば、バチルス・サブチリスのpurEKBCSQLFMNHDオペロン
（Bacillus subtilis and Its Closest Relatives, Editor in Chief: A.L. Sonenshein,
ASM Press, Washington D.C., 2002）やエシェリヒア・コリのpurレギュロン（Escherichia and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C. Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996）が挙げられる。例えば、プリンオペロンの発現をまとめて増強
してもよく、プリンオペロンに含まれる遺伝子から選択される１またはそれ以上の遺伝子の発現を増強してもよい。

これらの中では、例えば、ＰＲＰＰシンセターゼ（PRPP synthetase）（prs）およびＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼ（PRPP amidotransferase）（purF）から選択される１
またはそれ以上の酵素の活性を増強するのが好ましい。

なお、例えば、プリン系物質の生合成に関与する酵素がフィードバック阻害や発現抑制等の負のレギュレーションを受けている場合は、そのレギュレーションを低減又は解除することにより、酵素活性を増強し、プリン系物質生産能を向上させることができる（WO99/003988）。

プリンオペロンの発現は、purR遺伝子にコードされるプリンリプレッサーにより抑制される。よって、プリンオペロンの発現は、例えば、プリンリプレッサーの活性を低下させることにより、増強することができる（米国特許第6,284,495号）。プリンリプレッサー
の活性は、例えば、プリンリプレッサーをコードするpurR遺伝子を破壊することにより、低下させることができる（米国特許第6,284,495号）。また、プリンオペロンの発現は、
プロモーター下流に位置するterminator-antiterminator配列（アテニュエーター配列と
もいう）に制御されている（Ebbole, D. J. and Zalkin, H., J. Biol. Chem., 1987, 262, 8274－8287、Ebbole, D. J. and Zalkin, H., J. Biol. Chem., 1988, 263, 10894－10902、Ebbole, D. J. and Zalkin, H., J. Bacteriol., 1989, 171, 2136－2141）。よって、プリンオペロンの発現は、例えば、アテニュエーター配列を欠損させることにより、増強することができる。アテニュエーター配列の欠損は、後述する遺伝子の破壊と同様の手法により行うことができる。

ＰＲＰＰシンセターゼは、ＡＤＰによるフィードバック阻害を受ける。よって、例えば、ＡＤＰによるフィードバック阻害が低減又は解除された脱感作型ＰＲＰＰシンセターゼをコードする変異型ＰＲＰＰシンセターゼ遺伝子を細菌に保持させることにより、ＰＲＰＰシンセターゼ活性を増強し、プリン系物質生産能を向上させることができる（WO99/003988）。脱感作型ＰＲＰＰシンセターゼとしては、野生型ＰＲＰＰシンセターゼの128位のAsp(D)がAla(A)に置換される変異を有するものが挙げられる（S. G. Bower et al., J. Biol. Chem., 264, 10287 (1989)）。

ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼは、ＡＭＰおよびＧＭＰによるフィードバック阻害を受ける。よって、例えば、ＡＭＰおよび／またはＧＭＰによるフィードバック阻害が低減又は解除された脱感作型ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼをコードする変異型ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼ遺伝子を細菌に保持させることにより、ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼ活性を増強し、プリン系物質生産能を向上させることができる（WO99/003988）。脱感作型ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼとしては、野生型ＰＲＰＰアミドト
ランスフェラーゼの326位のLys(K)がGln(Q)に置換される変異を有するものや、野生型Ｐ
ＲＰＰアミドトランスフェラーゼの326位のLys(K)がGln(Q)に置換され、且つ410位のPro(P)がTrp(W)に置換される変異を有するものが挙げられる（G. Zhou et al., J. Biol. Chem., 269, 6784 (1994)）。

また、プリン系物質生産能は、プリン系物質の生合成経路から分岐して他の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性を低下させることにより、付与または増強することができる（WO99/003988）。１種の酵素の活性を低下させてもよく、２種またはそれ以上の酵
素の活性を低下させてもよい。なお、ここでいう「プリン系物質の生合成経路から分岐して他の化合物を生成する反応を触媒する酵素」には、プリン系物質の分解に関与する酵素も含まれる。酵素活性を低下させる手法については後述する。

プリン系物質の生合成経路から分岐して他の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、例えば、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（purine nucleoside phosphorylase
）（deoD, pupG）、サクシニル－ＡＭＰシンターゼ（succinyl-AMP synthase）（purA）
、アデノシンデアミナーゼ（adenosine deaminase）（add）、イノシン－グアノシンキナーゼ（inosine-guanosine kinase）（gsk）、ＧＭＰレダクターゼ（GMP reductase）（guaC）、６－ホスホグルコン酸デヒドラーゼ（6-phosphogluconate dehydrase）（edd）、
ホスホグルコースイソメラーゼ（phophoglucose isomerase）（pgi）、アデニンデアミナーゼ（adenine deaminase）（yicP）、キサントシンホスホリラーゼ（xanthosine phosphorylase）（xapA）、ＩＭＰデヒドロゲナーゼ（IMP dehydrogenase）（guaB）、ＧＭＰシンターゼ（GMP synthase）（guaA）が挙げられる。サクシニル－ＡＭＰシンターゼ（succinyl-AMP synthase）は、アデニロコハク酸シンセターゼ（adenylosuccinate synthetase）等とも呼ばれる。ＧＭＰシンターゼ（GMP synthase）は、ＧＭＰシンセターゼ（GMP synthetase）等とも呼ばれる。活性を低下させる酵素は、目的のプリン系物質の種類等に応じて選択してよい。例えば、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（purine nucleoside phosphorylase）、アデノシンデアミナーゼ（adenosine deaminase）、サクシニル－ＡＭＰシンターゼ（succinyl-AMP synthase）、ＩＭＰデヒドロゲナーゼ（IMP dehydrogenase）、およびＧＭＰシンターゼ（GMP synthase）から選択される１種またはそれ以上、例えば全て、の酵素の活性を低下させてもよい。具体的には、例えば、プリン系物質がイノシンである場合に、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（purine nucleoside phosphorylase
）、アデノシンデアミナーゼ（adenosine deaminase）、サクシニル－ＡＭＰシンターゼ
（succinyl-AMP synthase）、ＩＭＰデヒドロゲナーゼ（IMP dehydrogenase）、およびＧＭＰシンターゼ（GMP synthase）から選択される１種またはそれ以上、例えば全て、の酵素の活性を低下させてもよい。

また、プリン系物質生産能は、フルクトース１，６－ビスフォスファターゼ（fructose
1,6-bisphosphatase）（fbp）の活性を低下させることにより、付与または増強することができる（WO2007/125782）。

また、プリン系物質生産能は、プリン系物質の取り込みに関与するタンパク質の活性を低下させることにより、付与または増強することができる（WO99/003988）。例えば、プ
リンヌクレオシドの取り込みに関与するタンパク質としては、ヌクレオシドパーミアーゼ（nucleoside permease）（nupG）が挙げられる（WO99/003988）。

また、プリン系物質生産能は、プリン系物質の排出に関与するタンパク質の活性を増強することにより、付与または増強することができる。例えば、プリンヌクレオシドの排出に関与するタンパク質としては、rhtA（ybiF）遺伝子（ロシア国特許第2239656号）、yijE遺伝子（ロシア国特許第2244003号）、ydeD遺伝子（ロシア国特許第2244004号）、yicM
遺伝子（ロシア国特許第2271391号）、ydhL遺伝子（特表2007-530011）、nepI遺伝子（FEMS Microbiology Letters, Volume 250, Issue 1, pages 39-47, September 2005）にコ
ードされるタンパク質が挙げられる。

また、プリン系物質生産能は、変異型yggB遺伝子を保持するように細菌を改変することにより、付与または増強することができる（特開2015-029474）。

また、イノシン酸生産能は、Ｌ－グルタミンのアナログに対する耐性とプロリンのアナログに対する耐性とを細菌に付与することにより、付与または増強することができる（特開2004-516833）。Ｌ－グルタミンのアナログとしては、アザセリンや６－ジアゾ－５－
オキソ－Ｌ－ノルロイシン（ＤＯＮ）が挙げられる。プロリンのアナログとしては、３，４－デヒドロプロリン、Ｌ－アゼチジン－２－カルボン酸、Ｌ－チアゾリジン－４－カルボン酸、（Ｓ）－２，２－ジメチル－４－オキサゾリドカルボン酸、（Ｓ）－５，５－ジメチル－４－チアゾリドカルボン酸、（４Ｓ，２ＲＳ）－２－エチル－４－チアゾリジン－カルボン酸、（２Ｓ，４Ｓ）－４－ヒドロキシ－２－ピロリン－カルボン酸、２－ピペ
リジンカルボン酸、及び２，５－ピロリジンジオンが挙げられる。

また、キサンチル酸生産能は、PRPP amidotransferase活性の増強（特開平8-168383）
、脂肪族アミノ酸に対する耐性の付与（特開平4-262790）、またはデヒドロプロリンに対する耐性の付与（韓国特許公開公報2003-56490）により、付与または増強することができる。

上記のようなプリン系物質生産能を付与または増強する手法は、単独で用いてもよく、任意の組み合わせで用いてもよい。

プリン系物質生産菌の育種に使用される遺伝子およびタンパク質は、それぞれ、例えば、上記例示した遺伝子およびタンパク質等の公知の遺伝子およびタンパク質の塩基配列およびアミノ酸配列を有していてよい。また、プリン系物質生産菌の育種に使用される遺伝子およびタンパク質は、それぞれ、上記例示した遺伝子およびタンパク質等の公知の遺伝子およびタンパク質の保存的バリアントであってもよい。具体的には、例えば、プリン系物質生産菌の育種に使用される遺伝子は、元の機能が維持されている限り、公知のタンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。プリン系物質生産菌の育種に使用される遺伝子は、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変されていてもよい。遺伝子およびタンパク質の保存的バリアントについては、後述する標的遺伝子および標的タンパク質の保存的バリアントに関する記載を準用できる。

＜１－２＞特定の性質
本発明の細菌は、特定の性質を有するように改変されている。本発明の細菌は、プリン系物質生産能を有する細菌を、特定の性質を有するように改変することにより取得できる。また、本発明の細菌は、特定の性質を有するように細菌を改変した後に、プリン系物質生産能を付与または増強することによっても取得できる。なお、本発明の細菌は、特定の性質を有するように改変されたことにより、プリン系物質生産能を獲得したものであってもよい。本発明の細菌は、特定の性質を有するように改変されていることに加えて、例えば、上記のようなプリン系物質生産菌が有する性質を適宜有していてよい。本発明の細菌を構築するための改変は、任意の順番で行うことができる。

特定の性質を有するように細菌を改変することによって、細菌のプリン系物質生産能を向上させることができ、すなわち同細菌によるプリン系物質生産を増大させることができる。プリン系物質生産の増大としては、プリン系物質の蓄積量の増大やプリン系物質の収率の増大が挙げられる。

特定の性質としては、以下の（A）～（C）の改変が挙げられる：
（A）PAJ_3461タンパク質の活性が低下する改変；
（B）PAJ_3462タンパク質の活性が低下する改変；
（C）PAJ_3463タンパク質の活性が低下する改変。

本発明の細菌は、例えば、上記（A）～（C）の改変から選択される１つまたはそれ以上、例えば、１つ、２つ、または３つ全て、の改変を有していてよい。

「PAJ_3461タンパク質」、「PAJ_3462タンパク質」、および「PAJ_3463タンパク質」とは、それぞれ、PAJ_3461遺伝子、PAJ_3462遺伝子、およびPAJ_3463遺伝子にコードされるタンパク質を意味する。PAJ_3461遺伝子、PAJ_3462遺伝子、およびPAJ_3463遺伝子を総称して、「GlcNDH遺伝子」ともいう。PAJ_3461タンパク質、PAJ_3462タンパク質、およびPA
J_3463タンパク質は、いずれも、グルコン酸－２－デヒドロゲナーゼ（gluconate 2-dehydrogenase）であってよい。すなわち、「PAJ_3461タンパク質の活性の低下」、「PAJ_3462タンパク質の活性の低下」、および「PAJ_3463タンパク質の活性の低下」とは、いずれ
も、gluconate 2-dehydrogenase活性の低下を意味してよい。PAJ_3461タンパク質、PAJ_3462タンパク質、およびPAJ_3463タンパク質は、具体的には、それぞれ、gluconate 2-dehydrogenaseを構成するサブユニットであってよい。PAJ_3461タンパク質は、より具体的には、gluconate 2-dehydrogenaseを構成する機能未知のサブユニットであってよい。PAJ_3462タンパク質は、より具体的には、gluconate 2-dehydrogenaseを構成するdehydrogenaseサブユニットであってよい。PAJ_3463タンパク質は、より具体的には、gluconate 2-dehydrogenaseを構成するcytochrome cサブユニットであってよい。PAJ_3461タンパク質、PAJ_3462タンパク質、およびPAJ_3463タンパク質は、例えば、それらタンパク質で構成される複合体を形成してgluconate 2-dehydrogenaseとして機能してよい。「gluconate 2-dehydrogenase」とは、グルコン酸を酸化して２－デヒドログルコン酸を生成する反応および／またはその逆反応を触媒する活性を有するタンパク質を意味してよい（EC 1.1.99.3等
）。同活性を、「gluconate 2-dehydrogenase活性」ともいう。gluconate 2-dehydrogenase活性は、具体的には、電子受容体の存在下でグルコン酸を酸化して２－デヒドログルコン酸を生成する反応および／またはその逆反応を触媒する活性であってよい。電子受容体としては、酸化型キノン、NAD⁺、NADP⁺、FAD⁺が挙げられる。逆反応には、電子供与体が
用いられてよい。電子供与体としては、還元型キノン、NADH、NADPH、FADH₂が挙げられる。gluconate 2-dehydrogenase活性は、特に、以下の化学反応をいずれか一方向または両
方向に触媒する活性であってよい。
D-gluconate+electron acceptor = 2-dehydro-D-gluconate + reduced electron acceptor

なお、「タンパク質がgluconate 2-dehydrogenase活性を有する」とは、当該タンパク
質が単独でgluconate 2-dehydrogenase活性を有する場合に限られず、当該タンパク質が
他のサブユニットとの組み合わせでgluconate 2-dehydrogenase活性を有する場合も包含
する。「タンパク質が単独でgluconate 2-dehydrogenase活性を有する」とは、当該タン
パク質が単独でgluconate 2-dehydrogenaseとして機能することを意味してよい。「タン
パク質が他のサブユニットとの組み合わせでgluconate 2-dehydrogenase活性を有する」
とは、当該タンパク質が他のサブユニットとの組み合わせでgluconate 2-dehydrogenase
として機能する（例えば、当該タンパク質が他のサブユニットと複合体を形成してgluconate 2-dehydrogenaseとして機能する）ことを意味してよい。

PAJ_3461タンパク質についての他のサブユニットとしては、PAJ_3462タンパク質やPAJ_3463タンパク質が挙げられる。すなわち、PAJ_3461タンパク質についての「タンパク質がgluconate 2-dehydrogenase活性を有する」とは、当該タンパク質が単独でgluconate 2-dehydrogenase活性を有する場合に限られず、当該タンパク質がPAJ_3462タンパク質および／またはPAJ_3463タンパク質との組み合わせ（特にPAJ_3462タンパク質およびPAJ_3463タンパク質との組み合わせ）でgluconate 2-dehydrogenase活性を有する場合も包含する。

PAJ_3462タンパク質についての他のサブユニットとしては、PAJ_3461タンパク質やPAJ_3463タンパク質が挙げられる。すなわち、PAJ_3462タンパク質についての「タンパク質がgluconate 2-dehydrogenase活性を有する」とは、当該タンパク質が単独でgluconate 2-dehydrogenase活性を有する場合に限られず、当該タンパク質がPAJ_3461タンパク質および／またはPAJ_3463タンパク質との組み合わせ（特にPAJ_3461タンパク質およびPAJ_3463タンパク質との組み合わせ）でgluconate 2-dehydrogenase活性を有する場合も包含する。

PAJ_3463タンパク質についての他のサブユニットとしては、PAJ_3461タンパク質やPAJ_3462タンパク質が挙げられる。すなわち、PAJ_3463タンパク質についての「タンパク質が
gluconate 2-dehydrogenase活性を有する」とは、当該タンパク質が単独でgluconate 2-dehydrogenase活性を有する場合に限られず、当該タンパク質がPAJ_3461タンパク質および／またはPAJ_3462タンパク質との組み合わせ（特にPAJ_3461タンパク質およびPAJ_3462タンパク質との組み合わせ）でgluconate 2-dehydrogenase活性を有する場合も包含する。

改変される細菌が有するPAJ_3461遺伝子、PAJ_3462遺伝子、およびPAJ_3463遺伝子の塩基配列およびそれらにコードされるPAJ_3461タンパク質、PAJ_3462タンパク質、およびPAJ_3463タンパク質のアミノ酸配列は、例えば、NCBI等の公開データベースから取得できる。Pantoea ananatis AJ13355のPAJ_3461遺伝子の塩基配列は、GenBank accession AP012032.2で登録されたPantoea ananatis AJ13355のゲノム配列中、4149024～4149749位の塩基配列に相当する。Pantoea ananatis AJ13355のPAJ_3462遺伝子の塩基配列は、GenBank accession AP012032.2で登録されたPantoea ananatis AJ13355のゲノム配列中、4149752～4151536位の塩基配列に相当する。Pantoea ananatis AJ13355のPAJ_3463遺伝子の塩基配列は、GenBank accession AP012032.2で登録されたPantoea ananatis AJ13355のゲノム配列中、4151542～4152858位の塩基配列に相当する。Pantoea ananatis AJ13355のPAJ_3461遺伝子の塩基配列および同遺伝子がコードするPAJ_3461タンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１および２に示す。Pantoea ananatis AJ13355のPAJ_3462遺伝子の塩基配列および同遺伝子がコードするPAJ_3462タンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号３および４に示す。Pantoea ananatis AJ13355のPAJ_3463遺伝子の塩基配列および同遺伝子がコードするPAJ_3463タンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号５および６に示す。

上記（A）～（C）の改変について、各タンパク質の活性は非改変株と比較して低下する。タンパク質の活性を低下させる手法については後述する。タンパク質の活性は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子の発現を低下させることにより、または同遺伝子を破壊することにより低下させることができる。このようなタンパク質の活性を低下させる手法は、単独で、あるいは適宜組み合わせて、用いることができる。

PAJ_3461タンパク質、PAJ_3462タンパク質、およびPAJ_3463タンパク質を総称して、「標的タンパク質」ともいう。PAJ_3461遺伝子、PAJ_3462遺伝子、およびPAJ_3463遺伝子を総称して、「標的遺伝子」ともいう。

標的遺伝子は、例えば、上記例示した標的遺伝子の塩基配列（例えば、配列番号１、３、または５に示す塩基配列）を有する遺伝子であってよい。また、標的タンパク質は、例えば、上記例示した標的タンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号２、４、または６に示すアミノ酸配列）を有するタンパク質であってよい。なお、「（アミノ酸または塩基）配列を有する」という表現は、特記しない限り、当該「（アミノ酸または塩基）配列を含む」ことを意味し、当該「（アミノ酸または塩基）配列からなる」場合も包含する。

標的遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記例示した標的遺伝子（例えば、配列番号１、３、または５に示す塩基配列を有する遺伝子）のバリアントであってもよい。同様に、標的タンパク質は、元の機能が維持されている限り、上記例示した標的タンパク質（例えば、配列番号２、４、または６に示すアミノ酸配列を有するタンパク質）のバリアントであってもよい。なお、そのような元の機能が維持されたバリアントを「保存的バリアント」という場合がある。「PAJ_3461遺伝子」、「PAJ_3462遺伝子」、および「PAJ_3463遺伝子」という用語は、それぞれ、上記例示したPAJ_3461遺伝子、PAJ_3462遺伝子、およびPAJ_3463遺伝子に加えて、それらの保存的バリアントを包含するものとする。同様に、「PAJ_3461タンパク質」、「PAJ_3462タンパク質」、および「PAJ_3463タンパク質」という用語は、それぞれ、上記例示したPAJ_3461タンパク質、PAJ_3462タンパク質、およびPAJ_3463タンパク質に加えて、それらの保存的バリアントを包含するものとする。保存
的バリアントとしては、例えば、上記例示した標的遺伝子や標的タンパク質のホモログや人為的な改変体が挙げられる。ただし、活性を低下させる標的タンパク質は、改変される細菌が有する標的タンパク質であり、言い換えると、改変される細菌が有する標的遺伝子にコードされる標的タンパク質である。改変される細菌は、標的遺伝子を、染色体上に有していてもよく、染色体外の構造物（例えばプラスミド）上に有していてもよい。「染色体」は、「ゲノム」と代替可能に用いられてよい。

「元の機能が維持されている」とは、遺伝子またはタンパク質のバリアントが、元の遺伝子またはタンパク質の機能（例えば活性や性質）に対応する機能（例えば活性や性質）を有することをいう。遺伝子についての「元の機能が維持されている」とは、遺伝子のバリアントが、元の機能が維持されたタンパク質をコードすることをいう。すなわち、各標的遺伝子についての「元の機能が維持されている」とは、遺伝子のバリアントが、各標的タンパク質の活性（これは、PAJ_3461タンパク質、PAJ_3462タンパク質、およびPAJ_3463タンパク質についてgluconate 2-dehydrogenase活性であってよい）を有するタンパク質
をコードすることを意味してよい。また、各標的タンパク質についての「元の機能が維持されている」とは、タンパク質のバリアントが、各標的タンパク質の活性（これは、PAJ_3461タンパク質、PAJ_3462タンパク質、およびPAJ_3463タンパク質についてgluconate 2-dehydrogenase活性であってよい）を有することを意味してよい。

gluconate 2-dehydrogenase活性は、例えば、電子受容体の存在下で酵素を対応する基
質（例えばグルコン酸）とインキュベートし、酵素および基質依存的な対応する産物（例えば２－デヒドログルコン酸）の生成を測定することにより、測定することができる。また、逆反応の場合、gluconate 2-dehydrogenase活性は、例えば、電子供与体の存在下で
酵素を対応する基質（例えば２－デヒドログルコン酸）とインキュベートし、酵素および基質依存的な対応する産物（例えばグルコン酸）の生成を測定することにより、測定することができる。

以下、保存的バリアントについて例示する。

標的遺伝子のホモログまたは標的タンパク質のホモログは、例えば、上記例示した標的遺伝子の塩基配列または上記例示した標的タンパク質のアミノ酸配列を問い合わせ配列として用いたBLAST検索やFASTA検索によって公開データベースから容易に取得することができる。また、標的遺伝子のホモログは、例えば、各種生物の染色体を鋳型にして、これら公知の標的遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたPCRにより取得することができる。

標的遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列（例えば、配列番号２、４、または６に示すアミノ酸配列）において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。例えば、コードされるタンパク質は、そのＮ末端および／またはＣ末端が、延長または短縮されていてもよい。なお上記「１又は数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には、例えば、１～５０個、１～４０個、１～３０個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個、特に好ましくは１～３個を意味する。

上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、および／または付加は、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸で
ある場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸
性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln
、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加には、遺伝子が由来する生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。

また、標的遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列全体に対して、例えば、50%以上、65%以上、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、
さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。

また、標的遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記塩基配列（例えば、配列番号１、３、または５に示す塩基配列）から調製され得るプローブ、例えば上記塩基配列の全体または一部に対する相補配列、とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子（例えばDNA）であってもよい。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的
なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、同一性が高いDNA同士、例えば、50%以上、65%以上、80%以上、好ましくは90%以
上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の同一
性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより同一性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1
×SSC、0.1% SDS、好ましくは60℃、0.1×SSC、0.1% SDS、より好ましくは68℃、0.1×SSC、0.1% SDSに相当する塩濃度および温度で、１回、好ましくは２～３回洗浄する条件を
挙げることができる。

上述の通り、上記ハイブリダイゼーションに用いるプローブは、遺伝子の相補配列の一部であってもよい。そのようなプローブは、公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、上述の遺伝子を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。例えば、プローブとしては、300 bp程度の長さのDNA断片を用いる
ことができる。プローブとして300 bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブリ
ダイゼーションの洗いの条件としては、50℃、2×SSC、0.1% SDSが挙げられる。

また、宿主によってコドンの縮重性が異なるので、標的遺伝子は、任意のコドンをそれと等価のコドンに置換したものであってもよい。すなわち、標的遺伝子は、遺伝コードの縮重による上記例示した標的遺伝子のバリアントであってもよい。

なお、アミノ酸配列間の「同一性」とは、blastpによりデフォルト設定のScoring Parameters（Matrix：BLOSUM62；Gap Costs：Existence＝11, Extension＝1；Compositional Adjustments：Conditional compositional score matrix adjustment）を用いて算出されるアミノ酸配列間の同一性を意味する。また、塩基配列間の「同一性」とは、blastnによりデフォルト設定のScoring Parameters（Match/Mismatch Scores＝1,-2；Gap Costs＝Linear）を用いて算出される塩基配列間の同一性を意味する。

なお、上記の遺伝子やタンパク質の保存的バリアントに関する記載は、プリン系物質生合成系酵素等の任意のタンパク質、およびそれらをコードする遺伝子にも準用できる。

＜１－３＞タンパク質の活性を増大させる手法
以下に、タンパク質の活性を増大させる手法について説明する。

「タンパク質の活性が増大する」とは、同タンパク質の活性が非改変株と比較して増大することを意味する。「タンパク質の活性が増大する」とは、具体的には、同タンパク質の細胞当たりの活性が非改変株と比較して増大することを意味する。ここでいう「非改変株」とは、標的のタンパク質の活性が増大するように改変されていない対照株を意味する。非改変株としては、野生株や親株が挙げられる。非改変株として、具体的には、各細菌種の基準株（type strain）が挙げられる。また、非改変株として、具体的には、細菌の
説明において例示した菌株も挙げられる。すなわち、一態様において、タンパク質の活性は、基準株（すなわち本発明の細菌が属する種の基準株）と比較して増大してよい。また、別の態様において、タンパク質の活性は、E. coli K-12 MG1655株と比較して増大して
もよい。また、別の態様において、タンパク質の活性は、P. ananatis AJ13355株と比較
して増大してもよい。また、別の態様において、タンパク質の活性は、P. ananatis NA1
株と比較して増大してもよい。なお、「タンパク質の活性が増大する」ことを、「タンパク質の活性が増強される」ともいう。「タンパク質の活性が増大する」とは、より具体的には、非改変株と比較して、同タンパク質の細胞当たりの分子数が増加していること、および／または、同タンパク質の分子当たりの機能が増大していることを意味してよい。すなわち、「タンパク質の活性が増大する」という場合の「活性」とは、タンパク質の触媒活性に限られず、タンパク質をコードする遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）または翻訳量（タンパク質の量）を意味してもよい。「タンパク質の細胞当たりの分子数」とは、同タンパク質の分子数の細胞当たりの平均値を意味してよい。また、「タンパク質の活性が増大する」ことには、もともと標的のタンパク質の活性を有する菌株において同タンパク質の活性を増大させることだけでなく、もともと標的のタンパク質の活性が存在しない菌株に同タンパク質の活性を付与することも包含される。また、結果としてタンパク質の活性が増大する限り、宿主が本来有する標的のタンパク質の活性を低下または消失させた上で、好適な標的のタンパク質の活性を付与してもよい。

タンパク質の活性の増大の程度は、タンパク質の活性が非改変株と比較して増大していれば特に制限されない。タンパク質の活性は、例えば、非改変株の、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。また、非改変株が標的のタンパク質の活性を有していない場合は、同タンパク質をコードする遺伝子を導入することにより同タンパク質が生成されていればよいが、例えば、同タンパク質はその活性が測定できる程度に生産されていてよい。

タンパク質の活性が増大するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子の発現を上昇させることによって達成できる。「遺伝子の発現が上昇する」とは、同遺伝子の発現が野生株や親株等の非改変株と比較して増大することを意味する。「遺伝子の発現が上昇する」とは、具体的には、同遺伝子の細胞当たりの発現量が非改変株と比較して増大することを意味する。「遺伝子の細胞当たりの発現量」とは、同遺伝子の発現量の細胞当たりの平均値を意味してよい。「遺伝子の発現が上昇する」とは、より具体的には、遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）が増大すること、および／または、遺伝子の翻訳量（タンパク質の量）が増大することを意味してよい。なお、「遺伝子の発現が上昇する」ことを、「遺伝子の発現が増強される」ともいう。遺伝子の発現は、例えば、非改変株の、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。また、「遺伝子の発現が上昇する」ことには、もともと標的の遺伝子が発現している菌株において同遺伝子の発現量を上昇
させることだけでなく、もともと標的の遺伝子が発現していない菌株において、同遺伝子を発現させることも包含される。すなわち、「遺伝子の発現が上昇する」とは、例えば、標的の遺伝子を保持しない菌株に同遺伝子を導入し、同遺伝子を発現させることを意味してもよい。

遺伝子の発現の上昇は、例えば、遺伝子のコピー数を増加させることにより達成できる。

遺伝子のコピー数の増加は、宿主の染色体へ同遺伝子を導入することにより達成できる。染色体への遺伝子の導入は、例えば、相同組み換えを利用して行うことができる（Miller, J. H. Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory）。相同組み換えを利用する遺伝子導入法としては、例えば、Redドリブンインテグレー
ション（Red-driven integration）法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法、温度感受
性複製起点を含むプラスミドを用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法、ファージを用いたtransduction法が挙げられる。遺伝子は、１コピーのみ導入されてもよく、２コピーまたはそれ以上導入されてもよい。例えば、染色体上に多数のコピーが存在する塩基配列を標的として相同組み換えを行うことで、染色体へ遺伝子の多数のコピーを導入することができる。染色体上に多数のコピーが存在する塩基配列としては、反復DNA配列（repetitive DNA）、トランスポゾンの両端に存在するインバーテッド・リピートが挙げられる。また
、目的物質の生産に不要な遺伝子等の染色体上の適当な塩基配列を標的として相同組み換えを行ってもよい。また、遺伝子は、トランスポゾンやMini-Muを用いて染色体上にラン
ダムに導入することもできる（特開平2-109985号公報、US5,882,888、EP805867B1）。な
お、このような相同組み換えを利用した染色体の改変手法は、標的遺伝子の導入に限られず、発現調節配列の改変等の、染色体の任意の改変に利用できる。

染色体上に標的遺伝子が導入されたことの確認は、同遺伝子の全部又は一部と相補的な配列を持つプローブを用いたサザンハイブリダイゼーション、又は同遺伝子の配列に基づいて作成したプライマーを用いたPCR等によって確認できる。

また、遺伝子のコピー数の増加は、同遺伝子を含むベクターを宿主に導入することによっても達成できる。例えば、標的遺伝子を含むＤＮＡ断片を、宿主で機能するベクターと連結して同遺伝子の発現ベクターを構築し、当該発現ベクターで宿主を形質転換することにより、同遺伝子のコピー数を増加させることができる。標的遺伝子を含むＤＮＡ断片は、例えば、標的遺伝子を有する微生物のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲにより取得できる。ベクターとしては、宿主の細胞内において自律複製可能なベクターを用いることができる。ベクターは、マルチコピーベクターであるのが好ましい。また、形質転換体を選択するために、ベクターは抗生物質耐性遺伝子などのマーカーを有することが好ましい。また、ベクターは、挿入された遺伝子を発現するためのプロモーターやターミネーターを備えていてもよい。ベクターは、例えば、細菌プラスミド由来のベクター、酵母プラスミド由来のベクター、バクテリオファージ由来のベクター、コスミド、またはファージミド等であってよい。エシェリヒア・コリ等の腸内細菌科の細菌において自律複製可能なベクターとして、具体的には、例えば、pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pBR322、pSTV29（いずれもタカラバイオ社より入手可）、pACYC184、pMW219（ニッポンジーン社）
、pTrc99A（ファルマシア社）、pPROK系ベクター（クロンテック社）、pKK233-2（クロンテック社）、pET系ベクター（ノバジェン社）、pQE系ベクター（キアゲン社）、pCold TF
DNA（タカラバイオ社）、pACYC系ベクター、広宿主域ベクターRSF1010が挙げられる。

遺伝子を導入する場合、遺伝子は、発現可能に宿主に保持されていればよい。具体的に
は、遺伝子は、宿主で機能するプロモーターによる制御を受けて発現するように保持されていればよい。プロモーターは、宿主において機能するものであれば特に制限されない。「宿主において機能するプロモーター」とは、宿主においてプロモーター活性を有するプロモーターをいう。プロモーターは、宿主由来のプロモーターであってもよく、異種由来のプロモーターであってもよい。プロモーターは、導入する遺伝子の固有のプロモーターであってもよく、他の遺伝子のプロモーターであってもよい。プロモーターとしては、例えば、後述するような、より強力なプロモーターを利用してもよい。

遺伝子の下流には、転写終結用のターミネーターを配置することができる。ターミネーターは、宿主において機能するものであれば特に制限されない。ターミネーターは、宿主由来のターミネーターであってもよく、異種由来のターミネーターであってもよい。ターミネーターは、導入する遺伝子の固有のターミネーターであってもよく、他の遺伝子のターミネーターであってもよい。ターミネーターとして、具体的には、例えば、T7ターミネーター、T4ターミネーター、fdファージターミネーター、tetターミネーター、およびtrpAターミネーターが挙げられる。

各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネーターに関しては、例えば「微生物学基礎講座８ 遺伝子工学、共立出版、1987年」に詳細に記載されており、それらを利用することが可能である。

また、２またはそれ以上の遺伝子を導入する場合、各遺伝子が、発現可能に宿主に保持されていればよい。例えば、各遺伝子は、全てが単一の発現ベクター上に保持されていてもよく、全てが染色体上に保持されていてもよい。また、各遺伝子は、複数の発現ベクター上に別々に保持されていてもよく、単一または複数の発現ベクター上と染色体上とに別々に保持されていてもよい。また、２またはそれ以上の遺伝子でオペロンを構成して導入してもよい。「２またはそれ以上の遺伝子を導入する場合」としては、例えば、２またはそれ以上のタンパク質（例えば酵素）をそれぞれコードする遺伝子を導入する場合、単一のタンパク質複合体（例えば酵素複合体）を構成する２またはそれ以上のサブユニットをそれぞれコードする遺伝子を導入する場合、およびそれらの組み合わせが挙げられる。

導入される遺伝子は、宿主で機能するタンパク質をコードするものであれば特に制限されない。導入される遺伝子は、宿主由来の遺伝子であってもよく、異種由来の遺伝子であってもよい。導入される遺伝子は、例えば、同遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用い、同遺伝子を有する生物のゲノムDNAや同遺伝子を搭載するプラスミド等を
鋳型として、PCRにより取得することができる。また、導入される遺伝子は、例えば、同
遺伝子の塩基配列に基づいて全合成してもよい（Gene, 60(1), 115-127 (1987)）。取得
した遺伝子は、そのまま、あるいは適宜改変して、利用することができる。すなわち、遺伝子を改変することにより、そのバリアントを取得することができる。遺伝子の改変は公知の手法により行うことができる。例えば、部位特異的変異法により、DNAの目的の部位
に目的の変異を導入することができる。すなわち、例えば、部位特異的変異法により、コードされるタンパク質が特定の部位においてアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むように、遺伝子のコード領域を改変することができる。部位特異的変異法としては、PCRを用いる方法（Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989)；Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)）や、ファージを用いる方法（Kramer, W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987)；Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)）が挙げられる。
あるいは、遺伝子のバリアントを全合成してもよい。

なお、タンパク質が複数のサブユニットからなる複合体として機能する場合、結果としてタンパク質の活性が増大する限り、それら複数のサブユニットの全てを改変してもよく
、一部のみを改変してもよい。すなわち、例えば、遺伝子の発現を上昇させることによりタンパク質の活性を増大させる場合、それらのサブユニットをコードする複数の遺伝子の全ての発現を増強してもよく、一部の発現のみを増強してもよい。通常は、それらのサブユニットをコードする複数の遺伝子の全ての発現を増強するのが好ましい。また、複合体を構成する各サブユニットは、複合体が標的のタンパク質の機能を有する限り、１種の生物由来であってもよく、２種またはそれ以上の異なる生物由来であってもよい。すなわち、例えば、複数のサブユニットをコードする、同一の生物由来の遺伝子を宿主に導入してもよく、それぞれ異なる生物由来の遺伝子を宿主に導入してもよい。

また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の転写効率を向上させることにより達成できる。また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の翻訳効率を向上させることにより達成できる。遺伝子の転写効率や翻訳効率の向上は、例えば、発現調節配列の改変により達成できる。「発現調節配列」とは、遺伝子の発現に影響する部位の総称である。発現調節配列としては、例えば、プロモーター、シャインダルガノ（ＳＤ）配列（リボソーム結合部位（ＲＢＳ）ともいう）、およびＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域が挙げられる。発現調節配列は、プロモーター検索ベクターやＧＥＮＥＴＹＸ等の遺伝子解析ソフトを用いて決定することができる。これら発現調節配列の改変は、例えば、温度感受性ベクターを用いた方法や、Ｒｅｄドリブンインテグレーション法（WO2005/010175）により行うことがで
きる。

遺伝子の転写効率の向上は、例えば、染色体上の遺伝子のプロモーターをより強力なプロモーターに置換することにより達成できる。「より強力なプロモーター」とは、遺伝子の転写が、もともと存在している野生型のプロモーターよりも向上するプロモーターを意味する。より強力なプロモーターとしては、例えば、公知の高発現プロモーターであるT7プロモーター、trpプロモーター、lacプロモーター、thrプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーター、tetプロモーター、araBADプロモーター、rpoHプロモーター、msrAプロモーター、Bifidobacterium由来のPm1プロモーター、PRプロモーター、およびPLプロモーターが挙げられる。また、より強力なプロモーターとしては、各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターの高活性型のものを取得してもよい。例えば、プロモーター領域内の-35、-10領域をコンセンサス配列に近づけることにより、プロモーターの活性を高めることができる（国際公開第00/18935号）。高活性型プロモーターとしては、各種tac様プロモーター（Katashkina JI et al. Russian Federation Patent application 2006134574）やpnlp8プロモーター（WO2010/027045）が挙げられる。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)）等に記載されている。

遺伝子の翻訳効率の向上は、例えば、染色体上の遺伝子のシャインダルガノ（ＳＤ）配列（リボソーム結合部位（ＲＢＳ）ともいう）をより強力なＳＤ配列に置換することにより達成できる。「より強力なＳＤ配列」とは、ｍＲＮＡの翻訳が、もともと存在している野生型のＳＤ配列よりも向上するＳＤ配列を意味する。より強力なＳＤ配列としては、例えば、ファージＴ７由来の遺伝子１０のＲＢＳが挙げられる（Olins P. O. et al, Gene,
1988, 73, 227-235）。さらに、ＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域、特に開始コドンのすぐ上流の配列（5’-UTR）における数個のヌクレオチドの置換、あるいは挿入
、あるいは欠失がｍＲＮＡの安定性および翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することによっても遺伝子の翻訳効率を向上させることができる。

遺伝子の翻訳効率の向上は、例えば、コドンの改変によっても達成できる。例えば、遺伝子中に存在するレアコドンを、より高頻度で利用される同義コドンに置き換えることにより、遺伝子の翻訳効率を向上させることができる。すなわち、導入される遺伝子は、例
えば、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変されてよい。コドンの置換は、例えば、部位特異的変異法により行うことができる。また、コドンが置換された遺伝子断片を全合成してもよい。種々の生物におけるコドンの使用頻度は、「コドン使用データベース」（http://www.kazusa.or.jp/codon; Nakamura, Y. et al, Nucl. Acids Res., 28, 292 (2000)）に開示されている。

また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の発現を上昇させるようなレギュレーターを増幅すること、または、遺伝子の発現を低下させるようなレギュレーターを欠失または弱化させることによっても達成できる。

上記のような遺伝子の発現を上昇させる手法は、単独で用いてもよく、任意の組み合わせで用いてもよい。

また、タンパク質の活性が増大するような改変は、例えば、タンパク質の比活性を増強することによっても達成できる。比活性の増強には、フィードバック阻害の脱感作（desensitization to feedback inhibition）も含まれる。比活性が増強されたタンパク質は、例えば、種々の生物を探索し取得することができる。また、在来のタンパク質に変異を導入することで高活性型のものを取得してもよい。導入される変異は、例えば、タンパク質の１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されるものであってよい。変異の導入は、例えば、上述したような部位特異的変異法により行うことができる。また、変異の導入は、例えば、突然変異処理により行ってもよい。突然変異処理としては、Ｘ線の照射、紫外線の照射、ならびにＮ－メチル－Ｎ'－ニ
トロ－Ｎ－ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、およびメチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤による処理が挙げられる。また、in vitroでDNAを直接ヒドロキシルアミンで処理し、ランダム変異を誘発してもよい。
比活性の増強は、単独で用いてもよく、上記のような遺伝子の発現を増強する手法と任意に組み合わせて用いてもよい。

形質転換の方法は特に限定されず、従来知られた方法を用いることができる。例えば、エシェリヒア・コリ K-12について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウム
で処理してDNAの透過性を増す方法（Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol. 1970, 53, 159-162）や、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞
からコンピテントセルを調製してDNAを導入する方法（Duncan, C. H., Wilson, G. A. and Young, F. E., 1977. Gene 1: 153-167）を用いることができる。あるいは、バチルス
・ズブチリス、放線菌類、及び酵母について知られているような、DNA受容菌の細胞を、
組換えDNAを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えDNAをDNA受容菌に導入する方法（Chang, S. and Choen, S. N., 1979. Mol. Gen. Genet. 168: 111-115; Bibb, M. J., Ward, J. M. and Hopwood, O. A. 1978. Nature 274: 398-400; Hinnen, A., Hicks, J. B. and Fink, G. R. 1978. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929-1933）も応用できる。あるいは、コリネ型細菌について報告されているような、電気パルス法（特開平2-207791）を利用することもできる。

タンパク質の活性が増大したことは、同タンパク質の活性を測定することで確認できる。

タンパク質の活性が増大したことは、同タンパク質をコードする遺伝子の発現が上昇したことを確認することによっても、確認できる。遺伝子の発現が上昇したことは、同遺伝子の転写量が上昇したことを確認することや、同遺伝子から発現するタンパク質の量が上昇したことを確認することにより確認できる。

遺伝子の転写量が上昇したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を野生株または親株等の非改変株と比較することによって行うことができる。mRNAの量を評価する方法としてはノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCR、マイクロアレイ、RNA-seq等が挙
げられる（Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual/Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001）。mRNAの量（例えば、細胞当たりの分子数）は、例えば、非改変株の、１．５倍以上、２倍以
上、または３倍以上に上昇してよい。

タンパク質の量が上昇したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことができる（Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual/Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001
）。タンパク質の量（例えば、細胞当たりの分子数）は、例えば、非改変株の、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。

上記したタンパク質の活性を増大させる手法は、任意のタンパク質の活性増強や任意の遺伝子の発現増強に利用できる。

＜１－４＞タンパク質の活性を低下させる手法
以下に、タンパク質の活性を低下させる手法について説明する。

「タンパク質の活性が低下する」とは、同タンパク質の活性が非改変株と比較して低下することを意味する。「タンパク質の活性が低下する」とは、具体的には、同タンパク質の細胞当たりの活性が非改変株と比較して低下することを意味する。ここでいう「非改変株」とは、標的のタンパク質の活性が低下するように改変されていない対照株を意味する。非改変株としては、野生株や親株が挙げられる。非改変株として、具体的には、各細菌種の基準株（type strain）が挙げられる。また、非改変株として、具体的には、細菌の
説明において例示した菌株も挙げられる。すなわち、一態様において、タンパク質の活性は、基準株（すなわち本発明の細菌が属する種の基準株）と比較して低下してよい。また、別の態様において、タンパク質の活性は、E. coli K-12 MG1655株と比較して低下して
もよい。また、別の態様において、タンパク質の活性は、P. ananatis AJ13355株と比較
して低下してもよい。また、別の態様において、タンパク質の活性は、P. ananatis NA1
株と比較して低下してもよい。なお、「タンパク質の活性が低下する」ことには、同タンパク質の活性が完全に消失している場合も包含される。「タンパク質の活性が低下する」とは、より具体的には、非改変株と比較して、同タンパク質の細胞当たりの分子数が低下していること、および／または、同タンパク質の分子当たりの機能が低下していることを意味してよい。すなわち、「タンパク質の活性が低下する」という場合の「活性」とは、タンパク質の触媒活性に限られず、タンパク質をコードする遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）または翻訳量（タンパク質の量）を意味してもよい。「タンパク質の細胞当たりの分子数」とは、同タンパク質の分子数の細胞当たりの平均値を意味してよい。なお、「タンパク質の細胞当たりの分子数が低下している」ことには、同タンパク質が全く存在していない場合も包含される。また、「タンパク質の分子当たりの機能が低下している」ことには、同タンパク質の分子当たりの機能が完全に消失している場合も包含される。タンパク質の活性の低下の程度は、タンパク質の活性が非改変株と比較して低下していれば特に制限されない。タンパク質の活性は、例えば、非改変株の、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。

タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子の発現を低下させることにより達成できる。「遺伝子の発現が低下する」とは、同遺伝子の発現が野生株や親株等の非改変株と比較して低下することを意味する。「遺伝子の発現が低下する」とは、具体的には、同遺伝子の細胞当たりの発現量が非改変株と比較して低
下することを意味する。「遺伝子の細胞当たりの発現量」とは、同遺伝子の発現量の細胞当たりの平均値を意味してよい。「遺伝子の発現が低下する」とは、より具体的には、遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）が低下すること、および／または、遺伝子の翻訳量（タンパク質の量）が低下することを意味してよい。「遺伝子の発現が低下する」ことには、同遺伝子が全く発現していない場合も包含される。なお、「遺伝子の発現が低下する」ことを、「遺伝子の発現が弱化される」ともいう。遺伝子の発現は、例えば、非改変株の、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。

遺伝子の発現の低下は、例えば、転写効率の低下によるものであってもよく、翻訳効率の低下によるものであってもよく、それらの組み合わせによるものであってもよい。遺伝子の発現の低下は、例えば、遺伝子のプロモーター、シャインダルガノ（ＳＤ）配列（リボソーム結合部位（ＲＢＳ）ともいう）、ＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域等の発現調節配列を改変することにより達成できる。発現調節配列を改変する場合には、発現調節配列は、好ましくは１塩基以上、より好ましくは２塩基以上、特に好ましくは３塩基以上が改変される。遺伝子の転写効率の低下は、例えば、染色体上の遺伝子のプロモーターをより弱いプロモーターに置換することにより達成できる。「より弱いプロモーター」とは、遺伝子の転写が、もともと存在している野生型のプロモーターよりも弱化するプロモーターを意味する。より弱いプロモーターとしては、例えば、誘導型のプロモーターが挙げられる。すなわち、誘導型のプロモーターは、非誘導条件下（例えば、誘導物質の非存在下）でより弱いプロモーターとして機能し得る。また、発現調節配列の一部または全部の領域を欠失（欠損）させてもよい。また、遺伝子の発現の低下は、例えば、発現制御に関わる因子を操作することによっても達成できる。発現制御に関わる因子としては、転写や翻訳制御に関わる低分子（誘導物質、阻害物質など）、タンパク質（転写因子など）、核酸（siRNAなど）等が挙げられる。また、遺伝子の発現の低下は、例えば、遺伝子
のコード領域に遺伝子の発現が低下するような変異を導入することによっても達成できる。例えば、遺伝子のコード領域のコドンを、宿主においてより低頻度で利用される同義コドンに置き換えることによって、遺伝子の発現を低下させることができる。また、例えば、後述するような遺伝子の破壊により、遺伝子の発現自体が低下し得る。

また、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子を破壊することにより達成できる。「遺伝子が破壊される」とは、正常に機能するタンパク質を産生しないように同遺伝子が改変されることを意味する。「正常に機能するタンパク質を産生しない」ことには、同遺伝子からタンパク質が全く産生されない場合や、同遺伝子から分子当たりの機能（例えば活性や性質）が低下又は消失したタンパク質が産生される場合が包含される。

遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子を欠失（欠損）させることにより達成できる。「遺伝子の欠失」とは、遺伝子のコード領域の一部又は全部の領域の欠失をいう。さらには、染色体上の遺伝子のコード領域の前後の配列を含めて、遺伝子全体を欠失させてもよい。遺伝子のコード領域の前後の配列には、例えば、遺伝子の発現調節配列が含まれてよい。タンパク質の活性の低下が達成できる限り、欠失させる領域は、Ｎ末端領域（タンパク質のＮ末端側をコードする領域）、内部領域、Ｃ末端領域（タンパク質のＣ末端側をコードする領域）等のいずれの領域であってもよい。通常、欠失させる領域は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。欠失させる領域は、例えば、遺伝子のコード領域全長の１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の長さの領域であってよい。また、欠失させる領域の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。リーディングフレームの不一致により、欠失させる領域の下流でフレームシフトが生じ得る。

また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、終止コドン（ナンセンス変異）を導入すること、または１～２塩基の付加または欠失（フレームシフト変異）を導入すること等によっても達成できる（Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617(1997), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95 5511-5515(1998), Journal of Biological Chemistry 26 116, 20833-20839(1991)）。

また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域に他の塩基配列を挿入することによっても達成できる。挿入部位は遺伝子のいずれの領域であってもよいが、挿入する塩基配列は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、挿入部位の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。リーディングフレームの不一致により、挿入部位の下流でフレームシフトが生じ得る。他の塩基配列としては、コードされるタンパク質の活性を低下又は消失させるものであれば特に制限されないが、例えば、抗生物質耐性遺伝子等のマーカー遺伝子や目的物質の生産に有用な遺伝子が挙げられる。

遺伝子の破壊は、特に、コードされるタンパク質のアミノ酸配列が欠失（欠損）するように実施してよい。言い換えると、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、タンパク質のアミノ酸配列（アミノ酸配列の一部または全部の領域）を欠失させることにより、具体的には、アミノ酸配列（アミノ酸配列の一部または全部の領域）を欠失したタンパク質をコードするように遺伝子を改変することにより、達成できる。なお、「タンパク質のアミノ酸配列の欠失」とは、タンパク質のアミノ酸配列の一部または全部の領域の欠失をいう。また、「タンパク質のアミノ酸配列の欠失」とは、タンパク質において元のアミノ酸配列が存在しなくなることをいい、元のアミノ酸配列が別のアミノ酸配列に変化する場合も包含される。すなわち、例えば、フレームシフトにより別のアミノ酸配列に変化した領域は、欠失した領域とみなしてよい。タンパク質のアミノ酸配列の欠失により、典型的にはタンパク質の全長が短縮されるが、タンパク質の全長が変化しないか、あるいは延長される場合もあり得る。例えば、遺伝子のコード領域の一部又は全部の領域の欠失により、コードされるタンパク質のアミノ酸配列において、当該欠失した領域がコードする領域を欠失させることができる。また、例えば、遺伝子のコード領域への終止コドンの導入により、コードされるタンパク質のアミノ酸配列において、当該導入部位より下流の領域がコードする領域を欠失させることができる。また、例えば、遺伝子のコード領域におけるフレームシフトにより、当該フレームシフト部位がコードする領域を欠失させることができる。アミノ酸配列の欠失における欠失させる領域の位置および長さについては、遺伝子の欠失における欠失させる領域の位置および長さの説明を準用できる。

染色体上の遺伝子を上記のように改変することは、例えば、正常に機能するタンパク質を産生しないように改変した破壊型遺伝子を作製し、該破壊型遺伝子を含む組換えＤＮＡで宿主を形質転換して、破壊型遺伝子と染色体上の野生型遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の野生型遺伝子を破壊型遺伝子に置換することによって達成できる。その際、組換えＤＮＡには、宿主の栄養要求性等の形質にしたがって、マーカー遺伝子を含ませておくと操作がしやすい。破壊型遺伝子としては、遺伝子のコード領域の一部又は全部の領域を欠失した遺伝子、ミスセンス変異を導入した遺伝子、ナンセンス変異を導入した遺伝子、フレームシフト変異を導入した遺伝子、トランスポゾンやマーカー遺伝子等の挿入配列を挿入した遺伝子が挙げられる。破壊型遺伝子によってコードされるタンパク質は、生成したとしても、野生型タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失する。相同組換えに用いる組換えＤＮＡの構造は、所望の態様で相同組換えが起こるものであれば特に制限されない。例えば、破壊型遺伝子を含む線状ＤＮＡであって、両端に染色体上の野生型遺伝子の上流および下流の配列をそれぞれ備える線状ＤＮＡで宿主を形質転換して、野生型遺伝子の上流および下流でそれぞれ相同組換えを起こさせる
ことにより、野生型遺伝子を破壊型遺伝子に置換することができる。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は既に確立しており、「Redドリブンインテグ
レーション（Red-driven integration）」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組み合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミドを
用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法などがある（米国特許第6,303,383号、特開平05-007491号）。なお、このような相同組み換えを利用した染色体の改変手法は、標的遺伝子の破壊に限られず、発現調節配列の改変等の、染色体の任意の改変に利用できる。

また、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、突然変異処理により行ってもよい。突然変異処理としては、Ｘ線の照射、紫外線の照射、ならびにＮ－メチル－Ｎ'
－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、およびメチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤による処理が挙げられる。

なお、タンパク質が複数のサブユニットからなる複合体として機能する場合、結果としてタンパク質の活性が低下する限り、それら複数のサブユニットの全てを改変してもよく、一部のみを改変してもよい。すなわち、例えば、それらのサブユニットをコードする複数の遺伝子の全てを破壊等してもよく、一部のみを破壊等してもよい。また、タンパク質に複数のアイソザイムが存在する場合、結果としてタンパク質の活性が低下する限り、複数のアイソザイムの全ての活性を低下させてもよく、一部のみの活性を低下させてもよい。すなわち、例えば、それらのアイソザイムをコードする複数の遺伝子の全てを破壊等してもよく、一部のみを破壊等してもよい。

上記のようなタンパク質の活性を低下させる手法は、単独で用いてもよく、任意の組み合わせで用いてもよい。

タンパク質の活性が低下したことは、同タンパク質の活性を測定することで確認できる。

タンパク質の活性が低下したことは、同タンパク質をコードする遺伝子の発現が低下したことを確認することによっても、確認できる。遺伝子の発現が低下したことは、同遺伝子の転写量が低下したことを確認することや、同遺伝子から発現するタンパク質の量が低下したことを確認することにより確認できる。

遺伝子の転写量が低下したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を非改変株と比較することによって行うことができる。mRNAの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCR、マイクロアレイ、RNA-seq等が挙げられる（Sambrook,
J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual/Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001）。mRNAの量（例えば、細胞当たりの分子数）は、例えば、非改変株の、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。

タンパク質の量が低下したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことができる（Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual/Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001
）。タンパク質の量（例えば、細胞当たりの分子数）は、例えば、非改変株の、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。

遺伝子が破壊されたことは、破壊に用いた手段に応じて、同遺伝子の一部または全部の塩基配列、制限酵素地図、または全長等を決定することで確認できる。

上記したタンパク質の活性を低下させる手法は、任意のタンパク質の活性低下や任意の遺伝子の発現低下や破壊に利用できる。上記したタンパク質の活性を低下させる手法は、発現低下や破壊等の対象となる遺伝子が染色体外の構造物（例えばプラスミド）上に存在する場合にも利用できる。その場合、上記したタンパク質の活性を低下させる手法における「染色体」は、「染色体外の構造物」（例えばプラスミド）と読み替えてよい。

＜２＞本発明のプリン系物質の製造方法
本発明の方法の一態様は、本発明の細菌を培地で培養し、該培地中および／または該細菌の菌体内にプリン系物質を蓄積すること、および前記培地および／または前記菌体より前記プリン系物質を採取すること、を含むプリン系物質の製造方法である。プリン系物質については上述した通りである。本発明においては、１種のプリン系物質が製造されてもよく、２種またはそれ以上のプリン系物質が製造されてもよい。

使用する培地は、本発明の細菌が増殖でき、目的のプリン系物質が生産される限り、特に制限されない。培地としては、例えば、腸内細菌科の細菌等の細菌の培養に用いられる通常の培地を用いることができる。培地としては、例えば、炭素源、窒素源、リン酸源、硫黄源、その他の各種有機成分や無機成分から選択される成分を必要に応じて含有する培地を用いることができる。培地成分の種類や濃度は、使用する細菌の種類等の諸条件に応じて適宜設定してよい。

炭素源として、具体的には、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、ラクトース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、廃糖蜜、澱粉加水分解物、バイオマスの加水分解物等の糖類、酢酸、フマル酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類、グリセロール、粗グリセロール、エタノール等のアルコール類、脂肪酸類が挙げられる。炭素源としては、特に、糖類が挙げられる。なお、炭素源としては、植物由来原料を好適に用いることができる。植物としては、例えば、トウモロコシ、米、小麦、大豆、サトウキビ、ビート、綿が挙げられる。植物由来原料としては、例えば、根、茎、幹、枝、葉、花、種子等の器官、それらを含む植物体、それら植物器官の分解産物が挙げられる。植物由来原料の利用形態は特に制限されず、例えば、未加工品、絞り汁、粉砕物、精製物等のいずれの形態でも利用できる。また、キシロース等の５炭糖、グルコース等の６炭糖、またはそれらの混合物は、例えば、植物バイオマスから取得して利用できる。具体的には、これらの糖類は、植物バイオマスを、水蒸気処理、濃酸加水分解、希酸加水分解、セルラーゼ等の酵素による加水分解、アルカリ処理等の処理に供することにより取得できる。なお、ヘミセルロースは一般的にセルロースよりも加水分解されやすいため、植物バイオマス中のヘミセルロースを予め加水分解して五炭糖を遊離させ、次いで、セルロースを加水分解して六炭糖を生成してもよい。また、キシロースは、例えば、本発明の細菌にグルコース等の六炭糖からキシロースへの変換経路を保有させて、六炭糖からの変換により供給してもよい。炭素源としては、１種の炭素源を用いてもよく、２種またはそれ以上の炭素源を組み合わせて用いてもよい。

窒素源として、具体的には、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆タンパク質分解物等の有機窒素源、アンモニア、ウレアが挙げられる。pH調整に用いられるアンモニアガスやアンモニア水を窒素源として利用してもよい。窒素源としては、１種の窒素源を用いてもよく、２種またはそれ以上の窒素源を組み合わせて用いてもよい。

リン酸源として、具体的には、例えば、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム等のリン酸塩、ピロリン酸等のリン酸ポリマーが挙げられる。リン酸源としては、１種のリン酸源を用いてもよく、２種またはそれ以上のリン酸源を組み合わせて用いてもよい。

硫黄源として、具体的には、例えば、硫酸塩、チオ硫酸塩、亜硫酸塩等の無機硫黄化合物、システイン、シスチン、グルタチオン等の含硫アミノ酸が挙げられる。硫黄源としては、１種の硫黄源を用いてもよく、２種またはそれ以上の硫黄源を組み合わせて用いてもよい。

その他の各種有機成分や無機成分として、具体的には、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩類；鉄、マンガン、マグネシウム、カルシウム、亜鉛、銅、コバルト等の微量金属類；ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ビタミンB12等のビタミン類；アミノ酸類；核酸類；これらを含有するペプトン、カザ
ミノ酸、酵母エキス、大豆タンパク質分解物等の有機成分が挙げられる。その他の各種有機成分や無機成分としては、１種の成分を用いてもよく、２種またはそれ以上の成分を組み合わせて用いてもよい。

また、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には、培地に要求される栄養素を補添することが好ましい。例えば、サクシニル－ＡＭＰシンターゼ遺伝子（purA）の欠損株等のアデニン要求性変異株の培養には、アデニンやそれを含有する有機成分を用いてよい。

また、培地中のビオチン量を制限することや、培地に界面活性剤またはペニシリンを添加することも好ましい。

培養条件は、本発明の細菌が増殖でき、目的のプリン系物質が生産される限り、特に制限されない。培養は、例えば、腸内細菌科の細菌等の細菌の培養に用いられる通常の条件で行うことができる。培養条件は、使用する細菌の種類等の諸条件に応じて適宜設定してよい。

培養は、液体培地を用いて行うことができる。培養の際には、本発明の細菌を寒天培地等の固体培地で培養したものを直接液体培地に接種してもよく、本発明の細菌を液体培地で種培養したものを本培養用の液体培地に接種してもよい。すなわち、培養は、種培養と本培養とに分けて行われてもよい。その場合、種培養と本培養の培養条件は、同一であってもよく、そうでなくてもよい。培養開始時に培地に含有される本発明の細菌の量は特に制限されない。本培養は、例えば、本培養の培地に、種培養液を1～50％（v/v）植菌することにより行ってよい。

培養は、回分培養（batch culture）、流加培養（Fed-batch culture）、連続培養（continuous culture）、またはそれらの組み合わせにより実施することができる。なお、培養開始時の培地を、「初発培地」ともいう。また、流加培養または連続培養において培養系（発酵槽）に供給する培地を、「流加培地」ともいう。また、流加培養または連続培養において培養系に流加培地を供給することを、「流加」ともいう。なお、培養が種培養と本培養とに分けて行われる場合、例えば、種培養と本培養を、共に回分培養で行ってもよい。また、例えば、種培養を回分培養で行い、本培養を流加培養または連続培養で行ってもよい。

本発明において、各培地成分は、初発培地、流加培地、またはその両方に含有されていてよい。初発培地に含有される成分の種類は、流加培地に含有される成分の種類と、同一であってもよく、そうでなくてもよい。また、初発培地に含有される各成分の濃度は、流
加培地に含有される各成分の濃度と、同一であってもよく、そうでなくてもよい。また、含有する成分の種類および／または濃度の異なる２種またはそれ以上の流加培地を用いてもよい。例えば、複数回の流加が間欠的に行われる場合、各回の流加培地に含有される成分の種類および／または濃度は、同一であってもよく、そうでなくてもよい。

培地中の炭素源の濃度は、本発明の細菌が増殖でき、プリン系物質が生産される限り、特に制限されない。培地中の炭素源の濃度は、例えば、プリン系物質の生産が阻害されない範囲で可能な限り高くしてよい。培地中の炭素源の濃度は、例えば、初発濃度（初発培地中の濃度）として、１～３０w/v%、好ましくは３～１０w/v%であってよい。また、適宜、炭素源を追加で培地に添加してもよい。例えば、発酵の進行に伴う炭素源の消費に応じて、炭素源を追加で培地に添加してもよい。

培養は、例えば、好気条件で行うことができる。好気条件とは、液体培地中の溶存酸素濃度が、酸素膜電極による検出限界である0.33 ppm以上であることをいい、好ましくは1.5 ppm以上であることであってよい。酸素濃度は、例えば、飽和酸素濃度に対して5～50％、好ましくは10％程度に制御されてもよい。好気条件での培養は、具体的には、通気培養、振盪培養、撹拌培養、またはそれらの組み合わせで行うことができる。培地のpHは、例えば、pH3～10、好ましくはpH4.0～9.5であってよい。培養中、必要に応じて培地のpHを
調整することができる。培地のpHは、アンモニアガス、アンモニア水、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム等の各種アルカリ性または酸性物質を用いて調整することができる。培養温度は、例えば、20～40℃、好ましくは25℃～37℃であってよい。培養期間は、例えば、10時間～120時間であってよい。培養は、
例えば、培地中の炭素源が消費されるまで、あるいは本発明の細菌の活性がなくなるまで、継続してもよい。このような条件下で本発明の細菌を培養することにより、培地中および／または菌体内にプリン系物質が蓄積する。

プリン系物質が生成したことは、化合物の検出または同定に用いられる公知の手法により確認することができる。そのような手法としては、例えば、HPLC、LC/MS、GC/MS、NMR
が挙げられる。これらの手法は、単独で、あるいは適宜組み合わせて用いることができる。

発酵液からのプリン系物質の回収は、化合物の分離精製に用いられる公知の手法により行うことができる。そのような手法としては、例えば、イオン交換樹脂法（Nagai, H. et
al., Separation Science and Technology, 39(16), 3691-3710）、沈殿法、膜分離法（特開平9-164323、特開平9-173792）、晶析法（WO2008/078448、WO2008/078646）が挙げられる。これらの手法は、単独で、あるいは適宜組み合わせて用いることができる。なお、菌体内にプリン系物質が蓄積する場合には、例えば、菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清から、イオン交換樹脂法などによってプリン系物質を回収することができる。プリン系物質が塩を形成し得る物質（例えば、プリンヌクレオチド）である場合、回収されるプリン系物質は、フリー体、その塩、またはそれらの混合物であってよい。塩としては、例えば、ナトリウム塩やカリウム塩が挙げられる。

また、プリン系物質が培地中に析出する場合は、遠心分離又は濾過等により回収することができる。また、培地中に析出したプリン系物質は、培地中に溶解しているプリン系物質を晶析した後に、併せて単離してもよい。

尚、回収されるプリン系物質は、プリン系物質以外に、細菌菌体、培地成分、水分、及び細菌の代謝副産物等の成分を含んでいてもよい。プリン系物質は、所望の程度に精製されていてもよい。回収されるプリン系物質の純度は、例えば、30％（w/w）以上、50％（w
/w）以上、70％（w/w）以上、80％（w/w）以上、90％（w/w）以上、または95％（w/w）以上であってよい。

＜３＞本発明のプリンヌクレオチドの製造法
本発明の方法の別態様は、プリンヌクレオシド生産能を有する本発明の細菌を培地で培養し、該培地中および／または該細菌の菌体内にプリンヌクレオシドを蓄積すること、前記プリンヌクレオシドをリン酸化しプリンヌクレオチドを生成すること、および前記プリンヌクレオチドを採取すること、を含むプリンヌクレオチドの製造方法である。

プリンヌクレオシドおよびプリンヌクレオチドについては上述した通りである。プリンヌクレオチドとしては、プリンヌクレオシドの５’－リン酸エステルが挙げられる。プリンヌクレオシドの５’－リン酸エステルとしては、イノシン酸（イノシン－５’－リン酸エステル；ＩＭＰ）、グアニル酸（グアノシン－５’－リン酸エステル；ＧＭＰ）、キサンチル酸（キサントシン－５’－リン酸エステル；ＸＭＰ）、およびアデニル酸（アデノシン－５’－リン酸エステル；ＡＭＰ）が挙げられる。本発明のプリンヌクレオチドの製造法においては、使用するプリンヌクレオシドに対応するプリンヌクレオチドが生成する。すなわち、例えば、イノシンからはイノシン酸を、グアノシンからはグアニル酸を、キサントシンからはキサンチル酸を、アデノシンからはアデニル酸を、それぞれ製造できる。本発明においては、１種のプリンヌクレオチドが製造されてもよく、２種またはそれ以上のプリンヌクレオチドが製造されてもよい。

本発明の細菌の培養については、本発明のプリン系物質の製造法において上述した通りである。

プリンヌクレオシドは、培地または菌体に含まれたままリン酸化に供してもよく、培地または菌体から回収してからリン酸化に供してもよい。また、プリンヌクレオシドは、適宜前処理を行ってからリン酸化に供してもよい。前処理としては、例えば、精製、希釈、濃縮、結晶化、乾燥、破砕、溶解等が挙げられる。これらの前処理は、適宜組み合わせて行ってもよい。例えば、プリンヌクレオシドを含有する培養液をそのまま、あるいは所望の程度に精製して、リン酸化に供してよい。

プリンヌクレオシドをリン酸化する手法は特に制限されない。リン酸化は、例えば、公知の手法により行うことができる。

リン酸化は、例えば、化学的に行うことができる。化学的リン酸化は、塩化ホスホリル（POCl₃）等のリン酸化剤を使用して行うことができる（Yoshikawa et. al., Studies of
phosphorylation, III, Selective phosphorylation of unprotected nucleosides, Bull. Chem. Soc. Jpn., 1969, 42: 3505-3508）。

リン酸化は、例えば、微生物または酵素を利用して行うことができる。すなわち、プリンヌクレオシドおよびリン酸供与体に、プリンヌクレオチドを生成する能力を有する微生物を作用させることにより、プリンヌクレオチドを生成することができる（特開平07-231793）。ここでいう「プリンヌクレオチドを生成する能力」とは、プリンヌクレオシドを
リン酸化して対応するプリンヌクレオチドを生成する能力を意味してよい。また、プリンヌクレオシドおよびリン酸供与体に、リン酸化酵素を作用させることにより、プリンヌクレオチドを生成することができる。

プリンヌクレオチドを生成する能力を有する微生物として、具体的には、例えば、以下のようなものが挙げられる（特開平07-231793）。
エシェリヒア・ブラッタエ（Escherichia blattae）JCM 1650
セラチア・フィカリア（Serratia ficaria）ATCC 33105
クレブシエラ・プランティコーラ（Klebsiella planticola）IFO 14939（ATCC 33531）
クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）IFO 3318（ATCC 8724）
クレブシエラ・テリゲナ（Klebsiella terrigena）IFO 14941（ATCC 33257）
モルガネラ・モルガニ（Morganella morganii）IFO 3168
エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）IFO 12010
エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）IFO 13534（ATCC 13048）
クロモバクテリウム・フラビアタイル（Chromobacterium fluviatile）IAM 13652
クロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium violaceum）IFO 12614
セデシア・ラパゲイ（Cedecea lapagei）JCM 1684
セデシア・ダビシエ（Cedecea davisiae）JCM 1685
セデシア・ネテリ（Cedecea neteri）JCM 5909

リン酸化酵素としては、例えば、ホスファターゼ、ヌクレオシドキナーゼ、ヌクレオシドホスホトランスフェラーゼが挙げられる。リン酸化酵素は、精製されたものであってもよく、そうでなくてもよい。例えば、リン酸化酵素を生産する微生物の培養物、該培養物から分離した培養上清、該培養物から分離した菌体、該微生物の菌体処理物、それらの部分精製物、等のリン酸化酵素を含有する画分をリン酸化酵素として利用してもよい。

ヌクレオシドキナーゼとしては、例えば、イノシングアノシンキナーゼが挙げられる。イノシングアノシンキナーゼを利用する方法として、具体的には、例えば、エシェリヒア・コリのイノシングアノシンキナーゼをコードする遺伝子を導入したエシェリヒア属細菌を用いるプリンヌクレオチドの製造法（WO91/08286）や、エキシグオバクテリウム・アセチリカムのイノシングアノシンキナーゼをコードする遺伝子を導入したコリネバクテリウム・アンモニアゲネスを用いたプリンヌクレオチドの製造法（WO96/30501）が挙げられる。

ホスファターゼとしては、例えば、酸性ホスファターゼが挙げられる。酸性ホスファターゼとしては、例えば、特開2002-000289に開示されているものが挙げられる。また、好
ましい酸性ホスファターゼとしては、例えば、ヌクレオシドに対する親和性が上昇した変異型酸性ホスファターゼ（特開平10-201481）、ヌクレオチダーゼ活性が低下した変異型
酸性ホスファターゼ（WO96/37603）、リン酸エステル加水分解活性が低下した変異型酸性ホスファターゼ（特開2001-245676）が挙げられる。

リン酸供与体としては、例えば、ポリリン酸、フェニルリン酸、アセチルリン酸、カルバミルリン酸、ＡＴＰ、ｄＡＴＰ（デオキシＡＴＰ）が挙げられる。ポリリン酸としては、例えば、ピロリン酸、トリポリリン酸、トリメタリン酸、テトラメタリン酸、ヘキサメタリン酸が挙げられる。リン酸供与体は、いずれもフリー体もしくはその塩、またはそれらの混合物であってよい。塩としては、例えば、ナトリウム塩やカリウム塩が挙げられる。リン酸供与体は、用いる微生物やリン酸化酵素の種類等に応じて適宜選択することができる。また、ＡＴＰやｄＡＴＰをリン酸供与体として用いる場合、それらの再生系を併用することもできる（WO91/08286、WO96/30501）。

プリンヌクレオチドが生成したことは、化合物の検出または同定に用いられる公知の手法により確認することができる。そのような手法としては、例えば、HPLC、LC/MS、GC/MS、NMRが挙げられる。これらの手法は、単独で、あるいは適宜組み合わせて用いることが
できる。

生成したプリンヌクレオチドの回収は、化合物の分離精製に用いられる公知の手法により行うことができる。そのような手法としては、例えば、イオン交換樹脂法（Nagai, H.
et al., Separation Science and Technology, 39(16), 3691-3710）、沈殿法、膜分離法（特開平9-164323、特開平9-173792）、晶析法（WO2008/078448、WO2008/078646）が挙げられる。これらの手法は、単独で、あるいは適宜組み合わせて用いることができる。回収されるプリンヌクレオチドは、フリー体、その塩、またはそれらの混合物であってよい。塩としては、例えば、ナトリウム塩やカリウム塩が挙げられる。

尚、回収されるプリンヌクレオチドは、プリンヌクレオチド以外に、リン酸化酵素、リン酸供与体、細菌菌体、培地成分、水分、及び細菌の代謝副産物等の成分を含んでいてもよい。プリンヌクレオチドは、所望の程度に精製されていてよい。回収されるプリンヌクレオチドの純度は、例えば、30％（w/w）以上、50％（w/w）以上、70％（w/w）以上、80
％（w/w）以上、90％（w/w）以上、または95％（w/w）以上であってよい。

以下、非限定的な実施例を参照して本発明をさらに具体的に説明する。

実施例：Pantoea ananatisのGlcNDH遺伝子（PAJ_3461、PAJ_3462、およびPAJ_3463）欠損株によるイノシン生産
（１）Pantoea ananatis PH10株の取得
Pantoea ananatis AJ13355（FERM BP-6614）を親株として、deoD遺伝子（purine nucleoside phosphorylase遺伝子）、add遺伝子（adenosine deaminase遺伝子）、purA遺伝子
（succinyl-AMP synthase遺伝子）、guaB遺伝子（IMP dehydrogenase遺伝子）、およびguaA遺伝子（GMP synthase遺伝子）の欠失により、PH10株を取得した。Pantoea ananatis AJ13355のdeoD遺伝子（PAJ_2545）の塩基配列および同遺伝子がコードするDeoDタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１７および１８に示す。Pantoea ananatis AJ13355のadd遺伝子（PAJ_1166）の塩基配列および同遺伝子がコードするAddタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１９および２０に示す。Pantoea ananatis AJ13355のpurA遺伝子（PAJ_2759）の塩基配列および同遺伝子がコードするPurAタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２１および２２に示す。Pantoea ananatis AJ13355のguaB遺伝子（PAJ_2137）の塩基配列および同遺伝子がコードするGuaBタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２３および２４に示す。Pantoea ananatis AJ13355のguaA遺伝子（PAJ_2135）の塩基配列および同遺伝子がコードするGuaAタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２５および２６に示す。遺伝子を欠失させる方法は後述する。

（２）Pantoea ananatis PH11株の取得
Pantoea ananatis PH10株を親株として、PAJ_3461遺伝子、PAJ_3462遺伝子、およびPAJ_3463遺伝子（gluconate-2-dehydrogenaseの３つのサブユニット遺伝子）の欠失により、PH11株を取得した。遺伝子を欠失させる方法は後述する。

（３）遺伝子を欠失させる方法
（３－１）遺伝子欠失用のPCR断片の調製
λattL-ARM-λattR構造（「ARM」は抗生物質耐性マーカー遺伝子である）を含むプラスミド（WO2005/010175およびWO2008/090770）またはλattL-ARM-λattR構造を含む染色体DNA（Joanna I Katashkina et al., Use of the lambda Red-recombineering method for genetic engineering of Pantoea ananatis, BMC Mol Biol, doi: 10.1186/1471-2199-10-34.）を鋳型として、欠失させる遺伝子に対応するプライマーを用いてPCRを行うことに
より、欠失させる遺伝子の上流配列と下流配列の間にλattL-ARM-λattRが挟まった構造
を有するPCR断片を取得した。プライマーと欠失させる遺伝子と抗生物質耐性マーカー遺
伝子の組み合わせを表１に示す。

（３－２）λ-red法による遺伝子の欠失
SC17(0)/RSFred spc株（WO2015/005405）を50 mg/L Spc（スぺクチノマイシン）含有のLB培地に接種し、34 ℃、120 rpmで一晩振とう培養して前培養液を得た。次に、坂口フラスコ内の1 mM IPTGと50 mg/L Spc含有のSOB培地50 mLに前培養液を0.5 mL接種し、3時間
培養した。得られた培養液を冷却遠心機で集菌し、氷冷した10 ％グリセロールで3度洗浄することで、コンピテントセルを調製した。続いて、エレクトロポーレーション法により、遺伝子欠失用のPCR断片をコンピテントセルに導入した。LB培地またはLBGA培地を添加
して34℃で1時間回復培養をした後、培養液を適切な抗生物質を含むLB寒天培地またはLBGA寒天培地に塗布した。遺伝子欠失株を抗生物質耐性株として取得した。

（３－３）ゲノム導入による遺伝子の欠失
上記（３－２）で得られた遺伝子欠失株からゲノム抽出キットPurElute^TM Bacterial Genomic Kit（EdgeBio社）を用いてゲノムの抽出を行った。次に、遺伝子欠失を導入した
い株を寒天培地で一晩培養し、生育したプレートから菌体をかき取って10 %グリセロールで3度洗浄することで、コンピテントセルを調製した。続いて、エレクトロポーレーショ
ン法により、遺伝子欠失株のゲノムをコンピテントセルに導入した。LB培地またはLBGA培地を添加して34 ℃で1 時間回復培養をした後、培養液を適切な抗生物質を含むLB寒天培
地またはLBGA寒天培地に塗布した。遺伝子欠失株を抗生物質耐性株として取得した。

（３－４）ヘルパープラスミドpMW-intxis-sacB(Spc)を用いたマーカー除去
染色体に導入した抗生物質耐性マーカー遺伝子を除去するために、上記（３－３）で得られた遺伝子欠失株にλファージのint-xis遺伝子を発現させるためのヘルパープラスミ
ドpMW-intxis-sacB(Spc)（WO2015/005405A1）をエレクトロポーレーション法によって導
入し、50 mg/L Spcを含むLB培地またはLBGA培地を用いて30℃でコロニーを形成させた。
その後、Spcを含まず、10 % Sucroseおよび1 mM IPTGを含むLB培地またはLBGA培地を用いて34℃で単コロニー分離を行い、抗生物質（Spcと染色体に導入した抗生物質耐性マーカ
ー遺伝子に対応する抗生物質）への感受性により、pMW-intxis-sacB(Spc)と染色体上の抗生物質耐性マーカー遺伝子が脱落した株を取得した。

（４）使用した培地
LB培地（表２）
LBGA培地（表３）
イノシン生産培地（表４）

（５）Pantoea ananatis PH11株によるイノシン生産
Pantoea ananatis PH11株およびPH10株をグリセロールストックからLBGA寒天培地にリ
フレッシュし、34℃で一晩培養した。次に、0.15 g/本の炭酸カルシウムを入れた太試験
管にイノシン生産培地を5 mL張り込み、そこにプレートから１エーゼ分の菌体を接種し、34℃、120 rpmで一晩振とう培養した。培養上清中のイノシン量および2-ケトグルコン酸
量を測定した。

結果を表５に示す。GlcNDH遺伝子（PAJ_3461、PAJ_3462、およびPAJ_3463）の欠損によりイノシン生産が向上した。よって、PAJ_3461タンパク質、PAJ_3462タンパク質、および／またはPAJ_3463タンパク質の活性低下によりイノシン等のプリン系物質の生産が向上す
ることが明らかとなった。

〔配列表の説明〕
配列番号１：P. ananatis AJ13355のPAJ_3461遺伝子の塩基配列
配列番号２：P. ananatis AJ13355のPAJ_3461タンパク質のアミノ酸配列
配列番号３：P. ananatis AJ13355のPAJ_3462遺伝子の塩基配列
配列番号４：P. ananatis AJ13355のPAJ_3462タンパク質のアミノ酸配列
配列番号５：P. ananatis AJ13355のPAJ_3463遺伝子の塩基配列
配列番号６：P. ananatis AJ13355のPAJ_3463タンパク質のアミノ酸配列
配列番号７～１６：プライマー
配列番号１７：P. ananatis AJ13355のdeoD遺伝子の塩基配列
配列番号１８：P. ananatis AJ13355のDeoDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１９：P. ananatis AJ13355のadd遺伝子の塩基配列
配列番号２０：P. ananatis AJ13355のAddタンパク質のアミノ酸配列
配列番号２１：P. ananatis AJ13355のpurA遺伝子の塩基配列
配列番号２２：P. ananatis AJ13355のPurAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号２３：P. ananatis AJ13355のguaB遺伝子の塩基配列
配列番号２４：P. ananatis AJ13355のGuaBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号２５：P. ananatis AJ13355のguaA遺伝子の塩基配列
配列番号２６：P. ananatis AJ13355のGuaAタンパク質のアミノ酸配列

Claims (15)

1. プリン系物質の製造方法であって、
   プリン系物質生産能を有する腸内細菌科（Enterobacteriaceae）に属する細菌を培地で培養し、該培地中および／または該細菌の菌体内にプリン系物質を蓄積すること、および
   前記培地および／または前記菌体より前記プリン系物質を採取すること、
   を含み、
   前記細菌が、下記（A）～（C）の改変から選択される１つまたはそれ以上の改変を有する、方法：
   （A）PAJ_3461タンパク質の活性が低下する改変；
   （B）PAJ_3462タンパク質の活性が低下する改変；
   （C）PAJ_3463タンパク質の活性が低下する改変。
2. 前記プリン系物質が、プリンヌクレオシドおよびプリンヌクレオチドからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
3. 前記プリン系物質が、イノシン、キサントシン、グアノシン、およびアデノシンからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
4. 前記プリン系物質が、イノシン酸、キサンチル酸、グアニル酸、およびアデニル酸からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
5. プリンヌクレオチドの製造方法であって、
   プリンヌクレオシド生産能を有する腸内細菌科（Enterobacteriaceae）に属する細菌を培地で培養し、該培地中および／または該細菌の菌体内にプリンヌクレオシドを蓄積すること、
   前記プリンヌクレオシドをリン酸化しプリンヌクレオチドを生成すること、および
   前記プリンヌクレオチドを採取すること、
   を含み、
   前記細菌が、下記（A）～（C）の改変から選択される１つまたはそれ以上の改変を有する、方法：
   （A）PAJ_3461タンパク質の活性が低下する改変；
   （B）PAJ_3462タンパク質の活性が低下する改変；
   （C）PAJ_3463タンパク質の活性が低下する改変。
6. 前記プリンヌクレオシドが、イノシン、キサントシン、グアノシン、およびアデノシンからなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
7. 前記プリンヌクレオチドが、イノシン酸、キサンチル酸、グアニル酸、およびアデニル酸からなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
8. 前記細菌が、前記（A）～（C）の改変を有する、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
9. 請求項１～７のいずれか一項に記載の方法であって、
   前記PAJ_3461タンパク質の活性が、PAJ_3461遺伝子の発現を低下させることにより、または該遺伝子を破壊することにより、低下し；
   前記PAJ_3462タンパク質の活性が、PAJ_3462遺伝子の発現を低下させることにより、または該遺伝子を破壊することにより、低下し；且つ／又は
   前記PAJ_3463タンパク質の活性が、PAJ_3463遺伝子の発現を低下させることにより、ま
   たは該遺伝子を破壊することにより、低下した、方法。
10. 請求項９に記載の方法であって、
    前記PAJ_3461遺伝子の発現が、PAJ_3461遺伝子の発現調節配列の改変により、低下し；
    前記PAJ_3462遺伝子の発現が、PAJ_3462遺伝子の発現調節配列の改変により、低下し；且つ／又は
    前記PAJ_3463遺伝子の発現が、PAJ_3463遺伝子の発現調節配列の改変により、低下した、方法。
11. 請求項１～７のいずれか一項に記載の方法であって、
    前記PAJ_3461タンパク質の活性が、PAJ_3461遺伝子の欠失により、低下し；
    前記PAJ_3462タンパク質の活性が、PAJ_3462遺伝子の欠失により、低下し；且つ／又は
    前記PAJ_3463タンパク質の活性が、PAJ_3463遺伝子の欠失により、低下した、方法。
12. 請求項１～７のいずれか一項に記載の方法であって、
    前記PAJ_3461タンパク質が、下記（１ａ）、（１ｂ）、または（１ｃ）に記載のタンパク質であり：
    （１ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
    （１ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、グルコン酸－２－デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質；
    （１ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、グルコン酸－２－デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質；
    前記PAJ_3462タンパク質が、下記（２ａ）、（２ｂ）、または（２ｃ）に記載のタンパク質であり：
    （２ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
    （２ｂ）配列番号４に示すアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、グルコン酸－２－デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質；
    （２ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、グルコン酸－２－デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質；且つ／又は
    前記PAJ_3463タンパク質が、下記（３ａ）、（３ｂ）、または（３ｃ）に記載のタンパク質である、方法：
    （３ａ）配列番号６に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
    （３ｂ）配列番号６に示すアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、グルコン酸－２－デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質；
    （３ｃ）配列番号６に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、グルコン酸－２－デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質；
13. 前記細菌が、パントエア（Pantoea）属細菌である、請求項１～７のいずれか一項に記
    載の方法。
14. 前記細菌が、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記リン酸化が、前記プリンヌクレオシドおよびリン酸供与体にプリンヌクレオチドを生成する能力を有する微生物またはリン酸化酵素を作用させることにより実施される、請求項５～７のいずれか一項に記載の方法。