CN117802187A

CN117802187A - 嘌呤类物质的制造方法

Info

Publication number: CN117802187A
Application number: CN202311275652.1A
Authority: CN
Inventors: N·P·扎卡塔埃娃; Y·G·罗斯托娃; 林和之; V·S·斯克里普尼科娃
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2022-09-30
Filing date: 2023-09-28
Publication date: 2024-04-02
Also published as: JP2024052596A; KR20240046411A

Abstract

本发明提供一种肌苷等嘌呤类物质的制造方法。本发明中，将具有嘌呤类物质生产能力并且属于肠杆菌科的细菌在培养基中培养，并从该培养基和/或该细菌的菌体中采集嘌呤类物质，从而制造嘌呤类物质，其中，所述细菌被修饰为具有选自下述(A)～(C)的修饰中的一种或一种以上的修饰：(A)PAJ_3461蛋白的活性降低的修饰；(B)PAJ_3462蛋白的活性降低的修饰；(C)PAJ_3463蛋白的活性降低的修饰。

Description

嘌呤类物质的制造方法

技术领域

本发明涉及一种通过使用了细菌的发酵法来制造肌苷等嘌呤类物质的方法。嘌呤类物质作为调味料原料等在工业上是有用的。

背景技术

嘌呤类物质例如通过使用了具有嘌呤类物质生产能力的细菌等微生物的发酵法而进行工业生产。作为这样的微生物，例如，会使用从自然界中分离的菌株、或它们的突变株。此外，可以通过重组DNA技术使微生物的嘌呤类物质生产能力提高。

PAJ_3461基因、PAJ_3462基因和PAJ_3463基因所编码的PAJ_3461蛋白、PAJ_3462蛋白和PAJ_3463蛋白分别已知为构成葡萄糖酸-2-脱氢酶(gluconate2-dehydrogenase)的亚基。

发明内容

发明所要解决的技术问题

本发明的技术问题在于开发一种提高细菌的嘌呤类物质生产能力的新技术，提供一种高效的嘌呤类物质的制造方法。

解决技术问题的手段

本发明人为了解决所述技术问题进行了深入研究，结果发现，通过以具有选自下述(A)～(C)的修饰中的1种或1种以上的修饰的方式修饰属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的细菌，能够提高该细菌的嘌呤类物质生产能力，从而完成了本发明：

(A)PAJ_3461蛋白的活性降低的修饰；

(B)PAJ_3462蛋白的活性降低的修饰；

(C)PAJ_3463蛋白的活性降低的修饰。

即，本发明可以例举如下。

[1]一种嘌呤类物质的制造方法，其包含：

在培养基中培养具有嘌呤类物质生产能力并且属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的细菌，在该培养基中和/或该细菌的菌体内蓄积嘌呤类物质；以及

从所述培养基和/或所述菌体中采集所述嘌呤类物质，

在所述制造方法中，所述细菌具有选自下述(A)～(C)的修饰中的一种或一种以上的修饰：

(A)PAJ_3461蛋白的活性降低的修饰；

(B)PAJ_3462蛋白的活性降低的修饰；

(C)PAJ_3463蛋白的活性降低的修饰。

[2]根据所述(具体而言，[1]所述的)方法，其中，

所述嘌呤类物质选自嘌呤核苷和嘌呤核苷酸。

[3]根据所述(具体而言，[1]或[2]所述的)方法，其中，

所述嘌呤类物质选自肌苷、黄苷、鸟苷和腺苷。

[4]根据所述(具体而言，[1]～[3]中任一项所述的)方法，其中，

所述嘌呤类物质选自肌苷酸、黄苷酸、鸟苷酸和腺苷酸。

[5]一种嘌呤核苷酸的制造方法，其包含：

在培养基中培养具有嘌呤核苷生产能力并且属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的细菌，在该培养基中和/或该细菌的菌体内蓄积嘌呤核苷；

将所述嘌呤核苷磷酸化而生成嘌呤核苷酸；以及

采集所述嘌呤核苷酸，

(A)PAJ_3461蛋白的活性降低的修饰；

(B)PAJ_3462蛋白的活性降低的修饰；

(C)PAJ_3463蛋白的活性降低的修饰。

[6]根据所述(具体而言，[5]所述的)方法，其中，

所述嘌呤核苷选自肌苷、黄苷、鸟苷和腺苷。

[7]根据所述(具体而言，[5]或[6]所述的)方法，其中，

所述嘌呤核苷酸选自肌苷酸、黄苷酸、鸟苷酸和腺苷酸。

[8]根据所述(具体而言，[1]～[7]中任一项所述的)方法，其中，

所述细菌具有所述(A)～(C)的修饰。

[9]根据所述(具体而言，[1]～[8]中任一项所述的)方法，其中，

所述PAJ_3461蛋白的活性通过降低PAJ_3461基因的表达或破坏该基因而降低；

所述PAJ_3462蛋白的活性通过降低PAJ_3462基因的表达或破坏该基因而降低；并且/或者

所述PAJ_3463蛋白的活性通过降低PAJ_3463基因的表达或破坏该基因而降低。

[10]根据所述(具体而言，[7]所述的)方法，其中，

所述PAJ_3461基因的表达通过修饰PAJ_3461基因的表达调节序列而降低；

所述PAJ_3462基因的表达通过修饰PAJ_3462基因的表达调节序列而降低；并且/或者

所述PAJ_3463基因的表达通过修饰PAJ_3463基因的表达调节序列而降低。

[11]根据所述(具体而言，[1]～[10]中任一项所述的)方法，其中，

所述PAJ_3461蛋白的活性通过PAJ_3461基因的缺失而降低；

所述PAJ_3462蛋白的活性通过PAJ_3462基因的缺失而降低；并且/或者

所述PAJ_3463蛋白的活性通过PAJ_3463基因的缺失而降低。

[12]根据所述(具体而言，[1]～[11]中任一项所述的)方法，其中，

所述PAJ_3461蛋白为下述(1a)、(1b)或(1c)所述的蛋白质：

(1a)包含SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的蛋白质；

(1b)包含在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中含有1～10个氨基酸残基的替换、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列，并且具有葡萄糖酸-2-脱氢酶活性的蛋白质；

(1c)包含与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列，并且具有葡萄糖酸-2-脱氢酶活性的蛋白质，

所述PAJ_3462蛋白为下述(2a)、(2b)或(2c)所述的蛋白质：

(2a)包含SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列的蛋白质；

(2b)包含在SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列中含有1～10个氨基酸残基的替换、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列，并且具有葡萄糖酸-2-脱氢酶活性的蛋白质；

(2c)包含与SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列，并且具有葡萄糖酸-2-脱氢酶活性的蛋白质，并且/或者

所述PAJ_3463蛋白为下述(3a)、(3b)或(3c)所述的蛋白质：

(3a)包含SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列的蛋白质；

(3b)包含在SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列中含有1～10个氨基酸残基的替换、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列，并且具有葡萄糖酸-2-脱氢酶活性的蛋白质；

(3c)包含与SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列，并且具有葡萄糖酸-2-脱氢酶活性的蛋白质。

[13]根据所述(具体而言，[1]～[12]中任一项所述的)方法，其中，

所述细菌为泛菌(Pantoea)属细菌。

[14]根据所述(具体而言，[1]～[13]中任一项所述的)方法，其中，

所述细菌为菠萝泛菌(Pantoea ananatis)。

[15]根据所述(具体而言，[5]～[14]中任一项所述的)方法，其中，

所述磷酸化通过使具有生成嘌呤核苷酸的能力的微生物或磷酸化酶作用于所述嘌呤核苷和磷酸供体来实施。

发明效果

根据本发明，能够提高细菌的嘌呤类物质生产能力，能够高效地制造嘌呤类物质。

具体实施方式

下文中将对本发明进行详细描述。

本发明的方法的一个方式涉及一种嘌呤类物质的制造方法，其包含：将具有嘌呤类物质生产能力并且属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的细菌在培养基中培养，在该培养基中和/或该细菌的菌体内蓄积嘌呤类物质；以及从所述培养基和/或所述菌体采集所述嘌呤类物质，所述制造方法中，所述细菌被修饰为具有特定的性质。也将该方式称为“本发明的嘌呤类物质的制造方法。”该方法中使用的细菌也称为“本发明的细菌”。

当本发明的细菌具有嘌呤核苷生产能力作为嘌呤类物质生产能力时，可以由本发明的细菌制造嘌呤核苷，接着由该嘌呤核苷制造嘌呤核苷酸。即，本发明的方法的另一方式涉及一种嘌呤核苷酸的制造方法，其包含：在培养基中培养具有嘌呤核苷生产能力并且属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的细菌，在该培养基中和/或该细菌的菌体内蓄积嘌呤核苷；将所述嘌呤核苷磷酸化而生成嘌呤核苷酸；以及采集所述嘌呤核苷酸，其中，所述细菌被修饰为具有特定性质。该方式也称为“本发明的嘌呤核苷酸的制造方法”。

<1>本发明的细菌

本发明的细菌是以使其具有特定的性质的方式进行了修饰的、具有嘌呤类物质生产能力并且属于肠杆菌科的细菌。

<1-1>具有嘌呤类物质生产能力的细菌

在本发明中，“具有嘌呤类物质生产能力的细菌”是指，具有在用培养基培养时，生成作为目标的嘌呤类物质，并在培养基中和/或菌体内蓄积到能够回收的程度的能力的细菌。具有嘌呤类物质生产能力的细菌可以是能够使作为目标的嘌呤类物质以比非修饰株更多的量蓄积在培养基中和/或菌体内的细菌。“非修饰株”是指，未以具有特定的性质的方式进行修饰的对照株。即，作为非修饰株，可举出野生株、亲本株。此外，具有嘌呤类物质生产能力的细菌可以优选为能够使0.5g/L以上，更优选为能够使1.0g/L以上的量的作为目标的嘌呤类物质蓄积在培养基的细菌。

作为嘌呤类物质可举出嘌呤核苷和嘌呤核苷酸。作为嘌呤核苷，可举出：肌苷、鸟苷、黄苷和腺苷。作为嘌呤核苷酸，可举出：嘌呤核苷的5’-磷酸酯。作为嘌呤核苷的5’-磷酸酯，可举出：肌苷酸(肌苷-5’-磷酸酯；IMP)、鸟苷酸(鸟苷-5’-磷酸酯；GMP)、黄苷酸(黄苷-5’-磷酸酯；XMP)和腺苷酸(腺苷-5’-磷酸酯；AMP)。本发明的细菌可以具有一种嘌呤类物质的生产能力，也可以具有两种或两种以上的嘌呤类物质的生产能力。本发明的细菌可以具有例如生产1种或1种以上的嘌呤核苷的能力。本发明的细菌可以具有例如生产1种或1种以上的嘌呤核苷酸的能力。

当嘌呤类物质为可形成盐的物质(例如，嘌呤核苷酸)时，在本发明中，除非另有说明，则术语“嘌呤类物质”是指游离体的嘌呤类物质、其盐或其混合物。关于盐在下文中叙述。

作为属于肠杆菌科的细菌，可举出属于埃希氏菌(Escherichia)属、肠杆菌(Enterobacter)属、泛菌(Pantoea)属、克雷伯氏菌(Klebsiella)属、沙雷氏菌(Serr atia)属、欧文氏菌(Erwinia)属、光杆状菌(Photorhabdus)属、普罗威登斯菌(Pr ovidencia)属、沙门氏菌(Salmonella)属、摩根氏菌(Morganella)等属的细菌。具体而言，可使用通过NCBI(National Center for Biotechnology Information)的数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi？id＝91347)中使用的分类法而被分类为肠杆菌科的细菌。

作为埃希氏菌属细菌，没有特别限定，可举出通过微生物学专家所知的分类被分类为埃希氏菌属的细菌。作为埃希氏菌属细菌，例如可举出Neidhar dt等的著书(Backmann,B.J.1996.Derivations and Genotypes of some mut ant derivatives ofEscherichia coli K-12,p.2460-2488.Table 1.In F.D.Neidhardt(ed.),Escherichiacoli and Salmonella Cellular and Molecular Biolog y/Second Edition,AmericanSociety for Microbiology Press,Washington,D.C.)中记载的细菌。作为埃希氏菌属细菌，例如可举出大肠杆菌(Escherichia coli)。作为大肠杆菌，具体而言，例如可举出W3110株(ATCC 27325)、MG1655株(ATCC 47076)等大肠杆菌K-12株；大肠杆菌K5株(ATCC 23506)；BL21(DE3)株等大肠杆菌B株；和这些的衍生菌株。

作为肠杆菌属细菌，没有特别限制，可举出根据微生物学的专家已知的分类而分类为肠杆菌属的细菌。作为肠杆菌属细菌，例如可举出成团肠杆菌(Enterobacteragglomerans)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)。作为成团肠杆菌，具体而言，例如可举出成团肠杆菌ATCC12287株。作为产气肠杆菌，具体而言，例如可举出产气肠杆菌ATCC13048株、NBRC12010株(Biotechonol Bioeng.2007Mar 27；98(2)340-348)、AJ110637株(FERM BP-10955)。此外，作为肠杆菌属细菌，例如可举出欧州专利申请公开EP0952221号说明书中记载的细菌。需要说明的是，成团肠杆菌中也存在被分类为成团泛菌的细菌。

作为泛菌属细菌，没有特别限定，可举出根据微生物学的专家已知的分类而分类为泛菌属的细菌。作为泛菌属细菌，例如可举出菠萝泛菌(Pantoea ananatis)、斯氏泛菌(Pantoea stewartii)、成团泛菌(Pantoea agglomerans)、柠檬泛菌(Pantoea citrea)。作为菠萝泛菌，具体而言，例如可举出菠萝泛菌LMG20103株、AJ13355株(FERM BP-6614)、AJ13356株(FERM BP-6615)、AJ13601株(FERM BP-7207)、SC17株(FERM BP-11091)、SC17(0)株(VKPM B-9246)和SC17sucA株(FERM BP-8646)。需要说明的是，肠杆菌属细菌、欧文氏菌属细菌中存在被再分类为泛菌属的(Int.J.Syst.Bacteriol.,39,337-345(1989)；Int.J.Syst.Bacteriol.,43,162-173(1993))。例如，最近成团肠杆菌的某些细菌基于16SrRNA的碱基序列分析等，被再分类为成团泛菌、菠萝泛菌、斯氏泛菌等(Int.J.Syst.Bacteriol.,39,337-345(1989))。本发明中，泛菌属细菌中也包含这样被再分类为泛菌属的细菌。

FERM BP-6614菌株于1998年2月19日被保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(现为NITE国际专利微生物保藏中心，邮编292-0818，地址：日本千叶县木更津市上总镰足2-5-8 120号室)，并于1999年1月11日基于布达佩斯条约而被移交至国际保藏中心，并被赋予保藏编号FER M BP-6614。

作为欧文氏菌属细菌，可举出解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)、软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)。作为克雷伯氏菌属细菌，可举出植生克雷伯氏菌(Klebsiellaplanticola)。

需要说明的是，属于肠杆菌科的细菌近年来通过总括性的比较基因组分析被再分类为多个科(Adelou M.et al.,Genome-based phylogeny and taxono my of the‘Enterobacteriales’:proposal for Enterobacterales ord.nov.dividedinto thefamilies Enterobacteriaceae,Erwiniaceae fam.nov.,Pectobacteriacea e fam.nov.,Yersiniaceae fam.nov.,Hafniaceae fam.nov.,Morganellaceae fam.nov.,andBudviciaceae fam.nov.,Int.J.Syst.Evol.Microbiol.,2016,66:5575-5599)。然而，本说明书中，以往被分类为肠杆菌科的细菌作为属于肠杆菌科的细菌来处理。即，泛菌属细菌等所述例示的细菌不依赖于当前的分类，而作为属于肠杆菌科的细菌来处理。

这些菌株例如可以从美国典型培养物保藏中心(American type culture collection，ATCC)(地址12301Parklawn Drive,Rockville,Maryland 20852P.O.Box 1549,Manassas,VA20108,United States of America)处订购。即各菌株被赋予了对应的登录编号，可以利用该登录编号来订购(参照http://www.atcc.org/)。与各菌株对应的登录编号记载在美国典型培养物保藏中心的目录中。此外，这些菌株例如可以从寄存有各菌株的寄存机关处获得。

本发明的细菌可以是本来就具有嘌呤类物质生产能力的细菌，也可以是以使其具有嘌呤类物质生产能力的方式进行了修饰的细菌。具有嘌呤类物质生产能力的细菌例如，可以通过对如上所述的细菌赋予嘌呤类物质生产能力，或者使如上所述的细菌的嘌呤类物质生产能力增强而取得。

嘌呤类物质生产能力的赋予或增强可以通过以往在芽孢杆菌属细菌、埃希氏菌属细菌等嘌呤类物质生产菌的育种中使用的方法进行。

例如，可以通过赋予腺嘌呤缺陷型等营养缺陷型，或者进一步赋予对嘌呤类似物或磺胺胍等药剂的抗性，来赋予或增强嘌呤类物质生产能力(参照日本特公昭38-23099、日本特公昭54-17033、日本特公昭55-45199、日本特公昭57-14160、日本特公昭57-41915、日本特开昭59-42895、US2004-0166575A)。具有嘌呤类物质生产能力的营养缺陷株、耐药株等突变株，可以通过将亲本株或野生株供于突变处理，使用适当的选择培养基选择具有期望表型的突变株而得到。作为突变处理，例如可举出X射线照射、紫外线照射、利用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、甲基磺酸乙酯(EMS)、甲基磺酸甲酯(MMS)等诱变剂的处理。

此外，可以通过增强参与嘌呤类物质生物合成的酶在细胞内的活性来赋予或增强嘌呤类物质的生产能力。可以增强1种酶的活性，也可以增强2种或2种以上的酶的活性。增强酶活性，例如，可以通过增强编码相同酶的基因的表达从而修饰细菌来进行。增强基因表达的方法记载于WO00/18935、EP1010755A等。下文描述了增强酶活性的方法。

嘌呤核苷酸是以磷酸核糖焦磷酸(phosphoribosylpyrophosphate；PRPP)作为中间产物而生物合成的。嘌呤核苷是通过将嘌呤核苷酸脱磷酸化而生物合成的。作为参与这类嘌呤类物质生物合成的酶，例如可举出PRPP合成酶(PRPP synthetase)(prs)或嘌呤操纵子所编码的蛋白质。需要说明的是，括号内是编码所述酶的基因的缩写(下文的记载中也相同)。但是，基因名称(基因的缩写)只是一个实例，根据生物种类不同，有时会存在基因名称不同、以及不具有该基因的情况。

作为嘌呤操纵子，例如可举出：枯草芽孢杆菌的purEKBCSQLFMNHD操纵子(Bacillus subtilis and Its Closest Relatives,Editor in Chief:A.L.Sonenshein,ASM Press,Washington D.C.,2002)、大肠杆菌的pur调节子(Escherichia andSalmonella,Second Edition,Editor in Chief:F.C.Neidhardt,ASMPress,WashingtonD.C.,1996)。例如，可以整体增强嘌呤操纵子的表达，也可以增强选自嘌呤操纵子中包含的基因中的1个或1个以上基因的表达。

其中，例如，优选增强选自PRPP合成酶(PRPP synthetase)(prs)和PRPP酰胺转移酶(PRPP amidotransferase)(purF)的1种或1种以上的酶的活性。

需要说明的是，例如，当参与嘌呤类物质的生物合成的酶受到反馈抑制、表达抑制等负调控时，可通过降低或消除所述调控来增强酶活性，提高嘌呤类物质的生产能力(WO99/003988)。

嘌呤操纵子的表达被purR基因编码的嘌呤阻遏物抑制。因此，可以通过例如降低嘌呤阻遏物的活性，增强嘌呤操纵子的表达(美国专利第6284495号)。例如，通过破坏编码嘌呤阻遏物的purR基因，可以降低嘌呤阻遏物的活性(美国专利第6284495号)。此外，嘌呤操纵子的表达受位于启动子下游的终止子-抗终止子(terminator-antiterminator)序列(也称为弱化子序列)控制(Ebbo le,D.J.and Zalkin,H.,J.Biol.Chem.,1987,262,8274-8287，Ebbole,D.J.and Zalkin,H.,J.Biol.Chem.,1988,263,10894-10902，Ebbole,D.J.and Zalkin,H.,J.Bacteriol.,1989,171,2136-2141)。因此，嘌呤操纵子的表达例如可以通过使弱化子序列缺失来增强。弱化子序列的缺失可以通过与下述的基因的破坏相同的方法来进行。

PRPP合成酶受ADP的反馈抑制。因此，例如可以通过使细菌保有编码降低或消除了ADP产生的反馈抑制的脱敏型PRPP合成酶的突变型PRPP合成酶基因，来增强PRPP合成酶活性，提高嘌呤类物质的生产能力(WO99/003988)。作为脱敏型PRPP合成酶，可举出具有将野生型PRPP合成酶的第128位Asp(D)替换为Ala(A)的突变的(S.G.Bower et al.,J.Biol.Chem.,264,10287(1989))。

PRPP酰胺转移酶受AMP和GMP的反馈抑制。因此，例如可以通过使细菌保有编码降低或消除了AMP和/或GMP产生的反馈抑制的脱敏型PRPP酰胺转移酶的突变型PRPP酰胺转移酶基因，来增强PRPP酰胺转移酶活性，提高嘌呤类物质的生产能力(WO99/003988)。作为脱敏型PRPP酰胺转移酶，可举出具有以下突变的：将野生型PRPP酰胺转移酶的第326位的Lys(K)替换为Gln(Q)的突变、将野生型PRPP酰胺转移酶的第326位的Lys(K)替换为Gln(Q)且将第410位的Pro(P)替换为Trp(W)的突变(G.Zhou et al.,J.Biol.Chem.,269,6784(1994))。

此外，可通过降低从嘌呤类物质的生物合成途径分支出来而生成其他化合物的反应中作为催化剂的酶的活性，赋予或增强嘌呤类物质的生产能力(WO99/003988)。可以降低1种酶的活性，也可以降低2种或2种以上的酶的活性。需要说明的是，这里所谓的“从嘌呤类物质的生物合成途径分支出来生成其他化合物的反应中作为催化剂的酶”中，也包含参与分解嘌呤类物质的酶。下文将描述降低酶活性的方法。

从嘌呤类物质的生物合成途径分支出来生成其他化合物的反应中作为催化剂的酶，例如可举出：嘌呤核苷磷酸化酶(purine nucleoside phosphorylase)(deoD,pupG)、琥珀酰-AMP合酶(succinyl-AMP synthase)(purA)、腺苷脱氨酶(adenosine deaminase)(add)、肌苷-鸟苷激酶(inosine-guanosine kinase)(gsk)、GMP还原酶(GMP reductase)(guaC)、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6-phosphogluconate dehydrase)(edd)、磷酸葡萄糖异构酶(phophoglucose isomerase)(pgi)、腺嘌呤脱氨酶(adenine deaminase)(yicP)、黄苷磷酸化酶(xanthosine phosphorylase)(xapA)、IMP脱氢酶(IMP dehydrogenase)(guaB)。琥珀酰-AMP合酶(succinyl-AMP synthase)也被称为腺苷酸琥珀酸合成酶(adenylosuccinate synthetase)等。GMP合酶(GMP synthase)也被称为GMP合成酶(GMPsynthetase)等。可以根据目标嘌呤类物质的种类等选择使活性降低的酶。例如，可以降低选自嘌呤核苷磷酸化酶(purine nucleoside phosphorylase)、腺苷脱氨酶(adenosinedeaminase)、琥珀酰-AMP合酶(succinyl-AMP synthase)、IMP脱氢酶(IMP dehydrogenase)和GMP合酶(GMP synthase)中的一种或一种以上、例如全部的酶的活性。具体而言，例如，当嘌呤类物质为肌苷时，可以降低选自嘌呤核苷磷酸化酶(purine nucleosidephosphorylase)、腺苷脱氨酶(adenosine deaminase)、琥珀酰-AMP合酶(succinyl-AMPsynthase)、IMP脱氢酶(IMP dehydrogenase)和GMP合酶(GMP synthase)中的一种或一种以上、例如全部的酶的活性。

此外，可以通过降低果糖-1,6-二磷酸酶(fructose 1,6-bisphosphatase)(fbp)的活性，赋予或增强嘌呤类物质的生产能力(WO2007/125782)。

此外，可通过降低参与吸收嘌呤类物质的蛋白质的活性，赋予或增强嘌呤类物质生产能力(WO99/003988)。例如，作为参与吸收嘌呤核苷的蛋白质，可举出核苷透酶(nucleoside permease)(nupG)(WO99/003988)。

此外，可通过增强参与分泌嘌呤类物质的蛋白质的活性，赋予或增强嘌呤类物质生产能力。例如，作为参与分泌嘌呤核苷的蛋白质，可举出rhtA(ybiF)基因(俄罗斯专利第2239656号)、yijE基因(俄罗斯专利第2244003号)、ydeD基因(俄罗斯专利第2244004号)、yicM基因(俄罗斯专利第2271391号)、ydhL基因(日本特表2007-530011)、nepI基因(FEMSMicrobiology Letters,Volume 250,Issue 1,pages 39-47,September 2005)编码的蛋白质。

此外，通过修饰细菌以保持突变型yggB基因，可以赋予或增强嘌呤类物质生产能力(日本特开2015-029474)。

此外，可以通过赋予细菌对L-谷氨酰胺类似物的抗性和对脯氨酸类似物的抗性，赋予或增强肌苷酸生产能力(日本特开2004-516833)。作为L-谷氨酰胺类似物，可举出：重氮丝氨酸或6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸(DON)。作为脯氨酸类似物，可举出：3,4-脱氢脯氨酸、L-吖丁啶-2-羧酸、L-噻唑烷-4-羧酸、(S)-2,2-二甲基-4-噁唑烷羧酸、(S)-5,5-二甲基-4-噻唑烷羧酸、(4S,2RS)-2-乙基-4-噻唑烷-羧酸、(2S,4S)-4-羟基-2-吡咯烷羧酸、2-哌啶羧酸以及2,5-吡咯烷二酮。

此外，黄苷酸生产能力可以通过增强PRPP酰胺转移酶活性(日本特开平8-168383)、赋予对脂肪族氨基酸的抗性(日本特开平4-262790)、或赋予对脱氢脯氨酸的抗性(韩国专利公开公报2003-56490)来赋予或增强。

所述赋予或增强嘌呤类物质生产能力的方法可以单独使用，也可以任意组合的使用。

嘌呤类物质生产菌的育种中使用的基因和蛋白质分别例如可以具有所述例示的基因和蛋白质等公知的基因和蛋白质的碱基序列和氨基酸序列。此外，嘌呤类物质生产菌的育种中使用的基因和蛋白质分别可以为所述例示的基因和蛋白质等公知的基因和蛋白质的保守变体。具体而言，例如，只要保持有原来的功能，则嘌呤类物质生产菌的育种中使用的基因可以是编码具有在公知的蛋白质的氨基酸序列中，在1个或者数个位置处置换、缺失、插入或添加有1个或数个氨基酸的氨基酸序列的蛋白质的基因。嘌呤类物质生产菌的育种中使用的基因可以根据所使用的宿主的密码子使用频率进行修饰以具有最佳的密码子。对于基因和蛋白质的保守变体，可以准用后述关于靶基因和靶蛋白的保守变体的记载。

<1-2>特定的性质

本发明的细菌以使其具有特定的性质的方式进行了修饰。本发明的细菌可以通过将具有嘌呤类物质生产能力的细菌修饰为具有特定的性质而取得。此外，本发明的细菌也可以通过在以使其具有特定的性质的方式对细菌进行了修饰后，赋予或增强嘌呤类物质生产能力而取得。需要说明的是，本发明的细菌可以是通过以使其具有特定的性质的方式进行了修饰而获得了嘌呤类物质生产能力的细菌。本发明的细菌也可以是在以使其具有特定的性质的方式进行了修饰之外，例如，适宜具有如上所述的嘌呤类物质生产菌所具有的性质。用于构建本发明的细菌的修饰可以以任意的顺序进行。

通过以使其具有特定的性质的方式修饰细菌，可以使细菌的嘌呤类物质生产能力提高，即可以使基于该细菌的嘌呤类物质生产增大。作为嘌呤类物质生产的增大，可举出嘌呤类物质的蓄积量的增大、嘌呤类物质的收率的增大。

作为特定的性质，可举出以下的(A)～(C)的修饰：

(A)PAJ_3461蛋白的活性降低的修饰；

(B)PAJ_3462蛋白的活性降低的修饰；

(C)PAJ_3463蛋白的活性降低的修饰。

本发明的细菌可以具有例如选自所述(A)～(C)的修饰中的1种或1种以上，例如1种、2种或全部3种修饰。

“PAJ_3461蛋白”、“PAJ_3462蛋白”和“PAJ_3463蛋白”分别是指由PAJ_3461基因、PAJ_3462基因和PAJ_3463基因编码的蛋白质。也将PAJ_3461基因、PAJ_3462基因和PAJ_3463基因统称为“GlcNDH基因”。PAJ_3461蛋白、PAJ_3462蛋白和PAJ_3463蛋白均可以为葡萄糖酸-2-脱氢酶(gluconate 2-dehydro genase)。即，“PAJ_3461蛋白的活性的降低”、“PAJ_3462蛋白的活性的降低”和“PAJ_3463蛋白的活性的降低”均可以是指葡萄糖酸-2-脱氢酶活性的降低。PAJ_3461蛋白、PAJ_3462蛋白和PAJ_3463蛋白具体可以分别为构成葡萄糖酸-2-脱氢酶的亚基。PAJ_3461蛋白更具体而言可以是构成葡萄糖酸-2-脱氢酶的功能未知的亚基。PAJ_3462蛋白更具体而言可以是构成葡萄糖酸-2-脱氢酶的脱氢酶亚基。更具体而言，PAJ_3463蛋白可以是构成葡萄糖酸-2-脱氢酶的细胞色素c亚基。PAJ_3461蛋白、PAJ_3462蛋白和PAJ_3463蛋白例如可以形成由这些蛋白质构成的复合体而作为葡萄糖酸-2-脱氢酶发挥功能。“葡萄糖酸-2-脱氢酶”可以是指具有催化将葡萄糖酸氧化而生成2-脱氢葡萄糖酸的反应和/或其逆反应的活性的蛋白质(EC 1.1.99.3等)。也将该活性称为“葡萄糖酸-2-脱氢酶活性”。葡萄糖酸-2-脱氢酶活性具体可以是催化在电子受体的存在下将葡萄糖酸氧化而生成2-脱氢葡萄糖酸的反应和/或其逆反应的活性。作为电子受体，可举出：氧化型醌、NAD⁺、NADP⁺、FAD⁺。在逆反应中，可以使用电子供体。作为电子供体，可举出还原型醌、NADH、NADPH、FADH₂。葡萄糖酸-2-脱氢酶活性特别可以是在任意一个方向或两个方向上催化以下化学反应的活性。

D-gluconate+electron acceptor＝2-dehydro-D-gluconate+reduced electron acceptor

需要说明的是，“蛋白质具有葡萄糖酸-2-脱氢酶活性”不限于该蛋白质单独具有葡萄糖酸-2-脱氢酶活性的情况，也包含该蛋白质与其他亚基组合而具有葡萄糖酸-2-脱氢酶活性的情况。“蛋白质单独具有葡萄糖酸-2-脱氢酶活性”可以是指该蛋白质单独作为葡萄糖酸-2-脱氢酶发挥功能。“蛋白质与其他亚基组合而具有葡萄糖酸-2-脱氢酶活性”可以是指该蛋白质与其他亚基组合而作为葡萄糖酸-2-脱氢酶发挥功能(例如，该蛋白质与其他亚基形成复合体而作为葡萄糖酸-2-脱氢酶发挥功能)。

作为PAJ_3461蛋白的其它亚基，可举出PAJ_3462蛋白和PAJ_3463蛋白。即，关于PAJ_3461蛋白的“蛋白质具有葡萄糖酸-2-脱氢酶活性”不限于该蛋白质单独具有葡萄糖酸-2-脱氢酶活性的情况，也包含该蛋白质与PAJ_3462蛋白和/或PAJ_3463蛋白的组合(特别是与PAJ_3462蛋白和PAJ_3463蛋白的组合)具有葡萄糖酸-2-脱氢酶活性的情况。

作为PAJ_3462蛋白的其它亚基，可举出PAJ_3461蛋白和PAJ_3463蛋白。即，关于PAJ_3462蛋白的“蛋白质具有葡萄糖酸-2-脱氢酶活性”不限于该蛋白质单独具有葡萄糖酸-2-脱氢酶活性的情况，也包含该蛋白质与PAJ_3461蛋白和/或PAJ_3463蛋白的组合(特别是与PAJ_3461蛋白和PAJ_3463蛋白的组合)具有葡萄糖酸-2-脱氢酶活性的情况。

作为PAJ_3463蛋白的其它亚基，可举出PAJ_3461蛋白和PAJ_3462蛋白。即，关于PAJ_3463蛋白的“蛋白质具有葡萄糖酸-2-脱氢酶活性”不限于该蛋白质单独具有葡萄糖酸-2-脱氢酶活性的情况，也包含该蛋白质与PAJ_3461蛋白和/或PAJ_3462蛋白的组合(特别是与PAJ_3461蛋白和PAJ_3462蛋白的组合)具有葡萄糖酸-2-脱氢酶活性的情况。

被修饰的细菌所具有的PAJ_3461基因、PAJ_3462基因和PAJ_3463基因的碱基序列以及它们所编码的PAJ_3461蛋白、PAJ_3462蛋白和PAJ_3463蛋白的氨基酸序列，例如可以从NCBI等公开数据库取得。菠萝泛菌AJ13355的PAJ_3461基因的碱基序列相当于GenBankaccession AP012032.2中登记的菠萝泛菌AJ13355的基因组序列中4149024～4149749位的碱基序列。菠萝泛菌AJ13355的PAJ_3462基因的碱基序列相当于GenBank accessionAP012032.2中登记的菠萝泛菌AJ13355的基因组序列中4149752～4151536位的碱基序列。菠萝泛菌AJ13355的PAJ_3463基因的碱基序列相当于GenBank accessi on AP012032.2中登记的菠萝泛菌AJ13355的基因组序列中4151542～4152858位的碱基序列。将菠萝泛菌AJ13355的PAJ_3461基因的碱基序列和该基因编码的PAJ_3461蛋白的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO.1和2。将菠萝泛菌AJ13355的PAJ_3462基因的碱基序列和该基因编码的PAJ_3462蛋白的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO.3和4。将菠萝泛菌AJ13355的PAJ_3463基因的碱基序列和该基因编码的PAJ_3463蛋白的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO.5和6。

关于所述(A)～(C)的修饰，各蛋白质的活性与非修饰株相比降低。关于使蛋白质的活性降低的方法，在后详述。就蛋白质的活性而言，例如，可以通过使编码该蛋白质的基因的表达降低或破坏该基因，来使其降低。这样的使蛋白质的活性降低的方法可以单独使用，或适宜组合使用。

将PAJ_3461蛋白、PAJ_3462蛋白和PAJ_3463蛋白统称为“靶蛋白”。也将PAJ_3461基因、PAJ_3462基因和PAJ_3463基因统称为“靶基因。”

靶基因例如可以是具有所述例示的靶基因的碱基序列(例如，SEQ ID NO.1、3或5所示的碱基序列)的基因。此外，靶蛋白例如可以是具有所述例示的靶蛋白的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO.2、4或6所示的氨基酸序列)的蛋白质。需要说明的是，除非有特别记载，否则“具有(氨基酸或碱基)序列”这一表达是指“包含该(氨基酸或碱基)序列，”也包含“由该(氨基酸或碱基)序列构成”的情况。

只要保持有原来的功能，则靶基因可以为所述例示的靶基因(例如，具有SEQ IDNO.1、3或5所示的碱基序列的基因)的变体。同样地，只要保持有原来的功能，则靶蛋白可以为所述例示的靶蛋白(例如，具有SEQ ID NO.2、4或6所示的氨基酸序列的蛋白质)的变体。需要说明的是，有时也将这样的保持原来的功能的变体称为“保守变体。”“PAJ_3461基因”、“PAJ_3462基因”和“PAJ_3463基因”这样的用语分别包含所述例示的PAJ_3461基因、PAJ_3462基因和PAJ_3463基因以及它们的保守变体。同样地，“PAJ_3461蛋白”、“PAJ_3462蛋白”和“PAJ_3463蛋白”这样的术语分别包含所述例示的PAJ_3461蛋白、PAJ_3462蛋白和PAJ_3463蛋白以及它们的保守变体。作为保守变体，例如，可举出所述例示的靶基因、靶蛋白的同源物(homolog)或人工修饰体。其中，降低活性的靶蛋白是被修饰的细菌所具有的靶蛋白，换言之，是被修饰的细菌所具有的靶基因所编码的靶蛋白。被修饰的细菌可以在染色体上具有靶基因，也可以在染色体外的结构物(例如质粒)上具有靶基因。“染色体”可以代替“基因组”使用。

“保持有原来的功能”可以是指，基因或蛋白质的变体具有与原来的基因或蛋白质的功能(例如活性、性质)对应的功能(例如活性、性质)。关于基因的“保持有原来的功能”可以是指，基因的变体编码保持有原来的功能的蛋白质。即，关于各靶基因的“保持有原来的功能”可以是指，基因的变体编码具有各靶蛋白的活性(就此而言，关于PAJ_3461蛋白、PAJ_3462蛋白和PAJ_3463蛋白优选为葡萄糖酸-2-脱氢酶活性)的蛋白质。此外，关于各靶蛋白的“保持有原来的功能”可以是指，蛋白质的变体具有各靶蛋白的活性(就此而言，关于PAJ_3461蛋白、PAJ_3462蛋白和PAJ_3463蛋白优选为葡萄糖酸-2-脱氢酶活性)。

葡萄糖酸-2-脱氢酶活性例如可以通过在电子受体的存在下将酶与对应的底物(例如葡萄糖酸)进行孵育，测定酶和底物依赖性的对应产物(例如2-脱氢葡萄糖酸)的生成来测定。此外，在逆反应的情况下，葡萄糖酸-2-脱氢酶活性例如可以通过在电子供体的存在下将酶与对应的底物(例如2-脱氢葡萄糖酸)进行孵育，测定酶和底物依赖性的对应产物(例如葡萄糖酸)的生成来测定。

以下，就保守变体进行例示。

就靶基因的同源物或靶蛋白的同源物而言，例如，可以通过使用所述例示的靶基因的碱基序列或所述例示的靶蛋白的氨基酸序列作为查询序列的B LAST检索、FASTA检索而从公开数据库容易地取得。此外，就靶基因的同源物而言，例如，可以将各种生物的染色体作为模板，通过将基于这些公知的靶基因的碱基序列而制备的寡核苷酸用作引物而通过PCR而取得。

就靶基因而言，只要保持有原来的功能，则可以为编码下述蛋白质的基因：具有在所述氨基酸序列(例如，SEQ ID NO.2、4、或6所示的氨基酸序列)中，在1个或者数个位置处的1或数个氨基酸出现置换、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列的蛋白质。例如，就编码的蛋白质而言，其N末端和/或C末端可以延长或短缩。需要说明的是，所述“1或数个”也根据氨基酸残基的蛋白质的立体结构中的位置、种类而不同，具体而言，例如是指1～50个、1～40个、1～30个，优选为1～20个，更优选为1～10个，进一步优选为1～5个，特别优选为1～3个。

所述的1个或者数个氨基酸的置换、缺失、插入和/或添加是蛋白质的功能正常保持的保守变异。代表性的保守变异为保守置换。就保守置换而言，在置换位点为芳香族氨基酸的情况下，是指Phe、Trp、Tyr之间的相互置换的变异，在置换位点为疏水性氨基酸的情况下，是指Leu、Ile、Val之间的相互置换的变异，在极性氨基酸的情况下，是指Gln、Asn之间的相互置换的变异，在碱性氨基酸的情况下，是指Lys、Arg、His之间的相互置换的变异，在酸性氨基酸的情况下，是指Asp、Glu之间的相互置换的变异，在具有羟基的氨基酸的情况下，是指Ser、Thr之间的相互置换的变异。作为视为保守置换的置换，具体而言，可举出从Ala到Ser或Thr的置换，从Arg到Gln、His或Lys的置换，从Asn到Glu、Gln、Lys、His或Asp的置换，从Asp到Asn、Glu或Gln的置换，从Cys到Ser或Ala的置换，从Gln到Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg的置换，从Glu到Gly、Asn、Gln、Lys或Asp的置换，从Gly到Pro的置换，从His到Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr的置换，从Ile到Le u、Met、Val或Phe的置换，从Leu到Ile、Met、Val或Phe的置换，从Lys到Asn、Glu、Gln、His或Arg的置换，从Met到Ile、Leu、Val或Phe的置换，从Phe到Trp、Tyr、Met、Ile或Leu的置换，从Ser到Thr或Ala的置换，从Thr到Ser或Ala的置换，从Trp到Phe或Tyr的置换，从Tyr到His、Phe或Trp的置换，以及从Val到Met、Ile或Leu的置换。此外，如上所述的氨基酸的置换、缺失、插入或添加中，还包括基于源自基因的生物的个体差、种的不同的情况等的天然产生的变异(mutant或variant)所导致的。

此外，只要保持有原来的功能，靶基因可以为编码以下蛋白质的基因：相对于所述氨基酸序列整体，例如，具有50％以上，65％以上，80％以上，优选为90％以上，更优选为95％以上，进一步优选为97％以上，特别优选为99％以上的同一性的氨基酸序列的蛋白质。

此外，只要保持有原来的功能，靶基因可以是与可由所述碱基序列(例如，SEQ IDNO.1、3或5所示的碱基序列)制备的探针、例如相对于所述碱基序列的整体或一部分的互补序列，在严格条件下杂交的基因(例如DNA)。“严格条件”可以是指，形成所谓的特异杂交体，而不形成非特异杂交体的条件。作为一个例子，可举出同一性较高的DNA彼此杂交，例如，具有50％以上，65％以上，80％以上，优选90％以上，更优选95％以上，进一步优选97％以上，特别优选99％以上的同一性的DNA彼此杂交，比该同一性低的DNA彼此不杂交的条件，或者以相当于作为通常的Southern杂交的清洗条件的60℃、1×SSC、0.1％ SDS，优选为60℃、0.1×SSC、0.1％ SDS，更优选为68℃、0.1×SSC、0.1％ SDS的盐浓度和温度，清洗1次，优选为2～3次的条件。

如上所述，所述杂交中使用的探针可以是基因的互补序列的一部分。这样的探针可以通过以基于公知的基因序列而制备的寡核苷酸作为引物，以包含上述的基因的DNA片段作为模板的PCR而制备。例如，作为探针，可以使用300bp左右的长度的DNA片段。在使用300bp左右的长度的DNA片段作为探针情况下，作为杂交的清洗条件，可举出50℃、2×SSC、0.1％ SDS。

此外，由于根据宿主不同，密码子的简并性也不同，因此靶基因可以为将任意的密码子置换为与之等价的密码子的基因。即，靶基因可以是基于遗传编码的简并的所述例示的靶基因的变体。

需要说明的是，氨基酸序列间的“同一性”是指，通过blastp使用默认设定的Scoring Parameters(Matrix：BLOSUM62；Gap Costs：Existence＝11,Exte nsion＝1；Compositional Adjustments：Conditional compositional score matri x adjustment)算出的氨基酸序列间的同一性。此外，碱基序列间的“同一性”是指，通过blastn使用默认设定的Scoring Parameters(Match/Mismatch Scores＝1,-2；Gap Costs＝Linear)而算出的碱基序列间的同一性。

需要说明的是，关于所述的基因、蛋白质的保守变体的记载也可以准用于嘌呤类物质生物合成系酶等任意的蛋白质和编码它们的基因中。

<1-3>使蛋白质的活性增大的方法

以下对使蛋白质的活性增大的方法进行说明。

“蛋白质的活性增大”是指，该蛋白质的活性与非修饰株相比有所增大。“蛋白质的活性增大”是指，具体而言，该蛋白质的每细胞的活性与非修饰株相比有所增大。此处的“非修饰株”是指，未以使靶蛋白的活性增大的方式进行修饰的对照株。作为非修饰株，可举出野生株、亲本株。作为非修饰株，具体而言，可举出各细菌种的基准株(type strain)。此外，作为非修饰株，具体而言，还可举出细菌的说明中例示的菌株。即，在一个方式中，蛋白质的活性可以与基准株(即本发明的细菌所属的种的基准株)相比有所增大。此外，在别的方式中，蛋白质的活性可以与E.coli K-12MG1655株相比有所增大。此外，在别的方式中，蛋白质的活性可以与P.ananatis AJ13355株相比有所增大。此外，在别的方式中，蛋白质的活性可以与P.ananatis NA1株相比有所增大。需要说明的是，“蛋白质的活性增大”也称为“蛋白质的活性得到了增强。”更具体而言，“蛋白质的活性增大”可以是指，与非修饰株相比，该蛋白质的每细胞的分子数增加并且/或者该蛋白质的每分子的功能增大。即，“蛋白质的活性增大”时的“活性”不限于蛋白质的催化活性，可以是指编码蛋白质的基因的转录量(mRNA量)或翻译量(蛋白质的量)。“蛋白质的每细胞的分子数”可以是指，该蛋白质的分子数的每细胞的平均值。此外，“蛋白质的活性增大”中不仅包含使原本具有靶蛋白的活性的菌株中该蛋白质的活性增大，还包含对原本不存在靶蛋白的活性的菌株赋予该蛋白质的活性。此外，只要结果蛋白质的活性增大，也可以在使宿主本来具有的靶蛋白的活性降低或消失的基础上，赋予适宜的靶蛋白的活性。

就蛋白质的活性增大的程度而言，只要蛋白质的活性与非修饰株相比有所增大就无特别限制。就蛋白质的活性而言，例如，可以上升至非修饰株的1.5倍以上、2倍以上或3倍以上。此外，在非修饰株不具有靶蛋白的活性的情况下，只要通过导入编码该蛋白质的基因，使该蛋白质生成即可，例如，可以使该蛋白质被生产到其活性可以被测定的程度。

就使蛋白质的活性增大的修饰而言，例如，可以通过使编码该蛋白质的基因的表达上升而达成。“基因的表达上升”可以是指，该基因的表达与野生株、亲本株等非修饰株相比有所增大。具体而言，“基因的表达上升”可以是指，该基因的每细胞的表达量与非修饰株相比有所增大。“基因的每细胞的表达量”可以是指，该基因的表达量的每细胞的平均值。更具体而言，“基因的表达上升”可以是指，基因的转录量(mRNA量)增大和/或基因的翻译量(蛋白质的量)增大。需要说明的是，“基因的表达上升”也称为“基因的表达得到了增强”。基因的表达例如可以上升至非修饰株的1.5倍以上、2倍以上或3倍以上。此外，“基因的表达上升”中不仅包含在原本表达靶基因的菌株中使该基因的表达量上升，还包含在原本不表达靶基因的菌株中，使该基因表达。即，“基因的表达上升”例如可以是指，向不保持靶基因的菌株中导入该基因，使该基因表达。

就基因的表达的上升而言，例如，可以通过使基因的拷贝数增加而达成。

基因的拷贝数的增加可以通过向宿主的染色体中导入该基因而达成。就向染色体中导入基因而言，例如，可以利用同源重组而进行(Miller,J.H.Ex periments inMolecular Genetics,1972,Cold Spring Harbor Laboratory)。作为利用同源重组的基因导入法，例如，可举出Red驱动整合(Red-driven integ ration)法(Datsenko,K.A,andWanner,B.L.Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.97:6640-6645(2000))等使用直链状DNA的方法、使用包含温度敏感性复制起点的质粒的方法、使用可以接合传递的质粒的方法、使用不具有在宿主内发挥功能的复制起点的自杀载体的方法、使用了噬菌体的转导(transduction)法。基因可以仅导入1个拷贝，也可以导入2个拷贝或2个拷贝以上。例如，通过以在染色体上存在多个拷贝的碱基序列作为靶进行同源重组，可以将基因的多个拷贝导入至染色体。作为在染色体上存在多个拷贝的碱基序列，可举出重复DNA序列(repetitive DNA)、存在于转座子的两端的反向重复。此外，也可以以目标物质的生产中不需要的基因等染色体上的适当的碱基序列作为靶进行同源重组。此外，基因也可以使用转座子、Mini-Mu而随机地导入至染色体上(日本特开平2-109985号公报，US5882888，EP805867B1)。需要说明的是，就这样的利用了同源重组的染色体的修饰方法而言，不限于靶基因的导入，也可以用于表达调节序列的修饰等染色体的任意的修饰。

就靶基因导入至染色体上的确认而言，可以通过使用了具有与该基因的全部或一部分互补的序列的探针的Southern杂交、或使用了基于该基因的序列而制备的引物的PCR等进行确认。

此外，基因的拷贝数的增加也可以通过将包含该基因的载体导入至宿主中而达成。例如，将包含靶基因的DNA片段与在宿主中发挥功能的载体连接而构建该基因的表达载体，通过用该表达载体转化宿主，可以使该基因的拷贝数增加。就包含靶基因的DNA片段而言，例如，可以通过以具有靶基因的微生物的基因组DNA作为模板的PCR而取得。作为载体，可以使用能够在宿主的细胞内自主复制的载体。载体优选为多拷贝载体。此外，为了选择转化子，优选载体具有抗生素抗性基因等标记。此外，载体可以具有用于使插入的基因表达的启动子、终止子。载体例如可以为来源于细菌质粒的载体、来源于酵母质粒的载体、来源于噬菌体的载体、粘粒或噬菌粒等。作为在大肠杆菌等肠杆菌科的细菌中能够自主复制的载体，具体而言，例如可举出：pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pBR322、pSTV29(均可从TAKARABIO公司得到)、pACYC184、pMW219(NIPPON GENE公司)、pTr c99A(PHARMACIA公司)、pPROK类载体(CLONTECH(クロンテック)公司)、pKK233-2(CLONTECH公司)、pET类载体(NOVAGEN公司)、pQE类载体(QIAGEN公司)、pCold TF DNA(TAKARABIO公司)、pACYC类载体、宽宿主区域载体RSF1010。

在导入基因的情况下，基因只要以可以表达的方式保持在宿主中即可。具体而言，基因只要以受到基于在宿主中发挥功能的启动子的控制而表达的方式被保持即可。就启动子而言，只要是在宿主中发挥功能的启动子就无特别限制。“在宿主中发挥功能的启动子”可以是指，在宿主中具有启动子活性的启动子。启动子可以是来源于宿主的启动子，也可以是来源于异种的启动子。启动子可以是导入的基因的固有的启动子，也可以是其他基因的启动子。作为启动子，例如，可以如后所述，使用更为强力的启动子。

基因的下游可以配置终结转录用的终止子。就终止子而言，只要是在宿主中发挥功能的终止子就无特别限制。终止子可以是来源于宿主的终止子，也可以是来源于异种的终止子。终止子可以是导入的基因的固有终止子，也可以是其他基因的终止子。终止子的具体实例包含T7终止子、T4终止子、fd噬菌体终止子、tet终止子和trpA终止子。

关于可以在各种微生物中利用的载体、启动子、终止子，例如在“微生物学基础讲座8基因工学，共立出版，1987年”中有详细的记载，可以使用它们。

此外，在导入2种或2种以上的基因的情况下，各基因以可以表达的方式保持在宿主中即可。例如，各基因可以都保持在单一的表达载体上，也可以都保持在染色体上。此外，各基因可以分别保持在多个表达载体上，也可以分别保持在单一或多个表达载体上以及染色体上。此外，也可以以2种或2种以上的基因构成操纵子进行导入。作为“导入2种或2种以上的基因的情况，”例如，可举出导入分别编码2种或2种以上的蛋白质(例如酶)的基因的情况、导入分别编码构成单一的蛋白质复合体(例如酶复合体)的2种或2种以上的亚基的基因的情况、以及它们的组合。

就导入的基因而言，只要是编码在宿主中发挥功能的蛋白质的基因就无特别限制。导入的基因可以是来源于宿主的基因，也可以是来源于异种的基因。就导入的基因而言，例如，可以使用基于该基因的碱基序列而设计的引物，以具有该基因的生物的基因组DNA或搭载该基因的质粒等作为模板，通过PCR而取得。此外，导入的基因例如也可以基于该基因的碱基序列而进行全合成(Gene,60(1),115-127(1987))。取得的基因可以就这样使用，或进行适宜修饰而使用。即，通过对基因进行修饰，可以取得其变体。基因的修饰可以通过公知的方法进行。例如，通过位点特异性的变异法，可以对DNA的目标位点导入目标变异。即，例如，通过位点特异性的变异法，可以对基因的编码区域进行修饰，以使得编码的蛋白质在特定的位点处包含氨基酸残基的置换、缺失、插入和/或添加。作为位点特异性的变异法，可举出使用PCR的方法(Higuchi,R.,61,in PCR technology,Erlich,H.A.Eds.,Stockton press(1989)；Carter,P.,Meth.in Enzymol.,154,382(1987))、使用噬菌体的方法(Kramer,W.and Frits,H.J.,Meth.in Enzymol.,154,350(1987)；Kunkel,T.A.et al.,Meth.in Enzymol.,154,367(1987))。或者可以对基因的变体进行全合成。

需要说明的是，在蛋白质作为包含多个亚基的复合体而发挥功能的情况下，只要作为结果，蛋白质的活性有所增大，则可以对这些多个亚基的全部进行修饰，也可以仅对一部分进行修饰。即，例如，在通过使基因的表达上升而使蛋白质的活性增大的情况下，可以使编码这些亚基的多个基因的表达全部都增强，也可以仅使一部分的表达增强。通常而言，优选使编码这些亚基的多个基因的表达全都增强。此外，就构成复合体的各亚基而言，只要复合体具有靶蛋白的功能，则可以来源于1种生物，也可以来源于2种或2种以上的不同生物。即，例如，可以将编码多个亚基的、来源于同一生物的基因导入至宿主中，也可以将分别来源于不同生物的基因导入至宿主中。

此外，基因的表达的上升可以通过使基因的转录效率提高而达成。此外，基因的表达的上升可以通过使基因的翻译效率提高而达成。基因的转录效率或翻译效率的提高例如可以通过表达调节序列的修饰而达成。“表达调节序列”可以是指对基因的表达产生影响的位点的总称。作为表达调节序列，例如，可举出启动子、Shine-Dalgarno(SD)序列(也称为核糖体结合位点(RBS))、以及RBS与起始密码子之间的间隔区域。表达调节序列可以通过启动子检索载体、GENETYX等基因解析软件来确定。这些表达调节序列的修饰例如可以通过使用了温度敏感性载体的方法、Red驱动整合法(WO2005/010175)而进行。

就基因的转录效率的提高而言，例如，可以通过将染色体上的基因的启动子置换为更为强力的启动子来达成。“更为强力的启动子”可以是指，基因的转录与原本存在的野生型的启动子相比有所提高的启动子。作为更强力的启动子，例如可举出作为公知的高表达启动子的T7启动子、trp启动子、lac启动子、thr启动子、tac启动子、trc启动子、tet启动子、araBAD启动子、rpo H启动子、msrA启动子、源自双歧杆菌(Bifidobacterium)的Pm1启动子、PR启动子和PL启动子。此外，作为更强力的启动子，也可以通过使用各种报告基因，来取得原有的启动子的高活性型。例如，通过使启动子区域内的-35、-10区域接近共有序列，能够提高启动子的活性(国际公开第00/18935号)。作为高活性型启动子，可举出各种tac样启动子(Katashkina JI et al.Russian Federation Patent application 2006134574)、pnlp8启动子(WO2010/027045)。启动子的强度的评价法和强力的启动子的例子在Goldstein等的论文(Prokaryoticpromoters in biotechnology.Biotechnol.Annu.Rev.,1,105-128(1995))等中有所记载。

就基因的翻译效率的提高而言，例如，可以通过将染色体上的基因的Shine-Dalgarno(SD)序列(也称为核糖体结合位点(RBS))置换更为强力的SD序列而达成。“更为强力的SD序列”可以是指，mRNA的翻译与原本存在的野生型的SD序列相比有所提高的SD序列。作为更为强力的SD序列，例如，可举出来源于噬菌体T7的基因10的RBS(Olins P.O.et al,Gene,1988,73,227-235)。此外，已知RBS与起始密码子之间的间隔区域，特别是起始密码子的上游侧靠近处的序列(5’-UTR)中的数个核苷酸的置换或插入或缺失会对mRNA的稳定性和翻译效率产生非常大的影响，也可以对它们进行修饰来使基因的翻译效率提高。

基因的翻译效率的提高例如也可以通过密码子的修饰来达成。例如，通过将基因中存在的稀有密码子置换为以更高频率利用的同义密码子，能够使基因的翻译效率提高。即，就导入的基因而言，例如，可以进行修饰以使其根据使用的宿主的密码子使用频率而具有最适合的密码子。密码子的置换例如可以通过位点特异性变异法进行。此外，也可以全合成密码子经过置换的基因片段。各种生物中的密码子的使用频率在“密码子使用数据库”(http://www.kazusa.or.jp/codon；Nakamura,Y.et al,Nucl.Acids Res.,28,292(2000))中有所公开。

此外，就基因的表达的上升而言，也可以通过使得使基因的表达上升的调节子扩增，或使得使基因的表达降低的调节子缺失或弱化而达成。

如上所述的使基因的表达上升的方法可以单独使用，也可以以任意的组合使用。

此外，以使得蛋白质的活性增大的修饰例如也可以通过使蛋白质的比活性增强来达成。比活性的增强中也包含反馈抑制的脱敏(desensitization to feedbackinhibition)。就比活性得到了增强的蛋白质而言，例如，可以对各种生物进行探索而取得。此外，也可以向原有的蛋白质中导入变异而取得高活性型。就导入的变异而言，例如，可以是蛋白质的1个或者数个位置处的1或数个氨基酸被置换、缺失、插入和/或添加的变异。变异的导入例如可以通过如上所述的位点特异性的变异法进行。此外，变异的导入例如也可以通过突变处理进行。作为突变处理，可举出X射线的照射、紫外线的照射以及基于N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、甲基磺酸乙酯(EMS)和甲基磺酸甲酯(MMS)等诱变剂的处理。此外，也可以在体外对DNA直接用羟胺进行处理，诱发随机变异。比活性的增强可以单独使用，也可以与如上所述的使基因的表达增强的方法任意组合地使用。

转化方法没有特别限制，可以使用现有已知的方法。例如，可以使用如针对大肠杆菌K-12所报道的那样的、用氯化钙处理受体菌细胞而增加DNA的透过性的方法(Mandel,M.and Higa,A.,J.Mol.Biol.1970,53,159-162)、如针对枯草芽孢杆菌所报道的那样的、由增殖阶段的细胞制备感受态细胞而导入DNA的方法(Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and Young,F.E.,1977.Gene 1:153-167)。或者，也可以应用如枯草芽孢杆菌、放线菌类以及酵母中已知的那样的，使DNA受体菌的细胞成为易于吸收重组DNA的原生质体或原生质球的状态，将重组DNA导入DNA受体菌的方法(Chang,S.and Ch oen,S.N.,1979.Mol.Gen.Genet.168:111-115；Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Hopwood,O.A.1978.Nature 274:398-400；Hinnen,A.,Hicks,J.B.and Fink,G.R.1978.Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:1929-1933)。或者，也可以利用关于棒状细菌所报道那样的电脉冲法(日本特开平2-207791)。

蛋白质的活性增大这一点，可以通过对该蛋白质的活性进行测定来确认。

蛋白质的活性增大这一点，也可以通过确认编码该蛋白质的基因的表达有所上升来确认。基因的表达上升这一点，可以通过确认该基因的转录量有所上升，或确认由该基因表达的蛋白质的量有所上升来确认。

基因的转录量上升这一点的确认，可以通过将由该基因转录的mRNA的量与野生株或亲本株等非修饰株相比较来进行。作为对mRNA的量进行评价的方法，可举出Northern杂交、RT-PCR、微阵列、RNA-seq等(Sambrook,J.,et al.,Molecular Cloning:ALaboratoryManual/Third Edition,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor(USA),2001)。就mRNA的量(例如，每细胞的分子数)而言，例如，可以上升至非修饰株的1.5倍以上、2倍以上或3倍以上。

蛋白质的量上升这一点的确认，可以使用抗体通过蛋白质印迹法来进行(Sambrook,J.,et al.,Molecular Cloning:ALaboratory Manual/Third Editio n,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor(USA),2001)。蛋白质的量(例如，每细胞的分子数)例如，可以上升至非修饰株的1.5倍以上、2倍以上或3倍以上。

所述使蛋白质的活性增大的方法可以用于任意的蛋白质的活性增强或任意的基因的表达增强。

<1-4>使蛋白质的活性降低的方法

以下将对使蛋白质的活性降低的方法进行说明。

“蛋白质的活性降低”是指，该蛋白质的活性与非修饰株相比有所降低。具体而言，“蛋白质的活性降低”是指，该蛋白质的每细胞的活性与非修饰株相比有所降低。此处的“非修饰株”是指，未以使靶蛋白的活性降低的方式进行了修饰的对照株。作为非修饰株，可举出野生株、亲本株。作为非修饰株，具体而言，可举出各细菌种的基准株(type strain)。此外，作为非修饰株，具体而言，还可举出细菌的说明中例示的菌株。即，在一个方式中，蛋白质的活性可以与基准株(即本发明的细菌所属的种的基准株)相比有所降低。此外，在别的方式中，蛋白质的活性可以与E.coli K-12MG1655株相比有所降低。此外，在别的方式中，蛋白质的活性可以与P.ananatis AJ13355株相比有所降低。此外，在别的方式中，蛋白质的活性可以与P.ananatis NA1株相比有所降低。需要说明的是，“蛋白质的活性降低”中也包含该蛋白质的活性完全消失的情况。更具体而言，“蛋白质的活性降低”可以是指，与非修饰株相比，该蛋白质的每细胞的分子数有所降低并且/或者该蛋白质的每分子的功能有所降低。即，“蛋白质的活性降低”这一情况中的“活性”不限于蛋白质的催化剂活性，可以是指编码蛋白质的基因的转录量(mRNA量)或翻译量(蛋白质的量)。“蛋白质的每细胞的分子数”可以是指，该蛋白质的分子数的每细胞的平均值。需要说明的是，“蛋白质的每细胞的分子数降低”中也包含该蛋白质完全不存在的情况。此外，“蛋白质的每分子的功能降低”中也包含该蛋白质的每分子的功能完全消失的情况。就蛋白质的活性的降低的程度而言，只要蛋白质的活性与非修饰株相比有所降低就无特别限制。蛋白质的活性例如可以降低至非修饰株的50％以下、20％以下、10％以下、5％以下或0％。

就使蛋白质的活性降低的修饰而言，例如，可以通过使编码该蛋白质的基因的表达降低而达成。“基因的表达降低”是指，该基因的表达与野生株、亲本株等非修饰株相比有所降低。具体而言，“基因的表达降低”是指，该基因的每细胞的表达量与非修饰株相比有所降低。“基因的每细胞的表达量”可以是指，该基因的表达量的每细胞的平均值。更具体而言，“基因的表达降低”可以是指，基因的转录量(mRNA量)降低和/或基因的翻译量(蛋白质的量)降低。“基因的表达降低”中也包含该基因完全不表达的情况。需要说明的是，“基因的表达降低”也称为“基因的表达弱化。”基因的表达例如可以降低至非修饰株的50％以下、20％以下、10％以下、5％以下或0％。

基因的表达的降低例如可以是转录效率的降低所带来的，可以是翻译效率的降低所带来的，也可以是它们的组合所带来的。就基因的表达的降低而言，例如，可以通过对基因的启动子、Shine-Dalgarno(SD)序列(也称为核糖体结合位点(RBS))、RBS与起始密码子之间的间隔区域等表达调节序列进行修饰而达成。在对表达调节序列进行修饰的情况下，优选表达调节序列的1个碱基以上，更优选2个碱基以上，特别优选3个碱基以上受到修饰。就基因的转录效率的降低而言，例如，可以通过将染色体上的基因的启动子置换为更弱的启动子而达成。“更弱的启动子”是指，基因的转录与原本存在的野生型的启动子相比有所弱化的启动子。作为更弱的启动子，例如，可举出诱导型的启动子。即，诱导型的启动子在非诱导条件下(例如，不存在诱导物质的条件下)可以作为更弱的启动子而发挥功能。此外，也可以使表达调节序列的一部分或全部的区域缺失(缺损)。此外，就基因的表达的降低而言，例如，也可以通过对涉及表达控制的因子进行操作而达成。作为涉及表达控制的因子，可举出涉及转录、翻译控制的低分子(诱导物质、抑制物质等)、蛋白质(转录因子等)、核酸(siRNA等)等。此外，就基因的表达的降低而言，例如，也可以通过向基因的编码区域中导入使基因的表达降低的变异而达成。例如，通过将基因的编码区域的密码子置换为在宿主中以更低的频率被使用的同义密码子，可以使基因的表达降低。此外，例如，也可以通过如后所述的基因的破坏，使基因的表达本身降低。

此外，就使蛋白质的活性降低的修饰而言，例如，可以通过破坏编码该蛋白质的基因来达成。“基因被破坏”是指，以使得不产生正常发挥功能的蛋白质的方式对该基因进行修饰。“不产生正常发挥功能的蛋白质”中包含：从该基因中完全不产生蛋白质的情况、由该基因中产生每分子的功能(例如活性、性质)降低或消失了的蛋白质的情况。

就基因的破坏而言，例如，可以通过使染色体上的基因缺失(缺损)而达成。“基因的缺失”是指，基因的编码区域的一部分或全部的区域的缺失。进一步而言，也可以连同染色体上的基因的编码区域的前后的序列，使基因整体缺失。基因的编码区域的前后的序列中，例如，可以包含基因的表达调节序列。只要能够达成蛋白质的活性的降低，使之缺失的区域可以为N末端区域(编码蛋白质的N末端侧的区域)、内部区域、C末端区域(编码蛋白质的C末端侧的区域)等任一区域。通常，使之缺失的区域越长，则更能够可靠地使基因失活。使之缺失的区域例如可以为基因的编码区域全长的10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上或95％以上的长度的区域。此外，就使之缺失的区域的前后的序列而言，优选阅读框不一致。通过阅读框的不一致，可使缺失的区域的下游发生移码。

此外，就基因的破坏而言，例如，也可以通过向染色体上的基因的编码区域中导入氨基酸置换(错义变异)、导入终止密码子(无义变异)或导入1～2个碱基的添加或缺失(移码变异)等来达成(Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617(1997),Proceedings of the National Academy of Sciences,USA95 5511-5515(1998),Journalof Biological Chemistry 26 116,20833-20839(1991))。

此外，就基因的破坏而言，例如，也可以通过向染色体上的基因的编码区域中插入其他碱基序列来达成。插入位点可以为基因的任一区域，插入的碱基序列越长则更能够可靠地使基因失活。此外，就插入位点的前后的序列而言，优选阅读框不一致。通过阅读框的不一致，可使插入位点的下游发生移码。作为其他碱基序列，只要使编码的蛋白质的活性降低或消失就无特别限制，例如，可举出抗生素抗性基因等标记基因、对目标物质的生产有用的基因。

就基因的破坏而言，特别可以以使编码的蛋白质的氨基酸序列缺失(缺损)的方式实施。换言之，就使蛋白质的活性降低的修饰而言，例如，可以通过使蛋白质的氨基酸序列(氨基酸序列的一部分或全部的区域)缺失，具体而言，以使其编码氨基酸序列(氨基酸序列的一部分或全部的区域)缺失了的蛋白质的方式对基因进行修饰，而达成。需要说明的是，“蛋白质的氨基酸序列的缺失”是指，蛋白质的氨基酸序列的一部分或全部的区域的缺失。此外，“蛋白质的氨基酸序列的缺失”是指，蛋白质中原来的氨基酸序列变得不存在，也包含原来的氨基酸序列变化为其他氨基酸序列的情况。即，例如，由于移码而变化为其他氨基酸序列的区域可以视为缺失了的区域。通过蛋白质的氨基酸序列的缺失，典型而言，蛋白质的全长会缩短，也存在蛋白质的全长不变化或延长的情况。例如，可以通过基因的编码区域的一部分或全部的区域的缺失，而使得编码的蛋白质的氨基酸序列中，该缺失了的区域编码的区域缺失。此外，例如，通过向基因的编码区域中导入终止密码子，能够使编码的蛋白质的氨基酸序列中，该导入位点下游的区域编码的区域缺失。此外，例如，通过基因的编码区域中的移码，能够使该移码位点编码的区域缺失。关于氨基酸序列的缺失中的使之缺失的区域的位置和长度，可以准用基因的缺失中的使之缺失的区域的位置和长度的说明。

就对染色体上的基因以所述的方式进行修饰而言，例如，可以制备以使其不产生正常发挥功能的蛋白质的方式进行了修饰的破坏型基因，用包含该破坏型基因的重组DNA转化宿主，使破坏型基因与染色体上的野生型基因发生同源重组，将染色体上的野生型基因置换为破坏型基因而达成。此时，重组DNA中，如果根据宿主的营养缺陷型等性状而包含标记基因，则容易操作。作为破坏型基因，可举出使基因的编码区域的一部分或全部的区域缺失了的基因、导入了错义变异的基因、导入了无义变异的基因、导入了移码变异的基因、插入了转座子、标记基因等插入序列的基因。由破坏型基因编码的蛋白质即使生成，也具有与野生型蛋白质不同的立体结构，功能降低或消失。就同源重组中使用的重组DNA的结构而言，只要以期望的方式引起同源重组就无特别限制。例如，用一种包含破坏型基因的线状DNA转化宿主，所述线状DNA为两端分别具备染色体上的野生型基因的上游和下游的序列的线状D NA，在野生型基因的上游和下游分别引起同源重组，由此能够将野生型基因置换为破坏型基因。这样的基于利用同源重组的基因置换的基因破坏方法已经被确立，有被称为“Red驱动整合(Red-driven integration)”的方法(Datsenko,K.A,and Wanner,B.L.Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.97:6640-6645(2000))、Red驱动整合法与来源于λ噬菌体的切出系统(Cho,E.H.,Gumport,R.I.,Gardner,J.F.J.Bacteriol.184:5200-5203(2002))组合的方法(参WO2005/010175号)等使用直链状DNA的方法、使用包含温度敏感性复制起点的质粒的方法、使用可以接合传递的质粒的方法、使用不包含在宿主内发挥功能的复制起点的自杀载体的方法等(美国专利第6,303,383号，日本特开平05-007491号)。需要说明的是，就这样的利用同源重组的染色体的修饰方法而言，不限于靶基因的破坏，也可以用于表达调节序列的修饰等染色体的任意的修饰。

此外，就使蛋白质的活性降低的修饰而言，例如，可以通过突变处理进行。作为突变处理，可举出X射线的照射、紫外线的照射以及基于N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、甲基磺酸乙酯(EMS)和甲基磺酸甲酯(MMS)等诱变剂的处理。

需要说明的是，在蛋白质作为包含多个亚基的复合体而发挥功能的情况下，只要作为结果，蛋白质的活性降低，则可以对这些多个亚基全都进行修饰，也可以仅对一部分进行修饰。即，例如，可以将编码这些亚基的多个基因的全部破坏等，也可以仅破坏一部分等。此外，在蛋白质存在多个同工酶的情况下，只要作为结果，蛋白质的活性降低，则可以使多个同工酶的活性全部降低，也可以仅使一部分的活性降低。即，例如，可以使编码这些同工酶的多个基因的全部破坏等，也可以仅破坏一部分等。

如上所述的使蛋白质的活性降低的方法可以单独使用，也可以以任意的组合使用。

蛋白质的活性降低这一点，可以通过测定该蛋白质的活性来确认。

蛋白质的活性降低这一点，也可以通过确认编码该蛋白质的基因的表达降低来确认。基因的表达降低这一点，可以通过确认该基因的转录量降低或确认由该基因表达的蛋白质的量降低，来进行确认。

就基因的转录量降低这一点的确认而言，可以通过将由该基因转录的mR NA的量与非修饰株相比较而进行。作为对mRNA的量进行评价的方法，可举出Northern杂交、RT-PCR、微阵列、RNA-seq等(Sambrook,J.,et al.,Mo lecular Cloning:ALaboratoryManual/Third Edition,Cold Spring Harbor La boratory Press,Cold Spring Harbor(USA),2001)。mRNA的量(例如，每细胞的分子数)例如可以降低至非修饰株的50％以下、20％以下、10％以下、5％以下或0％。

蛋白质的量降低这一点的确认，可以使用抗体通过蛋白质印迹法来进行(Sambrook,J.,et al.,Molecular Cloning:ALaboratory Manual/Third Editio n,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor(USA),2001)。蛋白质的量(例如，每细胞的分子数)例如可以降低至非修饰株的50％以下、20％以下、10％以下、5％以下或0％。

基因被破坏这一点，可以根据用于破坏的手段，通过确定该基因的一部分或全部的碱基序列、限制酶图谱或全长等来确认。

所述的使蛋白质的活性降低的方法可以用于任意的蛋白质的活性降低、任意的基因的表达降低。所述的使蛋白质的活性降低的方法也可以用于成为表达降低、破坏等的对象的基因存在于染色体外的结构物(例如质粒)上的情况。此时，所述的降低蛋白质活性的方法中的“染色体”可以替换为“染色体外的结构物”(例如质粒)。

<2>本发明的嘌呤类物质的制造方法

本发明的方法的一个方式是嘌呤类物质的制造方法，其包含：用培养基培养本发明的细菌，在该培养基中和/或该细菌的菌体内蓄积嘌呤类物质；以及从所述培养基和/或所述菌体中采集所述嘌呤类物质。关于嘌呤类物质，如上所述。本发明中，可以制造1种嘌呤类物质，也可以制造2种或2种以上的嘌呤类物质。

就使用的培养基而言，只要本发明的细菌能够增殖，目标嘌呤类物质能够生产，就无特别限制。作为培养基，例如，可以使用肠杆菌科的细菌的培养中使用的通常的培养基。作为培养基，例如，可以使用根据需要而含有选自碳源、氮源、磷酸源、硫源、其它各种有机成分或无机成分中的成分的培养基。培养基成分的种类、浓度可以根据使用的细菌的种类等各种条件而适宜设定。

作为碳源，具体而言，例如，可举出葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、黑糖蜜、淀粉水解物、生物质的水解物等糖类、乙酸、富马酸、柠檬酸、琥珀酸等有机酸类、甘油、粗甘油、乙醇等醇类、脂肪酸类。作为碳源，特别可举出糖类。需要说明的是，作为碳源，可以适宜使用来源于植物的原料。作为植物，例如，可举出玉米、米、小麦、大豆、甘蔗、甜菜根、棉花。作为来源于植物的原料，例如，可举出根、茎、干、枝、叶、花、种子等器官、包含它们的植物体、它们的植物器官的分解产物。来源于植物的原料的利用形态无特别限制，例如，可以利用未加工品、榨汁、粉碎物、纯化物等任一形态。此外，就木糖等戊糖、葡萄糖等己糖或它们的混合物而言，例如，可以从植物生物物质中取得并利用。具体而言，这些糖类可以通过将植物生物物质供至水蒸气处理、浓酸水解、稀酸水解、基于纤维素酶等酶的水解、碱处理等处理而取得。需要说明的是，半纤维素比一般的纤维素更易于水解，因此也可以使植物生物物质中的半纤维素预先水解而使戊糖游离，接下来，使纤维素水解而生成己糖。此外，就木糖而言，例如，可以使本发明的细菌保有从葡萄糖等己糖到木糖的转化途径，通过从己糖出发的转化而进行供给。作为碳源，可以使用1种碳源，也可以将2种或2种以上的碳源组合使用。

作为氮源，具体而言，例如，可举出硫酸铵、氯化铵、磷酸铵等铵盐、蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、大豆蛋白质分解物等有机氮源、氨、尿素。也可以将pH调节中使用的氨气、氨水作为氮源利用。作为氮源，可以使用1种氮源，也可以将2种或2种以上的氮源组合使用。

作为磷酸源，具体而言，例如，可举出磷酸2氢钾、磷酸氢2钾等磷酸盐、焦磷酸等磷酸聚合物。作为磷酸源，可以使用1种磷酸源，也可以将2种或2种以上的磷酸源组合使用。

作为硫源，具体而言，例如，可举出硫酸盐、硫代硫酸盐、亚硫酸盐等无机硫化合物、半胱氨酸、胱氨酸、谷胱甘肽等含硫氨基酸。作为硫源，可以使用1种硫源，也可以将2种或2种以上的硫源组合使用。

作为其它各种有机成分或无机成分，具体而言，例如，可举出氯化钠、氯化钾等无机盐类；铁、锰、镁、钙、锌、铜、钴等微量金属类；维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸、烟酸酰胺、维生素B12等维生素类；氨基酸类；核酸类；含有它们的蛋白胨、酪蛋白氨基酸、酵母提取物、大豆蛋白质分解物等有机成分。作为其它各种有机成分或无机成分，可以使用1种成分，也可以将2种或2种以上的成分组合使用。

此外，在使用生长时需要氨基酸等的营养缺陷型突变株的情况下，优选向培养基中补添所需要的营养素。例如，在琥珀酰-AMP合酶基因(purA)的缺失株等腺嘌呤缺陷型突变株的培养中，可以使用腺嘌呤或包含其的有机成分。

此外，优选限制培养基中的生物素量、向培养基中添加表面活性剂或青霉素。

就培养条件而言，只要本发明的细菌能够增殖，能够生产目标嘌呤类物质，就无特别限制。培养例如可以在肠杆菌科的细菌等细菌的培养中使用的通常的条件下进行。培养条件可以根据使用的细菌的种类等各种条件而适宜设定。

培养可以使用液体培养基进行。培养时，可以将用琼脂培养基等固体培养基培养本发明的细菌而得到的产物直接接种至液体培养基中，也可以将用液体培养基对本发明的细菌进行种培养而得的产物接种至主培养用的液体培养基中。即，培养可以分为种培养和主培养来进行。在该情况下，种培养和主培养的培养条件可以相同，也可以不同。在培养开始时培养基中含有的本发明的细菌的量无特别限制。主培养例如可以通过向主培养的培养基中，植菌1～50％(v/v)的种培养液来进行。

培养可以通过分批培养(batch culture)、流加培养(Fed-batch culture)、连续培养(continuous culture)、或它们的组合来实施。需要说明的是，也将培养开始时的培养基称为“初始培养基”。此外，也将在流加培养或连续培养中向培养体系(发酵槽)中供给的培养基称为“流加培养基”。此外，也将在流加培养或连续培养中向培养体系中供给流加培养基的工序称为“流加。”需要说明的是，在培养分为种培养和主培养进行的情况下，例如，可以将种培养和主培养都以分批培养进行。此外，例如，也可以将种培养以分批培养进行，将主培养以流加培养或连续培养进行。

本发明中，各培养基成分可以在初始培养基、流加培养基或这两者中含有。初始培养基中含有的成分的种类与流加培养基中含有的成分的种类可以相同，也可以不同。此外，初始培养基中含有的各成分的浓度与流加培养基中含有的各成分的浓度可以相同，也可以不同。此外，也可以使用含有的成分的种类和/或浓度不同的2种或2种以上的流加培养基。例如，在间歇地进行多次流加的情况下，各次的流加培养基中含有的成分的种类和/或浓度可以相同，也可以不同。

就培养基中的碳源的浓度而言，只要本发明的细菌能够增殖，能够生产嘌呤类物质，就无特别限制。就培养基中的碳源的浓度而言，例如，可以在嘌呤类物质的生产不受到抑制的范围内尽可能高。就培养基中的碳源的浓度而言，例如，作为初始浓度(初始培养基中的浓度)，可以为1～30w/v％，优选为3～10w/v％。此外，也可以适宜地将碳源通过追加添加至培养基中。例如，可以根据伴随发酵的进行的碳源的消耗，而将碳源通过追加添加至培养基中。

培养例如可以在好氧条件下进行。好氧条件是指，液体培养基中的溶解氧浓度为作为氧膜电极的检测极限的0.33ppm以上，可以优选为1.5ppm以上。就氧浓度而言，例如，可以控制为相对于饱和氧浓度为5～50％，优选为10％左右。具体而言，好氧条件下的培养可以通过通气培养、振荡培养、搅拌培养或它们的组合来进行。就培养基的pH而言，例如，可以为pH3～10，优选为pH4.0～9.5。在培养中，可以根据需要对培养基的pH进行调节。培养基的pH可以使用氨气、氨水、碳酸钠、重碳酸钠、碳酸钾、重碳酸钾、碳酸镁、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化镁等各种碱性或酸性物质进行调节。培养温度例如可以为20～40℃，优选为25℃～37℃。培养期间例如可以为10小时～120小时。培养例如可以持续至培养基中的碳源消耗完或本发明的细菌失去活性。通过在这样的条件下培养本发明的细菌，嘌呤类物质蓄积在培养基中和/或菌体内。

生成了嘌呤类物质这一点，可以通过化合物的检测或鉴定中使用的公知方法来确认。作为这样的方法，例如，可举出HPLC、LC/MS、GC/MS、NM R。这些方法可以单独使用，或适宜组合使用。

就从发酵液中回收嘌呤类物质而言，可以通过化合物的分离纯化中使用的公知方法进行。作为这样的方法，例如，可举出离子交换树脂法(Nagai,H.et al.,SeparationScience and Technology,39(16),3691-3710)、沉淀法、膜分离法(日本特开平9-164323、日本特开平9-173792)、晶析法(WO2008/078448、WO2008/078646)。这些方法可以单独使用，或适宜组合使用。需要说明的是，在嘌呤类物质蓄积于菌体内的情况下，例如，可以从用超声波等使菌体破碎，通过离心分离将菌体除去而得到的上清中，通过离子交换树脂法等回收嘌呤类物质。在嘌呤类物质为可形成盐的物质(例如，嘌呤核苷酸)的情况下，回收的嘌呤类物质可以为游离体、其盐、或它们的混合物。作为盐，例如，可举出钠盐、钾盐。

此外，在嘌呤类物质在培养基中析出的情况下，可以通过离心分离或过滤等回收。此外，培养基中析出的嘌呤类物质可以在使溶解于培养基中的嘌呤类物质晶析后，一并分离。

需要说明的是，就回收的嘌呤类物质而言，除了嘌呤类物质之外，还可以包含细菌菌体、培养基成分、水分以及细菌的代谢副产物等成分。嘌呤类物质可以纯化至期望的程度。回收的嘌呤类物质的纯度例如可以为30％(w/w)以上，50％(w/w)以上，70％(w/w)以上，80％(w/w)以上，90％(w/w)以上或95％(w/w)以上。

<3>本发明的嘌呤核苷酸的制造方法

本发明的方法的另一个方式涉及一种嘌呤核苷酸的制造方法，其包含：在培养基中培养具有嘌呤核苷生产能力的本发明的细菌，在该培养基中和/或该细菌的菌体内蓄积嘌呤核苷；将所述嘌呤核苷磷酸化而生成嘌呤核苷酸；以及采集所述嘌呤核苷酸。

嘌呤核苷和嘌呤核苷酸如上所述。作为嘌呤核苷酸可举出：嘌呤核苷的5’-磷酸酯。作为嘌呤核苷的5’-磷酸酯，可举出：肌苷酸(肌苷-5’-磷酸酯；IMP)、鸟苷酸(鸟苷-5’-磷酸酯；GMP)、黄苷酸(黄苷-5’-磷酸酯；XMP)和腺苷酸(腺苷-5’-磷酸酯；AMP)。在本发明的嘌呤核苷酸的制造方法中，生成与使用的嘌呤核苷对应的嘌呤核苷酸。即，例如，可以分别从肌苷制造肌苷酸、从鸟苷制造鸟苷酸、从黄苷制造黄苷酸、从腺苷制造腺苷酸。在本发明中，可以制造1种嘌呤核苷酸，也可以制造2种或2种以上的嘌呤核苷酸。

关于本发明的细菌的培养，在本发明的嘌呤类物质的制造方法中如上所述。

嘌呤核苷可以以包含在培养基或菌体中的状态供于磷酸化，也可以从培养基或菌体中回收后供于磷酸化。此外，嘌呤核苷可以在进行恰当的预处理后进行磷酸化。作为预处理，例如可举出：纯化、稀释、浓缩、结晶、干燥、破裂、溶解等。这些预处理也可以适当组合进行。例如，可以将包含嘌呤核苷的培养液直接进行磷酸化，或者纯化到理想程度以后再进行磷酸化。

对嘌呤核苷进行磷酸化的方法没有特别限制。例如可以通过公知的方法进行磷酸化。

磷酸化，例如可以化学性地进行。化学性的磷酸化可以使用磷酰氯(POCl₃)等磷酸化剂进行(Yoshikawa et.al.,Studies of phosphorylation,III,Selectiv ephosphorylation of unprotected nucleosides,Bull.Chem.Soc.Jpn.,1969,42:3505-3508)。

磷酸化，例如可以使用微生物或酶进行。即，通过使具有生成嘌呤核苷酸的能力的微生物作用于嘌呤核苷和磷酸供体，能够生成嘌呤核苷酸(日本特开平07-231793)。这里所说的“生成嘌呤核苷酸的能力”可以是指，将嘌呤核苷磷酸化而生成对应的嘌呤核苷酸的能力。此外，可以使磷酸化酶作用于嘌呤核苷和磷酸供体，生成嘌呤核苷酸。

作为具有生成嘌呤核苷酸的能力的微生物，具体而言，例如可举出以下微生物(日本特开平07-231793)。

蟑螂埃希氏菌(Escherichia blattae)JCM 1650

无花果沙雷氏菌(Serratia ficaria)ATCC 33105

植生克雷伯氏菌(Klebsiella planticola)IFO 14939(ATCC 33531)

肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)IFO 3318(ATCC 8724)

土生克雷伯氏菌(Klebsiella terrigena)IFO 14941(ATCC 33257)

摩氏摩根菌(Morganella morganii)IFO 3168

产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)IFO 12010

产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)IFO 13534(ATCC 13048)

河流色杆菌(Chromobacterium fluviatile)IAM 13652

紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)IFO 12614

拉氏西地西菌(Cedecea lapagei)JCM 1684

戴氏西地西菌(Cedecea davisiae)JCM 1685

奈氏西地西菌(Cedecea neteri)JCM 5909

作为磷酸化酶，例如可举出：磷酸酶、核苷激酶、核苷磷酸转移酶。磷酸化酶可以是纯化后的，也可以是未纯化的。例如，可以使用生产磷酸化酶的微生物的培养物、从所述培养物分离的培养上清液、从所述培养物分离的菌体、该微生物的菌体处理物、它们的部分纯化物等包含磷酸化酶的组分作为磷酸化酶。

作为核苷激酶，例如可举出：肌苷鸟苷激酶。作为利用肌苷鸟苷激酶的方法，具体而言，例如可举出：使用导入了编码大肠杆菌的肌苷鸟苷激酶的基因的埃希氏菌属细菌的、嘌呤核苷酸的制造法(WO91/08286)；使用导入了编码乙酰微小杆菌(Exiguobacteriumacetylicum)的肌苷鸟苷激酶的基因的、产氨棒杆菌的嘌呤核苷酸的制造法(WO96/30501)。

作为磷酸酶，例如可举出酸性磷酸酶。作为酸性磷酸酶，例如可举出日本特开2002-000289中公开的磷酸酶。此外，作为优选的酸性磷酸酶，例如可举出对核苷的亲和力升高的突变型酸性磷酸酶(日本特开平10-201481)、核苷酸酶活性降低的突变型酸性磷酸酶(WO96/37603)、磷酸酯水解活性降低的突变型酸性磷酸酶(日本特开2001-245676)。

作为磷酸供体，例如可举出：多聚磷酸、磷酸苯酯、乙酰磷酸、氨基甲酰磷酸、ATP、dATP(脱氧ATP)。作为多聚磷酸，例如可举出：焦磷酸、三多磷酸(tripolyphosphoricacid)、三偏磷酸、四偏磷酸、六偏磷酸。磷酸供体可以是任一种游离体、或其盐、或其混合物。作为盐，例如可举出钠盐、钾盐。磷酸供体可以根据使用的微生物、磷酸化酶的种类进行恰当选择。此外，在使用ATP、dATP作为磷酸供体时，也可以组合使用所述再生体系(WO91/08286、WO96/30501)。

嘌呤核苷酸的生成可以通过用于化合物的检测或鉴定的公知方法来确认。作为这样的方法，例如可举出HPLC、LC/MS、GC/MS、NMR。这些方法可以单独或适当地组合使用。

生成的嘌呤核苷酸的回收，可以通过用于化合物的分离纯化的公知方法进行。作为这样的方法，例如可举出：离子交换树脂法(Nagai,H.et al.,Separation Science andTechnology,39(16),3691-3710)、沉淀法、膜分离法(日本特开平9-164323、日本特开平9-173792)、晶析法(WO2008/078448、WO2008/078646)。这些方法可以单独或适当地组合使用。回收的嘌呤核苷酸可以是游离体、其盐或它们的混合物。作为盐，例如可举出钠盐、钾盐。

需要说明的是，回收的嘌呤核苷酸中，除了嘌呤核苷酸以外，还可以包含磷酸化酶、磷酸供体、细菌菌体、培养基成分、水分和细菌的代谢副产物等成分。可以将嘌呤核苷酸纯化到理想的程度。嘌呤核苷酸的纯度例如可以为30％(w/w)以上，50％(w/w)以上，70％(w/w)以上，80％(w/w)以上，90％(w/w)以上或95％(w/w)以上。

实施例

以下，参照非限定性的实施例对本发明进行更具体的说明。

实施例：基于菠萝泛菌(Pantoea ananatis)的GlcNDH基因(PAJ_3461、PAJ_3462和PAJ_3463)缺失株的肌苷生产

(1)菠萝泛菌PH10株的取得

以菠萝泛菌AJ13355(FERM BP-6614)为亲本株，通过deoD基因(purinenucleosidephosphorylase基因)、add基因(adenosine deaminase基因)、purA基因(succinyl-AMPsynthase基因)、guaB基因(IMP deh ydrogenase基因)和guaA基因(GMP synthase基因)的缺失，得到PH10株。将菠萝泛菌AJ13355的deoD基因(PAJ_2545)的碱基序列和该基因编码的DeoD蛋白的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO.17和18。将菠萝泛菌AJ13355的add基因(PAJ_1166)的碱基序列和该基因编码的Add蛋白的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO.19和20。将菠萝泛菌AJ13355的purA基因(PAJ_2759)的碱基序列和该基因编码的PurA蛋白的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO.21和22。将菠萝泛菌AJ13355的guaB基因(PAJ_2137)的碱基序列和该基因编码的GuaB蛋白的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO.23和24。将菠萝泛菌AJ13355的guaA基因(PAJ_2135)的碱基序列和该基因所编码的GuaA蛋白质的氨基酸序列分别示于SEQID NO.25和26。使基因缺失的方法后述。

(2)菠萝泛菌PH11株的取得

以菠萝泛菌PH10株作为亲本株，通过PAJ_3461基因、PAJ_3462基因和PAJ_3463基因(gluconate-2-dehydrogenase的3个亚基基因)的缺失，得到PH11株。使基因缺失的方法后述。

(3)使基因缺失的方法

(3-1)基因缺失用PCR片段的制备

以包含λattL-ARM-λattR结构(“ARM”为抗生素抗性标记基因)的质粒(WO 2005/010175和WO2008/090770)或包含λattL-ARM-λattR结构的染色体DNA(Joanna IKatashkina et al.,Use of the lambda Red-recombineering method for geneticengineering of Pantoea ananatis,BMC Mol Biol,doi:10.1186/1471-2199-10-34.)为模板，使用与待缺失的基因对应的引物进行PCR，由此得到具有在待缺失的基因的上游序列与下游序列之间夹着λattL-ARM-λattR的结构的PCR片段。引物、待缺失的基因和抗生素抗性标记基因的组合如表1所示。

[表1]

/>

Km：卡那霉素，Cm：氯霉素，Tc：四环素

(3-2)基于λ-red法的基因缺失

将SC17(0)/RSFred spc株(WO2015/005405)接种于包含50mg/L Spc(奇霉素)的LB培养基中，在34℃、120rpm下振荡培养过夜，得到预培养液。接着，在坂口烧瓶内的包含1mMIPTG和50mg/L Spc的SOB培养基50mL中接种0.5mL预培养液，培养3小时。用冷却离心机收集得到的培养液，用冰冷了的10％甘油洗涤3次，由此制造感受态细胞。接着，通过电穿孔(electroporat ion)法将基因缺失用PCR片段导入感受态细胞。添加LB培养基或LBGA培养基，在34℃下恢复培养1小时后，将培养液涂布于包含适当的抗生素的LB琼脂培养基或LBGA琼脂培养基。得到基因缺失株作为抗生素抗性株。

(3-3)基于基因组导入的基因缺失

使用基因组提取试剂盒PurElute^TM Bacterial Genomic Kit(EdgeBio公司)从所述(3-2)中得到的基因缺失株中进行基因组的提取。接着，将想要导入基因缺失的菌株在琼脂培养基中培养一晚，从生长的平板刮取菌体，用10％甘油洗涤3次，由此制备感受态细胞。接着，通过电穿孔法将基因缺失株的基因组导入感受态细胞。添加LB培养基或LBGA培养基，在34℃下恢复培养1小时后，将培养液涂布于包含适当的抗生素的LB琼脂培养基或LBGA琼脂培养基。得到基因缺失株作为抗生素抗性株。

(3-4)使用了辅助质粒pMW-intxis-sacB(Spc)的标记除去

为了除去导入染色体中的抗生素抗性标记基因，通过电穿孔法在所述(3-3)中得到的基因缺失株中导入用于表达λ噬菌体的int-xis基因的辅助质粒pM W-intxis-sacB(Spc)(WO2015/005405A1)，使用包含50mg/L Spc的LB培养基或LBGA培养基在30℃形成菌落。然后，使用不含Spc且包含10％蔗糖和1mM IPTG的LB培养基或LBGA培养基在34℃下进行单菌落分离，通过对抗生素(与导入Spc和染色体的抗生素抗性标记基因对应的抗生素)的敏感性，得到pMW-intxis-sacB(Spc)和染色体上的抗生素抗性标记基因脱落了的菌株。

(4)使用的培养基

LB培养基(表2)

LBGA培养基(表3)

肌苷生产培养基(表4)

[表2]

表2LB培养基

在用作平板的情况下添加琼脂15g/L。

在120℃下进行20min高压釜灭菌。

高压釜后，根据需要添加药剂(Cm25mg/L、Km40mg/L、Spc50mg/L或Tc15mg/L)。

[表3]

表3LBGA培养基

在用作平板的情况下添加琼脂15g/L。

在120℃下进行20min高压釜灭菌。

[表4]

表4肌苷生产培养基

<A区>

/>

(5)基于菠萝泛菌PH11株的肌苷生产

将菠萝泛菌PH11株和PH10株从甘油储备(glycerol stock)更新至LBGA琼脂培养基，在34℃培养一夜。接着，在加入了0.15g/根的碳酸钙的粗试管中装入5mL肌苷生产培养基，在其中从平板接种1环(loop)份的菌体，在34℃、120rpm下振荡培养一夜。测定培养上清液中的肌苷量和2-酮葡萄糖酸(2-ketogluconic acid)量。

将结果示于表5。由于GlcNDH基因(PAJ_3461、PAJ_3462和PAJ_3463)的缺失，使得肌苷生产提高。因此可知，通过PAJ_3461蛋白、PAJ_3462蛋白和/或PAJ_3463蛋白的活性降低，使得肌苷等嘌呤类物质的生产提高。

[表5]

序列表的说明

SEQ ID NO.1：P.ananatis AJ13355的PAJ_3461基因的碱基序列

SEQ ID NO.2：P.ananatis AJ13355的PAJ_3461蛋白的氨基酸序列

SEQ ID NO.3：P.ananatis AJ13355的PAJ_3462基因的碱基序列

SEQ ID NO.4：P.ananatis AJ13355的PAJ_3462蛋白的氨基酸序列

SEQ ID NO.5：P.ananatis AJ13355的PAJ_3463基因的碱基序列

SEQ ID NO.6：P.ananatis AJ13355的PAJ_3463蛋白的氨基酸序列

SEQ ID NO.7～16：引物

SEQ ID NO.17：P.ananatis AJ13355的deoD基因的碱基序列

SEQ ID NO.18：P.ananatis AJ13355的DeoD蛋白质的氨基酸序列

SEQ ID NO.19：P.ananatis AJ13355的add基因的碱基序列

SEQ ID NO.20：P.ananatis AJ13355的Add蛋白质的氨基酸序列

SEQ ID NO.21：P.ananatis AJ13355的purA基因的碱基序列

SEQ ID NO.22：P.ananatis AJ13355的PurA蛋白质的氨基酸序列

SEQ ID NO.23：P.ananatis AJ13355的guaB基因的碱基序列

SEQ ID NO.24：P.ananatis AJ13355的GuaB蛋白质的氨基酸序列

SEQ ID NO.25：P.ananatis AJ13355的guaA基因的碱基序列

SEQ ID NO.26：P.ananatis AJ13355的GuaA蛋白质的氨基酸序列。

Claims

1.一种嘌呤类物质的制造方法，其包含：

在培养基中培养具有嘌呤类物质生产能力并且属于肠杆菌科(Enterobact eriaceae)的细菌，在该培养基中和/或该细菌的菌体内蓄积嘌呤类物质；以及

从所述培养基和/或所述菌体中采集所述嘌呤类物质，

(A)PAJ_3461蛋白的活性降低的修饰；

(B)PAJ_3462蛋白的活性降低的修饰；

(C)PAJ_3463蛋白的活性降低的修饰。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，

所述嘌呤类物质选自嘌呤核苷和嘌呤核苷酸。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，

所述嘌呤类物质选自肌苷、黄苷、鸟苷和腺苷。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，

所述嘌呤类物质选自肌苷酸、黄苷酸、鸟苷酸和腺苷酸。

5.一种嘌呤核苷酸的制造方法，其包含：

在培养基中培养具有嘌呤核苷生产能力并且属于肠杆菌科(Enterobacteri aceae)的细菌，在该培养基中和/或该细菌的菌体内蓄积嘌呤核苷；

将所述嘌呤核苷磷酸化而生成嘌呤核苷酸；以及

采集所述嘌呤核苷酸，

(A)PAJ_3461蛋白的活性降低的修饰；

(B)PAJ_3462蛋白的活性降低的修饰；

(C)PAJ_3463蛋白的活性降低的修饰。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，

所述嘌呤核苷选自肌苷、黄苷、鸟苷和腺苷。

7.根据权利要求5所述的方法，其中，

所述嘌呤核苷酸选自肌苷酸、黄苷酸、鸟苷酸和腺苷酸。

8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，

所述细菌具有所述(A)～(C)的修饰。

9.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，

10.根据权利要求9所述的方法，其中，

11.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，

所述PAJ_3461蛋白的活性通过PAJ_3461基因的缺失而降低；

所述PAJ_3463蛋白的活性通过PAJ_3463基因的缺失而降低。

12.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，

所述PAJ_3461蛋白为下述(1a)、(1b)或(1c)所述的蛋白质：

(1a)包含SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的蛋白质；

所述PAJ_3462蛋白为下述(2a)、(2b)或(2c)所述的蛋白质：

(2a)包含SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列的蛋白质；

所述PAJ_3463蛋白为下述(3a)、(3b)或(3c)所述的蛋白质：

(3a)包含SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列的蛋白质；

13.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，

所述细菌为泛菌(Pantoea)属细菌。

14.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，

所述细菌为菠萝泛菌(Pantoea ananatis)。

15.根据权利要求5～7中任一项所述的方法，其中，