JP4363042B2 - プリンヌクレオシドおよびプリンヌクレオチドの製造方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、５’−イノシン酸、５’−キサンチル酸および５’−グアニル酸の合成用の原料として重要な、イノシンおよびキサントシンのようなプリンヌクレオシドの製造方法、ならびにそれらの製造用の新規微生物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、ヌクレオシドは、アデニン栄養要求株、またはこれらの株にプリンアナログおよびサルファグアニジンのような様々な薬剤に対する耐性をさらに付与した株を用いた発酵法により工業的に生産されてきた。そのような株として、バチルス属（特許文献１〜８）、ブレビバクテリウム属（特許文献９、１０、非特許文献１）、エシェリヒア属（特許文献１１）等がある。
【０００３】
従来、これらの変異株の取得は、微生物を、ＵＶ照射およびニトロソグアニジン（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）処理等、突然変異処理し、適当な選択培地を用いることで、所望の株を選択することを含む。他方、遺伝子操作技術を用いた変異株の育種も、バチルス属（特許文献１２〜２１）、およびブレビバクテリウム属（特許文献２２）に属する菌株について行われてきた。
【０００４】
本発明者等は、最小培地中で高濃度のスレオニン、ホモセリンおよび幾つかの他のアミノ酸、ならびにアミノ酸アナログに対する耐性を付与するｒｈｔＡ２３変異を有するエシェリヒア・コリＫ−１２の変異株を得ている。ｒｈｔＡ２３変異は、エシェリヒア・コリ生産株によるＬ−スレオニンの生産を顕著に改善した（非特許文献２）。さらに、本発明者等は、ｒｈｔＡ遺伝子はエシェリヒア・コリ染色体上の１８分の位置に存在し、同遺伝子はｐｅｘＢとｏｍｐＸ遺伝子との間のｙｂｉＦ ＯＲＦと同一であることを見出した。また、本発明者等は、ｒｈｔＡ２３変異は、ＡＴＧ開始コドンに対して−１位のＧからＡへの置換であることを見出した。この変異は、細胞からのスレオニンおよびホモセリンの輸送を増加させると思われる（非特許文献２）。
【０００５】
しかし、現時点では、細胞からのプリン化合物の輸送体については報告されていない。
【０００６】
【特許文献１】
特公昭３８−２３０３９号公報
【特許文献２】
特公昭５４−１７０３３号公報
【特許文献３】
特公昭５５−２９５６号公報
【特許文献４】
特公昭５５−４５１９９号公報
【特許文献５】
特開昭５６−１６２９９８号公報
【特許文献６】
特公昭５７−１４１６０号公報
【特許文献７】
特公昭５７−４１９１５
【特許文献８】
特開昭５９−４２８９５号公報
【特許文献９】
特公昭５１−５０７５号公報
【特許文献１０】
特公昭５８−１７５９２号公報
【特許文献１１】
国際公開第９９０３９８８号パンフレット
【特許文献１２】
特開昭５８−１５８１９７号公報
【特許文献１３】
特開昭５８−１７５４９３号公報
【特許文献１４】
特開昭５９−２８４７０号公報
【特許文献１５】
特開昭６０−１５６３８８号公報
【特許文献１６】
特開平１−２７４７７号公報
【特許文献１７】
特開平１−１７４３８５号公報
【特許文献１８】
特開平３−５８７８７号公報
【特許文献１９】
特開平３−１６４１８５号公報
【特許文献２０】
特開平５−８４０６７号公報
【特許文献２１】
特開平５−１９２１６４号公報
【特許文献２２】
特開昭６３−２４８３９４号公報
【非特許文献１】
Agric. Biol. Chem., 42, 399 (1978)
【非特許文献２】
ABSTRACTS of 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ヌクレオシド生産株のヌクレオシド生産性を高めて、その株を用いたイノシンまたはキサントシン等のヌクレオシドの製造方法を提供することを課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記課題は、ｒｈｔＡ２３変異がプリン塩基アナログである８−アザアデニンに対する耐性を付与し、ヌクレオシド生産性を高めることができることを見出すことにより解決された。さらに、野生型ｒｈｔＡ遺伝子（これは膜タンパク質をコードする）は、プリンヌクレオチドの生合成経路に関与しないが、同遺伝子を多コピーベクターで細菌に導入すると、同細菌にプリン塩基アナログに対する耐性を付与した。さらに、野生型ｒｈｔＡ遺伝子は、コピー数を高めるようにエシェリヒア属またはバチルス属に属するプリン生産株に導入されると、それぞれのヌクレオシド生産性を高めることができる。かくして本発明は完成された。
本発明は、エシェリヒア属またはバチルス属に属し、プリンヌクレオシドを生産する能力を有する微生物を提供する。
【０００９】
具体的には、本発明は、微生物の細胞からのプリンヌクレオシドの輸送に関与すると思われるタンパク質の活性の上昇に基づいてプリンヌクレオシド生産能が改善された微生物を提供する。より具体的には、本発明は、プリンヌクレオシド排出に関与するタンパク質をコードする遺伝子の発現の増加に基づいてプリンヌクレオシド生産能が改善された微生物を提供する。
【００１０】
本発明はさらに、上記微生物を培地で培養して、該培地中にプリンヌクレオシドを生成、蓄積させ、同培地からプリンヌクレオチドを採取することとを含む、発酵によりプリンヌクレオシドを製造する方法を提供する。
【００１１】
本発明はさらに、本発明の細菌を培地で培養し、生成、蓄積したヌクレオシドをリン酸化し、生成、蓄積したプリンヌクレオチドを採取することを含む、５’−イノシン酸および５’−キサンチル酸等のプリンヌクレオチドの製造方法を提供する。
【００１２】
本発明はさらに、上記細菌のような細菌を培地で培養し、生成、蓄積したキサントシンをリン酸化し、生成、蓄積した５’−キサンチル酸をアミノ化し、そして生成、蓄積した５’−グアニル酸を採取することとを含む、５’−グアニル酸の製造方法を提供する。
【００１３】
本発明は、以下のとおりである。
（１）プリンヌクレオシド生産能を有するエシェリヒア属またはバチルス属に属する細菌であって、上記細菌中の下記（Ａ）または（Ｂ）に示すタンパク質の活性が増強された細菌：
（Ａ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、
（Ｂ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、前記細菌を８−アザアデニン耐性にする活性を有するタンパク質。
（２）前記（Ａ）または（Ｂ）に示すタンパク質の活性が、前記（Ａ）または（Ｂ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡでの前記細菌の形質転換、または前記細菌中の同ＤＮＡの発現調節配列の改変により増強された、（１）に記載の細菌。
（３）前記形質転換は多コピーベクターを用いて行われる（２）に記載の細菌。
（４）前記プリンヌクレオシドはイノシンである（１）に記載の細菌。
（５）前記プリンヌクレオシドはキサントシンである、（１）に記載の細菌。
（６）プリンヌクレオシドの製造方法であって、（１）〜（５）のいずれかに記載の細菌を培地で培養し、生成、蓄積したプリンヌクレオシドを該培地から採取する。
（６）（１）〜（５）のいずれかに記載の細菌を培地で培養し、生成、蓄積したプリンヌクレオシドを該培地から採取することを特徴とするプリンヌクレオシドの製造方法。
（７）前記プリンヌクレオシドはイノシンである（６）に記載の方法。
（８）前記プリンヌクレオシドはキサントシンである（６）に記載の方法。
（９）前記細菌は、プリンヌクレオチド生合成のための遺伝子の発現が高められるよう改変された（６）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）（１）〜（５）のいずれかに記載の細菌を培地で培養し、生成、蓄積したヌクレオシドをリン酸化し、生成、蓄積したプリンヌクレオチドを採取することを特徴とするプリンヌクレオチドの製造方法。
（１１）前記プリンヌクレオチドは５’−イノシン酸である（１０）に記載の方法。
（１２）前記プリンヌクレオチドは５’−キサンチル酸である（１０）に記載の方法。
（１３）前記細菌は、プリンヌクレオチド生合成のための遺伝子の発現が高められるように改変された（１０）〜（１２）のいずれかに記載の方法。
（１４）（５）に記載の細菌を培地で培養し、生成、蓄積したキサントシンをリン酸化し、生成、蓄積した５’−キサンチル酸をアミノ化し、そして生成、蓄積した５’−グアニル酸を採取することを特徴とする５’−グアニル酸の製造方法。
（１５）前記細菌は、プリンヌクレオチド生合成のための遺伝子の発現が高められるように改変された（１４）に記載の方法。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１５】
＜１＞本発明の細菌
本発明の細菌は、プリンヌクレオシド生産能を有するエシェリヒア属またはバチルス属に属する細菌であって、細菌の細胞中の下記（Ａ）または（Ｂ）に示すタンパク質の活性が増強された細菌である。
（Ａ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、
（Ｂ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、前記細菌を８−アザアデニン耐性にする活性を有するタンパク質。
【００１６】
「バチルス属またはエシェリヒア属に属する細菌」という用語は、細菌が、微生物学における当業者に既知の分類に従ってバチルス属またはエシェリヒア属に分類されることを意味する。本発明で使用されるエシェリヒア属に属する細菌の例として、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli (E.coli)）が挙げられる。本発明で使用されるバチルス属に属する細菌の例として、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis (B.subtilis)）を挙げることができる。
【００１７】
本明細書中で使用する「プリンヌクレオシド」という用語は、イノシン、キサントシン、グアノシン、およびアデノシンを包含する。
【００１８】
本明細書で使用する「プリンヌクレオシド生産能」という用語は、プリンヌクレオシドを生成して培地中に蓄積する能力を意味する。「プリンヌクレオチド生産能を有する」という用語は、エシェリヒア属またはバチルス属に属する細菌が、エシェリヒア・コリＷ３１１０およびＭＧ１６５５株のようなエシェリヒア・コリの野生株、またはバチルス・ズブチリス１６８のようなバチルス・ズブチリスの野生株よりも多い量で、プリンヌクレオシドを生成して培地中に蓄積することが可能であることを意味し、好ましくは、細菌が、１０ｍｇ／Ｌ以上、より好ましくは５０ｍｇ／Ｌ以上の量のイノシン、キサントシン、グアノシンまたはアデノシン、又はこれらの混合物を生成して培地中に蓄積することが可能であることを意味する。
【００１９】
「細菌の細胞中の下記（Ａ）または（Ｂ）に示すタンパク質の活性が増強された」という用語は、細胞中のタンパク質分子の量が増加するか、またはタンパク質自体当たりの比活性が上昇することを意味する。この「活性」という用語は、細菌を８−アザアデニン耐性にする活性を意味する。
【００２０】
本発明のタンパク質には、下記（Ａ）または（Ｂ）に示すものが含まれる。
（Ａ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、
（Ｂ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ細菌を８−アザアデニン耐性にする活性を有するタンパク質。
【００２１】
配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質は、ＲｈｔＡタンパク質をコードする。ＲｈｔＡタンパク質は、２９５個のアミノ酸から構成され、未知の機能を有する推定上の膜貫通サブユニットである。ＲｈｔＡタンパク質は、ｒｈｔＡ遺伝子によりコードされる。ｒｈｔＡ遺伝子は、グルタミン輸送系の構成成分をコードするｇｌｎＨＰＱオペロンに近接するエシェリヒア・コリ染色体上の１８分に存在する。ｒｈｔＡ遺伝子は、ｐｅｘＢおよびｏｍｐＸ遺伝子の間に位置するＯＲＦ１（ｙｂｉＦ遺伝子、GenBankアクセッション番号AAA218541、gi:440181の７６４番〜１６５１番）と同一である。このＯＲＦによりコードされるタンパク質を発現するユニットはｒｈｔＡ（ｒｈｔ：resistance to homoserine and threonine（ホモセリンおよびスレオニンに対する耐性））遺伝子と称されている（Astaurova, O.B. et al., Appl. Bioch. And Microbiol., 21, 611-616 (1985)）。これは、本発明者等は以前に、最小培地での高濃度のスレオニンまたはホモセリンに対する耐性に関与するｒｈｔＡ遺伝子の変異体であるｔｈｒＲ（本明細書中ではｒｈｔＡ２３と呼ぶ）を有するエシェリヒア・コリＫ−１２の変異株を得ていたことによる。この変異は、ＶＫＰＭ−３９９６株のようなエシェリヒア・コリ生産株のＬ−スレオニン（旧ソビエト連邦共和国特許第９７４８１７号）、ホモセリンおよびグルタミン酸（Astaurova, O.B. et al., Appl. Bioch. And Microbiol., 27, 556-561, 1991）の生産性を改善した。本発明者等は、ｒｈｔＡ２３変異が、ＡＴＧ開始コドンに対して−１位におけるＧからＡへの置換であることを示している（ABSTRACTS of 17th International Congress of Biochmistry and Molecular Biology in conjugation with 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457）。
【００２２】
本発明における「数個の」アミノ酸の数は、タンパク質の三次元構造中のアミノ酸残基の位置またはタイプによって異なる。この数は、タンパク質（Ａ）について２〜３０個、好ましくは２〜１５個、より好ましくは２〜５個であり得る。
【００２３】
「８−アザアデニン耐性」という用語は、野生株または親株が生育できない濃度で８−アザアデニンを含有する最小培地上で細菌が生育する能力、又は、８−アザアデニンを含有する培地上で細菌が野生株または親株より速く生育する能力を意味する。上記の８−アザアデニンの濃度は、通常５０〜５０００μｇ／ｍｌ、好ましくは１００〜１０００μｇ／ｍｌである。
【００２４】
本発明のタンパク質の活性の増強のための手法、特に細胞中のタンパク質分子の量を増加させるための手法として、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの発現調節配列の改変、および遺伝子のコピー数の増加が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２５】
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの発現調節配列の改変は、強力なプロモーターの制御下に、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを配置することにより達成され得る。プロモーターの強度は、ＲＮＡ合成開始の頻度により定義される。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Deuschle, U., Kammerer, W., Gentz, R., Bujard, H.（Promotors in Esherichia coli : a hierarchy of in vivo strength indicates alternate structures. EMBO J. 1986, 5, 2987-2994）等に記載されている。例えば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、λファージのＰLプロモーターが強力なプロモーターとして知られている。又は、プロモーターは、例えばプロモーターの下流に位置する遺伝子の転写レベルを上昇させるようにプロモーターに変異を導入することにより増強され得る。さらに、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と開始コドンとの間のスペーサ、特に開始コドンのすぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換がｍＲＮＡの翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られている。例えば、開始コドンの前の３つのヌクレオチドの性質に応じて、発現レベルの２０倍の変化が見出されている（Gold et al., Annu. Rev. Microbiol., 35, 365-403, 1981; Hui et al., EMBO J., 3, 623-629, 1984）。上述に記載されるように、本発明者等は、ｒｈｔＡ２３変異が、ＡＴＧ開始コドンに対して−１位におけるＧからＡへの置換であることを示した。したがって、ｒｈｔＡ２３変異は、ｒｈｔＡ遺伝子の発現を高め、結果として、細胞外に輸送されるスレオニン、ホモセリンおよび他のいくつかの物質に対する耐性レベルを増大させることが示唆される。
【００２６】
さらに、遺伝子の転写レベルを上昇させるために、エンハンサーを新たに導入してもよい。遺伝子またはプロモーターを含むＤＮＡの染色体ＤＮＡへの導入は、例えば、特開平１−２１５２８０号に記載されている。
【００２７】
あるいは、遺伝子のコピー数は、多コピーベクターに遺伝子を挿入して組換えＤＮＡを調製した後、同組換えＤＮＡを微生物に導入することにより上昇させることができる。組換えＤＮＡの導入に使用されるベクターとしては、ｐＭＷ１１８、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＥＴ２２ｂ等のプラスミドベクター、ｌ１０５９、ｌＢＦ１０１、Ｍ１３ｍｐ９、Ｍｕファージ（特開平２−１０９９８５号）等のようなファージベクター、およびＭｕ、Ｔｎ１０、Ｔｎ５等のようなトランスポゾン（Berg, D.E. and Berg, C.M., Bio/Technol., 1, 417 (1983)）が例示される。相同組換えのためのプラスミドを利用した方法等により遺伝子を染色体に組み込むことで、遺伝子のコピー数を増加させることも可能である。
【００２８】
強力なプロモーターまたはエンハンサーを用いた手法は、遺伝子コピーの増加に基づく手法と組み合わせることができる。
【００２９】
本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現量が増加したエシェリヒア属またはバチルス属に属する細菌を育種するために、エシェリヒア・コリおよびバチルス・ズブチリスの遺伝子について既に入手可能な情報に主として基づいて、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）により、遺伝子の必須領域を得ることができる。例えば、輸送体をコードする遺伝子と思われるｒｈｔＡ遺伝子を、ＰＣＲ手法を用いて、エシェリヒア・コリＫ１２ Ｗ３１１０またはエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株の染色体ＤＮＡからクローニングすることができる。これに使用される染色体ＤＮＡは、エシェリヒア・コリの他の任意の株に由来してもよい。
【００３０】
本発明のタンパク質には、ＲｈｔＡタンパク質の機能的特性、少なくとも８−アザアデニン耐性を示す限り、自然の多様性に起因して存在し得るＲｈｔＡタンパク質の変異体およびバリアントが包含される。同変異体およびバリアントをコードするＤＮＡは、ストリンジェントな条件下でｒｈｔＡ遺伝子（配列番号１）または同遺伝子の一部とハイブリダイズし、かつＬ−アミノ酸生産性を高めるタンパク質をコードするＤＮＡを単離することにより得ることができる。本明細書にいう「ストリンジェントな条件」という用語は、いわゆる特異的ハイブリッドが形成され、非特異的ハイブリッドが形成されない条件である。例えば、ストリンジェントな条件としては、高い相同性を有するＤＮＡ、例えば、互いに７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズする条件が挙げられる。あるいは、ストリンジェントな条件としては、サザンハイブリダイゼーションにおける洗浄の通常の条件、例えば、６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含む条件が例示される。変異体をコードし、かつｒｈｔＡ遺伝子とハイブリダイズするＤＮＡ用のプローブとして、配列番号１のヌクレオチド配列の部分配列もまた使用することができる。そのようなプローブは、プライマーとして配列番号１のヌクレオチド配列に基づいて調製されるオリゴヌクレオチド、および、鋳型として配列番号１のヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ断片を用いたＰＣＲにより調製され得る。約３００ｂｐ長のＤＮＡ断片をプローブとして用いる場合、ハイブリダイゼーション用の洗浄条件は、例えば、５０℃、２×ＳＳＣ、および０．１％ＳＤＳを含む。前記相同性は、典型的にはLipman-Pearsonの方法（Science 227, 1435-1441 (1985)）又はTakashi & Gotohの方法（J. Biochem. 92, 1173-1177 (1984)）により算出される値である。プローブの設計は、当業者に公知の方法に従って行うことができる。
【００３１】
本発明の細菌は、ヌクレオシドを生産する能力を元々有する細菌に本発明のタンパク質をコードする上記ＤＮＡを導入することにより得ることができる。あるいは、本発明の細菌は、上記ＤＮＡをすでに保有する細菌に、ヌクレオシドを生産する能力を付与することにより得ることができる。
【００３２】
イノシンを生産し、かつ、本発明のタンパク質の活性を高める親株としては、エシェリヒア・コリAJ13732（FADRaddeddyicPpgixapA(pMWKQ)）株（WO 9903988号）を使用することができる。同株は、ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼをコードするｐｕｒＦ遺伝子、プリンリプレッサーをコードするｐｕｒＲ遺伝子、プリンヌクレオシドホスホリラーゼをコードするｄｅｏＤ遺伝子、スクシニル−ＡＭＰシンターゼをコードするｐｕｒＡ遺伝子、アデノシンデアミナーゼをコードするａｄｄ遺伝子、６−ホスホグルコン酸デヒドラーゼをコードするｅｄｄ遺伝子、ホスホグルコースイソメラーゼをコードするｐｇｉ遺伝子、キサントシンホスホリラーゼをコードするｘａｐＡ遺伝子に変異が導入され（ｐｕｒＦ-、ｐｕｒＡ-、ｄｅｏＤ-、ｐｕｒＲ-、ａｄｄ-、ｅｄｄ-、ｐｇｉ-、ｘａｐＡ-）、ｐＭＷＫＱプラスミドを保有する、既知の菌株Ｗ３１１０の誘導体である。そして、同株が保持するｐＭＷＫＱプラスミドは、ｐＭＷ２１８ベクターの誘導体であり、ＧＭＰに非感受性のＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼをコードするｐｕｒＦＫＯ遺伝子が挿入されている（国際公開第９９０３９８８号）。
【００３３】
キサントシンを生産し、本発明のタンパク質の活性が高められる親株としては、エシェリヒア・コリAJ13732guaA::Tn10(pMWKQ)株を使用することができる。エシェリヒア・コリAJ13732guaA::Tn10(pMWKQ)株は、AJ13732(pMWKQ)上のＧＭＰシンテターゼ遺伝子を破壊することにより構築される（実施例７を参照）。
【００３４】
バチルス属に属するイノシン生産株の例として、バチルス・ズブチリスＫＭＢＳ１６株を使用することができる。同菌株は、プリンリプレッサーをコードするｐｕｒＲ遺伝子（ｐｕｒＲ：：ｓｐｃ）、スクシニル−ＡＭＰシンターゼをコードするｐｕｒＡ遺伝子（ｐｕｒＡ：：ｅｒｍ）、およびプリンヌクレオシドホスホリラーゼをコードするｄｅｏＤ遺伝子（ｄｅｏＤ：：ｋａｎ）に変異が導入された、既知のバチルス・ズブチリスｔｒｐＣ２株の誘導体である。本発明のタンパク質の活性が高められるバチルス属に属する別の親株として、バチルス・ズブチリスＡＪ１２７０７（ＦＥＲＭ Ｐ−１２９５１）株（特開昭６１−１３８７６Ａ２号）、バチルス・ズブチリス菌株ＡＪ３７７２（ＦＥＲＭ Ｐ−２５５５）（特開昭６２−０１４７９４Ａ２）等を例示することができる。
【００３５】
本発明のタンパク質当たりの比活性を上昇させるために、同タンパク質の活性を高めるような変異を同タンパク質の構造遺伝子に導入してもよい。遺伝子に変異を導入するためには、部位特異的変異誘発（Kramer, W. and Frits, H.J., Methods in Enzymology, 154, 350 (1980)）、リコンビナントＰＣＲ法（PCR Technology, Stockton Press (1989)）、ＤＮＡの特定部分の化学合成、目的の遺伝子のヒドロキシアミン処理、ＵＶ照射またはニトロソグアニジンもしくは亜硝酸のような化学薬剤により目的の遺伝子を保持する細菌菌株の処理等を使用することができる。前記タンパク質の活性が増強された細菌は、８−アザアデニンを含有する最小培地で生育する株、又は同培地で野生株もしくは親株よりも速く生育する株として選択することができる。
【００３６】
本発明の細菌は、プリン生合成に関与する１つまたはそれ以上の遺伝子の発現を増強することにより、さらに改善することができる。そのような遺伝子としては、バチルス・ズブチリスのpurEKB-purC(orf)QLF-purMNH(J)-purDオペロンの遺伝子（Ebbole DJ and Zalkin H, J. Biol. Chem., 262, 17, 8274-87, 1987）、およびエシェリヒア・コリのｐｕｒレギュロンの遺伝子（Escherichia and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C. Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996）が例示される。
【００３７】
プリンヌクレオチド合成酵素の抑制が遺伝子的に改変されたバチルス・ズブチリスの８−アザグアニン耐性変異株のイノシン生産が増強されたことが示されている（Shiio I., and Ishii K., J. Biochem., 69, 339-347, 1971）。ｐｕｒＲ変異株では、ｐｕｒＡ遺伝子の基底レベルの発現が１０倍増加し、さらにグアノシンによる刺激またはアデニンによる抑制は存在しない（Rappu P. et al, J Bacterial., 181, 123810-5, 1999）。ＧＭＰおよびＡＭＰによるフィードバック阻害を受けないように改変された変異型ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼをコードする変異ｐｕｒＦ遺伝子、およびプリンヌクレオチド生合成系のレプレッサーをコードするｐｕｒＲ遺伝子の不活性型を保持するエシェリヒア・コリのイノシン生産株が開示されている（国際公開第９９０３９８８号）。
【００３８】
本発明のタンパク質の活性の増強により、細菌のプリンヌクレオシド生産性が増強するメカニズムは、細菌の細胞からの目的プリンヌクレオシドの排出が増進することに起因することによると推測される。
【００３９】
＜２＞プリンヌクレオシドの製造方法
本発明の方法は、本発明の細菌を培地で培養し、プリンヌクレオシドを生成して培地中に蓄積させ、同プリンヌクレオシドを同培地から採取する、プリンヌクレオシドの製造方法を包含する。具体的には、本発明の方法は、本発明の細菌を培地で培養し、イノシンを生成して培地中に蓄積させ、イノシンを同培地から採取する、イノシンの製造方法を包含する。また、本発明の方法は、本発明の細菌を培地で培養し、キサントシンを生成して培地中に蓄積させ、キサントシンを同培地から採取する、キサントシンの製造方法を包含する。
【００４０】
本発明においては、培養、培地からのプリンヌクレオシドの採取および精製等は、プリンヌクレオシドが微生物を用いて生産される従来の発酵法と同様にして行うことができる。使用されるプリンヌクレオシド生産用培地は、炭素源、窒素源、無機イオン、および必要に応じて他の有機成分を含有する通常の培地であってよい。炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フルクトース、アラビノース、マルトース、キシロース、トレハロース、リボース、およびデンプン加水分解物のような糖類、グリセロール、マンニトールおよびソルビトールのようなアルコール類、グルコン酸、フマル酸、クエン酸およびコハク酸のような有機酸等を使用することができる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、およびリン酸アンモニウムのような無機アンモニウム塩、ダイズ加水分解物のような有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水溶液等を使用することができる。ビタミンＢ１のようなビタミン、要求物質、例えば、アデニンおよびＲＮＡのような核酸、または酵母抽出物等が、微量有機栄養分として適切な量で含まれることが望ましい。これら以外に、必要に応じて、少量の、リン酸カルシウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等を使用してもよい。
【００４１】
培養は、好ましくは、好気性条件下で１６〜７２時間行われ、培養中の培養温度は、３０〜４５℃以内に、ｐＨは、５〜８以内に制御される。ｐＨは、無機または有機の酸性もしくはアルカリ性物質、およびアンモニアガスにより調節され得る。
【００４２】
培養後、遠心分離または膜濾過により、細胞のような固形分を液体培地から除去することができ、続いてイオン交換樹脂および沈殿のような従来の技法のいずれか、または任意の組合せにより、目的とするプリンヌクレオシドを発酵液から回収することができる。
【００４３】
＜３＞プリンヌクレオチドの製造方法
本発明の方法はまた、本発明の細菌を培地で培養し、生成、蓄積したヌクレオシドをリン酸化し、生成、蓄積したプリンヌクレオチドを採取する、プリンヌクレオチドの製造方法を包含する。具体的には、本発明の方法は、本発明の細菌を培地で培養し、生成、蓄積したイノシンをリン酸化し、生成、蓄積した５’−イノシン酸を採取する、５’−イノシン酸の製造方法を包含する。さらに、本発明の方法は、本発明の細菌を培地で培養し、生成、蓄積したキサントシンをリン酸化し、生成、蓄積した５’−キサンチル酸を採取する、５’−キサンチル酸の製造方法を包含する。
【００４４】
本発明においては、培養、培地からのプリンヌクレオチドの採取および精製等は、プリンヌクレオチドを微生物を用いて生産する従来の発酵法と同様にして行うことができる。さらに、本発明においては、生成、蓄積したプリンヌクレオシドのリン酸化、および生成、蓄積したプリンヌクレオチドの採取は、プリンヌクレオシドからプリンヌクレオチドを生産する従来の発酵法に類似した様式で実施されてもよい。
【００４５】
プリンヌクレオシドのリン酸化は、種々のホスファターゼ、ヌクレオシドキナーゼまたはヌクレオシドホスホトランスフェラーゼを用いて酵素的に、あるいはＰＯＣｌ3等のようなリン酸化剤を用いて化学的に行うことができる。ヌクレオシドへのピロリン酸塩のリン酸基のＣ−５’位選択的転移を触媒することが可能なホスファターゼ（Mihara et al, Phosphorylation of nucleosides by the mutated acid phosphatase from Morganella morganii. Appl. Environ. Microbiol. 2000, 66:2811-2816）、またはポリリン酸（塩）、フェニルリン酸（塩）もしくはカルバミルリン酸（塩）をリン酸ドナーとして利用する酸性ホスファターゼ（WO 96/37603A1）等を使用してもよい。また、ホスファターゼの一例として、基質としてｐ−ニトロフェニルリン酸塩（Mitsugi, K., et al, Agric. Biol. Chem. 1964, 28, 586-600）、無機リン酸塩（特開昭４２−１１８６号）またはアセチルリン酸塩（特開昭６１−４１５５５号）を利用したヌクレオシドのＣ−２’、３’または５’位へのリン酸基の転移を触媒することが可能なホスファターゼ等を使用してもよい。ヌクレオチドキナーゼの例としては、エシェリヒア・コリ由来のグアノシン／イノシンキナーゼ（Mori et al., Cloning of a guanosine-inosine kinase gene of Escherichia coli and characterization of the purified gene product. J. Bacteriol. 1995. 177:4921-4926；WO 91/08286）等を使用してもよい。ヌクレオシドホスホトランスフェラーゼの例として、Hammer-Jespersen, K. (Nucleoside catabolism, p203-258. In A Munch-Petesen (ed.), Metabolism of nucleotides, nucleosides, and nucleobases in microorganism. 1980, Academic Press, New York）等に記載されているヌクレオシドホスホトランスフェラーゼを使用してもよい。ヌクレオシドの化学的リン酸化は、ＰＯＣｌ3のようなリン酸化剤（Yoshikawa et al. Studies of phosphorylation. III. Selective phosphorylation of unprotected nucleosides. Bull. Chem. Soc. Jpn. 1969, 42:3505-3508）等を用いて行うことができる。
【００４６】
本発明の方法は、前記細菌のような細菌を培地で培養し、生成、蓄積したキサントシンをリン酸化し、生成、蓄積した５’−キサンチル酸をアミノ化し、そして生成、蓄積した５’−グアニル酸を採取する、５’−グアニル酸の製造方法を包含する。本発明においては、前記細菌のような細菌の培地での培養、生成、蓄積したキサントシンのリン酸化、生成、蓄積した５’−キサンチル酸のアミノ化、および生成、蓄積した５’−グアニル酸の採取は、５’−キサンチル酸から５’−グアニル酸を生産する従来の発酵法と同様にして行うことができる。
【００４７】
５’−キサンチル酸のアミノ化は、例えば、エシェリヒア・コリ由来のＧＭＰシンテターゼ（Fujio et al. High level of expression of XMP aminase in Escherichia coli and its application for the industrial production of 5'-guanylic acid. Biosci. Biotech. Biochem. 1997, 61:840-845、欧州特許第０２５１４８９Ｂ１号）を用いて酵素的に行うことができる。
【００４８】
本発明の方法においては、本発明の細菌は、プリンヌクレオチド生合成のための遺伝子発現が高められるように改変してもよい。
【００４９】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【実施例１】
エシェリヒア・コリのｒｈｔＡ遺伝子のミニＭｕファージミドへのクローニング
ホモセリンおよびスレオニン耐性に関与することが当初見出されたｒｈｔＡ遺伝子を、ミニＭｕ ｄ５００５ファージミドを用いてクローニングした（Groisman, E.A., et al., J. Bacteriol., 168, 357-364 (1986)）。ＭＧ４４２株のＭｕＣｔｓ６２溶原株（Guayatiner et al., Genetika (in Russian), 14, 947-956 (1978)）をドナーとして使用し、新たに調製した溶菌液を用いて、ＶＫＰＭ Ｂ−５１３株（Ｈｆｒ Ｋ１０ｍｅｔＢ）のＭｕＣｔｓ溶原性誘導体に感染させた。メチオニン（５０μｇ／ｍｌ）、カナマイシン（４０μｇ／ｍｌ）およびホモセリン（１０ｍｇ／ｍｌ）を含むＭ９グルコース最小培地上で細胞を平板培養し、培養４８時間後に出現したコロニーを採取した。同コロニーからプラスミドＤＮＡを単離し、それを用いて、標準的な手法によりＶＫＰＭ Ｂ−５１３株を形質転換した。上述のように、カナマイシンおよびホモセリンを含むＬブロス寒天板上で形質転換体を選択した。ホモセリン耐性の形質転換体からプラスミドＤＮＡを単離して、挿入断片の構造を制限酵素マッピングにより分析した。異なる染色体領域に属する２つのタイプの挿入物をドナーからクローニングした。すなわち、多コピーベクター上でホモセリンに対する耐性を細菌に付与する少なくとも２つの異なる遺伝子が、エシェリヒア・コリに存在する。挿入物の１つのタイプは、（染色体マップ）８６分の領域由来の染色体断片であることが証明された。この場合には、耐性表現形質は、ｒｈｔＢおよびｒｈｔＣ遺伝子の過剰発現に関連していた（欧州特許出願公開第１０１３７６５Ａ１号および第１０１６７１０Ａ２号）。
【００５０】
（染色体マップ）１８分の染色体領域の挿入物を有するファージミドを選択するために、１７．５〜１８．５分の染色体断片を含む、Koharaライブラリー（Kohara's collection; Kohara et al., Cell, 50, 495-508, 1987）中の６つの組換えＥＭＢＬ４ファージ（３Ｄ４、２４Ｆ９、１Ｂ４、１０ＡＢ、３Ｅ５および１Ｅ２）を32Ｐで標識した混合物を、ハイブリダイゼーションプローブとして用いたコロニーハイブリダイゼーションを行った。結果として、細胞にスレオニンおよびホモセリンに対する耐性を付与する９．３ｋｂの領域を挿入物として有するファージミドｐＮＺ４Ｓが得られた。
【００５１】
【実施例２】
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ+およびｐＡＹＣＴＥＲ３ベクターへのｒｈｔＡ遺伝子のクローニング
ｐＮＺ４ＳファージミドをＸｍｎＩおよびＳｔｕＩ酵素で消化して、低融点アガロース中での電気泳動により分離した。ｒｈｔＡ遺伝子とそれ自身の調節領域を含む適切な断片を溶出して、ＥｃｏＲＶであらかじめ消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ+ベクター(Promega)のＥｃｏＲＶ部位に、ｌａｃプロモーターの向きと反対方向に挿入した。こうして、プラスミドｐＮＰＺ１６が得られた（図１）。さらに、ｐＮＰＺ１６上のｒｈｔＡ遺伝子を、ｐＡＹＣ３２の誘導体である安定な中程度のコピー数のベクターｐＡＹＣＴＥＲ３のＳｍａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位に再クローニングした。こうして、プラスミドｐＲＨＴＡ３が得られた（図２）。前記ベクターｐＡＹＣＴＥＲ３は、ＲＳＦ１０１０プラスミドレプリコンを有するｐＡＹＣ３２プラスミドに、ｐＵＣ１９プラスミド由来のポリリンカーおよびｒｒｎＢの強力なターミネーターを導入した、非常に安定な中程度のコピー数のベクターである（Christoserdov A.Y., Tsygankov Y.D, Plasmid, 1986, v. 16, pp. 161-167）。
【００５２】
【実施例３】
Ｌ−システイン誘導体排出に関与するＹｄｅＤタンパク質に対するｒｈｔＡ遺伝子産物の相同性の検討
ｒｈｔＡ遺伝子（配列番号１）は、２９５個のアミノ酸残基からなり、３１．３ｋＤａと計算される分子量を有するタンパク質をコードする。既知の方法（Kyte and Doolittle, J. Mol. Biol., 157, 105-132, (1982)）によるＲｈｔＡ配列の分析により、それが１０個の推定膜貫通セグメントを含む非常に疎水性の高いタンパク質であることが明らかとなった。ＲｈｔＡのハイドロパシープロフィールおよび推定膜貫通セグメント数（図３、実線）は、ＹｄｅＤタンパク質（図３、破線）に類似している。この結果により、それらの相同性が示された（Lolkema, J.S., and Slotboom, D.-J. FEMS Microbiol Rev., 22, 305-322 (1998)）。ＹｄｅＤタンパク質をコードするｙｄｅＤ遺伝子は、システイン経路の代謝産物の排出に関与している（Dabler et al., Mol. Microbiol. 36, 1101-1112 (2000)）。したがって、ｒｈｔＡ遺伝子は、細胞からの幾つかの代謝産物の輸送に関与する膜タンパク質をコードすると予測され得る。
【００５３】
【実施例４】
ｐＥＴ２２ｂ−ｒｈｔＡプラスミドの構築、およびｒｈｔＡ遺伝子産物の細胞内局在部位の決定
ＮｄｅＩ制限部位を含む配列番号３およびＥｃｏＲＩ制限部位を含む配列番号４のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、ｒｈｔＡ構造遺伝子をｐＮＰＺ１６から増幅した。ＰＣＲ産物をＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素で消化して、同じ制限酵素であらかじめ処理した細菌発現ベクターｐＥＴ２２ｂ(Novogene)に連結させた。ｌａｃプロモーターの制御下にあるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子(Novogene)を含む得られたプラスミドｐＥＴ２２ｂ−ｒｈｔＡは、エシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株の形質転換に使用した。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の誘導、およびタンパク質の［35Ｓ］メチオニンによる標識は、基本的にこれまでに記載されている方法（Tabor and Richardson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 1074-1078 (1985)）を、いくつかの点で変更して行った。
上記の変更は、以下のとおりである。タンパク質の発現は、１９個のアミノ酸混合物（最終濃度０．００５％）を補充したＭ９培地中で対数増殖期に達した培養液５ｍｌに、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ；最終濃度２ｍＭ）を添加することにより誘導した。新たに合成されたタンパク質の標識は、培養液５ｍｌに５０μＣｉの［35Ｓ］メチオニンを添加することにより行った。遠心分離により細胞を採取して、それを分画に使用した。破砕用緩衝液（１ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ジチオトレイトールおよび１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリドを含有する１００ｍＭ トリスＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５）中にペレットを再懸濁させ、超音波処理により細胞を破壊した。１５，０００ｇで２０分間遠心分離して細胞片を除去した後、１８，０００ｇで１８０分間超遠心分離して膜分画を採取した。室温で３０分間、１ＭのＫＣｌを含有する破砕用緩衝液中で得られたペレット（膜分画）を攪拌し、１８０，０００ｇで１８０分間遠心分離した。上清（溶解性分画）に、トリクロロ酢酸（最終濃度１０％）を加えて４℃で３０分間インキュベーションすることによりタンパク質を沈殿させ、遠心分離して、アセトンで洗浄した。すべてのペレットを、相当する上清と同一容量のゲルローディング緩衝液（Laemmli, Nature 227, 680-685 (1970)）中に再懸濁させた。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Laemmli, Nature 227, 680-685 (1970)）を用いて、タンパク質を分析した。
【００５４】
細胞分画中のＲｈｔＡタンパク質の分布を図４に示す。ＲｈｔＡは、膜分画と共沈降し（図４、レーン４および６）、溶解性タンパク質の分画中には存在しなかった（図４、レーン５）。同様のタンパク質分布が、膜分画のＫＣｌ処理後に観察された（図４、レーン６、７）。これらのデータは、ＲｈｔＡが膜内在性タンパク質（integral membrane protein）であるとの見解を支持する。ＲｈｔＡの電気泳動における移動度は、予測される３１．３ｋＤではなく約２５ｋＤａの分子質量に相当した。ＹｄｅＤタンパク質もまた、同様の移動性を示す（Dabler et al., Mol. Microbiol. 36, 1101-1112 (2000)）ことから、それはＲｈｔＡが疎水性であることの結果であるかもしれない。
【００５５】
【実施例５】
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のプリン塩基アナログ耐性に対するｒｈｔＡ２３変異およびｒｈｔＡ遺伝子増幅の影響
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株に、ＶＫＰＭ Ｂ−３９９６株（米国特許第５，９７６，８４３号）が有するｒｈｔＡ２３変異を、ファージＰ１媒介形質導入によって導入することにより、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５ ｒｈｔＡ２３株を構築した。形質導入株を、１０ｍｇ／ｍｌのホモセリンを含有するＭ９最小培地（Miller, 1972）上で選択した。こうして、同質遺伝子型菌株であるエシェリヒア・コリＭＧ１６５５ ｒｈｔＡ+およびエシェリヒア・コリＭＧ１６５５ ｒｈｔＡ２３が得られた。
【００５６】
さらに、ｐＮＰＺ１６およびｐＲＨＴＡ３プラスミド、ならびにこれらに相当するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ+およびｐＡＹＣＴＥＲ３ベクターを、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株に導入した。こうして、ＭＧ１６５５（ｐＮＺ６１）株、ＭＧ１６５５（ｐＲＨＴＡ３）株、ＭＧ１６５５（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）株およびＭＧ１６５５（ｐＡＹＣＴＥＲ３）株を得た。次に、段階的濃度のプリン塩基アナログを含有するＭ９グルコース最少寒天板上で各株が生育する能力を測定した。最小培地（プラスミド保持株用にはアンピシリン１００ｍｇ／ｍｌを補充した）中で一晩生育させた培養液中の１０5〜１０6個の細胞を、プレートにスポットし、３７℃の４４時間のインキュベーション後に、生育を評価した。結果を表１に示す。
【００５７】
【表１】
【００５８】
表１からわかるように、ｒｈｔＡ２３変異およびｒｈｔＡ遺伝子の増幅は、細菌の８−アザアデニンに対する耐性を増加させた。したがって、ｒｈｔＡ遺伝子は、プリン誘導体の排出に関与すると予測され得る。
【００５９】
【実施例６】
エシェリヒア・コリのイノシン生産株によるイノシン生産に対するｒｈｔＡ２３変異の効果
イノシン生産株ＡＪ１３７３２（ｐＭＷＫＱ）を、実施例５に記載したように、ｒｈｔＡ２３変異の導入用の親株として使用した。こうして、ＡＪ１３７３２ｒｈｔＡ２３（ｐＭＷＫＱ）株を得た。ＡＪ１３７３２（ｐＭＷＫＱ）株およびＡＪ１３７３２ｒｈｔＡ２３（ｐＭＷＫＱ）株を、それぞれ１００ｍｇ／ｌのアンピシリンおよび７５ｍｇ／ｌのカナマイシンを含有するＬブロス中で、３７℃で１８時間培養した。得られた培養物０．３ｍｌを、２０×２００ｍｍ試験管中の１００ｍｇ／ｌアンピシリンおよび７５ｍｇ／ｌカナマイシンを含有する発酵培地３ｍｌに接種し、ロータリーシェーカーを用いて３７℃で７２時間培養した。
【００６０】
発酵培地の組成（ｇ／ｌ）：
グルコース ４０．０
（ＮＨ4）2ＳＯ4 １６．０
Ｋ2ＨＰＯ4 １．０
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １．０
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０１
ＭｎＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ０．０１
酵母抽出物 ８．０
ＣａＣＯ3 ３０．０
グルコースおよび硫酸マグネシウムは、別個に滅菌する。ＣａＣＯ3は、１８０度で２時間、乾熱滅菌する。ｐＨは７．０に調節する。滅菌後に、培地中に抗生物質を加える。
【００６１】
培養後、培地中に蓄積したイノシン量をＨＰＬＣにより測定した。培養液（５００μｌ）を、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清をＨ2Ｏで１００倍希釈して、ＨＰＬＣにより分析した。
【００６２】
ＨＰＬＣ分析用条件：
カラム：Ｌｕｎａ Ｃ１８（２） ２５０×３ｍｍ、５ｕ(Phenomenex, USA)。
緩衝液：２％ｖ／ｖＣ2Ｈ5ＯＨ；０．８％ｖ／ｖトリエチルアミン；０．５％ｖ／ｖ酢酸（氷酢酸）；ｐＨ４．５。
温度：３０℃。
流速：０．３ｍｌ／分。
注入容量：５μｌ。
検出：ＵＶ２５０ｎｍ。
保持時間（分）：
キサントシン １３．７
イノシン ９．６
ヒポキサンチン ５．２
グアノシン １１．４
アデノシン ２８．２
【００６３】
結果を表２に示す。
【００６４】
【表２】
【００６５】
表２からわかるように、ｒｈｔＡ２３変異は、ＡＪ１３７３２株のイノシン生産性を改善した。
【００６６】
【実施例７】
エシェリヒア・コリのキサントシン生産株によるキサントシン生産に対するｒｈｔＡ変異の効果
キサントシン生産株を、イノシン生産株ＡＪ１３７３２（ｐＭＷＫＱ）から得た。ＡＪ１３７３２（ｐＭＷＫＱ）株に、ＧＭＰシンテターゼ遺伝子（ｇｕａＡ）を不活性化する変異ｇｕａＡ：：Ｔｎ１０を、ファージＰ１媒介形質導入により導入した。形質導入株を、２０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有するＬＢ培地上で選択した。その中から、キサントシンを生産することが可能なＡＪ１３７３２ｇｕａＡ：：Ｔｎ１０（ｐＭＷＫＱ）株を見出した。実施例５に記載したように、ｒｈｔＡ２３変異を含むこの株の誘導体を取得し、ＡＪ１３７３２ｇｕａＡ：：Ｔｎ１０ｒｈｔＡ２３（ｐＭＷＫＱ）株と命名した。
【００６７】
ＡＪ１３７３２ｇｕａ：：Ｔｎ１０（ｐＭＷＫＱ）株およびＡＪ１３７３２ｇｕａＡ：：Ｔｎ１０ｒｈｔＡ２３（ｐＭＷＫＱ）株を、それぞれ１０ｍｇ／ｌのカナマイシンおよび１０ｍｇ／ｌのテトラサイクリンを含有するＬブロス中で、３７℃で１８時間培養した。得られた培養液０．３ｍｌを、２０×２００ｍｍ試験管中の７５ｍｇ／ｌのカナマイシンおよび１０ｍｇ／ｌのテトラサイクリンを含有する発酵培地（実施例３を参照）３ｍｌに接種し、ロータリーシェーカーを用いて、３７℃で４８時間培養した。培養後、培地中に蓄積したキサントシン量を、上述のようにＨＰＬＣにより測定した。結果を表３に示す。
【００６８】
【表３】
【００６９】
表３からわかるように、ｒｈｔＡ２３変異は、ＡＪ１３７３２ｇｕａＡ：：Ｔｎ１０（ｐＭＷＫＱ）株のキサントシン生産性を改善した。
【００７０】
【実施例８】
エシェリヒア・コリのイノシン生産株によるイノシン生産に対するｒｈｔＡ遺伝子増幅の効果
イノシン生産株ＡＪ１３７３２（ｐＭＷＫＱ）を、ｐＡＹＣＴＥＲ３ベクターおよびｐＲＨＴＡ３プラスミドにより形質転換した。こうして、ＡＪ１３７３２（ｐＭＷＫＱ，ｐＡＹＣＴＥＲ３）株およびＡＪ１３７３２（ｐＭＷＫＱ，ＲＨＴＡ３）株を得た。これらの株を、それぞれ１００ｍｇ／ｌのアンピシリンおよび７５ｍｇ／ｌのカナマイシンを含有するＬブロス中で、３７℃で１８時間培養した。得られた培養液０．３ｍｌを、２０×２００ｍｍ試験管中の１００ｍｇ／ｌのアンピシリンおよび７５ｍｇ／ｌのカナマイシンを含有する発酵培地（実施例３を参照）３ｍｌに接種し、ロータリーシェーカーを用いて３７℃で４８時間培養した。培養後、培地中に蓄積したイノシン量を、上述のようにＨＰＬＣにより測定した。結果を表４に示す。
【００７１】
【表４】
【００７２】
表４からわかるように、ｒｈｔＡ遺伝子増幅は、、ＡＪ１３７３２（ｐＭＷＫＱ）株のイノシン生産性を改善した。
【００７３】
【実施例９】
エシェリヒア・コリのキサントシン生産株によるキサントシン生産に対するｒｈｔＡ遺伝子増幅の影響
実施例７に記載したキサントシン生産株ＡＪ１３７３２ｇｕａＡ：：Ｔｎ１０（ｐＭＷＫＱ）を、ｐＲＨＴＡ３プラスミドまたはｐＡＹＣＴＥＲ３ベクターにより形質転換して、ＡＪ１３７３２ｇｕａＡ：：Ｔｎ１０（ｐＭＷＫＱ，ＲＨＴＡ３）およびＡＪ１３７３２ｇｕａＡ：：Ｔｎ１０（ｐＭＷＫＱ，ｐＡＹＣＴＥＲ３）を得た。これらの株を、それぞれ１００ｍｇ／ｌのアンピシリンおよび７５ｍｇ／ｌのカナマイシンを有するＬブロス中で、３７℃で１８時間培養した。得られた培養液０．３ｍｌを、２０×２００ｍｍ試験管中の１００ｍｇ／ｌのアンピシリンおよび７５ｍｇ／ｌのカナマイシンを含有する発酵培地（実施例３を参照）３ｍｌに接種し、ロータリーシェーカーを用いて、３７℃で４８時間培養した。培養後、培地中に蓄積したキサントシン量を、上述のようにＨＰＬＣにより測定した。結果を表５に示す。
【００７４】
【表５】
【００７５】
表５からわかるように、ｒｈｔＡ遺伝子増幅は、ＡＪ１３７３２ｇｕａＡ：：Ｔｎ１０（ｐＭＷＫＱ）株のキサントシン生産性を改善した。
【００７６】
【実施例１０】
ｒｈｔＡ遺伝子のｐＬＦ１４ベクターへのクローニング
遺伝子バンクデータの検索により得られる情報に基づいて、５１merのプライマーＮｏ．１（配列番号５）および１９merのプライマーＮｏ．２（配列番号６）を合成した。
【００７７】
プライマーＮｏ．１は、バチルス・ズブチリス由来のｐｕｒＥ遺伝子の開始コドンから上流の３０番目〜１番目のヌクレオチド由来の配列、およびエシェリヒア・コリ由来のｒｈｔＡ遺伝子の開始コドンから２１番目の下流ヌクレオチド由来の配列から構成される。ｐｕｒＥ遺伝子の開始コドンから上流の３０番目〜１番目のヌクレオチド由来の配列は、ｐｕｒＥ遺伝子リボソーム結合部位およびその隣接スペーサー配列を含む。プライマーＮｏ．２は、ｒｈｔＡ遺伝子の終止コドンから１２２〜１０５ヌクレオチド下流の配列に相補的な配列である。鋳型としてエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株の染色体ＤＮＡを用いて、９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で２分を３０サイクルでＰＣＲを行った（Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer）。バチルス・ズブチリス由来のｐｕｒＥ遺伝子リボソーム結合部位およびその隣接スペーサー配列に融合されたｒｈｔＡ遺伝子を含有する得られたＰＣＲ断片を、ｐＧＥＭ−Ｔベクター(Promega)にクローニングした。
【００７８】
次に、バチルス属の細胞中で、Ｋａｎ遺伝子プロモーター制御下にて異種遺伝子を発現することができる移動性（接合伝達性）単一レプリコンシャトルベクターｐＬＦ１４（Shevelev et al., Plasmid, 43, 190-199, 2000）のＳａｃＩ−ＳｐｈＩ部位に再クローニングした。得られたプラスミドｐＬＦ−ＲＨＴＡ（図５）を、共在性（co-resident）ＲＰ４プラスミドを用いてエシェリヒア・コリＴＧ１株から、バチルス・ズブチリス１６８株に移動させた。バチルス細胞で発現したｒｈｔＡ遺伝子は、同細胞をＭ９最小培地上で生育させたときに、ホモセリン耐性を増加させた（表６）。
【００７９】
【表６】
【００８０】
【参考例１】
バチルス・ズブチリスのイノシン生産菌ＫＭＢＳ１６株の構築ｐｕｒＲ、ｐｕｒＡ、およびｄｅｏＤ遺伝子中に挿入−欠失変異を有する変異株であるバチルス・ズブチリスのイノシン生産菌ＫＭＢＳ１６株を、バチルス・ズブチリス１６８ Ｍａｒｂｕｒｇ株から得た。
【００８１】
１）バチルス・ズブチリスのｐｕｒＲ欠損変異株の構築
バチルス・ズブチリス１６８ Ｍａｒｂｕｒｇの染色体ＤＮＡを鋳型として、また遺伝子データバンクのＤＮＡ配列情報に従って合成したオリゴヌクレオチドプライマーＮｏ．１（配列番号７）およびＮｏ．２（配列番号８）を用いて、９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で１分の３０サイクルでＰＣＲを行った（Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer）。プライマーＮｏ．１（２８mer）は、バチルス・ズブチリスｐｕｒＲ遺伝子（M. Weng, P.L. Nagy, and H. Zalkin. Identification of the Bacillus subtilis pur operon repressor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995, 92:7455-7459）の開始コドン上流の２４６番目〜２２８番目のヌクレオチド由来の配列、および、５’末端に付加したＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む９mer配列から構成される。プライマーＮｏ．２（２８mer）は、ＰｓｔＩ部位を含む９mer配列を５’末端に融合したｐｕｒＲ遺伝子の終止コドンの下流の５７〜７５のヌクレオチド由来の配列である。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩで消化したＰＣＲ増幅断片（０．９ｋｂ）を、ｐＨＳＧ３８９(TaKaRa, Japan)の両方の制限酵素部位の間に挿入して、ｐＨＳＧ３９８ＢＳＰＲを創製した。増幅されたｐｕｒＲ遺伝子の内部配列であるＥｃｏＲＶ−ＨｉｎｃＩＩ断片０．３ｋｂをｐＨＳＧ３９８ＢＳＰＲから除去し、続いて、ｐＤＧ１７２６（Bacillus Genetic Stock Center, Ohio）から切り出したエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）のスペクチノマイシン耐性遺伝子（１．２ｋｂ）で置き換えた。
【００８２】
得られたプラスミドｐＨＳＧ３９８ｐｕｒＲ：：ｓｐｃを、Dubunau and Davidoff-Abelsonの方法（Dubnau, D., and R. Davidoff-Abelson. Fate of transforming DNA following uptake by competent Bacillus subtilis. J. Mol. Biol. 1971, 56:209-221）により調製したバチルス・ズブチリス１６８ Ｍａｒｂｕｒｇのコンピテントセルの形質転換に使用した。スペクチノマイシン耐性コロニーから個々に染色体ＤＮＡを調製し、続いて上述のＰＣＲにより、ダブルクロスオーバー変異株をスクリーニングした。ｐｕｒＲ欠損変異株（ｐｕｒＲ：：ｓｐｃ）であると確認されたコロニーの１つをＫＭＢＳ４と命名した。
【００８３】
２）バチルス・ズブチリスのｐｕｒＡ欠損変異株の構築
バチルス・ズブチリス１６８ Ｍａｒｂｕｒｇの染色体ＤＮＡを鋳型として、また遺伝子データバンクのＤＮＡ配列情報に従って合成したオリゴヌクレオチドプライマーＮｏ．３（配列番号９）およびＮｏ．４（配列番号１０）を用いて、９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で２分の３０サイクルでＰＣＲを行った（Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer）。プライマーＮｏ．３（２９mer）は、バチルス・ズブチリスｐｕｒＡ遺伝子の開始コドンの上流の１３７番目〜１１８番目のヌクレオチド由来の配列（P. Mantsala and H, Zalikin. Cloning and sequence of Bacillus subtilis purA and gua A, involved in the conversion of IMP to AMP and GMP. J, Bacteriol. 1992, 174: 1883-1890）、および５’末端に付加したＳａｌＩ部位を含む追加の９mer配列から構成される。プライマーＮｏ．４（２９mer）は、５’末端でＳｐｈＩ部位を含む追加の９mer配列を融合したｐｕｒＡ遺伝子の終止コドンの下流の５１〜７０のヌクレオチド由来の配列である。ＳａｌＩおよびＳｐｈＩで消化したＰＣＲ増幅断片（１．５ｋｂ）を、ｐＳＴＶ２８(TaKaRa Japan)の両制限酵素部位の間に挿入した。得られたプラスミドｐＳＴＶ２８ＢＳＰＡをＭｌｕＩおよびＢｇｌIIで消化し、増幅ｐｕｒＡ遺伝子の内部配列０．４ｋｂを除去して、クレノウ酵素で平滑末端化し、続いて、ｐＤＧ６４６（Bacillus Genetic Stock Center, Ohio）から切り出したスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）のエリスロマイシン耐性遺伝子（１．６ｋｂ）の平滑末端化した断片に連結した。
【００８４】
得られたプラスミドｐＨＳＧ３９８ｐｕｒＡ：：ｅｒｍを、上述のようにDubunau and Davidoff-Abelsonの方法により調製された、ＫＭＢＳ４のコンピテントセルの形質転換に使用した。エリスロマイシン耐性コロニーから個々に染色体ＤＮＡを調製し、続いて上述のＰＣＲにより、ダブルクロスオーバー変異株をスクリーニングした。ｐｕｒＡ欠損変異株（ｐｕｒＲ：：ｓｐｃ ｐｕｒＡ：：ｅｒｍ）であると確認されたコロニーの１つをＫＭＢＳ１３と命名した。予想通り、ＫＭＢＳ１３の細胞は、アデニン栄養要求株であった。
【００８５】
３）バチルス・ズブチリスのｄｅｏＤ欠損変異株の構築
バチルス・ズブチリス由来のｄｅｏＤ遺伝子の５’末端およびその上流領域を増幅するために、遺伝子データバンクのＤＮＡ配列情報に従って合成したオリゴヌクレオチドプライマーＮｏ．５（配列番号１１）およびＮｏ．６（配列番号１２）を用いて、９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で１分の３０サイクルでＰＣＲを行った（Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer）。プライマーＮｏ．５（２９mer）は、ｄｅｏＤ遺伝子の開始コドンの上流の３１０番目〜２９１番目のヌクレオチド由来の配列、および５’末端に付加したＥｃｏＲＩ部位を含む追加の９mer配列から構成される。プライマーＮｏ．６（２９mer）は、５’末端にＢａｍＨＩ部位を含む追加の９mer配列を融合したｄｅｏＤ遺伝子の開始コドンの下流の３９〜５７のヌクレオチド由来の配列である。ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化したＰＣＲ増幅断片（０．４ｋｂ）を、ｐＳＴＶ２８(TaKaRa Japan)の両制限酵素部位の間に挿入して、ｐＳＴＶ２８ＤＯＮを創製した。
【００８６】
ｄｅｏＤ遺伝子の３’末端およびその下流領域を増幅するために、遺伝子データバンクのＤＮＡ配列情報に従って合成したオリゴヌクレオチドプライマーＮｏ．７（配列番号１３）およびＮｏ．８（配列番号１４）を用いて、９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で１分の３０サイクルでＰＣＲを行った（Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer）。プライマーＮｏ．７（２９mer）は、ｄｅｏＤ遺伝子の終止コドンの下流の３２１番目〜３０２番目のヌクレオチド由来の配列、および５’末端に付加したＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む９mer配列から構成される。プライマーＮｏ．８（２９mer）は、５’末端にＢａｍＨＩ部位を含む追加の９mer配列を融合したｄｅｏＤ遺伝子の終止コドンの上流の２４番目〜４２番目のヌクレオチド由来の配列である。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化したＰＣＲ増幅断片（０．４ｋｂ）を、ｐＳＴＶ２８ＤＯＮの両制限酵素部位の間に挿入して、ｐＳＴＶ２８ＤＯＮＣを創出した。
【００８７】
ストレプトコッカス・フェカーリス（Streptococcus faecalis）のカナマイシン耐性遺伝子を増幅するために、鋳型としてｐＤＧ７８３のプラスミドＤＮＡ(Bacillus Genetic Stock Center, Ohio)を、また遺伝子データバンクのＤＮＡ配列情報に従って合成したオリゴヌクレオチドプライマーＮｏ．１０（配列番号１５）およびＮｏ．１１（配列番号１６）を用いて、９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で２分の３０サイクルでＰＣＲを行った（Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer）。プライマーＮｏ．１０（３３mer）は、カナマイシン耐性遺伝子の開始コドンの上流の５１３番目〜４９０番目のヌクレオチド由来の配列、および５’末端に付加したＢａｍＨＩ部位を含む追加の９mer配列から構成される。プライマーＮｏ．１１（３３mer）は、５’末端にＢａｍＨＩ部位を含む追加の９mer配列を融合したカナマイシン耐性遺伝子の終止コドンの下流の１１７〜１４０のヌクレオチド由来の配列である。ＢａｍＨＩで消化したＰＣＲ増幅断片（１．５ｋｂ）を、ｐＳＴＶ２８ＤＯＮＣの唯一のＢａｍＨＩ部位に挿入した。得られたプラスミドｐＳＴＶ２８ｄｅｏＤ：：ｋａｎを、上述のようにDubunau and Davidoff-Abelsonの方法により調製した、ＫＭＢＳ１３のコンピテントセルの形質転換に使用した。カナマイシン耐性コロニーから個々に染色体ＤＮＡを調製し、続いてプライマーＮｏ．５およびＮｏ．７を用いた上述のＰＣＲにより、ダブルクロスオーバー変異株をスクリーニングした。ｄｅｏＤ欠損変異株（ｐｕｒＲ：：ｓｐｃ：：ｅｒｍ ｄｅｏＤ：：ｋａｎ）であると確認されたコロニーの１つをＫＭＢＳ１６と命名した。
【００８８】
【実施例１１】
バチルス・ズブチリスのイノシン生産株によるイノシン生産に対するｒｈｔＡ遺伝子増幅の効果
ｐＬＦ−ＲＨＴＡプラスミドおよびｐＬＦ１４ベクターを、バチルス・ズブチリスのイノシン生産株であるＫＭＢＳ１６に移動させた。こうして、バチルス・ズブチリスＫＭＢＳ１６（ｐＬＦ−ＲＨＴＡ）株およびバチルス・ズブチリスＫＭＢＳ１６（ｐＬＦ１４）株を得た。これらの株を、それぞれ１０ｍｇ／ｌのクロラムニフェニコールを含有するＬブロス中で、３７℃で１８時間培養し、得られた培養液０．３ｍｌを、２０×２００ｍｍ試験管中の１０ｍｇ／ｌのクロラムニフェニコールを含有するバチルス用発酵培地３ｍｌに接種し、ロータリーシェーカーを用いて３７℃で７２時間培養した。
【００８９】
バチルス用発酵培地の組成（ｇ／ｌ）：
グルコース ８０．０
ＫＨ2ＰＯ4 １．０
ＭｇＳＯ4 ０．４
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０１
ＭｎＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ０．０１
Ｍａｍｅｎｏ−ＴＮ １．３５
ＤＬ−メチオニン ０．３
ＮＨ4Ｃｌ ３２．０
アデニン ０．１
トリプトファン ０．０２
ＣａＣＯ3 ５０．０
【００９０】
培養後、培地中に蓄積したイノシン量を、上述のようにＨＰＬＣにより測定した。結果を表７に示す。
【００９１】
【表７】
【００９２】
表７からわかるように、ｒｈｔＡ遺伝子増幅は、バチルス・ズブチリス菌株ＫＭＢＳ１６のイノシン生産性を改善した。
【発明の効果】
本発明により、エシェリヒア属およびバチルス属に属する細菌によるイノシンおよびキサントシン等のプリンヌクレオシドの生産性を向上させることができる。また、本発明によれば、５’−イノシン酸、５’−キサンチル酸および５’−グアニル酸等のプリンヌクレオチドを効率よく製造することができる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ｐＮＺ１６プラスミドの構造を示す図。
【図２】 ｐＲＨＴＡ３プラスミドの構造を示す図。
【図３】 ＲｈｔＡタンパク質のハイドロパシープロフィールの、ＹｄｅＤタンパク質のハイドロパシープロフィールとの比較を示す図。
【図４】 細胞分画中のＲｈｔＡタンパク質の分布を示す図。
ライン１は、プラスミドを保持しない発現誘導されたＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の沈降物（１５，０００ｇ）を表す（コントロール）。
ライン２〜７は、プラスミドｐＥＴ２２ｂ−ｒｈｔＡを保持する発現誘導されたＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の等容量の沈降物および溶解性分画を表す。
ライン２、３は、それぞれ１５，０００ｇでの遠心分離の沈降物および上清、
ライン４、５は、それぞれ１８０，０００ｇでの遠心分離の沈降物および上清、 ライン６、７は、細胞を１ＭのＫＣｌで処理した後のそれぞれ１８０，０００ｇでの遠心分離の沈降物および上清を表す。
分子量マーカー（ｋＤａ）を左端に示し、ＲｈｔＡタンパク質の位置を右端の矢印で示した。
【図５】ｐＬＦ−ＲＨＴＡプラスミドの構造を示す図。
【発明の属する技術分野】
本発明は、５’−イノシン酸、５’−キサンチル酸および５’−グアニル酸の合成用の原料として重要な、イノシンおよびキサントシンのようなプリンヌクレオシドの製造方法、ならびにそれらの製造用の新規微生物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、ヌクレオシドは、アデニン栄養要求株、またはこれらの株にプリンアナログおよびサルファグアニジンのような様々な薬剤に対する耐性をさらに付与した株を用いた発酵法により工業的に生産されてきた。そのような株として、バチルス属（特許文献１〜８）、ブレビバクテリウム属（特許文献９、１０、非特許文献１）、エシェリヒア属（特許文献１１）等がある。
【０００３】
従来、これらの変異株の取得は、微生物を、ＵＶ照射およびニトロソグアニジン（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）処理等、突然変異処理し、適当な選択培地を用いることで、所望の株を選択することを含む。他方、遺伝子操作技術を用いた変異株の育種も、バチルス属（特許文献１２〜２１）、およびブレビバクテリウム属（特許文献２２）に属する菌株について行われてきた。
【０００４】
本発明者等は、最小培地中で高濃度のスレオニン、ホモセリンおよび幾つかの他のアミノ酸、ならびにアミノ酸アナログに対する耐性を付与するｒｈｔＡ２３変異を有するエシェリヒア・コリＫ−１２の変異株を得ている。ｒｈｔＡ２３変異は、エシェリヒア・コリ生産株によるＬ−スレオニンの生産を顕著に改善した（非特許文献２）。さらに、本発明者等は、ｒｈｔＡ遺伝子はエシェリヒア・コリ染色体上の１８分の位置に存在し、同遺伝子はｐｅｘＢとｏｍｐＸ遺伝子との間のｙｂｉＦ ＯＲＦと同一であることを見出した。また、本発明者等は、ｒｈｔＡ２３変異は、ＡＴＧ開始コドンに対して−１位のＧからＡへの置換であることを見出した。この変異は、細胞からのスレオニンおよびホモセリンの輸送を増加させると思われる（非特許文献２）。
【０００５】
しかし、現時点では、細胞からのプリン化合物の輸送体については報告されていない。
【０００６】
【特許文献１】
特公昭３８−２３０３９号公報
【特許文献２】
特公昭５４−１７０３３号公報
【特許文献３】
特公昭５５−２９５６号公報
【特許文献４】
特公昭５５−４５１９９号公報
【特許文献５】
特開昭５６−１６２９９８号公報
【特許文献６】
特公昭５７−１４１６０号公報
【特許文献７】
特公昭５７−４１９１５
【特許文献８】
特開昭５９−４２８９５号公報
【特許文献９】
特公昭５１−５０７５号公報
【特許文献１０】
特公昭５８−１７５９２号公報
【特許文献１１】
国際公開第９９０３９８８号パンフレット
【特許文献１２】
特開昭５８−１５８１９７号公報
【特許文献１３】
特開昭５８−１７５４９３号公報
【特許文献１４】
特開昭５９−２８４７０号公報
【特許文献１５】
特開昭６０−１５６３８８号公報
【特許文献１６】
特開平１−２７４７７号公報
【特許文献１７】
特開平１−１７４３８５号公報
【特許文献１８】
特開平３−５８７８７号公報
【特許文献１９】
特開平３−１６４１８５号公報
【特許文献２０】
特開平５−８４０６７号公報
【特許文献２１】
特開平５−１９２１６４号公報
【特許文献２２】
特開昭６３−２４８３９４号公報
【非特許文献１】
Agric. Biol. Chem., 42, 399 (1978)
【非特許文献２】
ABSTRACTS of 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ヌクレオシド生産株のヌクレオシド生産性を高めて、その株を用いたイノシンまたはキサントシン等のヌクレオシドの製造方法を提供することを課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記課題は、ｒｈｔＡ２３変異がプリン塩基アナログである８−アザアデニンに対する耐性を付与し、ヌクレオシド生産性を高めることができることを見出すことにより解決された。さらに、野生型ｒｈｔＡ遺伝子（これは膜タンパク質をコードする）は、プリンヌクレオチドの生合成経路に関与しないが、同遺伝子を多コピーベクターで細菌に導入すると、同細菌にプリン塩基アナログに対する耐性を付与した。さらに、野生型ｒｈｔＡ遺伝子は、コピー数を高めるようにエシェリヒア属またはバチルス属に属するプリン生産株に導入されると、それぞれのヌクレオシド生産性を高めることができる。かくして本発明は完成された。
本発明は、エシェリヒア属またはバチルス属に属し、プリンヌクレオシドを生産する能力を有する微生物を提供する。
【０００９】
具体的には、本発明は、微生物の細胞からのプリンヌクレオシドの輸送に関与すると思われるタンパク質の活性の上昇に基づいてプリンヌクレオシド生産能が改善された微生物を提供する。より具体的には、本発明は、プリンヌクレオシド排出に関与するタンパク質をコードする遺伝子の発現の増加に基づいてプリンヌクレオシド生産能が改善された微生物を提供する。
【００１０】
本発明はさらに、上記微生物を培地で培養して、該培地中にプリンヌクレオシドを生成、蓄積させ、同培地からプリンヌクレオチドを採取することとを含む、発酵によりプリンヌクレオシドを製造する方法を提供する。
【００１１】
本発明はさらに、本発明の細菌を培地で培養し、生成、蓄積したヌクレオシドをリン酸化し、生成、蓄積したプリンヌクレオチドを採取することを含む、５’−イノシン酸および５’−キサンチル酸等のプリンヌクレオチドの製造方法を提供する。
【００１２】
本発明はさらに、上記細菌のような細菌を培地で培養し、生成、蓄積したキサントシンをリン酸化し、生成、蓄積した５’−キサンチル酸をアミノ化し、そして生成、蓄積した５’−グアニル酸を採取することとを含む、５’−グアニル酸の製造方法を提供する。
【００１３】
本発明は、以下のとおりである。
（１）プリンヌクレオシド生産能を有するエシェリヒア属またはバチルス属に属する細菌であって、上記細菌中の下記（Ａ）または（Ｂ）に示すタンパク質の活性が増強された細菌：
（Ａ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、
（Ｂ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、前記細菌を８−アザアデニン耐性にする活性を有するタンパク質。
（２）前記（Ａ）または（Ｂ）に示すタンパク質の活性が、前記（Ａ）または（Ｂ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡでの前記細菌の形質転換、または前記細菌中の同ＤＮＡの発現調節配列の改変により増強された、（１）に記載の細菌。
（３）前記形質転換は多コピーベクターを用いて行われる（２）に記載の細菌。
（４）前記プリンヌクレオシドはイノシンである（１）に記載の細菌。
（５）前記プリンヌクレオシドはキサントシンである、（１）に記載の細菌。
（６）プリンヌクレオシドの製造方法であって、（１）〜（５）のいずれかに記載の細菌を培地で培養し、生成、蓄積したプリンヌクレオシドを該培地から採取する。
（６）（１）〜（５）のいずれかに記載の細菌を培地で培養し、生成、蓄積したプリンヌクレオシドを該培地から採取することを特徴とするプリンヌクレオシドの製造方法。
（７）前記プリンヌクレオシドはイノシンである（６）に記載の方法。
（８）前記プリンヌクレオシドはキサントシンである（６）に記載の方法。
（９）前記細菌は、プリンヌクレオチド生合成のための遺伝子の発現が高められるよう改変された（６）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）（１）〜（５）のいずれかに記載の細菌を培地で培養し、生成、蓄積したヌクレオシドをリン酸化し、生成、蓄積したプリンヌクレオチドを採取することを特徴とするプリンヌクレオチドの製造方法。
（１１）前記プリンヌクレオチドは５’−イノシン酸である（１０）に記載の方法。
（１２）前記プリンヌクレオチドは５’−キサンチル酸である（１０）に記載の方法。
（１３）前記細菌は、プリンヌクレオチド生合成のための遺伝子の発現が高められるように改変された（１０）〜（１２）のいずれかに記載の方法。
（１４）（５）に記載の細菌を培地で培養し、生成、蓄積したキサントシンをリン酸化し、生成、蓄積した５’−キサンチル酸をアミノ化し、そして生成、蓄積した５’−グアニル酸を採取することを特徴とする５’−グアニル酸の製造方法。
（１５）前記細菌は、プリンヌクレオチド生合成のための遺伝子の発現が高められるように改変された（１４）に記載の方法。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１５】
＜１＞本発明の細菌
本発明の細菌は、プリンヌクレオシド生産能を有するエシェリヒア属またはバチルス属に属する細菌であって、細菌の細胞中の下記（Ａ）または（Ｂ）に示すタンパク質の活性が増強された細菌である。
（Ａ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、
（Ｂ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、前記細菌を８−アザアデニン耐性にする活性を有するタンパク質。
【００１６】
「バチルス属またはエシェリヒア属に属する細菌」という用語は、細菌が、微生物学における当業者に既知の分類に従ってバチルス属またはエシェリヒア属に分類されることを意味する。本発明で使用されるエシェリヒア属に属する細菌の例として、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli (E.coli)）が挙げられる。本発明で使用されるバチルス属に属する細菌の例として、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis (B.subtilis)）を挙げることができる。
【００１７】
本明細書中で使用する「プリンヌクレオシド」という用語は、イノシン、キサントシン、グアノシン、およびアデノシンを包含する。
【００１８】
本明細書で使用する「プリンヌクレオシド生産能」という用語は、プリンヌクレオシドを生成して培地中に蓄積する能力を意味する。「プリンヌクレオチド生産能を有する」という用語は、エシェリヒア属またはバチルス属に属する細菌が、エシェリヒア・コリＷ３１１０およびＭＧ１６５５株のようなエシェリヒア・コリの野生株、またはバチルス・ズブチリス１６８のようなバチルス・ズブチリスの野生株よりも多い量で、プリンヌクレオシドを生成して培地中に蓄積することが可能であることを意味し、好ましくは、細菌が、１０ｍｇ／Ｌ以上、より好ましくは５０ｍｇ／Ｌ以上の量のイノシン、キサントシン、グアノシンまたはアデノシン、又はこれらの混合物を生成して培地中に蓄積することが可能であることを意味する。
【００１９】
「細菌の細胞中の下記（Ａ）または（Ｂ）に示すタンパク質の活性が増強された」という用語は、細胞中のタンパク質分子の量が増加するか、またはタンパク質自体当たりの比活性が上昇することを意味する。この「活性」という用語は、細菌を８−アザアデニン耐性にする活性を意味する。
【００２０】
本発明のタンパク質には、下記（Ａ）または（Ｂ）に示すものが含まれる。
（Ａ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、
（Ｂ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ細菌を８−アザアデニン耐性にする活性を有するタンパク質。
【００２１】
配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質は、ＲｈｔＡタンパク質をコードする。ＲｈｔＡタンパク質は、２９５個のアミノ酸から構成され、未知の機能を有する推定上の膜貫通サブユニットである。ＲｈｔＡタンパク質は、ｒｈｔＡ遺伝子によりコードされる。ｒｈｔＡ遺伝子は、グルタミン輸送系の構成成分をコードするｇｌｎＨＰＱオペロンに近接するエシェリヒア・コリ染色体上の１８分に存在する。ｒｈｔＡ遺伝子は、ｐｅｘＢおよびｏｍｐＸ遺伝子の間に位置するＯＲＦ１（ｙｂｉＦ遺伝子、GenBankアクセッション番号AAA218541、gi:440181の７６４番〜１６５１番）と同一である。このＯＲＦによりコードされるタンパク質を発現するユニットはｒｈｔＡ（ｒｈｔ：resistance to homoserine and threonine（ホモセリンおよびスレオニンに対する耐性））遺伝子と称されている（Astaurova, O.B. et al., Appl. Bioch. And Microbiol., 21, 611-616 (1985)）。これは、本発明者等は以前に、最小培地での高濃度のスレオニンまたはホモセリンに対する耐性に関与するｒｈｔＡ遺伝子の変異体であるｔｈｒＲ（本明細書中ではｒｈｔＡ２３と呼ぶ）を有するエシェリヒア・コリＫ−１２の変異株を得ていたことによる。この変異は、ＶＫＰＭ−３９９６株のようなエシェリヒア・コリ生産株のＬ−スレオニン（旧ソビエト連邦共和国特許第９７４８１７号）、ホモセリンおよびグルタミン酸（Astaurova, O.B. et al., Appl. Bioch. And Microbiol., 27, 556-561, 1991）の生産性を改善した。本発明者等は、ｒｈｔＡ２３変異が、ＡＴＧ開始コドンに対して−１位におけるＧからＡへの置換であることを示している（ABSTRACTS of 17th International Congress of Biochmistry and Molecular Biology in conjugation with 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457）。
【００２２】
本発明における「数個の」アミノ酸の数は、タンパク質の三次元構造中のアミノ酸残基の位置またはタイプによって異なる。この数は、タンパク質（Ａ）について２〜３０個、好ましくは２〜１５個、より好ましくは２〜５個であり得る。
【００２３】
「８−アザアデニン耐性」という用語は、野生株または親株が生育できない濃度で８−アザアデニンを含有する最小培地上で細菌が生育する能力、又は、８−アザアデニンを含有する培地上で細菌が野生株または親株より速く生育する能力を意味する。上記の８−アザアデニンの濃度は、通常５０〜５０００μｇ／ｍｌ、好ましくは１００〜１０００μｇ／ｍｌである。
【００２４】
本発明のタンパク質の活性の増強のための手法、特に細胞中のタンパク質分子の量を増加させるための手法として、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの発現調節配列の改変、および遺伝子のコピー数の増加が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２５】
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの発現調節配列の改変は、強力なプロモーターの制御下に、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを配置することにより達成され得る。プロモーターの強度は、ＲＮＡ合成開始の頻度により定義される。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Deuschle, U., Kammerer, W., Gentz, R., Bujard, H.（Promotors in Esherichia coli : a hierarchy of in vivo strength indicates alternate structures. EMBO J. 1986, 5, 2987-2994）等に記載されている。例えば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、λファージのＰLプロモーターが強力なプロモーターとして知られている。又は、プロモーターは、例えばプロモーターの下流に位置する遺伝子の転写レベルを上昇させるようにプロモーターに変異を導入することにより増強され得る。さらに、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と開始コドンとの間のスペーサ、特に開始コドンのすぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換がｍＲＮＡの翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られている。例えば、開始コドンの前の３つのヌクレオチドの性質に応じて、発現レベルの２０倍の変化が見出されている（Gold et al., Annu. Rev. Microbiol., 35, 365-403, 1981; Hui et al., EMBO J., 3, 623-629, 1984）。上述に記載されるように、本発明者等は、ｒｈｔＡ２３変異が、ＡＴＧ開始コドンに対して−１位におけるＧからＡへの置換であることを示した。したがって、ｒｈｔＡ２３変異は、ｒｈｔＡ遺伝子の発現を高め、結果として、細胞外に輸送されるスレオニン、ホモセリンおよび他のいくつかの物質に対する耐性レベルを増大させることが示唆される。
【００２６】
さらに、遺伝子の転写レベルを上昇させるために、エンハンサーを新たに導入してもよい。遺伝子またはプロモーターを含むＤＮＡの染色体ＤＮＡへの導入は、例えば、特開平１−２１５２８０号に記載されている。
【００２７】
あるいは、遺伝子のコピー数は、多コピーベクターに遺伝子を挿入して組換えＤＮＡを調製した後、同組換えＤＮＡを微生物に導入することにより上昇させることができる。組換えＤＮＡの導入に使用されるベクターとしては、ｐＭＷ１１８、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＥＴ２２ｂ等のプラスミドベクター、ｌ１０５９、ｌＢＦ１０１、Ｍ１３ｍｐ９、Ｍｕファージ（特開平２−１０９９８５号）等のようなファージベクター、およびＭｕ、Ｔｎ１０、Ｔｎ５等のようなトランスポゾン（Berg, D.E. and Berg, C.M., Bio/Technol., 1, 417 (1983)）が例示される。相同組換えのためのプラスミドを利用した方法等により遺伝子を染色体に組み込むことで、遺伝子のコピー数を増加させることも可能である。
【００２８】
強力なプロモーターまたはエンハンサーを用いた手法は、遺伝子コピーの増加に基づく手法と組み合わせることができる。
【００２９】
本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現量が増加したエシェリヒア属またはバチルス属に属する細菌を育種するために、エシェリヒア・コリおよびバチルス・ズブチリスの遺伝子について既に入手可能な情報に主として基づいて、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）により、遺伝子の必須領域を得ることができる。例えば、輸送体をコードする遺伝子と思われるｒｈｔＡ遺伝子を、ＰＣＲ手法を用いて、エシェリヒア・コリＫ１２ Ｗ３１１０またはエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株の染色体ＤＮＡからクローニングすることができる。これに使用される染色体ＤＮＡは、エシェリヒア・コリの他の任意の株に由来してもよい。
【００３０】
本発明のタンパク質には、ＲｈｔＡタンパク質の機能的特性、少なくとも８−アザアデニン耐性を示す限り、自然の多様性に起因して存在し得るＲｈｔＡタンパク質の変異体およびバリアントが包含される。同変異体およびバリアントをコードするＤＮＡは、ストリンジェントな条件下でｒｈｔＡ遺伝子（配列番号１）または同遺伝子の一部とハイブリダイズし、かつＬ−アミノ酸生産性を高めるタンパク質をコードするＤＮＡを単離することにより得ることができる。本明細書にいう「ストリンジェントな条件」という用語は、いわゆる特異的ハイブリッドが形成され、非特異的ハイブリッドが形成されない条件である。例えば、ストリンジェントな条件としては、高い相同性を有するＤＮＡ、例えば、互いに７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズする条件が挙げられる。あるいは、ストリンジェントな条件としては、サザンハイブリダイゼーションにおける洗浄の通常の条件、例えば、６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含む条件が例示される。変異体をコードし、かつｒｈｔＡ遺伝子とハイブリダイズするＤＮＡ用のプローブとして、配列番号１のヌクレオチド配列の部分配列もまた使用することができる。そのようなプローブは、プライマーとして配列番号１のヌクレオチド配列に基づいて調製されるオリゴヌクレオチド、および、鋳型として配列番号１のヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ断片を用いたＰＣＲにより調製され得る。約３００ｂｐ長のＤＮＡ断片をプローブとして用いる場合、ハイブリダイゼーション用の洗浄条件は、例えば、５０℃、２×ＳＳＣ、および０．１％ＳＤＳを含む。前記相同性は、典型的にはLipman-Pearsonの方法（Science 227, 1435-1441 (1985)）又はTakashi & Gotohの方法（J. Biochem. 92, 1173-1177 (1984)）により算出される値である。プローブの設計は、当業者に公知の方法に従って行うことができる。
【００３１】
本発明の細菌は、ヌクレオシドを生産する能力を元々有する細菌に本発明のタンパク質をコードする上記ＤＮＡを導入することにより得ることができる。あるいは、本発明の細菌は、上記ＤＮＡをすでに保有する細菌に、ヌクレオシドを生産する能力を付与することにより得ることができる。
【００３２】
イノシンを生産し、かつ、本発明のタンパク質の活性を高める親株としては、エシェリヒア・コリAJ13732（FADRaddeddyicPpgixapA(pMWKQ)）株（WO 9903988号）を使用することができる。同株は、ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼをコードするｐｕｒＦ遺伝子、プリンリプレッサーをコードするｐｕｒＲ遺伝子、プリンヌクレオシドホスホリラーゼをコードするｄｅｏＤ遺伝子、スクシニル−ＡＭＰシンターゼをコードするｐｕｒＡ遺伝子、アデノシンデアミナーゼをコードするａｄｄ遺伝子、６−ホスホグルコン酸デヒドラーゼをコードするｅｄｄ遺伝子、ホスホグルコースイソメラーゼをコードするｐｇｉ遺伝子、キサントシンホスホリラーゼをコードするｘａｐＡ遺伝子に変異が導入され（ｐｕｒＦ-、ｐｕｒＡ-、ｄｅｏＤ-、ｐｕｒＲ-、ａｄｄ-、ｅｄｄ-、ｐｇｉ-、ｘａｐＡ-）、ｐＭＷＫＱプラスミドを保有する、既知の菌株Ｗ３１１０の誘導体である。そして、同株が保持するｐＭＷＫＱプラスミドは、ｐＭＷ２１８ベクターの誘導体であり、ＧＭＰに非感受性のＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼをコードするｐｕｒＦＫＯ遺伝子が挿入されている（国際公開第９９０３９８８号）。
【００３３】
キサントシンを生産し、本発明のタンパク質の活性が高められる親株としては、エシェリヒア・コリAJ13732guaA::Tn10(pMWKQ)株を使用することができる。エシェリヒア・コリAJ13732guaA::Tn10(pMWKQ)株は、AJ13732(pMWKQ)上のＧＭＰシンテターゼ遺伝子を破壊することにより構築される（実施例７を参照）。
【００３４】
バチルス属に属するイノシン生産株の例として、バチルス・ズブチリスＫＭＢＳ１６株を使用することができる。同菌株は、プリンリプレッサーをコードするｐｕｒＲ遺伝子（ｐｕｒＲ：：ｓｐｃ）、スクシニル−ＡＭＰシンターゼをコードするｐｕｒＡ遺伝子（ｐｕｒＡ：：ｅｒｍ）、およびプリンヌクレオシドホスホリラーゼをコードするｄｅｏＤ遺伝子（ｄｅｏＤ：：ｋａｎ）に変異が導入された、既知のバチルス・ズブチリスｔｒｐＣ２株の誘導体である。本発明のタンパク質の活性が高められるバチルス属に属する別の親株として、バチルス・ズブチリスＡＪ１２７０７（ＦＥＲＭ Ｐ−１２９５１）株（特開昭６１−１３８７６Ａ２号）、バチルス・ズブチリス菌株ＡＪ３７７２（ＦＥＲＭ Ｐ−２５５５）（特開昭６２−０１４７９４Ａ２）等を例示することができる。
【００３５】
本発明のタンパク質当たりの比活性を上昇させるために、同タンパク質の活性を高めるような変異を同タンパク質の構造遺伝子に導入してもよい。遺伝子に変異を導入するためには、部位特異的変異誘発（Kramer, W. and Frits, H.J., Methods in Enzymology, 154, 350 (1980)）、リコンビナントＰＣＲ法（PCR Technology, Stockton Press (1989)）、ＤＮＡの特定部分の化学合成、目的の遺伝子のヒドロキシアミン処理、ＵＶ照射またはニトロソグアニジンもしくは亜硝酸のような化学薬剤により目的の遺伝子を保持する細菌菌株の処理等を使用することができる。前記タンパク質の活性が増強された細菌は、８−アザアデニンを含有する最小培地で生育する株、又は同培地で野生株もしくは親株よりも速く生育する株として選択することができる。
【００３６】
本発明の細菌は、プリン生合成に関与する１つまたはそれ以上の遺伝子の発現を増強することにより、さらに改善することができる。そのような遺伝子としては、バチルス・ズブチリスのpurEKB-purC(orf)QLF-purMNH(J)-purDオペロンの遺伝子（Ebbole DJ and Zalkin H, J. Biol. Chem., 262, 17, 8274-87, 1987）、およびエシェリヒア・コリのｐｕｒレギュロンの遺伝子（Escherichia and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C. Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996）が例示される。
【００３７】
プリンヌクレオチド合成酵素の抑制が遺伝子的に改変されたバチルス・ズブチリスの８−アザグアニン耐性変異株のイノシン生産が増強されたことが示されている（Shiio I., and Ishii K., J. Biochem., 69, 339-347, 1971）。ｐｕｒＲ変異株では、ｐｕｒＡ遺伝子の基底レベルの発現が１０倍増加し、さらにグアノシンによる刺激またはアデニンによる抑制は存在しない（Rappu P. et al, J Bacterial., 181, 123810-5, 1999）。ＧＭＰおよびＡＭＰによるフィードバック阻害を受けないように改変された変異型ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼをコードする変異ｐｕｒＦ遺伝子、およびプリンヌクレオチド生合成系のレプレッサーをコードするｐｕｒＲ遺伝子の不活性型を保持するエシェリヒア・コリのイノシン生産株が開示されている（国際公開第９９０３９８８号）。
【００３８】
本発明のタンパク質の活性の増強により、細菌のプリンヌクレオシド生産性が増強するメカニズムは、細菌の細胞からの目的プリンヌクレオシドの排出が増進することに起因することによると推測される。
【００３９】
＜２＞プリンヌクレオシドの製造方法
本発明の方法は、本発明の細菌を培地で培養し、プリンヌクレオシドを生成して培地中に蓄積させ、同プリンヌクレオシドを同培地から採取する、プリンヌクレオシドの製造方法を包含する。具体的には、本発明の方法は、本発明の細菌を培地で培養し、イノシンを生成して培地中に蓄積させ、イノシンを同培地から採取する、イノシンの製造方法を包含する。また、本発明の方法は、本発明の細菌を培地で培養し、キサントシンを生成して培地中に蓄積させ、キサントシンを同培地から採取する、キサントシンの製造方法を包含する。
【００４０】
本発明においては、培養、培地からのプリンヌクレオシドの採取および精製等は、プリンヌクレオシドが微生物を用いて生産される従来の発酵法と同様にして行うことができる。使用されるプリンヌクレオシド生産用培地は、炭素源、窒素源、無機イオン、および必要に応じて他の有機成分を含有する通常の培地であってよい。炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フルクトース、アラビノース、マルトース、キシロース、トレハロース、リボース、およびデンプン加水分解物のような糖類、グリセロール、マンニトールおよびソルビトールのようなアルコール類、グルコン酸、フマル酸、クエン酸およびコハク酸のような有機酸等を使用することができる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、およびリン酸アンモニウムのような無機アンモニウム塩、ダイズ加水分解物のような有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水溶液等を使用することができる。ビタミンＢ１のようなビタミン、要求物質、例えば、アデニンおよびＲＮＡのような核酸、または酵母抽出物等が、微量有機栄養分として適切な量で含まれることが望ましい。これら以外に、必要に応じて、少量の、リン酸カルシウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等を使用してもよい。
【００４１】
培養は、好ましくは、好気性条件下で１６〜７２時間行われ、培養中の培養温度は、３０〜４５℃以内に、ｐＨは、５〜８以内に制御される。ｐＨは、無機または有機の酸性もしくはアルカリ性物質、およびアンモニアガスにより調節され得る。
【００４２】
培養後、遠心分離または膜濾過により、細胞のような固形分を液体培地から除去することができ、続いてイオン交換樹脂および沈殿のような従来の技法のいずれか、または任意の組合せにより、目的とするプリンヌクレオシドを発酵液から回収することができる。
【００４３】
＜３＞プリンヌクレオチドの製造方法
本発明の方法はまた、本発明の細菌を培地で培養し、生成、蓄積したヌクレオシドをリン酸化し、生成、蓄積したプリンヌクレオチドを採取する、プリンヌクレオチドの製造方法を包含する。具体的には、本発明の方法は、本発明の細菌を培地で培養し、生成、蓄積したイノシンをリン酸化し、生成、蓄積した５’−イノシン酸を採取する、５’−イノシン酸の製造方法を包含する。さらに、本発明の方法は、本発明の細菌を培地で培養し、生成、蓄積したキサントシンをリン酸化し、生成、蓄積した５’−キサンチル酸を採取する、５’−キサンチル酸の製造方法を包含する。
【００４４】
本発明においては、培養、培地からのプリンヌクレオチドの採取および精製等は、プリンヌクレオチドを微生物を用いて生産する従来の発酵法と同様にして行うことができる。さらに、本発明においては、生成、蓄積したプリンヌクレオシドのリン酸化、および生成、蓄積したプリンヌクレオチドの採取は、プリンヌクレオシドからプリンヌクレオチドを生産する従来の発酵法に類似した様式で実施されてもよい。
【００４５】
プリンヌクレオシドのリン酸化は、種々のホスファターゼ、ヌクレオシドキナーゼまたはヌクレオシドホスホトランスフェラーゼを用いて酵素的に、あるいはＰＯＣｌ3等のようなリン酸化剤を用いて化学的に行うことができる。ヌクレオシドへのピロリン酸塩のリン酸基のＣ−５’位選択的転移を触媒することが可能なホスファターゼ（Mihara et al, Phosphorylation of nucleosides by the mutated acid phosphatase from Morganella morganii. Appl. Environ. Microbiol. 2000, 66:2811-2816）、またはポリリン酸（塩）、フェニルリン酸（塩）もしくはカルバミルリン酸（塩）をリン酸ドナーとして利用する酸性ホスファターゼ（WO 96/37603A1）等を使用してもよい。また、ホスファターゼの一例として、基質としてｐ−ニトロフェニルリン酸塩（Mitsugi, K., et al, Agric. Biol. Chem. 1964, 28, 586-600）、無機リン酸塩（特開昭４２−１１８６号）またはアセチルリン酸塩（特開昭６１−４１５５５号）を利用したヌクレオシドのＣ−２’、３’または５’位へのリン酸基の転移を触媒することが可能なホスファターゼ等を使用してもよい。ヌクレオチドキナーゼの例としては、エシェリヒア・コリ由来のグアノシン／イノシンキナーゼ（Mori et al., Cloning of a guanosine-inosine kinase gene of Escherichia coli and characterization of the purified gene product. J. Bacteriol. 1995. 177:4921-4926；WO 91/08286）等を使用してもよい。ヌクレオシドホスホトランスフェラーゼの例として、Hammer-Jespersen, K. (Nucleoside catabolism, p203-258. In A Munch-Petesen (ed.), Metabolism of nucleotides, nucleosides, and nucleobases in microorganism. 1980, Academic Press, New York）等に記載されているヌクレオシドホスホトランスフェラーゼを使用してもよい。ヌクレオシドの化学的リン酸化は、ＰＯＣｌ3のようなリン酸化剤（Yoshikawa et al. Studies of phosphorylation. III. Selective phosphorylation of unprotected nucleosides. Bull. Chem. Soc. Jpn. 1969, 42:3505-3508）等を用いて行うことができる。
【００４６】
本発明の方法は、前記細菌のような細菌を培地で培養し、生成、蓄積したキサントシンをリン酸化し、生成、蓄積した５’−キサンチル酸をアミノ化し、そして生成、蓄積した５’−グアニル酸を採取する、５’−グアニル酸の製造方法を包含する。本発明においては、前記細菌のような細菌の培地での培養、生成、蓄積したキサントシンのリン酸化、生成、蓄積した５’−キサンチル酸のアミノ化、および生成、蓄積した５’−グアニル酸の採取は、５’−キサンチル酸から５’−グアニル酸を生産する従来の発酵法と同様にして行うことができる。
【００４７】
５’−キサンチル酸のアミノ化は、例えば、エシェリヒア・コリ由来のＧＭＰシンテターゼ（Fujio et al. High level of expression of XMP aminase in Escherichia coli and its application for the industrial production of 5'-guanylic acid. Biosci. Biotech. Biochem. 1997, 61:840-845、欧州特許第０２５１４８９Ｂ１号）を用いて酵素的に行うことができる。
【００４８】
本発明の方法においては、本発明の細菌は、プリンヌクレオチド生合成のための遺伝子発現が高められるように改変してもよい。
【００４９】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【実施例１】
エシェリヒア・コリのｒｈｔＡ遺伝子のミニＭｕファージミドへのクローニング
ホモセリンおよびスレオニン耐性に関与することが当初見出されたｒｈｔＡ遺伝子を、ミニＭｕ ｄ５００５ファージミドを用いてクローニングした（Groisman, E.A., et al., J. Bacteriol., 168, 357-364 (1986)）。ＭＧ４４２株のＭｕＣｔｓ６２溶原株（Guayatiner et al., Genetika (in Russian), 14, 947-956 (1978)）をドナーとして使用し、新たに調製した溶菌液を用いて、ＶＫＰＭ Ｂ−５１３株（Ｈｆｒ Ｋ１０ｍｅｔＢ）のＭｕＣｔｓ溶原性誘導体に感染させた。メチオニン（５０μｇ／ｍｌ）、カナマイシン（４０μｇ／ｍｌ）およびホモセリン（１０ｍｇ／ｍｌ）を含むＭ９グルコース最小培地上で細胞を平板培養し、培養４８時間後に出現したコロニーを採取した。同コロニーからプラスミドＤＮＡを単離し、それを用いて、標準的な手法によりＶＫＰＭ Ｂ−５１３株を形質転換した。上述のように、カナマイシンおよびホモセリンを含むＬブロス寒天板上で形質転換体を選択した。ホモセリン耐性の形質転換体からプラスミドＤＮＡを単離して、挿入断片の構造を制限酵素マッピングにより分析した。異なる染色体領域に属する２つのタイプの挿入物をドナーからクローニングした。すなわち、多コピーベクター上でホモセリンに対する耐性を細菌に付与する少なくとも２つの異なる遺伝子が、エシェリヒア・コリに存在する。挿入物の１つのタイプは、（染色体マップ）８６分の領域由来の染色体断片であることが証明された。この場合には、耐性表現形質は、ｒｈｔＢおよびｒｈｔＣ遺伝子の過剰発現に関連していた（欧州特許出願公開第１０１３７６５Ａ１号および第１０１６７１０Ａ２号）。
【００５０】
（染色体マップ）１８分の染色体領域の挿入物を有するファージミドを選択するために、１７．５〜１８．５分の染色体断片を含む、Koharaライブラリー（Kohara's collection; Kohara et al., Cell, 50, 495-508, 1987）中の６つの組換えＥＭＢＬ４ファージ（３Ｄ４、２４Ｆ９、１Ｂ４、１０ＡＢ、３Ｅ５および１Ｅ２）を32Ｐで標識した混合物を、ハイブリダイゼーションプローブとして用いたコロニーハイブリダイゼーションを行った。結果として、細胞にスレオニンおよびホモセリンに対する耐性を付与する９．３ｋｂの領域を挿入物として有するファージミドｐＮＺ４Ｓが得られた。
【００５１】
【実施例２】
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ+およびｐＡＹＣＴＥＲ３ベクターへのｒｈｔＡ遺伝子のクローニング
ｐＮＺ４ＳファージミドをＸｍｎＩおよびＳｔｕＩ酵素で消化して、低融点アガロース中での電気泳動により分離した。ｒｈｔＡ遺伝子とそれ自身の調節領域を含む適切な断片を溶出して、ＥｃｏＲＶであらかじめ消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ+ベクター(Promega)のＥｃｏＲＶ部位に、ｌａｃプロモーターの向きと反対方向に挿入した。こうして、プラスミドｐＮＰＺ１６が得られた（図１）。さらに、ｐＮＰＺ１６上のｒｈｔＡ遺伝子を、ｐＡＹＣ３２の誘導体である安定な中程度のコピー数のベクターｐＡＹＣＴＥＲ３のＳｍａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位に再クローニングした。こうして、プラスミドｐＲＨＴＡ３が得られた（図２）。前記ベクターｐＡＹＣＴＥＲ３は、ＲＳＦ１０１０プラスミドレプリコンを有するｐＡＹＣ３２プラスミドに、ｐＵＣ１９プラスミド由来のポリリンカーおよびｒｒｎＢの強力なターミネーターを導入した、非常に安定な中程度のコピー数のベクターである（Christoserdov A.Y., Tsygankov Y.D, Plasmid, 1986, v. 16, pp. 161-167）。
【００５２】
【実施例３】
Ｌ−システイン誘導体排出に関与するＹｄｅＤタンパク質に対するｒｈｔＡ遺伝子産物の相同性の検討
ｒｈｔＡ遺伝子（配列番号１）は、２９５個のアミノ酸残基からなり、３１．３ｋＤａと計算される分子量を有するタンパク質をコードする。既知の方法（Kyte and Doolittle, J. Mol. Biol., 157, 105-132, (1982)）によるＲｈｔＡ配列の分析により、それが１０個の推定膜貫通セグメントを含む非常に疎水性の高いタンパク質であることが明らかとなった。ＲｈｔＡのハイドロパシープロフィールおよび推定膜貫通セグメント数（図３、実線）は、ＹｄｅＤタンパク質（図３、破線）に類似している。この結果により、それらの相同性が示された（Lolkema, J.S., and Slotboom, D.-J. FEMS Microbiol Rev., 22, 305-322 (1998)）。ＹｄｅＤタンパク質をコードするｙｄｅＤ遺伝子は、システイン経路の代謝産物の排出に関与している（Dabler et al., Mol. Microbiol. 36, 1101-1112 (2000)）。したがって、ｒｈｔＡ遺伝子は、細胞からの幾つかの代謝産物の輸送に関与する膜タンパク質をコードすると予測され得る。
【００５３】
【実施例４】
ｐＥＴ２２ｂ−ｒｈｔＡプラスミドの構築、およびｒｈｔＡ遺伝子産物の細胞内局在部位の決定
ＮｄｅＩ制限部位を含む配列番号３およびＥｃｏＲＩ制限部位を含む配列番号４のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、ｒｈｔＡ構造遺伝子をｐＮＰＺ１６から増幅した。ＰＣＲ産物をＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素で消化して、同じ制限酵素であらかじめ処理した細菌発現ベクターｐＥＴ２２ｂ(Novogene)に連結させた。ｌａｃプロモーターの制御下にあるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子(Novogene)を含む得られたプラスミドｐＥＴ２２ｂ−ｒｈｔＡは、エシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株の形質転換に使用した。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の誘導、およびタンパク質の［35Ｓ］メチオニンによる標識は、基本的にこれまでに記載されている方法（Tabor and Richardson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 1074-1078 (1985)）を、いくつかの点で変更して行った。
上記の変更は、以下のとおりである。タンパク質の発現は、１９個のアミノ酸混合物（最終濃度０．００５％）を補充したＭ９培地中で対数増殖期に達した培養液５ｍｌに、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ；最終濃度２ｍＭ）を添加することにより誘導した。新たに合成されたタンパク質の標識は、培養液５ｍｌに５０μＣｉの［35Ｓ］メチオニンを添加することにより行った。遠心分離により細胞を採取して、それを分画に使用した。破砕用緩衝液（１ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ジチオトレイトールおよび１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリドを含有する１００ｍＭ トリスＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５）中にペレットを再懸濁させ、超音波処理により細胞を破壊した。１５，０００ｇで２０分間遠心分離して細胞片を除去した後、１８，０００ｇで１８０分間超遠心分離して膜分画を採取した。室温で３０分間、１ＭのＫＣｌを含有する破砕用緩衝液中で得られたペレット（膜分画）を攪拌し、１８０，０００ｇで１８０分間遠心分離した。上清（溶解性分画）に、トリクロロ酢酸（最終濃度１０％）を加えて４℃で３０分間インキュベーションすることによりタンパク質を沈殿させ、遠心分離して、アセトンで洗浄した。すべてのペレットを、相当する上清と同一容量のゲルローディング緩衝液（Laemmli, Nature 227, 680-685 (1970)）中に再懸濁させた。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Laemmli, Nature 227, 680-685 (1970)）を用いて、タンパク質を分析した。
【００５４】
細胞分画中のＲｈｔＡタンパク質の分布を図４に示す。ＲｈｔＡは、膜分画と共沈降し（図４、レーン４および６）、溶解性タンパク質の分画中には存在しなかった（図４、レーン５）。同様のタンパク質分布が、膜分画のＫＣｌ処理後に観察された（図４、レーン６、７）。これらのデータは、ＲｈｔＡが膜内在性タンパク質（integral membrane protein）であるとの見解を支持する。ＲｈｔＡの電気泳動における移動度は、予測される３１．３ｋＤではなく約２５ｋＤａの分子質量に相当した。ＹｄｅＤタンパク質もまた、同様の移動性を示す（Dabler et al., Mol. Microbiol. 36, 1101-1112 (2000)）ことから、それはＲｈｔＡが疎水性であることの結果であるかもしれない。
【００５５】
【実施例５】
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のプリン塩基アナログ耐性に対するｒｈｔＡ２３変異およびｒｈｔＡ遺伝子増幅の影響
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株に、ＶＫＰＭ Ｂ−３９９６株（米国特許第５，９７６，８４３号）が有するｒｈｔＡ２３変異を、ファージＰ１媒介形質導入によって導入することにより、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５ ｒｈｔＡ２３株を構築した。形質導入株を、１０ｍｇ／ｍｌのホモセリンを含有するＭ９最小培地（Miller, 1972）上で選択した。こうして、同質遺伝子型菌株であるエシェリヒア・コリＭＧ１６５５ ｒｈｔＡ+およびエシェリヒア・コリＭＧ１６５５ ｒｈｔＡ２３が得られた。
【００５６】
さらに、ｐＮＰＺ１６およびｐＲＨＴＡ３プラスミド、ならびにこれらに相当するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ+およびｐＡＹＣＴＥＲ３ベクターを、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株に導入した。こうして、ＭＧ１６５５（ｐＮＺ６１）株、ＭＧ１６５５（ｐＲＨＴＡ３）株、ＭＧ１６５５（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）株およびＭＧ１６５５（ｐＡＹＣＴＥＲ３）株を得た。次に、段階的濃度のプリン塩基アナログを含有するＭ９グルコース最少寒天板上で各株が生育する能力を測定した。最小培地（プラスミド保持株用にはアンピシリン１００ｍｇ／ｍｌを補充した）中で一晩生育させた培養液中の１０5〜１０6個の細胞を、プレートにスポットし、３７℃の４４時間のインキュベーション後に、生育を評価した。結果を表１に示す。
【００５７】
【表１】
表１からわかるように、ｒｈｔＡ２３変異およびｒｈｔＡ遺伝子の増幅は、細菌の８−アザアデニンに対する耐性を増加させた。したがって、ｒｈｔＡ遺伝子は、プリン誘導体の排出に関与すると予測され得る。
【００５９】
【実施例６】
エシェリヒア・コリのイノシン生産株によるイノシン生産に対するｒｈｔＡ２３変異の効果
イノシン生産株ＡＪ１３７３２（ｐＭＷＫＱ）を、実施例５に記載したように、ｒｈｔＡ２３変異の導入用の親株として使用した。こうして、ＡＪ１３７３２ｒｈｔＡ２３（ｐＭＷＫＱ）株を得た。ＡＪ１３７３２（ｐＭＷＫＱ）株およびＡＪ１３７３２ｒｈｔＡ２３（ｐＭＷＫＱ）株を、それぞれ１００ｍｇ／ｌのアンピシリンおよび７５ｍｇ／ｌのカナマイシンを含有するＬブロス中で、３７℃で１８時間培養した。得られた培養物０．３ｍｌを、２０×２００ｍｍ試験管中の１００ｍｇ／ｌアンピシリンおよび７５ｍｇ／ｌカナマイシンを含有する発酵培地３ｍｌに接種し、ロータリーシェーカーを用いて３７℃で７２時間培養した。
【００６０】
発酵培地の組成（ｇ／ｌ）：
グルコース ４０．０
（ＮＨ4）2ＳＯ4 １６．０
Ｋ2ＨＰＯ4 １．０
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １．０
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０１
ＭｎＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ０．０１
酵母抽出物 ８．０
ＣａＣＯ3 ３０．０
グルコースおよび硫酸マグネシウムは、別個に滅菌する。ＣａＣＯ3は、１８０度で２時間、乾熱滅菌する。ｐＨは７．０に調節する。滅菌後に、培地中に抗生物質を加える。
【００６１】
培養後、培地中に蓄積したイノシン量をＨＰＬＣにより測定した。培養液（５００μｌ）を、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清をＨ2Ｏで１００倍希釈して、ＨＰＬＣにより分析した。
【００６２】
ＨＰＬＣ分析用条件：
カラム：Ｌｕｎａ Ｃ１８（２） ２５０×３ｍｍ、５ｕ(Phenomenex, USA)。
緩衝液：２％ｖ／ｖＣ2Ｈ5ＯＨ；０．８％ｖ／ｖトリエチルアミン；０．５％ｖ／ｖ酢酸（氷酢酸）；ｐＨ４．５。
温度：３０℃。
流速：０．３ｍｌ／分。
注入容量：５μｌ。
検出：ＵＶ２５０ｎｍ。
保持時間（分）：
キサントシン １３．７
イノシン ９．６
ヒポキサンチン ５．２
グアノシン １１．４
アデノシン ２８．２
【００６３】
結果を表２に示す。
【００６４】
【表２】
表２からわかるように、ｒｈｔＡ２３変異は、ＡＪ１３７３２株のイノシン生産性を改善した。
【００６６】
【実施例７】
エシェリヒア・コリのキサントシン生産株によるキサントシン生産に対するｒｈｔＡ変異の効果
キサントシン生産株を、イノシン生産株ＡＪ１３７３２（ｐＭＷＫＱ）から得た。ＡＪ１３７３２（ｐＭＷＫＱ）株に、ＧＭＰシンテターゼ遺伝子（ｇｕａＡ）を不活性化する変異ｇｕａＡ：：Ｔｎ１０を、ファージＰ１媒介形質導入により導入した。形質導入株を、２０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有するＬＢ培地上で選択した。その中から、キサントシンを生産することが可能なＡＪ１３７３２ｇｕａＡ：：Ｔｎ１０（ｐＭＷＫＱ）株を見出した。実施例５に記載したように、ｒｈｔＡ２３変異を含むこの株の誘導体を取得し、ＡＪ１３７３２ｇｕａＡ：：Ｔｎ１０ｒｈｔＡ２３（ｐＭＷＫＱ）株と命名した。
【００６７】
ＡＪ１３７３２ｇｕａ：：Ｔｎ１０（ｐＭＷＫＱ）株およびＡＪ１３７３２ｇｕａＡ：：Ｔｎ１０ｒｈｔＡ２３（ｐＭＷＫＱ）株を、それぞれ１０ｍｇ／ｌのカナマイシンおよび１０ｍｇ／ｌのテトラサイクリンを含有するＬブロス中で、３７℃で１８時間培養した。得られた培養液０．３ｍｌを、２０×２００ｍｍ試験管中の７５ｍｇ／ｌのカナマイシンおよび１０ｍｇ／ｌのテトラサイクリンを含有する発酵培地（実施例３を参照）３ｍｌに接種し、ロータリーシェーカーを用いて、３７℃で４８時間培養した。培養後、培地中に蓄積したキサントシン量を、上述のようにＨＰＬＣにより測定した。結果を表３に示す。
【００６８】
【表３】
表３からわかるように、ｒｈｔＡ２３変異は、ＡＪ１３７３２ｇｕａＡ：：Ｔｎ１０（ｐＭＷＫＱ）株のキサントシン生産性を改善した。
【００７０】
【実施例８】
エシェリヒア・コリのイノシン生産株によるイノシン生産に対するｒｈｔＡ遺伝子増幅の効果
イノシン生産株ＡＪ１３７３２（ｐＭＷＫＱ）を、ｐＡＹＣＴＥＲ３ベクターおよびｐＲＨＴＡ３プラスミドにより形質転換した。こうして、ＡＪ１３７３２（ｐＭＷＫＱ，ｐＡＹＣＴＥＲ３）株およびＡＪ１３７３２（ｐＭＷＫＱ，ＲＨＴＡ３）株を得た。これらの株を、それぞれ１００ｍｇ／ｌのアンピシリンおよび７５ｍｇ／ｌのカナマイシンを含有するＬブロス中で、３７℃で１８時間培養した。得られた培養液０．３ｍｌを、２０×２００ｍｍ試験管中の１００ｍｇ／ｌのアンピシリンおよび７５ｍｇ／ｌのカナマイシンを含有する発酵培地（実施例３を参照）３ｍｌに接種し、ロータリーシェーカーを用いて３７℃で４８時間培養した。培養後、培地中に蓄積したイノシン量を、上述のようにＨＰＬＣにより測定した。結果を表４に示す。
【００７１】
【表４】
表４からわかるように、ｒｈｔＡ遺伝子増幅は、、ＡＪ１３７３２（ｐＭＷＫＱ）株のイノシン生産性を改善した。
【００７３】
【実施例９】
エシェリヒア・コリのキサントシン生産株によるキサントシン生産に対するｒｈｔＡ遺伝子増幅の影響
実施例７に記載したキサントシン生産株ＡＪ１３７３２ｇｕａＡ：：Ｔｎ１０（ｐＭＷＫＱ）を、ｐＲＨＴＡ３プラスミドまたはｐＡＹＣＴＥＲ３ベクターにより形質転換して、ＡＪ１３７３２ｇｕａＡ：：Ｔｎ１０（ｐＭＷＫＱ，ＲＨＴＡ３）およびＡＪ１３７３２ｇｕａＡ：：Ｔｎ１０（ｐＭＷＫＱ，ｐＡＹＣＴＥＲ３）を得た。これらの株を、それぞれ１００ｍｇ／ｌのアンピシリンおよび７５ｍｇ／ｌのカナマイシンを有するＬブロス中で、３７℃で１８時間培養した。得られた培養液０．３ｍｌを、２０×２００ｍｍ試験管中の１００ｍｇ／ｌのアンピシリンおよび７５ｍｇ／ｌのカナマイシンを含有する発酵培地（実施例３を参照）３ｍｌに接種し、ロータリーシェーカーを用いて、３７℃で４８時間培養した。培養後、培地中に蓄積したキサントシン量を、上述のようにＨＰＬＣにより測定した。結果を表５に示す。
【００７４】
【表５】
表５からわかるように、ｒｈｔＡ遺伝子増幅は、ＡＪ１３７３２ｇｕａＡ：：Ｔｎ１０（ｐＭＷＫＱ）株のキサントシン生産性を改善した。
【００７６】
【実施例１０】
ｒｈｔＡ遺伝子のｐＬＦ１４ベクターへのクローニング
遺伝子バンクデータの検索により得られる情報に基づいて、５１merのプライマーＮｏ．１（配列番号５）および１９merのプライマーＮｏ．２（配列番号６）を合成した。
【００７７】
プライマーＮｏ．１は、バチルス・ズブチリス由来のｐｕｒＥ遺伝子の開始コドンから上流の３０番目〜１番目のヌクレオチド由来の配列、およびエシェリヒア・コリ由来のｒｈｔＡ遺伝子の開始コドンから２１番目の下流ヌクレオチド由来の配列から構成される。ｐｕｒＥ遺伝子の開始コドンから上流の３０番目〜１番目のヌクレオチド由来の配列は、ｐｕｒＥ遺伝子リボソーム結合部位およびその隣接スペーサー配列を含む。プライマーＮｏ．２は、ｒｈｔＡ遺伝子の終止コドンから１２２〜１０５ヌクレオチド下流の配列に相補的な配列である。鋳型としてエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株の染色体ＤＮＡを用いて、９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で２分を３０サイクルでＰＣＲを行った（Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer）。バチルス・ズブチリス由来のｐｕｒＥ遺伝子リボソーム結合部位およびその隣接スペーサー配列に融合されたｒｈｔＡ遺伝子を含有する得られたＰＣＲ断片を、ｐＧＥＭ−Ｔベクター(Promega)にクローニングした。
【００７８】
次に、バチルス属の細胞中で、Ｋａｎ遺伝子プロモーター制御下にて異種遺伝子を発現することができる移動性（接合伝達性）単一レプリコンシャトルベクターｐＬＦ１４（Shevelev et al., Plasmid, 43, 190-199, 2000）のＳａｃＩ−ＳｐｈＩ部位に再クローニングした。得られたプラスミドｐＬＦ−ＲＨＴＡ（図５）を、共在性（co-resident）ＲＰ４プラスミドを用いてエシェリヒア・コリＴＧ１株から、バチルス・ズブチリス１６８株に移動させた。バチルス細胞で発現したｒｈｔＡ遺伝子は、同細胞をＭ９最小培地上で生育させたときに、ホモセリン耐性を増加させた（表６）。
【００７９】
【表６】
【参考例１】
バチルス・ズブチリスのイノシン生産菌ＫＭＢＳ１６株の構築ｐｕｒＲ、ｐｕｒＡ、およびｄｅｏＤ遺伝子中に挿入−欠失変異を有する変異株であるバチルス・ズブチリスのイノシン生産菌ＫＭＢＳ１６株を、バチルス・ズブチリス１６８ Ｍａｒｂｕｒｇ株から得た。
【００８１】
１）バチルス・ズブチリスのｐｕｒＲ欠損変異株の構築
バチルス・ズブチリス１６８ Ｍａｒｂｕｒｇの染色体ＤＮＡを鋳型として、また遺伝子データバンクのＤＮＡ配列情報に従って合成したオリゴヌクレオチドプライマーＮｏ．１（配列番号７）およびＮｏ．２（配列番号８）を用いて、９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で１分の３０サイクルでＰＣＲを行った（Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer）。プライマーＮｏ．１（２８mer）は、バチルス・ズブチリスｐｕｒＲ遺伝子（M. Weng, P.L. Nagy, and H. Zalkin. Identification of the Bacillus subtilis pur operon repressor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995, 92:7455-7459）の開始コドン上流の２４６番目〜２２８番目のヌクレオチド由来の配列、および、５’末端に付加したＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む９mer配列から構成される。プライマーＮｏ．２（２８mer）は、ＰｓｔＩ部位を含む９mer配列を５’末端に融合したｐｕｒＲ遺伝子の終止コドンの下流の５７〜７５のヌクレオチド由来の配列である。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩで消化したＰＣＲ増幅断片（０．９ｋｂ）を、ｐＨＳＧ３８９(TaKaRa, Japan)の両方の制限酵素部位の間に挿入して、ｐＨＳＧ３９８ＢＳＰＲを創製した。増幅されたｐｕｒＲ遺伝子の内部配列であるＥｃｏＲＶ−ＨｉｎｃＩＩ断片０．３ｋｂをｐＨＳＧ３９８ＢＳＰＲから除去し、続いて、ｐＤＧ１７２６（Bacillus Genetic Stock Center, Ohio）から切り出したエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）のスペクチノマイシン耐性遺伝子（１．２ｋｂ）で置き換えた。
【００８２】
得られたプラスミドｐＨＳＧ３９８ｐｕｒＲ：：ｓｐｃを、Dubunau and Davidoff-Abelsonの方法（Dubnau, D., and R. Davidoff-Abelson. Fate of transforming DNA following uptake by competent Bacillus subtilis. J. Mol. Biol. 1971, 56:209-221）により調製したバチルス・ズブチリス１６８ Ｍａｒｂｕｒｇのコンピテントセルの形質転換に使用した。スペクチノマイシン耐性コロニーから個々に染色体ＤＮＡを調製し、続いて上述のＰＣＲにより、ダブルクロスオーバー変異株をスクリーニングした。ｐｕｒＲ欠損変異株（ｐｕｒＲ：：ｓｐｃ）であると確認されたコロニーの１つをＫＭＢＳ４と命名した。
【００８３】
２）バチルス・ズブチリスのｐｕｒＡ欠損変異株の構築
バチルス・ズブチリス１６８ Ｍａｒｂｕｒｇの染色体ＤＮＡを鋳型として、また遺伝子データバンクのＤＮＡ配列情報に従って合成したオリゴヌクレオチドプライマーＮｏ．３（配列番号９）およびＮｏ．４（配列番号１０）を用いて、９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で２分の３０サイクルでＰＣＲを行った（Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer）。プライマーＮｏ．３（２９mer）は、バチルス・ズブチリスｐｕｒＡ遺伝子の開始コドンの上流の１３７番目〜１１８番目のヌクレオチド由来の配列（P. Mantsala and H, Zalikin. Cloning and sequence of Bacillus subtilis purA and gua A, involved in the conversion of IMP to AMP and GMP. J, Bacteriol. 1992, 174: 1883-1890）、および５’末端に付加したＳａｌＩ部位を含む追加の９mer配列から構成される。プライマーＮｏ．４（２９mer）は、５’末端でＳｐｈＩ部位を含む追加の９mer配列を融合したｐｕｒＡ遺伝子の終止コドンの下流の５１〜７０のヌクレオチド由来の配列である。ＳａｌＩおよびＳｐｈＩで消化したＰＣＲ増幅断片（１．５ｋｂ）を、ｐＳＴＶ２８(TaKaRa Japan)の両制限酵素部位の間に挿入した。得られたプラスミドｐＳＴＶ２８ＢＳＰＡをＭｌｕＩおよびＢｇｌIIで消化し、増幅ｐｕｒＡ遺伝子の内部配列０．４ｋｂを除去して、クレノウ酵素で平滑末端化し、続いて、ｐＤＧ６４６（Bacillus Genetic Stock Center, Ohio）から切り出したスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）のエリスロマイシン耐性遺伝子（１．６ｋｂ）の平滑末端化した断片に連結した。
【００８４】
得られたプラスミドｐＨＳＧ３９８ｐｕｒＡ：：ｅｒｍを、上述のようにDubunau and Davidoff-Abelsonの方法により調製された、ＫＭＢＳ４のコンピテントセルの形質転換に使用した。エリスロマイシン耐性コロニーから個々に染色体ＤＮＡを調製し、続いて上述のＰＣＲにより、ダブルクロスオーバー変異株をスクリーニングした。ｐｕｒＡ欠損変異株（ｐｕｒＲ：：ｓｐｃ ｐｕｒＡ：：ｅｒｍ）であると確認されたコロニーの１つをＫＭＢＳ１３と命名した。予想通り、ＫＭＢＳ１３の細胞は、アデニン栄養要求株であった。
【００８５】
３）バチルス・ズブチリスのｄｅｏＤ欠損変異株の構築
バチルス・ズブチリス由来のｄｅｏＤ遺伝子の５’末端およびその上流領域を増幅するために、遺伝子データバンクのＤＮＡ配列情報に従って合成したオリゴヌクレオチドプライマーＮｏ．５（配列番号１１）およびＮｏ．６（配列番号１２）を用いて、９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で１分の３０サイクルでＰＣＲを行った（Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer）。プライマーＮｏ．５（２９mer）は、ｄｅｏＤ遺伝子の開始コドンの上流の３１０番目〜２９１番目のヌクレオチド由来の配列、および５’末端に付加したＥｃｏＲＩ部位を含む追加の９mer配列から構成される。プライマーＮｏ．６（２９mer）は、５’末端にＢａｍＨＩ部位を含む追加の９mer配列を融合したｄｅｏＤ遺伝子の開始コドンの下流の３９〜５７のヌクレオチド由来の配列である。ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化したＰＣＲ増幅断片（０．４ｋｂ）を、ｐＳＴＶ２８(TaKaRa Japan)の両制限酵素部位の間に挿入して、ｐＳＴＶ２８ＤＯＮを創製した。
【００８６】
ｄｅｏＤ遺伝子の３’末端およびその下流領域を増幅するために、遺伝子データバンクのＤＮＡ配列情報に従って合成したオリゴヌクレオチドプライマーＮｏ．７（配列番号１３）およびＮｏ．８（配列番号１４）を用いて、９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で１分の３０サイクルでＰＣＲを行った（Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer）。プライマーＮｏ．７（２９mer）は、ｄｅｏＤ遺伝子の終止コドンの下流の３２１番目〜３０２番目のヌクレオチド由来の配列、および５’末端に付加したＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む９mer配列から構成される。プライマーＮｏ．８（２９mer）は、５’末端にＢａｍＨＩ部位を含む追加の９mer配列を融合したｄｅｏＤ遺伝子の終止コドンの上流の２４番目〜４２番目のヌクレオチド由来の配列である。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化したＰＣＲ増幅断片（０．４ｋｂ）を、ｐＳＴＶ２８ＤＯＮの両制限酵素部位の間に挿入して、ｐＳＴＶ２８ＤＯＮＣを創出した。
【００８７】
ストレプトコッカス・フェカーリス（Streptococcus faecalis）のカナマイシン耐性遺伝子を増幅するために、鋳型としてｐＤＧ７８３のプラスミドＤＮＡ(Bacillus Genetic Stock Center, Ohio)を、また遺伝子データバンクのＤＮＡ配列情報に従って合成したオリゴヌクレオチドプライマーＮｏ．１０（配列番号１５）およびＮｏ．１１（配列番号１６）を用いて、９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で２分の３０サイクルでＰＣＲを行った（Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer）。プライマーＮｏ．１０（３３mer）は、カナマイシン耐性遺伝子の開始コドンの上流の５１３番目〜４９０番目のヌクレオチド由来の配列、および５’末端に付加したＢａｍＨＩ部位を含む追加の９mer配列から構成される。プライマーＮｏ．１１（３３mer）は、５’末端にＢａｍＨＩ部位を含む追加の９mer配列を融合したカナマイシン耐性遺伝子の終止コドンの下流の１１７〜１４０のヌクレオチド由来の配列である。ＢａｍＨＩで消化したＰＣＲ増幅断片（１．５ｋｂ）を、ｐＳＴＶ２８ＤＯＮＣの唯一のＢａｍＨＩ部位に挿入した。得られたプラスミドｐＳＴＶ２８ｄｅｏＤ：：ｋａｎを、上述のようにDubunau and Davidoff-Abelsonの方法により調製した、ＫＭＢＳ１３のコンピテントセルの形質転換に使用した。カナマイシン耐性コロニーから個々に染色体ＤＮＡを調製し、続いてプライマーＮｏ．５およびＮｏ．７を用いた上述のＰＣＲにより、ダブルクロスオーバー変異株をスクリーニングした。ｄｅｏＤ欠損変異株（ｐｕｒＲ：：ｓｐｃ：：ｅｒｍ ｄｅｏＤ：：ｋａｎ）であると確認されたコロニーの１つをＫＭＢＳ１６と命名した。
【００８８】
【実施例１１】
バチルス・ズブチリスのイノシン生産株によるイノシン生産に対するｒｈｔＡ遺伝子増幅の効果
ｐＬＦ−ＲＨＴＡプラスミドおよびｐＬＦ１４ベクターを、バチルス・ズブチリスのイノシン生産株であるＫＭＢＳ１６に移動させた。こうして、バチルス・ズブチリスＫＭＢＳ１６（ｐＬＦ−ＲＨＴＡ）株およびバチルス・ズブチリスＫＭＢＳ１６（ｐＬＦ１４）株を得た。これらの株を、それぞれ１０ｍｇ／ｌのクロラムニフェニコールを含有するＬブロス中で、３７℃で１８時間培養し、得られた培養液０．３ｍｌを、２０×２００ｍｍ試験管中の１０ｍｇ／ｌのクロラムニフェニコールを含有するバチルス用発酵培地３ｍｌに接種し、ロータリーシェーカーを用いて３７℃で７２時間培養した。
【００８９】
バチルス用発酵培地の組成（ｇ／ｌ）：
グルコース ８０．０
ＫＨ2ＰＯ4 １．０
ＭｇＳＯ4 ０．４
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０１
ＭｎＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ０．０１
Ｍａｍｅｎｏ−ＴＮ １．３５
ＤＬ−メチオニン ０．３
ＮＨ4Ｃｌ ３２．０
アデニン ０．１
トリプトファン ０．０２
ＣａＣＯ3 ５０．０
【００９０】
培養後、培地中に蓄積したイノシン量を、上述のようにＨＰＬＣにより測定した。結果を表７に示す。
【００９１】
【表７】
表７からわかるように、ｒｈｔＡ遺伝子増幅は、バチルス・ズブチリス菌株ＫＭＢＳ１６のイノシン生産性を改善した。
【発明の効果】
本発明により、エシェリヒア属およびバチルス属に属する細菌によるイノシンおよびキサントシン等のプリンヌクレオシドの生産性を向上させることができる。また、本発明によれば、５’−イノシン酸、５’−キサンチル酸および５’−グアニル酸等のプリンヌクレオチドを効率よく製造することができる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ｐＮＺ１６プラスミドの構造を示す図。
【図２】 ｐＲＨＴＡ３プラスミドの構造を示す図。
【図３】 ＲｈｔＡタンパク質のハイドロパシープロフィールの、ＹｄｅＤタンパク質のハイドロパシープロフィールとの比較を示す図。
【図４】 細胞分画中のＲｈｔＡタンパク質の分布を示す図。
ライン１は、プラスミドを保持しない発現誘導されたＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の沈降物（１５，０００ｇ）を表す（コントロール）。
ライン２〜７は、プラスミドｐＥＴ２２ｂ−ｒｈｔＡを保持する発現誘導されたＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の等容量の沈降物および溶解性分画を表す。
ライン２、３は、それぞれ１５，０００ｇでの遠心分離の沈降物および上清、
ライン４、５は、それぞれ１８０，０００ｇでの遠心分離の沈降物および上清、 ライン６、７は、細胞を１ＭのＫＣｌで処理した後のそれぞれ１８０，０００ｇでの遠心分離の沈降物および上清を表す。
分子量マーカー（ｋＤａ）を左端に示し、ＲｈｔＡタンパク質の位置を右端の矢印で示した。
【図５】ｐＬＦ−ＲＨＴＡプラスミドの構造を示す図。
Claims (6)
- プリンヌクレオシド生産能を有するエシェリヒア属またはバチルス属に属する細菌を培地で培養し、生成、蓄積したプリンヌクレオシドを該培地から採取することを特徴とするプリンヌクレオシドの製造方法であって、
前記細菌が、同細菌中の下記（Ａ）または（Ｂ）に示すタンパク質の活性が、該タンパク質をコードするＤＮＡを含む多コピーベクターを用いた形質転換、または前記細菌中の同ＤＮＡのプロモーターの置換、またはATG開始コドンに対して−１位におけるGからAへの置換により増強された細菌であり、前記プリンヌクレオシドがイノシンまたはキサントシンであることを特徴とする方法：
（Ａ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、（Ｂ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、前記細菌を８−アザアデニン耐性にする活性を有するタンパク質。 - 前記細菌は、プリンヌクレオチド生合成のための遺伝子の発現が高められるように改変されたことを特徴とする請求項１に記載の方法。
- プリンヌクレオシド生産能を有するエシェリヒア属またはバチルス属に属する細菌を培地で培養し、生成、蓄積したヌクレオシドをリン酸化し、生成、蓄積したプリンヌクレオチドを採取することを特徴とするプリンヌクレオチドの製造方法であって、前記細菌が、同細菌中の下記（Ａ）または（Ｂ）に示すタンパク質の活性が、該タンパク質をコードするＤＮＡを含む多コピーベクターを用いた形質転換、または前記細菌中の同ＤＮＡのプロモーターの置換、またはATG開始コドンに対して−１位におけるGからAへの置換により増強された細菌であり、前記プリンヌクレオチドが５'−イノシン酸または５'−キサンチル酸であることを特徴とする方法：
（Ａ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、（Ｂ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、前記細菌を８−アザアデニン耐性にする活性を有するタンパク質。 - 前記細菌は、プリンヌクレオチド生合成のための遺伝子の発現が高められるように改変されたことを特徴とする請求項３に記載の方法。
- キサントシン生産能を有するエシェリヒア属またはバチルス属に属する細菌を培地で培養し、生成、蓄積したキサントシンをリン酸化し、生成、蓄積した５'−キサンチル酸をアミノ化し、そして生成、蓄積した５'−グアニル酸を採取することを特徴とする５'−グアニル酸の製造方法であって、前記細菌が、同細菌中の下記（Ａ）または（Ｂ）に示すタンパク質の活性が、該タンパク質をコードするＤＮＡを含む多コピーベクターを用いた形質転換、または前記細菌中の同ＤＮＡのプロモーターの置換、またはATG開始コドンに対して−１位におけるGからAへの置換により増強された細菌であることを特徴とする方法：
（Ａ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、（Ｂ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、前記細菌を８−アザアデニン耐性にする活性を有するタンパク質。 - 前記細菌は、プリンヌクレオチド生合成のための遺伝子の発現が高められるように改変された請求項５に記載の方法。
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