JP2003325182A - 発酵法によるヌクレオシド−５’−リン酸エステルの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 エシェリヒア属細菌を用いてＩＭＰ及びＧＭ
Ｐ等のヌクレオシド−５’−リン酸エステルを製造する
方法を提供する。 【解決手段】 ヌクレオシド−５’−リン酸エステルの
生産能を有し、かつ、下記（Ａ）又は（Ｂ）に記載のタ
ンパク質の発現量が上昇するように改変されたエシェリ
ヒア属細菌を培地で培養し、該培地中にヌクレオシド−
５’−リン酸エステルを生成蓄積せしめ、該培地から前
記ヌクレオシド−５’−リン酸エステルを採取する。
（Ａ）特定なアミノ酸配列を有するタンパク質。（Ｂ）
特定なアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ
酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列
を有し、かつ、エシェリヒア属細菌において発現量を上
昇させたときにヌクレオシド−５’−リン酸エステルの
生産能を向上させる活性を有するタンパク質。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、発酵法によるヌク
レオシド−５’−リン酸エステルの製造法に関する。ヌ
クレオシド−５’−リン酸エステルは、調味料、医薬並
びにそれらの原料等として有用である。

【０００２】

【従来の技術】ヌクレオシド−５’−リン酸エステルの
工業的な製造法としては、ヌクレオシドを発酵法により
製造し、得られたヌクレオシドを酵素的にリン酸化して
ヌクレオシド−５’−リン酸エステルを得る方法が知ら
れている。

【０００３】一方、ヌクレオシド−５’−リン酸エステ
ルを発酵法により直接製造する方法が提案されている。
例えば、特公昭５６−１２４３８号公報には、アデニン
要求性を有しさらにデコイニンまたはメチオニンスルフ
ォキシドに耐性を有し、かつ５’−グアニル酸（グアノ
シン−５’−モノリン酸、以下「ＧＭＰ」ともいう）生
産能を有するバチルス属の変異株を培養し、培地中に生
成蓄積したＧＭＰを採取することを特徴とする５’−グ
アニル酸の製造法が開示されている。

【０００４】また、バチルス・サブチリスのイノシン生
産菌からの５’−イノシン酸（イノシン−５’−リン
酸、以下「ＩＭＰ」ともいう）生産菌の誘導について、
いくつか報告されている（Magasanik, B. et al., J. B
iol. Chem., 226, 339 (1957);Fujimoto, M., et al.,
Agric. Biol. Chem., 30, 605 (1966)）。

【０００５】しかし、一般的に、ヌクレオシド−５’−
リン酸エステルの直接発酵は、収率が十分ではなく、前
記酵素法に比較して実用的でない。ＩＭＰあるいはＧＭ
Ｐの直接発酵が困難である理由として、ヌクレオシド−
５’−リン酸エステルはリン酸化合物であるために細胞
透過性がわるいこと、及び、ヌクレオシド−５’−リン
酸エステルを分解する酵素がかなり普遍的に分布してい
ることが挙げられている（核酸発酵、アミノ酸・核酸集
談会編、講談社サイエンティフィク）。このような障害
を克服するために、ヌクレオシド−５’−リン酸エステ
ル分解活性を欠失させる試みがなされてきた。前記特公
昭５６−１２４３８号公報には、ヌクレオチダーゼ活性
が低下した変異株から、ＧＭＰの収率が高い菌株を取得
しうることが示唆されている。欧州特許公開１１７０３
７０号には、エシェリヒア属細菌において、２種類のヌ
クレオチダーゼ遺伝子（ｕｓｈＡ、ａｐｈＡ）を欠損さ
せることにより、培養液中にＩＭＰあるいはＧＭＰを蓄
積せしめることが可能であることが記載されている。

【０００６】また、工業レベルでヌクレオシド−５’−
リン酸エステルを製造する技術としては、ブレビバクテ
リウム・アンモニアゲネスの変異株を用いてＩＭＰを製
造する方法が開発されている（Furuya et al., Appl. M
icrobiol., 16, 981 (1968)）。

【０００７】ところで、Ｌ−アミノ酸の発酵生産におい
ては、Ｌ−アミノ酸の排出に関与するタンパク質遺伝子
の発現を増強することによって生産性を増強する技術が
知られている（WO9723597A2、米国特許5,972,663等）。
しかしながら、微生物において、ヌクレオシド−５’−
リン酸エステルの透過又は排出に関与する担体あるいは
それを促進するような因子の報告はなされていない。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】前述のように、直接発
酵によるヌクレオシド−５’−リン酸エステルの製造に
ついて種々の研究が行われており、成功例もいくつか知
られている。しかし、ヌクレオシド−５’−リン酸エス
テルの生産性向上に関する研究は十分とはいえず、特に
エシェリヒア属細菌では実用レベルでヌクレオシド−
５’−リン酸エステルを製造した例は知られていない。

【０００９】本発明は、上記観点からなされたものであ
り、エシェリヒア属細菌を用いてＩＭＰ及びＧＭＰ等の
ヌクレオシド−５’−リン酸エステルを製造する方法を
提供することを課題とする。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するために鋭意研究を行い、エシェリヒア・コリの
ゲノム上のコードされる遺伝子の中からヌクレオシド−
５’−リン酸エステルの生産能を向上する因子をコード
する遺伝子の存在を発見することに成功した。そして、
同遺伝子を増幅することによって、ＩＭＰ又はＧＭＰの
生産能を有するエシェリヒア・コリのＩＭＰ又はＧＭＰ
の生産能が向上することを見出し、本発明を完成するに
至った。

【００１１】すなわち本発明は、以下のとおりである （１）ヌクレオシド−５’−リン酸エステルの生産能を
有し、かつ、下記（Ａ）又は（Ｂ）に記載のタンパク質
の発現量が上昇するように改変されたエシェリヒア属細
菌。 （Ａ）配列番号２３に示すアミノ酸配列を有するタンパ
ク質。 （Ｂ）配列番号２３に示すアミノ酸配列において、１若
しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加
を含むアミノ酸配列を有し、かつ、エシェリヒア属細菌
において発現量を上昇させたときにヌクレオシド−５’
−リン酸エステルの生産能を向上させる活性を有するタ
ンパク質。 （２）前記タンパク質の発現量の増強は、同タンパク質
をコードする遺伝子のコピー数を高めること、又は前記
細菌細胞内の前記タンパク質をコードする遺伝子の発現
が増強されるように同遺伝子の発現調節配列を改変する
ことによるものである(1)の細菌。 （３）前記タンパク質は、配列番号２３に示すアミノ酸
配列において、２以上、かつ、１０以下のアミノ酸の置
換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有す
る(1)又は(2)の細菌。 （４）前記タンパク質は、配列番号２３に示すアミノ酸
配列と９０％以上の相同性を有する(1)又は(2)の細菌。 （５）前記タンパク質は、下記（ａ）又は（ｂ）に示す
ＤＮＡによりコードされる(1)〜(4)のいずれかの細菌。 （ａ）配列番号２２に記載の塩基配列を含むＤＮＡ。 （ｂ）配列番号２２に記載の塩基配列又は同塩基配列か
ら調製され得るプローブとストリンジェントな条件下で
ハイブリダイズし、かつ、エシェリヒア属細菌において
発現量を上昇させたときにヌクレオシド−５’−リン酸
エステルの生産能を向上させる活性を有するタンパク
質。 （６）前記ヌクレオシド−５’−リン酸エステルが５’
−イノシン酸又は５’−グアニル酸である(1)〜(5)のい
ずれかの細菌。 （７）前記ＤＮＡが、低コピー数ベクターを用いて細胞
に導入された(1)〜(6)のいずれかの細菌。 （８）ｕｓｈＡ遺伝子及びａｐｈＡ遺伝子が正常に機能
しないように改変されたことを特徴とする(1)〜(7)のい
ずれかの細菌。 （９）５’−イノシン酸生産能を有し、５’−アデニル
酸及び５’−グアニル酸によるフィードバック阻害が解
除されたＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼを保持する
ように改変された(1)〜(8)のいずれかの細菌。 （１０）５’−グアニル酸生産能を有し、ＧＭＰレダク
ターゼが正常に機能せず、かつ、グアノシンキナーゼ活
性が増強されるように改変された(1)〜(8)のいずれかの
細菌。 （１１）(1)〜(10)のいずれかの細菌を培地で培養し、
該培地中にヌクレオシド−５’−リン酸エステルを生成
蓄積せしめ、該培地から前記ヌクレオシド−５’−リン
酸エステルを採取することを特徴とするヌクレオシド−
５’−リン酸エステルの製造法。

【００１２】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。

【００１３】＜１＞本発明のエシェリヒア属細菌 本発明のエシェリヒア属細菌は、ヌクレオシド−５’−
リン酸エステルの生産能を有し、かつ、下記（Ａ）又は
（Ｂ）に記載のタンパク質の発現量が上昇するように改
変されたエシェリヒア属細菌である。 （Ａ）配列番号２３に示すアミノ酸配列を有するタンパ
ク質。 （Ｂ）配列番号２３に示すアミノ酸配列において、１若
しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加
を含むアミノ酸配列を有し、かつ、エシェリヒア属細菌
において発現量を上昇させたときにヌクレオシド−５’
−リン酸エステルの生産能を向上させる活性を有するタ
ンパク質。

【００１４】本発明にいうエシェリヒア属細菌として
は、エシェリヒア・コリ等、エシェリヒア属に属する微
生物であれば特に制限されないが、具体的にはナイトハ
ルトらの著書（Neidhardt,F.C. et.al.,Escherichia co
li and Salmonella Typhimurium,American Society for
Microbiology,Washington D.C.,1208, table 1）に挙
げられるものが利用できる。エシェリヒア・コリを遺伝
子工学的手法を用いて育種する場合には、E. coli K12
株及びその誘導体を用いることができる。

【００１５】本発明にいうヌクレオシド−５’−リン酸
エステルとは、例えば５’−グアニル酸、５’−イノシ
ン酸などが挙げられる。また、本発明でいうヌクレオシ
ド−５’−リン酸エステル生産能とは、ヌクレオシド−
５’−リン酸エステルを培地中に生産蓄積する能力を意
味する。

【００１６】以下に、前記タンパク質について説明す
る。本発明者は、微生物において、ヌクレオシド−５’
−リン酸エステル生産能に影響を与えるタンパク質、例
えばヌクレオシド−５’−リン酸エステルの排出、又は
透過に関与するタンパク質が存在し、かつ、このタンパ
ク質は膜タンパク質であるとの仮説に基づき、データベ
ースの検索を行った。すなわち、既知の塩基配列（エシ
ェリヒア・コリK-12株の染色体の全塩基配列（Blattner
F.R., Plunkett G., Bloch C.A. et al., Science, 22
7, 1453-1474 (1997)）においてタンパク質をコードす
ると予想される、機能未知の遺伝子を抽出した。次に選
出した遺伝子のアミノ酸配列を公知の膜タンパク質予想
プログラムSOSui（Hirokawa, T., et al., Bioinformat
ics, 14, 378-379 (1998)）により、膜タンパク質と予
想される遺伝子を抽出した。この作業により、機能未知
かつ膜タンパク質と予想される遺伝子を抽出した。その
結果得られた候補の中から、１箇所の膜貫通領域を有す
るb1903遺伝子（GenBankのACCESSION No.AE000283のo11
2に対応）、３箇所有するb3002（yqhA）遺伝子（GenBan
kのACCESSION No.AE000382のf164に対応）、同じく３箇
所有するb2377遺伝子（GenBankのACCESSION No.AE00032
6のf80に対応）、11箇所有するydhC遺伝子（GenBankのA
CCESSION No.AE000261のo403に対応）、14箇所有するb0
709（ybgH）遺伝子（GenBankのACCESSION No.AE000174
のf493に対応）を、目的タンパク質の候補遺伝子として
選出した。そして、エシェリヒア・コリにおいてこれら
のタンパク質発現量を増大させ、その活性を高めること
により、ヌクレオシド−５’−リン酸エステル生産に与
える影響を確認した。その結果、実施例に示すように、
b2377遺伝子のコードするタンパク質、すなわち、配列
番号２３に示すアミノ酸配列を有するタンパク質が、ヌ
クレオシド−５’−リン酸エステル生産量を増大させる
効果を有することが確認された。

【００１７】上記の経緯から、本明細書においては、b2
377遺伝子のコードするタンパク質を便宜的に「ＮＡＰ
タンパク質（Nucleotide Accumulation Promotion Prot
ein）」と呼ぶ。ＮＡＰタンパク質は、前記仮説に基づ
いて選択されたものであり、ヌクレオシド−５’−リン
酸エステルの排出又は透過に関与している可能性があ
る。しかし、ＮＡＰタンパク質の直接の機能は不明であ
り、必ずしも機能がヌクレオシド−５’−リン酸エステ
ルの排出又は透過に限定されることを意味するものでは
なく、ヌクレオシド−５’−リン酸エステルの生産能を
向上させる活性を有する限り、異なる機能であってもよ
い。

【００１８】ＮＡＰタンパク質をコードするＤＮＡとし
ては、例えば、配列番号２２に示す塩基配列を有するＤ
ＮＡが挙げられる。また、同塩基配列において、各々の
コドンを他の等価のコドンに置換した配列であってもよ
い。なお、本発明において「タンパク質をコードするＤ
ＮＡ」とは、ＤＮＡが二本鎖の場合にはそのいずれか一
方の鎖がタンパク質をコードすることを意味する。

【００１９】本発明において、ＮＡＰタンパク質の「ヌ
クレオシド−５’−リン酸エステルの生産能を向上させ
る活性」とは、同タンパク質の発現量が上昇するように
改変されたエシェリヒア属細菌が、エシェリヒア属細菌
の非改変株、例えば野生株よりも多量にヌクレオシド−
５’−リン酸エステルを培地中に生産蓄積することを意
味する。エシェリヒア・コリの野生株としては、例えば
E. coli MG1655株、及びW3110株が挙げられる。

【００２０】本発明において、ＮＡＰタンパク質は、ヌ
クレオシド−５’−リン酸エステルの産生能を向上させ
る活性が損なわれない限り、配列番号２３に示すアミノ
酸配列において１若しくは複数の位置での１若しくは数
個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位を
含んでもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基の
タンパク質の立体構造における位置や種類によっても異
なるが、具体的には、２〜１０個、好ましくは、２〜７
個、より好ましくは２〜４個である。

【００２１】上記のようなＮＡＰタンパク質と実質的に
同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特
異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸残基が置
換、欠失、挿入、付加、または逆位を含むように塩基配
列を改変することによって得られる。また、上記のよう
な改変されたＤＮＡは、従来知られている変異処理によ
っても取得され得る。変異処理としては、ＮＡＰタンパ
ク質をコードするＤＮＡをヒドロキシルアミン等でイン
ビトロ処理する方法、及びＮＡＰタンパク質をコードす
るＤＮＡを保持する微生物、例えばエシェリヒア属細菌
を、紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−
ニトロソグアニジン（NG）もしくは亜硝酸等の通常に変
異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が
挙げられる。

【００２２】また、上記のようなアミノ酸残基の置換、
欠失、挿入、付加、または逆位等には、ＮＡＰタンパク
質を保持する微生物の個体差、種や株の違いに基づく場
合などの天然に生じる変異（mutationまたはvariatio
n）も含まれる。

【００２３】上記のような変異を有するＤＮＡを、適当
なエシェリヒア属細菌の細胞で発現させ、その細胞のヌ
クレオシド−５’−リン酸エステルの生産性の向上を調
べることにより、ＮＡＰタンパク質と実質的に同一のタ
ンパク質をコードするＤＮＡが得られる。また、変異を
有するＮＡＰタンパク質をコードするＤＮＡまたはこれ
を保持する細胞から、例えば配列番号２２の塩基配列又
はその一部を有するプローブとストリンジェントな条件
下でハイブリダイズし、ヌクレオシド−５’−リン酸エ
ステルの生産能を向上させる活性を有するたんぱく質を
コードするＤＮＡを単離することによっても、ＮＡＰタ
ンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮ
Ａが得られる。ここでいう「ストリンジェントな条件」
とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特
異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条
件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せ
ば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５０％以上、好ま
しくは８０％以上、より好ましくは９０％以上の相同性
を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同
性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件が挙げ
られる。より具体的には、通常のサザンハイブリダイゼ
ーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．
１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％Ｓ
ＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げ
られる。

【００２４】プローブとして、配列番号２２の塩基配列
の一部の配列を用いることもできる。そのようなプロー
ブは、配列番号２２の塩基配列に基づいて作製したオリ
ゴヌクレオチドをプライマーとし、配列番号２２の塩基
配列を含むＤＮＡ断片を鋳型とするＰＣＲによって作製
することができる。プローブとして、３００ｂｐ程度の
長さのＤＮＡ断片を用いる場合には、ハイブリダイゼー
ションの洗いの条件は、５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％
ＳＤＳが挙げられる。

【００２５】上記のような条件でハイブリダイズする遺
伝子の中には途中にストップコドンが発生したものや、
変異により活性を失ったものも含まれるが、それらにつ
いては、ヌクレオシド−５’−リン酸エステルの生産性
を有するエシェリヒア属細菌において目的タンパク質を
発現させ、ヌクレオシド−５’−リン酸エステルの生産
性の向上を調べることによって選択することができる。

【００２６】次に、エシェリヒア属細菌のＮＡＰタンパ
ク質の発現量を上昇させる方法について説明する。本発
明において、「ＮＡＰタンパク質の発現量が上昇するよ
うに改変された」とは、エシェリヒア属細菌の非改変
株、例えば野生株よりも、ＮＡＰタンパク質の発現量が
多いことを意味する。ＮＡＰタンパク質の発現量は、例
えばＮＡＰ遺伝子の転写産物をノザン法により検出する
方法、ＮＡＰタンパク質をウェスタン法により検出する
方法等により調べることができる。また、ＮＡＰタンパ
ク質の発現量は、エシェリヒア属細菌のヌクレオシド−
５’−リン酸エステルの生産能を調べることにより、間
接的に決定することもできる。定性的には、ＮＡＰタン
パク質をコードする遺伝子を発現可能な状態で導入され
たエシェリヒア属細菌、又はＮＡＰタンパク質をコード
する遺伝子の発現が増強されるように同遺伝子の発現調
節配列が改変されたエシェリヒア属細菌は、ＮＡＰタン
パク質の発現量が上昇するように改変されている。

【００２７】ＮＡＰタンパク質の発現量を上昇させる方
法としては、ＮＡＰタンパク質をコードするＤＮＡの、
細菌の細胞内のコピー数を上昇させる方法が挙げられ
る。細胞内のコピー数を上昇させるには、ＮＡＰタンパ
ク質をコードするＤＮＡ断片を、エシェリヒア属細菌で
機能するベクターと連結して組み換えＤＮＡを作製し、
これを宿主に導入して形質転換すればよい。形質転換株
の細胞内のＮＡＰタンパク質をコードする遺伝子（ＮＡ
Ｐタンパク質遺伝子）のコピー数が上昇する結果、ＮＡ
Ｐタンパク質の発現量が上昇する。

【００２８】細胞内のコピー数の上昇は、ＮＡＰタンパ
ク質遺伝子を上記宿主の染色体ＤＮＡ上に多コピー存在
させることによっても達成できる。エシェリヒア属細菌
に属する細菌の染色体ＤＮＡ上にＮＡＰタンパク質を多
コピーで導入するには、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在
する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色
体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列としては、レペッテ
ィブＤＮＡ、転移因子の端部に存在するインバーティッ
ド・リピートが利用できる。あるいは、特開平２−１０
９９８５号公報に開示されているように、目的遺伝子を
トランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体ＤＮ
Ａ上に多コピー導入することも可能であり、好ましい。
いずれの方法によっても形質転換株内のＮＡＰタンパク
質遺伝子のコピー数が上昇する結果、ＮＡＰタンパク質
の発現量が上昇する。

【００２９】多コピーベクターとしては、pSTV29、pMW2
18、pUC19等のプラスミドベクター、λ1059、λBF101、
M13mp9等のファージベクターが挙げられる。また、トラ
ンスポゾンとしては、Mu、Tn10、Tn5が挙げられる。
尚、ＮＡＰタンパク質は膜タンパク質である可能性が高
く、発現量は適度であることが好ましい。すなわち、発
現量が低すぎると、ヌクレオシド−５’−リン酸エステ
ルの生産能を向上させる効果が十分に発揮されず、発現
量が多過ぎると生育に影響を及ぼす可能性がある。した
がって、ＮＡＰタンパク質の発現にb2377遺伝子固有の
プロモーターを用いる場合は、多コピーベクターの中で
も低コピー数ベクターを用いることが好ましい。低コピ
ー数とは、ゲノム当量が、好ましくは１０以下、より好
ましくは、５以下であることをいう。低コピー数ベクタ
ーとしては、例えば、pSC101由来の複製制御領域を有す
るベクター、例えばpMW218、pMW218等が挙げられる。ま
た、高コピー数ベクターであっても、ＮＡＰタンパク質
遺伝子を発現させるのに適度な強さのプロモーターを用
いることによって、適度な量で発現させることができ
る。

【００３０】ＮＡＰタンパク質の発現量の上昇は、上記
の遺伝子増幅による以外に、染色体DNA上またはプラス
ミド上のＮＡＰタンパク質遺伝子のプロモーター等の発
現調節配列を強力なものに置換することによっても達成
される。例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、
trcプロモーター等が強力なプロモーターとして知られ
ている。また、国際公開WO00/18935に開示されているよ
うに、ＮＡＰタンパク質遺伝子のプロモーター領域に数
塩基の塩基置換を導入し、より強力なものに改変するこ
とも可能である。これらのプロモーター置換または改変
によりＮＡＰタンパク質遺伝子の発現が強化され、同タ
ンパク質の活性が増強される。

【００３１】ＮＡＰタンパク質をコードするＤＮＡは、
その塩基配列が公知であるので（GenBankのACCESSION N
o.AE000326のf80に対応する）、その配列に基づいてプ
ライマーを合成し、エシェリヒア属細菌の染色体ＤＮＡ
を鋳型にしてＰＣＲ法により増幅を行うことによって取
得することができる。また、同塩基配列に基づいてプロ
ーブを調製し、エシェリヒア属細菌の染色体ＤＮＡライ
ブラリーからハイブリダイゼーションにより目的のＤＮ
Ａ断片を選択することもできる。あるいは、ＮＡＰタン
パク質をコードするＤＮＡを、既知の塩基配列に基づい
て化学的に合成してもよい。また、エシェリヒア属細菌
以外の微生物からも、上記塩基配列に基づいて、ＮＡＰ
タンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードす
る遺伝子を取得し得る。また、本発明により、１〜３個
の膜貫通領域を有する膜タンパク質と予想されるタンパ
ク質が、ヌクレオシド−５’−リン酸エステルの生産能
を向上させる活性を有する可能性が示されたので、本発
明と同様の検索によって、ＮＡＰタンパク質と同等の機
能を有するタンパク質をコードする遺伝子を検索するこ
とができると予想される。

【００３２】エシェリヒア属細菌へのＤＮＡの導入は、
C. T. Chungの方法（C. T. Chung et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 86, 2172-2175 (1989)）、D. M. Mor
risonの方法（Methods in Enzymology 68, 326 (197
9)）、又は受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮ
Ａの透過性を増す方法（Mandel, M. and Higa, A., J.M
ol. Biol., 53, 159 (1970)）等により行うことができ
る。

【００３３】染色体ＤＮＡの調製、染色体ＤＮＡライブ
ラリーの作製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラ
スミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断及び連結、形質転
換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオシド−５’
−リン酸エステルの設定等の方法は、当業者によく知ら
れている通常の方法を採用することができる。これらの
方法は、Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniati
s, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Sec
ond Edition," Cold Spring Harbor Laboratory Press
(1989)等に記載されている。

【００３４】本発明のエシェリヒア属細菌は、例えば、
ヌクレオシド−５’−リン酸エステルの生産能を有する
エシェリヒア属細菌を親株として、ＮＡＰタンパク質の
発現量が上昇するように改変することによって得ること
ができる。また、本発明のエシェリヒア属細菌は、前記
タンパク質の発現量が上昇するように改変された菌株を
親株として、ヌクレオシド−５’−リン酸エステル生産
株の育種と同様の育種を施すことによっても、取得する
ことができる。さらに、前記タンパク質の発現量を上昇
するような改変と、ヌクレオシド−５’−リン酸エステ
ルの生産能の付与を、同時に行ってもよい。

【００３５】ヌクレオシド−５’−リン酸エステル生産
能を有するエシェリヒア属細菌は、例えば、例えば、プ
リンヌクレオシド生産能を有するエシェリヒア属細菌を
親株として、ushA遺伝子（GenBank accession X03895）
及びaphA遺伝子（GenBank accession X86971）が正常に
機能しない変異株又は遺伝子組換え株を育種することに
よって得ることができる（欧州特許公開１１７０３７０
号）。プリンヌクレオシド生産能を有するエシェリヒア
属細菌については、例えば、WO99/03988号国際公開パン
フレットに詳しい。

【００３６】具体的には例えば、イノシン又はグアノシ
ン生産能を有するエシェリヒア属細菌は、AMP及びGMPに
よるフィードバック阻害が解除されたＰＲＰＰアミドト
ランスフェラーゼをコードする遺伝子（変異型purF）を
導入することによって、育種することができる。

【００３７】※ ushA遺伝子及びaphA遺伝子が正常に機
能しない変異株又は遺伝子組換え株は、これらの遺伝子
が、それらの遺伝子産物である５’−ヌクレオチダーゼ
の活性が低下又は消失するか、又はこれらの遺伝子の転
写が低下または消失するように、改変することによって
得られる。このような微生物は、例えば、遺伝子組換え
法を用いた相同組換え法（Experiments in Molecular G
enetics, Cold Spring Harbor Laboratory press (197
2); Matsuyama, S. and Mizushima, S., J. Bacterio
l., 162, 1196(1985)）により、染色体上のushA遺伝子
及びaphA遺伝子を、正常に機能しないushA遺伝子及びap
hA遺伝子（以下、「破壊型ushA遺伝子」及び「破壊型ap
hA遺伝子」ということがある）で置換することによって
行うことができる。

【００３８】相同組換えは、染色体上の配列と相同性を
有する配列を持つプラスミド等が菌体内に導入される
と、ある頻度で相同性を有する配列の箇所で組換えを起
こし、導入されたプラスミド全体が染色体上に組み込ま
れる。この後さらに染色体上の相同性を有する配列の箇
所で組換えを起こすと、再びプラスミドが染色体上から
抜け落ちるが、この時組換えを起こす位置により破壊さ
れた遺伝子の方が染色体上に固定され、元の正常な遺伝
子がプラスミドと一緒に染色体上から抜け落ちることも
ある。このような菌株を選択することにより、破壊型us
hA遺伝子又は破壊型aphA遺伝子が、が染色体上の正常な
ushA遺伝子又はaphA遺伝子と置換された菌株を取得する
ことができる。

【００３９】このような相同組換えによる遺伝子破壊技
術は既に確立しており、直鎖ＤＮＡを用いる方法、温度
感受性プラスミドを用いる方法等が利用できる。また、
薬剤耐性等のマーカー遺伝子が内部に挿入されたushA遺
伝子又はaphA遺伝子を含み、かつ、目的とする微生物細
胞内で複製できないプラスミドを用いることによって
も、ushA遺伝子及びaphA遺伝子の破壊を行うことができ
る。すなわち、前記プラスミドで形質転換され、薬剤耐
性を獲得した形質転換体は、染色体ＤＮＡ中にマーカー
遺伝子が組み込まれている。このマーカー遺伝子は、そ
の両端のushA遺伝子又はaphA遺伝子配列と染色体上のこ
れらの遺伝子との相同組換えによって組み込まれる可能
性が高いため、効率よく遺伝子破壊株を選択することが
できる。

【００４０】遺伝子破壊に用いる破壊型ushA遺伝子及び
破壊型aphA遺伝子は、具体的には、制限酵素消化及び再
結合によるこれらの遺伝子の一定領域の欠失、これらの
遺伝子への他のＤＮＡ断片（マーカー遺伝子等）の挿
入、または部位特異的変異法（Kramer, W. and Frits,
H. J., Methods in Enzymology, 154, 350 (1987)）や
次亜硫酸ナトリウム、ヒドロキシルアミン等の化学薬剤
による処理（Shortle, D. and Nathans, D., Proc. Nat
l. Acad. Sci. U.S.A., 75, 270(1978)）によって、ush
A遺伝子又はaphA遺伝子のコーディング領域またはプロ
モーター領域等の塩基配列の中に１つまたは複数個の塩
基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を起こさせるこ
とにより、コードされるリプレッサーの活性を低下又は
消失させるか、又はushA遺伝子又はaphA遺伝子の転写を
低下または消失させることにより、取得することができ
る。これらの態様の中では、制限酵素消化及び再結合に
よりushA遺伝子又はaphA遺伝子の一定領域を欠失させる
方法、又はこれらの遺伝子へ他のＤＮＡ断片を挿入する
方法が、確実性及び安定性の点から好ましい。ushA遺伝
子及びaphA遺伝子の遺伝子破壊の順序は問わず、いずれ
を先に行ってもよい。

【００４１】ushA遺伝子及びaphA遺伝子は、いずれも配
列自体は公知であり、それらの配列に基づいて、PCR法
又はハイブリダイゼーション法等によって容易に取得す
ることができる。

【００４２】目的とする遺伝子が破壊されたことは、サ
ザンブロッティングやPCR法により、染色体上の遺伝子
を解析することによって、確認することができる。５’
−グアニル酸生産能は、上記のようにしてushA遺伝子及
びaphA遺伝子が破壊されたエシェリヒア属細菌におい
て、さらにGMPレダクターゼが正常に機能せず、かつ、
グアノシンキナーゼ活性が増強されるように改変するこ
とによって、増強することができる。GMPレダクターゼ
が正常に機能しないように改変するには、例えば、GMP
レダクターゼをコードする遺伝子（guaC）を、ushA遺伝
子及びaphA遺伝子と同様にして破壊することによって、
行うことができる。また、グアノシンキナーゼ活性を増
強するには、グアノシンキナーゼをコードする遺伝子
（gsk）を用いて、ＮＡＰタンパク質の発現量を上昇さ
せるのと同様の手法によって、行うことができる。

【００４３】５’−イノシン酸生産菌として具体的に
は、欧州特許公開１１７０３７０号に記載のIΔushAΔa
phA/pMWpurFKQ株が挙げられる。また、５’−グアニル
酸生産菌として具体的には、欧州特許公開１１７０３７
０号に記載のWΔushAΔaphA株から育種されたWΔushAΔ
aphAΔguaC/pKE1.8）（後記実施例参照）が挙げられ
る。

【００４４】本発明に用いる各種遺伝子の取得、ハイブ
リダイゼーション、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、
ＤＮＡの切断及び連結、形質転換等の方法は、Sambroo
k, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., Molecular Clo
ning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1.21 (1
989)に記載されている。

【００４５】＜２＞ヌクレオシド−５’−リン酸エステ
ルの製造法 上記の本発明のエシェリヒア属細菌を培地で培養し、該
培地中にヌクレオシド−５’−リン酸エステルを生成蓄
積せしめ、該培地から前記ヌクレオシド−５’−リン酸
エステルを採取することにより、ヌクレオシド−５’−
リン酸エステルを製造することができる。

【００４６】培地は、炭素源、窒素源、無機イオンおよ
び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地で
よい。炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラ
クトース、フラクトース、アラビノース、マルトース、
キシロース、トレハロース、リボースや澱粉の加水分解
物などの糖類、グリセロール、マンニトールやソルビト
ールなどのアルコール類、グルコン酸、フマール酸、ク
エン酸やコハク酸等の有機酸類を用いることができる。
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆
加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニ
ア水等を用いることができる。有機微量栄養素として
は、ビタミンB1等のビタミン類、アデニンやRNA等の核
酸類などの要求物質または酵母エキス等を適量含有させ
ることが望ましい。これらの他に、必要に応じて、リン
酸カルシウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガン
イオン等が少量添加される。

【００４７】培養は好気的条件下で１６〜７２時間程度
実施するのがよく、培養温度は３０℃〜４５℃に、培養
中pHは５〜８に制御する。なお、pH調整には無機あるい
は有機の酸性あるいはアルカリ性物質、さらにアンモニ
アガス等を使用することができる。

【００４８】発酵液からのヌクレオシド−５’−リン酸
エステルの採取は通常、イオン交換樹脂法、沈殿法その
他の公知の方法を組合せることにより実施できる。

【００４９】

【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。

【００５０】

【実施例１】エシェリヒア・コリの膜タンパク質をコー
ドする遺伝子のクローニング エシェリヒア・コリ（E. coli）K-12株のゲノムDNAの全
塩基配列は既に明らかにされている（Blattner F.R., P
lunkett G., Bloch C.A. et al., Science, 227, 1453-
1474 (1997); ftp://ftp.genetics.wisc.edu/pub/seque
nce/ecolim52.seq.gz）。エシェリヒア・コリのゲノム
において予想されている遺伝子の中から、機能未知かつ
膜タンパク質をコードすると予想される遺伝子ydhC、b1
903、b3002、b0709及びb2377を選出した。選出したydh
C、b1903、b3002、b0709及びb2377遺伝子について、報
告されている塩基配列に基づいてプライマーを合成し、
E. coli W3110株のゲノムDNAを鋳型として、それぞれの
遺伝子をPCR法により増幅した。ゲノムDNAの抽出は、QI
AGEN-Genomic-tip System（キアゲン社製）を用いた。P
CRは、Pyrobest DNA Polymerase（宝酒造社製）を用
い、添付説明書にしたがって行った。PCR用プライマー
には、BamHIサイトとSphIサイト（但し、b0709に対して
はBamHIサイトとPstIサイト）がそれぞれデザインされ
ており、これらのサイトをクローニングに利用した。

【００５１】（１）ydhC遺伝子のクローニング ydhC遺伝子は、以下のプライマー１及び２を用いて増幅
した。 プライマー1：gggggatccttttgaaaccagtcatcaaa（GenBan
kのaccession No. AE000261の塩基配列の塩基番号4531-
4550の5’末にgggおよびBamHIサイトを付加したもの：
配列番号１） プライマー2：ggggcatgcgttagcagcctaagtataag（GenBan
kのaccession No. AE000261の塩基配列の塩基番号5853-
5872に相補的な配列の5’末にgggおよびSphIサイトを付
加したもの：配列番号２）

【００５２】PCR後の増幅DNA断片（GenBankのaccession
No. AE000261の塩基配列の塩基番号4531-5872の5’末
にBamHIサイトを、3’末にSphIサイトを付加した配列）
は、QIAquick PCR Purification Kit（キアゲン社製）
にて精製した。精製したDNA断片を、BamHI及びSphI（宝
酒造社製）にて切断した後、MinElute Reaction Cleanu
p Kit（キアゲン社製）にて精製した。同様にBamHI及び
SphIで切断したpHSG398（宝酒造社製）と前記精製DNA断
片とを、DNA ligation Kit Ver.2（宝酒造社製）を用い
て連結した。

【００５３】上記連結反応液にて、JM109コンピテント
細胞（宝酒造社製）を形質転換し、IPTG（イソプロピル
−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）（和光純薬社製）
10μg/ml、X-Gal（５−ブロモ−４−クロロ−３−イン
ドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）（ナカライテスク社
製）40μg/ml及びクロラムフェニコール（シグマ社製）
30μg/mLを含むLB寒天プレート（LB＋IPTG＋X-gal＋ク
ロラムフェニコールプレート）に塗布した。37℃で一晩
培養後、生育した白色コロニーを30μg/mLのクロラムフ
ェニコールを含むLB培地で37℃にて試験管培養し、QIAp
rep Spin MiniprepKit Protocol（キアゲン社製）を用
いてプラスミド抽出を行った。抽出したプラスミドをBa
mHI及びSphIで切断し、目的長断片が得られるプラスミ
ドを選択し、pHSG#ydhCと名づけた。

【００５４】上記で得られたプラスミドの目的断片の配
列を、ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing
Ready Reaction KitおよびABI PRISM 310 sequencer
（アプライドバイオシステム社製）を用いて確認した。
この操作は、配列確認用プライマーとしてM13 Primer M
4、M13 Primer RV（宝酒造社製）及び下記の合成プライ
マー3、4を用いて、添付説明書にしたがって行い、報告
されている塩基配列と一致するDNA断片が挿入されてい
るプラスミドを選択した。

【００５５】プライマー3：cggcctgacaatttttgcgttaggt
agtc（GenBankのaccession No. AE000261の塩基配列の
塩基番号4854-4882：配列番号３） プライマー4：ggcccgtaacaatagtcaggatggtctgac（GenBa
nkのaccession No. AE000261の塩基配列の塩基番号5181
-5210：配列番号４）

【００５６】（２）b1903遺伝子のクローニング b1903遺伝子は、染色体の構造上、機能未知遺伝子yecI
とオペロンを形成していると考えられる。以下のプライ
マー5及び6を用い、b1903オペロンを増幅した。

【００５７】プライマー5：gggggatccttaagcattttcttat
accc（GenBankのaccession No. AE000283の塩基配列の
塩基番号9582-9601の5’末にgggおよびBamHIサイトを付
加した配列：配列番号５） プライマー6：ggggcatgctgtgaagtcgctactataac（GenBan
kのaccession No. AE000283の塩基配列の塩基番号10615
-10634に相補的な配列の5’末にgggおよびSphIサイトを
付加した配列：配列番号６）

【００５８】精製した目的断片（GenBankのaccession N
o. AE000283の塩基配列9582-10634の5’末にBamHIサイ
トを、3’末にSphIサイトを付加した配列）をBamHI、Sp
hIで切断し、pHSG398に連結した。上記と同様にJM109を
形質転換し、pHSG#b1903と名づけたプラスミドを得た
後、M13 Primer M4、M13 Primer RV及び合成したプライ
マー7を用いてシークエンスの確認を行った。

【００５９】プライマー7：agtctgaacggcaccgccactttcc
ttcgc（GenBankのaccession No. AE000283の塩基配列の
塩基番号9854-9883の配列：配列番号７）

【００６０】（３）b3002遺伝子のクローニング b3002遺伝子は以下のプライマー8及び9を用いて増幅し
た。

【００６１】プライマー8：gggggatccaggaagatccctaaac
ctcaga（GenBankのaccession No. AE000382の塩基配列
の塩基番号11003-11024に相補的な配列の5’末にgggお
よびBamHIサイトを付加した配列：配列番号８） プライマー9：ggggcatgcgatcagtgattatgacgagt（GenBan
kのaccession No. AE000382の塩基配列の塩基番号10405
-10424の5’末にgggおよびSphIサイトを付加した配列：
配列番号９）

【００６２】精製した目的断片（GenBankのaccession N
o. AE000382の塩基配列10405-11024に相補的な配列の
5’末にBamHIサイトを、3’末にSphIサイトを付加した
配列）をBamHI、SphIで切断し、pHSG398に連結した。上
記と同様にJM109を形質転換し、pHSG#b3002と名づけた
プラスミドを得た後、M13 Primer M4及びM13 Primer RV
を用いてシークエンスの確認を行った。

【００６３】（４）b0709遺伝子のクローニング b0709遺伝子は以下のプライマー10及び11を用いて増幅
した。

【００６４】プライマー10：gggggatcccagttcgtcgatagc
caatc（GenBankのaccession No. AE000174の塩基配列の
塩基番号8623-8642に相補的な配列の5’末にgggおよびB
amHIサイトを付加した配列：配列番号１０） プライマー11：gggctgcagtgctggcctattaagactcc（GenBa
nkのaccession No. AE000174の塩基配列の塩基番号6934
-6953の5’末にgggおよびPstIサイトを付加した配列：
配列番号１１）

【００６５】精製した目的断片（GenBankのaccession N
o. AE000174の塩基配列6934-8642に相補的な配列の5’
末にBamHIサイトを、3’末にPstIサイトを付加した配
列）をBamHI、PstIで切断し、pSTV29（宝酒造社製）に
連結した。上記と同様にJM109を形質転換し、pSTV#b070
9と名づけたプラスミドを得た後、M13 Primer M4、M13
Primer RV、及びプライマー12、プライマー13を用いて
配列確認を行った。

【００６６】プライマー12：gttgatggcgatcggtcatgtggt
gctggg（GenBankのaccession No. AE000174の塩基配列
の塩基番号8145-8174に相補的な配列：配列番号１２） プライマー13：tttctcctgccgaactggggatggctgctg（GenB
ankのaccession No. AE000174の塩基配列の塩基番号777
5-7804に相補的な配列：配列番号１３）

【００６７】（５）b2377遺伝子のクローニング b2377遺伝子は以下のプライマー14及び15を用いて増幅
した。

【００６８】プライマー14：gggggatcctttttccgtacacaa
cagtcttgc（GenBankのaccession No.AE000326の塩基配
列の塩基番号1926-1949に相補的な配列の5’末にgggお
よびBamHIサイトを付加した配列：配列番号１４） プライマー15：ggggcatgcaaatgagccatcctgacccactacc
（GenBankのaccession No.AE000326の塩基配列の塩基番
号1550-1574の5’末にgggおよびSphIサイトを付加した
配列：配列番号１５）

【００６９】精製した目的断片（GenBankのaccession N
o. AE000326の塩基配列1550-1949に相補的な配列の5’
末にBamHIサイトを、3’末にSphIサイトを付加した配
列）をBamHI、SphIで切断し、pSTV29に連結した。上記
と同様にJM109を形質転換し、pSTV#b2377と名づけたプ
ラスミドを得た後、M13 Primer M4及びM13 Primer RV
（宝酒造社製）を用いてシークエンスの確認を行った。

【００７０】

【実施例２】IMP生産菌におけるydhC、b1903、b3002、b
0709、及びb2377遺伝子の増幅効果 ヌクレオシド−５’−リン酸エステル生産に対するydh
C、b1903、b3002、b0709、b2377遺伝子の増幅効果を確
認するために、IMP生産能を有するエシェリヒア・コリ
のIMP生産菌IΔushAΔaphA/pMWpurFKQ株（欧州特許公開
１１７０３７０号）を用いた。本菌株内において、ydh
C、b1903、b3002、b0709およびb2377遺伝子をプラスミ
ドを用いて多コピー化することにより、各々の遺伝子産
物の発現量を上昇させたときの菌体外ヌクレオシド−
５’−リン酸エステル濃度を測定することにより、これ
らの遺伝子がヌクレオシド−５’−リン酸エステル生産
に対して有用であるかを検証した。

【００７１】前記IΔushAΔaphA/pMWpurFKQ株の保持す
る変異型purF遺伝子が搭載されているプラスミドpMWpur
FKQに上記５遺伝子をそれぞれ搭載し、得られた組み換
えプラスミドを導入したIΔushAΔaphA株を培養し、IMP
蓄積量を測定した。

【００７２】（１）プラスミドの構築 pMWpurFKQ に搭載されている変異型purF遺伝子は、pMW2
18のマルチクローニングサイトのBamHI、HindIIIサイト
にクローニングされている。この変異型purF遺伝子をマ
ルチクローニングサイトの上流（EcoRIサイト、KpnIサ
イト）に再クローニングし、その下流（BamHIサイト、H
indIIIサイト）に目的遺伝子を搭載することで、目的遺
伝子のIMP蓄積への影響を検討することとした。

【００７３】クローニングされている変異型purF遺伝子
の塩基配列に基づいてプライマー16、17を合成し、pMWp
urFKQを鋳型として、変異型purF遺伝子をPCR法により増
幅した。PCRは、Pyrobest DNA Polymerase（宝酒造社
製）を用い、添付説明書にしたがって行った。PCR用プ
ライマーにはEcoRIサイトとKpnIサイトがそれぞれデザ
インされており、このサイトをクローニングに利用し
た。

【００７４】プライマー16：cccgaattcaacgaggaaaaagac
gtatg（配列番号１６） プライマー17：cccggtacctcatccttcgttatgcattt（配列
番号１７）

【００７５】PCR後の増幅DNA断片は、QIAquick PCR Pur
ification Kit（キアゲン社製）にて精製した。精製し
たDNA断片を、EcoRI及びKpnI（宝酒造社製）にて切断し
た後、MinElute Reaction Cleanup Kit（キアゲン社
製）にて精製した。同様にEcoRI及びKpnIで切断したpMW
218（日本ジーン社製）と前記精製DNA断片とを、DNA li
gation Kit Ver.2（宝酒造社製）を用いて連結した。こ
の連結反応液にて、JM109コンピテント細胞（宝酒造社
製）を形質転換し、IPTG（イソプロピル−β−Ｄ−チオ
ガラクトピラノシド）（和光純薬社製）10μg/ml、X-Ga
l（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ
−ガラクトシド）（ナカライテスク社製）40μg/ml及び
カナマイシン（シグマ社製）50μg/mLを含むLB寒天プレ
ート（LB＋IPTG＋X-gal＋カナマイシンプレート）に塗
布した。37℃で一晩培養後、生育した白色コロニーを50
μg/mLのカナマイシンを含むLB培地で37℃にて試験管培
養し、QIAprep Spin Miniprep Kit Protocol（キアゲン
社製）を用いてプラスミド抽出を行った。抽出したプラ
スミドをEcoRI及びKpnIで切断し、目的長断片が得られ
るプラスミドを選択し、pMWKQEKと名づけた。

【００７６】pHSG#ydhC、pHSG#b1903、pHSG#b3002、pST
V#b0709、pSTV#b2377をBamHI、HindIII（宝酒造社製）
で切断し、目的断片をゲルから切り出し、MinElute Gel
Extraction Kit（キアゲン社製）を用いて精製した。
これらの精製ＤＮＡ断片を、BamHI、HindIIIで切断しMi
nElute Reaction Cleanup Kit（キアゲン社製）を用い
て精製したpMWKQEKと連結し、それぞれpMWKQEK#ydhC、p
MWKQEK#b1903、pMWKQEK#b3002、pMWKQEK#b0709およびpM
WKQEK#b2377を得た。

【００７７】（２）IΔushAΔaphAの形質転換 pMWKQEK#ydhC、pMWKQEK#b1903、pMWKQEK#b3002、pMWKQE
K#b0709およびpMWKQEK#b2377を用いてIΔushAΔaphAを
形質転換し、IΔushAΔaphA/pMWKQEK#ydhC、IΔushAΔa
phA/pMWKQEK#b1903、IΔushAΔaphA/pMWKQEK#b3002、I
ΔushAΔaphA/pMWKQEK#b0709およびIΔushAΔaphA/pMWK
QEK#b2377を得た。方法はC. T. Chungらの方法（C. T.
Chung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 2172
-2175 (1989)）に従った。

【００７８】（３）培養評価 IΔushAΔaphA/pMWKQEKを対照とし、IΔushAΔaphA/pMW
KQEK#ydhC、IΔushAΔaphA/pMWKQEK#b1903、IΔushAΔa
phA/pMWKQEK#b3002、IΔushAΔaphA/pMWKQEK#b0709およ
びIΔushAΔaphA/pMWKQEK#b2377の培養評価を行い、IMP
蓄積量を比較した。以下に、そのための培地および培養
方法ならびに分析方法を示す。

【００７９】

【００８０】〔培養方法〕 リフレッシュ(refresh)培養；保存状態の菌を接種 LB寒天培地（必要に応じて薬剤添加）、37℃、24時間 種(seed)培養；リフレッシュ培養した菌をプレートの1/
8に塗布 LB寒天培地（必要に応じて薬剤添加）、37℃、一晩 主(main)培養；種培養菌体プレートの1/16を接種 MS培地（必要に応じて、薬剤添加）、37℃、20ml/500ml
容坂口フラスコ

【００８１】〔分析方法〕培養液500μlを経時的にサン
プリングし、15,000rpmで、5分間遠心し、その上清液を
蒸留水にて6倍希釈後、HPLC分析に供した。

【００８２】分析条件： カラム ： Asahipak GS-220 (7.6mmID×500mmL) 緩衝液 ： 0.2M NaH₂PO₄(pH3.98) リン酸にてpH調整 温度 ： 55℃ 流速 ： 1.5ml/min 検出 ： UV254nm

【００８３】結果を図１から図５に示す。ydhC増幅株お
よびb3002増幅株は、対照と同程度のIMP蓄積を示した。
一方、b0709増幅株においては若干のIMP蓄積量の増加が
認められたが、不安定であった。これに対し、b1903増
幅株およびb2377増幅株においては顕著にIMP蓄積の増加
が認められた。これら２遺伝子について更にGMP生産菌
における増幅効果を検証した。

【００８４】

【実施例３】GMP生産菌におけるb1903、及びb2377遺伝
子の増幅効果 （１）GMP生産検定用菌株の構築 GMP生産に対するエシェリヒア・コリW3110株由来b190
3、b2377遺伝子の増幅効果を確認するための菌株を構築
した。そのために、エシェリヒア・コリW3110由来のush
AおよびaphAの二重欠損株（WΔushAΔaphA）（欧州特許
公開１１７０３７０号）を用いた。この株から、GMPか
らIMPへの反応を触媒する酵素をコードするGMPレダクタ
ーゼ遺伝子（guaC）を欠損し、さらに、グアノシンから
GMPへの反応を触媒する酵素をコードするグアノシンキ
ナーゼ遺伝子（gsk）を増強した株を構築した。この株
を、グアノシンを添加して培養することにより菌体内の
GMP濃度を上昇させた状態におくことで、候補遺伝子の
ヌクレオシド−５’−リン酸エステル蓄積に対する効果
を確認できると考えられた。実施例２において、b1903
およびb2377の増幅によりIMP蓄積向上効果が認められた
ため、ここでは、これらの遺伝子のGMP蓄積への効果を
検討した。

【００８５】（２）guaC欠損株の作製 報告されているguaCの塩基配列に基づいてプライマーを
合成し、guaC遺伝子のN末およびC末断片をPCR法により
増幅した。ゲノムDNAの抽出は、QIAGEN-Genomic-tip Sy
stem（キアゲン社製）を用いた。PCRは、Pyrobest DNA
Polymerase（宝酒造社製）を用い、添付説明書にしたが
って行った。N末端断片増幅用PCR用プライマーにはプラ
イマー18、19を、C末端断片増幅用PCR用プライマーには
プライマー20、21を用いた。プライマー18にはHindIII
サイトが、プライマー21にはXbaIサイトがそれぞれデザ
インされている。

【００８６】プライマー18：cccaagcttctcttgccactgcca
atg（GenBankのaccession No. AE000119の塩基配列の塩
基番号7929-7946の配列の5’末にcccおよびHindIIIサイ
トを付加した配列：配列番号１８） プライマー19：atcaaaagaagccagcgc（GenBankのaccessi
on No. AE000119の塩基配列の塩基番号8392-8409に相補
的な配列：配列番号１９） プライマー20：gcgctggcttcttttgatccgatttcgtcatgcttg
（GenBankのaccession No. AE000119の塩基配列の8906-
8923の配列の5’末にGenBankのaccession No. AE000119
の塩基配列の塩基番号8392-8409の配列を付加した配
列：配列番号２０） プライマー21：gggtctagagctggcgtgttgctccac（GenBank
のaccession No. AE000119の塩基配列の塩基番号9259-9
276に相補的な配列に5’末にgggおよびXbaIサイトを付
加した配列：配列番号２１）

【００８７】PCR後の増幅DNA断片は、それぞれ、QIAqui
ck PCR Purification Kit（キアゲン社製）にて精製
し、精製したN末端DNA断片およびC末端DNA断片、プライ
マー18、21を用いて、クロスオーバーPCR法（A. J. Lin
k, D. Phillips, G. M. Church, Journal of Bacteriol
ogy, 179, 6228-6237 (1997)）により、欠損型guaC断片
を得た。精製したDNA断片を、HindIII及びXbaI（宝酒造
社製）にて切断した後、フェノール／クロロホルム処
理、及びエタノール沈殿を行った。同様にHindIII及びX
baIで切断した温度感受性プラスミドpMAN997（WO 99/03
988号国際公開パンフレット）と前記DNA断片とをDNA li
gation Kit Ver.2（宝酒造社製）を用いて連結した。こ
の連結反応液にて、JM109コンピテント細胞（宝酒造社
製）を形質転換し、アンピシリン（シグマ社製）を25μ
g/mL含むLB寒天プレート（LB＋アンピシリンプレート）
に塗布した。30℃で１日培養後、生育したコロニーを25
μg/mLのアンピシリンを含むLB培地で30℃にて試験管培
養し、自動プラスミド抽出機PI-50（クラボウ社製）を
用いてプラスミド抽出を行った。得られたプラスミドを
HindIII及びXbaIで切断し、アガロースゲル電気泳動を
行って、目的断片が挿入されているプラスミドをguaC破
壊用プラスミドpMAN#ΔguaCとした。尚、前記pMAN997
は、pMAN031(S．Matsuyama and S. Mizushima, J. Bact
eriol., 162, 1196 (1985))とpUC19（宝酒造社製）のそ
れぞれのVspI-HindIII断片を繋ぎ換えたものである。

【００８８】プラスミドpMAN#ΔguaCでWΔushAΔaphA株
をC. T. Chungらの方法により形質転換し、LB＋アンピ
シリンプレートで30℃でコロニーを選択した。選択した
クローンを30℃で一晩液体培養した後、培養液を10^-3希
釈してLB＋アンピシリンプレートにまき、42℃でコロニ
ーを選択した。選択したクローンをLB＋アンピシリンプ
レートに塗り広げて30℃で培養した後、プレートの1/8
の菌体をLB培地 2 mLに懸濁し、42℃で4〜5時間振とう
培養した。10^-5希釈した菌体をLBプレートにまき、得ら
れたコロニーのうち数百コロニーをLBプレートとLB＋ア
ンピシリンプレートに植菌し、生育を確認することで、
アンピシリン感受性株を選択した。アンピシリン感受性
株の数株についてコロニーPCRを行い、guaC遺伝子の欠
失を確認した。こうしてE. coli W3110ΔushAΔaphA由
来のguaC破壊株WΔushAΔaphAΔguaCを得た。

【００８９】（３）発現プラスミドの構築 WΔushAΔaphAΔguaCの菌体内ヌクレオシド−５’−リ
ン酸エステル濃度を上昇させるため、グアノシンからGM
Pへの反応を触媒する酵素遺伝子gskをプラスミドにより
増強させることとした。Brevibacterium acetylicum由
来のgsk遺伝子がクローン化されたプラスミドpKE1.8（U
suda et al., J. Bacteriol., 179, 6959-6964 (200
0)）によりWΔushAΔaphAΔguaCを形質転換し、WΔushA
ΔaphAΔguaC/pKE1.8を得た。pKE1.8は、pACYC184（A.
C. Y. Chang, and S. N. Cohen, J. Bacteriol., 134,
1141-1156 (1978)）由来の複製起点を持つプラスミドpS
TV28から構築されている。次にb1903およびb2377増幅用
プラスミドを構築し、WΔushAΔaphAΔguaC/pKE1.8をb1
903およびb2377増幅用プラスミドにより形質転換を行
い、GMP生産検定用菌株を得た。

【００９０】プラスミドpHSG#b1903およびpSTV#b2377を
BamHI、HindIII（宝酒造社製）で切断し、目的断片をゲ
ルから切り出し、MinElute Gel Extraction Kit（キア
ゲン社製）を用いて精製した。これらの精製DNA断片
を、BamHI、HindIIIで切断しMinElute Reaction Cleanu
p Kit（キアゲン社製）を用いて精製したpMW219と連結
し、pMW#b1903、pMW#b2377を得た。

【００９１】（４）形質転換 pKE1.8によりWΔushAΔaphAΔguaCを形質転換し、WΔus
hAΔaphAΔguaC/pKE1.8を得た。更に、WΔushAΔaphAΔ
guaC/pKE1.8を、pMW#b1903およびpMW#b2377により形質
転換し、WΔushAΔaphAΔguaC/pKE1.8/pMW#b1903および
WΔushAΔaphAΔguaC/pKE1.8/pMW#b2377を得た。形質転
換は、C. T. Chungらの方法に従った。

【００９２】（５）遺伝子増幅株の培養とGMP測定 WΔushAΔaphAΔguaC/pKE1.8/pMW219を対照として、WΔ
ushAΔaphAΔguaC/pKE1.8/pMW#b1903およびWΔushAΔap
hAΔguaC/pKE1.8/pMW#b2377のGMP蓄積量を検討するた
め、これらの株をグルコースを炭素源とするM9培地でフ
ラスコ培養し、GMP蓄積量を評価した。以下にそのため
の培地および培養方法ならびに分析方法を示す。

【００９３】

【００９４】〔培養方法〕 リフレッシュ(refresh)培養；保存状態の菌を接種 LB寒天培地（必要に応じて薬剤添加）、37℃、24時間 種(seed)試験管培養；リフレッシュ培養した菌を接種 M9液体培地（必要に応じて薬剤添加）、37℃、24時間 種(seed)坂口フラスコ培養；種試験管培養した菌を5％
接種 M9液体培地（必要に応じて薬剤添加）、37℃、24時間 20ml/500ml容坂口フラスコ 主(main)培養；種培養液体培地から10％接種 M9液体培地（必要に応じて薬剤添加）、37℃ 50ml/500ml容坂口フラスコ

【００９５】ODが0.5〜0.6付近に達した時点で培養液に
終濃度50 mg/Lとなるようグアノシンを加え培養を続
け、グアノシン添加後２時間培養した培養液を500 μl
サンプリングした。

【００９６】〔分析方法〕サンプリングした培養液500
μlを15,000rpmで、5分間遠心し、その上清液をHPLC分
析に供した。分析条件は実施例２記載の条件で行った。
結果を表１に示す。

【００９７】b1903増幅株のGMP蓄積量は対照株よりやや
劣るが、b2377増幅株では対照株の約1.3倍のGMP蓄積が
認められた。したがって、b2377遺伝子はヌクレオシド
−５’−リン酸エステル蓄積向上に有用であることが示
された。

【００９８】

【表１】 表１：b1903およびb2377増幅株によるGMP蓄積 ──────────────────────────────── 菌 株 GMP蓄積 (mg/L) ──────────────────────────────── WΔushAΔaphAΔguaC/pKE1.8/pMW219 5.03 WΔushAΔaphAΔguaC/pKE1.8/pMW#b1903 4.38 WΔushAΔaphAΔguaC/pKE1.8/pMW#b2377 6.59 ────────────────────────────────

【００９９】この株はGMP蓄積も安定して上昇してお
り、また、前記のIΔushAΔaphA/pMWKQEKを用いたb2377
増幅株においてもIMP蓄積が上昇することから、このb23
77遺伝子が5’-リン酸ヌクレオシド蓄積に関与する因子
であり、この遺伝子の増幅がIMP及び GMPいずれの5’-
リン酸ヌクレオシドの製造に対しても有用であることが
示された。b2377遺伝子のタンパク質をコードする領域
とそのアミノ酸配列は配列番号２２に示されている。ま
た、同アミノ酸配列のみを、配列番号２３に示す。

【０１００】

【発明の効果】本発明により、エシェリヒア属細菌を用
いて、ＩＭＰ及びＧＭＰ等のヌクレオシド−５’−リン
酸エステルを直接発酵により製造することができる。

【０１０１】

【配列表】

SEQUENCE LISTING <110> 味の素株式会社（Ajinomoto Co., Inc.） <120> 発酵法によるヌクレオシド−５’−リン酸エステ
ルの製造法 <130> P-9702 <140> <141> 2002-05-10 <160> 23 <170> PatentIn Ver. 2.0

【０１０２】<210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer f
or amplifying Escherichia coli ydhC gene <400> 1 gggggatcct tttgaaacca gtcatcaaa 29

【０１０３】<210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer f
or amplifying Escherichia coli ydhC gene <400> 2 ggggcatgcg ttagcagcct aagtataag 29

【０１０４】<210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer f
or sequencing of Escherichia coli ydhC gene <400> 3 cggcctgaca atttttgcgt taggtagtc 29

【０１０５】<210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer f
or sequencing of Escherichia coli ydhC gene <400> 4 ggcccgtaac aatagtcagg atggtctgac 30

【０１０６】<210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer f
or amplifying Escherichia coli b1903 gene <400> 5 gggggatcct taagcatttt cttataccc 29

【０１０７】<210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer f
or amplifying Escherichia coli b1903 gene <400> 6 ggggcatgct gtgaagtcgc tactataac 29

【０１０８】<210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer f
or sequencing of Escherichia coli b1903 gene <400> 7 agtctgaacg gcaccgccac tttccttcgc 30

【０１０９】<210> 8 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer f
or amplifying Escherichia coli b3002 gene <400> 8 gggggatcca ggaagatccc taaacctcaga 31

【０１１０】<210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer f
or amplifying Escherichia coli b3002 gene <400> 9 ggggcatgcg atcagtgatt atgacgagt 29

【０１１１】<210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer f
or amplifying Escherichia coli b0709 gene <400> 10 gggggatccc agttcgtcga tagccaatc 29

【０１１２】<210> 11 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer f
or amplifying Escherichia coli b0709 gene <400> 11 gggctgcagt gctggcctat taagactcc 29

【０１１３】<210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence

【０１１４】<220> <223> Description of Artificial Sequence: primer f
or sequencing of Escherichia coli b0709 gene <400> 12 gttgatggcg atcggtcatg tggtgctggg 30

【０１１５】<210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer f
or sequencing of Escherichia coli b0709 gene <400> 13 tttctcctgc cgaactgggg atggctgctg 30

【０１１６】<210> 14 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer f
or amplifying Escherichia coli b2377 gene <400> 14 gggggatcct ttttccgtac acaacagtct tgc 33

【０１１７】<210> 15 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer f
or amplifying Escherichia coli b2377 gene <400> 15 ggggcatgca aatgagccat cctgacccac tacc 34

【０１１８】<210> 16 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer f
or amplifying Escherichia coli purF gene <400> 16 cccgaattca acgaggaaaa agacgtatg 29

【０１１９】<210> 17 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer f
or amplifying Escherichia coli purF gene <400> 17 cccggtacct catccttcgt tatgcattt 29

【０１２０】<210> 18 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer f
or amplifying Escherichia coli guaC gene <400> 18 cccaagcttc tcttgccact gccaatg 27

【０１２１】<210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer f
or amplifying Escherichia coli guaC gene <400> 19 atcaaaagaa gccagcgc 18

【０１２２】<210> 20 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer f
or amplifying Escherichia coli guaC gene <400> 20 gcgctggctt cttttgatcc gatttcgtca tgcttg 36

【０１２３】<210> 21 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer f
or amplifying Escherichia coli guaC gene <400> 21 gggtctagag ctggcgtgtt gctccac 27

【０１２４】 <210> 22 <211> 243 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (1)..(243) <400> 22 atg att aat tta tgg atg ttt ctc gcc ctg tgt att gtc tgc gta agc 48 Met Ile Asn Leu Trp Met Phe Leu Ala Leu Cys Ile Val Cys Val Ser 1 5 10 15 ggc tac atc ggt cag gta ctg aac gtg gta tcg gcg gtc tct tct ttc 96 Gly Tyr Ile Gly Gln Val Leu Asn Val Val Ser Ala Val Ser Ser Phe 20 25 30 ttc ggc atg gtg atc ctc gct gca ctc att tat tac ttc acc atg tgg 144 Phe Gly Met Val Ile Leu Ala Ala Leu Ile Tyr Tyr Phe Thr Met Trp 35 40 45 tta act ggc ggt aat gaa cta gtg acg ggg ata ttt atg ttt ctt gcc 192 Leu Thr Gly Gly Asn Glu Leu Val Thr Gly Ile Phe Met Phe Leu Ala 50 55 60 ccg gct tgt ggc ttg atg att cgc ttt atg gtg ggg tat ggc agg cgg 240 Pro Ala Cys Gly Leu Met Ile Arg Phe Met Val Gly Tyr Gly Arg Arg 65 70 75 80 tag 243

【０１２５】 <210> 23 <211> 80 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 23 Met Ile Asn Leu Trp Met Phe Leu Ala Leu Cys Ile Val Cys Val Ser 1 5 10 15 Gly Tyr Ile Gly Gln Val Leu Asn Val Val Ser Ala Val Ser Ser Phe 20 25 30 Phe Gly Met Val Ile Leu Ala Ala Leu Ile Tyr Tyr Phe Thr Met Trp 35 40 45 Leu Thr Gly Gly Asn Glu Leu Val Thr Gly Ile Phe Met Phe Leu Ala 50 55 60 Pro Ala Cys Gly Leu Met Ile Arg Phe Met Val Gly Tyr Gly Arg Arg 65 70 75 80

【図面の簡単な説明】

【図１】 IΔushAΔaphA/pMWKQEK#ydhCのIMP蓄積パタ
ーンを示す図。

【図２】 IΔushAΔaphA/pMWKQEK#b1903のIMP蓄積パタ
ーンを示す図。

【図３】 IΔushAΔaphA/pMWKQEK#b3002のIMP蓄積パタ
ーンを示す図。

【図４】 IΔushAΔaphA/pMWKQEK#b0709のIMP蓄積パタ
ーンを示す図。

【図５】 IΔushAΔaphA/pMWKQEK#b2377のIMP蓄積パタ
ーンを示す図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 杉本 愼一 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素 株式会社発酵技術研究所内 (72)発明者 松井 和彦 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素 株式会社ライフサイエンス研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA05 BA07 BA80 CA04 DA06 EA04 GA11 HA12 4B064 AF33 CA02 CA19 CC24 DA01 DA10 4B065 AA26X AA26Y AB01 AC14 CA23 CA41 CA44

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヌクレオシド−５’−リン酸エステルの
   生産能を有し、かつ、下記（Ａ）又は（Ｂ）に記載のタ
   ンパク質の発現量が上昇するように改変されたエシェリ
   ヒア属細菌。 （Ａ）配列番号２３に示すアミノ酸配列を有するタンパ
   ク質。 （Ｂ）配列番号２３に示すアミノ酸配列において、１若
   しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加
   を含むアミノ酸配列を有し、かつ、エシェリヒア属細菌
   において発現量を上昇させたときにヌクレオシド−５’
   −リン酸エステルの生産能を向上させる活性を有するタ
   ンパク質。
2. 【請求項２】 前記タンパク質の発現量の増強は、同タ
   ンパク質をコードする遺伝子のコピー数を高めること、
   又は前記細菌細胞内の前記タンパク質をコードする遺伝
   子の発現が増強されるように同遺伝子の発現調節配列を
   改変することによるものである請求項１記載の細菌。
3. 【請求項３】 前記タンパク質は、配列番号２３に示す
   アミノ酸配列において、２以上、かつ、１０以下のアミ
   ノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配
   列を有する請求項１又は２に記載の細菌。
4. 【請求項４】 前記タンパク質は、配列番号２３に示す
   アミノ酸配列と９０％以上の相同性を有する請求項１又
   は２に記載の細菌。
5. 【請求項５】 前記タンパク質は、下記（ａ）又は
   （ｂ）に示すＤＮＡによりコードされる請求項１〜４の
   いずれか一項に記載の細菌。 （ａ）配列番号２２に記載の塩基配列を含むＤＮＡ。 （ｂ）配列番号２２に記載の塩基配列又は同塩基配列か
   ら調製され得るプローブとストリンジェントな条件下で
   ハイブリダイズし、かつ、エシェリヒア属細菌において
   発現量を上昇させたときにヌクレオシド−５’−リン酸
   エステルの生産能を向上させる活性を有するタンパク
   質。
6. 【請求項６】 前記ヌクレオシド−５’−リン酸エステ
   ルが５’−イノシン酸又は５’−グアニル酸である請求
   項１〜５のいずれか一項に記載の細菌。
7. 【請求項７】 前記ＤＮＡが、低コピー数ベクターを用
   いて細胞に導入された請求項５記載の細菌。
8. 【請求項８】 ｕｓｈＡ遺伝子及びａｐｈＡ遺伝子が正
   常に機能しないように改変されたことを特徴とする請求
   項１〜７のいずれか一項に記載の細菌。
9. 【請求項９】 ５’−イノシン酸生産能を有し、５’−
   アデニル酸及び５’−グアニル酸によるフィードバック
   阻害が解除されたＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼを
   保持するように改変された請求項１〜８のいずれか一項
   に記載の細菌。
10. 【請求項１０】 ５’−グアニル酸生産能を有し、ＧＭ
    Ｐレダクターゼが正常に機能せず、かつ、グアノシンキ
    ナーゼ活性が増強されるように改変された請求項１〜８
    のいずれか一項に記載の細菌。
11. 【請求項１１】 請求項１〜１０のいずれか一項に記載
    の細菌を培地で培養し、該培地中にヌクレオシド−５’
    −リン酸エステルを生成蓄積せしめ、該培地から前記ヌ
    クレオシド−５’−リン酸エステルを採取することを特
    徴とするヌクレオシド−５’−リン酸エステルの製造
    法。