WO2009107631A1

WO2009107631A1 - ５’－グアニル酸の製造法

Info

Publication number: WO2009107631A1
Application number: PCT/JP2009/053358
Authority: WO
Inventors: 貴之浅原; 寛朗深田; 潔松野
Original assignee: 味の素株式会社
Priority date: 2008-02-25
Filing date: 2009-02-25
Publication date: 2009-09-03
Also published as: EP2264144A4; KR101599977B1; BRPI0907542A2; EP2264144A1; US20110045543A1; US8309329B2; CN101960005B; JP5440489B2; CN101960005A; JPWO2009107631A1; KR20100127784A

Abstract

　イノシン酸（ＩＭＰ）脱水素酵素および５’－グアニル酸（ＧＭＰ）合成酵素の活性が増大するように改変された細菌にＩＭＰを反応させてＧＭＰを得る。

Description

５’－グアニル酸の製造法

本発明は５’－グアニル酸の製造法、及びその製造に用いられる新規微生物に関する。５’－グアニル酸は、調味料、医薬及びそれらの原料として有用である。

５’－グアニル酸（グアノシン－５’－モノリン酸、以下「ＧＭＰ」ともいう）の工業的な製法としては、グアノシンを発酵法により製造し、得られたグアノシンを酵素的にリン酸化して５’－グアニル酸を得る方法が知られている（特許文献１～４）。

また、ＧＭＰ合成酵素活性を増大させたエシェリヒア属に属する微生物と、グルコースを代謝して、５’－キサンチル酸（ＸＭＰ）からＧＭＰを合成する反応に必要なアデノシン－三リン酸（ＡＴＰ）を生合成する（以下、「ＡＴＰを再生する」ともいう）活性が高いブレビバクテリウム・アンモニアゲネスとを、ＸＭＰとアンモニアまたはグルタミンを含む培地で培養し、ＸＭＰを高効率にＧＭＰに変換して培養液中にＧＭＰを生成蓄積せしめる製造法も知られていた（非特許文献１）。

一方、ＧＭＰを発酵法により製造する方法が提案されている。例えば、特許文献５には、アデニン要求性を有し、さらにデコイニンまたはメチオニンスルフォキシドに耐性を示し、かつＧＭＰ生産能を有するバチルス属の変異株を培養し、培地中に生成蓄積したＧＭＰを採取することを特徴とするＧＭＰの製造法が開示されている。また特許文献６では、イノシン酸（イノシン酸－5’－モノリン酸、以下「ＩＭＰ」ともいう）生産能を有するエシェリヒア属細菌の２種類の５’－ヌクレオチダーゼ遺伝子を欠失させ、更にＩＭＰ脱水素酵素およびＧＭＰ合成酵素遺伝子を増強した株を培養し、培地中に生成蓄積したＧＭＰを採取することを特徴とするＧＭＰの製造法が開示されている。しかし、一般的にＧＭＰの直接発酵は収率が十分ではなく、前述の酵素法に比較して必ずしも実用的ではない。

これまでに、ＩＭＰ脱水素酵素およびＧＭＰ合成酵素の活性を高めたエシェリヒア属の細菌を利用して、ＩＭＰを原料としてＧＭＰを生産した例は報告されていない。
特開平０７－２３１７９３号公報特開平１０－２０１４８１号公報国際公開第９６／３７６０３号パンフレット特開２００１－２４５６７６号公報特公昭５６－１２４３８号公報特開２００２－３５５０８７号公報ＴａｔｓｕｒｏＦｕｊｉｏら、Ｂｉｏｓｃｉ. Ｂｉｏｔｅｃｈ. Ｂｉｏｃｈｅｍ., １９９７年, 第６１巻, ５号, ８４０－８４５頁

本発明は、微生物を用いてＩＭＰからＧＭＰを製造する方法を提供すること、および該方法に使用できるＩＭＰを高効率にＧＭＰに変換することが可能な新規微生物を創製することを課題とする。

本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ＩＭＰ脱水素酵素、およびＧＭＰ合成酵素の活性が増大するように改変されたエシェリヒア属の微生物を利用することにより、ＩＭＰが高効率、高速度でＧＭＰに変換されることを見出し、さらに、ＩＭＰを高効率にＧＭＰに変換することが可能な新規微生物を創製することにも成功し、本発明を完成するに至った。

　本発明の一態様は、イノシン酸脱水素酵素および５’－グアニル酸合成酵素の活性が増大するように改変された、イノシン酸を５’－グアニル酸に変換する能力を有する微生物に、イノシン酸を作用させて５’－グアニル酸を生成させ、これを採取することを特徴とする５’－グアニル酸の製造方法を提供することである。
　本発明の他の態様は、前記微生物が、ｇｕａＢ遺伝子およびｇｕａＡ遺伝子の発現を増加させることによってイノシン酸脱水素酵素および５’－グアニル酸合成酵素の活性を増大するように改変された微生物である、前記方法を提供することである。
　本発明の他の態様は、ｇｕａＡ遺伝子が下記（Ａ）または（Ｂ）のタンパク質をコードする、前記方法を提供することである。
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、５’－グアニル酸合成酵素活性を有するタンパク質。
　本発明の他の態様は、ｇｕａＢ遺伝子が下記（Ｃ）または（Ｄ）のタンパク質をコードする、前記方法を提供することである。
（Ｃ）配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｄ）配列番号１０に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、イノシン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質。
　本発明の他の態様は、前記微生物が、さらに、ｕｓｈＡ遺伝子およびａｐｈＡ遺伝子から選ばれる１種又はそれ以上の遺伝子が正常に機能しないように改変された微生物である、前記方法を提供することである。
　本発明の他の態様は、前記微生物が、さらに、ｐｕｒＲ遺伝子、ａｄｄ遺伝子およびｐｕｒＡ遺伝子から選ばれる１種又はそれ以上の遺伝子が正常に機能しないように改変された微生物である、前記方法を提供することである。
　本発明の他の態様は、前記微生物が、さらに、ｎａｇＤ遺伝子が正常に機能しないように改変された微生物である、前記方法を提供することである。
　本発明の他の態様は、前記微生物が、腸内細菌科に属する細菌、バチルス属細菌、またはコリネ型細菌である、前記方法を提供することである。
　本発明の他の態様は、前記微生物がエシェリヒア属細菌である、前記方法を提供することである。
　本発明の他の態様は、前記微生物がエシェリヒア・コリである、前記方法を提供することである。
　本発明の他の態様は、ｇｕａＢ遺伝子およびｇｕａＡ遺伝子の発現を増加させることによってイノシン酸脱水素酵素および５’－グアニル酸合成酵素の活性が増大するように改変され、さらにｕｓｈＡ遺伝子、ａｐｈＡ遺伝子およびｎａｇＤ遺伝子が正常に機能しないように改変された、イノシン酸を５’－グアニル酸に変換する能力を有する微生物を提供することである。
　本発明の他の態様は、さらに、ｐｕｒＲ遺伝子、ａｄｄ遺伝子およびｐｕｒＡ遺伝子から選ばれる１種又はそれ以上の遺伝子が正常に機能しないように改変された、前記微生物を提供することである。
　本発明の他の態様は、腸内細菌科に属する細菌、バチルス属細菌、またはコリネ型細菌である、前記微生物を提供することである。
　本発明の他の態様は、エシェリヒア属細菌である、前記微生物を提供することである。
　本発明の他の態様は、エシェリヒア・コリである、前記微生物を提供することである。

JM109ΔushAΔaphAΔpurR/ pUC18-guaBA株をＩＭＰと反応させたときの、ＩＭＰ、ＸＭＰおよびＧＭＰの濃度変化を示すグラフ。 JM109ΔushAΔaphAΔpurR/ pUC18-guaBA株、およびJM109ΔushAΔaphAΔpurRΔnagD/ pUC18-guaBA株をＩＭＰと反応させたときの、ＩＭＰ（Ａ）およびＧＭＰ（Ｂ）の濃度変化を示すグラフ。（Ａ）JM109ΔushAΔaphAΔpurRΔnagD/ pUC18-guaBA株をＩＭＰと反応させたときの、ＩＭＰおよびＧＭＰの濃度変化を示すグラフ。（Ｂ）JM109ΔushAΔaphAΔpurRΔnagD/ pUC18-guaBA株をＸＭＰと反応させたときの、ＸＭＰおよびＧＭＰの濃度変化を示すグラフ。（Ｃ）JM109ΔushAΔaphAΔpurRΔnagD/ pUC18-guaBA株をＩＭＰまたはＸＭＰと反応させたときのＧＭＰの蓄積量を示すグラフ。（Ａ）MG1655ΔushAΔaphAΔpurAΔpurRΔadd/pUC18-guaBA株をＩＭＰと反応させたときの、ＩＭＰ、ＸＭＰおよびＧＭＰの濃度変化を示すグラフ。（Ｂ）MG1655ΔushAΔaphAΔpurAΔpurRΔadd/pUC18-guaBA株をＩＭＰまたはＸＭＰと反応させたときのＧＭＰの蓄積量を示すグラフ。

以下、本発明を詳細に説明する。

＜Ｉ＞本発明の方法において使用される微生物
本発明の方法において使用される微生物は、ＩＭＰ脱水素酵素活性及びＧＭＰ合成酵素活性が増大するように改変され、ＩＭＰをＧＭＰに変換する能力を有する微生物である。

微生物としては、腸内細菌科に属する細菌、コリネ型細菌（Coryneform bacterium）、バチルス（Bacillus）属細菌などが挙げられる。
腸内細菌科に属する細菌としては、エシェリヒア（Escherichia）属細菌、パントエア（Pantoea）属細菌、エンテロバクター（Enterobacter）属細菌、クレブシエラ（Klebsiella）属細菌、セラチア（Serratia）属細菌、エルビニア（Erwinia）属細菌、サルモネラ（Salmonella）属細菌、モルガネラ（Morganella）属細菌などが挙げられる。エシェリヒア属細菌としては、エシェリヒア・コリ等、エシェリヒア属に属する細菌であれば特に制限されないが、具体的にはＮｅｉｄｈａｒｄｔらの著書（Neidhardt, FR. C. et al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D. C., 1208, table 1）に挙げられるものが利用できる。また、エンテロバクター属細菌としては、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)等、パントエア属細菌としてはパントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）等が挙げられる。

  コリネ型細菌としては、微生物分野の当業者に既知の分類によりコリネ型細菌として分類される細菌、今までブレビバクテリウム属に分類されていたが、現在はコリネバクテリウム属に再分類されている細菌（Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1991)）、およびコリネバクテリウム属に近い類縁菌であるブレビバクテリウム属に属する細菌などが挙げられる。このようなコリネ型細菌の例を以下に列挙する。
    コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム
    コリネバクテリウム・アセトグルタミカム
    コリネバクテリウム・アルカノリティカム
    コリネバクテリウム・カルナエ
    コリネバクテリウム・グルタミカム
    コリネバクテリウム・リリウム
    コリネバクテリウム・メラセコーラ
    コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス
    コリネバクテリウム・ハーキュリス
    ブレビバクテリウム・ディバリカタム
    ブレビバクテリウム・フラバム
    ブレビバクテリウム・インマリオフィラム
    ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
    ブレビバクテリウム・ロゼウム
    ブレビバクテリウム・サッカロリティカム
    ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
    コリネバクテリウム・アンモニアゲネス
    ブレビバクテリウム・アルバム
    ブレビバクテリウム・セリヌム
    ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム

バチルス属細菌としては、微生物分野の当業者に既知の分類によりバチルス属として分類される細菌が使用でき、具体的には、バチルス・ズブチリス、バチルス・アミロリクファシエンス等が挙げられるが、これらに限定されない。

上記のような微生物において、ＩＭＰ脱水素酵素（guaB遺伝子産物）およびＧＭＰ合成酵素（guaA遺伝子産物）の活性を増大させる方法について説明する。
本発明において、「ＩＭＰ脱水素酵素およびＧＭＰ合成酵素の活性が増大するように改変された」とは、エシェリヒア属細菌などの微生物の非改変株、例えば野生株よりも、ＩＭＰ脱水素酵素およびＧＭＰ合成酵素の活性が高いことを意味する。

ＩＭＰ脱水素酵素は、下記反応を触媒する酵素であり、「ＩＭＰ脱水素酵素活性」とはIMPからXMPを生成する反応を触媒する活性をいう。ＩＭＰ脱水素酵素活性は、例えば、Gilbertの方法で測定出来る（Gilbert, H．J．， Lowe, C．R． and Drabble，W．T．， Biochem J.， 1979， Dec 1，183(3)，481-94）。

NAD+ + IMP + H₂O → NADH H+ + XMP

また、ＧＭＰ合成酵素とは、下記反応を触媒する酵素（EC 6.3.4.1）であり、「ＧＭＰ合成酵素の酵素活性」とは、XMPからGMPを生成する反応を触媒する活性を意味する。

ATP + XMP + NH₃ → AMP + ピロリン酸 + GMP

ＧＭＰ合成酵素活性は、例えば、Spectorの方法（Spector, T．， Methods Enzymol., 1978，51，p219）により、ＮＡＤＨの減少速度を調べることで、測定することができる。

ＩＭＰ脱水素酵素およびＧＭＰ合成酵素の活性を増大させるためには、これらの酵素を各々コードするguaB遺伝子、およびguaA遺伝子の発現量を上昇させることが好ましい。発現量を上昇させる方法としては、ＩＭＰ脱水素酵素をコードするＤＮＡおよびＧＭＰ合成酵素をコードするＤＮＡの、細菌の細胞内のコピー数を上昇させる方法が挙げられる。細胞内のコピー数を上昇させるには、ＩＭＰ脱水素酵素およびＧＭＰ合成酵素を各々コードするＤＮＡ断片を、エシェリヒア属細菌などの微生物で機能するベクターと連結して組換えＤＮＡを作製し、これを宿主に導入して形質転換すればよい。guaB遺伝子とguaA遺伝子は、同時にコピー数を高めてもよいし、各々独立にコピー数を高めてもよい。エシェリヒア・コリの場合、ｇｕａＢ遺伝子とｇｕａＡ遺伝子はオペロン（ＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｍ１０１０１）を形成しており、ｇｕａＢＡオペロンをベクターに連結して組換えＤＮＡを作製し、これを宿主に導入して形質転換してもよい。形質転換株の細胞内の、ＩＭＰ脱水素酵素およびＧＭＰ合成酵素をコードする遺伝子（ｇｕａＢ遺伝子及びｇｕａＡ遺伝子）のコピー数が上昇する結果、ＩＭＰ脱水素酵素およびＧＭＰ合成酵素の活性が増大する。

細胞内のコピー数の上昇は、ＩＭＰ脱水素酵素遺伝子およびＧＭＰ合成酵素遺伝子を上記宿主の染色体ＤＮＡ上に多コピー存在させることによっても達成できる。エシェリヒア属細菌に属する細菌の染色体ＤＮＡ上に、ＩＭＰ脱水素酵素遺伝子およびＧＭＰ合成酵素遺伝子を多コピーで導入するには、染色体上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行うことができる。染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列としては、レペティティブＤＮＡ、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートなどが利用できる。あるいは、特開平２－１０９９８５号公報に開示されているように、目的遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体ＤＮＡ上に多コピー導入することでも可能である。いずれの方法によっても形質転換株内のＩＭＰ脱水素酵素遺伝子およびＧＭＰ合成酵素遺伝子のコピー数が上昇する結果、ＩＭＰ脱水素酵素およびＧＭＰ合成酵素の活性が増大する。

上記遺伝子を導入するためのベクターとしては、ｐＳＴＶ２９、ｐＭＷ２１８、ｐＵＣ１９等のプラスミドベクター、λ１０５９、λＢＦ１０１，Ｍ１３ｍｐ９等のファージベクターが挙げられる。またトランスポゾンとしては、Ｍｕ，Ｔｎ１０、Ｔｎ５が挙げられる。

ＩＭＰ脱水素酵素およびＧＭＰ合成酵素をコードするＤＮＡは、その塩基配列が公知であるので、その配列に基づいてプライマーを合成し、エシェリヒア属細菌などの微生物の染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ法により増幅を行うことによって取得することが出来る。例えば、エシェリヒア・コリのｇｕａＡ遺伝子としては配列番号１の塩基配列を有するものが挙げられ、エシェリヒア・コリのｇｕａＢ遺伝子としては配列番号９の塩基配列を有するものが挙げられる。これらの遺伝子は、同塩基配列に基づいてプローブを調製し、エシェリヒア属細菌の染色体ＤＮＡライブラリーからハイブリダイゼーションにより目的のＤＮＡ断片を選択することも出来る。あるいはＩＭＰ脱水素酵素およびＧＭＰ合成酵素をコードするＤＮＡ断片を、既知の塩基配列に基づいて化学的に合成してもよい。なお、エシェリヒア・コリのｇｕａＢＡオペロンは、配列番号３１と３２のプライマーを用いてクローニングすることができる。

  また、エシェリヒア属細菌以外の微生物からも、上記塩基配列に基づいて、ＩＭＰ脱水素酵素およびＧＭＰ合成酵素と同等の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を取得し得る。
  Bacillus subtilis のＧＭＰ合成酵素遺伝子（ｇｕａＡ）としては、配列番号３の塩基配列を有するものが挙げられる。この塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を配列番号４に示す。  Corynebacterium glutamicum のＧＭＰ合成酵素遺伝子（ｇｕａＡ）としては配列番号５の塩基配列を有するものが挙げられる。この塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を配列番号６に示す。
  Corynebacterium ammoniagenes のＧＭＰ合成酵素遺伝子（ｇｕａＡ）としては配列番号７の塩基配列を有するものが挙げられる。この塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を配列番号８に示す。
  Bacillus subtilis のＩＭＰ脱水素酵素遺伝子（ｇｕａＢ）としては、配列番号１１の塩基配列を有するものが挙げられる。この塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を配列番号１０に示す。
  Corynebacterium glutamicum のＩＭＰ脱水素酵素遺伝子（ｇｕａＢ）としては、配列番号１３の塩基配列を有するものが挙げられる。この塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を配列番号１４に示す。
  Corynebacterium ammoniagenes のＩＭＰ脱水素酵素遺伝子（ｇｕａＢ）としては、配列番号１５の塩基配列を有するものが挙げられる。この塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を配列番号１６に示す。  上記のように、微生物が属する属、種又は菌株によって、ｇｕａＡ遺伝子及びｇｕａＢ遺伝子の塩基配列に差異が存在することがあるため、ｇｕａＡ遺伝子及びｇｕａＢ遺伝子は、上記遺伝子のバリアントであってもよい。

ｇｕａＡ遺伝子によってコードされるタンパク質は、ＧＭＰ合成酵素活性を有する限り、配列番号２のアミノ酸配列全体に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するものであってもよい。また、ｇｕａＢ遺伝子によってコードされるタンパク質は、ＩＭＰ脱水素酵素活性を有する限り、配列番号１０のアミノ酸配列全体に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するものであってもよい。アミノ酸配列および塩基配列の同一性は、例えばKarlin および AltschulによるアルゴリズムBLAST(Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993))やPearsonによるFASTA(MethodsEnzymol., 183, 63 (1990))を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている (http://www.ncbi.nlm.nih.gov参照)。

また、本発明に用いるｇｕａＡ遺伝子およびｇｕａＢ遺伝子は、野生型遺伝子には限られず、コードされるタンパク質の機能、すなわち、ＧＭＰ合成酵素活性またはＩＭＰ脱水素酵素活性が損なわれない限り、配列番号２または１０のアミノ酸配列において、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含む配列を有するタンパク質をコードする、変異体又は人為的な改変体であってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には２～２０個、好ましくは２～１０個、より好ましくは２～５個を意味する。上記置換は保存的置換が好ましく、保存的変異とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換としては、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、ｇｕａＡ遺伝子、又はｇｕａＢ遺伝子を保持する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。

また、ｇｕａＡ遺伝子およびｇｕａＢ遺伝子は、それぞれ、配列番号１または９の塩基配列に相補的な塩基配列又は該配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、ＧＭＰ合成酵素活性またはＩＭＰ脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、同一性が高いＤＮＡ同士、例えば８０％、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより同一性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳさらに好ましくは、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度、温度で、１回より好ましくは２～３回洗浄する条件が挙げられる。

上記の遺伝子のバリアントに関する記載は、後述のｕｓｈＡ遺伝子、ａｐｈＡ遺伝子、ｐｕｒＲ遺伝子、ａｄｄ遺伝子、ｐｕｒＡ遺伝子、及びその他の遺伝子にも同様に適用される。

微生物へのＤＮＡの導入は、Ｃ．Ｔ．ｃｈｕｎｇの方法（Ｃ．Ｔ．ｃｈｕｎｇｅｔａｌ., Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ．Ｓｃｉ. ＵＳＡ, ８６, ２１７２－２１７５(１９８９)）、Ｄ．Ｍ. Ｍｏｒｒｉｓｏｎの方法（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６８, ３２６ (１９７９)）、又は受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Ｍａｎｄｅｌ, Ｍ. ａｎｄＨｉｇａ, Ａ., Ｊ．Ｍｏｌ. Ｂｉｏｌ., ５３, １５９ (１９７０)）等により行うことが出来る。

ＩＭＰ脱水素酵素遺伝子およびＧＭＰ合成酵素遺伝子の発現量の上昇は、上記の遺伝子増幅による以外に、染色体ＤＮＡ上またはプラスミド上のＩＭＰ脱水素酵素遺伝子およびＧＭＰ合成酵素遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することによっても達成される。例えば、lacプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。また、国際公開ＷＯ００／１８９３５に開示されているように、遺伝子のプロモーター領域に数塩基の塩基置換を導入し、より強力なものに改変することも可能である。これらのプロモーター置換または改変によりＩＭＰ脱水素酵素遺伝子およびＧＭＰ合成酵素遺伝子の発現が強化され、両タンパク質の活性が増大する。ｇｕａＢ遺伝子、ｇｕａＡ遺伝子の発現量の増大は、ノザン法、RT-PCR法などにより検出することが出来る。

ＩＭＰ脱水素酵素およびＧＭＰ合成酵素をコードするｇｕａＢＡオペロン、およびプリンオペロンは、ＰｕｒＲタンパク質によってその発現が抑制されているため、本発明の方法において使用する細菌においては、ＰｕｒＲタンパク質をコードするｐｕｒＲ遺伝子（（ＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎＪ０４２１２：配列番号１７）を正常に機能しないよう改変することが好ましく、その発現を低下させることがより好ましい。ｐｕｒＲ遺伝子を正常に機能しないよう改変することは、以下のような方法で達成できる。例えば、遺伝子組み換え法を用いた相同組換え法（ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ, ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙｐｒｅｓｓ (１９７２); Ｍａｔｓｕｙａｍａ, Ｓ. ａｎｄＭｉｚｕｓｈｉｍａ, Ｓ., Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ., １６２, １１９６ (１９８５)）により、染色体上のｐｕｒＲ遺伝子を、正常に機能しないｐｕｒＲ遺伝子（以下、「破壊型ｐｕｒＲ遺伝子」ということがある）で置換することによって行うことが出来る。相同組換えは、染色体上の配列と相同性を有する配列を持つプラスミド等が菌体内に導入されると、ある頻度で相同性を有する配列の箇所で組換えを起こし、導入されたプラスミド全体が染色体上に組み込まれる。この後、さらに染色体上の相同性を有する配列の箇所で組換えを起こすと、再びプラスミドが抜け落ちるが、この時、組換えを起こす位置により、破壊された遺伝子のほうが染色体上に固定され、元の正常な遺伝子がプラスミドと一緒に染色体から抜け落ちることもある。このような菌株を選択することにより、染色体上の正常なｐｕｒＲ遺伝子が破壊型ｐｕｒＲ遺伝子と置換された菌株を取得することができる。

このような相同組換えを利用した遺伝子置換は、「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol.97, No.12, p6640-6645）とλファージ由来の切り出しシステム（J. Bacteriol. 2002 Sep; 184(18):5200-3.）と組合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol.97, No.12, p6640-6645、米国特許第6303383号、又は特開平05-007491号公報）などがある。
また、上述のような相同組換えを利用した遺伝子置換による部位特異的変異導入は、宿主上で複製能力を持たないプラスミドを用いても行うことが出来る。また、薬剤耐性等のマーカー遺伝子が内部に挿入されたｐｕｒＲ遺伝子を含み、かつ、目的とする微生物内で複製できないプラスミドを用いることによっても、ｐｕｒＲ遺伝子の破壊を行うことが出来る。すなわち、前記プラスミドで形質転換され、薬剤耐性を獲得した形質転換体は、染色体ＤＮＡ中にマーカー遺伝子が組み込まれている。このマーカー遺伝子は、その両端のpurR遺伝子配列と染色体上のこれらの遺伝子との相同組換えによって組み込まれる可能性が高いため、効率よく遺伝子破壊株を選択することが出来る。

遺伝子破壊に用いる破壊型ｐｕｒＲ遺伝子は、具体的には、制限酵素消化及び再結合によるこれらの遺伝子の一定領域の欠失、これらの遺伝子への他のＤＮＡ断片（マーカー遺伝子等）の挿入、または部位特異的変異法（Kramer, W. and Frits, H. J., Methods in Enzymology, 154, 350 (1987)）や次亜塩素酸ナトリウム、ヒドロキシルアミン等の化学薬剤による処理（Shortle, D. and Nathans, D., Proc., Natl., Acad., Sci., U.S.A., 75, 270 (1978)）によって、ｐｕｒＲ遺伝子のコーディング領域又はプロモーター領域等の塩基配列の中に１つまたは複数個の塩基置換、欠失、挿入、付加または逆位を起こさせることにより、コードされるリプレッサーの活性を低下又は消失させるか、又はｐｕｒＲ遺伝子の転写を低下または消失させることにより、取得することが出来る。

  ｐｕｒＲ遺伝子は、配列自体は公知であり、それらの配列に基づいて、PCR法又はハイブリダイゼーション法等によって容易に取得することが出来る。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｐｕｒＲ遺伝子として配列番号１８のアミノ酸配列をコードする遺伝子が挙げられる。ｐｕｒＲ遺伝子は、例えば、エシェリヒア・コリの染色体ＤＮＡから、配列番号１９及び２０に示すプライマーを用いたＰＣＲによって取得することが出来る。
  その他の微生物のｐｕｒＲ遺伝子も、公知の配列または上記Ｅ．ｃｏｌｉのｐｕｒＲ遺伝子との配列相同性に基づいて取得し、微生物の改変に使用できる。
  ｐｕｒＲ遺伝子は、配列番号１８のアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするものであればよい。

目的とする遺伝子が破壊されたことは、サザンブロッティングやＰＣＲ法により、染色体上の遺伝子を解析することによって確認することができる。

また、微生物を紫外線照射またはＮ－メチル－Ｎ’－ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）もしくは亜硝酸などの通常変異処理に用いられる変異剤によって処理することによっても、機能を有するＰｕｒＲタンパク質が産生されないようになった変異株を取得することができる。また、ｇｕａＢＡオペロンプロモーター上流に位置するＰｕｒＲ結合配列（M.I. Hutchings, W.T. Drabble , FEMS Microbiology Letters 187 (2000) 115-122）に、１つまたは複数個の塩基置換、欠失、挿入、付加または逆位を起こさせることにより、ＰｕｒＲタンパク質が通常のように結合しなくなるよう改変することができる。

  本発明の方法において使用する細菌においては、さらに、ｕｓｈＡ遺伝子及び／またはａｐｈＡ遺伝子が正常に機能しないように改変されていることが好ましい。これらの遺伝子の変異株又は遺伝子組み換え株は、これらの遺伝子が、それらの遺伝子によってコードされる５’－ヌクレオチダーゼの活性が低下又は消失するか、又はこれらの遺伝子の転写が低下、又は消失するように、改変することによって得られる。このような変異株又は遺伝子組み換え株は、前述のｐｕｒＲ遺伝子が正常に機能しない変異株又は遺伝子組み換え株と同様にして得ることができる。
  ｕｓｈＡ遺伝子は、配列自体は公知であり、それらの配列に基づいて、ＰＣＲ法又はハイブリダイゼーション法等によって容易に取得することが出来る。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｕｓｈＡ遺伝子として配列番号２２のアミノ酸配列をコードする遺伝子が挙げられる。  その他の微生物のｕｓｈＡ遺伝子も、公知の配列または上記Ｅ．ｃｏｌｉのｕｓｈＡ遺伝子との配列相同性に基づいて取得し、改変に使用できる。
  尚、ｕｓｈＡ遺伝子は、配列番号２２のアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするものであればよい。
  ａｐｈＡ遺伝子は、配列自体は公知であり、それらの配列に基づいて、PCR法又はハイブリダイゼーション法等によって容易に取得することが出来る。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのａｐｈＡ遺伝子として配列番号２４のアミノ酸配列をコードする遺伝子が挙げられる。
  その他の微生物のａｐｈＡ遺伝子も、公知の配列または上記Ｅ．ｃｏｌｉのａｐｈＡ遺伝子との配列相同性に基づいて取得し、改変に使用できる。
  ａｐｈＡ遺伝子は、配列番号２４のアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするものであればよい。

  本発明の方法において使用する細菌においては、さらに、ａｄｄ遺伝子及び／またはｐｕｒＡ遺伝子が正常に機能しないように改変されていることが好ましい。これらの遺伝子の変異株又は遺伝子組み換え株は、これらの遺伝子が、それらの遺伝子によってコードされるアデノシンデアミナーゼ及び／またはサクシニル－ＡＭＰシンターゼの活性が低下又は消失するか、又はこれらの遺伝子の転写が低下、又は消失するように、改変することによって得られる。このような変異株又は遺伝子組み換え株は、前述のｐｕｒＲ遺伝子が正常に機能しない変異株又は遺伝子組み換え株と同様にして得ることができる。  ａｄｄ遺伝子は、配列自体は公知であり、それらの配列に基づいて、ＰＣＲ法又はハイブリダイゼーション法等によって容易に取得することが出来る。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのａｄｄ遺伝子として配列番号３８のアミノ酸配列をコードする遺伝子が挙げられる。
  その他の微生物のａｄｄ遺伝子も、公知の配列または上記Ｅ．ｃｏｌｉのａｄｄ遺伝子との配列相同性に基づいて取得し、改変に使用できる。
  ａｄｄ遺伝子は、配列番号３８のアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするものであればよい。
  ｐｕｒＡ遺伝子は、配列自体は公知であり、それらの配列に基づいて、ＰＣＲ法又はハイブリダイゼーション法等によって容易に取得することが出来る。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｐｕｒＡ遺伝子として配列番号３４のアミノ酸配列をコードする遺伝子が挙げられる。  その他の微生物のｐｕｒＡ遺伝子も、公知の配列または上記Ｅ．ｃｏｌｉのｐｕｒＡ遺伝子との配列相同性に基づいて取得し、改変に使用できる。
  purA遺伝子は、配列番号３４のアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするものであればよい。

  本発明の方法において使用する細菌においては、さらに、ｎａｇＤ遺伝子が正常に機能しないように改変されていることが好ましい。ｎａｇＤ遺伝子の変異株又は遺伝子組み換え株は、該遺伝子が、該遺伝子によってコードされるタンパク質の活性が低下又は消失するか、又はこれらの遺伝子の転写が低下、又は消失するように、改変することによって得られる。このような変異株又は遺伝子組み換え株は、前述のｐｕｒＲ遺伝子が正常に機能しない変異株又は遺伝子組み換え株と同様にして得ることができる。
  ｎａｇＤ遺伝子は、配列自体は公知であり、それらの配列に基づいて、ＰＣＲ法又はハイブリダイゼーション法等によって容易に取得することが出来る。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｎａｇＤ遺伝子として配列番号４２のアミノ酸配列をコードする遺伝子が挙げられる。
　E.coliのnagD遺伝子は、N-アセチルグルコサミンの資化に関与するnagBACDオペロン内に存在し、このnagBACDオペロン遺伝子の発現は培地中にバクテリアの細胞壁の主成分を構成する糖の一種であるN-アセチルグルコサミンを添加することで誘導されることが明らかになっている（Plumbridge JA., Mol. Micobiol. (1989) 3. 505-515）。E.coliのnagDにコードされるNagDタンパク質は、保存的な構造上の特徴からハロ酸脱ハロゲン化酵素（HAD）ファミリーに属すことがわかっており、試験管内の実験によればGMPおよび５’－ウリジル酸(ウリジン－５’－モノリン酸、以下「UＭＰ」ともいう）に対してヌクレオチダーゼ活性を有することが報告されている（Tremblay LW., Biochemistry, (2006) 45. 1183-1193）。ただし、E.coliのゲノム上には23種のHADファミリータンパク質が存在し、それらの基質特異性の範囲は非常に広い（Kuznetsova et al., J.Biol.Chem., (2006) 281., 36149-36161）ので、nagD遺伝子の細胞内での生理的な役割については知られていない。
　本発明においては、ｇｕａＢ遺伝子およびｇｕａＡ遺伝子の発現を増加させ、ｕｓｈＡ遺伝子およびａｐｈＡ遺伝子が正常に機能しないように改変された微生物において、さらにｎａｇＤ遺伝子が正常に機能しないように改変することでイノシン酸から効率よく５’－グアニル酸を生産することが見出された。
　したがって、本発明は新規微生物として、ｇｕａＢ遺伝子およびｇｕａＡ遺伝子の発現を増加させることによってイノシン酸脱水素酵素および５’－グアニル酸合成酵素の活性が増大するように改変され、さらにｕｓｈＡ遺伝子、ａｐｈＡ遺伝子およびｎａｇＤ遺伝子が正常に機能しないように改変された、イノシン酸を５’－グアニル酸に変換する能力を有する微生物を提供する。この微生物においては、さらに、ｐｕｒＲ遺伝子、ａｄｄ遺伝子およびｐｕｒＡ遺伝子から選ばれる１種又はそれ以上の遺伝子が正常に機能しないように改変されることが好ましい。
  なお、nagD遺伝子はE．coliのものに限定されず、その他の微生物のnagD遺伝子も、公知の配列または上記E．coliのnagD遺伝子との配列相同性に基づいて取得し、改変に使用できる。すなわち、nagD遺伝子は、配列番号４２のアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするものであればよい。

＜ＩＩ＞ＧＭＰの製造法
上述した、ＩＭＰ脱水素酵素活性及びＧＭＰ合成酵素活性が増大するように改変された微生物にＩＭＰを反応させ、ＩＭＰをＧＭＰに変換することによって、ＧＭＰを得ることができる。

  ＩＭＰ脱水素酵素反応はＮＡＤ⁺を、ＧＭＰ合成酵素反応はＡＴＰを、それぞれ必要とする。ＩＭＰ脱水素酵素反応により生じたＮＡＤＨは酸化的リン酸化経路により再びＮＡＤ⁺に変換されるが、その際にＡＴＰが生成する。したがって、ＩＭＰ脱水素酵素活性及びＧＭＰ合成酵素活性を同時に増大させることによって、ＩＭＰからＧＭＰへの反応が効率よく進行すると推定される。
  本発明において、「反応させる」とは、上記微生物菌体をＩＭＰが添加された培地に存在させて、該微生物をいわゆる微生物触媒として用いてＩＭＰをＧＭＰに変換すること、及び、上記微生物を培養しながらＩＭＰを培地に加えてＧＭＰを生成させることの両方を含む。
  好ましくは、上記微生物の培養後の菌体を、ＩＭＰを含む反応液中に添加すること、または上記微生物を含む溶液中にＩＭＰを添加することで、ＩＭＰを効率よくＧＭＰに変換し、ＧＭＰを生成蓄積せしめることができる。

該微生物の培養を行う際の炭素源としては、グルコース、フラクトース、シュークロース、糖蜜、廃糖蜜、澱粉加水分解物等の炭水化物、エタノール、グリセリン、ソルビトール等のアルコール類、ピルビン酸、乳酸、酢酸等の有機酸、グリシン、アラニン、グルタミン酸、アスパラギン酸等のアミノ酸など、上記微生物が資化可能であればいずれも使用できる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニア、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の各種無機及び有機アンモニウム塩、尿素、各種アミノ酸、ペプトン、ＮＺアミン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、フィッシュミールまたはその消化物等が使用できる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、リン酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、炭酸カルシウム等を用いることができる。用いる微生物がアミノ酸、核酸、ビタミン等特定の栄養物質を生育に要求する場合には、培地にこれら物質を適量添加する。培養はｐＨ５．０～８．５、１５℃～４５℃の適切な範囲にて好気的条件にて５時間～７２時間程度行えばよい。なお、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、さらにアンモニアガス等を使用することが出来る。

該微生物の培養液を直接、または遠心した後に菌体のみを、あるいは菌体を適当な溶液に懸濁したものを、ＩＭＰを含む反応液に接種してＩＭＰからＧＭＰへの変換を行うことができる。なお、本発明のＧＭＰの製造法においては、上記微生物の菌体処理物を使用することもできる。菌体の処理物としては、例えば、菌体をアクリルアミド、カラギーナン等で固定化した固定化菌体等が挙げられる。

反応液の炭素源としては、グルコース、フラクトース、シュークロース、糖蜜、廃糖蜜、澱粉加水分解物等の炭水化物、エタノール、グリセリン、ソルビトール等のアルコール類、ピルビン酸、乳酸、酢酸等の有機酸、グリシン、アラニン、グルタミン酸、アスパラギン酸等のアミノ酸など、上記微生物が資化可能であればいずれも使用できる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニア、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の各種無機及び有機アンモニウム塩、尿素、各種アミノ酸、ペプトン、ＮＺアミン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、フィッシュミールまたはその消化物等が使用できる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、リン酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、炭酸カルシウム等を用いることができる。用いる微生物がアミノ酸、核酸、ビタミン等特定の栄養物質を生育に要求する場合には、培地にこれら物質を適量添加する。

なお、反応液には有機溶剤を加えてヌクレオチドの細胞透過性を活性化させることが好ましい。
ヌクレオチドの膜透過性活性化剤である有機溶剤としては、キシレン、トルエン、ベンゼン、脂肪酸アルコール、酢酸エチルなどが利用でき、通常0.1～30 ml/Lの濃度にて用いることが好ましい。反応はｐＨ５．０～８．５、１５℃～４５℃の適切な範囲にて好気的条件または嫌気的条件にて１時間～７日程度行えばよい。なお、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、さらにアンモニアガス等を使用することが出来る。なお、原料のＩＭＰは、化学合成されたもの、市販のもの、および発酵法（ＷＯ９６／３０５０１、特開２００２－３５５０８７、特開２００３－３２５１８２など）によって製造されたものなどを使用することができる。

反応液からのＧＭＰの搾取は通常、イオン交換樹脂法、沈殿法、その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。

［実施例］以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。

＜１－１＞ＪＭ１０９株由来で５’－ヌクレオチダーゼをコードするushA,aphA遺伝子破壊株の構築
　一般的なＤＮＡクローニング用宿主として利用されているエシェリヒア・コリＪＭ１０９株を親株として、まず５’－ヌクレオチダーゼ非産生株の構築を行った。５’－ヌクレオチダーゼは、ushA遺伝子（Genbank Accession X03895 配列番号２１）、aphA遺伝子（Genbank Accession X86971 配列番号２３）によってコードされている。

　５’－ヌクレオチダーゼをコードするushA、aphA遺伝子の欠失は、DatsenkoとWannerによって最初に開発された「Red-driven integration」と呼ばれる方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 2000， vol. 97， No. 12， p6640-6645）とλファージ由来の切り出しシステム（J. Bacteriol. 2002 Sep; 184(18): 5200-3. Interactions between integrase and excisionase in the phage lambda excisive nucleoprotein complex. Cho EH， Gumport RI， Gardner JF.）によって行った。「Red-driven integration」方法によれば、目的とする遺伝子の一部を合成オリゴヌクレオチドの5’側に、抗生物質耐性遺伝子の一部を３’側にデザインした合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて得られたPCR産物を用いて、一段階で遺伝子破壊株を構築することができる。さらにλファージ由来の切り出しシステムを組合わせることにより、遺伝子破壊株に組み込んだ抗生物質耐性遺伝子を除去することが出来る。

（１）ushA遺伝子の破壊
　PCRの鋳型としてPCRの鋳型として、プラスミドpMW118-attＬ－Cm-attRを使用した。pMW118-attＬ－Cm-attR（WO2006078039）は、pMW118(宝バイオ社製)にλファージのアタッチメントサイトであるattL及びattR遺伝子と抗生物質耐性遺伝子であるcat遺伝子を挿入したプラスミドであり、attＬ－cat－attRの順で挿入されている。

　このattLとattRの両端に対応する配列をプライマーの3’末端に、目的遺伝子であるushA遺伝子の一部に対応するプライマーの5’末端に有する配列番号２５及び２６に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーに用いてＰＣＲを行った。

　増幅したPCR産物をアガロースゲルで精製し、温度感受性の複製能を有するプラスミドpKD46を含むエシェリヒア・コリJM109株にエレクトロポレーションにより導入した。プラスミドpKD46（Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 2000， vol. 97， No. 12， p6640-6645）は、アラビノース誘導性P_araBプロモーターに制御されるλRed相同組換えシステムのRed レコンビナーゼをコードする遺伝子（γ、β、exo遺伝子）を含むλファージの合計2154塩基のDNAフラグメント（GenBank/EMBL アクセッション番号 J02459、第31088番目～33241番目）を含む。プラスミドpKD46はPCR産物をJM109株の染色体に組み込むために必要である。

　エレクトロポレーション用のコンピテントセルは次のようにして調製した。すなわち、100mg／Lのアンピシリンを含んだLB培地中で３０℃、一晩培養したエシェリヒア・コリJM109株を、アンピシリン（20mg/L）とＬ－アラビノース（1mM）を含んだ5mLのSOB培地（モレキュラークローニング：実験室マニュアル第２版、Sambrook， J.ら，Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989年））で100倍希釈した。得られた希釈物を３０℃で通気しながらＯＤ600が約０．６になるまで生育させた後、100倍に濃縮し、10%グリセロールで３回洗浄することによってエレクトロポレーションに使用できるようにした。エレクトロポレーションは７０μＬのコンピテントセルと約１００ｎｇのＰＣＲ産物を用いて行った。エレクトロポレーション後のセルは１ｍＬのＳＯＣ培地（モレキュラークローニング：実験室マニュアル第２版、Sambrook， J.ら，Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989年））を加えて３７℃で２．５時間培養した後、３７℃でＣｍ（クロラムフェニコール）(25mg/L)を含むＬ－寒天培地上で平板培養し、Ｃｍ耐性組換え体を選択した。次に、pKD46プラスミドを除去するために、Ｃｍを含むＬ－寒天培地上、４２℃で２回継代し、得られたコロニーのアンピシリン耐性を試験し、pKD46が脱落しているアンピシリン感受性株を取得した。

　クロラムフェニコール耐性遺伝子によって識別できた変異体のushA遺伝子の欠失を、PCRによって確認した。得られたushA欠損株をJM109ΔushA::att-cat株と名づけた。

　次に、ushA遺伝子内に導入されたatt-cat遺伝子を除去するために、ヘルパープラスミド上述のpMW-intxis-tsを使用した。pMW-intxis-tsは、λファージのインテグラーゼ（Int）をコードする遺伝子、エクシジョナーゼ(Xis)をコードする遺伝子を搭載し、温度感受性の複製能を有するプラスミドである。pMW-intxis-ts導入により、染色体上のattLあるいはattRを認識して組換えを起こしattLとattRの間の遺伝子を切り出し、染色体上にはattLあるいはattR配列のみ残る構造になる。

　上記で得られたJM109ΔushA::att-cat株のコンピテントセルを常法に従って作製し、ヘルパープラスミドpMW-intxis-tsにて形質転換し、３０℃で50 mg/Lのアンピシリンを含むＬ－寒天培地上にて平板培養し、アンピシリン耐性株を選択した。
次に、pMW-intxis-tsプラスミドを除去するために、Ｌ－寒天培地上、４２℃で２回継代し、得られたコロニーのアンピシリン耐性、及びクロラムフェニコール耐性を試験し、att-cat、及びpMW-intxis-tsが脱落しているushA破壊株であるクロラムフェニコール、アンピシリン感受性株を取得した。この株をJM109ΔushAと名づけた。

　（2）JM109ΔushA株のaphA遺伝子の欠失
　JM109ΔushA株におけるaphA遺伝子の欠失は、上記手法に則って、aphA破壊用プライマーとして、配列番号２７、２８のプライマーを使用して行った。これによって、ushA aphA破壊株であるJM109ΔushAΔaphAを得た。

＜１－２＞ＪＭ１０９ΔushAΔaphA株由来でプリンオペロンやguaBAオペロンのリプレッサーをコードするpurR遺伝子破壊株の構築
　続いて、ＪＭ１０９ΔushAΔaphA株を親株として、guaBAオペロンのリプレッサーPurR非産生株の構築を行った。PurRは、purR遺伝子（Genbank Accession J04212 配列番号１７）によってコードされている。前述のushA、aphA遺伝子破壊手法に則って、purR破壊用プライマーとして、配列番号２９、３０のプライマーを使用して行った。これによって、JM109ΔushAΔaphAΔpurRを得た。

＜１－３＞IMP脱水素酵素及びＧＭＰ合成酵素発現強化プラスミドpUC18-guaBAの構築及び該プラスミドのJM109ΔushAΔaphAΔpurR株への導入
　IMP脱水素酵素及びＧＭＰ合成酵素発現強化プラスミドpUC18-guaBAを以下のようにして行った。両酵素をコードするguaB、guaA遺伝子は、エシェリヒア・コリではオペロン（guaBA）を構成していることが知られている。そこで、配列番号３１及び配列番号３２に示したプライマーを用いてＰＣＲを行い、エシェリヒア・コリのguaBAオペロンを増幅した。増幅断片を精製した後、両端に形成された制限酵素部位をSacI及びKpnIで切断した。切断断片を、同じくSacI及びKpnIで切断したpUC18と連結し、guaBA遺伝子が組み込まれたプラスミドpUC18-guaBAを選択した。このプラスミドを前記JM109ΔushAΔaphAΔpurR株に導入し、JM109ΔushAΔaphAΔpurR/ pUC18-guaBA株を得た。

＜１－４＞JM109ΔushAΔaphAΔpurR/ pUC18-guaBA株菌体を利用したＩＭＰからＧＭＰへの変換反応
　上記菌株について、ＩＭＰからＧＭＰへの変換反応評価を実施した。以下に、ＩＭＰからＧＭＰへの変換反応評価のための、菌体の調製方法、反応方法、反応溶液組成、分析方法を示す。

［菌体の調製方法］
　LB培地プレート上にJM109ΔushAΔaphAΔpurR/ pUC18-guaBA株をまんべんなく塗布し、37℃で一晩培養した。翌日、1/32プレート分の菌体を、LB培地20mlを張り込んだ500 ml容の坂口フラスコに植菌し、37℃で一晩培養した。LB 600ml分の培養液の遠心後菌体を、60mlの反応溶液に用いた。

［反応方法］
　前述のLB 600ml分の培養後菌体を薬さじで掻き取り、後述する反応液60mlに接種して反応を開始した。反応は42℃で、pHを7.2で維持されるよう、水酸化ナトリウムを加えながら実施した。

［反応溶液組成］
　　60 mM          IMP
　　50 g/L　　　   Glucose
　　9.2 g/L        ヘキサメタリン酸ナトリウム
　　5 g/L          MgSO₄・7H₂O
　　6.6 g/L        (NH₄)₂SO₄
　　10 g/L　　　　 KH₂PO₄
　　5 ml/L　　　　 Xylene

［分析方法］
　反応液500μlを経時的にサンプリングし、15,000rpmで5分間遠心した上清液をNaOHで希釈して反応を停止した。反応停止液をフィルターろ過し、通常300 μlをHPLC分析に供した。分析条件は以下の通りである。
　　カラム：Asahipak GS-220(直径7.6mm，50cm)を2本連結
　　溶離液：0.2 M NaH₂PO₄ (pH 3.98 )
　　温度：55℃
　　流速：1 ml/分
　　検出：紫外線(254nm)吸収

　結果を図１に示す。JM109ΔushAΔaphAΔpurR/ pUC18-guaBAでは反応１２時間で最大約16.2g/LのGMPを反応液中に蓄積することが示された。

＜２－１＞ＪＭ１０９ΔushAΔaphAΔpurR株由来のnagD遺伝子破壊株の構築
　実施例１の＜１－２＞で得られたＪＭ１０９ΔushAΔaphAΔpurR株を親株として、NagD非産生株の構築を行った。NagDはnagD遺伝子（Genbank Accession X14135 配列番号４１）によってコードされている。前述のushA、aphA、purR遺伝子破壊手法に則って、nagD破壊用プライマーとして配列番号４３、４４のプライマーを使用してnagD遺伝子破壊を行った。これによって、JM109ΔushAΔaphAΔpurRΔnagDを得た。

＜２－２＞IMP脱水素酵素及びＧＭＰ合成酵素発現強化プラスミドpUC18-guaBAのJM109ΔushAΔaphAΔpurR株およびJM109ΔushAΔaphAΔpurRΔnagD株への導入
プラスミドpUC18-guaBAを前記JM109ΔushAΔaphAΔpurR株およびJM109ΔushAΔaphAΔpurRΔnagD株に導入し、JM109ΔushAΔaphAΔpurR / pUC18-guaBA株およびJM109ΔushAΔaphAΔpurRΔnagD / pUC18-guaBA株を得た。

＜２－３＞JM109ΔushAΔaphAΔpurR / pUC18-guaBA株およびJM109ΔushAΔaphAΔpurRΔnagD / pUC18-guaBA株菌体を利用したＩＭＰからＧＭＰへの変換反応
上記菌株について、ＩＭＰからＧＭＰへの変換反応評価を実施した。以下に、ＩＭＰからＧＭＰへの変換反応のための、菌体の調製方法、反応方法、反応溶液組成、分析方法を示す。

［菌体の調製方法］
LB培地プレート上にJM109ΔushAΔaphAΔpurR / pUC18-guaBA株またはJM109ΔushAΔaphAΔpurRΔnagD / pUC18-guaBA株をまんべんなく塗布し、37℃で一晩培養した。翌日、1/32プレート分の菌体を、LB培地20mlを張り込んだ500 ml容の坂口フラスコに植菌し、37℃で一晩培養した。

［反応方法］
前述の培養液を遠心し、乾燥重量で0.8g相当の菌体を反応液60mlに接種して反応を開始した。反応は42℃で、pHを7.2で維持されるよう、水酸化ナトリウムを加えながら実施した。

［ＩＭＰからＧＭＰへの変換反応の反応溶液組成］
    50 mM IMP
    50 g/L Glucose
    9.2 g/L ヘキサメタリン酸ナトリウム
    5 g/L MgSO₄・7H₂O
    6.6 g/L (NH₄)₂SO₄
    10 g/L KH₂PO₄
    3 ml/L Xylene

［分析方法］
  反応液500μlを経時的にサンプリングし、NaOHで希釈して反応を停止した。反応停止液をフィルターろ過し、通常300 μlをHPLC分析に供した。分析条件は以下の通りである。
    カラム：Asahipak GS-220(直径7.6mm，50cm)を2本連結
    溶離液：0.2 M NaH₂PO₄ (pH 3.98 )
    温度：55℃流速：1 ml/分
    検出：紫外線(254nm)吸収

結果を図２に示す。JM109ΔushAΔaphAΔpurR / pUC18-guaBA株では最大約12.5g/LのGMPを、JM109ΔushAΔaphAΔpurRΔnagD / pUC18-guaBA株では最大約14.81g/LのGMPを反応液中に蓄積することが示された。

実施例２に記載のJM109ΔushAΔaphAΔpurRΔnagD / pUC18-guaBA株菌体を利用したＩＭＰからＧＭＰへの変換反応およびＸＭＰからＧＭＰへの変換反応とその比較
実施例２に記載のJM109ΔushAΔaphAΔpurRΔnagD / pUC18-guaBA株について、ＩＭＰからＧＭＰへの変換反応ならびにＸＭＰからＧＭＰへの変換反応を評価した。変換反応評価のための、菌体の調製方法、反応方法、ＩＭＰからＧＭＰへの変換反応溶液組成、分析方法については実施例２に従った。XＭＰからＧＭＰへの変換反応では、ＩＭＰからＧＭＰへの変換反応溶液組成のＩＭＰの代わりに等濃度のＸＭＰを使用した。

結果を図３に示す。IＭＰからＧＭＰへの変換反応では反応4時間で最大約16.9g/LのＧＭＰを、ＸＭＰからＧＭＰへの変換反応では反応7.5時間で最大約24.4g/LのＧＭＰを反応液中に蓄積し、ＸＭＰを基質とした反応よりもＩＭＰを基質とした反応のほうがＧＭＰの生成速度が速いことが示された。

＜４－１＞MG1655株由来で５’－ヌクレオチダーゼをコードするushA,aphA遺伝子破壊株の構築
エシェリヒア・コリ野性株MG1655株を親株として、５’－ヌクレオチダーゼUshA, AphA非産生株の構築を行った。５’－ヌクレオチダーゼをコードするushA、aphA遺伝子の欠失は、実施例1に従って、「Red-driven integration」と呼ばれる方法とλファージ由来の切り出しシステムによって行った。作製した株をMG1655ΔushAΔaphAと名づけた。

＜４－２＞MG1655ΔushAΔaphA株由来でサクシニル－ＡＭＰシンターゼをコードするpurA遺伝子破壊株の構築
続いて、MG1655ΔushAΔaphA株を親株として、サクシニル－ＡＭＰシンターゼ非産生株の構築を行った。Ｅ．ｃｏｌｉのサクシニル－ＡＭＰシンターゼはpurA遺伝子（Genbank Accession J04199 配列番号３３）によってコードされている。実施例1に示したushA、aphA、purR遺伝子破壊手法に則り、purA破壊用プライマーとして、配列番号３５、３６のプライマーを使用して行った。これによって、MG1655ΔushAΔaphAΔpurAを得た。

＜４－３＞MG1655ΔushAΔaphAΔpurA株由来でプリンオペロンやguaBAオペロンのリプレッサーをコードするpurR遺伝子破壊株の構築
続いて、MG1655ΔushAΔaphAΔpurA株を親株として、guaBAオペロンのリプレッサーPurR非産生株の構築を行った。purR遺伝子の破壊は、実施例1に従い、purR破壊用プライマーとして、配列番号２９、３０のプライマーを使用して行った。これによって、MG1655ΔushAΔaphAΔpurAΔpurRを得た。

＜４－４＞MG1655ΔushAΔaphAΔpurR株由来でアデノシンデアミナーゼをコードするadd遺伝子破壊株の構築
続いて、MG1655ΔushAΔaphAΔpurAΔpurR株を親株として、アデノシンデアミナーゼ非産生株の構築を行った。Ｅ．ｃｏｌｉのアデノシンデアミナーゼはadd遺伝子（Genbank Accession No. M59033 配列番号３７）によってコードされている。実施例1に示したushA、aphA、purR遺伝子破壊手法に則り、add破壊用プライマーとして、配列番号３９、４０のプライマーを使用して行った。これによって、MG1655ΔushAΔaphAΔpurAΔpurRΔadd株を得た。

＜４－５＞IMP脱水素酵素及びＧＭＰ合成酵素発現強化プラスミドpUC18-guaBAのMG1655ΔushAΔaphAΔpurAΔpurRΔadd株への導入
実施例1に示したpUC18-guaBAを前記MG1655ΔushAΔaphAΔpurAΔpurRΔadd株に導入し、MG1655ΔushAΔaphAΔpurAΔpurRΔadd/pUC18-guaBA株を得た。

＜４－６＞MG1655ΔushAΔaphAΔpurAΔpurRΔadd/pUC18-guaBA株菌体を利用したＩＭＰまたはＸＭＰからＧＭＰへの変換反応
上記菌株について、ＩＭＰまたはＸＭＰからＧＭＰへの変換反応評価を実施した。変換反応評価のための菌体の調製方法、反応方法、反応溶液組成、分析方法について以下に示す。

［菌体の調製方法］
LB培地プレート上にMG1655ΔushAΔaphAΔpurAΔpurRΔadd/pUC18-guaBA株をまんべんなく塗布し、37℃で一晩培養した。翌日、1/32プレート分の菌体を、LB培地20mlを張り込んだ500 ml容の坂口フラスコに植菌し、37℃で一晩培養した。LB 600ml分の培養液の遠心後菌体を、60mlの反応溶液に用いた。

［反応溶液組成］
    50 mM IMP  または　50 mM XMP
    50 g/L Glucose
    9.2 g/L ヘキサメタリン酸ナトリウム
    5 g/L MgSO₄・7H₂O
    6.6 g/L (NH₄)₂SO₄
    10 g/L KH₂PO₄
    5 ml/L Xylene

結果を図４に示す。ＸＭＰを基質とした反応よりもＩＭＰを基質とした反応のほうがＧＭＰの生成速度が速いことが示された。

本発明によれば、調味料、医薬及びそれらの原料として有用なＧＭＰを効率よく製造することができる。

〔配列表の説明〕
配列番号１：E. coli GMP合成酵素(GMPS)遺伝子（guaA）塩基配列
配列番号２：E. coli GMPSアミノ酸配列
配列番号３：B. subtilis GMPS遺伝子（guaA）塩基配列
配列番号４：B. subtilis GMPSアミノ酸配列
配列番号５：C. glutamicum GMPS遺伝子（guaA）塩基配列
配列番号６：C. glutamicum GMPSアミノ酸配列
配列番号７：C. ammoniagenes GMPS遺伝子（guaA）塩基配列
配列番号８：C. ammoniagenes GMPSアミノ酸配列
配列番号９：E. coli IMP脱水素酵素(IMPDH) 遺伝子（guaB）塩基配列
配列番号１０：E. coli IMPDHアミノ酸配列
配列番号１１：B. subtilis IMPDH遺伝子（guaB）塩基配列
配列番号１２：B. subtilis IMPDHアミノ酸配列
配列番号１３：C. glutamicum IMPDH遺伝子（guaB）塩基配列
配列番号１４：C. glutamicum IMPDHアミノ酸配列
配列番号１５：C. ammoniagenes IMPDH遺伝子（guaB）塩基配列
配列番号１６：C. ammoniagenes IMPDHアミノ酸配列
配列番号１７：E. coli purR塩基配列
配列番号１８：E. coli PurRアミノ酸配列
配列番号１９：E. coli purR クローニング用プライマー配列
配列番号２０：E. coli purR クローニング用プライマー配列
配列番号２１：E. coli ushA塩基配列
配列番号２２：E. coli UshAアミノ酸配列
配列番号２３：E. coli aphA塩基配列
配列番号２４：E. coli AphAアミノ酸配列
配列番号２５：E. coli ushA遺伝子破壊用プライマー配列
配列番号２６：E. coli ushA遺伝子破壊用プライマー配列
配列番号２７：E. coli aphA遺伝子破壊用プライマー配列
配列番号２８：E. coli aphA遺伝子破壊用プライマー配列
配列番号２９：E. coli purR遺伝子破壊用プライマー配列
配列番号３０：E. coli purR遺伝子破壊用プライマー配列
配列番号３１：E. coli guaBAクローニングプライマー配列
配列番号３２：E. coli guaBAクローニングプライマー配列
配列番号３３：E. coli purA塩基配列
配列番号３４：E. coli PurAアミノ酸配列
配列番号３５：E. coli purA遺伝子破壊用プライマー配列
配列番号３６：E. coli purA遺伝子破壊用プライマー配列
配列番号３７：E. coli add塩基配列
配列番号３８：E. coli Addアミノ酸配列
配列番号３９：E. coli add遺伝子破壊用プライマー配列
配列番号４０：E. coli add遺伝子破壊用プライマー配列
配列番号４１：E. coli nagD塩基配列
配列番号４２：E. coli NagDアミノ酸配列
配列番号４３：E. coli nagD遺伝子破壊用プライマー配列
配列番号４４：E. coli nagD遺伝子破壊用プライマー配列

Claims

　イノシン酸脱水素酵素および５’－グアニル酸合成酵素の活性が増大するように改変された、イノシン酸を５’－グアニル酸に変換する能力を有する微生物に、イノシン酸を作用させて５’－グアニル酸を生成させ、これを採取することを特徴とする５’－グアニル酸の製造方法。
　前記微生物が、ｇｕａＢ遺伝子およびｇｕａＡ遺伝子の発現を増加させることによってイノシン酸脱水素酵素および５’－グアニル酸合成酵素の活性を増大するように改変された微生物である、請求項１に記載の５’－グアニル酸の製造方法。
　ｇｕａＡ遺伝子が下記（Ａ）または（Ｂ）のタンパク質をコードする、請求項２に記載の５’－グアニル酸の製造方法：
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、５’－グアニル酸合成酵素活性を有するタンパク質。
　ｇｕａＢ遺伝子が下記（Ｃ）または（Ｄ）のタンパク質をコードする、請求項２又は３に記載の５’－グアニル酸の製造方法：
（Ｃ）配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｄ）配列番号１０に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、イノシン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質。
　前記微生物が、さらに、ｕｓｈＡ遺伝子およびａｐｈＡ遺伝子から選ばれる１種又はそれ以上の遺伝子が正常に機能しないように改変された微生物である、請求項１～４のいずれか一項に記載の５’－グアニル酸の製造方法。
　前記微生物が、さらに、ｐｕｒＲ遺伝子、ａｄｄ遺伝子およびｐｕｒＡ遺伝子から選ばれる１種又はそれ以上の遺伝子が正常に機能しないように改変された微生物である、請求項１～５のいずれか一項に記載の５’－グアニル酸の製造方法。
　前記微生物が、さらに、ｎａｇＤ遺伝子が正常に機能しないように改変された微生物である、請求項１～６のいずれか一項に記載の５’－グアニル酸の製造方法。
前記微生物が、腸内細菌科に属する細菌、バチルス属細菌、またはコリネ型細菌である、請求項１～７のいずれか一項に記載の５’－グアニル酸の製造方法。
　前記微生物が、エシェリヒア属細菌である、請求項８に記載の５’－グアニル酸の製造方法。
　前記微生物が、エシェリヒア・コリである、請求項９に記載の５’－グアニル酸の製造方法。
　ｇｕａＢ遺伝子およびｇｕａＡ遺伝子の発現を増加させることによってイノシン酸脱水素酵素および５’－グアニル酸合成酵素の活性が増大するように改変され、さらにｕｓｈＡ遺伝子、ａｐｈＡ遺伝子およびｎａｇＤ遺伝子が正常に機能しないように改変された、イノシン酸を５’－グアニル酸に変換する能力を有する微生物。
　さらに、ｐｕｒＲ遺伝子、ａｄｄ遺伝子およびｐｕｒＡ遺伝子から選ばれる１種又はそれ以上の遺伝子が正常に機能しないように改変された、請求項１１に記載の微生物。
　腸内細菌科に属する細菌、バチルス属細菌、またはコリネ型細菌である、請求項１１または１２に記載の微生物。
　エシェリヒア属細菌である、請求項１３に記載の微生物。
　エシェリヒア・コリである、請求項１４に記載の微生物。