JPH057491A - 温度感受性プラスミド - Google Patents

温度感受性プラスミド

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JPH057491A
JPH057491A JP3245291A JP24529191A JPH057491A JP H057491 A JPH057491 A JP H057491A JP 3245291 A JP3245291 A JP 3245291A JP 24529191 A JP24529191 A JP 24529191A JP H057491 A JPH057491 A JP H057491A
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朗子 田中
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裕 松井
Katsuaki Sato
勝明 佐藤
Wataru Nakamatsu
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Abstract

(57)【要約】 【目的】コリネ型細菌において、染色体への遺伝子組み
込み株の検出法を開発し、染色体遺伝子の計画的な改変
による菌株改良や解析を可能にする。 【構成】コリネ型細菌内で自律増殖可能なプラスミドの
複製起点を３１−３７℃での増殖が不能になる温度感受
性変異型に改変した。この変異型プラスミドに、染色体
と相同性のあるＤＮＡ配列をもつ目的遺伝子断片を結合
した染色体組み込み用プラスミドを作製した。組み込み
用プラスミドをコリネ型細菌に導入、培養後、３１−３
７℃にて培養してプラスミドを除去し、染色体にプラス
ミドＤＮＡを組み込んだ遺伝子組み込み株を選択的に取
得することができた。更に遺伝子組換えにより遺伝子置
換株を取得することができた。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、アミノ酸などの有用物
質の発酵生産に用いられているコリネ型細菌の染色体遺
伝子を改変し、その遺伝的形質を変換する方法に関する
もので、アミノ酸などの発酵生産等に有用な微生物の育
種に利用可能なものである。
【０００２】
【従来の技術】コリネ型細菌の遺伝的形質を遺伝子工学
的手法で改変し、アミノ酸など有用物質の発酵生産に利
用しようという試みは、数多くなされている。しかし、
それらは皆、コリネ型細菌内で自律増殖できるプラスミ
ドをベクターとして利用したものである。（特開昭５８
−１９２９００，特開昭５８−２１６１９９等がある）
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】プラスミドは染色体外
で増殖・機能するので、プラスミドＤＮＡを用いて菌の
遺伝的性質を改変する場合、宿主である菌の染色体まで
その改変を及ぼすことができない。とくに、欠失、変異
等、宿主菌のＤＮＡの性質が問題となる場合には、計画
的な対策が立てられなかった。これまでは、変異処理剤
などで宿主菌を処理し、ランダムに変異が入った菌から
目的通り改変された株を選択する方策が用いられていた
が、大きな労力と困難を伴っていた。また、プラスミド
ＤＮＡを用いた場合は、プラスミドが不安定で脱落し、
十分な発現が得られない、または、目的遺伝子を含むプ
ラスミドが多コピー存在することにより、発現が過剰に
なり、菌の生育、物質生産に悪影響を与える、などの問
題点がしばしば生じていた。本発明は、染色体上の特定
の遺伝子を計画的に改変し、また、定まったコピー数の
遺伝子を安定に染色体上に固定することにより、これら
問題点を解決しようというものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記問題点
を解決すべく鋭意研究を行った結果、コリネ型細菌中で
自律増殖可能なプラスミドＤＮＡの複製起点を、培養温
度を上昇させることにより複製不能になる、温度感受性
変異型の複製起点に改変することに成功した。この温度
感受性複製起点をもつプラスミドに目的遺伝子を接続
し、コリネ型細菌に導入し、プラスミドを保持した菌株
を１０〜２７℃、好ましくは２０〜２５℃にて培養後、
３１〜３７℃、好ましくは３３〜３６℃にて培養してプ
ラスミドを除去し、染色体へ遺伝子が組み込まれた株を
選択する。この際、プラスミド上にある薬剤耐性遺伝子
などのマーカー遺伝子が染色体上に組み込まれ、プラス
ミドを保持しなくてもマーカー遺伝子の発現により薬剤
耐性などの形質を示すことで組み込み株の選択ができ
る。この段階では、染色体上に、ベクタープラスミドＤ
ＮＡと目的遺伝子が、同時に組み込まれているが、組み
込み株から薬剤耐性などのマーカー遺伝子の形質の除去
を指標にして、再び相同組換えを起こして、ベクター部
分が染色体上から除去された株を選択することができ
る。このとき、目的遺伝子と対応する宿主の染色体遺伝
子が同時に除去されプラスミドにて導入した遺伝子と置
き変わる遺伝子置換を起こすことが出来る。
【０００５】尚、染色体への遺伝子組み込み方法として
は、ここに示した方法と並んで、複製できないＤＮＡを
導入し、組換えを起こした株を選択する方法もあるが、
温度感受性プラスミドを用いる方法は、目的遺伝子をプ
ラスミド状で菌体内で増殖させ、また、プラスミドを保
持した菌株をも増殖させうるので、複製できないＤＮＡ
を導入して組換えを起こさせる方法よりはるかに高頻度
での組換えが可能である。よって、宿主の形質転換頻度
やＤＮＡの分解の影響も、組換え体の出現頻度にはほと
んど影響せず、幅広い宿主で同様に遺伝子組換えが行え
る一般性の高い方法である、という特徴がある。
【０００６】コリネ型グルタミン酸生産性細菌の野生株
の例としては次のようなものがあげられるが、これ以外
にも、ここで構築した温度感受性複製起点が機能し、プ
ラスミドが複製可能な菌なら、全て宿主として利用でき
る。
【０００７】
【実施例】以下、実施例に基づき、発明の内容を詳細に
説明する。
【０００８】（実施例１ 温度感受性複製起点の取得
と、遺伝子組み込み用プラスミドベクターの構築）
【０００９】＜ｐＨＫ４の構築＞まず、温度感受性複製
起点の取得の材料として、エシェリシア・コリと、コリ
ネ型細菌の双方の菌体中で自律増殖可能なプラスミドベ
クター、ｐＨＫ４を作成した。エシェリシア・コリとコ
リネ型細菌中の双方で自律増殖可能なプラスミドベクタ
ーは、いくつか報告がある。ここでは、ｐＡＪ１８４４
（特開昭５８−２１６１９９参照）と、ｐＨＳＧ２９８
（Ｓ．Ｔａｋｅｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ：Ｇｅｎｅ ６
１，６３−７４（１９８７）参照）から、新規のシャト
ルベクターｐＨＫ４を構築した。ｐＡＪ１８４４を制限
酵素Ｓａｕ３Ａｌで部分切断し、制限酵素ＢａｍＨｌで
完全切断したｐＨＳＧ２９８と連結した。連結後のＤＮ
Ａをブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ１
２０３６（ＦＥＲＭ−Ｐ７５５９）に形質転換した。形
質転換の方法は、電気パルス法（特開平２−２０７７９
１参照）を用いた。形質転換体の選択は、カナマイシン
２５μｇ／ｍｌを含むＭ−ＣＭ２Ｇプレート（グルコー
ス５ｇ、ポリペプトン１０ｇ、酵母エキス１０ｇ、Ｎａ
Ｃｌ５ｇ、ＤＬ−メチオニン０．２ｇ、寒天１５ｇを純
水１ｌに含む。ｐＨ７．２）にて行った。形質転換体か
らプラスミドＤＮＡを調製し、大きさの最も小さいもの
を選択し、ｐＨＫ４と命名した。このプラスミドは、エ
シェリシア・コリと、コリネ型細菌中で自律増殖でき、
宿主にカナマイシン耐性を付与する。
【００１０】＜温度感受性複製起点をもつプラスミドの
取得と遺伝子組み込み用プラスミドベクターの構築＞ｐ
ＨＫ４をｉｎ ｖｉｔｒｏでヒドロキシルアミン処理し
た。ヒドロキシルアミン処理は、公知の方法（Ｇ．Ｏ．
Ｈｕｍｐｈｅｒｙｓ ｅｔ ａｌ ：Ｍｏｌｅｃ．ｇｅ
ｎ．Ｇｅｎｅｔ．１４５，１０１−１０８（１９７６）
などがある）によった。処理後のＤＮＡを回収し、ブレ
ビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ１２０３６
株を形質転換した。形質転換体は、カナマイシン２５μ
ｇ／ｍｌを含むＭ−ＣＭ２Ｇプレート上で低温（２０
℃）にて選択した。出現した形質転換体を、同様の選択
プレートにレプリカし、高温（３４℃）にて培養した。
高温でカナマイシンを含む選択プレート上で生育できな
い株３株を取得した。この株から、プラスミドを回収
し、ｐＨＳ４、ｐＨＳ２２、ｐＨＳ２３と命名した。ｐ
ＨＳ４をプラスミドとして保持するエシェリシア・コリ
ＡＪ１２５７０（ＦＥＲＭ−Ｐ１１７６２）及びｐＨＳ
２２、ｐＨＳ２３を各々保持するエシェリシア・コリよ
りプラスミドを回収し、コリネ型細菌中での複製起点で
あるｐＡＪ１８４４由来の遺伝子断片を、制限酵素Ｂａ
ｍＨｌおよびＫｐｎｌで切り出し、エシェリシア・コリ
用のベクターであるｐＨＳＧ３９８（Ｓ．Ｔａｋｅｓｈ
ｉｔａｅｔ ａｌ：Ｇｅｎｅ ６１，６３−７４（１９
８７）参照）に接続した。この、ｐＨＳ４由来の複製起
点を有するプラスミドをｐＨＳＣ４，ｐＨＳ２２由来の
複製起点を有するプラスミドをｐＨＳＣ２２、ｐＨＳ２
３由来の複製起点を有するプラスミドをｐＨＳＣ２３と
命名した。また、同様な方法でｐＨＫ４よりコリネ型細
菌中での複製起点をｐＨＳＧ３９８に移し、ｐＨＣ４を
作製した。ｐＨＣ４、ｐＨＳＣ４、ｐＨＳＣ２２、ｐＨ
ＳＣ２３は、コリネ型細菌、及びエシェリシア・コリ中
で自律増殖して、宿主にクロラムフェニコール耐性を付
与する。また、ｐＨＳＣ４、ｐＨＳＣ２２、ｐＨＳＣ２
３のコリネ型細菌で機能する複製起点が温度感受性変異
型であることを確認した。ｐＨＳＣ４をプラスミドとし
て保持するエシェリシア・コリＡＪ１２５７１（ＦＥＲ
Ｍ−Ｐ１１７６３）、及びｐＨＳＣ２２をプラスミドと
して保持するエシェリシア・コリＡＪ１２６１５（ＦＥ
ＲＭ−Ｐ１２２１３）、ｐＨＳＣ２３をプラスミドとし
て保持するエシェリシア・コリＡＪ１２６１６（ＦＥＲ
Ｍ−Ｐ１２２１４）、ｐＨＣ４をプラスミドとして保持
するエシェリシア・コリＡＪ１２６１７（ＦＥＲＭ−Ｐ
１２２１５）より、プラスミドを調製し、ブレビバクテ
リウム・ラクトファーメンタムＡＪ１２０３６に導入
し、非選択培地での高温（３４℃）培養によるプラスミ
ドの保持性の変化を観察した。ｐＨＳＣ４、ｐＨＳＣ２
２、ｐＨＳＣ２３のＡＪ１２０３６中での複製は、高温
培養で、ほぼ完全に阻止された。（図１−１，２，３，
４）
【００１１】＜温度感受性複製起点の塩基配列の決定＞
野生型の複製起点をもつプラスミドｐＨＣ４、および温
度感受性型の複製起点をもつプラスミドｐＨＳＣ４、ｐ
ＨＳＣ２２、ｐＨＳＣ２３のコリネ型細菌中での複製起
点部分の塩基配列を決定した。塩基配列決定の方法は、
サンガーらの方法（Ｆ．Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ ：
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７４，５４６
３（１９７７）などがある）によった。その結果、野生
型複製起点と、温度感受性変異型複製起点の間には、２
〜４個の塩基置換があることが判明した。ｐＨＳＣ４に
含まれるコリネ型細菌中で機能する温度感受性複製起点
部分の塩基配列を配列表１に、ｐＨＳＣ２２に含まれる
コリネ型細菌中で機能する温度感受性複製起点部分の塩
基配列を配列表２に、ｐＨＳＣ２３に含まれるコリネ型
細菌中で機能する温度感受性複製起点部分の塩基配列を
配列表３に、ｐＨＣ４に含まれるコリネ型細菌中で機能
する野生型の複製起点部分の塩基配列を配列表４に示
す。温度感受性複製起点部分の変異点はそれぞれ以下の
通りである。ｐＨＳＣ４については、配列上の１５４３
番目のＧがＡに変異しており、１５４６番目のＧがＡに
変異している。ｐＨＳＣ２２については、配列上の６８
３番目のＣがＴに変異しており、１１７２番目のＣがＴ
に変異しており、１６１５番目のＣがＴに変異してい
る。ｐＨＳＣ２３については、配列上の７５６番目のＧ
がＡに変異しており、１５６１番目のＧがＡに変異して
おり、１６６８番目のＣがＴに変異しており、１６８５
番目のＣがＴに変異している。
【００１２】（実施例２ 遺伝子組み込み用プラスミド
ベクターを用いたブレビバクテリウム・ラクトファーメ
ンタム染色体遺伝子へのプラスミド上のＤＮＡの組み込
みと、染色体上への遺伝子組み込み）チロシンおよびフ
ェニルアラニンによるフィードバック阻害が実質的に解
除されたブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの
３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロソネート−７−ホ
スフェートシンターゼ遺伝子（以下、「ＤＳ遺伝子」と
記す）は、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
の野生型の株に、フェニルアラニンのアナログであるｍ
−フロロフェニルアラニンの耐性と、フェニルアラニン
およびチロシンの生産能を付与することが知られている
（特開昭６１−１２４３７５参照）。この性質を指標と
して、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム野生
型株の染色体へのＤＳ遺伝子の相同組換えによる導入を
行った。
【００１３】＜遺伝子組み込み用プラスミドの作製＞チ
ロシンおよびフェニルアラニンによるフィードバック阻
害が実質的に解除されたＤＳ遺伝子を含むプラスミドで
あるｐＡＲ−１（特開昭６１−１２４３７５参照）をＳ
ａｕ３Ａｌにて部分分解し、制限酵素ＢａｍＨｌで完全
分解したｐＨＫ４と接続する。これをブレビバクテリウ
ム・ラクトファーメンタムＡＪ１２０３６株に電気パル
ス法にて導入した。５００μｇ／ｍｌのｍ−フルオロフ
ェニルアラニンを含む最少培地プレート（グルコース２
０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４５ｇ、尿素２ｇ、ＫＨ２ＰＯ
４１ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．５ｇ、ＦｅＳＯ４・
７Ｈ２Ｏ１０ｍｇ、ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ１０ｍｇ、ビ
オチン５０μｇ、サイアミン塩酸塩２０００μｇ、寒天
１５ｇを水１ｌに含む。ｐＨ６．６）上で形質転換体を
選択した。形質転換体よりプラスミドを調製し、大きさ
の最も小さいものを選択した。このプラスミドを制限酵
素ＢａｍＨｌ及びＳａｌｌで切断し、ＤＳ遺伝子を含む
１．９キロベースの断片を回収した。この断片を、Ｂａ
ｍＨｌおよびＳａｌｌで切断したｐＨＳＣ４と接続し
た。作製したプラスミドを、ｐＨＳＣ４Ｄと命名した。
【００１４】＜組み込み用プラスミドのブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタムへの導入と染色体への組み
込み株の選択＞ｐＨＳＣ４Ｄをプラスミドとして含むエ
シェリシア・コリＡＪ１２５７２（ＦＥＲＭ−Ｐ１１７
６４）よりプラスミドｐＨＳＣ４Ｄを調製し、ブレビバ
クテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ１２０３６株に
電気パルス法で導入した。形質転換体の選択は、５μｇ
／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＭ−ＣＭ２Ｇプレ
ートで、２０℃にて行った。導入後、得られた株をＭ−
ＣＭ２Ｇプレート培地にて培養した後、５μｇ／ｍｌの
クロラムフェニコールを含むＭ−ＣＭ２Ｇプレートに、
プレートあたり１０３〜１０５ｃｆｕとなるよう希釈
し、塗布した。プレートを３４℃にて培養した。温度感
受性プラスミドを保持した株は、この温度ではプラスミ
ドの複製が阻害されるため、クロラムフェニコール感受
性となり、コロニーを形成できないが、染色体にプラス
ミドＤＮＡを組み込んだ株は、コロニーを形成するた
め、選択することができた。相同的な組換えにより、宿
主染色体のＤＳ遺伝子の近傍に、ベクタープラスミド由
来の変異型ＤＳ遺伝子が組み込まれていることを、サザ
ンハイブリダイゼーション、および組み込み菌のｍ−フ
ロロフェニルアラニンの耐性により確認した。
【００１５】（実施例３ 染色体組み込み菌よりの、遺
伝子置換株の取得）相同的組換えにより、染色体上にＤ
Ｓ遺伝子を組み込んだＡＪ１２５７３株（ＦＥＲＭ−Ｐ
１１７６５）より、まず、クロラムフェニコール感受性
株を取得した。組み込み株をＭ−ＣＭ２Ｇプレートに希
釈、塗布し、３４℃で培養する。コロニー形成後、５μ
ｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＭ−ＣＭ２Ｇプ
レートにレプリカし、３４℃で培養する。このとき、ク
ロラムフェニコール感受性になった株を取得した。クロ
ラムフェニコール感受性になった株から、クロラムフェ
ニコール感受性かつｍ−フロロフェニルアラニンに耐性
な株を選択した。クロラムフェニコール感受性はベクタ
ープラスミドが染色体上から組換えにより脱落したこと
を、ｍ−フロロフェニルアラニン耐性はプラスミドから
導入した変異型のＤＳ遺伝子が染色体上になお残ってい
ることを意味する。すなわち、相同的組換えにより、染
色体から遺伝子が脱落する際、プラスミドにより導入し
た変異型の遺伝子は染色体上に残り、元来染色体上にあ
った野生型の遺伝子が、ベクタープラスミドと共に脱落
し、遺伝子置換が起こったことを意味する。
【００１６】（実施例４ 染色体への変異型ＤＳ遺伝子
組み込み菌によるチロシンおよびフェニルアラニンの生
産）変異型ＤＳ遺伝子を、温度感受性ベクターを用いて
染色体へ組み込んだＡＪ１２５７３株（ＦＥＲＭ−Ｐ１
１７６５）、及び遺伝子置換により変異型ＤＳ遺伝子が
染色体上に固定されたＡＪ１２５７４株（ＦＥＲＭ−Ｐ
１１７６６）により、チロシン、およびフェニルアラニ
ンの生産を行った。各々の株を、Ｍ−ＣＭ２Ｇプレート
培地にてｒｅｆｒｅｓｈした後、フェニルアラニン生産
培地（グルコース１３０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４１０
ｇ、ＫＨ２ＰＯ４１ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ１ｇ、フ
マル酸１２ｇ、酢酸３ｍｌ、大豆蛋白酸加水分解物「味
液」５０ｍｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ１０ｍｇ、ＭｎＳ
Ｏ４・４Ｈ２Ｏ１０ｍｇ、ビオチン５０μｇ、サイアミ
ン塩酸塩２０００μｇ及びＣａＣＯ３５０ｇを純水１ｌ
に含む。ｐＨ７．０）に植菌し、３１．５℃にて４８時
間培養した。培養後の培養液中のチロシン、フェニルア
ラニン生成量は表１に示す通りである。
【００１７】
【表１】
【００１８】（実施例５ ブレビバクテリウム・ラクト
ファーメンタム野生株染色体へのフィードバック阻害解
除型アスパルテートキナーゼ遺伝子の組み込みと組み込
み株を用いたリジン生産）
【００１９】＜遺伝子組み込み用プラスミドの作製＞リ
ジンおよびスレオニンによるフィードバック阻害が実質
的に解除したアスパルトキナーゼ遺伝子（以下「ＡＫ遺
伝子」と記す）をコリネバクテリウム・グルタミカム、
リジン生産菌ＡＪ３４６３（ＦＥＲＭ−Ｐ１９８７）よ
り取得した。方法は、ＡＪ３４６３の染色体ＤＮＡを、
制限酵素Ｓａｕ３Ａｌで部分分解し、ＢａｍＨｌで完全
分解したｐＨＳＣ４と接続した。このＤＮＡを、ＡＪ１
２０３６株に形質転換した。形質転換体の選択は、５μ
ｇ／ｍｌのクロラムフェニコール、１００ｍｇ／ｄｌの
Ｌ−スレオニンと、３０００μｇ／ｍｌのＳ−（２−ア
ミノエチル）−Ｌ−システイン（以下「ＡＥＣ」と記
す）を含む最少培地にて、２０℃にて選択した。形質転
換体よりプラスミドを調製し、ｐＨＳＣ４ＡＥと命名し
た。
【００２０】＜阻害解除型ＡＫ遺伝子のブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタム染色体への組み込みと遺伝
子置換株の取得＞プラスミドｐＨＳＣ４ＡＥにて、ブレ
ビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８
６９株を形質転換した。形質転換体の選択は２０℃にて
行った。形質転換体を、Ｍ−ＣＭ２Ｇプレートにプレー
ト当り１０３〜１０５ｃｆｕとなるよう滅菌水に希釈
し、塗布した。３４℃にて培養し、コロニーを形成する
ものを、遺伝子組み込み株として選択した。遺伝子組込
み株より再度クロラムフェニコール感受性株を取得し、
その中よりクロラムフェニコール感受性かつＡＥＣ耐性
を示す株を遺伝子置換株として選択した。
【００２１】＜遺伝子置換株を用いたリジン生産＞染色
体上に阻害解除型のＡＫ遺伝子を遺伝子置換により組み
込んだブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ
１２５７５株（ＦＥＲＭ−Ｐ１１７７２）および、その
親株であるＡＴＣＣ１３８６９株を、リジン生産培地
（グルコース１００ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４５５ｇ、Ｋ
Ｈ２ＰＯ４１ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ１ｇ、大豆蛋白
酸加水分解物「豆濃」５０ｍｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ
１０ｍｇ、ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ１０ｍｇ、ニコチン酸
アミド５ｍｇ、及びＣａＣＯ３５０ｇを純水１ｌに含
む。ｐＨ８．０）に植菌し、３１．５℃にて４８時間培
養した。培養後の培養液中のリジン生成量は表２に示す
通りである。
【００２２】
【表２】
【００２３】
【発明の効果】以上のように、この発明によれば、コリ
ネ型細菌中で自律増殖可能なプラスミドＤＮＡの複製起
点を培養温度を上昇させることにより複製不能にするこ
とで、染色体上の特定の遺伝子を計画的に改変し、又定
まったコピー数の遺伝子を安定に染色体上に固定すると
いう効果を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、薬剤を含まないＭ−ＣＭ２Ｇ液体培
地にて、高温（３４℃）にて培養した場合の、温度感受
性変異型複製起点を持つプラスミドｐＨＳＣ４を保持す
るＡＪ１２０３６株のプラスミド保持性の推移を示した
ものである。プラスミド保持性は、液体培養を希釈後、
クロラムフェニコールを含むＭ−ＣＭ２Ｇプレートと、
薬剤を含まないＭ−ＣＭ２Ｇプレートに塗布し、低温
（２０℃）にて形成したコロニー数より、プラスミド保
持菌と、生菌数を計測、比較することにより測定した。
【図２】 図２では上と同じようにして、ｐＨＳＣ２２
のプラスミド保持性の推移を示したものである。
【図３】 図３では上と同じようにして、ｐＨＳＣ２３
のプラスミド保持性の推移を示したものである。（以上
３つのプラスミドは温度感受性型複製起点をもつプラス
ミドである。）
【図４】 図４はｐＨＣ４（野生型複製起点をもつプラ
スミド）を保持するＡＪ１２０３６株のプラスミド保持
性の推移を示したものである。
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：２９５８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源 生物名：コリネバクテリムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ） 株名：ＡＴＣＣ １３０５８ 存在位置：１２９９．．２６６４ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列番号：２ 配列の長さ：２９５８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源 生物名：コリネバクテリムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ） 株名：ＡＴＣＣ １３０５８ 存在位置：１２９９．．２６６４ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列番号：３ 配列の長さ：２９５８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源 生物名：コリネバクテリムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ） 株名：ＡＴＣＣ １３０５８ 存在位置：１２９９．．２６６４ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列番号：４ 配列の長さ：２９５８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖 起源 生物名：コリネバクテリムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ） 株名：ＡＴＣＣ １３０５８ 存在位置：１２９９．．２６６４ 特徴を決定した方法：Ｅ
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 13/22 Ｃ 6977−4Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｐ 13/22 Ｃ１２Ｒ 1:13） (72)発明者 松井 裕 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社中央研究所内 (72)発明者 佐藤 勝明 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社中央研究所内 (72)発明者 中松 亘 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社中央研究所内

Claims (15)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 下記の性質を示す温度感受性複製起点を
    有するプラスミド。 （１）コリネ型細菌中で自律増殖でき、かつコリネ型細
    菌中で保持される （２）３１−３７℃で菌体を培養した時に菌体内でのプ
    ラスミドの増殖が阻害されると共に菌体内からプラスミ
    ドが除去される
  2. 【請求項２】 プラスミドがコリネバクテリウム・グル
    タミカム内に天然に存在するプラスミドｐＨＭ１５１９
    由来の複製起点を有するシャトルベクターｐＨＫ４を温
    度感受性となるよう改変して得たものである請求項１記
    載のプラスミド。
  3. 【請求項３】 配列表の配列番号１に示される塩基配列
    を有するプラスミドｐＨＳ４又はｐＨＳＣ４である請求
    項１又は２記載のプラスミド。
  4. 【請求項４】 配列表の配列番号２に示される塩基配列
    を有するプラスミドｐＨＳ２２又はｐＨＳＣ２２である
    請求項１又は２記載のプラスミド。
  5. 【請求項５】 配列表の配列番号３に示される塩基配列
    を有するプラスミドｐＨＳ２３又はｐＨＳＣ２３である
    請求項１又は２記載のプラスミド。
  6. 【請求項６】 請求項１乃至５記載のプラスミドに、コ
    リネ型細菌の染色体上に存在する遺伝子配列と相同な配
    列を有する遺伝子断片を接合したものであることを特徴
    とする相同組換え法による染色体への遺伝子組換え用プ
    ラスミド。
  7. 【請求項７】 プラスミドがプラスミドｐＨＳＣ４であ
    り、かつ遺伝子断片がブレビバクテリウム・ラクトファ
    ーメンタム由来のチロシン及びフェニルアラニンによる
    フィードバック阻害が解除された３−デオキシ−Ｄ−ア
    ラビノヘプツロソネート−７−ホスフェートシンターゼ
    遺伝子である請求項６記載のプラスミド。
  8. 【請求項８】 請求項６又は７記載のプラスミドをコリ
    ネ型細菌中に保持させた後、３１−３７℃で培養するこ
    とにより、該プラスミドが除去され、かつ相同な配列を
    有する遺伝子断片が染色体上に組み込まれた株を選択す
    ることを特徴とするコリネ型細菌の遺伝子組み込み方
    法。
  9. 【請求項９】 請求項８記載の方法により調製された形
    質転換体。
  10. 【請求項１０】 請求項９記載の形質転換体から組み込
    ませた遺伝子断片を維持させたまま、染色体上に元来存
    在し、かつ組み込ませた該遺伝子断片に相同な配列を有
    する遺伝子及びベクタープラスミドＤＮＡを相同組換え
    法により除去する方法。
  11. 【請求項１１】 形質転換体がブレビバクテリウム・ラ
    クトファーメンタムであり、かつ組み込ませた遺伝子が
    チロシン及びフェニルアラニンによるフィードバック阻
    害から解除された３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロ
    ネート−７−ホスフェートシンターゼ遺伝子である請求
    項１０記載の方法。
  12. 【請求項１２】 形質転換体がブレビバクテリウム・ラ
    クトファーメンタムであり、かつ組み込ませた遺伝子が
    リジン及びスレオニンのよるフィードバック阻害から解
    除されたアスパルトキナーゼ遺伝子である請求項１０記
    載の方法。
  13. 【請求項１３】 請求項１０乃至１２項記載の方法によ
    り調製されたコリネ型細菌。
  14. 【請求項１４】 請求項１３記載の細菌を培養して、培
    地中に目的とするアミノ酸を生産させ、該アミノ酸を採
    取することを特徴とするアミノ酸の製造法。
  15. 【請求項１５】 アミノ酸がチロシン、フェニルアラニ
    ン叉はリジンである請求項１４記載の製造法。
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