WO2013129001A1 - 3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸産生能を有するエシェリヒア・コリ - Google Patents

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義教 田島
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    • C12Y401/99Other Carbon-Carbon Lyases (1.4.99)

Definitions

  • Aminohydroxybenzoic acid is useful as an intermediate for dyes, agricultural chemicals, pharmaceuticals and other organic synthetic products, and as a monomer for high-performance heat-resistant polymer polybenzoxazole.
  • 3-Amino-4-hydroxybenzoic acid (3,4-AHBA) is composed of dihydroxyacetone phosphate (DHAP) and aspartic acid semialdehyde (ASA) as substrates, and C4 compounds having amino groups and C3 or C4 compounds. It is biosynthesized in two steps by both GriI, an enzyme that catalyzes the carbon-carbon bond reaction, and GriH, an enzyme that catalyzes cyclization of the C7 compound or cyclization accompanied by decarboxylation of the C8 compound.
  • GriI an enzyme that catalyzes the carbon-carbon bond reaction
  • GriH an enzyme that catalyzes cyclization of the C7 compound or cyclization accompanied by decarboxylation of the C8 compound.
  • Non-Patent Document 3 discloses catalyzing acetylation of an aromatic amino group as a function of the N-hydroxyarylamine O-acetyltransferase gene (nhoA) derived from Escherichia coli.
  • Non-Patent Document 4 describes E.I. E. coli BAP1 strain produces an N-acetylated product (3,5-AcAHBA) as a byproduct of 3,5-AHBA (structural isomer of 3,4-AHBA); It is also disclosed that NhoA is not considered to be a major factor in N-acetylation of 3,5-AHBA because 3,5-AcAHBA is also produced as a by-product in E. coli BAP1 nhoA gene-deficient strain (MAR1 strain). ing.
  • Escherichia which is a bacterium widely used in a production process by a biosynthesis method, uses aminohydroxybenzoic acids such as 3-amino-4-hydroxybenzoic acid.
  • -It aims at providing the method of manufacturing simply and cheaply using a coil.
  • the Escherichia coli according to [3], wherein the DNA encoding the protein having an activity to produce 3-amino-4-hydroxybenzoic acid includes a griI gene and a griH gene.
  • the present invention provides Escherichia coli, a bacterium having the ability to produce 3-amino-4-hydroxybenzoic acid.
  • the production of acetylated by-product (3,4-AcAHBA) can be suppressed.
  • N-hydroxyarylamine O-acetyltransferase N-hydroxyarylamine O-acetyltransferase
  • the bacterium of the present invention is modified so as to decrease the activity of N-hydroxyarylamine O-acetyltransferase (NhoA). Production of acetylated by-products can be suppressed.
  • NhoA activity is N-hydroxyarylamine O-acetyltransferase activity.
  • 3,4-AHBA is converted to 3-acetylamino- It refers to the activity of producing 4-hydroxybenzoic acid (3,4-AcAHBA).
  • Modified to reduce NhoA activity means that the NhoA activity is lower than the specific activity of an unmodified strain, for example, a wild-type Escherichia coli.
  • the NhoA activity is preferably reduced to 50% or less per cell, preferably 30% or less, more desirably 10% or less per cell as compared to the unmodified strain.
  • “Decrease” includes the case where the activity is completely lost.
  • the Escherichia coli of the present invention only needs to have a lower NhoA activity than the wild-type strain or the unmodified strain, but it is more desirable that the accumulation of 3,4-AHBA is further improved compared to these strains.
  • the protein encoding the nhoA gene includes an amino acid sequence including substitution, deletion, insertion or addition of one or several amino acids at one or a plurality of positions in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and Examples include proteins having NhoA activity.
  • “several” differs depending on the position and type of the amino acid residue in the three-dimensional structure of the protein, but preferably 1 to 50, more preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, Particularly preferred is 1 to 5.
  • Such amino acid substitutions, deletions, insertions or additions also include those caused by naturally occurring mutations (mutants or variants) based on individual differences in the microorganisms carrying the nhoA gene.
  • the nhoA gene may also be a DNA that hybridizes with a base sequence complementary to the base sequence of SEQ ID NO: 23 under stringent conditions and encodes a protein having NhoA activity.
  • stringent conditions refers to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed.
  • polynucleotides having high homology eg, identity or similarity
  • polynucleotides having high homology for example, 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, even more preferably 95%, particularly preferably This is a condition in which polynucleotides having a homology of 98% or more hybridize to each other and polynucleotides having lower homology do not hybridize to each other.
  • such conditions include hybridization at about 45 ° C. in 6 ⁇ SSC (sodium chloride / sodium citrate), followed by 50 ⁇ 0.2 ⁇ SSC in 0.1% SDS. One or more washings at ⁇ 65 ° C. may be mentioned.
  • SSC sodium chloride / sodium citrate
  • bacterium of the present invention comprises dihydroxyacetone phosphate (DHAP) and aspartate semialdehyde (ASA).
  • DHAP dihydroxyacetone phosphate
  • ASA aspartate semialdehyde
  • Such modification can be achieved, for example, by transforming the bacterium of the present invention with a recombinant vector incorporating a DNA encoding a protein having an activity of generating 3,4-AHBA from DHAP and ASA.
  • Examples of a gene encoding a protein having an enzyme activity that catalyzes the cyclization of a C7 compound obtained by forming a carbon-carbon bond between DHAP and ASA include a griH gene derived from Streptomyces griseus or a griH gene Homologs (the griH gene and the griH gene homolog may be simply referred to as the griH gene).
  • the griH gene homolog is a gene that is derived from another microorganism, shows high homology with the gene derived from Streptomyces griseus and encodes a protein having 3-amino-4-hydroxybenzoate synthase activity. Such genes can be searched by performing a Blast search.
  • the GriH homologue is 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more, relative to SEQ ID NO: 7 or 16, which is the amino acid sequence of the protein encoding the griH gene.
  • a protein having an identity of 98% or 99% or more and having 3-amino-4-hydroxybenzoate synthase activity For example, sequence number 23, 25, 27, 29, 31, 33 and 35 of patent document 2 are mentioned.
  • the griH gene homologue is 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more, relative to SEQ ID NO: 8 or 17, which is the base sequence of the griH gene. It is particularly preferable to encode a protein having 98% or 99% identity and having 3-amino-4-hydroxybenzoate synthase activity. For example, sequence number 22, 24, 26, 28, 30, 32 or 34 of patent document 2 is mentioned.
  • Patent Document 2 describes the alignment of amino acid sequences of the griI gene homolog (FIGS. 1 and 2 of Patent Document 2), the alignment of amino acid sequences of the griH gene homolog (FIGS.
  • sequence number 9, 11, 13, 15, 17, 19, and 21 of patent document 2 are mentioned.
  • the protein encoding the griH gene include substitution, deletion, insertion of one or several amino acids at one or a plurality of positions in the amino acid sequence (eg, SEQ ID NO: 7 or 16) of the protein encoding the griH gene.
  • a protein having an amino acid sequence including an addition and the like and having 3-amino-4-hydroxybenzoate synthase activity is desirable.
  • sequence number 23, 25, 27, 29, 31, 33 and 35 of patent document 2 are mentioned.
  • “several” differs depending on the position and type of the amino acid residue in the three-dimensional structure of the protein, but preferably 1 to 50, more preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, Particularly preferred is 1 to 5.
  • amino acid substitution, deletion, insertion, or addition may be caused by naturally occurring mutations (mutant or variant) such as cases based on individual differences or species differences of microorganisms that retain the griI or griH gene. It also includes what happens.
  • the substitution is preferably a conservative substitution, which is a neutral mutation that does not change functionally. The conservative mutation is as described above.
  • griI and griH genes and their homologous genes express a protein that improves 3,4-AHBA production ability is expressed as follows. This can be confirmed by introducing into a bacterium or the like having a gene encoding a kinase and examining whether the 3,4-AHBA production activity is improved. In that case, for example, the method of Suzuki et al. [J. Bio. Chem. , 281, 823-833 (2006)], the effect can be more clearly verified by quantifying 3,4-AHBA by reverse phase chromatography.
  • a recombinant vector that can be used in the present invention can be obtained by introducing a desired gene into an expression vector.
  • griI and griH when both griI and griH are used, as long as they are included in the transformant in an expressible state, they may be mounted on separate recombinant vectors and used for transformation, or griI and griH may be used appropriately. May be linked by a small spacer, mounted on the same recombinant vector, and used for transformation.
  • griI and griH may be genes derived from the same microorganism or genes derived from different microorganisms. If the genes are derived from the same microorganism and griI and griH are present at close positions on the chromosome, the DNA may be cut out at a site containing both griI and griH and mounted on a vector.
  • the bacterium of the present invention is modified so as to have the ability to produce 3-amino-4-hydroxybenzoic acid and to reduce the activity of N-hydroxyarylamine O-acetyltransferase (NhoA).
  • NhoA N-hydroxyarylamine O-acetyltransferase
  • the transformant of the present invention is transformed with a recombinant vector incorporating a DNA encoding a protein having an activity of generating 3-amino-4-hydroxybenzoic acid from dihydroxyacetone phosphate and aspartic acid semialdehyde. Is preferred.
  • Escherichia coli with enhanced activity of mutant AKIII released from feedback inhibition can also be obtained by transforming Escherichia coli using a plasmid containing the mutant AKIII gene released from feedback inhibition.
  • Transformation of Escherichia coli with a recombinant vector incorporating a DNA encoding a protein having an activity of generating 3-amino-4-hydroxybenzoic acid from dihydroxyacetone phosphate and aspartic acid semialdehyde is known in the art. It can be performed according to the method. For example, a protoplast method (Gene, 39, 281-286 (1985)), an electroporation method (Bio / Technology, 7, 1067-1070 (1989)), or the like can be used.
  • transforming to release feedback inhibition of AKIII either transformation for imparting 3,4-AHBA production activity or transformation for releasing feedback inhibition of AKIII may be performed first. .

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Abstract

 本発明は、3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸などのアミノヒドロキシ安息香酸類を、生合成法による製造プロセスに汎用されている細菌であるエシェリヒア・コリを利用することにより、簡便安価に製造する方法を提供する。具体的には、本発明は、3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸産生能を有するエシェリヒア・コリであって、N-ヒドロキシアリールアミン O-アセチルトランスフェラーゼ(NhoA)の活性が低下するように改変されたエシェリヒア・コリ、およびこのようなエシェリヒア・コリを用いる3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸類の製造方法などを提供する。

Description

3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸産生能を有するエシェリヒア・コリ
 本発明は、3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸産生能を有するエシェリヒア・コリ、およびそれを用いたアミノヒドロキシ安息香酸類の製造方法などに関する。
 アミノヒドロキシ安息香酸類は、染料、農薬、医薬品その他有機合成品の中間体や、高性能耐熱性高分子ポリベンゾオキサゾールのモノマーとして有用である。3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸(3,4-AHBA)は、ジヒドロキシアセトンリン酸(DHAP)とアスパラギン酸セミアルデヒド(ASA)を基質として、アミノ基を持ったC4化合物とC3あるいはC4化合物との炭素-炭素結合反応を触媒する酵素であるGriI、ならびにC7化合物の環化あるいはC8化合物の脱炭酸を伴った環化を触媒する酵素であるGriHの双方によって2段階で生合成される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 本発明に関連する先行技術としては、以下がある。
 特許文献1には、griIおよびgriHを導入したストレプトマイセス・グリセウス(Streptomyces griseus)を用いる3,4-AHBAの製造方法が開示されている。特許文献1はまた、3,4-AHBAの副生物である3-アセチルアミノ-4-ヒドロキシ安息香酸(3,4-AcAHBA)が生成すること、および3,4-AcAHBAを脱アセチル化処理して3,4-AHBAを生成することを開示している。3,4-AcAHBAの具体的な脱アセチル化処理方法としては、水酸化ナトリウムなどの強塩基や塩酸などの強酸の使用を例示しており、強塩基や強酸を使用しなければならないという課題がある。
 特許文献2には、griIおよびgriHを導入したコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)を用いることにより3,4-AHBAが生成されることが開示されている。
 非特許文献1には、griIおよびgriHのエシェリヒア・コリ(Escherichia coli)への導入により3,4-AHBAおよび3,4-AcAHBAが生成されることが開示されている。
 非特許文献2には、ストレプトマイセス・グリセウスにおいてアリールアミン N-アセチルトランスフェラーゼ遺伝子(natA)を欠失させると、培養中に3,4-AcAHBAが生成されなくなることが開示されている。
 非特許文献3には、エシェリヒア・コリ由来のN-ヒドロキシアリールアミン O-アセチルトランスフェラーゼ遺伝子(nhoA)の機能として、芳香族アミノ基に対するアセチル化を触媒することが開示されている。一方、非特許文献4には、E.coli BAP1株が3,5-AHBA(3,4-AHBAの構造異性体)の副生物としてN-アセチル化体(3,5-AcAHBA)を生成すること、ならびにE.coli BAP1のnhoA遺伝子欠損株(MAR1株)においても、3,5-AcAHBAが副生するため、NhoAが3,5-AHBAのN-アセチル化の主要な要因ではないと考えられることが開示されている。
特開2004-283163号公報 国際公開第2010/005099号
J.Biol.Chem.281(2006),36944-36951 J.Bacteriol.189(2007),2155-2159 Biochim.Biophys.Acta.1475(2000),10-16 J.Antibiot.,vol.59(2006),p.464
 本発明は、かかる従来技術の現状に鑑みてなされたものであり、3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸などのアミノヒドロキシ安息香酸類を、生合成法による製造プロセスに汎用されている細菌であるエシェリヒア・コリを利用することにより、簡便安価に製造する方法を提供することを目的とするものである。
 本発明者らは、鋭意検討した結果、エシェリヒア・コリにおける3,4-AHBAからの3,4-AcAHBAの副生にはnhoAが関与すること、したがって、NhoA活性が低下するように改変されたエシェリヒア・コリの使用により、アセチル化されていない3,4-AHBAを大量生産できることを見出し、本発明を完成するに至った。
 すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔1〕ジヒドロキシアセトンリン酸とアスパラギン酸セミアルデヒドから3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸を生成する活性が増大するように改変された3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸産生能を有するエシェリヒア・コリであって、N-ヒドロキシアリールアミン O-アセチルトランスフェラーゼ(NhoA)活性が低下するように改変されたエシェリヒア・コリ。
〔2〕染色体上のnhoA遺伝子が変異または欠損されたことによりNhoA活性が低下した、〔1〕に記載のエシェリヒア・コリ。
〔3〕前記3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸産生能が、ジヒドロキシアセトンリン酸とアスパラギン酸セミアルデヒドから3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸を生成する活性を有するタンパク質をコードするDNAを組み込んだ組換えベクターで形質転換されることにより付与された、〔1〕または〔2〕に記載のエシェリヒア・コリ。
〔4〕前記3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸を生成する活性を有するタンパク質が、GriIおよびGriHである、〔3〕に記載のエシェリヒア・コリ。
〔5〕前記GriIが、下記(A)~(C)のいずれか一つに記載のタンパク質であり、かつ、前記GriHが、下記(D)~(F)のいずれか一つに記載のタンパク質である、〔4〕に記載のエシェリヒア・コリ:
(A)配列番号5または配列番号14に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(B)上記(A)に示すアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質;
(C)上記(A)に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質;
(D)配列番号7または配列番号16に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(E)上記(D)に示すアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するタンパク質;
(F)上記(D)に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するタンパク質。
〔6〕前記3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸を生成する活性を有するタンパク質をコードするDNAが、griI遺伝子およびgriH遺伝子を含む、〔3〕に記載のエシェリヒア・コリ。
〔7〕griI遺伝子が、下記(a)~(c)のいずれか一つに記載のDNAであり、かつ、griH遺伝子が、下記(d)~(f)のいずれか一つに記載のDNAである、[6]に記載のエシェリヒア・コリ:
(a)配列番号6または配列番号15の塩基配列を含むDNA;
(b)上記(a)に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA;
(c)上記(a)に示す塩基配列に対して70%以上の同一性を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するDNA;
(d)配列番号8または配列番号17の塩基配列を含むDNA;
(e)上記(d)に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA;
(f)上記(d)に示す塩基配列に対して70%以上の同一性を有し、かつ、3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するDNA。
〔8〕griI遺伝子およびgriH遺伝子が放線菌由来である、〔7〕に記載のエシェリヒア・コリ。
〔9〕griI遺伝子およびgriH遺伝子がストレプトマイセス属由来である、〔7〕に記載のエシェリヒア・コリ。
〔10〕griI遺伝子およびgriH遺伝子がストレプトマイセス・グリセウス由来である、〔7〕に記載のエシェリヒア・コリ。
〔11〕griI遺伝子およびgriH遺伝子がストレプトマイセス・ムラヤマエンシス由来である、〔7〕に記載のエシェリヒア・コリ。
〔12〕フィードバック阻害を解除した変異型アスパルトキナーゼIIIをコードする遺伝子を有する、〔1〕~〔11〕のいずれかに記載のエシェリヒア・コリ。
〔13〕〔1〕~〔12〕のいずれかに記載のエシェリヒア・コリを培養する工程を含む、3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸類の製造方法。
〔14〕〔13〕に記載の方法により製造した3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸類をポリマー化する工程を含む、3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸類を構成単位として含むポリマーの製造方法。
〔15〕前記ポリマーが、ポリベンゾオキサゾールポリマーである、〔14〕の方法。
 本発明によれば、3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸などのアミノヒドロキシ安息香酸類を、簡便安価に製造することができる。
図1は、(a)エシェリヒア・コリBW25113株の培養上清液、(b)エシェリヒア・コリBW25113ΔnhoA株の培養上清液および(c)3,4-AHBA標準品の、逆相カラムクロマトグラフィーでの分析結果を示す図である。
 本発明は、3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸産生能を有する細菌、エシェリヒア・コリを提供する。本発明の細菌では、アセチル化された副生物(3,4-AcAHBA)の生成が抑制され得る。
<1>N-ヒドロキシアリールアミン O-アセチルトランスフェラーゼ(NhoA)の活性を低下させる改変
 本発明の細菌は、N-ヒドロキシアリールアミン O-アセチルトランスフェラーゼ(NhoA)活性を低下させるように改変することにより、アセチル化された副生物の生成が抑制され得る。NhoA活性とは、N-ヒドロキシアリールアミン O-アセチルトランスフェラーゼ活性であり、3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸(3,4-AHBA)との関係では、3,4-AHBAから3-アセチルアミノ-4-ヒドロキシ安息香酸(3,4-AcAHBA)を生成する活性をいう。
 「NhoA活性を低下させるように改変された」とは、NhoA活性が、非改変株、例えば、野生株のエシェリヒア・コリの比活性よりも低くなったことをいう。NhoA活性は、非改変株と比較して、菌体当たり50%以下、好ましくは30%以下、さらに望ましくは菌体当たり10%以下に低下されていることが好ましい。「低下」には活性が完全に消失した場合も含まれる。本発明のエシェリヒア・コリは、野生株又は非改変株よりNhoA活性が低下していればよいが、さらにこれらの株に比べて3,4-AHBAの蓄積が向上していることがより望ましい。また、「NhoA活性を低下させるように改変された」とは、例えば、細胞あたりのNhoAの分子数が低下した場合や、分子あたりのNhoA活性が低下した場合等が該当する。具体的には、NhoA活性を低下させるための改変は、通常の変異誘発処理又は遺伝子工学的な処理により導入され得る。変異誘発処理の例としては、X線又は紫外線照射、変異誘発剤、例えばN-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジンによる処理等が挙げられる。このような改変の例としては、NhoA活性が非変異株と比較して低減されるか又は消失されるよう、染色体上のnhoA遺伝子(発現調節領域を含む)に変異を導入するか又はnhoA遺伝子の一部もしくは全体を欠損させることが挙げられる。遺伝子を変異させるか又は欠損するための方法の例としては、プロモーター及びシャイン・ダルガルノ(SD)配列などの発現調節配列の改変、オープンリーディングフレーム中へのミスセンス変異、ナンセンス変異又はフレームシフト変異の導入、並びに遺伝子の一部分の欠失が挙げられる(J Biol Chem. 1997, 272 (13): 8611-7)。また、nhoA遺伝子の変異または欠損は、染色体上の野生型遺伝子を変異または欠損を有する遺伝子に置き換える相同組換え法を用いることにより、或いはトランスポゾン又はIS因子を用いることにより、微生物中に導入され得る。相同組換え法としては、線状DNA、温度感受性プラスミド及び非複製プラスミドを用いる方法が挙げられる。これらの方法は、Proc Natl Acad Sci USA.2000 Jun 6;97(12):6640-5、米国特許第6303383号、特開平05-007491号公報等に記載されている。
 標的酵素の活性及び活性の低下の程度は、候補菌株から得られる細胞抽出物又はその精製分画を用いて酵素活性を測定し、それを野生株又は非改変株の活性と比較することにより確認され得る。例えば、NhoA活性は、非特許文献3に記載の方法により測定され得る。
 NhoA活性が低下するように改変されるエシェリヒア・コリとしては、3,4-AHBA産生能を固有に有するエシェリヒア・コリ、および3,4-AHBA産生能を固有に有しないものの、3,4-AHBA産生能が付与されたエシェリヒア・コリが挙げられる。3,4-AHBA産生能の付与は、後述する方法により行うことができる。本発明で用いられるエシェリヒア・コリとしては、任意の適切な株を用いることができるが、例えば、K12株(ATCC10798)またはその亜株(例、BW25113(CGSC7630)、DH1(ATCC33747)、MG1655(ATCC700926)、W3110(ATCC27325))、B株またはその亜株(例、BL21(ATCCBAA-1025)、REL606(CGSC12149))が挙げられる。上記菌株のうち、CGSC番号が記載されているものは、The Coli Genetic Stock Center(http://cgsc.biology.yale.edu/)から分譲を受けることができる。また、上記菌株のうち、ATCC番号が記載されているものは、American Type Culture Collection(http://www.atcc.org/)から分譲を受けることができる。
 NhoAとしては、配列番号2のアミノ酸配列に対して、70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上、特に好ましくは98%または99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、NhoA活性を有するタンパク質が挙げられる。また、nhoA遺伝子としては、配列番号23の塩基配列に対して、70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上、特に好ましくは98%または99%以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ、NhoA活性を有するタンパク質をコードするものが挙げられる。
 アミノ酸配列およびヌクレオチド配列の相同性(例、同一性または類似性)は、例えばKarlinおよびAltschulによるアルゴリズムBLAST(Pro.Natl.Acad.Sci.USA,90,5873(1993))、PearsonによるFASTA(MethodsEnzymol.,183,63(1990))を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTP、BLASTNとよばれるプログラムが開発されているので(http://www.ncbi.nlm.nih.gov参照)、これらのプログラムをデフォルト設定で用いて、アミノ酸配列およびヌクレオチド配列の相同性を計算してもよい。また、アミノ酸配列の相同性としては、例えば、Lipman-Pearson法を採用している株式会社ゼネティックスのソフトウェアGENETYX Ver7.0.9を使用し、ORFにコードされるポリペプチド部分全長を用いて、Unit Size to Compare=2の設定でpercentage計算させた際の数値を用いてもよい。アミノ酸配列およびヌクレオチド配列の相同性として、これらの計算で導き出される値のうち、最も低い値を採用してもよい。
 エシェリヒア・コリの株によってnhoA遺伝子の塩基配列に差異が存在することがある。例えば、nhoA遺伝子をコードするタンパク質としては、配列番号2のアミノ酸配列において、1若しくは複数の位置での1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含むアミノ酸配列を含み、かつNhoA活性を有するタンパク質が挙げられる。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、好ましくは1から50個、さらに好ましくは1から20個、より好ましくは1から10個、特に好ましくは1から5個である。また、このようなアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加等には、nhoA遺伝子を保持する微生物の個体差に基づき天然に生じる変異(mutant又はvariant)によって生じるものも含まれる。
 nhoA遺伝子はまた、配列番号23の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、NhoA活性を有するタンパク質をコードするDNAであり得る。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性(例、同一性または類似性)が高いポリヌクレオチド同士、例えば70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%、特に好ましくは98%以上の相同性を有するポリヌクレオチド同士がハイブリダイズし、それより低い相同性を示すポリヌクレオチド同士がハイブリダイズしない条件である。具体的には、このような条件としては、6×SSC(塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム)中、約45℃でのハイブリダイゼーション、続いて、0.2×SSC、0.1%SDS中、50~65℃での1または2回以上の洗浄が挙げられる。
<2>ジヒドロキシアセトンリン酸とアスパラギン酸セミアルデヒドから3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸を生成する活性を増大させる改変
 本発明の細菌は、ジヒドロキシアセトンリン酸(DHAP)とアスパラギン酸セミアルデヒド(ASA)から3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸(3,4-AHBA)を生成する活性が増大するように改変されたものであってもよい。このような改変は、例えば、DHAPとASAから3,4-AHBAを生成する活性を有するタンパク質をコードするDNAを組み込んだ組換えベクターで本発明の細菌を形質転換することにより達成できる。DHAPとASAから3,4-AHBAを生成する活性を有するタンパク質は、DHAPおよびASAからの3,4-AHBAの生成に資するものである限り特に限定されず、例えば、DHAPとASAの炭素-炭素結合形成を触媒する酵素活性(以下、アルドラーゼ活性と略することがある)を有するタンパク質、およびDHAPとASAの炭素-炭素結合を形成させることによって得られたC7化合物の環化を触媒する酵素活性(以下、3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性と略することがある)を有するタンパク質が含まれる。以下、両活性を併せて、3,4-AHBA生合成能ということがある。
 DHAPとASAの炭素-炭素結合形成を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードする遺伝子としては、ストレプトマイセス・グリセウス由来のgriI遺伝子、又は、griI遺伝子ホモログ(griI遺伝子およびgriI遺伝子ホモログを併せて、単にgriI遺伝子ということがある)が挙げられる。griI遺伝子ホモログとは、他の微生物に由来し、上記ストレプトマイセス・グリセウス由来の遺伝子と高い相同性を示し、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子をいう。そのような遺伝子は、Blast検索を行うことにより、探索することができる。例えば、ストレプトマイセス・ムラヤマエンシス由来のnspI遺伝子(配列番号14、15)、フランキア・エスピー由来のFructose-bisphosphate aldolase (Accession no. YP_483282)、同Fructose-bisphosphate aldolase(Accession no.YP_481172)、ストレプトマイセス・スカビエス由来のFructose-bisphosphate aldolase(http://www.sanger.ac.uk/cgi-bin/blast/submitblast/s_scabies)、バークホルデリア・エスピー383由来のfructose-bisphosphate aldolase(Accession no.Q39NQ9)、Methanococcus jannaschii由来のfructose-bisphosphate aldolase(Accession no.NP_247374)、エシェリヒア・コリ由来のdhnA遺伝子(Accession no.NC_000913)などが挙げられる(Journal of Biochemistry vol.281,NO.48,pp.36944-36951,supplementary data)。
 DHAPとASAの炭素-炭素結合を形成させることによって得られたC7化合物の環化を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードする遺伝子としては、ストレプトマイセス・グリセウス由来のgriH遺伝子、又は、griH遺伝子ホモログ(griH遺伝子およびgriH遺伝子ホモログを併せて、単にgriH遺伝子ということがある)が挙げられる。griH遺伝子ホモログとは、他の微生物に由来し、上記ストレプトマイセス・グリセウス由来の遺伝子と高い相同性を示し、3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子をいう。そのような遺伝子は、Blast検索を行うことにより、探索することができる。例えば、ストレプトマイセス・ムラヤマエンシス由来のnspH遺伝子(配列番号16、17)、フランキア・エスピー由来の3-dehydroquinate synthase(Accession no.YP_483283)、同3-dehydroquinate synthase(Accession no.YP_481171)、バークホルデリア・エスピー383由来の3-dehydroquinate synthase(Accession no. YP_366552)、同3-dehydroquinate synthase(Accession no.YP_366553)、ストレプトマイセス・スカビエス由来の3-dehydroquinate synthase(〈http://www.sanger.ac.uk/cgi-bin/blast/submitblast/s_scabies〉)、Methanococcus jannaschii由来の3-dehydroquinate synthase(Accession no.NP_248244)などが挙げられる(Journal of Biochemistry vol.281,NO.48,pp.36944-36951, supplementary data)。
 本発明で用いられるGriIおよびGriH、またはgriI遺伝子およびgriH遺伝子は、任意の生物に由来するものを用いることができる。例えば、上述したような細菌または放線菌等の微生物に由来するものであってもよく、好ましくは、放線菌に由来するものであってもよい。放線菌としては、例えば、ストレプトマイセス属の微生物が挙げられる。ストレプトマイセス属に属する微生物としては、例えば、ストレプトマイセス・グリセウス(Streptomyces griseus)、ストレプトマイセス・ムラヤマエンシス(Streptomyces murayamaensis)、ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)、ストレプトマイセス・スカビエス(Streptomyces scabies)が挙げられる。GriIおよびGriH、またはgriI遺伝子およびgriH遺伝子は、同一の微生物に由来していてもよいし、異なる微生物に由来していてもよい。
 GriIホモログとしては、上記griI遺伝子をコードするタンパク質のアミノ酸配列である配列番号5または14に対して、70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上、特に好ましくは98%または99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質が望ましい。例えば、特許文献2の配列番号9、11、13、15、17、19および21が挙げられる。また、griI遺伝子ホモログとしては、上記griI遺伝子の塩基配列である配列番号6または15に対して、70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上、特に好ましくは98%または99%以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするものが望ましい。例えば、特許文献2の配列番号8、10、12、14、16、18または20が挙げられる。
 GriHホモログとしては、上記griH遺伝子をコードするタンパク質のアミノ酸配列である配列番号7または16に対して、70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上、特に好ましくは98%または99%以上の同一性を有し、かつ、3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するタンパク質が望ましい。例えば、特許文献2の配列番号23、25、27、29、31、33および35が挙げられる。また、griH遺伝子ホモログとしては、上記griH遺伝子の塩基配列である配列番号8または17に対して、70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上、特に好ましくは98%または99%以上の同一性を有し、かつ、3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするものが望ましい。例えば、特許文献2の配列番号22、24、26、28、30、32または34が挙げられる。
 アミノ酸配列において変異により活性に影響を与えないアミノ酸残基の位置は、当業者に明らかであるが、配列アライメントをさらに参考にして、タンパク質変異体を作製してもよい。具体的には、当業者は、1)複数のホモログタンパク質のアミノ酸配列を比較し、2)相対的に保存されている領域、および相対的に保存されていない領域を明らかにし、次いで、3)相対的に保存されている領域および相対的に保存されていない領域から、それぞれ、機能に重要な役割を果たし得る領域および機能に重要な役割を果たし得ない領域を予測できるので、構造・機能の相関性を認識できる。なお、特許文献2は、上記griI遺伝子ホモログのアミノ酸配列のアラインメント(特許文献2の図1及び図2)、上記griH遺伝子ホモログのアミノ酸配列のアラインメント(特許文献2の図3及び図4)、これらのコンセンサス(共通)配列(特許文献2の配列番号36、37)を開示している。前記griI遺伝子ホモログには、特許文献2の配列番号36のアミノ酸配列をコードする遺伝子、griH遺伝子ホモログには、特許文献2の配列番号37のアミノ酸配列をコードする遺伝子が含まれる。
 アミノ酸配列およびヌクレオチド配列の相同性(例、同一性または類似性)は、上述したように決定することができる。
 微生物の種や菌株によってgriI遺伝子やgriH遺伝子の塩基配列に差異が存在することがあるため、griI遺伝子およびgriH遺伝子は、エシェリヒア・コリ内で発現することにより、例えば、発現を増強することにより、エシェリヒア・コリの3,4-AHBAの生産能を向上させることができるものであればよい。例えば、griI遺伝子をコードするタンパク質としては、griI遺伝子をコードするタンパク質のアミノ酸配列(例、配列番号5または14)において、1若しくは複数の位置での1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含むアミノ酸配列を含み、かつアルドラーゼ活性を有するタンパク質が望ましい。例えば、特許文献2の配列番号9、11、13、15、17、19および21が挙げられる。griH遺伝子をコードするタンパク質としては、griH遺伝子をコードするタンパク質のアミノ酸配列(例、配列番号7または16)において、1若しくは複数の位置での1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含むアミノ酸配列を含み、かつ3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するタンパク質が望ましい。例えば、特許文献2の配列番号23、25、27、29、31、33および35が挙げられる。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、好ましくは1から50個、さらに好ましくは1から20個、より好ましくは1から10個、特に好ましくは1から5個である。また、このようなアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加等には、griI遺伝子もしくはgriH遺伝子を保持する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異(mutant又はvariant)によって生じるものも含まれる。置換は機能的に変化しない中性変異である保存的置換が好ましい。保存的変異は、上述したとおりである。
 さらに、griI遺伝子およびgriH遺伝子は、それぞれ導入する宿主により、遺伝子の縮重性が異なるので、エシェリヒア・コリで使用しやすいコドンに置換したものでもよい。同様にgriI遺伝子およびgriH遺伝子は、エシェリヒア・コリの3,4-AHBA生産能を向上させる機能を有する限り、N末端側、C末端側が延長したタンパク質、あるいは削られているタンパク質をコードする遺伝子でもよい。例えば延長・削除する長さは、アミノ酸残基で50以下、好ましくは20以下、より好ましくは10以下、特に好ましくは5以下である。より具体的には、N末端側50アミノ酸から5アミノ酸、又はC末端側50アミノ酸から5アミノ酸が延長又は削除されたタンパク質をコードする遺伝子でもよい。
 このようなgriI遺伝子およびgriH遺伝子と相同な遺伝子は、例えば、部位特異的変異法によって、コードされるタンパク質の特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加を含むようにそのアミノ酸配列をコードする遺伝子を改変することによって取得することができる。また、以下のような従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、griI遺伝子もしくはgriH遺伝子をヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、および該遺伝子を保持する微生物を、紫外線またはN-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(NTG)もしくはエチルメタンスルフォネート(EMS)等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法、エラ-プローンPCR(Cadwell,R.C.PCR Meth.Appl.2,28(1992))、DNA shuffling(Stemmer,W.P.Nature 370,389(1994))、StEP-PCR(Zhao,H.Nature Biotechnol.16,258(1998))によって、遺伝子組換えにより人工的にgriI遺伝子もしくはgriH遺伝子に変異を導入して活性の高い酵素をコードする遺伝子を取得することが出来る。
 griI遺伝子はまた、griI遺伝子またはそのホモログ遺伝子の塩基配列(例、配列番号6または15、あるいは特許文献2の配列番号8、10、12、14、16、18または20)に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAであり得る。griH遺伝子はまた、griH遺伝子またはそのホモログ遺伝子の塩基配列(例、配列番号8または17、あるいは特許文献2の配列番号22、24、26、28、30、32または34)に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAであり得る。「ストリンジェントな条件」は、上述したものと同様である。
 上記遺伝子ホモログ及び保存的変異に関する記載は、本明細書に記載された他の遺伝子についても同様に適用される。
 これらのgriI遺伝子およびgriH遺伝子ならびにそれらのホモログ遺伝子が発現することにより3,4-AHBA生産能を向上させるタンパク質をコードしているか否かは、これらの遺伝子をフィードバック阻害を解除した変異型アスパルトキナーゼをコードする遺伝子を有する細菌等に導入し、3,4-AHBA生成活性が向上するかどうかを調べることにより、確かめることができる。その場合、例えば鈴木らの方法[J.Bio.Chem.,281,823-833(2006)]に従い、3,4-AHBAを逆相クロマトグラフィーにより定量することでより明確に効果を検証することができる。
<3>組換えベクター
 所望の遺伝子を発現ベクターに導入することによって、本発明に用いられ得る組換えベクターを得ることができる。例えば、griIおよびgriHの双方が用いられる場合、それぞれ発現可能な状態で形質転換体に含まれる限り、それぞれ別の組換えベクターに搭載して形質転換に用いても良いし、griIとgriHを適当なスペーサーにより連結して、同一の組換えベクターに搭載し、形質転換に用いても良い。また、griIとgriHは同一の微生物に由来する遺伝子であってもよいし、異種微生物に由来する遺伝子であってもよい。同一の微生物に由来する遺伝子であり、griIおよびgriHは染色体上の近接した位置に存在する場合は、griIおよびgriHの双方を含む部位においてDNAを切り出し、ベクターに搭載しても良い。
 本発明に使用する組換えベクターは、一般にプロモーター、前述の本発明のDNA、例えばgriIおよびgriH、およびエシェリヒア・コリ中で該遺伝子を発現させるために必要な制御領域(オペレーターやターミネーター)を、それらが機能し得るように適切な位置に有するものである。
 組換えベクターとして使用できる発現ベクターは特に制限されず、エシェリヒア・コリ中で機能し得るベクターであればよく、プラスミドのように染色体外で自立増殖するものであっても細菌染色体に組み込まれるものであってもよい。具体的には、発現ベクターとしては、例えば、pSTV(例、pSTV28)、pUC(例、pUC18、pUC19)、pBR(例、pBR322)、pHSG(例、pHSG298、pHSG299、pHSG399、pHSG398)、pACYC(例、pACYC177、pACYC184)、pMW(例、pMW118、pMW119、pMW218、pMW219)、pQE(例、pQE)およびその誘導体が挙げられる。
 本発明に使用できるプロモーターは特に限定されず、通常E.coliにおける異種タンパク質生産に通常用いられるプロモータを使用することができ、例えば、T7プロモータ、lacプロモータ、trpプロモータ、trcプロモータ、tacプロモータ、ラムダファージのPRプロモータ、PLプロモータ、T5プロモータ等の強力なプロモータが挙げられる。
<4>形質転換体
 本発明の細菌は、3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸産生能を有し、かつ、N-ヒドロキシアリールアミン O-アセチルトランスフェラーゼ(NhoA)の活性が低下するように改変されているエシェリヒア・コリである限り特に限定されないが、好ましくは形質転換体である。本発明の形質転換体は、ジヒドロキシアセトンリン酸とアスパラギン酸セミアルデヒドから3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸を生成する活性を有するタンパク質をコードするDNAを組み込んだ組換えベクターで形質転換されることが好ましい。
 宿主として用いられるエシェリヒア・コリは、3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸類の生合成の基質となるジヒドロキシアセトンリン酸とアスパラギン酸セミアルデヒドを効率的に供給できる株であることが好ましい。エシェリヒア・コリは、非共役酵素であり、単独で機能するアスパルトキナーゼIII(AKIII)を有する。エシェリヒア・コリのAKIIIは、本来、リジンによるフィードバック阻害を受ける。エシェリヒア・コリとしては、リジンによるフィードバック阻害を解除し得る変異を持ったAKIII遺伝子を有するものが好ましい。
 リジン等のアミノ酸によるフィードバック阻害を解除し得る変異は、エシェリヒア・コリ、コリネバクテリウム・グルタミカム、セラチア・マルセッセンス等の種々の微生物由来のアスパルトキナーゼについて報告されている。エシェリヒア・コリのAKIIIについて、リジンによるフィードバック阻害を解除し得る変異としては、例えば、250位のグルタミン酸のリジンへの変異(E250K)、318位のメチオニンのイソロイシンへの変異(M318I)、344位のスレオニンのメチオニンへの変異(T344M)、345位のセリンのロイシンへの変異(S345L)、352位のスレオニンのイソロイシンへの変異(T352I)が報告されている(例、Kikuchi et al.,FEMS Microbiology Letters 173,211-215(1999)、およびFalco et al.,BioTechnology 13,577-582(1995)を参照)。したがって、本発明では、このような変異が導入されたAKIII遺伝子を有するエシェリヒア・コリを用いることができる。なお、AKIIIについては、野生型であってもその由来するエシェリヒア・コリの株によって数個のアミノ酸残基の相違があるものがあり、このようなアレル変異体を用いてもよい。アレル変異体について前記フィードバック阻害を解除するための改変部位は、当業者にとって公知の配列アラインメントを実施することにより対応する箇所を特定することができる。AKIIIのフィードバック阻害を解除するための改変は、当業者にとって公知の方法、例えば、2-アミノエチルシステイン等のリジンアナログに耐性を有する変異株の取得や相同組換えを利用した遺伝子置換による部位特異的変異導入によって達成できる。また、フィードバック阻害を解除した変異型AKIII遺伝子を含むプラスミドを用いてエシェリヒア・コリを形質転換することによっても、フィードバック阻害を解除した変異型AKIIIの活性を強化したエシェリヒア・コリを得ることができる。
 また、フィードバック阻害を解除した変異型AKIII遺伝子を有するエシェリヒア・コリは、さらにピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の発現を強化したものであってもよい。
 ジヒドロキシアセトンリン酸とアスパラギン酸セミアルデヒドから3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸を生成する活性を有するタンパク質をコードするDNAを組み込んだ組換えベクターによるエシェリヒア・コリの形質転換は、当該技術分野で公知の方法に従って行うことができる。例えば、プロトプラスト法(Gene,39,281-286(1985))、エレクトロポレーション法(Bio/Technology,7,1067-1070(1989))等を使用することができる。AKIIIのフィードバック阻害を解除するための形質転換を行う場合、3,4-AHBA生成活性を付与するための形質転換とAKIIIのフィードバック阻害を解除するための形質転換のいずれを先に行っても良い。
<5>3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸類およびそれを構成単位として含むポリマーの製造方法
 本発明はまた、本発明の細菌を培養する工程を含む、3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸類の製造方法を提供する。
 本発明における3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸類には、以下の構造を有する3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸(以下、「3,4-AHBA」と略すことがある)並びにその誘導体およびその塩が含まれる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸類の誘導体は、(1)1位のカルボキシル基、3位のアミノ基および4位のヒドロキシル基からなる群より選ばれる少なくとも1つの基が誘導体化されているか、または(2)1位のカルボキシル基、3位のアミノ基および4位のヒドロキシル基を保持し、かつ2位、5位および6位の炭素原子からなる群より選ばれる少なくとも1つの炭素原子上の水素原子が他の原子または基により置換されているか、あるいは(3)上記(1)および(2)の組合せによるものである。上記(2)における他の原子または基としては、例えば、ハロゲン原子(例、フッ素原子、臭素原子、塩素原子、ヨウ素原子)、アルキル基(例、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル等の炭素原子数1~6個のアルキル基)、ヒドロキシル基、アルキルオキシ基(アルキル部分は、上記と同様)、アミノ基、モノまたはジアルキルアミノ基(アルキル部分は、上記と同様)、シアノ基、ニトロ基、スルホニル基、カルボキシル基が挙げられる。具体的には、上記(1)の誘導体としては、例えば、1位のカルボキシル基が誘導体化された誘導体(例、3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸のカルボキシル基がアルデヒド化された3-アミノ-4-ヒドロキシベンズアルデヒド)、3位のアミノ基が上記アルキル基等の基で誘導体化された誘導体(例、3-アルキルアミノ誘導体)、および4位のヒドロキシ基が上記アルキル基等の基で誘導体化された誘導体(例、4-モノまたはジアルキルアミノ誘導体)が挙げられる。
 塩としては、カルボン酸のアルカリ金属(例、ナトリウム、カリウム、リチウム)塩、アルカリ土類金属(例、カルシウム、マグネシウム)塩などの塩基塩および塩酸塩、硫酸塩、硝酸鉛、リン酸塩などの酸付加塩が例示される。
 本発明の細菌を培養し、培地中で生産される3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸類を回収することによって、3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸類を製造することができる。
 本発明の細菌を培養するための培地は、エシェリヒア・コリが生育する培地であれば特に制限はなく、当該技術分野で公知の方法に従って培養することができる。例えば、炭素源、窒素源、無機イオンを含有する通常の培地で培養することができる。さらに高い増殖を得るために、ビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養素を必要に応じて添加することもできる。培養温度は、通常、25℃~42℃であり、pHは5~8に制御することが望ましい。培養時間は、通常、20時間~90時間である。
 本発明の細菌の培養は、酸素供給律速条件下で行うことが望ましい。具体的には菌体生育が対数増殖期に移行した段階で2.0ppm以下に保持されることが望ましい。
 該培養液から3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸類を回収・精製する工程で用いる回収方法は、公知の方法から適宜選択すればよい。例えば、該培養液を3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸類の溶解性の高い酸性pHに調整してから、菌体を遠心分離や膜ろ過等の方法により除去した培養液上清から回収することが好ましい。菌体を除去した培養液上清からからの3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸の回収方法としては、多孔性吸着剤による精製、晶析、沈殿化などが挙げられる。
 本発明において使用される多孔性吸着剤とは、表面積の大きな多孔質の固型吸着剤であり、具体的には、シリカゲル、アルミナ、ゼオライト、ボーキサイト、マグネシア、活性白土、アクリル系合成吸着剤等に代表される親水性吸着剤、木炭、骨炭、活性炭、芳香族系合成吸着剤等に代表される疎水性吸着剤が挙げられる。本発明においては、不純物を吸着することよって3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸類の純度を向上できるものであれば特に限定なく使用できる。ただし、多孔性吸着剤によって吸着される不純物とは、主として生化学的合成の過程において生産される芳香族系化合物が多く含有されるので、本発明においてはこれらの化合物が吸着しやすい活性炭や芳香族系合成吸着剤に代表される疎水性吸着剤が好適に用いられる。これら疎水性吸着剤は単独で使用してもよいし、2種類以上を組み合わせて使用してもよい。
 活性炭が使用される場合には、その原料としては特に限定はなく、例えば木粉、ヤシ殻などの植物原料、無煙炭、石油ピッチ、コークス等の石炭、石油系原料、アクリル樹脂、フェノール樹脂、エポキシ樹脂、ポリエステル樹脂などの合成樹脂系原料などが挙げられる。また活性炭の形状としては粉末状、粒状、繊維状、フィルターやカートリッジ状の二次加工品等があるが特に限定はなく適宜取り扱いやすいものを選択すればよい。
 一方、芳香族系合成吸着剤が使用される場合には、その原料としては特に限定はないが、例えば1)無置換基型の芳香族系樹脂、2)疎水性置換基を有する芳香族系樹脂、3)無置換基型に特殊処理を施した芳香族系樹脂等の多孔性樹脂が使用できる。具体的化合物としては、例えばスチレン‐ジビニルベンゼン系樹脂等が挙げられる。
 前述したように該培養液中の3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸類を多孔性吸着剤に接触させる目的は、不純物を多孔性吸着剤に吸着せしめ、3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸類の純度を向上させることにあるが、不純物と同時に目的生成物である3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸類も該多孔性吸着剤に少なからず吸着されてしまう場合がある。そこで該培養液中の3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸類を接触させた後、該多孔性吸着剤に極性有機溶媒を接触させ、該多孔性吸着剤から3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸類を脱着し、極性有機溶媒中に溶離させることでも3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸類を単離、回収することが可能である。本発明において使用される極性有機溶媒とは高い誘電率をもつ極性分子からなる有機溶媒のことをいい、上記したように、多孔性吸着剤から3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸類を脱着し、極性有機溶媒中に3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸類を溶離させることができるものであれば特に限定されることなく使用できる。極性有機溶媒は単独で使用しても構わないし、2種類以上を所望の配合比で組み合わせて使用しても良い。
 本発明における晶析または沈殿化とは、目的物質が溶解している溶媒を蒸発させて濃縮したり、あるいは温度を下げたり、あるいは目的物質が溶解している溶媒に貧溶媒を加えたりすることによって、飽和溶解度よりも濃度を高くすることにより結晶または沈殿を生じさせる操作のことを言い、従来公知の方法を含め特に限定されるものではない。また生成した結晶または沈殿は、沈降、濾過、遠心分離などによって分離することができる。
 本発明はまた、3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸類を構成単位として含むポリマーの製造方法を提供する。本発明のポリマーの製造方法は、前述の本発明の方法により得られる3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸類を、少なくとも一つのポリマー構成成分としてポリマー化する工程を含む。例えば、前述したように、本発明の細菌の培養液中から多孔性吸着剤を用いて、あるいは、晶析、沈殿化などによって純度を向上させた3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸類を、高温においてメタンスルフォン酸、もしくは、ポリリン酸のような非酸化溶媒酸中で、重縮合によって重合することによってポリマー化される(例、国際公開第91/01304号参照)。本発明のポリマーの製造方法では、3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸類を、他のポリマー構成成分とポリマー化させてもよい。他のポリマー構成成分としては、例えば、テレフタル酸およびビスフェノールA、またはテレフタル酸およびp-フェニレンジアミンが挙げられる。ポリマー化の方法は種々の公知の方法を適用することによって実施可能である(米国特許5142021号公報、米国特許5219981号公報、米国特許5422416号公報、Kricheldorf et. al.,(1992)Makromol. Chem.,193,2467-2476、Marcos-Fernandez et. al.,(2001)Polymer,42,7933-7941)。本発明の方法により製造される、3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸類を構成単位として含むポリマーとしては、例えば、ポリベンゾオキサゾールポリマー、ポリエステル、ポリアミドが挙げられる。
実施例1:エシェリヒア・コリが有する3,4-AHBAの変換を触媒する酵素の探索
(1)エシェリヒア・コリのゲノム情報をもとにした3,4-AHBA変換酵素の探索
 ストレプトマイセス・グリセウスIFO13350株において、アリールアミン N-アセチルトランスフェラーゼ(同意語:NatA;NCBI accession ID:BAF46971.1)が3,4-AHBAのN-アセチル化反応を触媒することが報告されており、NatAのアミノ酸配列が公知となっている[Suzuki et. al.,(2007)J.Bacteriol.,189,2155-2159]。
NatAのアミノ酸配列を配列番号1に示す。NatAと同様の機能を有する酵素を探索するため、エシェリヒア・コリK-12株のゲノム情報から、NatAと相同性を示す配列を検索した。公開されているデータベース(EcoCyc,http://ecocyc.org/,Keseler et al.,(2005)Nucleic Acids Res.,33,334-337)を利用し、blastpを用いて検索を行った結果、エシェリヒア・コリK-12株のN-ヒドロキシアリールアミン O-アセチルトランスフェラーゼ(同意語:NhoA,EC:2.3.1.118,NCBI accession ID:NP_415980.1)が、ストレプトマイセス・グリセウスIFO13350株由来NatAと49%の相同性を示すことを見出した。NhoAのアミノ酸配列を配列番号2に示す。
(2)エシェリヒア・コリnhoA遺伝子欠損株および野生株の3,4-AHBA変換能の解析
 NhoAをコードする遺伝子(同意語:nhoA,GenBank accession No.:NC_000913.2,GI:947251)が欠損された株として、エシェリヒア・コリBW25113ΔnhoA(同株:JW1458,Keio Collection)株を利用した。エシェリヒア・コリBW25113ΔnhoA株は、エシェリヒア・コリBW25113株(Haldimann et. al.,(2001)J.Bacteriol.,183,6384-6393)(CGSC7630)からnhoA遺伝子を欠損した株である(Baba et. al.,(2006)Mol.Syst.Biol.,2,2006-2008)。エシェリヒア・コリBW25113ΔnhoA株は、国立遺伝学研究所(http://www.nig.ac.jp/)から分譲を受けることができる。また、エシェリヒア・コリBW25113株は、The Coli Genetic Stock Center(http://cgsc.biology.yale.edu/)から分譲を受けることができる。
 エシェリヒア・コリBW25113ΔnhoA株とBW25113株の3,4-AHBA変換能を以下の手順に従って算出した。それぞれの株をLBプレートに均一に塗布し、37℃にて24時間培養した。得られたプレートから、1白金耳分の菌体を試験管中の4mLのMSグルコース/3,4-AHBA培地に接種し、往復振とう培養装置で30℃にて30時間培養した。MSグルコース/3,4-AHBA培地の組成は以下の表1に記載のとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 KOHでpH7.0に調整し、120℃で20分オートクレーブを行なった。但し、GlucoseとMgSO・7HOは混合し、別殺菌した。CaCOは乾熱滅菌後に添加した。3,4-AHBAは20(g/L)となるように蒸留水に溶解した後にKOHでpH7.0に調整し、ろ過滅菌した後に終濃度2.0(g/L)になるように添加した。
 培養終了後、培養液の600nmでのoptical density(OD)値を分光光度計(HITACHI U-2900)によって測定した。また、培養上清液中の3,4-AHBAを逆相カラムクロマトグラフィーを用いて分離し、濃度を定量した(Suzuki et. al.,(2006)J.Biol.Chem.,281,36944-36951)。各菌株の、培養液の600nmでのOD値、培養上清液中の3,4-AHBA濃度および3,4-AHBA変換率を表2に示した。3,4-AHBA変換率は以下の算式によって求めた。
[3,4-AHBA変換率(%)]=100×{2(g/L)-[培養終了後の培養液上清液中の3,4-AHBA濃度(g/L)]}/2(g/L)
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 この結果、エシェリヒア・コリBW25113株の培養上清液中では3,4-AHBA濃度は初発濃度の30%までに減少した。一方、エシェリヒア・コリBW25113ΔnhoA株の培養上清液中では、3,4-AHBA濃度の減少は10%程度に留まった。したがって、NhoAが3,4-AHBAの変換反応を触媒することが強く示唆された。
 エシェリヒア・コリBW25113株の培養上清液、エシェリヒア・コリBW25113ΔnhoA株の培養上清液、および3,4-AHBA標準品(東京化成工業株式会社製,Cat.No.:A0859)に対する逆相カラムクロマトグラフィーのチャートを、図1に示した。これにより、3,4-AHBAは、エシェリヒア・コリBW25113株によって溶出時間(R.T.)9.5min.に検出される化合物に変換されていることが示唆された。
(3)3,4-AHBA変換物(R.T.9.5min.)の分子量の同定
 実施例1(2)に記載の、BW25113株培養後の培養上清液中に含まれる3,4-AHBA変換物(R.T.9.5min.)の分子量を、LC/MSで同定した。分析条件は以下のとおりである。
 カラム:Inertsil ODS-3 2μm 2.1×75mm (GL Science社製)
 移動相:A=0.1% ギ酸/H
     B=0.1% ギ酸/アセトニトリル
      グラジェントプログラム 0min.A/B=100/0
                  3min.A/B=100/0
                  23min.A/B=20/80
                  25min.A/B=20/80
 流速:0.2(mL/min.)
 カラム温度:室温(25℃)
 検出波長:254nm(PDA)
 MSイオン化モード:ESI
 分析機種:Agilent Infinity1290(LC)
      Agilent Quadrupole LC/MS 6130(MS)
 分析の結果、変換物(R.T.9.5min.)のm/z値は195.1であり、3,4-AHBAのアセチル化体の計算上のm/z値(195.1)と一致した。以降、変換物(R.T.9.5min.)を3,4-AcAHBAと呼ぶ。
実施例2:ストレプトマイセス・グリセウス由来3,4-AHBA合成酵素遺伝子群の導入による3,4-AHBA生産菌の構築および3,4-AHBA、3,4-AcAHBA蓄積量の評価
(1)発現用プラスミドpSTV28-Ptac-Ttrpの構築
 次に、3,4-AHBA生産菌において、nhoA欠損が3,4-AHBAの蓄積に与える効果を検証した。まず、3,4-AHBAの生産能を付与する為の発現用プラスミドpSTV28-Ptac-Ttrpを構築した。
 始めに、tacプロモーター(同意語:Ptac)領域(deBoer, et al.,(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,80,21-25)およびエシェリヒア・コリ由来トリプトファンオペロンのターミネーター(同意語Ttrp)領域(Wu et al.,(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,75,5442-5446)を含み、5’末端にKpnIサイト、3’末端にBamHIサイトを有するDNA断片を化学合成した(塩基配列を配列番号3に示す)。得られたDNA断片をKpnI及びBamHIにて消化処理し、PtacおよびTtrpを含むDNA断片を得た。精製したDNA断片と、KpnI及びBamHIで消化処理したpSTV28(タカラバイオ社製)とを、DNA Ligaseによるライゲーション反応によって連結した。得られたプラスミドをpSTV28-Ptac-Ttrpと名付けた(塩基配列を配列番号4に示す)。本プラスミドのPtac下流に目的遺伝子をクローニングすることで、目的遺伝子の発現増幅が可能となる。
(2)エシェリヒア・コリのコドン使用頻度に対応したgriI遺伝子およびgriH遺伝子(griIH遺伝子)の化学合成
 ストレプトマイセス・グリセウスIFO13350株において、3,4-AHBAの合成はアルドラーゼ(同意語:SGR_4249,GriI)および3,4-AHBAシンターゼ(同意語:SGR_4248,GriH)からなる3,4-AHBA合成酵素群によって触媒される事が既に知られており、これらをコードする遺伝子の配列が公知となっている(Suzuki et. al.,(2006)J.Biol.Chem.,281,36944-36951)。GriIは、griI遺伝子(GenBank accession no.AB259663.1、ヌクレオチド13956~14780;GI:117676060)によりコードされている。GriIタンパク質のアミノ酸配列およびgriI遺伝子の塩基配列を配列番号5および配列番号6にそれぞれ示す。また、GriHは、griH遺伝子(GenBank accession no.AB259663.1、ヌクレオチド12690~13880;GI:117676059)によりコードされている。GriHタンパク質のアミノ酸配列およびgriH遺伝子の塩基配列を配列番号7および配列番号8にそれぞれ示す。
 griI遺伝子およびgriH遺伝子をエシェリヒア・コリで効率的に発現させるために、エシェリヒア・コリのコドン使用頻度に対応するようにgriI遺伝子およびgriH遺伝子の配列を変更し、オペロンとして発現するように設計して、これをEcGriIHと名付けた。EcGriIHの5’末端にEcoRI、3’末端にHindIIIの制限酵素認識配列を付加し、化学合成を行った(配列番号9に示す)。両末端に制限酵素認識配列が付与されたEcGriIHは、EcoRIとHindIIIで消化処理後、同制限酵素で消化処理されたpUC57(Genscript社製)にクローニングした。得られたベクターをpUC57-EcGriと名付けた。pUC57-EcGriの全長配列を配列番号10に示す。
(3)griI遺伝子およびgriH遺伝子(griIH遺伝子)発現用プラスミドの構築
 エシェリヒア・コリでgriI遺伝子およびgriH遺伝子を発現させる為の発現用プラスミドは次の手順で構築した。pUC57-EcGriを鋳型として、配列番号11に示す合成オリゴヌクレオチド、更には配列番号12に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、PrimeStarGXLポリメラーゼ(Takara社製)を用いてPCRを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、反応条件は98℃にて10秒、55℃にて15秒、68℃にて150秒の反応を30サイクル行った。その結果、EcGriIH遺伝子断片を含む、約2.1kbpのPCR産物を取得した。その後、精製されたEcGriIH遺伝子断片と、SmaIで消化処理されたpSTV28-Ptac-Ttrpを、In-Fusion HD Cloning Kit(Clontech社製)を用いて連結した。得られたgriIH遺伝子発現用プラスミドをpSTV28-EcGriと名付けた。pSTV28-EcGriの全長配列を配列番号13に示す。
(4)3,4-AHBA生産菌の構築
 エシェリヒア・コリBW25113株、並びにBW25113ΔnhoA株のコンピテントセルを調整後、エレクトロポレーションによりpSTV28-EcGriを導入し、30(mg/L)のクロラムフェニコールを含むLBプレートに均一に塗布し、37℃にて24時間培養した。得られたプレートから、クロラムフェニコール耐性を示す形質転換体を取得した。BW25113株にpSTV28-EcGriが導入された株をBW25113/pSTV28-EcGri株と名付け、エシェリヒア・コリBW25113ΔnhoA株にpSTV28-EcGriが導入された株をBW25113ΔnhoA/pSTV28-EcGri株と名付けた。
(5)3,4-AHBA生産培養評価
 BW25113ΔnhoA/pSTV28-EcGri株、及びBW25113/pSTV28-EcGri株を、30(mg/L)のクロラムフェニコールを含むLBプレートに均一に塗布し、37℃にて24時間培養した。得られたプレートから、1白金耳分の菌体を試験管中の30(mg/L)のクロラムフェニコールおよび0.1(mM)のイソプロピル-β-チオガラクトピラノシドを含むMSグルコース/Asp培地4mLに接種し、往復振とう培養装置で30℃、48時間の培養を行った。MSグルコース/Asp培地の組成は以下の表3に記載のとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
 KOHでpH7.0に調整し、120℃で20分オートクレーブを行なった。但し、GlucoseとMgSO・7HOは混合し、別殺菌した。CaCOは乾熱滅菌後に添加した。
 培養後、培養液の600nmでのOD値を分光光度計(HITACHI U-2900)によって測定した。また、培養上清液中に蓄積した3,4-AHBAおよび3,4-AcAHBAを逆相カラムクロマトグラフィーによって分離し、濃度を定量した(Suzuki et.al.,(2006) J.Biol.Chem.,281,36944-36951)。培養液の600nmでのOD値、培養上清液中の3,4-AHBA濃度および3,4-AcAHBA濃度を表4に示した。BW25113ΔnhoA/pSTV28-EcGri株では3,4-AcAHBAが検出されず、対照のBW25113/pSTV28-EcGri株と比べて、大幅に3,4-AHBAの濃度が上昇した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
実施例3:ストレプトマイセス・ムラヤマエンシス由来3,4-AHBA合成酵素遺伝子群の導入による3,4-AHBA生産菌の構築および3,4-AHBA、3,4-AcAHBA蓄積量の評価
(1)エシェリヒア・コリのコドン使用頻度に対応したnspI遺伝子およびnspH遺伝子の化学合成
 ストレプトマイセス・ムラヤマエンシス(Streptomyces murayamaensis)(Furusaki et. al.,(1972)Isr.J.Chem.,10,173-187)において、3,4-AHBAの合成はアルドラーゼ(同意語:NspI;NCBI accession ID:BAJ08171.1)および3,4-AHBAシンターゼ(同意語:NspH;NCBI accession ID:BAJ08172.1)からなる3,4-AHBA合成酵素群によって触媒される事が既に知られており、これらをコードする遺伝子の配列が公知となっている(Noguchi et.al.,(2010)Nat.Chem.Biol.,6,641-643)。NspIは、nspI遺伝子(GenBank accession no.AB530136、ヌクレオチド8730~9584; GI: 296784943)によりコードされている。NspIタンパク質のアミノ酸配列およびnspI遺伝子の塩基配列を配列番号14および配列番号15にそれぞれ示す。また、NspHは、nspH遺伝子(GenBank accession no.AB530136、ヌクレオチド9599~10702;GI:296784944)によりコードされている。NspHタンパク質のアミノ酸配列およびnspH遺伝子の塩基配列を配列番号16および配列番号17にそれぞれ示す。
 nspI遺伝子およびnspH遺伝子をエシェリヒア・コリで効率的に発現させるために、エシェリヒア・コリのコドン使用頻度に対応するようにnspI遺伝子およびnspH遺伝子の配列を変更し、オペロンとして発現するように設計して、これをEcNspIHと名付けた。EcNspIHの5’末端にEcoRI、3’末端にHindIIIの制限酵素認識配列を付加し、化学合成を行った(配列番号18に示す)。両末端に制限酵素認識配列が付与されたEcNspIHは、EcoRIとHindIIIで消化処理後、同制限酵素で消化処理されたpUC57(Genscript社製)にクローニングした。得られたベクターをpUC57-EcNspと名付けた。pUC57-EcNspの全長配列を配列番号19に示す。
(2)nspI遺伝子およびnspH遺伝子(nspIH遺伝子)発現用プラスミドの構築
 エシェリヒア・コリでnspI遺伝子およびnspH遺伝子を発現させる為の発現用プラスミドは次の手順で構築した。pUC57-EcNspを鋳型として、配列番号20に示す合成オリゴヌクレオチド、更には配列番号21に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、PrimeStarGXLポリメラーゼ(Takara社製)を用いてPCRを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、反応条件は98℃にて10秒、55℃にて15秒、68℃にて150秒の反応を30サイクル行った。その結果、EcNspIH遺伝子断片を含む、約2.1kbpのPCR産物を取得した。その後、精製されたEcNspIH遺伝子断片と、SmaIで消化処理されたpSTV28-Ptac-Ttrp(実施例2に記載)を、In-Fusion HD Cloning Kit(Clontech社製)を用いて連結した。得られたnspIH遺伝子発現用プラスミドをpSTV28-EcNspと名付けた。pSTV28-EcNspの全長配列を配列番号22に示す。
(3)3,4-AHBA生産菌の構築
 エシェリヒア・コリBW25113株、並びにBW25113ΔnhoA株のコンピテントセルを調整後、エレクトロポレーションによりpSTV28-EcNspを導入し、30(mg/L)のクロラムフェニコールを含むLBプレートに均一に塗布し、37℃にて24時間培養した。得られたプレートから、クロラムフェニコール耐性を示す形質転換体を取得した。BW25113株にpSTV28-EcNspが導入された株をBW25113/pSTV28-EcNsp株と名付け、エシェリヒア・コリBW25113ΔnhoA株にpSTV28-EcNspが導入された株をBW25113ΔnhoA/pSTV28-EcNsp株と名付けた。
(4)3,4-AHBA生産培養評価
 BW25113/pSTV28-EcNsp株、及びBW25113ΔnhoA/pSTV28-EcNsp株を、30(mg/L)のクロラムフェニコールを含むLBプレートに均一に塗布し、37℃にて24時間培養した。得られたプレートから、1白金耳分の菌体を試験管中の30(mg/L)のクロラムフェニコールおよび0.1(mM)のイソプロピル-β-チオガラクトピラノシドを含む表3に記載のMSグルコース/Asp培地4mLに接種し、往復振とう培養装置で30℃、48時間の培養を行った。
 培養後、培養液の600nmでのOD値を分光光度計(HITACHI U-2900)によって測定した。また、培養上清液中に蓄積した3,4-AHBAおよび3,4-AcAHBAを逆相カラムクロマトグラフィーによって分離し、濃度を定量した(Suzuki et.al.,(2006)J.Biol.Chem.,281,36944-36951)。培養液の600nmでのOD値、培養上清液中の3,4-AHBA濃度および3,4-AcAHBA濃度を表5に示した。BW25113ΔnhoA/pSTV28-EcNsp株では3,4-AcAHBAが検出されず、対照のBW25113/pSTV28-EcNsp株と比べて、大幅に3,4-AHBAの濃度が上昇した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
 本発明によって、染料、農薬、医薬品その他有機合成品の中間体やポリベンゾオキサゾールのモノマーとして有用であるアミノヒドロキシ安息香酸類を簡便安価に製造することができる。よって、例えば、本発明によって得られた3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸を重合することでポリベンゾオキサゾール(PBO)が得られ、これにより高強度、高弾性率、高耐熱性を有するPBO繊維やPBOフィルムなどを安価に提供することが可能となる。また、原料である3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸類を生合成によって製造することが可能であることから、本発明の方法は環境低負荷型のプロセスとなり、地球環境に対して優しい製造方法である。

Claims (15)

  1.  ジヒドロキシアセトンリン酸とアスパラギン酸セミアルデヒドから3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸を生成する活性が増大するように改変された3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸産生能を有するエシェリヒア・コリであって、N-ヒドロキシアリールアミン O-アセチルトランスフェラーゼ(NhoA)活性が低下するように改変されたエシェリヒア・コリ。
  2.  染色体上のnhoA遺伝子が変異または欠損されたことによりNhoA活性が低下した、請求項1に記載のエシェリヒア・コリ。
  3.  前記3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸産生能が、ジヒドロキシアセトンリン酸とアスパラギン酸セミアルデヒドから3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸を生成する活性を有するタンパク質をコードするDNAを組み込んだ組換えベクターで形質転換されることにより付与された、請求項1または2に記載のエシェリヒア・コリ。
  4.  前記3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸を生成する活性を有するタンパク質が、GriIおよびGriHである、請求項3に記載のエシェリヒア・コリ。
  5.  前記GriIが、下記(A)~(C)のいずれか一つに記載のタンパク質であり、かつ、前記GriHが、下記(D)~(F)のいずれか一つに記載のタンパク質である、請求項4に記載のエシェリヒア・コリ:
    (A)配列番号5または配列番号14に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
    (B)上記(A)に示すアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質;
    (C)上記(A)に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質;
    (D)配列番号7または配列番号16に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
    (E)上記(D)に示すアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するタンパク質;
    (F)上記(D)に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するタンパク質。
  6.  前記3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸を生成する活性を有するタンパク質をコードするDNAが、griI遺伝子およびgriH遺伝子を含む、請求項3に記載のエシェリヒア・コリ。
  7.  griI遺伝子が、下記(a)~(c)のいずれか一つに記載のDNAであり、かつ、griH遺伝子が、下記(d)~(f)のいずれか一つに記載のDNAである、請求項6に記載のエシェリヒア・コリ:
    (a)配列番号6または配列番号15の塩基配列を含むDNA;
    (b)上記(a)に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA;
    (c)上記(a)に示す塩基配列に対して70%以上の同一性を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するDNA;
    (d)配列番号8または配列番号17の塩基配列を含むDNA;
    (e)上記(d)に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA;
    (f)上記(d)に示す塩基配列に対して70%以上の同一性を有し、かつ、3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するDNA。
  8.  griI遺伝子およびgriH遺伝子が放線菌由来である、請求項7に記載のエシェリヒア・コリ。
  9.  griI遺伝子およびgriH遺伝子がストレプトマイセス属由来である、請求項7に記載のエシェリヒア・コリ。
  10.  griI遺伝子およびgriH遺伝子がストレプトマイセス・グリセウス由来である、請求項7に記載のエシェリヒア・コリ。
  11.  griI遺伝子およびgriH遺伝子がストレプトマイセス・ムラヤマエンシス由来である、請求項7に記載のエシェリヒア・コリ。
  12.  フィードバック阻害を解除した変異型アスパルトキナーゼIIIをコードする遺伝子を有する、請求項1~11のいずれか一項に記載のエシェリヒア・コリ。
  13.  請求項1~12のいずれか一項に記載のエシェリヒア・コリを培養する工程を含む、3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸類の製造方法。
  14.  請求項13に記載の方法により製造した3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸類をポリマー化する工程を含む、3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸類を構成単位として含むポリマーの製造方法。
  15.  前記ポリマーが、ポリベンゾオキサゾールポリマーである、請求項14の方法。
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