BR112020010328A2

BR112020010328A2 - micro-organismo geneticamente modificado e métodos de produção de ácido 3-hidroxiadípico, ácido a-hidromucônico e ácido adípico

Info

Publication number: BR112020010328A2
Application number: BR112020010328-4A
Authority: BR
Inventors: Kyohei Isobe; Kenji Kawamura; Katsushige Yamada
Original assignee: Toray Industries, Inc.
Priority date: 2017-11-30
Filing date: 2018-11-29
Publication date: 2020-11-17
Also published as: JPWO2019107516A1; JP7331691B2; CA3083563A1; CN111386339A; EP3719121A4; EP3719121A1; WO2019107516A1; US20200291435A1; CN111386339B; MX2020005324A

Abstract

É divulgado um micro-organismo geneticamente modificado no qual é introduzido um ácido nucleico que codifica uma enzima que catalisa uma reação para reduzir 3-oxoadipil-CoA em 3-hidroxiadipil-CoA. No micro-organismo geneticamente modificado, um ácido nucleico que codifica qualquer um dos polipeptídeos descritos em (a) a (c) abaixo é introduzido ou a expressão do polipeptídeo é melhorada: (a) um polipeptídeo composto por uma sequência de aminoácidos representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 6 e 213; (b) um polipeptídeo composto pela mesma sequência de aminoácidos de qualquer uma dessas sequências de aminoácidos, exceto que um ou vários aminoácidos são substituídos, deletados, inseridos e/ou adicionados e possuindo atividade enzimática que catalisa uma reação para reduzir 3-oxoadipil-CoA em 3-hidroxiadipil-CoA; e (c) um polipeptídeo composto por uma sequência de aminoácidos com uma identidade de sequência não inferior a 70% com qualquer uma dessas sequências de aminoácidos e possuindo atividade para reduzir 3-oxoadipil-CoA em 3-hidroxiadipil-CoA.

Description

“MICRO-ORGANISMO GENETICAMENTE MODIFICADO E MÉTODOS DE PRODUÇÃO DE ÁCIDO 3-HIDROXIADÍPICO, ÁCIDO α-HIDROMUCÔNICO E ÁCIDO ADÍPICO”

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção diz respeito a um micro-organismo geneticamente modificado no qual é introduzido um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo envolvido na produção de uma substância de interesse ou a expressão do polipeptídeo é melhorada, e a um método de produção da substância usando o micro-organismo.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] O ácido 3-hidroxiadípico (nome IUPAC: ácido 3-hidroxi- hexanodióico), ácido α-hidromucônico (nome IUPAC: ácido (E)-hex-2- enedióico) e ácido adípico (nome IUPAC: ácido hexanodióico) são ácidos dicarboxílicos contendo seis átomos de carbono. Estes ácidos dicarboxílicos podem ser utilizados como matérias-primas para a produção de poliésteres por polimerização com alcoóis poli-hídricos ou como matérias-primas para a produção de poliamidas por polimerização com aminas polifuncionais. Além disso, esses ácidos dicarboxílicos podem ser usados como matérias-primas para as poliamidas adicionando amônia ao final desses ácidos dicarboxílicos e convertendo os resultantes em lactamas.

[003] Exemplos da literatura relacionados à biossíntese de ácido 3-hidroxiadípico usando um micro-organismo de ocorrência não natural incluem o documento patentário 1, na qual o ácido 3-hidroxiadípico (3-hidroxiadipato) é descrito como um intermediário metabólico produzido pelo micro-organismo na via da biossíntese de 1,3-butadieno a partir de succinil-CoA.

[004] Exemplos da literatura relacionados à biossíntese de α- hidromucônico usando um micro-organismo de ocorrência não natural incluem o documento patentário 2, no qual o ácido α-hidromucônico (2,3-

desidroadipato) é descrito como um intermediário metabólico produzido pelo micro-organismo na via da biossíntese de ácido trans, trans-mucônico a partir de succinil-CoA.

[005] Exemplos da literatura relativa à biossíntese de ácido adípico usando um micro-organismo incluem o Documento Patentário 3, no qual a via reversa de degradação de adipato é descrita como uma via para produzir ácido adípico a partir de succinil-CoA.

[006] Todas as vias de biossíntese descritas nos Documentos patentários de 1 a 3 prosseguem através de uma reação enzimática que reduz 3-oxoadipil-CoA em 3-hidroxiadipil-CoA.

DOCUMENTOS DA ANTERIORIDADE DOCUMENTOS PATENTÁRIOS

[007] Documento Patentário 1: JP 2013-535203 A.

[008] Documento Patentário 2: US 2011/0124911 A1.

[009] Documento Patentário 3: JP 2011-515111 A.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO PROBLEMAS A SEREM RESOLVIDOS PELA INVENÇÃO

[010] Os Documentos de Patente 1 e 2 descrevem as vias metabólicas que podem produzir ácido 3-hidroxiadípico e ácido α- hidromucônico nos micro-organismos, mas nada sobre a interrupção das vias metabólicas para secretar ácido 3-hidroxiadípico e ácido α-hidromucônico no meio de cultura. Além disso, os estudos anteriores descritos nos Documentos de Patente 1 a 3 não examinaram se o ácido 3-hidroxiadípico, o ácido α- hidromucônico ou o ácido adípico podem ser realmente produzidos usando os micro-organismos não naturais nos quais é introduzido um ácido nucleico que codifica uma enzima que catalisa uma reação para reduzir 3-oxoadipil-CoA em 3-hidroxiadipil-CoA. Consequentemente, não se sabe se a enzima que catalisa uma reação para reduzir 3-oxoadipil-CoA em 3-hidroxiadipil-CoA, conforme descrito nos Documentos Patentários de 1 a 3, também exibe excelente atividade na produção de ácido 3-hidroxiadípico, ácido α-hidromucônico e/ou ácido adípico.

[011] Consequentemente, um objetivo da presente invenção é fornecer um micro-organismo geneticamente modificado no qual um ácido nucleico que codifica uma enzima que exibe excelente atividade em uma ação de redução de 3-oxoadipil-CoA é introduzido ou a expressão da enzima é melhorada e um método de produzir uma substância usando o micro- organismo modificado.

MODOS PARA RESOLVER OS PROBLEMAS

[012] Os inventores estudaram intensivamente para alcançar o objetivo descrito acima e, consequentemente, descobriram que um grupo de polipeptídeos com alta similaridade nas sequências de aminoácidos exibe uma excelente atividade catalítica para uma reação de redução de 3-oxoadipil-CoA em 3-hidroxiadipil-CoA, para concluir presente invenção.

[013] Ou seja, a presente invenção provê o seguinte: (1) Um micro-organismo geneticamente modificado no qual um ácido nucleico que codifica qualquer um dos polipeptídeos descritos em (a) a (c) abaixo é introduzido, ou a expressão do polipeptídeo é melhorada: (a) um polipeptídeo composto por uma sequência de aminoácidos representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 6 e 213; (b) um polipeptídeo composto da mesma sequência de aminoácidos que a sequência representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 6 e 213, exceto que um ou vários aminoácidos são substituídos, deletados, inseridos e/ou adicionados, e possuindo uma atividade enzimática que catalisa uma reação para reduzir a 3-oxoadipil-CoA em 3-hidroxiadipil-CoA; (c) um polipeptídeo composto por uma sequência de aminoácidos com uma identidade de sequência não inferior a 70% em relação às sequências representadas por qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 6 e 213 e com uma atividade enzimática que catalisa uma reação para reduzir 3-

oxoadipil-CoA em 3-hidroxiadipil-CoA;

(2) O micro-organismo geneticamente modificado de acordo com (1), em que o polipeptídeo descrito em (b) ou (c) compreende uma região com uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 212;

(3) O micro-organismo geneticamente modificado de acordo com (2), em que a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO:

212 compreende um resíduo de fenilalanina ou leucina como o 13º resíduo de aminoácido N-terminal, um resíduo de leucina ou glutamina como o 15º resíduo de aminoácido N-terminal, um resíduo de lisina ou asparagina como o 16º resíduo de aminoácido N-terminal, um resíduo de glicina ou serina como o 17º resíduo de aminoácido N-terminal, um resíduo de prolina ou arginina como o

19º resíduo de aminoácido N-terminal, de preferência, um resíduo de leucina,

metionina ou valina como o 21º resíduo de aminoácido N-terminal;

(4) O micro-organismo geneticamente modificado de acordo com qualquer um dentre (1) a (3), que é um micro-organismo geneticamente modificado selecionado a partir do grupo que consiste nos gêneros

Escherichia, Serratia, Hafnia e Pseudomonas;

(5) O micro-organismo geneticamente modificado de acordo com qualquer um dentre (1) a (4), que tem capacidade de gerar 3-oxoadipil-

CoA e coenzima A a partir de acetil-CoA e succinil-CoA; e uma capacidade de gerar ácido 3-hidroxiadípico a partir de 3-hidroxiadipil-CoA;

(6) O micro-organismo geneticamente modificado de acordo com qualquer um dentre (1) a (4), que tem capacidade de gerar 3-oxoadipil-

CoA e coenzima A a partir de acetil-CoA e succinil-CoA; a capacidade de gerar 2,3-desidroadipil-CoA a partir de 3-hidroxiadipil-CoA; e uma capacidade de gerar ácido α-hidromucônico a partir de 2,3-desidroadipil-CoA;

(7) O micro-organismo geneticamente modificado de acordo com qualquer um dentre (1) a (4), que tem capacidade de gerar 3-oxoadipil-

CoA e coenzima A a partir de acetil-CoA e succinil-CoA; uma capacidade de gerar 2,3-desidroadipil-CoA a partir de 3-hidroxiadipil-CoA; uma capacidade de gerar adipil-CoA a partir de 2,3-desidroadipil-CoA; e uma capacidade de gerar ácido adípico a partir de adipil-CoA;

(8) Um método de produção de ácido 3-hidroxiadípico,

caracterizado pelo fato de que compreende a cultura do micro-organismo geneticamente modificado de acordo com qualquer um dos itens de (1) a (5)

em um meio de cultura contendo uma fonte de carbono como material para fermentação;

(9) Um método de produção de ácido α-hidromucônico,

compreendendo a cultura do micro-organismo geneticamente modificado de acordo com qualquer um dos itens de (1) a (4) e (6) em um meio de cultura contendo uma fonte de carbono como material para fermentação;

(10) Um método de produção de ácido adípico, compreendendo a cultura do micro-organismo geneticamente modificado de acordo com qualquer um dos itens de (1) a (4) e (7) em um meio de cultura contendo uma fonte de carbono como material para fermentação; e

(11) Método de produção de uma ou mais substâncias selecionadas a partir do grupo que consiste em ácido 3-hidroxiadípico, ácido α-

hidromucônico e ácido adípico, compreendendo a cultura de um micro-

organismo geneticamente modificado em um meio de cultura contendo uma fonte de carbono como material para fermentação, em que um ácido nucleico codificante de um polipeptídeo codificado pelo gene da 3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase de um micro-organismo do gênero Serratia, que forma um cluster (aglomerado) de genes com o gene da ácido 5-aminolevulínico sintase no micro-organismo, é melhorado no micro-organismo geneticamente modificado.

EFEITOS DA INVENÇÃO

[014] O micro-organismo geneticamente modificado de acordo com a presente invenção expressa uma enzima que exibe excelente atividade em uma reação para reduzir 3-oxoadipil-CoA em 3-hidroxiadipil-CoA e, portanto, é excelente na produção de ácido 3-hidroxiadípico, ácido α- hidromucônico, e/ou ácido adípico através da produção de 3-hidroxiadipil-CoA.

[015] O método de produção de uma substância de acordo com a presente invenção utiliza o micro-organismo geneticamente modificado que é excelente na produção de ácido 3-hidroxiadípico, ácido α-hidromucônico e/ou ácido adípico através da produção de 3-hidroxiadipil-CoA e, portanto, pode aumentar grandemente a produção dessas substâncias.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[016] A Figura 1 mostra um cluster de genes constituído por um gene da 3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase e um gene da ácido 5- aminolevulínico sintase.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA PRESENTE INVENÇÃO

[017] O micro-organismo de acordo com a presente invenção é um micro-organismo geneticamente modificado, no qual um ácido nucleico que codifica qualquer um dos polipeptídeos descritos em (a) a (c) abaixo é introduzido, ou a expressão do polipeptídeo é melhorada: (a) um polipeptídeo composto por uma sequência de aminoácidos representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 6 e 213; (b) um polipeptídeo composto da mesma sequência de aminoácidos que a sequência representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 6 e 213, exceto que um ou vários aminoácidos são substituídos, deletados, inseridos e/ou adicionados, e possuindo uma atividade enzimática que catalisa a reação para reduzir 3-oxoadipil-CoA em 3-hidroxiadipil-CoA; e

(c) um polipeptídeo composto por uma sequência de aminoácidos com uma identidade de sequência não inferior a 70% em relação à sequência representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 6 e 213, e possuindo uma atividade para reduzir 3-oxoadipil-CoA em 3-hidroxiadipil-CoA.

[018] Uma enzima que catalisa a reação para reduzir 3-oxoadipil- CoA em 3-hidroxiadipil-CoA é doravante denominada “3-oxoadipil-CoA redutase” no relatório descritivo. Além disso, o ácido 3-hidroxiadípico pode ser abreviado como 3HA, o ácido α-hidromucônico pode ser abreviado como HMA e o ácido adípico pode ser abreviado como ADA, respectivamente, no relatório descritivo.

[019] Na presente invenção, a introdução de um ácido nucleico refere-se à introdução de um ácido nucleico de fora de um micro-organismo para dar ao micro-organismo a capacidade de produzir um polipeptídeo codificado pelo ácido nucleico. O método de introdução não se limita a um método específico, e exemplos do método que pode ser usado incluem um método no qual o ácido nucleico incorporado em um vetor de expressão capaz de replicação autônoma em um micro-organismo é introduzido em um micro- organismo hospedeiro e um método em que o ácido nucleico é integrado ao genoma de um micro-organismo.

[020] Na presente invenção, melhorar a expressão de polipeptídeo refere-se ao aprimoramento da expressão de um polipeptídeo que o micro-organismo originalmente possui. O método para melhorar a expressão não se limita a um método específico, e exemplos do método incluem um método no qual um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo é aumentado no número de cópias e um método no qual uma região promotora ou uma sequência de ligação ao ribossomo a montante da região que codifica o polipeptídeo é modificada. Estes métodos podem ser realizados individualmente ou de maneira combinada.

[021] Além disso, um ou mais ácidos nucleicos podem ser introduzidos. Além disso, a introdução de um ácido nucleico e o aumento da expressão de polipeptídeo pode ser combinada.

[022] Para o polipeptídeo usado na presente invenção e composto da mesma sequência de aminoácidos que a representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 6 e 213, exceto que um ou vários aminoácidos são substituídos, excluídos, inseridos e/ou adicionados e com atividade de 3-oxoadipil-CoA redutase, o intervalo representado pela frase “um ou vários” é preferencialmente de 10 ou menos, mais preferencialmente de 5 ou menos, preferencialmente de 4 ou menos e mais preferencialmente de um ou dois. No caso de substituição de aminoácidos, é mais provável que a atividade do polipeptídeo original seja mantida quando um aminoácido é substituído por um aminoácido com propriedades semelhantes (a chamada substituição conservadora). Ou seja, a atividade fisiológica do polipeptídeo original é frequentemente mantida quando o(s) aminoácido(s) é(são) substituído(s) por aminoácido(s) com propriedade(s) semelhante(s). Assim, o(s) aminoácido(s) é(são) preferencialmente substituído(s) por aminoácido(s) com propriedade(s) semelhante(s). Ou seja, os 20 aminoácidos que constituem proteínas de ocorrência natural podem ser divididos em grupos com propriedades semelhantes, como aminoácidos neutros com uma cadeia lateral menos polar (Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met, Pro), aminoácidos neutros com uma cadeia lateral hidrofílica (Asn, Gln, Thr, Ser, Tyr, Cys), aminoácidos ácidos (Asp, Glu) e aminoácidos básicos (Arg, Lys, His) e aminoácidos aromáticos (Phe, Tyr, Trp); é frequentemente o caso em que a substituição entre aminoácidos no mesmo grupo não altera as propriedades do polipeptídeo original.

[023] Para o polipeptídeo usado na presente invenção e com uma sequência de aminoácidos com uma identidade de sequência não inferior a 70% à sequência representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 6 e 213 e com atividade de 3-oxoadipil-CoA redutase, a identidade da sequência é preferencialmente não inferior a 80%, mais preferencialmente não inferior a 85%, ainda preferencialmente não inferior a 90%, ainda mais preferencialmente não inferior a 95%, ainda mais preferencialmente não inferior a 97% e ainda mais preferencialmente não inferior a 99%.

[024] Na presente invenção, o termo “identidade de sequência” significa uma razão (porcentagem) do número de resíduos idênticos de aminoácidos ou nucleotídeos em relação ao número total de resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos sobre a porção sobreposta de um alinhamento de sequência de aminoácidos (incluindo um aminoácido correspondente ao sítio de início da tradução) ou um alinhamento de sequência de nucleotídeos (incluindo o códon de início), que é obtido alinhando duas sequências de aminoácidos ou nucleotídeos com ou sem introdução de lacunas (gaps) para uma correspondência ideal e é calculado pela seguinte Fórmula (1). Na fórmula (1), o comprimento de uma sequência mais curta comparada não é inferior a 400 aminoácidos; nos casos em que o comprimento da sequência mais curta é menor que 400 aminoácidos, a identidade da sequência não é definida. A identidade da sequência pode ser facilmente determinada usando o BLAST (Ferramenta básica de busca de alinhamento local), um algoritmo amplamente usado nesse campo. Por exemplo, o BLAST está disponível publicamente em um website, como o NCBI (National Center for Biotechnology Information) ou KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes), nos quais a identidade de sequência pode ser facilmente determinada usando parâmetros padrão.

Além disso, a identidade da sequência também pode ser determinada usando uma função semelhante implementada em um programa de computador como o Genetyx.

[025] Identidade de sequência (%) = o número de correspondências (sem contar o número de lacunas) / comprimento de uma sequência mais curta (excluindo as lacunas terminais) x 100 (1)

[026] As identidades de sequência entre as sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID NOs: 1 a 6 e 213 são calculadas usando uma função Genetyx (matriz % de identidade (- % Identity Matrix)) com base na fórmula (1); a menor identidade de sequência é 71,51% entre as SEQ ID NOs: 2 e 4, e uma identidade de sequência não inferior a 70% é compartilhada pelo menos entre as sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID NOs: 1 a 6 e 213. Os resultados do cálculo de identidade de sequência usando Genetyx são apresentados na Tabela 1. Nas Tabelas 1 a 5 abaixo, os números na coluna mais à esquerda representam as SEQ ID NOs.

TABELA 1 * As lacunas (gaps) não são consideradas.

[027] Quando cada uma das sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID NOs: 1 a 6 e 213 como consultas foi comparada usando BLASTP para todas as sequências de aminoácidos registradas no banco de dados de aminoácidos NCBI (sequências de proteínas não redundantes) para determinar as identidades de sequência, as sequências com uma identidade de sequência não inferior a 70% foram todas derivadas de bactérias do gênero Serratia.

[028] Todos os polipeptídeos representados pelas SEQ ID NOs: 1 a 6 e 213, como descrito acima em (a) contêm uma sequência comum 1, composta por 24 resíduos de aminoácidos e representada pela SEQ ID NO: 212, dentro de uma região do 15º ao 38º resíduos de aminoácidos N-terminais (a seguir, um resíduo de aminoácido na n-ésima posição N-terminal pode ser convenientemente representado por n “a.a.”; por exemplo, a região do 15º ao 38º resíduo de aminoácidos do N-terminal pode ser simplesmente representado por “15 ao 38 a.a.”). Na sequência comum 1, Xaa representa um resíduo de aminoácido arbitrário; o 13 a.a. é preferencialmente um resíduo fenilalanina ou leucina; o 15 a.a. é preferencialmente um resíduo de leucina ou glutamina; o 16 a.a. é preferencialmente um resíduo de lisina ou asparagina; o 17 a.a. é um resíduo de glicina ou serina, mais preferencialmente resíduo de glicina; o 19 a.a. é preferencialmente um resíduo de prolina ou arginina e o 21 a.a. é preferencialmente um resíduo de leucina, metionina ou valina. A sequência comum 1 corresponde à região incluindo o resíduo de ligação a NAD+ e os resíduos de aminoácidos circundantes. Nos resíduos de ligação a NAD+, o 24º resíduo de aminoácido na sequência comum 1 é o ácido aspártico, como descrito em Biochimie. 2012 fev; 94 (2):471-8., mas na sequência comum 1, o resíduo é asparagina, que é característico. Acredita-se que os polipeptídeos representados pelas SEQ ID NOs: 1 a 6 e 213 exibem excelente atividade enzimática como 3-oxoadipil-CoA redutase devido à presença da sequência comum 1.

[029] Os polipeptídeos, como descrito acima em (b) e (c), também contêm preferencialmente a sequência comum 1, composta por 24 resíduos de aminoácidos e representada pela SEQ ID NO: 212, dentro de uma região de 1 a 200 a.a. A sequência comum está mais preferencialmente contida em uma região de 1 a 150 a.a., ainda preferencialmente de 1 a 100 a.a.

Exemplos específicos dos polipeptídeos incluem aqueles com as sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID NOs: 7 a 16 e 70 a 138. Nas sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID NOs: 7 a 16 e 70 a 138, a sequência comum 1, composta por 24 resíduos de aminoácidos e representada pela SEQ ID NO: 212, está contida em uma região de 15 a 38 a.a. As sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID NOs: 7 a 16 e 70 a 138 têm uma identidade de sequência não inferior a 90% com a sequência de aminoácidos representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 6 e 213.

Os resultados do cálculo da identidade de sequência usando Genetyx são apresentados nas Tabelas 2-1 a 2-3 e Tabelas 3-1 a 3-3.

TABELA 2-1 * As lacunas (gaps) não são consideradas.

TABELA 2-2

TABELA 2-3

TABELA 3-1

TABELA 3-2

TABELA 3-3

[030] Os ácidos nucleicos que codificam os polipeptídeos descritos em (a) a (c) de acordo com a presente invenção podem conter uma sequência adicional que codifica um peptídeo ou proteína adicionada aos polipeptídeos originais na(s) extremidade(s) N-terminal e/ou C-terminal.

Exemplos de tal peptídeo ou proteína podem incluir sequências de sinal secretoras, proteínas de translocação, proteínas de ligação, peptídeos marcadores aplicáveis para purificação e proteínas fluorescentes. Dentre esses peptídeos ou proteínas, um peptídeo ou proteína com uma função desejada pode ser selecionado dependendo da finalidade e pode ser adicionado aos polipeptídeos da presente invenção por aqueles versados no estado da técnica.

Deve-se notar que a sequência de aminoácidos de tal peptídeo ou proteína não está incluída no cálculo de identidade de sequência.

[031] Os ácidos nucleicos que codificam os polipeptídeos representados pelas SEQ ID NOs: 1 a 16, 70 a 138 e 213 não são particularmente limitados, desde que esses ácidos nucleicos sejam compostos de sequências nucleotídicas que podem ser traduzidas nas sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID NOs: 1 a 16 e 70 a 138, e as sequências nucleotídicas podem ser determinadas considerando um conjunto de códons (código genético padrão) correspondente a cada aminoácido. A este respeito, as sequências nucleotídicas podem ser redesenhadas utilizando códons que são frequentemente utilizados por um micro-organismo hospedeiro utilizado na presente invenção.

[032] Exemplos específicos das sequências nucleotídicas dos ácidos nucleicos que codificam os polipeptídeos com as sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID NOs: 1 a 16, 70 a 138 e 213 incluem as sequências nucleotídicas representadas pelas SEQ ID NOs: 54 a 69, 139 a 207 e 214, respectivamente.

[033] Na presente invenção, a determinação se um polipeptídeo codificado por um determinado ácido nucleico possui atividade de 3-oxoadipil- CoA redutase é feita da seguinte maneira: as cepas transformantes A e B descritas abaixo são produzidas e cultivadas em uma cultura, e se a presença de ácido 3-hidroxiadípico ou ácido α-hidromucônico no líquido de cultura resultante é confirmado, julga-se que o ácido nucleico codifica um polipeptídeo com atividade de 3-oxoadipil-CoA redutase. O método de determinação será descrito usando o Esquema 1 abaixo, que mostra uma via de biossíntese.

ESQUEMA 1

[034] O Esquema 1 acima mostra uma via de reação exemplar necessária para a produção de ácido 3-hidroxiadípico, ácido α-hidromucônico e/ou ácido adípico. Neste esquema, a reação A representa uma reação que gera 3-oxoadipil-CoA e coenzima A a partir de acetil-CoA e succinil-CoA. A reação B representa uma reação que gera 3-hidroxiadipil-CoA a partir de 3- oxoadipil-CoA. A reação C representa uma reação que gera 2,3-desidroadipil- CoA a partir de 3-hidroxiadipil-CoA. A reação D representa uma reação que gera adipil-CoA a partir de 2,3-desidroadipil-CoA. A reação E gera ácido 3- hidroxiadípico a partir de 3-hidroxiadipil-CoA. A reação F representa uma reação que gera ácido α-hidromucônico a partir de 2,3-desidroadipil-CoA. A reação G representa uma reação que gera ácido adípico a partir de adipil-CoA.

[035] A cepa transformante A possui enzimas que catalisam as reações A, E e F. A cepa transformante B possui enzimas que catalisam as reações A, C, E e F.

[036] A cepa transformante A é produzida primeiro. Os plasmídeos para a expressão de enzimas que catalisam as reações A, E e F, respectivamente, são produzidos. As reações E e F podem ser catalisadas por uma enzima idêntica. Os plasmídeos são introduzidos em Escherichia coli (E.

Coli), cepa BL21 (DE3), que é uma cepa de micro-organismo que carece de capacidade para produzir todos os três produtos; ácido 3-hidroxiadípico, ácido α-hidromucônico, e ácido adípico. Um plasmídeo de expressão no qual um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo, que é um sujeito de análise quanto à presença da atividade enzimática de interesse, é incorporado a jusante de um promotor adequado e é introduzido na cepa transformante obtida, para obter a cepa transformante A. A cepa transformante A é cultivada e o líquido pós-cultura é examinado quanto à presença de ácido 3-hidroxiadípico. Uma vez confirmada com sucesso a presença de ácido 3-hidroxiadípico no líquido de cultura, a cepa transformante B é então produzida. A cepa transformante B é obtida introduzindo um plasmídeo para a expressão de uma enzima que catalisa a reação C na cepa transformante A. A cepa transformante B é cultivada e o líquido pós-cultura é examinado quanto à presença de ácido α- hidromucônico. Quando a presença de ácido α-hidromucônico no líquido pós- cultura é confirmada, indica que o ácido 3-hidroxiadípico produzido na cepa transformante A e o ácido α-hidromucônico produzido na cepa transformante B são gerados através da produção de 3-hidroxiadipil-CoA e que o polipeptídeo em questão possui atividade de 3-oxoadipil-CoA redutase.

[037] Como o gene que codifica a enzima que catalisa a reação A, é utilizado o gene PcaF de Pseudomonas putida cepa KT2440 (NCBI Gene ID: 1041755; SEQ ID NO: 20).

[038] Como os genes que codificam a enzima que catalisa as reações E e F, é utilizada uma sequência contínua incluindo os comprimentos completos de pcaI e pcaJ de Pseudomonas putida cepa KT2440 (NCBI Gene IDs: 1046613 e 1046612; SEQ ID NOs: 23 e 24). Os polipeptídeos codificados por pcaI e pcaJ formam um complexo e depois catalisam as reações E e F.

[039] Como o ácido nucleico que codifica a enzima que catalisa a reação C, é utilizado o gene paaF de Pseudomonas putida cepa KT2440 (NCBI Gene ID: 1046932; SEQ ID NO: 47).

[040] O método de cultura da cepa transformante A e da cepa transformante B é o seguinte. Antibióticos para manutenção estável dos plasmídeos e/ou de uma substância que induz a expressão dos polipeptídeos codificados pelos ácidos nucleicos incorporados podem ser adicionados conforme apropriado. Uma alça de platina (também chamada de alça de transferência) da cepa transformante A ou B é inoculada em 5 mL do meio de cultura I (10 g/L Bacto Triptona (fabricado pela Difco Laboratories), 5 g/L de extrato de levedura Bacto Yeast Extract (fabricado pela Difco Laboratories), 5 g/L de cloreto de sódio) ajustado em pH 7 e o meio foi incubado a 30ºC com agitação a 120 min-1 por 18 horas para preparar um líquido de pré-cultura.

Posteriormente, 0,25 mL do líquido de pré-cultura é adicionado a 5 mL do meio de cultura II (10 g/L de ácido succínico, 10 g/L de glicose, 1 g/L de sulfato de amônio, 50 mM de fosfato de potássio, 0,025 g/L de sulfato de magnésio, 0,0625 mg/L de sulfato de ferro, 2,7 mg/L de sulfato de manganês, 0,33 mg/L de cloreto de cálcio, 1,25 g/L de cloreto de sódio, 2,5 g/L de Bacto triptona, 1,25 g/L de extrato de levedura de Bacto) ajustado para pH 6,5, e incubado a 30ºC com agitação de 120 min-1 por 24 horas. O líquido de cultura obtido é examinado quanto à presença de ácido 3-hidroxiadípico ou ácido α- hidromucônico.

[041] A presença de ácido 3-hidroxiadípico ou ácido α- hidromucônico no líquido de cultura pode ser confirmada centrifugando o líquido de cultura e analisando o sobrenadante com LC-MS/MS. As condições de análise são as descritas abaixo: HPLC: 1290 Infinity (fabricado pela Agilent Technologies, Inc.); Coluna Synergi hydro-RP (fabricada pela Phenomenex); comprimento, 100 mm; diâmetro interno, 3 mm; tamanho de partícula, 2,5 μm Fase móvel: Solução de ácido fórmico aquoso a 0,1%/metanol = 70/30 Velocidade de fluxo: 0,3 mL/minuto Temperatura de coluna: 40ºC Detector LC: DAD (210 nm) MS/MS: Triple-Quad LC/MS (fabricado pela Agilent Technologies, Inc.) Método de ionização: ESI em modo negativo.

[042] O valor da atividade da 3-oxoadipil-CoA redutase pode ser calculado pela quantificação de 3-hidroxiadipil-CoA gerado a partir de 3- oxoadipil-CoA usado como substrato pela 3-oxoadipil-CoA redutase purificada, em que a 3-oxoadipil-CoA é preparada a partir de ácido 3-oxoadípico por uma reação enzimática. O método específico é o seguinte.

[043] O ácido 3-oxoadípico pode ser preparado por um método conhecido (por exemplo, um método descrito no Exemplo de Referência 1 do documento WO 2017/099209).

[044] Preparação da solução de 3-oxoadipil-CoA: Uma PCR usando o DNA genômico de Pseudomonas putida cepa KT2440 como molde é realizada de acordo com procedimentos de rotina, para amplificar um ácido nucleico que codifica uma CoA transferase (pcaI e pcaJ; NCBI Gene IDs: 1046613 e 1046612) na forma de comprimento total. As sequências nucleotídicas dos iniciadores (primers) utilizados nesta PCR são, por exemplo, aquelas representadas pelas SEQ ID NOs: 25 e 26. O fragmento amplificado é inserido no sítio KpnI do pRSF-1b (fabricado pela Novagen), um vetor de expressão para E. coli, nas posições corretas de leitura (in-frame) com a sequência histidina-tag. O plasmídeo é introduzido em E. coli BL21 (DE3), e a expressão da enzima é induzida com isopropil-β-tiogalactopiranosídeo (IPTG) de acordo com procedimentos de rotina e a enzima é purificada usando o marcador histidina do líquido de cultura para obter uma solução de CoA transferase. A solução é usada para preparar uma solução de reação enzimática para a preparação de 3-oxoadipil-CoA com a seguinte composição, que é permitida reagir a 25ºC por 3 minutos e depois filtrada através de uma membrana de UF (Amicon Ultra-0,5mL 10K; fabricado Merck Millipore) para remover a enzima e o filtrado obtido é designado como solução de 3-oxoadipil- CoA: • Solução de reação enzimática para preparação de 3-

oxoadipil-CoA: - 100 mM Tris-HCl (pH 8.2); - 10 mM MgCl2; - 0,5 mM succinil-CoA; - 5 mM sal de sódio de ácido 3-oxoadípico; e - 2 μM CoA transferase.

[045] Identificação da atividade da 3-oxoadipil-CoA redutase: Uma PCR usando o DNA genômico de uma cepa de micro-organismo em questão como molde é realizada de acordo com procedimentos de rotina, para amplificar um ácido nucleico que codifica a 3- oxoadipil-CoA redutase na forma de comprimento total. As sequências nucleotídicas dos iniciadores (primers) utilizados nesta PCR são, por exemplo, aquelas representadas pelas SEQ ID NOs: 31 e 32. O fragmento amplificado é inserido no sítio BamHI do pACYCDuet-1 (fabricado pela Novagen), um vetor de expressão para E. coli, nas posições corretas de leitura (in-frame) com a sequência histidina-tag. O plasmídeo é introduzido em E. coli BL21 (DE3), e a expressão da enzima é induzida com isopropil-β-tiogalactopiranosídeo (IPTG) de acordo com procedimentos de rotina e a enzima é purificada usando o marcador histidina a partir do líquido de cultura para obter uma solução de 3-oxoadipil-CoA redutase. A atividade da 3-oxoadipil-CoA redutase pode ser determinada usando a solução de enzima para preparar uma solução de reação enzimática com a seguinte composição e quantificando 3-hidroxiadipil-CoA gerada a 25ºC: - 100 mM Tris-HCl (pH 8,2); - 10 mM MgCl2; - 150 μL/mL solução de 3-oxoadipil-CoA; - 0,5 mM NADH; - 1 mM ditiotreitol; e - 10 μM de 3-oxoadipil-CoA redutase.

[046] Na presente invenção, o micro-organismo geneticamente modificado no qual a expressão de qualquer um dos polipeptídeos descritos em (a) a (c) é melhorada, é um micro-organismo como um hospedeiro que originalmente possui os ácidos nucleicos que codificam qualquer um dos polipeptídeos descritos em (a) a (c) e é geneticamente modificado para expressar quantidades maiores de qualquer um dos polipeptídeos descritos em (a) a (c) que são próprios do micro-organismo hospedeiro.

[047] Exemplos específicos de micro-organismos que originalmente possuem um ácido nucleico que codifica qualquer um dos polipeptídeos descritos em (a) a (c) incluem os seguintes micro-organismos do gênero Serratia: Serratia marcescens (um micro-organismo possuindo as sequências representadas pelas SEQ ID NOs: 1, 70 a 80, 82 a 85, e 87 a 118), Serratia nematodiphila (um micro-organismo possuindo as sequências representadas pelas SEQ ID NOs: 2, 81, e 119), Serratia plymuthica (um micro- organismo possuindo as sequências representadas pelas SEQ ID NOs: 3, 131 a 136, e 138), Serratia proteamaculans (um micro-organismo possuindo as sequências representadas pelas SEQ ID NOs: 4 e 137), Serratia ureilytica (um micro-organismo possuindo a sequência representada pela SEQ ID NO: 5), Serratia sp. BW106 (um micro-organismo possuindo a sequência representada pela SEQ ID NO: 6), Serratia sp. S119 (um micro-organismo possuindo a sequência representada pela SEQ ID NO: 7), Serratia sp. YD25 (um micro- organismo possuindo a sequência representada pela SEQ ID NO: 8), Serratia sp. FS14 (um micro-organismo possuindo a sequência representada pela SEQ ID NO: 9), Serratia sp. HMSC15F11 (um micro-organismo possuindo a sequência representada pela SEQ ID NO: 10), Serratia sp. JKS000199 (um micro-organismo possuindo a sequência representada pela SEQ ID NO: 11), Serratia sp. TEL (um micro-organismo possuindo a sequência representada pela SEQ ID NO: 12), Serratia sp. ISTD04 (um micro-organismo possuindo a sequência representada pela SEQ ID NO: 13), Serratia sp. SCBI (um micro- organismo possuindo a sequência representada pela SEQ ID NO: 14), Serratia sp. S4 (um micro-organismo possuindo a sequência representada pela SEQ ID NO: 15), Serratia sp. C-1 (um micro-organismo possuindo a sequência representada pela SEQ ID NO: 16), Serratia sp. OMLW3 (um micro-organismo possuindo a sequência representada pela SEQ ID NO: 86), Serratia sp. OLEL1 (um micro-organismo possuindo a sequência representada pela SEQ ID NO: 120), Serratia sp. OLEL2 (um micro-organismo possuindo a sequência representada pela SEQ ID NO: 123), Serratia liquefaciens (um micro-organismo possuindo a sequência representada pela SEQ ID NO: 213), e similares.

[048] Cada um dos polipeptídeos, conforme descrito acima em (a), (b) e (c) também possui atividade de 3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase, e a 3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase é codificada pelo gene da 3-hidroxibutiril- CoA desidrogenase, que forma um cluster de genes com o gene da ácido 5- aminolevulínico sintase nos micro-organismos do gênero Serratia.

[049] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “cluster de genes” (grupamento de genes) na frase “gene da 3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase que forma um cluster de genes com o gene da ácido 5- aminolevulínico sintase nos micro-organismos do gênero Serratia” refere-se a uma região na qual um conjunto de ácidos nucleicos que codificam funções relacionadas estão localizados próximos entre si. Componentes específicos em um agrupamento de genes incluem, por exemplo, ácidos nucleicos que são transcritos sob controle de um único regulador de transcrição e aqueles em um operon que são transcritos sob controle de um único promotor de transcrição.

Se um determinado ácido nucleico é ou não um componente de um cluster de genes também pode ser investigado usando um programa on-line de pesquisa de cluster de genes, como o antiSMASH. Além disso, se um determinado polipeptídeo é ou não classificado como uma 3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase ou uma sintase do ácido 5-aminolevulínico pode ser determinado pela realização de uma pesquisa BLAST (Ferramenta de busca de alinhamento local básico) em um website, tal como o website do NCBI (National Center for Biotechnology Information) ou KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes), para encontrar qualquer enzima com alta homologia de sequência de aminoácidos com o polipeptídeo. Por exemplo, a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 4 é registrada em um banco de dados NCBI sob a proteína ID: ABV40935.1, que é anotada como uma proteína putativa com atividade desidrogenase de 3-hidroxibutiril-CoA, conforme julgado a partir da sequência de aminoácidos. Um gene que codifica a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 4 é registrado em um banco de dados NCBI sob Gene ID: CP000826.1 e pode ser identificado por meio de uma pesquisa no banco de dados como conservada no genoma da Serratia proteamaculans cepa 568 ou como conservada nas posições 2015313 a 2016842 pb na sequência do gene ID: CP000826.1. Além disso, as informações posicionais do gene podem levar à identificação das sequências dos genes de flanqueamento, a partir das quais pode-se descobrir que o gene forma um cluster de genes com o gene da sintase de ácido 5-aminolevulínico (proteína ID: ABV40933.1), como mostrado na FIG. 1. Da mesma forma, para as sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID NOs: 1 a 3, 6 a 16, 70 a 72, 74 a 82, 84 a 87, 89, 90, 92, 94 a 100, 103 a 108, 111 a 115, 117, 118, 120 a 125, 127 a 133, 135 a 137 e 213, as informações podem ser verificadas no site do NCBI com IDs da proteína (Protein ID) e IDs do gene (Gene ID) apresentados nas Tabelas 3-4 e 3-5.

TABELA 3-4 SEQ ID NO. ID do gene: posição (de..até) ID de proteína 1 JMPQ01000047.1:133194..134723 KFD11732.1 2 JPUX00000000.1:4202615..4204144 WP_033633399.1 3 BCTU01000013.1:85647..87176 WP_063199278.1

4 CP000826.1:2015313..2016842 ABV40935.1 6 MCGS01000002.1:43811..45340 WP_099061672.1 7 MSFH01000022.1:147976..149505 ONK16968.1 8 CP016948.1:1213474..1215003 AOE98783.1 9 CP005927.1:4244665..4246194 WP_044031504.1 10 LWNG01000196.1:83086..84615 OFS85208.1 11 LT907843.1:1172733..1174262 SNY82966.1 12 LDEG01000005.1:19627..21156 KLE40298.1 13 MBDW01000089.1:53478..55007 ODJ15373.1 14 CP003424.1:1869825..1871300 AIM21329.1 15 APLA01000003.1:1964823..1966352 WP_017892361.1 16 CAQO01000118.1:101692..103221 WP_062792820.1 70 JVDI01000070.1:19399..20928 WP_049300487.1 71 FCGF01000001.1:938090..939619 WP_060444298.1 72 NC_020211.1:1963542..1965071 WP_015377392.1 74 JVNC01000043.1:47711..49240 WP_049187553.1 75 MCNK01000010.1:591271..592800 WP_076740355.1 76 JVZV01000138.1:53080..54609 WP_049277247.1 77 CP021984.1:1963542..1965071 WP_088381461.1 78 NERL01000025.1：86571..88100 WP_060559176.1 79 MTEH01000001.1:215863..217392 WP_085336366.1 80 JVCS01000001.1:19397..20926 WP_049239700.1 81 MTBJ01000002.1:216232..217761 WP_082996863.1 82 AORJ01000010.1:70272..71801 WP_033645451.1 84 LFJS01000012.1:944087..945616 WP_025302345.1 85 CP018930.1:1161338..1162867 WP_060447438.1 86 MSTK01000013.1:54046..55575 WP_099817374.1 87 CP018929.1:1167577..1170106 WP_089180755.1 89 FCGS01000006.1:98915..100444 WP_060438851.1 90 MQRI01000002.1:585500..587029 WP_060387554.1 92 FCFE01000001.1:962839..964368 WP_060435888.1 94 FCIO01000002.1:145369146898.. WP_033637938.1 95 AP013063.1:1329259..1330788 WP_041034581.1 96 MQRJ01000004.1:178926..180455 WP_074026553.1 97 HG738868.1:1928329..1929858 WP_060437960.1

TABELA 3-5

SEQ ID NO: ID do gene: posição (de..até) ID de proteína 98 FCHQ01000006.1:51377..52906 WP_060420535.1 99 NPGG01000001.1:301231..302760 WP_047568134.1 100 FCME01000002.1:205632..207161 WP_060443161.1 103 FCIH01000014.1:52403..53932 WP_060429049.1 104 NBWV01000007.1:110621..112150 WP_039566649.1 105 FCKI01000001.1:594106..595635 WP_060429902.1 106 JPOB01000010.1:81351..82880 WP_033654196.1 107 FCFI01000001.1:582222..583751 WP_060443342.1

108 FCML01000001.1:1005802..1007331 WP_060456892.1 111 FCMR01000001.1:1873566..1875095 WP_060440240.1 112 LJEV02000002.1:115432..116961 WP_047727865.1 113 NPIX01000027.1:38249..39778 WP_094461128.1 114 NDXU01000091.1:70343..71872 WP_048233299.1 115 FNXW01000055.1:13619..15148 WP_080490898.1 117 AYMO01000023.1:23978..25507 WP_025160335.1 118 CP018926.1:1215941..1217470 WP_089191486.1 120 MORG01000026.1:13723..15252 WP_099782744.1 121 PEHC01000008.1:57274..58803 PHY81681.1 122 MEDA01000063.1:13491..15020 WP_072627918.1 123 MORH01000030.1:13633..15162 WP_099789708.1 124 KK214286.1:392757..394286 WP_033650708.1 125 KI929259.1:1574567..1576096 WP_033642621.1 127 CP012639.1:230596..232125 WP_060659686.1 128 LZOB01000011.1:1613417..1614946 WP_074054551.1 129 LCWI01000024.1:46336..47865 WP_046899223.1 130 CP018924.1:1213305..1214834 WP_089194521.1 131 NC_015567.1:1930552..1932081 WP_013812379.1 132 MQML01000205.1:9362..10891 WP_073439751.1 133 AMSV01000032.1:251478..253007 WP_006324610.1 135 CP007439.1:1991332..1992861 AHY06789.1 136 CP012096.1:319897..321426 WP_037432641.1 137 FWWG01000018.1:38528..40057 WP_085116175.1 213 CP006252.1:1825868..1827397 AGQ30498.1

[050] Um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo codificado pelo gene da 3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase de um micro- organismo do gênero Serratia, que forma um cluster de genes com o gene da sintase de ácido 5-aminolevulínico, é doravante referido como “gene da 3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase usado na presente invenção” e o polipeptídeo codificado pelo gene da 3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase é referido como a “3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase usada na presente invenção”.

[051] Um cluster de genes incluindo o gene da 3-hidroxibutiril- CoA desidrogenase usado na presente invenção pode incluir outros ácidos nucleicos, desde que pelo menos o gene da 3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase e o gene da ácido 5-aminolevulínico sintase estejam incluídos no cluster de genes. A FIG. 1 mostra um exemplo específico do cluster de genes, incluindo o gene da 3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase utilizado na presente invenção.

[052] Os exemplos específicos de micro-organismos do gênero Serratia que contêm o cluster de genes acima incluem S.

marcescens, S. nematodiphila, S. plymuthica, S. proteamaculans, S.

ureilytica, S. liquefaciens, Serratia sp. BW106, Serratia sp. S119, Serratia sp. YD25, Serratia sp. FS14, Serratia sp. HMSC15F11, Serratia sp.

JKS000199, Serratia sp. TEL, Serratia sp. ISTD04, Serratia sp. SCBI, Serratia sp. S4, Serratia sp. C-1, Serratia sp. OMLW3, Serratia sp. OLEL1, Serratia sp. OLEL2, e S. liquefaciens.

[053] A 3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase usada na presente invenção possui uma excelente atividade de 3-oxoadipil-CoA redutase. Se um ácido nucleico que codifica a 3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase possui ou não uma atividade de 3-oxoadipil-CoA redutase pode ser determinado pelo mesmo método descrito acima.

[054] O polipeptídeo codificado pelo gene da 3-hidroxibutiril- CoA desidrogenase usado na presente invenção é caracterizado por conter a sequência comum 1. Exemplos específicos de sequências de aminoácidos de tais polipeptídeos incluem as sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID NOs: 1 a 16, 70 a 138 e 213.

[055] Na presente invenção, um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo composto da mesma sequência de aminoácidos que a representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 7 a 16 ou 70 a 138, exceto que um ou vários aminoácidos são substituídos, deletados, inseridos, e/ou adicionados, e possuindo uma atividade enzimática que catalisa uma reação para reduzir 3-oxoadipil-CoA em 3-hidroxiadipil-CoA, pode ser adequadamente utilizado, desde que a sequência comum 1 esteja contida no polipeptídeo. A este respeito, o intervalo representado pela frase “um ou vários” é preferencialmente 10 ou menos, ainda preferencialmente 5 ou menos, particularmente preferencialmente 4 ou menos e, mais preferencialmente, um ou dois. No caso da substituição de aminoácidos, é mais provável que a atividade do polipeptídeo original seja mantida quando os aminoácidos são substituídos por aminoácidos com propriedades semelhantes (ou seja, uma substituição conservadora conforme descrito acima). Um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo composto por uma sequência de aminoácidos com uma identidade de sequência não inferior a 70%, preferencialmente não inferior a 80%, mais preferencialmente não inferior a 85%, ainda preferencialmente não inferior a 90%, ainda mais preferencialmente não inferior a 95%, ainda mais preferencialmente não inferior a 97%, ainda mais preferencialmente não inferior a 99%, à sequência representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 7 a 16 ou 70 a 138 e com uma atividade enzimática que catalisa uma reação para reduzir 3-oxoadipil-CoA em 3-hidroxiadipil-CoA também pode ser adequadamente utilizado.

[056] Por outro lado, exemplos de um polipeptídeo que não é a enzima 3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase usada na presente invenção, mas possui atividade de 3-oxoadipil-CoA redutase incluem: PaaH de Pseudomonas putida cepa KT2440 (SEQ ID NO: 208), PaaH de Escherichia coli cepa K-12 subcepa MG1655 (SEQ ID NO: 209), DcaH de Acinetobacter baylyi cepa ADP1 (SEQ ID NO: 210) e PaaH de Serratia plymuthica cepa NBRC102599 (SEQ ID NO: 211); e verificou-se que esses polipeptídeos não contêm a sequência comum 1, como mostrado nas Tabelas 4 e 5. Deve-se notar que esses polipeptídeos não são (b) polipeptídeos compostos da mesma sequência de aminoácidos que a representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 6 e 213, exceto que um ou vários aminoácidos são substituídos, deletados, inseridos e/ou adicionados e com uma atividade enzimática que catalisa uma reação para reduzir 3-oxoadipil-CoA em 3-hidroxiadipil-CoA, nem (c) polipeptídeos com uma sequência de aminoácidos com uma identidade de sequência não inferior a 70% com a sequência representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 6 e 213 e com uma atividade enzimática que catalisa uma reação para reduzir o 3-oxoadipil-CoA em 3-hidroxiadipil-CoA.

TABELA 4

TABELA 5

[057] Na presente invenção, exemplos de micro-organismos que podem ser usados como hospedeiros para obter os micro-organismos geneticamente modificados incluem micro-organismos pertencentes aos gêneros Escherichia, Serratia, Hafnia, Pseudomonas, Corynebacterium, Bacillus, Streptomyces, Cupriavidus, Acinetobacter, Alcaligenes, Brevibacterium, Delftia, Shimwellia, Aerobacter, Rhizobium, Thermobifida, Clostridium, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, e Candida. Entre eles, são preferíveis os micro-organismos pertencentes aos gêneros Escherichia, Serratia, Hafnia e Pseudomonas.

[058] O método de produção de ácido 3-hidroxiadípico, ácido α- hidromucônico e/ou ácido adípico usando um micro-organismo geneticamente modificado de acordo com a presente invenção será descrito.

[059] Qualquer micro-organismo geneticamente modificado de acordo com a presente invenção pode produzir ácido 3-hidroxiadípico, desde que o micro-organismo tenha a capacidade de gerar 3-oxoadipil-CoA e coenzima A a partir de acetil-CoA e succinil-CoA (reação A) e uma capacidade de gerar ácido 3-hidroxiadípico a partir de 3-hidroxiadipil-CoA (reação E).

Utilizando um micro-organismo com essas habilidades de produção como micro-organismo hospedeiro, pode ser obtido um micro-organismo geneticamente modificado que pode produzir abundantemente ácido 3- hidroxiadípico. Os micro-organismos sobre os quais se especula possuírem originalmente as habilidades de produção acima incluem os seguintes micro- organismos: micro-organismos do gênero Escherichia, como Escherichia fergusonii e Escherichia coli; do gênero Pseudomonas, como Pseudomonas chlororaphis, Pseudomonas putida, Pseudomonas azotoformans, e Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens; do gênero Hafnia, como Hafnia alvei; do gênero Corynebacterium, como Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, e Corynebacterium glutamicum; do gênero Bacillus, como Bacillus badius, Bacillus magaterium, e Bacillus roseus; do gênero Streptomyces, como Streptomyces vinaceus, Streptomyces karnatakensis, e Streptomyces olivaceus; do gênero Cupriavidus, como Cupriavidus metallidurans, Cupriavidus necator, e Cupriavidus oxalaticus; do gênero Acinetobacter, como Acinetobacter baylyi e Acinetobacter radioresistens; do gênero Alcaligenes, como Alcaligenes faecalis; do gênero Nocardioides, como

Nocardioides albus; do gênero Brevibacterium, como Brevibacterium iodinum; do gênero Delftia, como Delftia acidovorans; do gênero Shimwellia, como Shimwellia blattae; do gênero Aerobacter, como Aerobacter cloacae; do gênero Rhizobium, como Rhizobium radiobacter; do gênero Serratia, como Serratia grimesii, Serratia ficaria, Serratia fonticola, Serratia odorifera, Serratia plymuthica, Serratia entomophila, e Serratia nematodiphila Qualquer um desses micro-organismos pode ser usado como micro-organismo hospedeiro para obter um micro-organismo geneticamente modificado de acordo com a presente invenção, o que resulta na geração de um micro-organismo geneticamente modificado que produz abundantemente ácido 3-hidroxiadípico.

[060] Em um micro-organismo geneticamente modificado de acordo com a presente invenção, que originalmente não tem capacidade de gerar 3-oxoadipil-CoA e coenzima A a partir de acetil-CoA e succinil-CoA (reação A) e/ou gerar ácido 3-hidroxiadípico a partir de 3-hidroxiadipil-CoA (reação E), uma combinação apropriada de ácidos nucleicos que codificam enzimas que catalisam as reações A e E pode ser introduzida para conferir aos micro-organismos essas habilidades de produção.

[061] Qualquer micro-organismo geneticamente modificado de acordo com a presente invenção pode produzir ácido α-hidromucônico, desde que o micro-organismo tenha a capacidade de gerar 3-oxoadipil-CoA e coenzima A a partir de acetil-CoA e succinil-CoA (reação A), uma capacidade de gerar 2,3-desidroadipil-CoA por desidratação de 3-hidroxiadipil-CoA (reação C) e uma capacidade de gerar ácido α-hidromucônico a partir de 2,3- desidroadipil-CoA (reação F). Usando um micro-organismo com essas habilidades de produção como micro-organismo hospedeiro, pode ser obtido um micro-organismo geneticamente modificado que pode produzir abundantemente ácido α-hidromucônico. Os micro-organismos sobre os quais se especula possuírem originalmente as habilidades de produção acima incluem os seguintes micro-organismos: micro-organismos do gênero Escherichia, como Escherichia fergusonii e Escherichia coli; do gênero Pseudomonas, como Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas azotoformans, e Pseudomonas chlororaphis subsp.

aureofaciens; do gênero Hafnia, como Hafnia alvei; do gênero Bacillus, como Bacillus badius; do gênero Cupriavidus, como Cupriavidus metallidurans, Cupriavidus numazuensis, e Cupriavidus oxalaticus; do gênero Acinetobacter, como Acinetobacter baylyi e Acinetobacter radioresistens; do gênero Alcaligenes, como Alcaligenes faecalis; do gênero Delftia, como Delftia acidovorans; do gênero Shimwellia, como Shimwellia blattae; do gênero Serratia, como Serratia grimesii, Serratia ficaria, Serratia fonticola, Serratia odorifera, Serratia plymuthica, Serratia entomophila, e Serratia nematodiphila.

[062] Em um micro-organismo geneticamente modificado, de acordo com a presente invenção, que originalmente não tem capacidade de gerar 3-oxoadipil-CoA e coenzima A a partir de acetil-CoA e succinil-CoA (reação A), gerar 2,3-desidroadipil-CoA por desidratação de 3-hidroxiadipil-CoA (reação C) e gerar ácido α-hidromucônico a partir de 2,3-desidroadipil-CoA (reação F), uma combinação apropriada de ácidos nucleicos que codificam enzimas que catalisam as reações A, C e F pode ser introduzida para conferir ao micro-organismo essas habilidades de produção.

[063] Qualquer micro-organismo geneticamente modificado de acordo com a presente invenção pode produzir ácido adípico, desde que o micro-organismo tenha a capacidade de gerar 3-oxoadipil-CoA e coenzima A a partir de succinil-CoA (reação A), uma capacidade de gerar 2,3-desidroadipil- CoA por desidratação de 3-hidroxiadipil-CoA (reação C) e uma capacidade de gerar adipil-CoA pela redução de 2,3-desidroadipil-CoA (reação D) e uma capacidade de gerar ácido adípico a partir de adipil-CoA (reação G). Usando um micro-organismo com essas habilidades de produção como micro-

organismo hospedeiro, pode ser obtido um micro-organismo geneticamente modificado que pode produzir abundantemente ácido adípico. Os micro- organismos sobre os quais se especula possuírem originalmente as habilidades de produção acima incluem micro-organismos do gênero Thermobifida, como Thermobifida fusca.

[064] Nos casos em que um micro-organismo geneticamente modificado, de acordo com a presente invenção, que originalmente não tem capacidade de gerar 3-oxoadipil-CoA e coenzima A a partir de succinil-CoA (reação A), gerar 2,3-desidroadipil-CoA por desidratação de 3-hidroxia adil - CoA (reação C), gerar adipil-CoA, pela redução da 2,3-desidroadipil-CoA (reação D), e gerar ácido adípico a partir de adipil-CoA (reação G), uma combinação apropriada de ácidos nucleicos que codificam enzimas que catalisam as reações A, C, D e G pode ser introduzida no micro-organismo para dar ao micro-organismo essas habilidades de produção.

[065] Exemplos específicos das enzimas que catalisam as reações A e C a G são apresentados abaixo.

[066] Como enzima que catalisa a reação A para gerar 3- oxoadipil-CoA, pode-se utilizar, por exemplo, uma acil transferase (β- cetotiolase). A acil transferase não é limitada por um número específico na classificação EC e é preferencialmente uma acil transferase classificada como EC 2.3.1.-, incluindo especificamente uma enzima classificada como 3- oxoadipil-CoA tiolase e classificada como EC 2.3.1.174, uma enzima classificada como acetil-CoA C-acetiltransferase e classificada como EC

2.3.1.9 e uma enzima classificada como acetil-CoA C-acil transferase e classificada como EC 2.3.1.16. Entre elas, podem ser adequadamente utilizadas as enzimas PaaJ de Escherichia coli cepa MG1655 (NCBI Protein ID: NP_415915), PcaF de Pseudomonas putida cepa KT2440 (NCBI Protein ID: NP_743536) e enzimas similares.

[067] Se as acil transferases acima podem ou não gerar 3- oxoadipil-CoA a partir de succinil-CoA e acetil-CoA usadas como substratos podem ser determinadas medindo-se uma diminuição no NADH juntamente com a redução de 3-oxoadipil-CoA em uma combinação da reação para gerar 3-oxoadipil-CoA pela acil transferase purificada e reação para reduzir a 3- oxoadipil-CoA usada como substrato pela 3-oxoadipil-CoA redutase purificada.

O método de medição específico é, por exemplo, o seguinte.

[068] Identificação da atividade da acil transferase: Uma PCR usando o DNA genômico de uma cepa de micro-organismo em questão como molde é realizada de acordo com procedimentos de rotina, para amplificar um ácido nucleico que codifica uma acil transferase na forma de comprimento total.

O fragmento amplificado é inserido no sítio SacI do pACYCDuet-1 (fabricado pela Novagen), um vetor de expressão para E. coli, nas posições corretas de leitura (in-frame) com a sequência histidina-tag. O plasmídeo é introduzido em E. coli BL21 (DE3), e a expressão da enzima é induzida com isopropil-β- tiogalactopiranosídeo (IPTG) de acordo com procedimentos de rotina e a enzima é purificada usando o marcador histidina do líquido de cultura para obter uma solução de acil transferase. A atividade de acil transferase pode ser determinada usando a solução de enzima para preparar uma solução de reação enzimática com a seguinte composição e medindo uma diminuição na absorbância a 340 nm, acoplada à oxidação de NADH a 30ºC.

- 100 mM de Tris-HCl (pH 8,0) - 10 mM de MgCl2 - 0,1 mM de succinil-CoA - 0,2 mM de acetil-CoA - 0,2 mM de NADH - 1 mM de ditiotreitol - 10 μg/mL de 3-oxoadipil-CoA redutase

- 5 μg/mL de aciltransferase.

[069] Se uma enzima originalmente expressa em um micro- organismo hospedeiro usado na presente invenção possui atividade de acil transferase, essa presença de atividade pode ser determinada realizando a medição descrita acima usando o homogenato celular (extrato livre de células= CFE) em vez da acil transferase purificada. O método de medição específico direcionado para E. coli é, por exemplo, o seguinte.

[070] Preparação de CFE: Uma alça de platina de E. coli cepa MG1655 a ser submetida à medição da atividade é inoculada em 5 mL de um meio de cultura (composição do meio de cultura: 10 g/L de triptona, 5 g/L de extrato de levedura, 5 g/L de cloreto de sódio) ajustado para pH 7 e a mistura é incubada a 30ºC com agitação por 18 horas. O líquido de cultura obtido é adicionado a 5 mL de um meio de cultura (composição do meio de cultura: 10 g/L de triptona, 5 g/L de extrato de levedura, 5 g/L de cloreto de sódio, 2,5 mM de ácido ferúlico, 2,5 mM de ácido p-cumárico, 2,5 mM de ácido benzóico, 2,5 mM de ácido cis, cis-mucônico, 2,5 mM de ácido protocatecúico, 2,5 mM de catecol, 2,5 mM de 3OA, 2,5 mM de ácido 3-hidroxiadípico, 2,5 mM de ácido α- hidromucônico, 2,5 mM de ácido adípico, 2,5 mM de feniletilamina) ajustado para pH 7 e incubado a 30ºC com agitação por 3 horas.

[071] O líquido de cultura obtido é suplementado com 10 mL de cloreto de sódio a 0,9% e depois centrifugada para remover o sobrenadante das células bacterianas, e esta operação é repetida três vezes para lavar as células bacterianas. AS células bacterianas lavadas são suspensas em 1 mL de um tampão Tris-HCl composto por 100 mM de Tris-HCl (pH 8,0) e 1 mM de ditiotreitol, e esferas de vidro (com um diâmetro de 0,1 mm) são adicionadas à suspensão resultante para romper as células bacterianas a 4ºC com um disruptor ultrassônico. O homogenato bacteriano resultante é centrifugado para obter o sobrenadante e 0,5 mL do sobrenadante é filtrado através de uma membrana UF (Amicon Ultra-0,5 mL 10K; fabricado pela Merck Millipore) para remover o filtrado resultante, seguido pela aplicação de 0,4 mL do Tampão Tris-HCl à membrana de UF, e esta operação é repetida em um total de três vezes para remover impurezas de baixo peso molecular, e o sobrenadante resultante é então resuspenso em tampão Tris-HCl para um volume final de 0,1 mL, que é designado como CFE. Em vez da enzima purificada, adiciona-se 0,05 mL do CFE a um total de 0,1 mL da solução de reação enzimática para determinar a atividade enzimática.

[072] Como enzima que catalisa a reação C para gerar 2,3- desidroadipil-CoA pode-se utilizar, por exemplo, uma enoil-CoA hidratase. A enoil-CoA hidratase não é limitada por um número específico na classificação CE e é preferencialmente uma enoil-CoA hidratase classificada como EC

4.2.1.-, incluindo especificamente uma enzima classificada como enoil-CoA hidratase ou 2,3-desidroadipil-CoA hidratase e classificada como EC 4.2.1.17.

Entre elas, podem ser adequadamente utilizadas as enzimas PaaF de Escherichia coli cepa MG1655 (NCBI Protein ID: NP_415911), PaaF de Pseudomonas putida cepa KT2440 (NCBI Protein ID: NP_745427) e enzimas similares.

[073] Como a reação catalisada pela enoil-CoA hidratase é geralmente reversível, pode-se determinar se uma enoil-CoA hidratase tem ou não uma atividade para catalisar uma reação que gera 2,3-desidroadipil-CoA a partir de 3-hidroxiadipil-CoA usada como substrato através da detecção de 3- hidroxiadipil-CoA gerada utilizando enoil-CoA hidratase purificada com 2,3- desidroadipil-CoA utilizada como substrato da mesma, a qual é preparada a partir de ácido α-hidromucônico através de uma reação enzimática. O método de medição específico é, por exemplo, o seguinte.

[074] O ácido α-hidromucônico usado na reação acima pode ser reparado por um método conhecido (por exemplo, um método descrito no

Exemplo de Referência 1 do documento WO 2016/199858 A1).

[075] Preparação da solução de 2,3-desidroadipil-CoA: Uma PCR usando o DNA genômico de Pseudomonas putida cepa KT2440 como molde é realizada de acordo com procedimentos de rotina, para amplificar um ácido nucleico que codifica uma CoA transferase (incluindo pcaI e pcaJ; NCBI Gene IDs: 1046613 e 1046612) na forma de comprimento total. O fragmento amplificado é inserido no sítio KpnI do pRSF-1b (fabricado pela Novagen), um vetor de expressão para E. coli, nas posições corretas de leitura (in-frame) com a sequência histidina-tag. O plasmídeo é introduzido em E. coli BL21 (DE3), e a expressão da enzima é induzida com isopropil-β-tiogalactopiranosídeo (IPTG) de acordo com procedimentos de rotina e a enzima é purificada usando o marcador histidina do líquido de cultura para obter uma solução de CoA transferase. A solução é usada para preparar uma solução de reação enzimática para a preparação de 2,3-desidroadipil-CoA com a seguinte composição, que é permitida reagir a 30ºC por 10 minutos e depois filtrada através de uma membrana de UF (Amicon Ultra-0,5mL 10K; fabricado Merck Millipore) para remover a enzima, e o filtrado obtido é designado como solução de 2,3-desidroadipil-CoA.

[076] Solução de reação enzimática para preparação de 2,3- desidroadipil-CoA: - 100 mM de Tris-HCl (pH 8,0); - 10 mM de MgCl2; - 0,4 mM de succinil-CoA; - 2 mM de sal de sódio do ácido α-hidromucônico; e - 20 μg/mL de CoA transferase.

[077] Identificação da atividade de enoil-CoA hidratase: Uma PCR usando o DNA genômico de uma cepa de micro-organismo em questão como molde é realizada de acordo com procedimentos de rotina, para amplificar um ácido nucleico que codifica uma enoil-CoA hidratase na forma de comprimento total. O fragmento amplificado é inserido no sítio NdeI do pET-16b (fabricado pela Novagen), um vetor de expressão para E. coli, nas posições corretas de leitura (in-frame) com a sequência histidina-tag. O plasmídeo é introduzido em E. coli BL21 (DE3), e a expressão da enzima é induzida com isopropil-β-tiogalactopiranosídeo (IPTG) de acordo com procedimentos de rotina e a enzima é purificada usando o marcador histidina do líquido de cultura para obter uma solução de enoil-CoA hidratase. A solução é usada para preparar uma solução de reação enzimática com a seguinte composição, que é reagida a 30ºC por 10 minutos e depois filtrada através de uma membrana de UF (Amicon Ultra - 0,5mL 10K; fabricado pela Merck Millipore) para remover a enzima. A atividade de enoil-CoA hidratase pode ser confirmada através da detecção de 3-hidroxiadipil-CoA no filtrado resultante no espectrômetro de massa de cromatografia líquida em tandem de alto desempenho (LC-MS/MS) (Agilent Technologies, Inc.).

- 100 mM de Tris-HCl (pH 8,0) - 10 mM de MgCl2 - 300 μL/mL de solução de 2,3-desidroadipil-CoA - 1 mM de ditiotreitol - 20 μg/mL de enoil-CoA hidratase.

[078] Se uma enzima originalmente expressa em um micro- organismo hospedeiro usado na presente invenção possui atividade de enoil- CoA hidratase, essa presença de atividade pode ser determinada pela adição de 0,05 mL de CFE, em vez de enoil-CoA hidratase purificada, para um total de 0,1 mL da solução da reação enzimática e realizando a medição descrita acima. O método de preparação específico de CFE alvo para E. coli é conforme descrito para o CFE utilizado na determinação da atividade da acil transferase.

[079] Como enzima que catalisa a reação D para gerar adipil- CoA pode-se utilizar, por exemplo, uma enoil-CoA redutase. A enoil-CoA redutase não é limitada por um número específico na classificação EC, e é preferencialmente uma enoil-CoA redutase classificada como EC 1.3.-.-, especificamente incluindo uma enzima classificada como trans-2-enoil-CoA redutase e classificada como EC 1.3.1.44 e uma enzima classificada como acil- CoA desidrogenase e classificada como EC 1.3.8.7. Estes exemplos específicos são divulgados, por exemplo, nas publicações JP 2011-515111 A, J Appl Microbiol. 2015 Out; 119 (4): 1057-63 e similares; entre eles, TER de Euglena gracilis cepa Z (UniProtKB: Q5EU90), Tfu_1647 de Thermobifida fusca cepa YX (NCBI Protein ID: AAZ55682), DcaA de Acinetobacter baylyi cepa ADP1 (NCBI Protein ID: AAL09094.1) e semelhantes podem ser usados de maneira adequada.

[080] Se uma enoil-CoA redutase tem ou não uma atividade para gerar adipil-CoA a partir de 2,3-desidroadipil-CoA usado como substrato, essa presença ou ausência de atividade pode ser determinada medindo-se uma diminuição no NADH juntamente com a redução de 2,3-desidroadipil-CoA em uma reação usando enoil-CoA redutase purificada com 2,3-desidroadipil-CoA usado como substrato da mesma, que é preparado a partir do ácido α- hidromucônico através de outra reação enzimática.

[081] A preparação do ácido α-hidromucônico e uma solução de 2,3-desidroadipil-CoA podem ser realizadas da mesma maneira como foi descrito acima.

[082] Identificação da atividade de enoil-CoA redutase: Uma PCR usando o DNA genômico de uma cepa de micro-organismo em questão como molde é realizada de acordo com procedimentos de rotina, para amplificar um ácido nucleico que codifica uma enoil-CoA redutase na forma de comprimento total. O fragmento amplificado é inserido no sítio NdeI do pET-16b (fabricado pela Novagen), um vetor de expressão para E. coli, nas posições corretas de leitura (in-frame) com a sequência histidina-tag. O plasmídeo é introduzido em E. coli BL21 (DE3), e a expressão da enzima é induzida com isopropil-β- tiogalactopiranosídeo (IPTG) de acordo com procedimentos de rotina e a enzima é purificada usando o marcador histidina do líquido de cultura para obter uma solução de enoil-CoA redutase. A atividade da enoil-CoA redutase pode ser determinada usando a solução de enzima para preparar uma solução de reação enzimática com a seguinte composição e medindo uma diminuição na absorbância a 340 nm, acoplada à oxidação de NADH a 30ºC.

- 100 mM de Tris-HCl (pH 8,0) - 10 mM de MgCl2 - 300 μL/mL de solução de 2,3-desidroadipil-CoA - 0,2 mM de NADH - 1 mM de ditiotreitol - 20 μg/mL de enoil-CoA redutase.

[083] Se uma enzima originalmente expressa em um micro- organismo hospedeiro usado na presente invenção possui atividade de enoil- CoA redutase, essa presença de atividade pode ser determinada pela adição de 0,05 mL de CFE, em vez de enoil-CoA redutase purificada, para um total de 0,1 mL da solução da reação enzimática e realizando a medição descrita acima. O método de preparação específico de CFE alvo para E. coli é conforme descrito para o CFE utilizado na determinação da atividade da acil transferase.

[084] Como enzima que catalisa a reação E para gerar ácido 3- hidroxiadípico, a reação F para gerar ácido α-hidromucônico e a reação G para gerar ácido adípico pode-se utilizar, por exemplo, uma CoA transferase ou uma acil-CoA hidrolase, de preferência uma CoA transferase.

[085] A CoA transferase não é limitada por um número específico na classificação EC e é preferencialmente uma CoA transferase classificada como EC 2.8.3.-, especificamente incluindo uma enzima classificada como CoA transferase ou acil-CoA transferase e classificada como EC 2.8.3.6, e similares.

[086] Na presente invenção, o termo “CoA transferase” refere-se a uma enzima com atividade (atividade CoA transferase) para catalisar uma reação que gera ácido carboxílico e succinil-CoA a partir de acil-CoA e ácido succínico usado como substratos.

[087] Como enzima que catalisa a reação E para gerar ácido 3- hidroxiadípico e a reação F para gerar ácido α-hidromucônico, pode-se utilizar adequadamente a PcaI e PcaJ de Pseudomonas putida cepa KT2440 (NCBI Protein IDs: NP_746081 e NP_746082) e semelhantes, entre outros.

[088] Como enzima que catalisa a reação G para gerar ácido adípico, as enzimas DcaI e DcaJ de Acinetobacter baylyi cepa ADP1 (NCBI Protein IDs: CAG68538 e CAG68539) e similares podem ser adequadamente utilizadas.

[089] Como as reações enzimáticas acima são reversíveis, a atividade da CoA transferase contra 3-hidroxiadipil-CoA, 2,3-desidroadipil-CoA ou adipil-CoA usadas como substrato podem ser determinadas pela detecção de 3-hidroxiadipil-CoA, 2,3-desidroadipil-CoA ou adipil-CoA geradas, respectivamente, usando CoA transferase purificada com ácido 3- hidroxiadípico e succinil-CoA, ácido α-hidromucônico e succinil-CoA, ou ácido adípico e succinil-CoA usados como substratos dos mesmos. O método de medição específico é, por exemplo, o seguinte.

[100] Preparação de ácido 3-hidroxiadípico: A preparação do ácido 3-hidroxiadípico é realizada de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1 do documento WO 2016/199856 A1.

[101] Identificação da atividade da CoA transferase usando ácido 3-hidroxiadípico como substrato: Uma PCR usando o DNA genômico de uma cepa de micro-organismo em questão como molde é realizada de acordo com procedimentos de rotina, para amplificar um ácido nucleico que codifica uma CoA transferase na forma de comprimento total. O fragmento amplificado é inserido no sítio KpnI do pRSF-1b (fabricado pela Novagen), um vetor de expressão para E. coli, nas posições corretas de leitura (in-frame) com a sequência histidina-tag. O plasmídeo é introduzido em E. coli BL21 (DE3), e a expressão da enzima é induzida com isopropil-β-tiogalactopiranosídeo (IPTG) de acordo com procedimentos de rotina e a enzima é purificada usando o marcador histidina do líquido de cultura para obter uma solução de CoA transferase. A solução é usada para preparar uma solução de reação enzimática com a seguinte composição, que é reagida a 30ºC por 10 minutos e depois filtrada através de uma membrana de UF (Amicon Ultra - 0,5mL 10K; fabricado pela Merck Millipore) para remover a enzima. A atividade da CoA transferase pode ser confirmada através da detecção de 3-hidroxiadipil-CoA no filtrado resultante no espectrômetro de massa de cromatografia líquida em tandem de alto desempenho (LC-MS/MS) (Agilent Technologies, Inc.).

- 100 mM de Tris-HCl (pH 8,0) - 10 mM de MgCl2 - 0,4 mM de succinil-CoA - 2 mM de sal de sódio de ácido 3-hidroxiadípico - 20 μg/mL de CoA transferase.

[102] Preparação de ácido α-hidromucônico: A preparação do ácido 3-hidroxiadípico é realizada de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1 do documento WO 2016/199858 A1.

[103] Identificação da atividade da CoA transferase usando αcido α-hidromucônico como substrato: Uma PCR usando o DNA genômico de uma cepa de micro-organismo em questão como molde é realizada de acordo com procedimentos de rotina, para amplificar um ácido nucleico que codifica uma

CoA transferase na forma de comprimento total. O fragmento amplificado é inserido no sítio KpnI do pRSF-1b (fabricado pela Novagen), um vetor de expressão para E. coli, nas posições corretas de leitura (in-frame) com a sequência histidina-tag. O plasmídeo é introduzido em E. coli BL21 (DE3), e a expressão da enzima é induzida com isopropil-β-tiogalactopiranosídeo (IPTG) de acordo com procedimentos de rotina e a enzima é purificada usando o marcador histidina do líquido de cultura para obter uma solução de CoA transferase. A solução é usada para preparar uma solução de reação enzimática com a seguinte composição, que é reagida a 30ºC por 10 minutos e depois filtrada através de uma membrana de UF (Amicon Ultra - 0,5mL 10K; fabricado pela Merck Millipore) para remover a enzima. A atividade de CoA transferase pode ser confirmada através da detecção de 2,3-desidroadipil-CoA no filtrado resultante no espectrômetro de massa de cromatografia líquida em tandem de alto desempenho (LC-MS/MS) (Agilent Technologies, Inc.).

- 100 mM de Tris-HCl (pH 8,0) - 10 mM de MgCl2 - 0,4 mM de succinil-CoA - 2 mM de sal de sódio de ácido α-hidromucônico - 20 μg/mL de CoA transferase.

[104] Identificação da atividade da CoA transferase usando αcido adípico como substrato: Uma PCR usando o DNA genômico de uma cepa de micro-organismo em questão como molde é realizada de acordo com procedimentos de rotina, para amplificar um ácido nucleico que codifica uma CoA transferase na forma de comprimento total. O fragmento amplificado é inserido no sítio KpnI do pRSF-1b (fabricado pela Novagen), um vetor de expressão para E. coli, nas posições corretas de leitura (in-frame) com a sequência histidina-tag. O plasmídeo é introduzido em E. coli BL21 (DE3), e a expressão da enzima é induzida com isopropil-β-tiogalactopiranosídeo (IPTG)

de acordo com procedimentos de rotina e a enzima é purificada usando o marcador histidina do líquido de cultura para obter uma solução de CoA transferase. A solução é usada para preparar uma solução de reação enzimática com a seguinte composição, que é reagida a 30ºC por 10 minutos e depois filtrada através de uma membrana de UF (Amicon Ultra - 0,5mL 10K; fabricado pela Merck Millipore) para remover a enzima. A atividade de CoA transferase pode ser confirmada através da detecção de adipil-CoA no filtrado resultante no espectrômetro de massa de cromatografia líquida em tandem de alto desempenho (LC-MS/MS) (Agilent Technologies, Inc.).

- 100 mM de Tris-HCl (pH 8,0) - 10 mM de MgCl2 - 0,4 mM de succinil-CoA - 2 mM de sal de sódio de ácido adípico - 20 μg/mL de CoA transferase.

[105] Se uma enzima originalmente expressa em um micro- organismo hospedeiro usado na presente invenção possui atividade de CoA transferase, essa presença de atividade pode ser determinada pela adição de 0,05 mL de CFE, em vez de CoA transferase purificada, para um total de 0,1 mL da solução da reação enzimática e realizando a medição descrita acima. O método de preparação específico de CFE alvo para E. coli é conforme descrito para o CFE utilizado na determinação da atividade da acil transferase.

[106] Os polipeptídeos descritos em (a) a (c) ou a 3-hidroxibutiril- CoA desidrogenase na presente invenção são caracterizados por terem uma atividade mais alta que as de enzimas 3-oxoadipil-CoA redutases usadas nas técnicas convencionais. A esse respeito, a frase “atividade mais alta” refere-se à produção de ácido 3-hidroxiadípico, ácido α-hidromucônico ou ácido adípico com maior rendimento em um micro-organismo geneticamente modificado que expressa qualquer um dos polipeptídeos do que em um micro-organismo geneticamente modificado que expressa uma 3-oxoadipil-CoA redutase convencional quando esses micro-organismos são derivados da mesma espécie de micro-organismo hospedeiro e são cultivados sob as mesmas condições de expressão em um meio de cultura contendo uma fonte de carbono como material para fermentação. A este respeito, o rendimento do ácido 3-hidroxiadípico é calculado de acordo com a fórmula (3). O rendimento de ácido α-hidromucônico ou ácido adípico é calculado de acordo com a fórmula (3), em que o ácido 3-hidroxiadípico é substituído por ácido α- hidromucônico ou ácido adípico, respectivamente.

Rendimento (%) = quantidade de ácido 3-hidroxiadípico formado (mol) / quantidade de fonte de carbono consumida (mol) x 100 (3)

[107] O método específico para confirmar a atividade mais alta dos polipeptídeos descritos em (a) a (c) ou a 3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase na presente invenção comparada com a atividade de enzimas 3-oxoadipil-CoA redutases usadas nas técnicas convencionais é o seguinte. O vetor pBBR1MCS-2, que é capaz de se autorreplicar em E. coli (M.E. Kovach, (1995), Gene 166: 175-176), é clivado com Xhol para a obtenção de pBBR1MCS-2/XhoI. Para integrar um promotor de expressão constitutivo ao vetor, uma região 200-b a montante de gapA (NCBI Gene ID: NC_000913.3) é amplificada por PCR usando o DNA genômico de Escherichia coli K-12 MG1655 como molde de acordo com procedimentos de rotina (por exemplo, são utilizados iniciadores representados pelas SEQ ID NOs: 18 e 19), e o fragmento resultante e o pBBR1MCS-2/XhoI são unidos usando o kit In-Fusion HD Cloning Kit (fabricado pela Clontech) para obter o plasmídeo pBBR1MCS - 2::Pgap. O pBBR1MCS-2::Pgap é clivado com ScaI para se obter pBBR1MCS- 2::PgapA/ScaI. Um ácido nucleico que codifica uma acil transferase na forma completa (comprimento total) é amplificado por PCR de acordo com procedimentos de rotina (por exemplo, são utilizados iniciadores representados pelas SEQ ID NOs: 21 e 22) e o fragmento resultante e o pBBR1MCS- 2::Pgap/ScaI são ligados usando o kit In-Fusion HD Cloning Kit para se obter o plasmídeo pBBR1MCS-2::AT. O pBBR1MCS-2::AT é clivado com HpaI para se obter pBBR1MCS-2::AT/HpaI. Um ácido nucleico que codifica uma CoA transferase na forma completa (comprimento total) é amplificado por PCR de acordo com procedimentos de rotina (por exemplo, são utilizados iniciadores representados pelas SEQ ID NOs: 25 e 26) e o fragmento resultante e o pBBR1MCS-2::AT/HpaI são ligados usando o kit In-Fusion HD Cloning Kit para se obter o plasmídeo pBBR1MCS-2::ATCT.

[108] Por outro lado, o vetor de expressão pACYCDuet-1 (fabricado pela Novagen), que é capaz de se autorreplicar em E. coli, é clivado com BamHI para obter pACYCDuet-1/BamHI. Um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo representado por qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 16 ou 70 a 138, ou que codifica uma 3-oxoadipil-CoA redutase convencionalmente usada, é amplificado por PCR de acordo com os procedimentos de rotina (por exemplo, iniciadores representados pelas SEQ ID NOs: 31 e 32) e o fragmento resultante e o pACYCDuet-1/BamHI são ligados usando o kit In-Fusion HD Cloning Kit (fabricado por Clontech) para obter um plasmídeo para expressão do polipeptídeo representado por qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 16 ou 70 a 138, ou expressão da 3-oxoadipil-CoA redutase convencionalmente usada.

[109] O plasmídeo obtido e o pBBR1MCS-2::ATCT são introduzidos em E. coli cepa BL21 (DE3) por eletroporação (N.M. Calvin, P.C.

Hanawalt. J. Bacteriol, 170 (1988), pp. 2796-2801). Uma alça de platina da cepa após a introdução é inoculada em 5 mL do meio de cultura I (10 g/L Bacto Triptona (fabricado pela Difco Laboratories), 5 g/L de extrato de levedura Bacto Yeast Extract (fabricado pela Difco Laboratories), 5 g/L de cloreto de sódio, 25 μg/mL de canamicina e 15 μg/mL de cloranfenicol) ajustado em pH 7 e o meio foi incubado a 30ºC com agitação a 120 min -1 por 18 horas. Posteriormente, 0,25 mL do líquido de cultura é adicionado a 5 mL do meio de cultura II (10 g/L de ácido succínico, 10 g/L de glicose, 1 g/L de sulfato de amônio, 50 mM de fosfato de potássio, 0,025 g/L de sulfato de magnésio, 0,0625 mg/L de sulfato de ferro, 2,7 mg/L de sulfato de manganês, 0,33 mg/L de cloreto de cálcio, 1,25 g/L de cloreto de sódio, 2,5 g/L de Bacto triptona, 1,25 g/L de extrato de levedura de Bacto, 25 μg/mL de canamicina e 15 μg/mL de cloranfenicol e 0,01 mM de IPTG) ajustado para pH 6,5, e incubado a 30ºC com agitação de 120 min-1 por 24 horas. O sobrenadante separado das células bacterianas por centrifugação do líquido de cultura é processado por tratamento de membrana usando Millex-GV (0,22 μm; PVDF; fabricado pela Merck KGaA), e o filtrado resultante é analisado para medir as concentrações de ácido 3-hidroxiadípico e fonte de carbono no sobrenadante de cultura. A análise quantitativa de ácido 3- hidroxiadípico por LC-MS/MS foi realizada nas seguintes condições.

HPLC: 1290 Infinity (fabricado pela Agilent Technologies, Inc.); Coluna: Synergi hydro-RP (fabricada pela Phenomenex); comprimento, 100 mm; diâmetro interno, 3 mm; tamanho de partícula, 2,5 μm Fase móvel: Solução de ácido fórmico aquoso a 0,1%/metanol = 70/30 Velocidade de fluxo: 0,3 mL/minuto Temperatura de coluna:40ºC Detector LC: DAD (210 nm) MS/MS: Triple-Quad LC/MS (fabricado pela Agilent Technologies, Inc.) Método de ionização: ESI em modo negativo.

[110] A análise quantitativa de fontes de carbono, tais como os açúcares e ácido succínico, por HPLC, é realizada sob as seguintes condições.

HPLC: Shimadzu Prominence (fabricado pela Shimadzu Corporation) Coluna: Shodex Sugar SH1011 (fabricada pela Showa Denko K.K.); comprimento, 300 mm; diâmetro interno, 8 mm; tamanho de partícula, 6 μm Fase móvel: 0,05M de solução aquosa de ácido sulfúrico Velocidade de fluxo: 0,6 mL/minuto Temperatura da coluna:65ºC Detector: RI.

[111] Quando um ácido nucleico que codifica qualquer uma das enzimas selecionadas a partir do grupo de acil transferase, CoA transferase, enoil-CoA hidratase e enoil-CoA redutase é introduzido em um micro- organismo hospedeiro na presente invenção, o ácido nucleico pode ser artificialmente sintetizado com base nas informações de sequências de aminoácidos da enzima em um banco de dados ou podem ser isolados a partir do ambiente natural. Nos casos em que o ácido nucleico é sintetizado artificialmente, a frequência de uso dos códons correspondentes para cada aminoácido na sequência de ácido nucleico pode ser alterada dependendo do micro-organismo hospedeiro no qual o ácido nucleico é introduzido.

[112] Na presente invenção, o método de introdução de um ácido nucleico que codifica qualquer polipeptídeo selecionado a partir do grupo de acil transferase, CoA transferase, enoil-CoA hidratase e enoil-CoA redutase no método do micro-organismo hospedeiro não se limita a um método específico; por exemplo, pode ser utilizado um método no qual o ácido nucleico é integrado a um vetor de expressão capaz de replicação autônoma no micro- organismo hospedeiro e, em seguida, tal vetor é introduzido no micro- organismo hospedeiro, ou um método no qual o ácido nucleico é integrado ao genoma do micro-organismo hospedeiro.

[113] Nos casos em que os ácidos nucleicos que codificam as enzimas são isolados do ambiente natural, os organismos como fontes dos genes não se limitam a organismos específicos e exemplos de organismos incluem aqueles do gênero Acinetobacter, tal como Acinetobacter baylyi e Acinetobacter radioresistens; do gênero Aerobacter, tal como Aerobacter cloacae; do gênero Alcaligenes, tal como Alcaligenes faecalis; do gênero Bacillus, tal como Bacillus badius, Bacillus magaterium, e Bacillus roseus; do gênero Brevibacterium, tal como Brevibacterium iodinum; do gênero Corynebacterium, tal como Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, e Corynebacterium glutamicum; do gênero Cupriavidus, tal como Cupriavidus metallidurans, Cupriavidus necator, Cupriavidus numazuensis, e Cupriavidus oxalaticus; do gênero Delftia, tal como Delftia acidovorans; do gênero Escherichia, tal como Escherichia coli e Escherichia fergusonii; do gênero Hafnia, tal como Hafnia alvei; do gênero Microbacterium, tal como Microbacterium ammoniaphilum; do gênero Nocardioides, tal como Nocardioides albus; do gênero Planomicrobium, tal como Planomicrobium okeanokoites; do gênero Pseudomonas, tal como Pseudomonas azotoformans, Pseudomonas chlororaphis, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas fragi, Pseudomonas putida, e Pseudomonas reptilivora; do gênero Rhizobium, tal como Rhizobium radiobacter; do gênero Rhodosporidium, tal como Rhodosporidium toruloides; do gênero Saccharomyces, tal como Saccharomyces cerevisiae; do gênero Serratia, tal como Serratia entomophila, Serratia ficaria, Serratia fonticola, Serratia grimesii, Serratia nematodiphila,

Serratia odorifera, e Serratia plymuthica; do gênero Shimwellia, tal como Shimwellia blattae; do gênero Streptomyces, tal como Streptomyces vinaceus, Streptomyces karnatakensis, Streptomyces olivaceus, e Streptomyces vinaceus; do gênero Yarrowia, tal como Yarrowia lipolytica; do gênero Yersinia, tal como Yersinia ruckeri; do gênero Euglena, tal como Euglena gracilis; e do gênero Thermobifida, tal como Thermobifida fusca; preferencialmente micro- organismos do gênero Acinetobacter, Corynebacterium, Escherichia, Pseudomonas, Serratia, Euglena, e Thermobifida.

[114] Quando um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo expresso na presente invenção é integrado a um vetor de expressão ou ao genoma de um micro-organismo hospedeiro, o ácido nucleico a ser integrado ao vetor de expressão ou o genoma é preferencialmente composto por um promotor, uma sequência de ligação ao ribossomo, um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo a ser expresso e uma sequência de terminação da transcrição e pode adicionalmente conter um gene que controla a atividade do promotor.

[115] O promotor utilizado na presente invenção não está limitado a um promotor particular, desde que o promotor conduza a expressão da enzima no micro-organismo hospedeiro; exemplos de promotores incluem promotor gap, promotor trp, promotor lac, promotor tac e promotor T7.

[116] Nos casos em que um vetor de expressão é usado na presente invenção para introduzir o ácido nucleico ou aprimorar a expressão do polipeptídeo, o vetor de expressão não está limitado a um vetor específico, desde que o vetor seja capaz de replicação autônoma no micro-organismo; exemplos de vetores incluem o vetor pBBR1MCS, vetor pBR322, vetor pMW, vetor pET, vetor pRSF, vetor pCDF, vetor pACYC e derivados dos vetores acima.

[117] Nos casos em que um ácido nucleico para integração do genoma é usado na presente invenção para introduzir o ácido nucleico ou para melhorar a expressão do polipeptídeo, o ácido nucleico para a integração do genoma é introduzido por recombinação homóloga sítio-específica. O método para a recombinação homóloga síto-específica não se limita a um método específico, e exemplos do método incluem um método no qual são utilizadas recombinase λ Red e FLP (Proc Natl Acad Sci USA 2000 6 de junho; 97 (12): 6640 -6645), e um método no qual a recombinase λ Red e o gene sacB são usados (Biosci Biotechnol Biochem. Dez de 2007; 71 (12): 2905-11).

[118] O método de introdução do vetor de expressão ou do ácido nucleico para integração do genoma não se limita a um método específico, desde que o método seja para a introdução de um ácido nucleico em um micro- organismo; exemplos do método incluem o método do íon cálcio (Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)) e eletroporação (NM Calvin, PC Hanawalt.

J. Bacteriol, 170 (1988), pp. 2796-2801).

[119] Na presente invenção, um micro-organismo geneticamente modificado no qual um ácido nucleico que codifica uma 3-oxoadipil-CoA redutase é introduzido ou a expressão do polipeptídeo correspondente é melhorada, é cultivado em um meio de cultura, preferencialmente um meio de cultura líquido, contendo uma fonte de carbono como um material para fermentação que pode ser usada por micro-organismos comuns. O meio de cultura utilizado contém, além da fonte de carbono que pode ser usada pelo micro-organismo geneticamente modificado, quantidades apropriadas de uma fonte de nitrogênio, sais inorgânicos e, se necessário, nutrientes orgânicos, como aminoácidos e vitaminas. Qualquer um dos meios de cultura naturais e sintéticos pode ser utilizado desde que o meio contenha os nutrientes descritos acima.

[120] O material para fermentação é um material que pode ser metabolizado pelo micro-organismo geneticamente modificado. O termo

“metabolizar” refere-se à conversão de uma substância química, que um micro- organismo retirou do ambiente extracelular ou gerado intracelularmente a partir de uma substância química diferente, para outra substância química através de uma reação enzimática. Os açúcares podem ser adequadamente utilizados como fonte de carbono. Exemplos específicos dos açúcares incluem monossacarídeos como glicose, sacarose, frutose, galactose, manose, xilose e arabinose, dissacarídeos e polissacarídeos formados pela ligação desses monossacarídeos, e solução de amido sacarificado, melaço e solução sacarificada a partir de biomassa contendo celulose contendo cada qualquer um desses sacarídeos.

[121] Além dos açúcares acima, o ácido succínico, um substrato da CoA transferase, também pode ser adicionado ao meio de cultura para produção eficiente de ácido 3-hidroxiadípico, ácido α-hidromucônico e/ou ácido adípico.

[122] As fontes de carbono listadas acima podem ser usadas individualmente ou em combinação. Quando uma fonte de carbono é adicionada, a concentração da fonte de carbono no meio de cultura não é particularmente limitada e pode ser selecionada adequadamente, dependendo do tipo de fonte de carbono; no caso de açúcares, a concentração é preferencialmente de 5 g/L a 300 g/L; no caso de ácido succínico, a concentração é preferencialmente de 0,1 g/L a 100 g/L.

[123] Como fonte de nitrogênio usada para a cultura de micro- organismos geneticamente modificados, por exemplo, gás de amônia, amônia aquosa, sais de amônio, ureia, sais de ácido nítrico, outras fontes de nitrogênio orgânico usadas de forma favorável, como bolos de óleo, hidrolisado de soja, produtos de degradação de caseína, outros aminoácidos; podem ser usadas vitaminas, efluente de milho, levedura ou extrato de levedura, extrato de carne, peptídeos como peptona e células bacterianas e hidrolisado de várias bactérias fermentativas. A concentração da fonte de nitrogênio no meio de cultura não é particularmente limitada, e é preferivelmente de 0,1 g/l a 50 g/l.

[124] Como sais inorgânicos utilizados para a cultura do micro- organismo geneticamente modificado, por exemplo, sais de ácido fosfórico, sais de magnésio, sais de cálcio, sais de ferro e sais de manganês podem ser apropriadamente adicionados ao meio de cultura e utilizados.

[125] As condições de cultura para o micro-organismo geneticamente modificado para produzir ácido 3-hidroxiadípico, ácido α- hidromucônico e/ou ácido adípico são definidas ajustando ou selecionando apropriadamente, por exemplo, o meio de cultura com a composição acima, temperatura de cultura, velocidade de agitação, pH, taxa de proporção e quantidade de inoculação, dependendo, por exemplo, das espécies de micro- organismo geneticamente modificado e das condições externas. Nos casos em que a formação de espuma ocorre na cultura líquida, um agente antiespuma, tal como óleo mineral, óleo de silicone ou tensoativo, pode ser adequadamente incluído ao meio conforme apropriado.

[126] Após a produção de uma quantidade recuperável de ácido 3-hidroxiadípico, ácido α-hidromucônico e/ou ácido adípico durante a cultura do micro-organismo, os produtos produzidos podem ser recuperados. Os produtos produzidos podem ser recuperados, por exemplo, isolados, de acordo com um método comumente usado, no qual a cultura é interrompida quando um produto de interesse é acumulado até um nível apropriado e o produto de fermentação é coletado a partir da cultura. Especificamente, os produtos podem ser isolados da cultura por separação de células bacterianas através de, por exemplo, centrifugação ou filtração antes, por exemplo, da cromatografia em coluna, cromatografia de troca iônica, tratamento de carvão ativado, cristalização, separação por membrana ou destilação. Mais especificamente, os exemplos incluem, mas não estão limitados a, um método no qual um componente ácido é adicionado aos sais dos produtos e o precipitado resultante é coletado; um método no qual a água é removida da cultura por concentração usando, por exemplo, uma membrana de osmose reversa ou um evaporador para aumentar as concentrações dos produtos e os produtos e/ou sais dos produtos são então cristalizados e precipitados por resfriamento ou cristalização adiabática para recuperar os cristais dos produtos e/ou sais dos produtos, por exemplo, por centrifugação ou filtração; e um método no qual um álcool é adicionado à cultura para produzir ésteres dos produtos e os ésteres resultantes dos produtos são subsequentemente coletados por destilação e depois hidrolisados para recuperar os produtos. Esses métodos de recuperação podem ser selecionados e otimizados adequadamente, dependendo, por exemplo, das propriedades físicas dos produtos.

EXEMPLOS

[127] A presente invenção passará a ser descrita de maneira específica por meio de Exemplos.

EXEMPLO DE REFERÊNCIA 1

PRODUÇÃO DE UM PLASMÍDEO PARA EXPRESSÃO DE UMA ENZIMA QUE CATALISA UMA REAÇÃO PARA GERAR 3-OXOADIPIL-COA E COENZIMA A A PARTIR DE ACETIL- COA E SUCCINIL-COA (REAÇÃO A) E UMA ENZIMA QUE CATALISA UMA REAÇÃO PARA GERAR ÁCIDO 3-HIDROXIADÍPICO DE 3-HIDROXIADIPIL-COA (REAÇÃO E) E UMA REAÇÃO PARA GERAR ÁCIDO Α-HIDROMUCÔNICO A PARTIR DE 2,3- DESIDROADIPIL-COA (REAÇÃO F)

[128] O vetor pBBR1MCS-2, que é capaz de replicação autônoma em E. coli (M.E. Kovach, (1995), Gene 166: 175-176), é clivado com Xhol para a obtenção de pBBR1MCS-2/XhoI. Para integrar um promotor de expressão constitutivo ao vetor, os iniciadores (SEQ ID NOs: 18 e 19) foram projetados para uso na amplificação de uma região a montante 200 pb (SEQ ID NO: 17) de gapA (NCBI Gene ID: NC_000913.3) por PCR usando o DNA genômico de Escherichia coli K-12 MG1655 como molde e uma reação de PCR foi realizada de acordo com procedimentos de rotina. O fragmento resultante e o pBBR1MCS-2/Xhol foram ligados em conjunto, utilizando o kit de clonagem In-Fusion HD Cloning Kit (fabricado pela Clontech), e o plasmídeo resultante foi introduzido em E. coli cepa DH5α. A sequência nucleotídica no plasmídeo extraída da cepa recombinante de E. coli foi confirmada de acordo com procedimentos de rotina e o plasmídeo foi designado como pBBR1MCS- 2::Pgap. Em seguida, o plasmídeo pBBR1MCS-2::Pgap foi clivado com ScaI para se obter pBBR1MCS-2::Pgap/ScaI. Para amplificar um gene que codifica uma enzima que catalisa a reação A, os iniciadores (SEQ ID NOs: 21 e 22) foram projetados para uso na amplificação de todo o comprimento do gene da acil transferase PcaF (NCBI Gene ID: 1041755; SEQ ID NO: 20) por PCR usando o DNA genômico de Pseudomonas putida cepa KT2440 como molde e uma reação de PCR foi realizada de acordo com procedimentos de rotina. O fragmento resultante e o pBBR1MCS-2/Pgap/ScaI foram ligados em conjunto, utilizando o kit de clonagem In-Fusion HD Cloning Kit, e o plasmídeo resultante foi introduzido em E. coli cepa DH5α. A sequência nucleotídica no plasmídeo isolado da cepa recombinante obtida foi confirmada de acordo com procedimentos de rotina, e o plasmídeo foi designado como pBBR1MCS-2::AT.

Em seguida, o pBBR1MCS-2::AT é clivado com HpaI para se obter pBBR1MCS-2::AT/HpaI. Para amplificar um gene que codifica uma enzima que catalisa as reações E e F, os iniciadores (SEQ ID NOs: 25 e 26) foram projetados para uso na amplificação de uma sequência contígua incluindo os genes de comprimento total juntos que codificam uma CoA transferase, pcal e pcaJ (NCBI Gene ID: 1046613 e 1046612, SEQ ID NOs: 23, 24) por PCR usando o DNA genômico de Pseudomonas putida cepa KT2440 como molde; e uma reação de PCR foi realizada de acordo com procedimentos de rotina. O fragmento resultante e o pBBR1MCS-2/AT/Hpal foram ligados em conjunto,

utilizando o kit de clonagem In-Fusion HD Cloning Kit, e o plasmídeo resultante foi introduzido em E. coli cepa DH5α. A sequência nucleotídica no plasmídeo isolado da cepa recombinante obtida foi confirmada de acordo com procedimentos de rotina, e o plasmídeo foi designado como pBBR1MCS- 2::ATCT.

EXEMPLO DE REFERÊNCIA 2

PRODUÇÃO DE PLASMÍDEOS PARA EXPRESSÃO DE POLIPEPTÍDEOS REPRESENTADOS PELAS SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6 E 213.

[129] O vetor de expressão pACYCDuet-1 (fabricado pela Novagen), que é capaz de replicação autônoma em E. coli, foi clivado com BamHI para obter pACYCDuet-1/BamHI. Para amplificar um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo representado pela SEQ ID NO: 1, os iniciadores (SEQ ID NOs: 31 e 32) foram projetados para uso na amplificação de um ácido nucleico representado pela SEQ ID NO: 54 usando o DNA genômico de Serratia marcescens cepa ATCC13880 como molde; e uma reação de PCR foi realizada de acordo com procedimentos de rotina. Para amplificar um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo representado pela SEQ ID NO: 2, os iniciadores (SEQ ID NOs: 33 e 34) foram projetados para uso na amplificação de um ácido nucleico representado pela SEQ ID NO: 55 usando o DNA genômico de Serratia nematodiphila cepa DSM21420 como molde; e uma reação de PCR foi realizada de acordo com procedimentos de rotina. Para amplificar um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo representado pela SEQ ID NO: 3, os iniciadores (SEQ ID NOs: 35 e 36) foram projetados para uso na amplificação de um ácido nucleico representado pela SEQ ID NO: 56 usando o DNA genômico de Serratia plymuthica cepa NBRC102599 como molde; e uma reação de PCR foi realizada de acordo com procedimentos de rotina. Para amplificar um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo representado pela SEQ ID NO: 4, os iniciadores (SEQ ID NOs: 37 e 38) foram projetados para uso na amplificação de um ácido nucleico representado pela SEQ ID NO: 57 usando o DNA genômico de Serratia proteamaculans cepa 568 como molde; e uma reação de PCR foi realizada de acordo com procedimentos de rotina. Para amplificar um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo representado pela SEQ ID NO: 5, os iniciadores (SEQ ID NOs: 215 e 216) foram projetados para uso na amplificação de um ácido nucleico representado pela SEQ ID NO: 58 usando o DNA genômico de Serratia ureilytica cepa Lr5/4 como molde; e uma reação de PCR foi realizada de acordo com procedimentos de rotina. Para amplificar um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo representado pela SEQ ID NO: 6, os iniciadores (SEQ ID NOs: 217 e 218) foram projetados para uso na amplificação de um ácido nucleico representado pela SEQ ID NO: 59 usando o DNA genômico de Serratia sp. cepa BW106 como molde; e uma reação de PCR foi realizada de acordo com procedimentos de rotina. Para amplificar um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo representado pela SEQ ID NO: 213, os iniciadores (SEQ ID NOs: 219 e 220) foram projetados para uso na amplificação de um ácido nucleico representado pela SEQ ID NO: 214 usando o DNA genômico de Serratia liquefaciens cepa FK01 como molde; e uma reação de PCR foi realizada de acordo com procedimentos de rotina. Cada um dos fragmentos obtidos e o pACYCDuet- 1/BamHI foram unidos utilizando o kit de clonagem In-Fusion HD Cloning Kit (fabricado pela Clontech), e cada um dos plasmídeos resultantes foi introduzido em E. coli cepa DH5α. As sequências nucleotídicas nos plasmídeos isolados das cepas recombinantes obtidas foram confirmadas de acordo com procedimentos de rotina. A expressão do gene da 3-oxoadipil-CoA redutase integrada em cada um dos plasmídeos é induzida por IPTG, o que resultou na adição de 14 aminoácidos extras, incluindo um marcador de histidina N- terminal do polipeptídeo expresso.

[130] O plasmídeo para expressão do polipeptídeo representado pela SEQ ID NO: 1 é designado como “pACYCDuet-1::Smr1”; o plasmídeo para a expressão do polipeptídeo representado pela SEQ ID NO: 2 é designado como “pACYCDuet-1::Snm1”; o plasmídeo para a expressão do polipeptídeo representado pela SEQ ID NO: 3 é designado como “pACYCDuet-1::Spl1”; o plasmídeo para a expressão do polipeptídeo representado pela SEQ ID NO: 4 é designado como “pACYCDuet-1::Spe1”; o plasmídeo para a expressão do polipeptídeo representado pela SEQ ID NO: 5 é designado como “pACYCDuet- 1::Sur1”; o plasmídeo para a expressão do polipeptídeo representado pela SEQ ID NO: 6 é designado como “pACYCDuet-1::Ssp1”; e o plasmídeo para a expressão do polipeptídeo representado pela SEQ ID NO: 213 é designado como “pACYCDuet-1::Slq1”. As informações sobre esses plasmídeos são apresentadas na Tabela 6.

EXEMPLO DE REFERÊNCIA 3 PRODUÇÃO DE PLASMÍDEOS PARA EXPRESSÃO DE 3-OXOADIPIL-COA REDUTASE

[131] Além dos plasmídeos para expressão dos polipeptídeos descritos em (a) a (c) de acordo com a presente invenção, foram produzidos plasmídeos para expressão de quatro enzimas diferentes, cada uma delas catalisando uma reação de redução para gerar 3-hidroxiacil-CoA a partir de 3- oxoacil-CoA usado como substrato. Foram utilizados quatro genes, nomeadamente paaH de Pseudomonas putida cepa KT2440 (SEQ ID NO: 27), paaH de Escherichia coli cepa K-12 subcepa MG1655 (SEQ ID NO: 28), dcaH de Acinetobacter baylyi cepa ADP1 (SEQ ID NO: 29) e paaH de Serratia plymuthica cepa NBRC102599 (SEQ ID NO: 30). Os plasmídeos foram produzidos da mesma maneira que no Exemplo de Referência 2, exceto que foram utilizados os iniciadores (SEQ ID NOs: 39 e 40) para amplificação de um ácido nucleico representado pela SEQ ID NO: 27, iniciadores (SEQ ID NOs: 41 e 42) para amplificação de um ácido nucleico representado pela SEQ ID NO: 28, iniciadores (SEQ ID NOs: 43 e 44) para a amplificação de um ácido nucleico representado pela SEQ ID NO: 29, e iniciadores (SEQ ID NOs: 45 e 46) para a amplificação de um ácido nucleico representado pela SEQ ID NO:

30.

[132] O plasmídeo para a expressão do polipeptídeo codificado pelo ácido nucleico representado pela SEQ ID NO: 27 é designado como “pACYCDuet-1::Ppu1”; o plasmídeo para a expressão do polipeptídeo codificado pelo ácido nucleico representado pela SEQ ID NO: 28 é designado como “pACYCDuet-1::Eco1”; o plasmídeo para a expressão do polipeptídeo codificado pelo ácido nucleico representado pela SEQ ID NO: 29 é designado como “pACYCDuet-1::Aci1”; and o plasmídeo para a expressão do polipeptídeo codificado pelo ácido nucleico representado pela SEQ ID NO: 30 é designado como “pACYCDuet-1::Spl2”. As informações sobre esses plasmídeos são apresentadas na Tabela 6.

TABELA 6 Plasmídeo Organismo de origem Gene ID SEQ ID NO Serratia marcescens pACYCDuet-1::Smr1 JMPQ01000047.1 54 ATCC 13880 Serratia nematodiphila pACYCDuet-1::Snm1 JPUX00000000.1 55 DSM21420 Serratia plymuthica pACYCDuet-1::Spl1 BCTU01000013.1 56 NBRC102599 Serratia proteamaculans pACYCDuet-1::Spe1 CP000826.1 57 568 Pseudomonas putida pACYCDuet-1::Ppu1 NC_002947.4 27 KT2440 Escherichia coli str. pACYCDuet-1::Eco1 NC_000913.3 28 K-12 substr. MG1655 Acinetobacter baylyi pACYCDuet-1::Aci1 CR543861.1 29 ADP1 Serratia plymuthica pACYCDuet-1::Spl2 NZ_BCTU01000001.1 30 NBRC102599 pACYCDuet-1::Sur1 Serratia ureilytica Lr5/4 JSFB01000001 58 pACYCDuet-1::Ssp1 Serratia sp. BW106 MCGS01000002.1 59 pACYCDuet-1::Slq1 Serratia liquefaciens FK01 CP006252.1 214 EXEMPLO 1 GERAÇÃO DE CEPAS DE E. COLI POSSUINDO UMA CAPACIDADE DE PRODUZIR ÁCIDO

3-HIDROXIADÍPICO PELA INTRODUÇÃO DE CADA UM DOS ÁCIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAM OS POLIPEPTÍDEOS REPRESENTADOS PELAS SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6 E 213

[133] O plasmídeo pBBR1MCS-2::ATCT produzido no Exemplo de Referência 1 foi introduzidos em E. coli da cepa BL21 (DE3) por eletroporação (N.M. Calvin, P.C. Hanawalt. J. Bacteriol, 170 (1988), pp. 2796- 2801). A cepa após a introdução foi cultivada em meio ágar LB contendo 25 μg/mL de canamicina a 37ºC. A cepa recombinante obtida foi designada como BL21 (DE3)/pBBR1MCS-2::ATCT.

[134] Em seguida, cada um dos sete plasmídeos produzidos no Exemplo de Referência 2 foi introduzido individualmente no BL21 (DE3)/pBBR1MCS-2::ATCT por eletroporação. Cada uma das cepas após a introdução foi cultivada em meio ágar LB contendo 25 μg/mL de canamicina e 15 μg/mL de cloranfenicol a 37ºC. A cepa recombinante na qual “pACYCDuet- 1::Smr1” é introduzido é designada como “Ec/Smr1_3HA”; a cepa recombinante na qual “pACYCDuet-1::Snm1” é introduzido é designada como “Ec/Snm1_3HA”; a cepa recombinante na qual “pACYCDuet-1::Spl1” é introduzido é designada como “Ec/Spl1_3HA”; a cepa recombinante na qual “pACYCDuet-1::Spe1” é introduzido é designada como “Ec/Spe1_3HA”; a cepa recombinante na qual “pACYCDuet-1::Sur1” é introduzido é designada como “Ec/Sur1_3HA”; a cepa recombinante na qual “pACYCDuet-1::Ssp1” é introduzido é designada como “Ec/Ssp1_3HA”; e a cepa recombinante na qual “pACYCDuet-1::Slq1” é introduzido é designada como “Ec/Slq1_3HA”. As informações sobre as cepas recombinantes obtidas neste exemplo são apresentadas na Tabela 7.

EXEMPLO COMPARATIVO 1 GERAÇÃO DE CEPAS DE E. COLI POSSUINDO UMA CAPACIDADE DE PRODUZIR ÁCIDO 3-HIDROXIADÍPICO ATRAVÉS DA INTRODUÇÃO DE CADA UM DOS ÁCIDOS NUCLEICOS

QUE CODIFICAM 3-OXOADIPIL-COA REDUTASES

[135] O plasmídeo pBBR1MCS-2::ATCT produzido no Exemplo de Referência 1 foi introduzidos em E. coli da cepa BL21 (DE3) por eletroporação (N.M. Calvin, P.C. Hanawalt. J. Bacteriol, 170 (1988), pp. 2796- 2801). A cepa após a introdução foi cultivada em meio ágar LB contendo 25 μg/mL de canamicina a 37ºC. A cepa recombinante obtida foi designada como BL21 (DE3)/pBBR1MCS-2::ATCT.

[136] Em seguida, cada um dos quatro plasmídeos produzidos no Exemplo de Referência 3 foi introduzido individualmente no BL21 (DE3)/pBBR1MCS-2::ATCT por eletroporação. Cada uma das cepas após a introdução foi cultivada em meio ágar LB contendo 25 μg/mL de canamicina e 15 μg/mL de cloranfenicol a 37ºC.

[137] A cepa recombinante na qual “pACYCDuet-1::Ppu1” é introduzido é designada como “Ec/Ppu1_3HA”; a cepa recombinante na qual “pACYCDuet-1::Eco1” é introduzido é designada como “Ec/Eco1_3HA”; a cepa recombinante na qual “pACYCDuet-1::Aci1” é introduzido é designada como “Ec/Aci1_3HA”; e a cepa recombinante na qual “pACYCDuet-1::Spl2” é introduzido é designada como “Ec/Spl2_3HA”. As informações sobre as cepas recombinantes obtidas neste exemplo comparativo são apresentadas na Tabela 7.

EXEMPLO 2 TESTE PARA PRODUÇÃO DE ÁCIDO 3-HIDROXIADÍPICO UTILIZANDO AS CEPAS DE E.

COLI COM UMA CAPACIDADE DE PRODUZIR ÁCIDO 3-HIDROXIADÍPICO PELA

INTRODUÇÃO DE CADA UM DOS ÁCIDOS NUCLEICOS CODIFICANTES DOS POLIPEPTÍDEOS REPRESENTADOS PELAS SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6 E 213.

[138] As cepas de E. coli recombinantes produzidas no Exemplo 1 foram utilizadas para realizar um teste para a produção de ácido 3- hidroxiadípico.

[139] Uma alça de platina de cada cepa recombinante produzida no Exemplo 1 foi inoculada em 5 mL do meio de cultura I (10 g/L Bacto Triptona (fabricado pela Difco Laboratories), 5 g/L de extrato de levedura Bacto Yeast Extract (fabricado pela Difco Laboratories), 5 g/L de cloreto de sódio, 25 μg/mL de canamicina e 15 μg/mL de cloranfenicol) ajustado em pH 7 e o meio foi incubado a 30ºC com agitação a 120 min-1 por 18 horas. Posteriormente, 0,25 mL do líquido de cultura foi adicionado a 5 mL do meio de cultura II (10 g/L de ácido succínico, 10 g/L de glicose, 1 g/L de sulfato de amônio, 50 mM de fosfato de potássio, 0,025 g/L de sulfato de magnésio, 0,0625 mg/L de sulfato de ferro, 2,7 mg/L de sulfato de manganês, 0,33 mg/L de cloreto de cálcio, 1,25 g/L de cloreto de sódio, 2,5 g/L de Bacto triptona, 1,25 g/L de extrato de levedura de Bacto, 25 μg/mL de canamicina e 15 μg/mL de cloranfenicol e 0,01 mM de IPTG) ajustado para pH 6,5, e incubado a 30ºC com agitação de 120 min-1 por 24 horas.

ANÁLISES QUANTITATIVAS DE FONTES DE CARBONO E DE ÁCIDO 3-HIDROXIADÍPICO

[140] O sobrenadante separado das células bacterianas por centrifugação do líquido de cultura foi processado por tratamento de membrana usando Millex-GV (0,22 μm; PVDF; fabricado pela Merck KGaA), e o filtrado resultante foi analisado de acordo com o método a seguir para medir as concentrações de ácido 3-hidroxiadípico acumulado e de fonte de carbono no sobrenadante de cultura. Os resultados estão apresentados na Tabela 7. Além disso, o rendimento do ácido 3-hidroxiadípico calculado de acordo com a fórmula (3) é apresentado na Tabela 7.

ANÁLISE QUANTITATIVA DE ÁCIDO 3-HIDROXIADÍPICO POR LC-MS/MS HPLC: 1290 Infinity (fabricado pela Agilent Technologies, Inc.); Coluna: Synergi hydro-RP (fabricada pela Phenomenex); comprimento, 100 mm;

diâmetro interno, 3 mm; tamanho de partícula, 2,5 μm Fase móvel: Solução de ácido fórmico aquoso a 0,1%/metanol = 70/30 Velocidade de fluxo: 0,3 mL/minuto Temperatura de coluna:40ºC Detector LC: DAD (210 nm) MS/MS: Triple-Quad LC/MS (fabricado pela Agilent Technologies, Inc.) Método de ionização: ESI em modo negativo.

ANÁLISES QUANTITATIVAS DE AÇÚCARES E DE ÁCIDO SUCCÍNICO POR HPLC HPLC: Shimadzu Prominence (fabricado pela Shimadzu Corporation) Coluna: Shodex Sugar SH1011 (fabricada pela Showa Denko K.K.); comprimento, 300 mm; diâmetro interno, 8 mm; tamanho de partícula, 6 μm Fase móvel: 0,05M de solução aquosa de ácido sulfúrico Velocidade de fluxo: 0,6 mL/minuto Temperatura de coluna:65ºC Detector: RI HPLC: 1290 Infinity (fabricado pela Agilent Technologies, Inc.); Coluna: Synergi hydro-RP (fabricada pela Phenomenex); comprimento, 100 mm; diâmetro interno, 3 mm; tamanho de partícula, 2,5 μm

Fase móvel: Solução de ácido fórmico aquoso a 0,1%/metanol = 70/30 Velocidade de fluxo: 0,3 mL/minuto Temperatura de coluna:40ºC Detector LC: DAD (210 nm) MS/MS: Triple-Quad LC/MS (fabricado pela Agilent Technologies, Inc.) Método de ionização: ESI em modo negativo.

EXEMPLO COMPARATIVO 2 TESTE PARA A PRODUÇÃO DE ÁCIDO 3-HIDROXIADÍPICO UTILIZANDO AS CEPAS DE E. COLI COM UMA CAPACIDADE DE PRODUZIR ÁCIDO 3-HIDROXIADÍPICO ATRAVÉS DA INTRODUÇÃO DE CADA UM DOS ÁCIDOS NUCLEICOS CODIFICANTES DE 3- OXOADIPIL-COA REDUTASES

[141] Os resultados de um teste para a produção de ácido 3- hidroxiadípico realizado do mesmo modo que no Exemplo 2 utilizando as cepas de E. coli produzidas no Exemplo Comparativo 1 são apresentados na Tabela

7.

[142] Os resultados apresentados na Tabela 7 indicam que o rendimento do ácido 3-hidroxiadípico estava aumentado nas cepas recombinantes usadas no Exemplo 2 em comparação com o das cepas recombinantes usadas no Exemplo Comparativo 2. Isto é, demonstrou-se que a produção de ácido 3-hidroxiadípico foi muito aumentada pela introdução de qualquer um dos ácidos nucleicos codificantes dos polipeptídeos representados pelas SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 213 nos micro-organismos.

TABELA 7 Cepa Concentração de 3HA (g/L) Rend. de 3HA (%) Ec/Smr1_3HA 1,65 12,6 Exemplo 2 Ec/Snm1_3HA 2,69 18,9 Ec/Spl1_3HA 2,18 17,0

Cepa Concentração de 3HA (g/L) Rend. de 3HA (%) Ec/Spe1_3HA 2,72 19,3 Ec/Sur1_3HA 3,42 25,8 Ec/Ssp1_3HA 1,94 18,0 Ec/Slq1_3HA 2,67 21,8 Ec/Ppu1_3HA 0,67 5,7 Ec/Eco1_3HA 0,88 7,2 Exemplo Comparativo 2 Ec/Aci1_3HA 0,82 6,8 Ec/Spl2_3HA 0,91 7,4 EXEMPLO DE REFERÊNCIA 4

PRODUÇÃO DE UM PLASMÍDEO PARA EXPRESSÃO DE UMA ENZIMA QUE CATALISA UMA REAÇÃO PARA GERAR 2,3-DESIDROADIPIL-COA A PARTIR DE 3- HIDROXIADIPIL-COA (REAÇÃO C)

[143] O vetor de expressão pCDF-1b (fabricado pela Novagen), que é capaz de replicação autônoma em E. coli, foi clivado com KpnI para obter o plasmídeo pCDF-1b/KpnI. Para amplificar um gene que codifica uma enzima que catalisa a reação C, os iniciadores (SEQ ID NOs: 48 e 49) foram projetados para uso na amplificação de todo o comprimento do gene da enoil- CoA hidratase, paaF (NCBI Gene ID: 1046932; SEQ ID NO: 47) por PCR usando o DNA genômico de Pseudomonas putida cepa KT2440 como molde e uma reação de PCR foi realizada de acordo com procedimentos de rotina. O fragmento resultante e o pCDF-1b/KpnI foram ligados em conjunto, utilizando o kit de clonagem In-Fusion HD Cloning Kit (fabricado pela Clontech), e o plasmídeo resultante foi introduzido em E. coli cepa DH5α. A sequência nucleotídica no plasmídeo isolado a partir da cepa recombinante obtida foi confirmada de acordo com procedimentos de rotina. A expressão do gene da enoil-CoA hidratase integrada no plasmídeo é induzida por IPTG, o que resultou na adição de 11 aminoácidos extras, incluindo um marcador (tag) histidina N-terminal do polipeptídeo expresso. O plasmídeo obtido foi designado como “pCDF-1b::EHa”.

EXEMPLO 3

GERAÇÃO DE CEPAS DE E. COLI POSSUINDO UMA CAPACIDADE DE PRODUZIR ÁCIDO α-HIDROMUCÔNICO PELA INTRODUÇÃO DOS ÁCIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAM OS POLIPEPTÍDEOS REPRESENTADOS PELAS SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6 E 213

[144] O plasmídeo PCDF-1b::EHa produzido no Exemplo de Referência 4 foi introduzido por eletroporação na E. coli da cepa BL21 (DE3)/pBBR1MCS-2::ATCT produzida no Exemplo 1. A cepa após a introdução foi cultivada em meio de ágar LB contendo 25 µg/mL de canamicina e 50 µg/mL de estreptomicina a 37ºC. A cepa recombinante resultante foi designada como BL21 (DE3)/pBBR1MCS-2::ATCT/pCDF-1b::EHa.

[145] Em seguida, cada um dos plasmídeos produzidos no Exemplo de Referência 2, a saber, “pACYCDuet-1::Smr1,” “pACYCDuet- 1::Snm1”, “pACYCDuet-1::Spl1”, “pACYCDuet-1::Spe1”, “pACYCDuet-1::Sur1”, e “pACYCDuet-1::Ssp1,” “pACYCDuet-1::Slq1,” foi introduzido individualmente no BL21 (DE3)/pBBR1MCS-2::ATCT/pCDF-1b::EHa por eletroporação. Cada uma das cepas após a introdução foi cultivada em meio ágar LB contendo 25 μg/mL de canamicina, 50 μg/mL de estreptomicina e 15 μg/mL de cloranfenicol a 37ºC. A cepa recombinante na qual “pACYCDuet-1::Smr1” é introduzido é designada como “Ec/Smr1_HMA”; a cepa recombinante na qual “pACYCDuet- 1::Snm1” é introduzido é designada como “Ec/Snm1_HMA”; a cepa recombinante na qual “pACYCDuet-1::Spl1” é introduzido é designada como “Ec/Spl1_HMA”; a cepa recombinante na qual “pACYCDuet-1::Spe1” é introduzido é designada como “Ec/Spe1_HMA”; a cepa recombinante na qual “pACYCDuet-1::Sur1” é introduzido é designada como “Ec/Sur1_HMA”; a cepa recombinante na qual “pACYCDuet-1::Ssp1” é introduzido é designada como “Ec/Ssp1_HMA”; e a cepa recombinante na qual “pACYCDuet-1::Slq1” é introduzido é designada como “Ec/Slq1_HMA”. As informações sobre as cepas recombinantes obtidas neste exemplo são apresentadas na Tabela 8.

EXEMPLO COMPARATIVO 3

GERAÇÃO DE CEPAS DE E. COLI POSSUINDO UMA CAPACIDADE DE PRODUZIR ÁCIDO α-HIDROMUCÔNICO ATRAVÉS DA INTRODUÇÃO DE CADA UM DOS ÁCIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAM 3-OXOADIPIL-COA REDUTASES

[146] O plasmídeo PCDF-1b::EHa produzido no Exemplo de Referência 4 foi introduzido por eletroporação na E. coli da cepa BL21 (DE3)/pBBR1MCS-2::ATCT produzida no Exemplo de Referência 2. A cepa após a introdução foi cultivada em meio de ágar LB contendo 25 µg/mL de canamicina e 50 µg/mL de estreptomicina a 37ºC. A cepa recombinante obtida foi designada como BL21 (DE3)/pBBR1MCS-2::ATCT/pCDF-1b::EHa.

[147] Em seguida, cada um dos plasmídeos produzidos no Exemplo de Referência 3, a saber, “pACYCDuet-1::Ppu1,” “pACYCDuet- 1::Eco1,” “pACYCDuet-1::Aci1,” e “pACYCDuet-1::Spl2,” foram introduzidos individualmente no BL21 (DE3)/pBBR1MCS-2::ATCT/pCDF-1b::EHa por eletroporação. Cada uma das cepas após a introdução foi cultivada em meio ágar LB contendo 25 μg/mL de canamicina, 50 μg/mL de estreptomicina e 15 μg/mL de cloranfenicol a 37ºC.

[148] A cepa recombinante na qual “pACYCDuet-1::Ppu1” é introduzido é designada como “Ec/Ppu1_HMA”; a cepa recombinante na qual “pACYCDuet-1::Eco1” é introduzido é designada como “Ec/Eco1_HMA”; a cepa recombinante na qual “pACYCDuet-1::Aci1” é introduzido é designada como “Ec/Aci1_HMA”; e a cepa recombinante na qual “pACYCDuet-1::Spl2” é introduzido é designada como “Ec/Spl2_HMA”. As informações sobre as cepas recombinantes obtidas neste exemplo comparativo são apresentadas na Tabela 8.

EXEMPLO 4 TESTE PARA PRODUÇÃO DE ÁCIDO α-HIDROMUCÔNICO UTILIZANDO AS CEPAS DE E. COLI COM UMA CAPACIDADE DE PRODUZIR ÁCIDO α-HIDROMUCÔNICO PELA

INTRODUÇÃO DOS ÁCIDOS NUCLEICOS CODIFICANTES DOS POLIPEPTÍDEOS

REPRESENTADOS PELAS SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6 E 213.

[149] As cepas de E. coli recombinantes produzidas no Exemplo 3 foram utilizadas para realizar um teste para a produção de ácido α- hidromucônico. Uma alça de platina de cada cepa recombinante de E. coli produzida no Exemplo 3 foi inoculada em 5 mL do meio de cultura I (10 g/L Bacto Triptona (fabricado pela Difco Laboratories), 5 g/L de extrato de levedura Bacto Yeast Extract (fabricado pela Difco Laboratories), 5 g/L de cloreto de sódio, 25 μg/mL de canamicina, 50 μg/mL de estreptomicina e 15 μg/mL de cloranfenicol) ajustado em pH 7 e o meio foi incubado a 30ºC com agitação a 120 min-1 por 18 horas. Posteriormente, 0,25 mL do líquido de cultura foi adicionado a 5 mL do meio de cultura II (10 g/L de ácido succínico, 10 g/L de glicose, 1 g/L de sulfato de amônio, 50 mM de fosfato de potássio, 0,025 g/L de sulfato de magnésio, 0,0625 mg/L de sulfato de ferro, 2,7 mg/L de sulfato de manganês, 0,33 mg/L de cloreto de cálcio, 1,25 g/L de cloreto de sódio, 2,5 g/L de Bacto triptona, 1,25 g/L de extrato de levedura de Bacto, 25 μg/mL de canamicina, 50 μg/mL de estreptomicina e 15 μg/mL de cloranfenicol e 0,01 mM de IPTG) ajustado para pH 6,5, e incubado a 30ºC com agitação de 120 min-1 por 24 horas.

ANÁLISES QUANTITATIVAS DE FONTES DE CARBONO E DE ÁCIDO Α-HIDROMUCÔNICO

[150] O sobrenadante separado das células bacterianas por centrifugação do líquido de cultura foi processado por tratamento de membrana usando Millex-GV (0,22 μm; PVDF; fabricado pela Merck KGaA), e o filtrado resultante foi analisado por LC-MS/MS da mesma maneira como no Exemplo 2.

Os resultados da análise quantitativa do ácido α-hidromucônico acumulado no sobrenadante de cultura e o rendimento do ácido α-hidromucônico calculado de acordo com a fórmula (3) são apresentados na Tabela 8. EXEMPLO COMPARATIVO 4 TESTE PARA A PRODUÇÃO DE ÁCIDO α-HIDROMUCÔNICO UTILIZANDO AS CEPAS DE

E. COLI COM UMA CAPACIDADE DE PRODUZIR ÁCIDO α-HIDROMUCÔNICO ATRAVÉS DA INTRODUÇÃO DE CADA UM DOS ÁCIDOS NUCLEICOS CODIFICANTES DE 3- OXOADIPIL-COA REDUTASES

[151] Os resultados de um teste para a produção de ácido α- hidromucônico realizado do mesmo modo que no Exemplo 4 utilizando as cepas de E. coli produzidas no Exemplo Comparativo 3 são apresentados na Tabela 8.

[152] Os resultados apresentados na Tabela 8 indicam que o rendimento do ácido α-hidromucônico estava aumentado nas cepas recombinantes usadas no Exemplo 4 em comparação com o das cepas recombinantes usadas no Exemplo Comparativo 4. Isto é, demonstrou-se que a produção de ácido α-hidromucônico foi muito aumentada pela introdução de qualquer um dos ácidos nucleicos codificantes dos polipeptídeos representados pelas SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 213 nos micro-organismos.

TABELA 8 Cepa Concentração de HMA (mg/L) Rend. de HMA (%) Ec/Smr1_HMA 42,9 0,660 Ec/Snm1_HMA 50,6 0,755 Ec/Spl1_HMA 39,1 0,629 Exemplo 4 Ec/Spe1_HMA 47,7 0,731 Ec/Sur1_HMA 62,4 0,801 Ec/Ssp1_HMA 35,6 0,626 Ec/Slq1 HMA 48,5 0,719 Ec/Ppu1_HMA 0,7 0,012 Ec/Eco1_HMA 1,4 0,023 Exemplo Comparativo 4 Ec/Aci1_HMA 2,1 0,035 Ec/Spl2_HMA 2,1 0,034 EXEMPLO DE REFERÊNCIA 5

PRODUÇÃO DE PLASMÍDEOS PARA MELHORAR A EXPRESSÃO DOS POLIPEPTÍDEOS REPRESENTADOS PELAS SEQ ID NOS: 2 E 3

[153] Diferentes plasmídeos foram produzidos para expressão constitutiva dos polipeptídeos representados pelas SEQ ID NOs: 2 e 3.

[154] Para amplificar um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo representado pela SEQ ID NO: 2, os iniciadores (SEQ ID NOs: 50 e 51) foram projetados para uso na amplificação do ácido nucleico representado pela SEQ ID NO: 55 usando o DNA genômico de Serratia nematodiphila cepa DSM21420 como molde; e uma reação de PCR foi realizada de acordo com procedimentos de rotina. Para amplificar um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo representado pela SEQ ID NO: 3, os iniciadores (SEQ ID NOs: 52 e 53) também foram projetados para uso na amplificação de um ácido nucleico representado pela SEQ ID NO: 56 usando o DNA genômico de Serratia plymuthica cepa NBRC102599 como molde; e uma reação de PCR foi realizada de acordo com procedimentos de rotina. cada um dos fragmentos resultantes e o pBBR1MCS-2/Pgap/ScaI produzido no Exemplo de Referência 1 foram ligados em conjunto, utilizando o kit de clonagem In- Fusion HD Cloning Kit, e os plasmídeos resultantes foram introduzidos em E.

coli cepa DH5α. As sequências nucleotídicas nos plasmídeos isolados a partir das cepas recombinantes obtidas foram confirmadas de acordo com procedimentos de rotina, e os plasmídeos foram designados como “pBBR1MCS-2::Snm1” e “pBBR1MCS-2::Spl1”, respectivamente.

EXEMPLO 5 GERAÇÃO DE MICRO-ORGANISMOS DO GÊNERO SERRATIA MODIFICADOS PARA

AUMENTAR A EXPRESSÃO DOS POLIPEPTÍDEOS REPRESENTADOS PELAS SEQ ID NOS: 2 E 3

[155] O micro-organismo Serratia nematodiphila, cepa DSM21420, que é um micro-organismo que originalmente possui o ácido nucleico que codifica o polipeptídeo representado pela SEQ ID NO: 2, e Serratia plymuthica cepa NBRC102599, que é um micro-organismo que originalmente possui o ácido nucleico que codifica o polipeptídeo representado pela SEQ ID NO: 3, foram utilizados como micro-organismos hospedeiros para produzir cepas recombinantes com expressão melhorada dos polipeptídeos. O pBBR1MCS-2::Snm1 ou pBBR1MCS-2::Spl1 produzido no Exemplo de Referência 5 foi introduzido em cada uma das cepas de micro-organismos descritas acima do gênero Serratia por eletroporação (NM Calvin, PC Hanawalt. J. Bacteriol, 170 (1988) 2796-2801). Após a introdução, as cepas foram cultivadas em meio ágar LB contendo 25 μg/mL de canamicina a 30ºC.

As cepas recombinantes obtidas neste exemplo foram designadas como Sn/Snm1 e Sp/Spl1.

EXEMPLO 6 TESTE PARA A PRODUÇÃO DE ÁCIDO 3-HIDROXIADÍPICO E ÁCIDO α- HIDROMUCÔNICO UTILIZANDO OS MICRO-ORGANISMOS DO GÊNERO SERRATIA

MODIFICADOS PARA AUMENTAR A EXPRESSÃO DOS POLIPEPTÍDEOS REPRESENTADOS PELAS SEQ ID NOS: 2 E 3

[156] Para avaliar os efeitos da expressão melhorada dos polipeptídeos representados pelas SEQ ID NOs: 2 e 3, as cepas de micro- organismos recombinantes do gênero Serratia, produzidas no Exemplo 5, foram utilizadas para realizar um teste para a produção de ácido 3- hidroxiadípico e ácido α-hidromucônico.

[157] Uma alça de platina de cada cepa recombinante produzida no Exemplo 5 foi inoculada em 5 mL do meio de cultura I (10 g/L Bacto Triptona (fabricado pela Difco Laboratories), 5 g/L de extrato de levedura Bacto Yeast Extract (fabricado pela Difco Laboratories), 5 g/L de cloreto de sódio, 25 μg/mL de canamicina) ajustado em pH 7 e o meio foi incubado a 30ºC com agitação a 120 min-1 por 18 horas. Posteriormente, 0,25 mL do líquido de cultura foi adicionado a 5 mL do meio de cultura II (10 g/L de ácido succínico, 10 g/L de glicose, 1 g/L de sulfato de amônio, 50 mM de fosfato de potássio, 0,025 g/L de sulfato de magnésio, 0,0625 mg/L de sulfato de ferro, 2,7 mg/L de sulfato de manganês, 0,33 mg/L de cloreto de cálcio, 1,25 g/L de cloreto de sódio, 2,5 g/L de Bacto triptona, 1,25 g/L de extrato de levedura de Bacto, 25 μg/mL de canamicina) ajustado para pH 6,5, e incubado a 30ºC com agitação de 120 min-1 por 24 horas.

[158] Análises quantitativas de ácido 3-hidroxiadípico, α- hidromucônico e fontes carbono.

[159] O sobrenadante separado das células bacterianas por centrifugação do líquido de cultura foi processado por tratamento de membrana usando Millex-GV (0,22 μm; PVDF; fabricado pela Merck KGaA), e o filtrado resultante foi analisado por LC-MS/MS da mesma maneira como no Exemplo 2.

Os resultados das análises quantitativas do ácido 3-hidroxiadípico e do ácido α- hidromucônico acumulados no sobrenadante de cultura, e os rendimentos desses produtos são apresentados na Tabela 9.

EXEMPLO COMPARATIVO 5 GERAÇÃO DE MICRO-ORGANISMOS DO GÊNERO SERRATIA NÃO MODIFICADOS PARA

AUMENTAR A EXPRESSÃO DOS POLIPEPTÍDEOS REPRESENTADOS PELAS SEQ ID NOS: 2 E 3

[160] O pBBR1MCS-2::gap foi introduzido em cada uma das cepas de Serratia nematodiphila cepa DSM21420 de Serratia plymuthica cepa NBRC102599 da mesma maneira que no Exemplo 5. As cepas recombinantes resultantes foram designadas como Sn/NC e Sp/NC.

EXEMPLO COMPARATIVO 6 TESTE PARA A PRODUÇÃO DE ÁCIDO 3-HIDROXIADÍPICO E ÁCIDO α- HIDROMUCÔNICO UTILIZANDO OS MICRO-ORGANISMOS DO GÊNERO SERRATIA NÃO

[161] Os micro-organismos do gênero Serratia produzidos no Exemplo Comparativo 5 foram utilizados para realizar um teste para a produção de ácido 3-hidroxiadípico e ácido α-hidromucônico da mesma maneira que no Exemplo 6. Os resultados estão apresentados na Tabela 9.

[162] Os resultados apresentados na Tabela 9 indicam que os rendimentos de ácido 3-hidroxiadípico e ácido α-hidromucônico foram aumentados nas cepas recombinantes usadas no Exemplo 6 com expressão melhorada dos polipeptídeos representados pelas SEQ ID NOs: 2 e 3 em comparação com os rendimentos das cepas recombinantes usadas no Exemplo Comparativo 6 sem expressão melhorada dos polipeptídeos representados pelas SEQ ID NOs: 2 e 3. Isto é, foi demonstrado que a produção de ácido 3-hidroxiadípico e ácido α-hidromucônico aumentou muito pela melhora da expressão dos polipeptídeos representados pelas SEQ ID NOs: 2 e 3.

TABELA 9 Cepas Concentração de Rend. de Concentração de Rend. de 3HA 3HA HMA HMA (mg/L) (%) (mg/L) (%) Exemplo 6 Sn/Sn 37,4 0,193 13,7 0,077 m1 Sp/Spl1 64,1 0,331 14,2 0,080 Exemplo Sn/NC 2,5 0,013 1,7 0,010 Comparativo 6 Sp/NC 4,6 0,024 4,1 0,023 EXEMPLO COMPARATIVO 7

TESTE CONTROLO PARA CONFIRMAÇÃO DA ATIVIDADE DE CADA UM DOS POLIPEPTÍDEOS REPRESENTADOS PELAS SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6 E 213 PARA REDUZIR 3-OXOADIPIL-COA EM 3-HIDROXIADIPIL-COA

[163] Foi produzida uma E. coli que expressa de forma recombinante as enzimas que catalisam as reações A, E e F. O pACYCDuet-1 foi introduzido no BL21 (DE3)/pBBR1MCS-2::ATCT da mesma maneira que no Exemplo 1. A cepa recombinante resultante foi designada como Ec/NC_3HA.

[164] Foi produzida uma E. coli que expressa de forma recombinante as enzimas que catalisam as reações A, E, F e C. O pACYCDuet-1 foi introduzido no BL21 (DE3)/pBBR1MCS-2::ATCT/pCDF-

1b::EHa da mesma maneira que no Exemplo 3. A cepa recombinante resultante foi designada como Ec/NC_HMA.

[165] Ec/NC_3HA, Ec/NC_HMA, as sete E. coli recombinantes produzidas no Exemplo 1 (Ec/Smr1_3HA, Ec/Snm1_3HA, Ec/Spl1_3HA, Ec/Spe1_3HA, Ec/Sur1_3HA, Ec/Ssp1_3HA, Ec/Slq1_3HA) e as sete E. coli recombinantes produzidas no Exemplo 3 (Ec/Smr1_HMA, Ec/Snm1 _HMA, Ec/Spl1_HMA, Ec/Spe1_HMA, Ec/Sur1_HMA, Ec/Ssp1_HMA, Ec/Slq1_HMA) foram usadas e cultivadas nas mesmas condições do Exemplo 2 ou Exemplo 4 para quantificar o ácido 3-hidroxiadípico ou o ácido α-hidromucônico no líquido de cultura. Os resultados estão apresentados na Tabela 10.

[166] Os resultados apresentados na Tabela 10 indicam que nem o ácido 3-hidroxiadípico nem o ácido α-hidromucônico foram detectados em Ec/NC_3HA e Ec/NC_HMA, e confirmaram que a produção bem-sucedida de ácido 3-hidroxiadípico e ácido α-hidromucônico nos Exemplos 2 e 4 foi causada pela expressão de cada um dos polipeptídeos representados pelas SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 213. Além disso, os resultados indicam que o ácido α- hidromucônico não foi detectado nas cepas Ec/Smr1_3HA, Ec/Snm1_3HA, Ec/Spl1_3HA, Ec/Spe1_3HA, Ec/Sur1_3HA, Ec/Ssp1_3HA e Ec/Slq1_3HA, e confirmaram que a expressão da enzima que catalisava a reação C nas cepas Ec/Smr1_HMA, Ec/Snm1_HMA, Ec/Spl1_HMA, Ec/Spe1_HMA, Ec/Spe1_HMA, Ec/Sur1_HMA, Ec/Ssp1_HMA e Ec/Slq1_HMA resultaram na produção de ácido α-hidromucônico. Isso indica que o ácido 3-hidroxiadípico produzido nas cepas Ec/Smr1_3HA, Ec/Snm1_3HA, Ec/Spl1_3HA, Ec/Spe1_3HA, Ec/Sur1_3HA, Ec/Ssp1_3HA e Ec/Slq1_3HA e Ec/Slq1_3HA e ácido α- hidromucônico produzido nas cepas Ec/Smr1_HMA, Ec/Snm1_HMA, Ec/Spl1_HMA, Ec/Spe1_HMA, Ec/Sur1_HMA, Ec/Ssp1_HMA e Ec/Slq1_HMA foram produzidos através da produção de 3-hidroxiadipil-CoA. Assim, verificou- se que os polipeptídeos representados pelas SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 213 têm uma atividade de reduzir 3-oxoadipil-CoA em 3-hidroxiadipil-CoA.

TABELA 10 Cepa Concentração de 3HA (g/L) Concentração de HMA (mg/L) Ec/Smr1_3HA 1,65 N.D. Ec/Snm1_3HA 2,69 N.D. Ec/Spl1_3HA 2,18 N.D. Exemplo 2 Ec/Spe1_3HA 2,72 N.D. Ec/Sur1_3HA 3,42 N.D. Ec/Ssp1_3HA 1,94 N.D. Ec/Slq1_3HA 2,67 N.D. Ec/Smr1_HMA 0,85 42,9 Ec/Snm1_HMA 0,98 50,6 Ec/Spl1_HMA 0,67 39,1 Exemplo 4 Ec/Spe1_HMA 0,96 47,7 Ec/Sur1_HMA 1,37 62,4 Ec/Ssp1_HMA 0,84 35,6 Ec/Slq1 HMA 0,93 48,5 Exemplo Ec/NC_3HA N.D. N.D. Comparativo 7 Ec/NC_HMA N.D. N.D.

EXEMPLO DE REFERÊNCIA 6

PRODUÇÃO DE UM PLASMÍDEO PARA EXPRESSÃO DA ENZIMA QUE CATALISA UMA REAÇÃO PARA GERAR 3-OXOADIPIL-COA E COENZIMA A A PARTIR DE ACETIL-COA E SUCCINIL-COA (REAÇÃO A) E UMA ENZIMA QUE CATALISA UMA REAÇÃO PARA GERAR ÁCIDO ADÍPICO A PARTIR DE ADIPIL-COA (REAÇÃO G).

[167] Um fragmento de 6,6 kb obtido pela clivagem do pBBR1MCS-2::AT produzido no Exemplo de Referência 1 com HpaI foi designado como pBBR1MCS-2::AT/HpaI. Para amplificar um gene que codifica uma enzima que catalisa a reação G, os iniciadores (SEQ ID NOs: 223 e 224) foram projetados para uso na amplificação de todo o comprimento do gene da CoA transferase de comprimento total, dcaI e dcaJ (NCBI Gene ID: CR543861.

1, SEQ ID NOs: 221 e 222) por PCR utilizando o DNA genômico de Acinetobacter baylyi cepa ADP1 como molde e uma reação de PCR foi realizada de acordo com procedimentos de rotina. O fragmento resultante e o pBBR1MCS-2/AT/Hpal foram ligados em conjunto, utilizando o kit de clonagem

In-Fusion HD Cloning Kit, e o plasmídeo resultante foi introduzido em E. coli cepa DH5α. A sequência nucleotídica no plasmídeo isolado da cepa recombinante obtida foi confirmada de acordo com procedimentos de rotina, e o plasmídeo foi designado como pBBR1MCS-2::ATCT2.

EXEMPLO DE REFERÊNCIA 7

PRODUÇÃO DE UM PLASMÍDEO PARA EXPRESSÃO DE UMA ENZIMA QUE CATALISA UMA REAÇÃO PARA GERAR ADIPIL-COA A PARTIR DE 2,3-DESIDROADIPIL-COA (REAÇÃO D)

[168] O vetor de expressão pMW119 (fabricado pela Nippon Gene Co., Ltd.), que é capaz de replicação autônoma em E. coli, foi clivado com SacI para se obter pMW119/SacI. Para integrar um promotor de expressão constitutivo ao vetor, os iniciadores (SEQ ID NOs: 225 e 226) foram projetados para uso na amplificação de uma região a montante 200 pb (SEQ ID NO: 17) de gapA (NCBI Gene ID: NC_000913.3) por PCR usando o DNA genômico de Escherichia coli K-12 MG1655 como molde e uma reação de PCR foi realizada de acordo com procedimentos de rotina. O fragmento resultante e o pMW119/SacI foram ligados em conjunto, utilizando o kit de clonagem In- Fusion HD Cloning Kit (fabricado pela Clontech), e o plasmídeo resultante foi introduzido em E. coli cepa DH5α. A sequência nucleotídica no plasmídeo isolada da cepa recombinante de E. coli foi confirmada de acordo com procedimentos de rotina e o plasmídeo foi designado como pMW119::Pgap.

Em seguida, o pMW119::Pgap foi clivado com SphI para se obter o pMW119::Pgap/SphI. Para amplificar um gene que codifica uma enzima que catalisa a reação D, os iniciadores (SEQ ID NOs: 228 e 229) foram projetados para uso na amplificação de todo o comprimento do gene dcaA de Acinetobacter baylyi cepa ADP1 (NCBI Protein ID: AAL09094.1, SEQ ID NO: 227) por PCR, e uma reação de PCR foi realizada de acordo com procedimentos de rotina. O fragmento resultante e o pMW119::Pgap/SphI foram ligados em conjunto, utilizando o kit de clonagem In-Fusion HD Cloning Kit (fabricado pela Clontech), e o plasmídeo resultante foi introduzido em E. coli cepa DH5α. A sequência nucleotídica no plasmídeo isolado da cepa recombinante obtida foi confirmada de acordo com procedimentos de rotina, e o plasmídeo foi designado como pMW119::ER.

EXEMPLO 7 GERAÇÃO DE CEPAS DE E. COLI COM CAPACIDADE PARA PRODUZIR ÁCIDO ADÍPICO

POR INTRODUÇÃO DOS ÁCIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAM OS POLIPEPTÍDEOS REPRESENTADOS PELAS SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, E 213

[169] O plasmídeo pBBR1MCS-2::ATCT2 produzido no Exemplo de Referência 6 foi introduzidos em E. coli da cepa BL21 (DE3) por eletroporação (N.M. Calvin, P.C. Hanawalt. J. Bacteriol, 170 (1988), pp. 2796- 2801). A cepa após a introdução foi cultivada em meio ágar LB contendo 25 μg/mL de canamicina a 37ºC. A cepa recombinante resultante foi designada como BL21 (DE3)/pBBR1MCS-2::ATCT2.

[170] O plasmídeo pCDF-1b::EHa produzido no Exemplo de Referência 4 foi introduzido individualmente no BL21 (DE3)/pBBR1MCS- 2::ATCT2 por eletroporação. A cepa após a introdução foi cultivada em meio de ágar LB contendo 25 µg/mL de canamicina e 50 µg/mL de estreptomicina a 37ºC. A cepa recombinante resultante foi designada como BL21 (DE3)/pBBR1MCS-2::ATCT2/pCDF-1b::EHa.

[171] O plasmídeo pMW119::ER produzido no Exemplo de Referência 7 foi introduzido individualmente no BL21 (DE3)/pBBR1MCS- 2::ATCT2/pCDF-1b::EHa por eletroporação. A cepa após a introdução foi cultivada em meio ágar LB contendo 25 μg/mL de canamicina, 50 μg/mL de estreptomicina e 100 μg/mL de ampicilina a 37ºC. A cepa recombinante resultante foi designada como BL21 (DE3)/pBBR1MCS-2::ATCT2/pCDF- 1b::EHa/ pMW119::ER.

[172] Cada um dos sete plasmídeos produzidos no Exemplo de Referência 2 foi introduzido individualmente no BL21 (DE3)/pBBR1MCS- 2::ATCT2/pCDF-1b::EHa/ pMW119::ER por eletroporação. Após a introdução, as cepas foram cultivadas em meio ágar LB contendo 25 μg/mL de canamicina, 50 μg/mL de estreptomicina, 100 μg/mL de ampicilina e 15 μg/mL de cloranfenicol a 37ºC. A cepa recombinante na qual “pACYCDuet-1::Smr1” é introduzido é designada como “Ec/Smr1_ADA”; a cepa recombinante na qual “pACYCDuet-1::Snm1” é introduzido é designada como “Ec/Snm1_ADA”; a cepa recombinante na qual “pACYCDuet-1::Spl1” é introduzido é designada como “Ec/Spl1_ADA”; a cepa recombinante na qual “pACYCDuet-1::Spe1” é introduzido é designada como “Ec/Spe1_ADA”; a cepa recombinante na qual “pACYCDuet-1::Sur1” é introduzido é designada como “Ec/Sur1_ADA”; a cepa recombinante na qual “pACYCDuet-1::Ssp1” é introduzido é designada como “Ec/Ssp1_ADA”; e a cepa recombinante na qual “pACYCDuet-1::Slq1” é introduzido é designada como “Ec/Slq1_ADA”. As informações sobre as cepas recombinantes obtidas neste exemplo são apresentadas na Tabela 11.

EXEMPLO COMPARATIVO 8 GERAÇÃO DE CEPAS DE E. COLI POSSUINDO UMA CAPACIDADE DE PRODUZIR ÁCIDO

ADÍPICO ATRAVÉS DA INTRODUÇÃO DE CADA UM DOS ÁCIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAM 3-OXOADIPIL-COA REDUTASES

[173] Cada um dos plasmídeos produzidos no Exemplo de Referência 3, a saber, “pACYCDuet-1::Ppu1”, “pACYCDuet-1::Eco1”, “pACYCDuet-1::Aci1” e “pACYCDuet-1::Spl2” foram introduzidos individualmente no BL21 (DE3)/pBBR1MCS-2::ATCT2/pCDF-1b::EHa/ pMW119::ER por eletroporação. Após a introdução, as cepas foram cultivadas em meio ágar LB contendo 25 μg/mL de canamicina, 50 μg/mL de estreptomicina, 100 μg/mL de ampicilina e 15 μg/mL de cloranfenicol a 37ºC.

[174] A cepa recombinante na qual “pACYCDuet-1::Ppu1” é introduzido é designada como “Ec/Ppu1_ADA”; a cepa recombinante na qual “pACYCDuet-1::Eco1” é introduzido é designada como “Ec/Eco1_ADA”; a cepa recombinante na qual “pACYCDuet-1::Aci1” é introduzido é designada como “Ec/Aci1_ADA”; e a cepa recombinante na qual “pACYCDuet-1::Spl2” é introduzido é designada como “Ec/Spl2_ADA”. As informações sobre as cepas recombinantes obtidas neste exemplo comparativo são apresentadas na Tabela 11.

EXEMPLO 8 TESTE PARA PRODUÇÃO DE ÁCIDO ADÍPICO UTILIZANDO AS CEPAS DE E. COLI COM

UMA CAPACIDADE DE PRODUZIR ÁCIDO ADÍPICO PELA INTRODUÇÃO DOS ÁCIDOS

NUCLEICOS CODIFICANTES DOS POLIPEPTÍDEOS REPRESENTADOS PELAS SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6 E 213.

[175] As cepas de E. coli recombinantes produzidas no Exemplo 7 foram utilizadas para realizar um teste para a produção de ácido adípico .

Uma alça de platina de cada cepa recombinante de E. coli produzida no Exemplo 3 foi inoculada em 5 mL do meio de cultura I (10 g/L Bacto Triptona (fabricado pela Difco Laboratories), 5 g/L de extrato de levedura Bacto Yeast Extract (fabricado pela Difco Laboratories), 5 g/L de cloreto de sódio, 25 μg/mL de canamicina, 50 μg/mL de estreptomicina, 100 μg/mL de ampicilina e 15 μg/mL de cloranfenicol) ajustado em pH 7 e o meio foi incubado a 30ºC com agitação a 120 min-1 por 18 horas. Posteriormente, 0,25 mL do líquido de cultura foi adicionado a 5 mL do meio de cultura II (10 g/L de ácido succínico, 10 g/L de glicose, 1 g/L de sulfato de amônio, 50 mM de fosfato de potássio, 0,025 g/L de sulfato de magnésio, 0,0625 mg/L de sulfato de ferro, 2,7 mg/L de sulfato de manganês, 0,33 mg/L de cloreto de cálcio, 1,25 g/L de cloreto de sódio, 2,5 g/L de Bacto triptona, 1,25 g/L de extrato de levedura de Bacto, 25 μg/mL de canamicina, 50 μg/mL de estreptomicina, 100 μg/mL de ampicilina e 15 μg/mL de cloranfenicol e 0,01 mM de IPTG) ajustado para pH 6,5, e incubado a 30ºC com agitação de 120 min-1 por 24 horas.

ANÁLISES QUANTITATIVAS DE FONTES DE CARBONO E DE ÁCIDO ADÍPICO

[176] O sobrenadante separado das células bacterianas por centrifugação do líquido de cultura foi processado por tratamento de membrana usando Millex-GV (0,22 μm; PVDF; fabricado pela Merck KGaA), e o filtrado resultante foi analisado por LC-MS/MS da mesma maneira como no Exemplo 2.

Os resultados da análise quantitativa do ácido adípico acumulado no sobrenadante de cultura e o rendimento do ácido adípico calculado de acordo com a fórmula (3) são apresentados na Tabela 11.

EXEMPLO COMPARATIVO 9 TESTE PARA A PRODUÇÃO DE ÁCIDO ADÍPICO UTILIZANDO AS CEPAS DE E. COLI

COM UMA CAPACIDADE DE PRODUZIR ÁCIDO ADÍPICO ATRAVÉS DA INTRODUÇÃO DE CADA UM DOS ÁCIDOS NUCLEICOS CODIFICANTES DE 3-OXOADIPIL-COA

REDUTASES

[177] Os resultados de um teste para a produção de ácido adípico realizado do mesmo modo que no Exemplo 8 utilizando as cepas de E.

coli produzidas no Exemplo Comparativo 8 são apresentados na Tabela 11.

[178] Os resultados apresentados na Tabela 11 indicam que o rendimento do ácido adípico estava aumentado nas cepas recombinantes usadas no Exemplo 8 em comparação com o das cepas recombinantes usadas no Exemplo Comparativo 9. Isto é, demonstrou-se que a produção de ácido adípico foi significantemente aumentada pela introdução de qualquer um dos ácidos nucleicos codificantes dos polipeptídeos representados pelas SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 213 nos micro-organismos.

TABELA 11 Cepa Concentração de ADA (mg/L) Rend. de ADA (%) Ec/Smr1_ADA 5,18 0,076 Exemplo 8 Ec/Snm1 ADA 6,94 0,084 Ec/Spl1 ADA 5,38 0,075

Cepa Concentração de ADA (mg/L) Rend. de ADA (%) Ec/Spe1 ADA 6,01 0,093 Ec/Sur1 ADA 7,93 0,101 Ec/Ssp1 ADA 4,76 0,072 Ec/Slq1 ADA 6,82 0,082 Ec/Ppu1 ADA N.D. N.D. Ec/Eco1 ADA N.D. N.D. Exemplo Comparativo 9 Ec/Aci1 ADA N.D. N.D. Ec/Spl2 ADA N.D. N.D.

EXEMPLO 9 CONFIRMAÇÃO DA ATIVIDADE DA 3-OXOADIPIL-COA REDUTASE DOS POLIPEPTÍDEOS REPRESENTADOS PELAS SEQ ID NOS: 2 E 4

[179] Cada um dos plasmídeos produzidos no Exemplo de Referência 2, a saber pACYCDuet-1::Snm1 e pACYCDuet-1::Spe1, foi introduzido em E. coli BL21 (DE3) por eletroporação. Após a introdução, as cepas foram cultivadas em meio ágar LB contendo 15 μg/mL de canamicina a 37ºC. As cepas recombinantes resultantes foram designadas como BL21 (DE3)/pACYCDuet-1::Snm1 e BL21 (DE3)/pACYCDuet-1::Spe1.

[180] Uma alça de platina de BL21 (DE3)/pACYCDuet-1::Snm1 ou BL21 (DE3)/pACYCDuet-1::Spe1 foi inoculada em 20 mL de meio de cultura I (10 g/L de Bacto Triptona (fabricado pela Difco Laboratories), 5 g/L de extrato de levedura Bacto (fabricado pela Difco Laboratories), 5 g/L de cloreto de sódio e 15 μg/mL de cloranfenicol) ajustado para pH 7 e a cultura foi incubada a 37ºC com rotação a 120 rpm por 17 horas. Posteriormente, 10 mL do líquido de cultura foram adicionados a 2 L de meio de cultura I e incubados a 37ºC com agitação a 100 min-1 por 2 horas. O líquido de cultura foi suplementado com IPTG a uma concentração de 500 μM e incubado a 16ºC com agitação a 100 min-1 por 18 horas. O líquido de cultura foi então centrifugado a 6000 rpm a 4ºC por 15 minutos para remover o sobrenadante e o sedimento celular resultante foi suspenso no tampão de ligação fornecido no kit His-Bind Buffer (fabricado pela Merck KGaA). A suspensão de células obtida foi submetida à sonicação utilizando o sonicador Digital Sonifier (fabricado pela Branson Ultrasonics Co.), enquanto era resfriada em gelo. A solução sonicada foi centrifugada a 13.000 rpm a 4ºC por 30 minutos, e o sobrenadante obtido foi designado como homogenato celular.

[181] Um volume adequado da solução de resina His-Bind foi adicionado a 30 mL do homogenato de células e a solução resultante foi incubada a 4ºC por 1 hora. A solução foi centrifugada a 4000 rpm a 4ºC por 5 minutos para remover 20 mL do sobrenadante e a solução restante de resina His-Bind foi então carregada em uma coluna, a qual foi lavada por duas vezes com 10 mL do tampão de ligação, e subsequentemente com 10 mL do tampão de lavagem 1 (com imidazol a 25 mM) por duas vezes e depois com 10 mL do tampão de lavagem 2 (com imidazol a 60 mM) por duas vezes. Finalmente, a eluição foi realizada com 2 mL do tampão de eluição (com imidazol a 1 mM) por quatro vezes e as frações resultantes foram coletadas.

[182] Uma fração que mostra uma banda correspondente a um polipeptídeo de cerca de 55 kDa, que é igual ao peso molecular de cada uma das enzimas alvo, foi centrifugada a 8000 rpm a 4ºC por 15 minutos para remover o sobrenadante e 5 mL do Tampão Strage foi então adicionado ao remanescente para lavagem. A suspensão resultante foi adicionalmente centrifugada a 8000 rpm a 4ºC por 15 minutos para remover o sobrenadante, e 3 mL do tampão Strage foram então adicionados aos restos, e esta operação foi repetida duas vezes no total. As soluções obtidas foram designadas como soluções enzimáticas Snm1 e Spe1.

[183] Preparação de ácido 3-oxoadípico: A preparação do ácido 3- oxoadípico foi realizada de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1 do documento WO 2017/099209.

[184] Preparação da solução de 3-oxoadipil-CoA: O vetor de expressão pRSF-1b (fabricado pela Novagen), que é capaz de replicação autônoma em E. coli, foi clivado com KpnI para obter o plasmídeo pRSF-1b/KpnI.

Para amplificar um gene que codifica uma enzima que catalisa a reação E, os iniciadores (SEQ ID NOs: 230 e 231) foram projetados para uso na amplificação de todo o comprimento de genes da CoA transferase, pcal e pcaJ (NCBI Gene ID: 1046613 e 1046612, SEQ ID NOs: 23 e 24) por PCR usando o DNA genômico de Pseudomonas putida cepa KT2440 como molde e uma reação de PCR foi realizada de acordo com procedimentos de rotina. O fragmento resultante e o pRSF-1b/KpnI foram ligados em conjunto, utilizando o kit de clonagem In-Fusion HD Cloning Kit (fabricado pela Clontech), e o plasmídeo resultante foi introduzido em E. coli cepa DH5α. A sequência nucleotídica no plasmídeo isolado a partir da cepa recombinante obtida foi confirmada de acordo com procedimentos de rotina.

O plasmídeo obtido foi designado como “pRSF-1b::CT”.

[185] O plasmídeo pRSF-1b::CT foi introduzido em E. coli BL21 (DE3), e a expressão da enzima foi induzida com isopropil-β-tiogalactopiranosídeo (IPTG) de acordo com procedimentos de rotina e a enzima foi purificada usando o marcador histidina do líquido de cultura para obter uma solução de CoA transferase. A solução foi usada para preparar uma solução de reação enzimática para a preparação de 3-oxoadipil-CoA com a seguinte composição, que foi permitida reagir a 25ºC por 3 minutos e depois filtrada através de uma membrana de UF (Amicon Ultra-0,5mL 10K; fabricado Merck Millipore) para remover a enzima e o filtrado obtido foi designado como solução de 3-oxoadipil-CoA:

[186] Solução de reação enzimática para preparação de 3- oxoadipil-CoA: - 100 mM de Tris-HCl (pH 8,2); - 10 mM de MgCl2; - 0,5 mM de succinil-CoA; - 5 mM de sal de sódio de ácido 3-oxoadípico; e - 2 μM de CoA transferase.

[187] Identificação da atividade da 3-oxoadipil-CoA redutase: A atividade da 3-oxoadipil-CoA redutase foi determinada medindo a produção de 3- hidroxiadipil-CoA. Cada uma das soluções enzimáticas Snm1 e Spe1 foram usadas para preparar uma solução de reação enzimática com a seguinte composição, a qual foi deixada reagir a 25ºC por 1 hora e depois processada pelo tratamento com filtros de membrana Millex-GV (0,22 μm; PVDF; fabricado pela Merck KGaA), e o filtrado resultante foi analisado por LC-MS/MS da mesma maneira que no Exemplo 2. A este respeito, a concentração de 3-oxoadipil-CoA foi medida de acordo com o método descrito por Kaschabek et al. (J Bacteriol. 2002 Jan; 184 (1): 207-215) e ajustado para 15 μM na solução de reação enzimática. O resultado é apresentado na Tabela 12, juntamente com o resultado de uma reação semelhante à de um controle no qual o Tris-HCl é adicionado em vez da solução de enzima.

- 100 mM de Tris-HCl (pH 8,2); - 10 mM de MgCl2; - 150 μL/mL de solução de 3-oxoadipil-CoA; - 0,5 mM de NADH; - 1 mM de ditiotreitol; e - 10 μM de 3-oxoadipil-CoA redutase.

[188] Os resultados apresentados na Tabela 12 confirmaram a produção de 3-hidroxiadipil-CoA nas reações utilizando as soluções enzimáticas Snm1 e Spe1. Em contraste, a 3-hidroxiadipil-CoA não foi detectada no controle.

Assim, foi demonstrado que as soluções enzimáticas Snm1 e Spe1 apresentaram atividade de 3-oxoadipil-CoA redutase.

TABELA 12 Solução de enzima Concentração de 3-hidroxiadipil-CoA (µM) Snm1 13,9 Exemplo 9 Spe1 13,8 controle N.D.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. MICRO-ORGANISMO GENETICAMENTE MODIFICADO, caracterizado por um ácido nucleico que codifica qualquer um dos polipeptídeos descritos em (a) a (c) abaixo ser introduzido; ou a expressão dos referidos polipeptídeos ser melhorada: (a) um polipeptídeo composto por uma sequência de aminoácidos representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 6 e 213; (b) um polipeptídeo composto da mesma sequência de aminoácidos que a sequência representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 6 e 213, exceto que um ou vários aminoácidos são substituídos, deletados, inseridos e/ou adicionados, e possuindo uma atividade enzimática que catalisa uma reação para reduzir a 3-oxoadipil-CoA em 3-hidroxiadipil-CoA; e (c) um polipeptídeo composto por uma sequência de aminoácidos com uma identidade de sequência não inferior a 70% em relação às sequências representadas por qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 6 e 213 e com uma atividade enzimática que catalisa uma reação para reduzir 3- oxoadipil-CoA em 3-hidroxiadipil-CoA.

2. MICRO-ORGANISMO GENETICAMENTE MODIFICADO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo polipeptídeo descrito em (b) ou (c) compreender uma região com uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 212.

3. MICRO-ORGANISMO GENETICAMENTE MODIFICADO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pela sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 212 compreender um resíduo de fenilalanina ou leucina como o 13º resíduo de aminoácido N-terminal, um resíduo de leucina ou glutamina como o 15º resíduo de aminoácido N-terminal, um resíduo de lisina ou asparagina como o 16º resíduo de aminoácido N-terminal, um resíduo de glicina ou serina como o 17º resíduo de aminoácido N-terminal, um resíduo de prolina ou arginina como o 19º resíduo de aminoácido N-terminal, de preferência, um resíduo de leucina, metionina ou valina como o 21º resíduo de aminoácido N-terminal.

4. MICRO-ORGANISMO GENETICAMENTE MODIFICADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado por ser um micro-organismo geneticamente modificado selecionado a partir do grupo que consiste nos gêneros Escherichia, Serratia, Hafnia e Pseudomonas.

5. MICRO-ORGANISMO GENETICAMENTE MODIFICADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado por ter uma capacidade de gerar 3-oxoadipil-CoA e coenzima A a partir de acetil-CoA e succinil-CoA; e uma capacidade de gerar ácido 3-hidroxiadípico a partir de 3- hidroxiadipil-CoA.

6. MICRO-ORGANISMO GENETICAMENTE MODIFICADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado por ter uma capacidade de gerar 3-oxoadipil-CoA e coenzima A a partir de acetil-CoA e succinil-CoA; uma capacidade de gerar 2,3-desidroadipil-CoA a partir de 3- hidroxiadipil-CoA; e uma capacidade de gerar ácido α-hidromucônico a partir de 2,3-desidroadipil-CoA.

7. MICRO-ORGANISMO GENETICAMENTE MODIFICADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado por ter uma capacidade de gerar 3-oxoadipil-CoA e coenzima A a partir de acetil-CoA e succinil-CoA; uma capacidade de gerar 2,3-desidroadipil-CoA a partir de 3- hidroxiadipil-CoA; uma capacidade de gerar adipil-CoA a partir de 2,3- desidroadipil-CoA; e uma capacidade de gerar ácido adípico a partir de adipil- CoA.

8. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE ÁCIDO 3- HIDROXIADÍPICO, caracterizado por compreender a cultura do micro-

organismo geneticamente modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5 em um meio de cultura contendo uma fonte de carbono como material para fermentação.

9. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE ÁCIDO α- HIDROMUCÔNICO, caracterizado por compreender a cultura do micro- organismo geneticamente modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4 e 6 em um meio de cultura contendo uma fonte de carbono como material para fermentação.

10. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE ÁCIDO ADÍPICO, caracterizado por compreender a cultura do micro-organismo geneticamente modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4 e 7 em um meio de cultura contendo uma fonte de carbono como material para fermentação.

11. MÉTODO DE PRODUÇÃO, de uma ou mais substâncias selecionadas a partir do grupo que consiste em ácido 3-hidroxiadípico, ácido α- hidromucônico e ácido adípico, caracterizado por compreender o cultivo de um micro-organismo geneticamente modificado em um meio de cultura contendo uma fonte de carbono como material para fermentação, em que um ácido nucleico codificante de um polipeptídeo codificado pelo gene da 3-hidroxibutiril- CoA desidrogenase de um micro-organismo do gênero Serratia, que forma um cluster de genes com o gene da ácido 5-aminolevulínico sintase no micro- organismo, é melhorado no micro-organismo geneticamente modificado.