KR20220023757A - 알데하이드 데하이드로게나아제 활성을 개선하기 위한 조작된 미생물 및 방법 - Google Patents

알데하이드 데하이드로게나아제 활성을 개선하기 위한 조작된 미생물 및 방법 Download PDF

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해리시 나가라잔
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게노마티카 인코포레이티드
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Abstract

헥사메틸렌디아민, 카프로산 또는 카프로락탐의 생합성을 향상시키거나 개선시키는 생합성 방법 및 조작된 미생물이 개시된다. 조작된 미생물은 선택된 알데하이드 데하이드로게나아제 활성을 포함한다.

Description

알데하이드 데하이드로게나아제 활성을 개선하기 위한 조작된 미생물 및 방법
관련 출원에 대한 상호 참조문헌
본 출원은 2019년 4월 24일에 출원된 미국 가출원 제62/837,888호; 2019년 6월 11일에 출원된 제62/860,123호; 및 2019년 6월 11일에 출원된 제62/860,160호의 이익을 청구하며, 이러한 문헌의 개시내용은 전문이 본원에 참고로 포함된다.
서열목록의 통합
본 출원은 2020년 4월 23일에 생성되었고 크기가 319 킬로바이트인, 파일명이 "GNO0099WO Sequence Listing2.txt"인 서열목록을 포함한다. 서열목록은 본원에 참고로 포함된다.
나일론은 디아민과 디카복실산의 축중합 또는 락탐의 축중합에 의해 합성될 수 있는 폴리아미드이다. 나일론 6,6은 헥사메틸렌디아민(HMD) 및 아디프산의 반응에 의해 생성되며, 나일론 6은 카프로락탐의 개환 중합에 의해 생성된다. 이에 따라, 아디프산, 헥사메틸렌디아민, 및 카프로락탐은 나일론 생산에서 중요한 중간체이다.
미생물은 나일론 중간체 중 일부를 생산하도록 조작되었다. 그러나, 조작된 미생물은 경로 중간체 및 최종 산물에 대한 원하지 않는 효소 활성의 결과로서 원하지 않는 부산물을 제조할 수 있다. 이에 따라, 이러한 부산물 및 불순물은 화합물을 생합성하는 비용 및 복잡성을 증가시키고, 원하는 산물의 효율 또는 수율을 감소시킬 수 있다.
본원에는 6-아미노카프로산 경로, 카프로락탐 경로, 헥사메틸렌디아민 경로, 카프로락톤 경로, 1,6-헥산디올 경로, 또는 이러한 경로 중 하나 이상의 조합을 갖는 비천연 미생물 유기체가 제공된다. 미생물 유기체는 아디필-CoA와 반응하여 아디페이트-세미알데하이드를 형성하는 알데하이드 데하이드로게나아제 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함한다. 알데하이드 데하이드로게나아제 효소는 숙시닐 CoA, 아세틸 CoA, 또는 숙시닐 CoA와 아세틸 CoA 기질 둘 모두와 비교하여 아디필-CoA 기질에 대한 더 큰 전환 수(turnover number), 더 높은 촉매 효율, 또는 이들의 조합을 갖는다. 비천연 미생물 유기체는 개개 생성물을 제조하기에 충분한 양으로 6-아미노카프로산, 1,6-헥산디올, 카프로락톤, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민을 제조하는 데 필요한 효소를 인코딩하는 추가 외인성 핵산을 추가로 포함할 수 있다. 일부 경우에, 이러한 외인성 핵산 중 하나 이상은 미생물 유기체에 대해 이종일 수 있다.
또한, 6-아미노카프로산, 1,6-헥산디올, 카프로락톤, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민을 제조하는 방법이 개시된다. 방법은 6-아미노카프로산, 1,6-헥산디올, 카프로락톤, 카프로락탐, 및/또는 헥사메틸렌디아민을 배양하여 비천연 미생물 유기체를 제조하는 것을 포함할 수 있으며, 여기서, 미생물 유기체는 아디필-CoA와 반응하여 아디페이트-세미알데하이드를 형성하는 알데하이드 데하이드로게나아제 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 발현시킨다. 방법은 6-아미노카프로산, 1,6-헥산디올, 카프로락톤, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민을 제조하기 위해 충분한 기간 동안 및 조건하에서 비천연 미생물 유기체를 배양하는 것을 포함한다.
하나의 양태에서, 아디필-CoA와 반응하여 아디페이트-세미알데하이드를 형성하는 알데하이드 데하이드로게나아제 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하는 비천연 미생물 유기체가 제공되며, 여기서, 알데하이드 데하이드로게나아제는 숙시닐-CoA, 아세틸-CoA, 또는 숙시닐-CoA와 아세틸-CoA 기질 둘 모두와 비교하여 아디필-CoA 기질에 대해 더 높은 촉매 효율을 가지고/가지거나, 알데하이드 데하이드로게나아제는 숙시닐-CoA, 아세틸-CoA, 또는 숙시닐-CoA와 아세틸-CoA 기질 둘 모두와 비교하여 아디필-CoA 기질에 대해 더 높은 전환 수를 갖는다.
하나의 양태에서, 아디페이트-세미알데하이드를 제조하기 위한 충분한 기간 및 조건으로 상기 양태 및 구현예 중 어느 하나의 비천연 미생물을 배양하는 것을 포함하는 아디페이트-세미알데하이드를 제조하는 방법이 제공된다.
하나의 양태에서, 6ACA를 제조하기 위한 충분한 기간 및 조건으로 상기 양태 및 구현예 중 어느 하나의 비천연 미생물 유기체를 배양하는 것을 포함하는 6-아미노카프로산(6ACA)을 제조하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 방법은 미생물 유기체, 발효 브로쓰, 또는 둘 모두로부터 6ACA를 회수하는 것을 추가로 포함한다.
하나의 양태에서, 헥사메틸렌 디아민을 제조하기 위한 충분한 기간 및 조건으로 상기 양태 및 구현예 중 어느 하나의 비천연 미생물 유기체를 배양하는 것을 포함하는 헥사메틸렌 디아민을 제조하는 방법이 제공한다. 일부 구현예에서, 방법은 미생물 유기체, 발효 브로쓰, 또는 둘 모두로부터 헥사메틸렌 디아민을 회수하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 비천연 미생물 유기체는 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 외인성 핵산 서열을 포함하며, 각각은 헥사메틸렌 디아민 경로 효소를 인코딩한다.
하나의 양태에서, 6-아미노카프로산, 1,6-헥산디올, 카프로락톤, 카프로락탐, 및 헥사메틸렌디아민을 제조하기 위한 충분한 기간 및 조건으로 상기 양태 및 구현예 중 어느 하나의 비천연 미생물 유기체를 배양하는 것을 포함하는 6-아미노카프로산, 1,6-헥산디올, 카프로락톤, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민을 제조하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 방법은 미생물 유기체, 발효 브로쓰, 또는 둘 모두로부터 6-아미노카프로산, 1,6-헥산디올, 카프로락톤, 카프로락탐, 및 헥사메틸렌디아민을 회수하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 비천연 미생물 유기체는 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 외인성 핵산 서열을 포함하며, 각각은 6-아미노카프로산, 1,6-헥산디올, 카프로락톤, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 경로 효소를 인코딩한다.
하나의 양태에서, 개시된 방법을 이용하여 합성된 생체 유래 6-아미노카프로산, 헥사메틸렌디아민, 또는 카프로락탐이 제공된다.
일부 구현예에서, 비천연 미생물 유기체의 알데하이드 데하이드로게나아제 효소는 서열번호 1, 서열번호 2, 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 비천연 미생물 유기체의 알데하이드 데하이드로게나아제 효소는 서열번호 4, 7, 11, 15, 17, 19, 24, 25, 27, 28, 31-33, 36, 38, 40-42, 44, 45, 47, 53, 58-60, 63, 65-67, 74, 75, 77, 80, 82, 84, 86-88, 90, 91, 94, 95, 97, 100, 101, 103, 107, 109, 111, 112, 117, 134, 135, 137, 145, 146, 148-150, 152, 157-159, 164-167, 176, 187, 및 188 중 어느 하나의 적어도 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300개 이상의 인접 아미노산과 적어도 약 60% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 비천연 미생물 유기체의 알데하이드 데하이드로게나아제 효소는 서열번호 4, 7, 11, 15, 17, 19, 24, 25, 27, 28, 31-33, 36, 38, 40-42, 44, 45, 47, 53, 58-60, 63, 65-67, 74, 75, 77, 80, 82, 84, 86-88, 90, 91, 94, 95, 97, 100, 101, 103, 107, 109, 111, 112, 117, 134, 135, 137, 145, 146, 148-150, 152, 157-159, 164-167, 176, 187, 및 188 중 어느 하나의 적어도 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300개 이상의 인접 아미노산과 적어도 약 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 알데하이드 데하이드로게나아제 효소는 보조 인자로서 NADH를 사용한다.
일부 구현예에서, 비천연 미생물 유기체의 알데하이드 데하이드로게나아제 효소는 서열번호 7, 28, 60, 및 107 중 어느 하나의 적어도 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300개 이상의 인접 아미노산과 적어도 약 60% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 알데하이드 데하이드로게나아제는 서열번호 7, 28, 60, 및 188 중 어느 하나의 적어도 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300개 이상의 인접 아미노산과 적어도 약 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 알데하이드 데하이드로게나아제 효소는 보조 인자로서 NADH를 사용한다.
일부 구현예에서, 비천연 미생물 유기체의 알데하이드 데하이드로게나아제 효소는 서열번호 53, 77, 82, 94, 및 152 중 어느 하나의 적어도 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300개 이상의 인접 아미노산과 적어도 약 60% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 알데하이드 데하이드로게나아제 효소는 보조 인자로서 NADH, NADPH, 또는 둘 모두를 사용한다.
일부 구현예에서, 비천연 미생물 유기체의 알데하이드 데하이드로게나아제 효소는 숙시닐-CoA 기질과 비교하여 아디필-CoA 기질에 대해 더 높은 촉매 효율을 갖는다. 일부 구현예에서, 아디필-CoA 기질에 대한 알데하이드 데하이드로게나아제 효소의 촉매 효율은 숙시닐-CoA 기질에 대한 촉매 효율에 비해 적어도 2배 높다.
일부 구현예에서, 비천연 미생물 유기체의 알데하이드 데하이드로게나아제 효소는 아세틸-CoA 기질과 비교하여 아디필-CoA 기질에 대해 더 높은 촉매 효율을 갖는다. 일부 구현예에서, 아디필-CoA 기질에 대한 알데하이드 데하이드로게나아제 효소의 촉매 효율은 아세틸-CoA 기질에 대핸 촉매 효율에 비해 적어도 5배 높다. 일부 구현예에서, 알데하이드 데하이드로게나아제 효소는 아세틸-CoA 기질과 비교하여 아디필-CoA 기질에 대해 더 높은 전환 수를 갖는다.
일부 구현예에서, 비천연 미생물 유기체의 알데하이드 데하이드로게나아제 효소는 6-아미노카프로일-CoA와 추가로 반응하여 6-아미노카프로에이트 세미알데하이드를 형성한다.
일부 구현예에서, 알데하이드 데하이드로게나아제 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하는 비천연 미생물 유기체는 대조군 미생물 유기체가 알데하이드 데하이드로게나아제 효소를 인코딩하는 외인성 핵산을 포함하지 않는 것을 제외하고 비천연 미생물 유기체와 실질적으로 동일한 대조군 미생물 유기체보다 더 많은 아디필-CoA를 아디페이트 세미알데하이드로 전환시킨다.
일부 구현예에서, 아디필-CoA와 반응하여 아디페이트-세미알데하이드를 형성하는 알데하이드 데하이드로게나아제 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산은 미생물 유기체에 대해 이종이다.
일부 구현예에서, 비천연 미생물 유기체는 6-아미노카프로산 경로를 포함한다. 일부 구현예에서, 6-아미노카프로산 경로는 (i) 트랜스아미나아제, (ii) 6-아미노카프로에이트 데하이드로게나아제, 또는 (iii) 트랜스아미나아제 및 6-아미노카프로에이트 데하이드로게나아제 효소 둘 모두를 포함한다. 일부 구현예에서, 비천연 미생물 유기체는 6-아미노카프로산 경로 효소 중 하나 이상을 인코딩하는 하나 이상의 추가 외인성 핵산을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 6-아미노카프로산 경로 효소 중 하나 이상을 인코딩하는 외인성 핵산은 미생물 유기체에 대해 이종이다.
일부 구현예에서, 비천연 미생물 유기체는 헥사메틸렌디아민 경로를 포함한다. 일부 구현예에서, 헥사메틸렌디아민 경로는 (i) 6-아미노아카프로일 CoA 트랜스퍼라아제, (ii) 6-아미노 카프로일 CoA 신타아제, (iii) 6-아미노 카프로일 CoA 리덕타아제, (iv) 헥사메틸렌디아민 트랜스아미나아제, (v) 헥사메틸렌디아민 데하이드로게나아제, 또는 (v) 효소 (i) 내지 (v) 중 하나 이상의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 미생물 유기체는 6-아미노카프로에이트를 6-아미노카프로에이트 세미알데하이드로 전환시키는 카복실산 리덕타아제(CAR)와 같은 헥사메틸렌디아민 경로 효소 중 하나 이상을 인코딩하는 하나 이상의 추가 외인성 핵산을 추가로 포함한다. 6-아미노카프로에이트 세미알데하이드는 후속하여 헥사메틸렌 디아민으로 전환될 수 있다. 일부 구현예에서, 헥사메틸렌디아민 경로 효소 중 하나 이상을 인코딩하는 외인성 핵산은 미생물 유기체에 대해 이종이다.
일부 구현예에서, 비천연 미생물 유기체는 카프로락탐 경로를 포함한다. 일부 구현예에서, 카프로락탐 경로는 아미노하이드롤라아제 효소를 포함한다. 일부 구현예에서, 미생물 유기체는 아미노하이드롤라아제 효소를 인코딩하는 하나 이상의 추가 외인성 핵산을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 아미노하이드롤라아제 효소를 인코딩하는 외인성 핵산은 미생물 유기체에 대해 이종이다.
일부 구현예에서, 비천연 미생물 유기체는 1,6-헥산디올 경로를 포함한다. 일부 구현예에서, 1,6-헥산디올 경로는 하기 효소를 포함한다: 6ACA에서 6-아미노카프로일-CoA로의 6-아미노카프로일-CoA 트랜스퍼라아제 또는 신타아제 촉매 전환; 6-아미노카프로일-CoA에서 6-아미노카프로에이트 세미알데하이드로의 6-아미노카프로일-CoA 리덕타아제 촉매 전환; 6-아미노카프로에이트 세미알데하이드에서 6-아미노헥산올로의 6-아미노카프로에이트 세미알데하이드 리덕타아제 촉매 전환; 6ACA에서 6-아미노카프로에이트 세미알데하이드로의 6-아미노카프로에이트 리덕타아제 촉매 전환; 아디페이트 세미알데하이드로의 아디필-CoA 리덕타아제 아디필-CoA; 아디페이트 세미알데하이드에서 6-하이드록시헥사노에이트로의 아디페이트 세미알데하이드 리덕타아제 촉매 전환; 6-하이드록시헥사노에이트에서 6-하이드록시헥사노일-CoA로의 6-하이드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라아제 또는 신타아제 촉매 전환; 6-하이드록시헥사노일-CoA에서 6-하이드록시헥사날로의 6-하이드록시헥사노일-CoA 리덕타아제 촉매 전환; 6-하이드록시헥사날에서 HDO로의 6-하이드록시헥사날 리덕타아제 촉매 전환; 6-아미노헥산올에서 6-하이드록시헥사날로의 6-아미노헥산올 아미노트랜스퍼라아제 또는 옥시도리덕타아제 촉매 전환; 6-하이드록시헥사노에이트에서 6-하이드록시헥사날로의 6-하이드록시헥사노에이트 리덕타아제 촉매 전환; ADA에서 아디페이트 세미알데하이드로의 아디페이트 리덕타아제 촉매 전환; 및 아디필-CoA에서 ADA로의 아디필-CoA 트랜스퍼라아제, 하이드롤라아제 또는 신타아제 촉매 전환.
일부 구현예에서, 비천연 미생물 유기체는 아디페이트 또는 아디필-CoA에서 카프로락톤으로의 경로를 포함한다. 일부 구현예에서, 아디페이트 또는 아디필-CoA에서 카프로락톤으로의 경로는 하기 효소를 포함한다: 아디필-CoA 리덕타아제, 아디페이트 세미알데하이드 리덕타아제, 6-하이드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라아제 또는 신타아제, 6-하이드록시헥사노일-CoA 시클라아제 또는 자발적 고리화, 아디페이트 리덕타아제, 아디필-CoA 트랜스퍼라아제, 신타아제 또는 하이드롤라아제, 6-하이드록시헥사노에이트 시클라아제, 6-하이드록시헥사노에이트 키나아제, 6-하이드록시헥사노일 포스페이트 시클라아제 또는 자발적 고리화, 포스포트랜스-6-하이드록시헥사노일라아제.
일부 구현예에서, 비천연 미생물 유기체의 알데하이드 데하이드로게나아제는 원핵생물 종으로부터 유래된 것이다. 일부 구현예에서, 알데하이드 데하이드로게나아제 효소는 아시다미노코쿠스(Acidaminococcus), 콜린셀라(Collinsella), 펩토스트렙토코카세애(Peptostreptococcaceae), 또는 롬보우스트시아(Romboustsia)로부터 유래된 것이다.
일부 구현예에서, 비천연 미생물 유기체는 아시네토박터(Acinetobacter), 악티노바실러스(Actinobacillus), 아나에로바이오스필리룸(Anaerobiospirillum), 아스페르길루스(Aspergillus), 바실루스(Bacillus), 클로스트리듐(Clostridium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 에셔리키아(Escherichia), 글루코노박터(Gluconobacter), 클렙시엘라(Klebsiella), 클루베로마이세스(Kluyveromyces), 락토코쿠스(Lactococcus), 락토바실루스(Lactobacillus), 만헤이미아(Mannheimia), 피키아(Pichia), 슈도모나스(Pseudomonas), 리조비움(Rhizobium), 리조푸스(Rhizopus), 사카로마이세스(Saccharomyces), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 및 자이모모나스(Zymomonas)의 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 비천연 미생물 유기체는 에셔리키아. 콜라이의 균주이다.
일부 구현예에서, 배양은 당을 포함하는 발효 브로쓰에서 수행된다.
도 1은 숙시닐-CoA 및 아세틸-CoA로부터 6-아미노카프로에이트, 헥사메틸렌디아민(HMDA), 카프로락탐으로의 대표적인 경로를 도시한 것이다. 효소는 하기와 같이 지정된다: A) 3-옥소아디필-CoA 티올라아제, B) 3-옥소아디필-CoA 리덕타아제, C) 3-하이드록시아디필-CoA 데하이드라타아제, D) 5-카복시-2-펜테노일-CoA 리덕타아제, E) 3-옥소아디필-CoA/아실-CoA 트랜스퍼라아제, F) 3-옥소아디필-CoA 신타아제, G) 3-옥소아디필-CoA 하이드롤라아제, H) 3-옥소아디페이트 리덕타아제, I) 3-하이드록시아디페이트 데하이드라타아제, J) 5-카복시-2-펜테노에이트 리덕타아제, K) 아디필-CoA/아실-CoA 트랜스퍼라아제, L) 아디필-CoA 신타아제, M) 아디필-CoA 하이드롤라아제, N) 아디필-CoA 리덕타아제(알데하이드 형성), O) 6-아미노카프로에이트 트랜스아미나아제, P) 6-아미노카프로에이트 데하이드로게나아제, Q) 6-아미노카프로일-CoA/아실-CoA 트랜스퍼라아제, R) 6-아미노카프로일-CoA 신타아제, S) 아미도하이드롤라아제, T) 자발적 고리화, U) 6-아미노카프로일-CoA 리덕타아제(알데하이드 형성), V) HMDA 트랜스아미나아제, W) HMDA 데하이드로게나아제, X) 아디페이트 리덕타아제, Y) 아디페이트 키나아제, Z) 아디필포스페이트 리덕타아제.
도 2는 숙시닐-CoA에 비해 아디필-CoA가 갖는 활성을 나타낸 알데하이드 데하이드로게나아제 효소 용해물 데이터의 그래프 도식이다.
도 3a 내지 도 3c는 아세틸-CoA & 숙시닐-CoA에 비해 더 높은 아디필-CoA 선호도를 갖는 정제된 알데하이드 데하이드로게나아제 효소를 도시한 동력학 데이터의 그래프 도식이다. 도 3a는 숙시닐-CoA, 아세틸 Co-A, 및 아디필-CoA 기질에 대한 서열번호로 나타낸 다양한 알데하이드 데하이드로게나아제의 촉매 효율을 도시한 것이다. 도 3b는 숙시닐-CoA 기질과 비교하여 아디필-CoA에 대한 서열번호로 나타낸 다양한 알데하이드 데하이드로게나아제의 촉매 효율의 비율을 도시한 것이다. 도 3c는 아세틸-CoA 기질과 비교하여 아디필-CoA에 대한 서열번호로 나타낸 다양한 알데하이드 데하이드로게나아제의 촉매 효율의 비율을 도시한 것이다.
도 4는 출발점으로서 라이신을 사용한 6-아미노 카프로산 및 아디페이트의 합성에 대한 대표적인 경로를 도시한 것이다.
도 5는 출발점으로서 아디필-CoA를 사용한 대표적인 카프로락탐 합성 경로를 도시한 것이다.
도 6은 피루베이트 및 숙신 세미알데하이드로부터 6-아미노카프로에이트로의 대표적인 경로를 도시한 것이다. 효소는 A) HODH 알돌라아제, B) OHED 하이드라타아제, C) OHED 리덕타아제, D) 2-OHD 데카복실라아제, E) 아디페이트 세미알데하이드 아미노트랜스퍼라아제 및/또는 아디페이트 세미알데하이드 옥시도리덕타아제(아민화), F) OHED 데카복실라아제, G) 6-OHE 리덕타아제, H) 2-OHD 아미노트랜스퍼라아제 및/또는 2-OHD 옥시도리덕타아제(아민화), I) 2-AHD 데카복실라아제, J) OHED 아미노트랜스퍼라아제 및/또는 OHED 옥시도리덕타아제(아민화), K) 2-AHE 리덕타아제, L) HODH 포르메이트-리아제 및/또는 HODH 데하이드로게나아제, M) 3-하이드록시아디필-CoA 데하이드라타아제, N) 2,3-데하이드로아디필-CoA 리덕타아제, O) 아디필-CoA 데하이드로게나아제, P) OHED 포르메이트-리아제 및/또는 OHED 데하이드로게나아제, Q) 2-OHD 포르메이트-리아제 및/또는 2-OHD 데하이드로게나아제이다. 약어는 하기와 같다: HODH = 4-하이드록시-2-옥소헵탄-1,7-디오에이트, OHED = 2-옥소헵트-4-엔-1,7-디오에이트, 2-OHD = 2-옥소헵탄-1,7-디오에이트, 2-AHE = 2-아미노헵트-4-엔-1,7-디오에이트, 2-AHD = 2-아미노헵탄-1,7-디오에이트, 및 6-OHE = 6-옥소헥스-4-에노에이트.
도 7은 6-아미노카프로페이트로부터 헥사메틸렌디아민으로의 대표적인 경로를 도시한 것이다. 효소는 A) 6-아미노카프로에이트 키나아제, B) 6-AHOP 옥시도리덕타아제, C) 6-아미노카프로 세미알데하이드 아미노트랜스퍼라아제 및/또는 6-아미노카프로 세미알데하이드 옥시도리덕타아제(아민화), D) 6-아미노카프로에이트 N-아세틸트랜스퍼라아제, E) 6-아세트아미도헥사노에이트 키나아제, F) 6-AAHOP 옥시도리덕타아제, G) 6-아세트아미도헥사날 아미노트랜스퍼라아제 및/또는 6-아세트아미도헥사날 옥시도리덕타아제(아민화), H) 6-아세트아미도헥산아민 N-아세틸트랜스퍼라아제 및/또는 6-아세트아미도헥산아민 하이드롤라아제(아미드), I) 6-아세트아미도헥사노에이트 CoA 트랜스퍼라아제 및/또는 6-아세트아미도헥사노에이트 CoA 리가아제, J) 6-아세트아미도헥사노일-CoA 옥시도리덕타아제, K) 6-AAHOP 아실트랜스퍼라아제, L) 6-AHOP 아실트랜스퍼라아제, M) 6-아미노카프로에이트 CoA 트랜스퍼라아제 및/또는 6-아미노카프로에이트 CoA 리가아제, N) 6-아미노카프로일-CoA 옥시도리덕타아제이다. 약어는 하기와 같다: 6-AAHOP = [(6-아세트아미도헥사노일)옥시]포스포네이트 및 6-AHOP = [(6-아미노헥사노일)옥시]포스포네이트.
도 8은 1,6-헥산디올에 이르는 대표적인 생합성 경로를 도시한 것이다. A)는 6ACA에서 6-아미노카프로일-CoA로의 6-아미노카프로일-CoA 트랜스퍼라아제 또는 신타아제 촉매 전환이며; B)는 6-아미노카프로일-CoA에서 6-아미노카프로에이트 세미알데하이드로의 6-아미노카프로일-CoA 리덕타아제 촉매 전환이며; C)는 6-아미노카프로에이트 세미알데하이드에서 6-아미노헥산올로의 6-아미노카프로에이트 세미알데하이드 리덕타아제 촉매 전환이며; D)는 6ACA에서 6-아미노카프로에이트 세미알데하이드로의 6-아미노카프로에이트 리덕타아제 촉매 전환이며; E)는 아디필-CoA에서 아디페이트 세미알데하이드로의 아디필-CoA 리덕타아제 촉매 전환이며; F)는 아디페이트 세미알데하이드에서 6-하이드록시헥사노에이트로의 아디페이트 세미알데하이드 리덕타아제 촉매 전환이며; G)는 6-하이드록시헥사노에이트에서 6-하이드록시헥사노일-CoA로의 6-하이드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라아제 또는 신타아제 촉매 전환이며; H)는 6-하이드록시헥사노일-CoA에서 6-하이드록시헥사날로의 6-하이드록시헥사노일-CoA 리덕타아제 촉매 전환이며; I)는 6-하이드록시헥사날에서 HDO로의 6-하이드록시헥사날 리덕타아제 촉매 전환이며; J)는 6-아미노헥산올에서 6-하이드록시헥사날로의 6-아미노헥산올 아미노트랜스퍼라아제 또는 옥시도리덕타아제 촉매 전환이며; K)는 6-하이드록시헥사노에이트에서 6-하이드록시헥사날로의 6-하이드록시헥사노에이트 리덕타아제 촉매 전환이며; L)은 ADA에서 아디페이트 세미알데하이드로의 아디페이트 리덕타아제 촉매 전환이며; M)은 아디필-CoA에서 ADA로의 아디필-CoA 트랜스퍼라아제, 하이드롤라아제 또는 신타아제 촉매 전환이다.
도 9는 아디페이트 또는 아디필-CoA로부터 카프로락톤으로의 대표적인 경로를 도시한 것이다. 효소는 A. 아디필-CoA 리덕타아제, B. 아디페이트 세미알데하이드 리덕타아제, C. 6-하이드록시헥사노일-CoA 트랜스퍼라아제 또는 신타아제, D. 6-하이드록시헥사노일-CoA 시클라아제 또는 자발적 고리화, E. 아디페이트 리덕타아제, F. 아디필-CoA 트랜스퍼라아제, 신타아제 또는 하이드롤라아제, G. 6-하이드록시헥사노에이트 시클라아제, H. 6-하이드록시헥사노에이트 키나아제, I. 6-하이드록시헥사노일 포스페이트 시클라아제 또는 자발적 고리화, J. 포스포트랜스-6-하이드록시헥사노일라아제이다.
달리 정의하지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명의 속하는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 동일한 임의의 방법, 디바이스 및 물질은 본 발명의 실무에서 사용될 수 있다. 하기 정의는 본원에서 자주 사용되는 특정 용어의 이해를 용이하게 하기 위해 제공되고, 본 개시의 범위를 제한하는 것을 의미하지 않는다. 본원에서 언급되는 모든 참조문헌은 전문이 참고로 포함된다.
본원에는 숙시닐-CoA, 또는 아세틸-CoA, 또는 둘 모두 기질과 비교하여 아디팔 CoA 기질에 대해 더 높은 촉매 효율 및 전환 수를 갖는 외인성 알데하이드 데하이드로게나아제(ALD) 효소를 발현시키도록 조작된 비천연 미생물 유기체가 개시된다. 아디필 CoA는 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 및 헥사메틸렌디아민(본원에서 나일론 중간체로서 지칭됨)의 생합성 제조에 이르게 하는 경로에서 중간체이다. 이러한 나일론 중간체의 제조를 위해 다수의 상이한 경로가 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 나일론 중간체는 도 1에 도시된 경로로부터 제조될 수 있다. 아디필 CoA를 통한 나일론 중간체에 대한 다른 경로에 대한 세부사항은 예를 들어, 미국특허 제8,377,680호에서 확인될 수 있으며, 이러한 문헌은 전문이 본원에 참고로 포함된다.
나일론 중간체에 이르는 다양한 경로에서, 아실-CoA를 이의 상응하는 알데하이드로 환원시킬 수 있는 아실-CoA 데하이드로게나아제는 아디필-CoA를 아디페이트 세미알데하이드로 변형시킬 수 있다(단계 N, 도 1). 그러나, 일부 아실-CoA 데하이드로게나아제는 또한 숙시닐 CoA 및 아세틸 CoA와 반응할 수 있다. 일부 구현예에서, 숙시닐-CoA, 아세틸 CoA, 또는 둘 모두 기질에 비해 아디필 CoA 기질에 대해 더 높은 촉매 효율, 더 높은 전환 수, 또는 둘 모두를 갖는 아실 CoA 데하이드로게나아제(알데하이드 제조)가 개시된다. 이는 효율 및 또한, 나일론 중간체의 제조를 개선시킨다.
숙시닐-CoA, 아세틸 CoA, 또는 둘 모두 기질과 비교하여 아디필 CoA 기질에 대해 더 높은 촉매 효율, 더 큰 전환 수 또는 둘 모두를 갖는 효소를 식별하기 위해, 유전자 adh(서열번호 1)에 의해 인코딩되는 클로스트리듐 클루이베리(Clostridium kluyveri) DSM555의 대표적인 서열은 다른 알데하이드 데하이드로게나아제 효소를 식별하기 위해 사용되었다. 동종 효소는 표 1에 기술된 바와 같이(서열목록에 나타낸 아미노산 서열을 가짐) 식별되었다.
일부 구현예에서, 알데하이드 데하이드로게나아제 효소 또는 서열은 BLAST에 의해 식별된다. 일부 구현예에서, 알데하이드 데하이드로게나아제는 표 1의 ALD의 아미노산 서열의 적어도 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300개 이상의 인접 아미노산과 적어도 약 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 공유한다.
숙시닐-CoA, 아세틸 CoA, 또는 둘 모두 기질에 비해 아디필 CoA 기질에 대해 더 높은 촉매 효율, 더 큰 전환 수 또는 둘 모두를 갖는 이러한 알데하이드 데하이드로게나아제 효소는 유전적으로 매우 다양한 유기체로부터 유래된다. 종종, 서열 간에 단순한 아미노산 서열 동일성은 이의 공통 기능을 나타내지 않는다. 예를 들어, 표 1에 개시된 일부 대표적인 알데하이드 데하이드로게나아제의 쌍별 서열 정렬 결과는 하기에 나타나 있다.
Figure pct00001
이러한 알데하이드 데하이드로게나아제 효소는 이의 활성 부위에 다수의 보존 도메인, 예를 들어, N-말단 도메인, C-말단 도메인, 및 시스테인 잔기를 갖는다. 알데하이드 데하이드로게나아제는 로스만-폴드(Rossmann-fold) 타입 뉴클레오타이드 결합 아키텍쳐를 갖는 보조 인자 결합 도메인을 포함한다. βαβ 폴드로도 불려진 로스만 폴드는 베타-가닥-알파 나선-베타 가닥 2차 구조의 교대 모티프에 의해 특징되는 수퍼-2차 구조이다. β-가닥은 β-시트의 형성에 참여한다. βαβ 폴드 구조는 FAD, NAD 및 NADP와 같은 디뉴클레오타이드 보조효소를 갖는 효소에서 통상적으로 관찰된다. βαβ 폴드 구조는 제1 β-가닥과 α-나선 간에 단단한 루프의 영역에서 (GxGxxG)의 특정 Gly-풍부 서열과 연관되었다. 또한, 보조 인자 결합 도메인은 또한, 기질 CoA와 결합하는 동일한 도메인이다. 이는 Ald의 통상적인 특징이며, 여기서, 기질 CoA가 먼저 결합하고, 중간체를 형성하며, 이후에, 보조 인자가 결합하고, 화학을 완료하고, 하이드라이드 전달을 수행한다.
다중 서열 정렬 및 은닉 마르코프 모델(hidden Markov model; HMM)을 기초로 하여, 알데하이드 데하이드로게나아제 효소는 유럽 생물정보학 연구소의 Pfam 데이터베이스(pfam.xfam.org)의 Pfam PF00171, Clan CL0099로 그룹화된다. 이러한 효소는 효소 위원회 명명법에 따라 EC 1.2.1로서 분류된다.
일부 구현예에서, ALD 효소는 숙시닐-CoA, 아세틸 Co-A, 또는 둘 모두와 비교하여 아디필-CoA가 기질일 때 더 높은 촉매 효율, 및/또는 전환율을 갖는다. 일부 구현예에서, 알데하이드 데하이드로게나아제 효소는 서열번호 4, 7, 11, 15, 17, 19, 24, 25, 27, 28, 31-33, 36, 38, 40-42, 44, 45, 47, 53, 58-60, 63, 65-67, 74, 75, 77, 80, 82, 84, 86-88, 90, 91, 94, 95, 97, 100, 101, 103, 107, 109, 111, 112, 117, 134, 135, 137, 145, 146, 148-150, 152, 157-159, 164-167, 176, 187, 또는 188 중 어느 하나의 적어도 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300개 이상의 인접 아미노산과 적어도 약 60% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 아디필-CoA와 반응하여 아디페이트-세미알데하이드를 형성하는 알데하이드 데하이드로게나아제 효소의 아미노산 서열은 서열번호 1-4, 7, 11, 15, 17, 19, 24, 25, 27, 28, 31-33, 36, 38, 40-42, 44, 45, 47, 53, 58-60, 63, 65-67, 74, 75, 77, 80, 82, 84, 86-88, 90, 91, 94, 95, 97, 100, 101, 103, 107, 109, 111, 112, 117, 134, 135, 137, 145, 146, 148-150, 152, 157-159, 164-167, 176, 187, 및 188의 아미노산 서열로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 숙시닐-CoA, 아세틸-CoA, 또는 둘 모두 기질과 비교하여 아디필-CoA 기질에 대한 더 높은 촉매 효율, 더 큰 전환율 또는 이들의 조합을 갖는 알데하이드 데하이드로게나아제의 아미노산 서열은 서열번호 7, 28, 60 및 107 중 어느 하나의 적어도 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300개 이상의 인접 아미노산과 적어도 약 60% 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 숙시닐-CoA, 아세틸-CoA, 또는 둘 모두 기질과 비교하여 아디필-CoA 기질에 대한 더 높은 촉매 효율, 더 큰 전환율 또는 이들의 조합을 갖는 알데하이드 데하이드로게나아제의 아미노산 서열은 서열번호 7, 28, 60 및 107 중 어느 하나의 아미노산 서열의 적어도 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300개 이상의 인접 아미노산과 적어도 약 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, ALD 효소는 기질로서 숙시닐-CoA, 아세틸-CoA, 또는 둘 모두와 비교하여 적어도 5X, 적어도 10X, 적어도 25X, 또는 5 내지 25X인 적어도 아디필-CoA 기질에 대한 촉매 효율을 갖는다.
일부 구현예에서, 그러한 효소에 대한 공지된 표준 조건하에서 명시된 기질(들)(예를 들어, 아디필-CoA)의 명시된 산물(들)(예를 들어, 아디페이트 세미알데하이드)의 효소 전환은 단지 아디필-CoA에 대한 특이성을 가지지 않은 효소에 대한 효소 활성보다 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 또는 적어도 90% 더 크다.
일부 구현예에서, 알데하이드 데하이드로게나아제 효소는 6-아미노카프로에이트 세미알데하이드를 형성하기 위해 6-아미노카프로일-CoA와 추가로 반응한다.
효소 활성이 감소된 세포는 당분야에 공지된 임의의 방법을 이용하여 식별될 수 있다. 예를 들어, 효소 활성 검정은 효소 활성이 감소된 세포를 식별하기 위해 사용될 수 있다[예를 들어, 문헌[Enzyme Nomenclature, Academic Press, Inc., New York 2007] 참조]. ADH의 감소를 결정하기 위해 이용될 수 있는 다른 검정은 GC/MS 분석을 포함한다. 다시 말해서, NADH/NADPH의 수준이 모니터링될수 있다. 예를 들어, NADH/NADPH는 NADP/NADPH 검정 키트(예를 들어, ABCAM™으로부터 입수 가능한 ab65349)를 이용하여 비색 또는 분광학적으로 모니터링될 수 있다.
개시된 ALD 효소는 나일론 중간체의 제조를 위한 경로에서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 비천연 미생물은 아디페이트 세미알데하이드, 또는 중간체로서 아디페이트 세미알데하이드를 사용하여 제조된 다른 나일론 중간체의 제조에서 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 유전적으로 조작된 세포(예를 들어, 비천연 미생물)는 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 및 헥사메틸렌디아민과 같은 나일론 중간체를 제조할 수 있다.
일부 구현예에서, 나일론 중간체는 도 1에 기술된 경로를 이용하여 생합성된다. 일부 구현예에서, 도 1 경로는 본원에 기술된 유전적으로 조작된 세포(예를 들어, 비천연 미생물)에서 제공되며, 여기서, 경로는 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 및 헥사메틸렌디아민을 제조하기에 충분한 양으로 발현된 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함한다.
일부 구현예에서, 경로는 도 1에 도시된 HMD 경로이다. HMD 경로는 본원에 기술된 유전적으로 개질된 세포(예를 들어, 비천연 미생물)에 제공되며, 여기서, HMD 경로는 HMD를 제조하기에 충분한 양으로 발현되는 HMD 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함한다. 효소 1A는 3-옥소아디필-CoA 티올라아제이며; 1B는 3-옥소아디필-CoA 리덕타아제이며; 1C는 3-하이드록시아디필-CoA 데하이드라타아제이며; 1D는 5-카복시-2-펜테노일-CoA 리덕타아제이며; 1E는 3-옥소아디필-CoA/아실-CoA 트랜스퍼라아제이며; 1F는 3-옥소아디필-CoA 신타아제이며; 1G는 3-옥소아디필-CoA 하이드롤라아제이며; 1H는 3-옥소아디페이트 리덕타아제이며; 1I는 3-하이드록시아디페이트 데하이드라타아제이며; 1J는 5-카복시-2-펜테노에이트 리덕타아제이며; 1K는 아디필-CoA/아실-CoA 트랜스퍼라아제이며; 1L은 아디필-CoA 신타아제이며; 1M은 아디필-CoA 하이드롤라아제이며; 1N은 아디필-CoA 리덕타아제(알데하이드 형성)이며; 1O는 6-아미노카프로에이트 트랜스아미나아제이며; 1P는 6-아미노카프로에이트 데하이드로게나아제이며; 1Q는 6-아미노카프로일-CoA/아실-CoA 트랜스퍼라아제이며; 1R은 6-아미노카프로일-CoA 신타아제이며; 1S는 아미도하이드롤라아제이며; 1T는 자발적 고리화이며; 1U는 6-아미노카프로일-CoA 리덕타아제(알데하이드 형성)이며; 1V는 HMDA 트랜스아미나아제이며; 1W는 HMDA 데하이드로게나아제이다.
도 1을 참조하면, 일부 구현예에서, 비천연 미생물은 하기 경로들 중 하나 이상을 갖는다: ABCDNOPQRUVW; ABCDNOPQRT; 또는, ABCDNOPS. 아디페이트 세미알데하이드를 제조하기 위한 ALD 효소를 포함하는 다른 대표적인 경로는 미국특허 제8,377,680호에 기술된 것을 포함하며, 이러한 문헌은 전문이 본원에 참고로 포함된다.
도 1은 또한, 트랜스퍼라아제 또는 신타아제 효소에 의한 6-아미노카프로에이트로부터 6-아미노카프로일-CoA로의 경로(도 1, 단계 Q 또는 R), 이후 카프로락탐을 형성하기 위한 6-아미노카프로일-CoA의 자발적 고리화(도 1, 단계 T)를 도시한 것이다. 다른 구현예에서, 6-아미노카프로에이트는 6-아미노카프로일-CoA로 활성화되고(도 1, 단계 Q 또는 R), 이후에, HMDA를 형성하기 위해 환원(도 1, 단계 U) 및 아민화(도 1, 단계 V 또는 W)된다. 6-아미노카프로산은 또한, 6-아미노카프로일-CoA 대신에 6-아미노카프로일-포스페이트로 활성화될 수 있다. 6-아미노카프로일-포스페이트는 카프로락탐을 형성하기 위해 자발적으로 환형화될 수 있다. 일부 구현예에서, 6-아미노카프로일-포스페이트는 6-아미노카프로에이트 세미알데하이드로 환원되고, 이는 이후에 도 1에 도시된 바와 같이 HMDA로 전환될 수 있다. 일부 구현예에서, 6-아미노카프로산은 아미노카프로에이트 리덕타아제(CAR)에 의해 6-아미노카프로에이트 세미알데하이드로 전환된다. 도 1에 도시되어 있지 않지만, 아미노카프로에이트 리덕타아제는 도 1에 도시된 바와 같은 아미노카프로산의 6-아미노카프로에이트 세미알데하이드로의 전환을 촉매화할 수 있다.
일부 구현예에서, 비천연 미생물 유기체는 (i) 6-아미노아카프로일 CoA 트랜스퍼라아제, (ii) 6-아미노 카프로일 CoA 신타아제, (iii) 6-아미노 카프로일 CoA 리덕타아제, (iv) 헥사메틸렌디아민 트랜스아미나아제, (v) 헥사메틸렌디아민 데하이드로게나아제, 또는 (v) 효소 (i) 내지 (v) 중 하나 이상의 조합을 포함하는 헥사메틸렌디아민 경로를 갖는다. 다른 구현예에서, 비천연 미생물 유기체는 3-옥소아디필-CoA 티올라아제(Thl), 3-옥소아디필-CoA 데하이드로게나아제(Hbd), 및 3-옥소아디필-CoA 데하이드라타아제("크로토나아제" 또는 Crt), 5-카복시-2-펜테노일-CoA 리덕타아제(Ter), 트랜스아미나아제(HMD TA) 및 카복실산 리덕타아제(CAR)를 포함하는 헥사메틸렌디아민 경로를 갖는다.
미생물 유기체 또는 미생물을 참조하여 사용될 때 본원에서 사용되는 용어 "비천연"은 미생물 유기체가 언급된 종의 야생형 균주를 포함하는, 언급된 종의 자연 발생 균주에서 일반적으로 발견되지 않는 적어도 하나의 유전적 변경을 가짐을 의미하는 것으로 의도된다. 유전적 변경은 예를 들어, 대사 폴리펩타이드를 인코딩하는 발현 가능한 핵산을 도입한 변형, 다른 핵산 첨가, 핵산 결실, 및/또는 미생물 유전 물질의 다른 기능 파괴를 포함한다. 이러한 변형은 예를 들어, 언급된 종에 대한 이종, 동종, 또는 이종과 동종 폴리펩타이드 둘 모두에 대한, 코딩 영역 및 이의 기능적 단편을 포함한다. 추가 변형은 예를 들어, 변형이 유전자 또는 오페론의 발현을 변경시키는 비-코딩 조절 영역을 포함한다. 대표적인 대사 폴리펩타이드는 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산 생합성 경로 내의 효소를 포함한다.
대사 변형은 이의 자연 발생 상태로부터 변경된 생화학적 반응을 지칭한다. 이에 따라, 비천연 미생물은 대사 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 또는 이의 기능성 단편에 대한 유전적 변형을 가질 수 있다. 대표적인 대사 변형은 본원에 개시되어 있다.
본원에서 사용되는 용어 "미생물의," "미생물 유기체" 또는 "미생물"은 서로 교환 가능하게 사용되었고, 고세균, 박테리아 또는 진핵생물의 도메인 내에 포함된 미세한 세포로서 존재하는 임의의 유기체를 의미하는 것으로 의도된다. 이에 따라, 이러한 용어는 미세한 크기를 갖는 원핵 세포 또는 진핵 세포 또는 유기체를 포함하는 것으로 의도되고, 모든 종의 박테리아, 고세균 및 진정세균뿐만 아니라 진핵 미생물, 예를 들어, 효모 및 진균을 포함한다. 이러한 용어는 또한 생화학적 제조를 위해 배양될 수 있는 임의의 종의 세포 배양물을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "CoA" 또는 "조효소 A"는 유기 보조 인자 또는 보정 그룹(prosthetic group)(효소의 비단백질 부분)을 의미하는 것으로 의도되며, 이의 존재는 활성 효소 시스템을 형성하기 위해 여러 효소(아포효소)의 활성을 위해 요구된다. 특정의 축합 효소에서 조효소 A 기능은 아세틸 또는 다른 아실 기 전달에서 및 지방산 합성 및 산화, 피루베이트 산화에서, 및 다른 아세틸화에서 작용한다.
본원에서 사용되는, 화학식 -OOC-(CH2)4-COO-(도 1 참조)(IUPAC명 헥산디오에이트)를 갖는 "아디페이트"는 아디프산(IUPAC명 헥산디오산)의 이온화된 형태이며, 아디페이트 및 아디프산은 이의 임의의 염 형태를 포함하는 임의의 이의 중성 또는 이온화된 형태의 화합물을 지칭하기 위해 전반에 걸쳐 서로 교환 가능하게 사용될 수 있는 것으로 이해된다. 특정 형태가 pH에 따라 달라질 것이라는 것이 당업자에 의해 이해된다.
본원에서 사용되는, 화학식 -OOC-(CH2)5-NH2(도 1 참조, 및 6-ACA로서 약침됨)를 갖는 "6-아미노카프로에이트"는 6-아미노카프로산(IUPAC명 6-아미노헥산산)의 이온화된 형태이며, 6-아미노카프로에이트 및 6-아미노카프로산은 이의 임의의 염 형태를 포함하는 임의의 이의 중성 또는 이온화된 형태의 화합물을 지칭하기 위해 전반에 걸쳐 서로 교환 가능하게 사용될 수 있는 것으로 이해된다. 특정 형태가 pH에 따라 달라질 것이라는 것이 당업자에 의해 이해된다.
본원에서 사용되는 "카프로락탐"(IUPAC명 아제판-2-온)은 6-아미노헥산산의 락탐(도 1 참조, 및 CPO로서 약칭됨)이다.
본원에서 사용되는 1,6-디아미노헥산 또는 1,6-헥산디아민으로도 지칭되는 "헥사메틸렌디아민"은 화학식 H2N(CH2)6NH2(도 1 참조, 및 HMD로서 약칭됨)를 갖는다.
배양 또는 성장 조건과 관련하여 사용될 때 본원에서 사용되는 용어 "실질적으로 혐기성"은 산소의 양이 액체 배지 중 용존 산소에 대한 포화도의 약 10% 미만임을 의미하는 것으로 의도된다. 이러한 용어는 또한, 약 1% 미만의 산소의 대기와 함께 유지된 액체 또는 고체 배치의 시일링된 챔버를 포함하는 것으로 의도된다.
배양 또는 성장 조건과 관련하여 사용될 때 본원에서 사용되는 용어 "삼투 억제제"는 삼투물질로서 작용하고 본원에 기술된 미생물 유기체가 삼투 스트레스에서 생존하는 데 도움을 주는 화합물을 의미하는 것으로 의도된다. 삼투 억제제는 예를 들어, 베타인, 아미노산, 및 당 트레할로오스를 포함한다. 이의 비제한적인 예에는 글리신 베타인, 프랄린 베타인, 디메틸테틴, 디메틸설포니오프로피오네이트, 3-디메틸설포니오-2-메틸프로프리오네이트, 피페콜린산, 디메틸설포니오아세테이트, 콜린, L-카르니틴 및 엑토인이 있다.
생화학물질의 제조와 관련하여 사용될 때 본원에서 사용되는 용어 "성장-커플링된"은 언급된 생화학물의 생합성이 미생물의 성장 시기 동안 제조되는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 특정 구현예에서, 성장-커플링된 제조는 필수적일 수 있는데, 이는 언급된 생화학물의 생합성이 미생물의 성장 시기 동안 제조된 필수 산물임을 의미한다.
본원에서 사용되는 "대사 변형"은 이의 천연 발생 상태로부터 변경되는 생화학적 반응을 지칭하는 것으로 의도된다. 대사 변형은 예를 들어, 반응에 참여하는 효소를 인코딩하는 하나 이상의 유전자의 기능적 파괴에 의해 생화학적 반응 활성의 제거를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "유전자 파괴," 또는 이의 문법적 등가물은 인코딩된 유전자 산물을 비활성화시키는 유전적 변형을 의미하는 것으로 의도된다. 유전적 변경은 예를 들어, 전체 유전자의 결실, 전사 또는 번역을 위해 필요한 조절 서열의 결실, 절단된 유전자 산물을 초래하는 유전자의 일부의 결실, 또는 인코딩된 유전자 산물을 비활성화시키는 임의의 다양한 돌연변이 전략에 의한 것일 수 있다. 유전자 파괴의 하나의 특히 유용한 방법은 완전 유전자 결실인데, 왜냐하면, 이러한 것이 비천연 미생물에서 유전적 반전의 발생을 감소시키거나 제거하기 때문이다.
본원에서 사용되는 "외인성"은 언급된 분자 또는 언급된 활성이 숙주 미생물 유기체 내에 도입됨을 의미하는 것으로 의도된다. 분자는 예를 들어, 숙주 유전 물질 내에 인코딩 핵산의 도입에 의해, 예를 들어, 숙주 염색체 내에 또는 플라스미드와 같은 비-염색체 유전 물질로서 통합에 의해 도입될 수 있다. 이에 따라, 인코딩 핵산의 발현과 관련하여 사용될 때 이러한 용어는 미생물 유기체 내에 발현 가능한 형태로 인코딩 핵산의 도입을 지칭한다. 생합성 활성과 관련하여 사용될 때, 이러한 용어는 언급된 숙주 유기체 내에 도입된 활성을 지칭한다. 소스는 예를 들어, 숙주 미생물 유기체 내에 도입된 후 언급된 활성을 발현시키는 동종 또는 이종 인코딩 핵산일 수 있다. 이에 따라, 용어 "내인성"은 숙주에 존재하는 언급된 분자 또는 활성을 지칭한다. 유사하게는, 이러한 용어는 인코딩 핵산의 발현과 관련하여 사용될 때, 미생물 유기체 내에 함유된 인코딩 핵산의 발현을 지칭한다.
용어 "이종"은 언급된 종과는 다른 소스로부터 유래된 분자 또는 활성을 지칭하며, "동종"은 숙주 미생물 유기체로부터 유래된 분자 또는 활성을 지칭한다. 이에 따라, 인코딩 핵산의 외인성 발현은 이종 또는 동종 인코딩 핵산 중 어느 하나 또는 둘 모두를 사용할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "약"은 기술된 값의 ± 10%를 의미한다. 용어 "약"은 가장 가까운 유효 숫자로 반올림된 것을 의미할 수 있다. 이에 따라, 약 5%는 4.5% 내지 5.5%를 의미한다. 추가적으로, 특정 수와 관련한 약은 또한, 그러한 정확한 숫자도 포함한다. 예를 들어, 약 5%는 또한 정확하게 5%도 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 전환 수(kcat로도 언급됨)는 단일 촉매 부위가 제공된 효소 농도[ET]에 대해 실행할 초당 기질 분자의 화학적 전환의 최대 수로서 정의된다. 이는 하기와 같이 최대 반응 속도 Vmax 및 촉매 부위 농도[ET]로부터 계산될 수 있다:
Kcat = Vmax/[ET]. 단위는 s-1이다.
본원에서 사용되는 용어 "촉매 효율"은 효소가 얼마나 효율적으로 기질을 산물로 전환시키는 지에 대한 척도이다. 촉매 효율의 비교는 또한, 상이한 기질에 대한 효소의 선호도(즉, 기질 특이성)의 척도로서 사용될 수 있다. 촉매 효율이 높을수록, 효소가 그러한 기질을 더욱 "선호"하는 것이다. 이는 수학식, kcat/KM으로부터 계산될 수 있으며, 여기서, kcat는 전환 수이며, KM은 마이켈리스 상수(Michaelis constant)이며, KM은 반응 속도가 Vmax의 절반인 기질 농도이다. 촉매 효율의 단위는 s-1M-1로서 표현될 수 있다.
6-아미노카프로산, 1,6-헥산디올, 카프로락톤, 카프로락탐, 또는 헥사메틸렌디아민의 맥락에서 본원에서 사용되는 용어 "생체 유래"는 이러한 화합물이 미생물 유기체에서 합성됨을 의미한다.
하나 초과의 외인성 핵산이 미생물 유기체에 포함될 때, 외인성 핵산이 상기에 논의된 바와 같이, 언급된 인코딩 핵산 또는 생합성 활성을 지칭하는 것으로 이해된다. 또한, 본원에 개시된 바와 같이, 이러한 외인성 핵산이 별도의 핵산 분자, 폴리시스트론 핵산 분자 또는 이들의 조합 상에서 숙주 미생물 유기체 내에 도입될 수 있고, 여전히 하나 초과의 외인성 핵산으로서 여겨지는 것으로 이해된다. 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같이, 미생물 유기체는 원하는 경로 효소 또는 단백질을 인코딩하는 2개 이상의 외인성 핵산을 발현하도록 조작될 수 있다. 원하는 활성을 인코딩하는 2개의 외인성 핵산이 숙주 미생물 유기체 내에 도입되는 경우에, 2개의 외인성 핵산이 예를 들어, 단일 플라스미드, 별도의 플라스미드 상에 단일 핵산으로서 도입될 수 있고, 단일 부위 또는 다수의 부위에 숙주 염색체 내에 도입될 수 있고, 여전히 2개의 외인성 핵산으로서 여겨질 수 있다. 유사하게는, 2개 초과의 외인성 핵산이 예를 들어, 단일 플라스미드, 숙주 염색체 내에 도입되지 않은 별도의 플라스미드 상에 임의의 원하는 조합으로 숙주 유기체 내에 도입될 수 있으며, 플라스미드는 염색체외 구성요소로서 잔류하고, 여전히 2개 이상의 외인성 핵산으로서 여겨진다. 언급된 외인성 핵산 또는 생합성 활성의 수는 숙주 유기체 내에 도입된 별도의 핵산의 수가 아닌, 인코딩 핵산의 수 또는 생합성 활성의 수를 지칭한다.
비천연 미생물 유기체는 안전한 유전적 변경을 함유할 수 있으며, 이는 변경의 상실 없이 5세대 이상 배양될 수 있는 미생물을 지칭한다. 일반적으로, 안정한 유전적 변경은 10세대 이상 지속하는 변형을 포함하며, 특히 안정한 변형은 약 25세대 이상 지속할 것이며, 보다 특히, 안정한 유전적 변형은 무기한을 포함하는, 50세대 이상일 것이다.
유전자 파괴의 경우에, 특히 유용한 안정한 유전적 변경은 유전자 결실이다. 안정한 유전적 변경을 도입하기 위한 유전자 결실의 사용은 유전적 변경 이전에 표현형에 대한 반전의 가능성을 감소시키는 데 특히 유용하다. 예를 들어, 생화학물질의 안정한 성장-커플링된 제조는 예를 들어, 한 세트의 대사 변형 내에 하나 이상의 반응을 촉매화하는 효소를 인코딩하는 유전자의 결실에 의해 달성될 수 있다. 생화학물질의 성장-커플링된 제조의 안정성은 다수의 결실을 통해 추가로 향상되어, 각 파괴된 활성을 위해 발생하는 다수의 보상적 반전의 가능성을 크게 감소시킬 수 있다.
당업자는 본원에 예시된 대사 변형을 포함하는 유전적 변경이 E. 콜라이와 같은 적합한 숙주 유기체, 및 이의 상응하는 대사 반응 또는 원하는 대사 경로에 대한 유전자와 같은 원하는 유전 물질에 대한 적합한 소스 유기체와 관련하여 기술된다는 것을 이해할 것이다. 그러나, 매우 다양한 유기체의 완전한 게놈 시퀀싱 및 게놈학의 분야의 높은 수준의 기술을 고려하여, 당업자는 본질적으로 모든 다른 유기체에 본원에 제공된 교시 및 지침을 용이하게 적용할 수 있을 것이다. 예를 들어, 본원에서 예시된 E. 콜라이 대사 변경은 언급된 종과는 다른 종으로부터 동일하거나 유사한 인코딩 핵산을 도입함으로써 다른 종에 용이하게 적용될 수 있다. 이러한 유전적 변경은 예를 들어, 일반적으로 종 동족체, 및 특히 오르소로그(ortholog), 파라로그(paralog) 또는 비-오르소로그 유전자 변위의 유전적 변경을 포함한다.
오르소로그는 수직 혈통에 의해 관련된 유전자 또는 유전자들이고, 상이한 유기체에서 실질적으로 동일하거나 동일한 기능을 담당한다. 예를 들어, 마우스 에폭사이드 하이드롤라아제 및 인간 에폭사이드 하이드롤라아제는 에폭사이드의 가수분해의 생물학적 기능에 대한 오르소로그로 여겨질 수 있다. 유전자는 예를 들어, 동종이거나 공통 조상으로부터의 진화에 의해 연관된 것을 나타내기 위해 충분한 양의 서열 유사성을 공유할 때 수직 형태에 의해 관련된다. 유전자는 또한, 이러한 것이 1차 서열 유사성이 식별 가능하지 않은 정도로 공통 조상으로부터 진환되었음을 나타내기에 충분한 양의 3차원 구조를 공유하지만, 반드시 서열 유사성을 공유하지 않는 경우 오르소로그로 여겨질 수 있다. 오르소로그인 유전자는 약 25% 내지 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 단백질을 인코딩할 수 있다. 25% 미만의 아미노산 유사성을 공유하는 단백질을 인코딩하는 유전자는 또한, 이의 3차원 구조가 또한 유사성을 나타내는 경우 수직 혈통에 의해 발생한 것으로 여겨질 수 있다. 조직 플라스미노겐 활성제 및 엘라스타아제를 포함하는, 효소의 세린 프로테아제 패밀리의 구성원은 공통 조상으로부터 수직 혈통에 의해 발생한 것으로 여겨진다.
오르소로그는 예를 들어, 진화를 통해 구조 또는 전체 활성으로 분기된 유전자 또는 이의 인코딩된 유전자 산물을 포함한다. 예를 들어, 하나의 종이 2가지 기능을 나타내는 유전자 산물을 인코딩하는 경우 및 이러한 기능이 제2 종에서 별개의 유전자로 분리된 경우에, 3개의 유전자 및 이의 상응하는 산물은 오르소로그로 여겨진다. 생화학적 산물의 제조를 위해, 당업자는 도입되거나 파괴된 대사 활성을 은닉하는 오르소로그 유전자가 비천연 미생물의 구성을 위해 선택되어야 함을 이해할 것이다. 분리 가능한 활성을 나타내는 오르소로그의 예는 별개의 활성이 2개 이상의 종 사이에 또는 단일 종 내에 별개의 유전자 산물로 분리되는 경우이다. 특정 예는 엘라스타아제 단백질분해 및 플라스미노겐 단백질분해, 즉, 2가지 타입의 세린 프로테아제 활성의 팔르스미노겐 활성제 및 엘라스타아제로서 별도의 분자로의 분리이다. 제2 예는 미코플라스마 5'-3' 엑소뉴클레아제 및 트로소필라 DNA 폴리머라아제 III 활성의 분리이다. 제1 종으로부터의 DNA 폴리머라아제는 제2 종으로부터의 엑소뉴클레아제 또는 폴리머라아제 중 어느 하나 또는 둘 모두에 오르소로그으로 여겨질 수 있거나, 그 반대로도 여겨질 수 있다.
반대로, 유사체는 예를 들어, 복제 이후 진화적 발산에 의해 관련된 동족체이고, 유사하거나 공통적인 기능을 가지지만, 동일한 기능을 갖는 것은 아니다. 유사체는 예를 들어, 동일한 종 또는 상이한 종으로부터 기원하거나 유래될 수 있다. 예를 들어, 마이크로솜 에폭사이드 하이드롤라아제(에폭사이드 하이드롤라아제 I) 및 가용성 에폭사이드 하이드롤라아제(에폭사이드 하이드롤라아제 II)는 별개의 반응을 촉매화하고 동일한 종에서 별도의 기능을 갖는 유사체로서 여겨질 수 있는데, 왜냐하면, 이러한 것이 2개의 별개의 효소를 나타내고, 공통 조상으로부터 공동-진화하기 때문이다. 유사체는 서로 유의미한 서열 유사성을 갖는 동일한 종으로부터의 단벽질로서, 이는 이러한 것이 동종이거나, 공통 조상으로부터 공진화를 통해 동해 관련이 있음을 시사한다. 파라로그 단백질 패밀리의 그룹은 HipA 동족체, 루시페라아제 유전자, 펩티다아제 등을 포함한다.
비-오르소로그 유전자 변위는 상이한 종에서 언급된 유전자 기능을 치환할 수 있는 하나의 종으로부터의 비-오르소로그 유전자이다. 치환은 예를 들어, 상이한 종에서 언급된 기능과 비교하여 본래 종에서 실질적으로 동일하거나 유사한 기능을 수행할 수 있는 것을 포함한다. 일반적으로, 비-오르소로그 유전자 변위가 언급된 기능을 인코딩하는 공지된 유전자와 구조적으로 관련된 바와 같이 식별 가능할 수 있지만, 그럼에도 불구하고, 덜 구조적으로 관련되지만, 기능적으로 유사한 유전자 및 이의 상응하는 유전자 산물은 본원에서 사용되는 용어의 의미 내에 여전히 속할 것이다. 기능적 유사성은 예를 들어, 치환하고자 하는 기능을 인코딩하는 유전자와 비교하여 비-오르소로그 유전자 산물의 활성 부위 또는 결합 영역에 적어도 일부 구조적 유사성을 필요로 한다. 이에 따라, 비-오르소로그 유전자는 예를 들어, 파라로그 유전자 또는 관련되지 않은 유전자를 포함한다.
이에 따라, 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산 생합성 능력을 식별하고 작제화함에 있어서, 당업자는 특정 종에 본원에 제공된 교시 및 지침을 적용하면서, 대사 변형의 식별이 오르소로그 유전자의 식별 및 포함 또는 비활성화를 포함할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 유사한 또는 실질적으로 유사한 대사 반응을 촉매화하는 효소를 인코딩하는 언급된 미생물에 파라로그 유전자 및/또는 비-오르소로그 유전자 변위가 존재하는 한, 당업자는 또한, 이러한 진화적으로 관련된 유전자를 사용할 수 있다. 유전자 파괴 전략에서, 진화적으로 관련된 유전자는 또한, 파괴에 대해 표적화된 효소 활성의 임의의 기능적 중복이 설계된 대사 변형을 단락시키지 않음을 보장하기 위해 활성을 감소시키거나 제거하기 위해 숙주 미생물 유기체, 파라로그 유전자 또는 오르소로그 유전자에서 파괴되거나 결실될 수 있다.
오르소로그, 파라로그 및 비-오르소로그 유전자 변위는 당업자에게 널리 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 2개의 폴리펩타이드에 대한 핵산 또는 아미노산 서열의 검사는 비교된 서열 간의 서열 동일성 및 유사성을 나타낼 것이다. 이러한 유사성을 기초로 하여, 당업자는 단백질이 공통 조상으로부터의 진화를 통해 관련되어 있음을 나타낼만큼 유사성이 충분히 높은 지를 결정할 수 있다. 당업자에게 널리 공지된 알고리즘, 예를 들어, Align, BLAST, Clustal W 및 다른 것들은 원시 서열 유사성 또는 동일성을 비교하고, 결정하고, 또한, 가중치 또는 스코어를 할당할 수 있는 서열에서 갭의 존재 또는 유의도를 결정한다. 이러한 알고리즘은 또한, 당분야에 공지되어 있고, 뉴클레오타이드 서열 유사성 또는 동일성을 결정하기 위해 유사하게 적용 가능하다. 관련성을 결정하기 위한 충분한 유사성에 대한 파라미터는 통계학적 유사성을 계산하기 위한 널리 공지된 방법, 또는 랜덤 폴리펩타이드에서 유사한 일치를 발견할 기회, 및 결정될 일치의 유의도를 기초로 하여 계산된다. 2개 이상의 서열의 컴퓨터 비교는 원하는 경우에, 또한, 당업자에 의해 시각적으로 최적화될 수 있다. 관련된 유전자 산물 또는 단백질은 높은 유사성, 예를 들어, 25% 내지 100% 서열 동일성을 갖는 것으로 예상될 수 있다. 관련되지 않은 단백질은 충분한 크기의 데이터베이스가 스캐닝되는 경우(약 5%), 우연히 발생하는 것으로 예상되는 것과 본질적으로 동일한 동일성을 가질 수 있다. 5% 내지 24%의 서열은 비교된 서열이 관련되어 있다는 결론을 내리기 위해 충분한 동족성을 나타낼 수 있거나 나타내지 않을 수 있다. 데이터 세트의 크기가 제공된 이러한 일치의 유의도를 결정하기 위한 추가 통계학적 분석은 이러한 서열의 관련성을 결정하기 위해 수행될 수 있다.
BLAST 알고리즘을 이용하여 2개 이상의 서열의 관련성을 결정하기 위한 대표적인 파라미터는 예를 들어, 하기에 기술된 바와 같을 수 있다. 간단하게, 아미노산 서열 정렬은 BLASTP 버젼 2.2.29+(Jan-14, 2014) 및 하기 파라미터를 이용하여 수행될 수 있다: 매트릭스: 0 BLOSUM62; 갭 오픈(gap open): 11; 갭 연장(gap extension): 1; x_드롭오프: 50; 예상: 10.0; 워드사이즈: 3; 필터(filter): 온(on). 핵산 서열 정렬은 BLASTN 버젼 2.0.6(Sept-16-1998) 및 하기 파라미터를 이용하여 수행될 수 있다: 매치: 1; 미스매치: -2; 갭 오픈: 5; 갭 연장: 2; x_드롭오프: 50; 예상: 10.0; 워드사이즈: 11; 필터: 오프(off). 당업자는 비교의 엄격성을 증가 또는 감소시키기 위해, 예를 들어, 2개 이상의 서열의 관련성을 결정하기 위해 상기 파라미터를 어떻게 변경시킬 수 있는 지를 인지할 것이다.
도면에 기술된 바와 같은 것을 포함하는 본원에 개시된 임의의 경로가 원하는 경우에 임의의 경로 중간체 또는 생성물을 제조하는 비천연 미생물 유기체를 생성시키기 위해 사용될 수 있는 것으로 이해된다. 본원에 개시된 바와 같이, 중간체를 제조하는 이러한 미생물 유기체는 원하는 생성물을 제조하기 위해 다운스트림 경로 효소를 발현시키는 다른 미생물 유기체와 조합하여 사용될 수 있다. 그러나, 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산 경로 중간체를 제조하는 비천연 미생물 유기체가 원하는 생성물로서 중간체를 제조하기 위해 사용될 수 있는 것으로 이해된다.
본원에는 대사 반응, 이의 반응물 또는 생성물에 대한 일반적인 언급, 또는 언급된 대사 반응, 반응물 또는 생성물과 관련되거나 이를 촉매화하는 효소를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 또는 유전자에 대한 특정 언급이 기술된다. 본원에서 달리 명확하게 기술하지 않는 한, 당업자는 반응에 대한 언급이 또한, 반응물 및 반응 생성물에 대한 언급을 구성한다는 것을 이해할 것이다. 유사하게는, 본원에서 달리 명확하게 기술하지 않는 한, 반응물 또는 생성물에 대한 언급은 또한, 반응을 언급하며, 임의의 이러한 대사 구성성분에 대한 언급은 또한 언급된 반응을 촉매화하는 효소를 인코딩하는 유전자 또는 유전자들, 반응물 또는 생성물을 언급한다. 마찬가지로, 대사 생화학, 효소학 및 게놈학의 널리 공지된 분야를 고려하면, 본원에서 유전자 또는 인코딩 핵산에 대한 언급은 또한, 상응하는 인코딩된 효소 및 이를 촉매화하는 반응뿐만 아니라 반응물 및 반응 생성물에 대한 언급을 구성한다.
비천연 미생물 유기체는 하나 이상의 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산 생합성 경로에 참여하는 효소들 중 하나 이상을 인코딩하는 발현 가능한 핵산을 도입함으로써 제조될 수 있다. 생합성을 위해 선택된 숙주 미생물 유기체에 따라, 특정 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산 생합성 경로 중 일부 또는 모두에 대한 핵산이 발현될 수 있다. 예를 들어, 선택된 숙주에서 원하는 생합성 경로를 위한 하나 이상의 효소가 결핍된 경우에, 결핍된 효소(들)에 대한 발현 가능한 핵산은 후속 외인성 발현을 위해 숙주 내에 도입된다. 대안적으로, 선택된 숙주가 일부 경로 유전자의 내인성 발현을 나타내지만, 다른 것이 결핍된 경우에, 인코딩 핵산은 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산 생합성을 달성하기 위해 결핍된 효소(들)에 대해 요구된다. 이에 따라, 비천연 미생물 유기체는 원하는 생합성 경로를 얻기 위해 외인성 효소 활성을 도입함으로써 제조될 수 있거나, 원하는 생합성 경로는 하나 이상의 내인성 효소와 함께, 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산과 같은 원하는 산물을 제조하는 하나 이상의 외인성 효소 활성을 도입함으로써 얻어질 수 있다.
선택된 숙주 미생물 유기체의 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산 생합성 경로 구성성분에 따라, 비천연 미생물 유기체는 적어도 하나의 외인성으로 발현된 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산 경로-인코딩 핵산 및 최대 모든, 하나 이상의 아디페이트, 6-아미노카프로산 또는 카프로락탐 생합성 경로에 대한 인코딩 핵산을 포함할 것이다. 예를 들어, 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산 생합성은 상응하는 인코딩 핵산의 외인성 발현을 통해 경로 효소에서 결핍된 숙주에서 확립될 수 있다. 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산 경로의 모든 효소가 결핍된 숙주에서, 경로에서 모든 효소의 외인성 발현이 포함될 수 있지만, 숙주가 경로 효소들 중 적어도 하나를 함유하는 경우에도 경로의 모든 효소가 발현될 수 있는 것으로 이해된다.
본원에 제공된 교시 및 지침을 고려하면, 당업자는 발현 가능한 형태로 도입하는 인코딩 핵산의 수가 적어도, 선택된 숙주 미생물 유기체의 아디페이트, 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산 경로 결점과 적어도 아주 유사할 것임을 이해할 것이다. 이에 따라, 비천연 미생물 유기체는 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산 생합성 경로를 구성하는 상기 효소를 인코딩하는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12, 최대 모든 핵산을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 비천연 미생물 유기체는 또한, 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산 생합성을 촉진시키거나 최적화하거나 숙주 미생물 유기체 상에 다른 유용한 기능을 부여하는 다른 유전적 변형을 포함할 수 있다. 하나의 이러한 다른 작용성은 예를 들어, 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산 경로 전구체 중 하나 이상, 예를 들어, 아디페이트 합성의 경우에 숙시닐-CoA 및/또는 아세틸-CoA, 또는 본원에 개시된 아디페이트 경로 효소를 포함하는, 6-아미노카프로산 또는 카프로락탐 합성의 경우에 아디필-CoA 또는 아디페이트, 또는 6-아미노카프리오에이트 합성의 경우에 피루베이트 및 숙신 세미알데하이드, 글루타메이트, 글루타릴-CoA, 호모라이신 또는 2-아미노-7-옥소수바레이트, 또는 헥사메틸렌디아민 합성의 경우에 6-아미노카프로에이트, 글루타메이트, 글루타릴-CoA, 피루베이트 및 4-아미노부타날, 또는 2-아미노-7-옥소수바레이트를 포함하는, 이의 합성의 증대를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 비천연 미생물 유기체는 아디페이트-세미알데하이드를 형성하기 위해 아디필-CoA와 반응하고 서열번호 1-4, 7, 11, 15, 17, 19, 24, 25, 27, 28, 31-33, 36, 38, 40-42, 44, 45, 47, 53, 58-60, 63, 65-67, 74, 75, 77, 80, 82, 84, 86-88, 90, 91, 94, 95, 97, 100, 101, 103, 107, 109, 111, 112, 117, 134, 135, 137, 145, 146, 148-150, 152, 157-159, 164-167, 176, 187, 또는 188 중 어느 하나의 적어도 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300개 이상의 인접 아미노산과 적어도 약 60% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 알데하이드 데하이드로게나아제로부터 선택된 알데하이드 데하이드로게나아제를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 갖는다. 일부 구현예에서, 비천연 미생물 유기체는 아디페이트-세미알데하이드를 형성하기 위해 아디필-CoA와 반응하고 서열번호 1-4, 7, 11, 15, 17, 19, 24, 25, 27, 28, 31-33, 36, 38, 40-42, 44, 45, 47, 53, 58-60, 63, 65-67, 74, 75, 77, 80, 82, 84, 86-88, 90, 91, 94, 95, 97, 100, 101, 103, 107, 109, 111, 112, 117, 134, 135, 137, 145, 146, 148-150, 152, 157-159, 164-167, 176, 187, 또는 188 중 어느 하나의 적어도 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300개 이상의 인접 아미노산과 적어도 약 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 알데하이드 데하이드로게나아제로부터 선택된 알데하이드 데하이드로게나아제를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 갖는다.
다른 구현예에서, 비천연 미생물 유기체는 서열번호 7, 28, 60, 또는 107의 임의의 아미노산 서열의 적어도 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300개 이상의 인접 아미노산과 적어도 60% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 아디필-CoA와 반응하여 아디페이트-세미알데하이드를 형성하는 알데하이드 데하이드로게나아제를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 갖는다. 다른 구현예에서, 비천연 미생물 유기체는 서열번호 7, 28, 60, 또는 107의 임의의 아미노산 서열의 적어도 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300개 이상의 인접 아미노산과 적어도 약 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 아디필-CoA와 반응하여 아디페이트-세미알데하이드를 형성하는 알데하이드 데하이드로게나아제를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 갖는다.
일반적으로, 숙주 미생물 유기체는 자연적으로 제조된 분자로서 또는 원하는 전구체의 새로운 생산 또는 숙주 미생물 유기체에 의해 자연적으로 제조된 전구체의 증가된 생산을 제공하는 조작된 산물로서, 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 또는 헥사메틸렌디아민 경로의 전구체를 제조하도록 선택된다. 숙주 유기체는 본원에 개시된 바와 같이, 전구체의 제조를 증가시키기 위해 조작될 수 있다. 또한, 원하는 전구체를 제조하기 위해 조작된 미생물 유기체는 숙주 유기체로서 사용될 수 있고, 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산 경로의 효소 또는 단백질을 발현시키기 위해 추가로 조작될 수 있다.
일부 구현예에서, 비천연 미생물 유기체는 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산을 합성하는 효소 능력을 함유하는 숙주로부터 발생된다. 이러한 특정 구현예에서, 예를 들어, 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산 제조를 위한 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산 경로 반응을 유도하기 위해, 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산 경로 산물의 합성 또는 축적을 증가시키는 것이 유용할 수 있다. 합성 또는 축적 증가는 예를 들어, 상술된 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산 경로 효소 중 하나 이상을 인코딩하는 핵산의 과발현에 의해 달성될 수 있다. 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산 경로 효소 또는 효소들의 과발현은 예를 들어, 내인성 유전자 또는 유전자들의 외인성 발현을 통해, 또는 이종 유전자 또는 유전자들의 외인성 발현을 통해 일어날 수 있다. 이에 따라, 자연 발생 유기체는 예를 들어, 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산 생합성 경로 효소를 인코딩하는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 즉 최대 모든 핵산의 과발현을 통해 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산을 제조하는, 비천연 미생물 유기체이도록 용이하게 발생될 수 있다. 또한, 비천연 유기체는 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산 생합성 경로에서 효소의 활성을 증가시키는 내인성 유전자의 돌연변이 유발에 의해 생성될 수 있다.
특히 유용한 구현예에서, 인코딩 핵산의 외인성 발현이 사용된다. 외인성 발현은 사용자에 의해 제어된 원하는 발현 수준을 달성하기 위해 발현 및/또는 조절 요소를 숙주 및 적용에 맞춤화할 수 있는 능력을 부여한다. 그러나, 내인성 발현은 또한, 다른 구현예에서, 유도 가능한 프로모터 또는 다른 조절 요소에 연결될 때 유전자의 프로모터의 유도 또는 음성 조절 이펙터를 제거함으로써 사용될 수 있다. 이에 따라, 자연 발생 유도 가능한 프로모터를 갖는 내인성 유전자는 적절한 유도제를 제공함으로써 상향-조절될 수 있거나, 내인성 유전자의 조절 영역은 유도 가능한 조절 요소를 도입하기 위해 조작되어, 원하는 시간에 내인성 유전자의 발현 증가를 조절할 수 있다. 유사하게는, 유도 가능한 프로모터는 비천연 미생물 유기체 내에 도입된 외인성 유전자에 대한 조절 구성요소로서 포함될 수 있다.
일부 구현예에서, 비천연 미생물 유기체는 하나 이상의 유전자 파괴를 포함하며, 여기서, 유기체는 6-ACA, 아디페이트 및/또는 HMDA를 제조한다. 유전자 파괴가 비천연 유기체 상에 아디페이트, 6-ACA 및/또는 HMDA의 제조 증가를 부여하도록, 유전자 파괴가 효소의 활성을 감소시킬 때 유기체의 성장에 대한 아디페이트, 6-ACA 및/또는 HMDA의 제조를 커플링시키는 효소를 인코딩하는 효소에서 일어난다. 이에 따라, 일부 구현예에서, 단백질을 인코딩하는 유전자에서 발생하는 하나 이상의 유전자 파괴를 포함하는 비천연 미생물 유기체, 또는 하나 이상의 유전자 파괴가 유기체에서 아디페이트, 6-ACA 및/또는 HMDA의 제조 증가를 부여하는 효소가 제공된다. 본원에 개시된 바와 같이, 이러한 유기체는 아디페이트, 6-ACA 및/또는 HMDA의 제조를 위한 경로를 함유한다.
방법에서, 임의의 하나 이상의 외인성 핵산이 비천연 미생물 유기체를 제조하기 위해 미생물 유기체 내에 도입될 수 있는 것으로 이해된다. 핵산은 예를 들어, 미생물 유기체 상에 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산 생합성 경로를 부여하기 위해 도입될 수 있다. 대안적으로, 인코딩 핵산은 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산 생합성 능력을 부여하기 위해 원하는 반응들 중 일부를 촉매화하는 생합성 능력을 갖는 중간 미생물 유기체를 제조하기 위해 도입될 수 있다. 예를 들어, 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산 생합성 경로를 갖는 비천연 미생물 유기체는 원하는 효소를 인코딩하는 적어도 2개의 외인성 핵산을 포함할 수 있다. 아디페이트 제조의 경우에, 적어도 2개의 외인성 핵산은 숙시닐-CoA: 아세틸-CoA 아실 트랜스퍼라아제 및 3-하이드록시아실-CoA 데하이드로게나아제, 또는 숙시닐-CoA: 아세틸-CoA 아실 트랜스퍼라아제 및 3-하이드록시아디필-CoA 데하이드라타아제, 또는 3-하이드록시아디필-CoA 및 5-카복시-2-펜테노일-CoA 리덕타아제, 또는 3-하이드록시아실-CoA 및 아디필-CoA 신타아제 등의 조합과 같은 효소를 인코딩할 수 있다. 카프로락탐 제조의 경우에, 적어도 2개의 외인성 핵산은 CoA-의존 알데하이드 데하이드로게나아제 및 트랜스아미나아제, 또는 CoA-의존 알데하이드 데하이드로게나아제 및 아미도하이드롤라아제, 또는 트랜스아미나아제 및 아미도하이드롤라아제의 조합과 같은 효소를 인코딩할 수 있다. 6-아미노카프로산 제조의 경우에, 적어도 2개의 외인성 핵산은 4-하이드록시-2-옥소헵탄-1,7-디오에이트(HODH) 알돌라아제 및 2-옥소헵트-4-엔-1,7-디오에이트(OHED) 하이드라타아제, 또는 2-옥소헵트-4-엔-1,7-디오에이트(OHED) 하이드라타아제 및 2-아미노헵탄-1,7-디오에이트(2-AHD) 데카복실라아제, 3-하이드록시아디필-CoA 데하이드라타아제 및 아디필-CoA 데하이드로게나아제, 글루타밀-CoA 트랜스퍼라아제 및 6-아미노피멜로일-CoA 하이드롤라아제, 또는 글루타릴-CoA 베타-케토티올라아제 및 3-아미노피멜레이트 2,3-아미노뮤스타아제의 조합과 같은 효소를 인코딩할 수 있다. 헥사메틸렌디아민 제조의 경우에, 적어도 2개의 외인성 핵산은 6-아미노카프로에이트 키나아제 및 [(6-아미노헥사노일)옥시]포스포네이트(6-AHOP) 옥시도리덕타아제, 또는 6-아세트아미도헥사노에이트 키나아제 및 [(6-아세트아미도헥사노일)옥시]포스포네이트(6-AAHOP) 옥시도리덕타아제, 6-아미노카프로에이트 N-아세틸트랜스퍼라아제 및 6-아세트아미도헥사노일-CoA 옥시도리덕타아제, 3-하이드록시-6-아미노피멜로일-CoA 데하이드라타아제 및 2-아미노-7-옥소헵타노에이트 아미노트랜스퍼라아제, 또는 3-옥소피멜로일-CoA 리가아제 및 호모라이신 데카복실라아제의 조합과 같은 효소를 인코딩할 수 있다. 이에 따라, 생합성 경로의 2개 이상의 효소의 임의의 조합이 비천연 미생물 유기체에 포함될 수 있는 것으로 이해된다.
유사하게는, 생합성 경로의 3개 이상의 효소의 임의의 조합이 비천연 미생물 유기체에 포함될 수 있는 것으로 이해되며, 예를 들어, 아디페이트 제조의 경우에, 원하는 생합성 경로의 효소들의 조합이 상응하는 원하는 산물을 제조하는 한, 원하는 경우, 효소 숙시닐-CoA: 아세틸-CoA 아실 트랜스퍼라아제, 3-하이드록시아실-CoA 데하이드로게나아제, 및 3-하이드록시아디필-CoA 데하이드라타아제; 또는 숙시닐-CoA: 아세틸-CoA 아실 트랜스퍼라아제, 3-하이드록시아실-CoA 데하이드로게나아제 및 5-카복시-2-펜테노일-CoA 리덕타아제; 또는 숙시닐-CoA: 아세틸-CoA 아실 트랜스퍼라아제, 3-하이드록시아실-CoA 데하이드로게나아제 및 아디필-CoA 신타아제; 또는 3-하이드록시아실-CoA 데하이드로게나아제, 3-하이드록시아디필-CoA 데하이드라타아제 및 아디필-CoA: 아세틸-CoA 트랜스퍼라아제 등의 조합이 비천연 미생물 유기체에 포함될 수 있는 것으로 이해된다. 6-아미노카프로산 제조의 경우에, 적어도 3개의 외인성 핵산은 4-하이드록시-2-옥소헵탄-1,7-디오에이트(HODH) 알돌라아제, 2-옥소헵트-4-엔-1,7-디오에이트(OHED) 하이드라타아제 및 2-옥소헵탄-1,7-디오에이트(2-OHD) 데카복실라아제, 또는 2-옥소헵트-4-엔-1,7-디오에이트(OHED) 하이드라타아제, 2-아미노헵트-4-엔-1,7-디오에이트(2-AHE) 리덕타아제 및 2-아미노헵탄-1,7-디오에이트(2-AHD) 데카복실라아제, 또는 3-하이드록시아디필-CoA 데하이드라타아제, 2,3-데하이드로아디필-CoA 리덕타아제 및 아디필-CoA 데하이드로게나아제, 또는 6-아미노-7-카복시헵트-2-에노일-CoA 리덕타아제, 6-아미노피멜로일-CoA 하이드롤라아제 및 2-아미노피멜레이트 데카복실라아제, 또는 글루타릴-CoA 베타-케토티올라아제, 3-아민화 옥시도리덕타아제 및 2-아미노피멜레이트 데카복실라아제, 또는 3-옥소아디필-CoA 티올라아제, 5-카복시-2-펜테노에이트 리덕타아제 및 아디페이트 리덕타아제의 조합과 같은 효소를 인코딩할 수 있다. 헥사메틸렌디아민 제조의 경우에, 적어도 3개의 외인성 핵산은 6-아미노카프로에이트 키나아제, [(6-아미노헥사노일)옥시]포스포네이트(6-AHOP) 옥시도리덕타아제 및 6-아미노카프로 세미알데하이드 아미노트랜스퍼라아제, 또는 6-아미노카프로에이트 N-아세틸트랜스퍼라아제, 6-아세트아미도헥사노에이트 키나아제 및 [(6-아세트아미도헥사노일)옥시]포스포네이트(6-AAHOP) 옥시도리덕타아제, 또는 6-아미노카프로에이트 N-아세틸트랜스퍼라아제, [(6-아세트아미도헥사노일)옥시]포스포네이트(6-AAHOP) 아실트랜스퍼라아제 및 6-아세트아미도헥사노일-CoA 옥시도리덕타아제, 또는 3-옥소-6-아미노피멜로일-CoA 옥시도리덕타아제, 3-하이드록시-6-아미노피멜로일-CoA 데하이드라타아제 및 호모라이신 데카복실라아제, 또는 2-옥소-4-하이드록시-7-아미노헵타노에이트 알돌라아제, 2-옥소-7-아미노헵트-3-에노에이트 리덕타아제 및 호모라이신 데카복실라아제, 또는 6-아세트아미도헥사노에이트 리덕타아제, 6-아세트아미도헥사날 아미노트랜스퍼라아제 및 6-아세트아미도헥산아민 N-아세틸트랜스퍼라아제의 조합과 같은 효소를 인코딩할 수 있다. 유사하게는, 본원에 개시된 생합성 경로의 4개 이상의 효소의 임의의 조합은 원하는 생합성 경로의 효소들의 조합이 상응하는 원하는 산물을 제조하는 한, 원하는 경우에, 비천연 미생물 유기체에 포함될 수 있다.
본원에 기술된 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산의 생합성 이외에, 비천연 미생물 유기체 및 방법은 서로 및 다른 경로에 의해 생성물 생합성을 달성하기 위한 당분야에 널리 공지된 다른 미생물 유기체 및 방법과의 다양한 조합으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산 생산자의 사용을 제외하고 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산를 제조하는 하나의 대안예는 아디페이트, 6-아미노카프로산 또는 카프로락탐 경로 중간체를 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산으로 전환시킬 수 있는 다른 미생물 유기체의 첨가를 통하는 것이다. 하나의 이러한 절차는 예를 들어, 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산 경로 중간체를 제조하는 미생물 유기체의 발효를 포함한다. 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산 경로 중간체는 이후에, 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산 경로 중간체를 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산으로 전환시키는 제2 미생물 유기체에 대한 기질로서 사용될 수 있다. 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산 경로 중간체는 제2 유기체의 다른 배양물에 직접적으로 첨가될 수 있거나, 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산 경로 중간체 제조업체의 본래 배양물에는 예를 들어, 세포 분리에 의해 이러한 미생물 유기체가 결여될 수 있으며, 이후에, 발효 브로쓰에 제2 유기체의 후속 첨가는 중간체 정제 단계 없이 최종 산물을 제조하기 위해 사용될 수 있다.
다른 구현예에서, 비천연 미생물 유기체 및 방법은 예를 들어, 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산의 생합성을 달성하기 위해 매우 다양한 하위 경로에서 어셈블링될 수 있다. 이러한 구현예에서, 원하는 산물을 위한 생합성 경로는 상이한 미생물 유기체로 구분될 수 있으며, 상이한 미생물 유기체는 최종 산물을 제조하기 위해 공동-배양될 수 있다. 이러한 생합성 방식에서, 하나의 미생물 유기체의 산물은 최종 산물이 합성될 때까지 제2 미생물 유기체에 대한 기질이다. 예를 들어, 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산의 생합성은 하나의 경로 중간체의 다른 경로 중간체 또는 산물로의 전환을 위한 생합성 경로를 함유하는 미생물 유기체를 작제화함으로써 달성될 수 있다. 대안적으로, 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산은 또한, 동일한 용기에서 2개의 유기체를 사용하여 공동-배양 또는 공동-발효를 통해 미생물 유기체로부터 생합성적으로 제조될 수 있으며, 여기서, 제1 미생물 유기체는 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산 중간체를 제조하며, 제2 미생물 유기체는 중간체를 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산으로 전환시킨다.
본원에 제공된 교시 및 지침을 고려하면, 당업자는, 매우 다양한 조합 및 순열이 다른 미생물 유기체, 하위 경로를 갖는 다른 비천연 미생물 유기체의 공동-배양, 및 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산을 제조하기 위한 당해 분야에 널리 공지된 다른 화학적 및/또는 생화학적 절차의 조합과 함께 비천연 미생물 유기체 및 방법에 대해 존재한다는 것을 이해할 것이다.
유사하게는, 숙주 유기체가 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산의 제조를 증가시키기 위해 하나 이상의 유전자 파괴의 도입을 위한 원하는 특징을 기초로 하여 선택될 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해된다. 이에 따라, 유전적 변형이 유전자를 파괴하기 위해 숙주 유기체 내에 도입되는 경우에, 유사하지만 동일하지 않은 대사 반응을 촉매화하는 임의의 동족체, 오르소로그 유전자 또는 유사체가 유사하게, 원하는 대사 반응이 충분히 파괴되도록 유사하게 파괴될 수 있다는 것이 이해된다. 상이한 유기체 간의 대사 네트워크 사이에 특정 차이가 존재하기 때문에, 당업자는 제공된 유기체에서 파괴된 실제 유전자가 유기체들 간에 상이할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 그러나, 본원에 제공된 교시 및 지침을 고려하면, 당업자는 또한, 방법이 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산 생합성을 증가시키는 고려되는 종에서 유기체를 작제화하는 데 필요한 동족 대사 변경을 식별하기 위해 임의의 적합한 숙주 미생물에 적용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 특정 구현예에서, 제조 증가는 유기체의 성장에 대한 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산의 생합성을 커플링하고, 원하는 경우에 및 본원에 개시된 바와 같이 유기체의 성장에 대한 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산의 제조를 필수적으로 커플링시킬 수 있다.
6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산 경로 효소를 위한 핵산을 인코딩하는 소스는 예를 들어, 인코딩된 유전자 산물이 언급된 반응을 촉매화할 수 있는 임의의 종을 포함할 수 있다. 이러한 종은 고세균 및 진정세균을 포함하는 박테리아, 및 효소, 식물, 곤충, 동물, 및 인간을 포함하는 포유동물을 포함하는 진핵 세포를 포함하지만, 이로 제한되지 않는 원핵 및 진핵 유기체 둘 모두를 포함한다. 일부 구현예에서, 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산 경로 효소에 대한 인코딩 핵산의 소스는 표 1에 나타나 있다. 일부 구현예에서, 알데하이드 데하이드로게나아제 효소에 대한 인코딩 핵산의 소스는 표 1에 나타나 있다. 다른 구현예에서, 알데하이드 데하이드로게나아제 효소에 대한 인코딩 핵산의 소스에는 아시다미노코쿠스(Acidaminococcus), 콜린셀라(Collinsella), 펩토스트렙토코카세애(Peptostreptococcaceae), 또는 롬보우스트시아(Romboustsia)가 있다. 일부 구현예에서, 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산 경로 효소에 대한 인코딩 핵산의 소스는 에셔리키아 콜라이(Escherichia coli), 에셔리키아 콜라이 str. K12(Escherichia coli str. K12), 에셔리키아 콜라이 C(Escherichia coli C), 에셔리키아 콜라이 W(Escherichia coli W), 슈도모나스 sp(Pseudomonas sp), 슈도모나스 내크무시이(Pseudomonas knackmussii), 슈도모나스 sp. 균주 B13(Pseudomonas sp. Strain B13), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 스튜트제리(Pseudomonas stutzeri), 슈도모나스 멘도시나(Pseudomonas mendocina), 로도슈도모나스 팔루스트리스(Rhodopseudomonas palustris), 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 비브리오 콜레라(Vibrio cholera), 헬리오박터 피로리(Heliobacter pylori), 클렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae), 세라티아 프로테아마쿨란스(Serratia proteamaculans), 스트렙토마이세스 sp. 2065(Streptomyces sp. 2065), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 에루지노사 PAO1(Pseudomonas aeruginosa PAO1), 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha), 랄스토니아 유트로파 H16(Ralstonia eutropha H16), 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum), 유글레나 그라실리스(Euglena gracilis), 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola), 클로스트리듐 클루이베리(Clostridium kluyveri), 호모 사피엔스(Homo sapiens), 라투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus), 아시네토박터 sp. ADP1(Acinetobacter sp. ADP1), 아시네토박터 sp. 균주 M-1(Acinetobacter sp. Strain M-1), 스트렙토마이세스 코엘리콜로르(Streptomyces coelicolor), 유박테리움 바르케리(Eubacterium barkeri), 펩토스트렙토코쿠스 아사카롤리티쿠스(Peptostreptococcus asaccharolyticus), 클로스트리듐 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리듐 보툴리눔 A3 str(Clostridium botulinum A3 str), 클로스트리듐 티로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum), 클로스트리듐 파스테우리아눔(Clostridium pasteurianum), 클로스트리듐 써모아세티쿰(Clostridium thermoaceticum)(무렐라 써모아세티쿰(Moorella thermoaceticum)), 무렐라 테르모아세티카 아시네토박터 칼코아세티쿠스(Moorella thermoacetica Acinetobacter calcoaceticus), 무스 무스쿨루스(Mus musculus), 수스 스크로파(Sus scrofa), 플라보박테리움 sp(Flavobacterium sp), 아르트로박터 아우레센스(Arthrobacter aurescens), 페니실리움 크리소게눔(Penicillium chrysogenum), 아스페르길루스 니제르(Aspergillus niger), 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis), 만헤이미아 숙시니프로듀센스(Mannheimia succiniciproducens), 클로스트리듐 리운그다흘리이(Clostridium ljungdahlii), 클로스트리듐 카복시디보란스(Clostridium carboxydivorans), 게오바실러스 스테아로테르모필루스(Geobacillus stearothermophilus), 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 아크로모박터 데니트리피칸스(Achromobacter denitrificans), 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 해모필루스 인플루엔재(Haemophilus influenzae), 아시다미노코쿠스 페르멘탄스(Acidaminococcus fermentans), 클로스트리듐 sp. M62/1(Clostridium sp. M62/1), 푸소박테리움 누클레아툼(Fusobacterium nucleatum), 보스 타우루스(Bos taurus), 주글로에아 라미게라(Zoogloea ramigera), 로도박터 스파에로이데스(Rhodobacter sphaeroides), 클로스트리듐 베이제린키이(Clostridium beijerinckii), 메탈로스파에라 세둘라(Metallosphaera sedula), 테르모아내로박터(Thermoanaerobacter) 종, 테르모아내로박터 브록키이(Thermoanaerobacter brockii), 아시네토박터 바일리(Acinetobacter baylyi), 포르피로모나스 깅기발리스(Porphyromonas gingivalis), 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides), 술폴로부스 토코다이이(Sulfolobus tokodaii), 술폴로부스 토코다이이 7(Sulfolobus tokodaii 7), 술폴로부스 솔파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus), 술폴로부스 솔파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus), 술폴로부스 아시도칼다리우스(Sulfolobus acidocaldarius), 살모넬라 티피무륨(Salmonella typhimurium), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 테르모토가 마리티마(Thermotoga maritima), 할로박테리움 살리나룸(Halobacterium salinarum), 바실루스 세레우스(Bacillus cereus), 클로스트리듐 디피실(Clostridium difficile), 알칼리필루스 메탈리레디게네스(Alkaliphilus metalliredigenes), 테르모아내로박터 텡콘게네시스(Thermoanaerobacter tengcongensis), 사카로마이세스 클루이베리(Saccharomyces kluyveri), 헬리코박터 피로리(Helicobacter pylori), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 클로스트리듐 사카로페르부틸아세토니쿰(Clostridium saccharoperbutylacetonicum), 슈도모나스 클로로라피스(Pseudomonas chlororaphis), 스트렙토마이세스 클라불리게루스(Streptomyces clavuligerus), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 테르무스 테르모필루스(Thermus thermophilus), 팰로토말쿨룸 테르모프로피오니쿰(Pelotomaculum thermopropionicum), 박테로이데스 카필로수스(Bacteroides capillosus), 아나에로트룬쿠스 콜리호미니스(Anaerotruncus colihominis), 나트라나에로비우스 테르모필루스(Natranaerobius thermophilius), 아르카에오글로부스 풀기두스(Archaeoglobus fulgidus), 아르카에오글로부스 풀기두스 DSM 4304(Archaeoglobus fulgidus DSM 4304), 할로아르쿨라 마리스모르투이(Haloarcula marismortui), 피로바쿨룸 아에로필룸(Pyrobaculum aerophilum), 피로바쿨룸 아에로필룸 str. IM2(Pyrobaculum aerophilum str. IM2), 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum), 멘테 피페리타(Menthe piperita), 피누스 타에다(Pinus taeda), 호르데움 불가레(Hordeum vulgare), 제아 메이스(Zea mays), 로도코쿠스 오파쿠스(Rhodococcus opacus), 큐프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator), 브라디리조비움 자포니쿰(Bradyrhizobium japonicum), 브라디리조비움 자포니쿰 USDA110(Bradyrhizobium japonicum USDA110), 아스카리우스 수움(Ascarius suum), 부티레이트-제조 박테리움 L2-50, 바실루스 메가테리움(Bacillus megaterium), 메타노코쿠스 마리팔루디스(Methanococcus maripaludis), 메타노사르시나 마제이(Methanosarcina mazei), 메타노사르시나 마제이(Methanosarcina mazei), 메타노사르시나 바르케리(Methanocarcina barkeri), 메타노칼도코쿠스 잔나스키이(Methanocaldococcus jannaschii), 카에노르하브디티스 엘레간스(Caenorhabditis elegans), 레이스마니아 마조르(Leishmania major), 메틸로미크로븀 알칼리필룸 20Z(Methylomicrobium alcaliphilum 20Z), 크로모할로박터 살렉시겐스(Chromohalobacter salexigens), 아르카에글루부스 풀기두스(Archaeglubus fulgidus), 클라미도모나스 레인하르드티이(Chlamydomonas reinhardtii), 트리코모나스 바기날리스 G3(trichomonas vaginalis G3), 트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei), 미코플라나 라모스(Mycoplana ramose), 미크로코쿠스 루테아스(Micrococcus luteas), 아세토박터 파스테우리안스(Acetobacter pasteurians), 클루베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 메소리조비움 로티(Mesorhizobium loti), 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis), 리시니바실루스 스파에리쿠스(Lysinibacillus sphaericus), 칸디다 보이디니이(Candida boidinii), 칸디다 알비칸스 SC5314(Candida albicans SC5314), 버크홀데리아 암비파리아 AMMD(Burkholderia ambifaria AMMD), 아스카리스 수운(Ascaris suun), 아시네토박터 바우마니이(Acinetobacter baumanii), 아시네토박터 칼코아세티쿠스(Acinetobacter calcoaceticus), 버크홀데리아 피마툼(Burkholderia phymatum), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 클로스트리듐 서브테르미날레(Clostridium subterminale), 큐프리아비두스 타이와넨시스(Cupriavidus taiwanensis), 플라보박테리움 루테센스(Flavobacterium lutescens), 라칸세아 클루이베리(Lachancea kluyveri), 락토바실루스 sp. 30a(Lactobacillus sp. 30a), 렙토스피라 인테로간스(Leptospira interrogans), 무렐라 테르모아세티카(Moorella thermoacetica), 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus), 니코티아나 글루티노사(Nicotiana glutinosa), 노카르디아 아이오웬시스(Nocardia iowensis)(sp. NRRL 5646), 슈도모나스 레이네케이 MT1(Pseudomonas reinekei MT1), 랄스토니아 유트로파 JMP134(Ralstonia eutropha JMP134), 랄스토니아 메탈리두란스(Ralstonia metallidurans), 로도코쿠스 조스티이(Rhodococcus jostii), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 셀레노모나스 루미난티움(Selenomonas ruminantium), 스트렙토마이세스 클라불리게누스(Streptomyces clavuligenus), 신트로푸스 아시디트로피쿠스(Syntrophus aciditrophicus), 비브리오 파라해몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus), 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus) 뿐만 아니라 상응하는 유전자에 대한 본원에 개시되거나 소스 유기체로서 입수 가능한 다른 대표적인 종(실시예 참조)과 같은 종이다. 그러나, 395개의 미생물 게놈 및 다양한 효모, 진균, 식물, 및 포유류 게놈을 포함하는, 현재 550개 초과의 종에 대해 이용 가능한 완전 게놈 서열(NCBI와 같은 공개 데이터베이스에서 입수 가능한 것들 중 절반 이상)과 함께, 예를 들어, 공지된 유전자의 동종, 오르소로그, 파라로그 및 비-오르소로그 유전자 변위 및 유기체 간의 유전적 변경의 상호교환을 포함하는, 관련되거나 별개의 종에서의 하나 이상의 유전자에 대한 필요한 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산 생합성 활성을 인코딩하는 유전자의 식별은 일반적이고, 당분야에 널리 공지되어 있다. 이에 따라, E. 콜라이와 같은 특정 유기체와 관련하여 본원에 기술된 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산의 생합성을 가능하게 하는 대사 변경은 원핵 유기체 및 진핵 유기체 모두를 포함하는 다른 미생물에 용이하게 적용될 수 있다. 본원에 제공된 교시 및 지침을 고려하면, 당업자는 하나의 유기체에서 예시된 대사 변경이 다른 유기체에 동일하게 적용될 수 있다는 것을 인지할 것이다.
일부 경우에, 예를 들어, 관련되지 않은 종에서 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산 생합성 경로가 존재할 때, 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산 생합성은 예를 들어, 언급된 반응을 대체하기 위해 유사한, 그러나 동일하지 않은 대사 반응을 촉매화하는 관련되지 않은 종으로부터 유사체 또는 유사체들의 외인성 발현에 의해 숙주 종 상에 부여될 수 있다. 대사 네트워크 간의 특정 차이가 상이한 유기체 간에 존재하기 때문에, 당업자는, 상이한 유기체들 간의 실제 유전자 사용방법이 상이할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 그러나, 본원에 제공된 교시 및 지침을 고려하여, 당업자는 또한, 교시 및 방법이 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산을 합성하는 고려되는 종에서 미생물 유기체를 작제화하기 위해 본원에 예시된 것에 대한 동족 대사 변경을 이용하여 모든 미생물 유기체에 적용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
숙주 미생물 유기체는 예를 들어, 박테리아, 효모, 진균 또는 발효 과정에 적용 가능한 임의의 다양한 다른 미생물에서 생성된 비천연 미생물 유기체로부터 선택될 수 있다. 대표적인 박테리아는 에셔리키아 콜라이(Escherichia coli), 클렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 아나에로바이오스필리룸 숙시니프로듀센스(Anaerobiospirillum succiniciproducens), 악티노바실러스 숙시노게네스(Actinobacillus succinogenes), 만헤이미아 숙시니프로듀센스(Mannheimia succiniciproducens), 리조비움 에틀리(Rhizobium etli), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxydans), 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis), 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis), 락토바실루스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 스트렙토마이세스 코엘리콜로르(Streptomyces coelicolor), 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 및 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)로부터 선택된 종을 포함한다. 대표적인 효모 또는 진균은 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 클루베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 클루베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus), 아스페르길루스 테레우스(Aspergillus terreus), 아스페르길루스 니제르(Aspergillus niger), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 리조푸스 아리주스(Rhizopus arrhizus), 리조부스 오리재(Rhizobus oryzae) 등으로부터 선택된 종을 포함한다. 예를 들어, E. 콜라이는 특히 유용한 숙주 유기체인데, 왜냐하면, 이러한 것이 유전적 조작을 위해 적합한 널리 특징된 미생물 유기체이기 때문이다. 다른 특히 유용한 숙주 유기체는 사카로마이세스 세레비시애와 같은 효모를 포함한다. 임의의 적합한 미생물 숙주 유기체가 원하는 산물을 제조하기 위해 대사 및/또는 유전적 변형을 도입하기 위해 사용될 수 있는 것으로 이해된다.
비천연 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산-제조 숙주의 발현 수준을 구성하고 시험하기 위한 방법은 예를 들어, 당분야에 널리 공지된 재조합 및 검출 방법에 의해 수행될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001); and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1999)]에 기술된 문헌에서 확인될 수 있다.
6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산의 제조를 위한 경로에 포함된 외인성 핵산 서열은 비제한적으로, 컨쥬게이션, 전기천공, 화학적 변형, 형질도입, 트랜스펙션, 및 초음파 변형을 포함하는, 당분야에 널리 공지된 기술을 이용하여 숙주 세포에 안정적으로 또는 일시적으로 도입될 수 있다. E. 콜라이 또는 다른 원핵 세포에서의 외인성 발현을 위해, 진핵 핵산의 유전자 또는 cDNA에서의 일부 핵산 서열은 표적화 신호, 예를 들어, N-말단 미토콘드리아 또는 다른 표적화 신호를 인코딩할 수 있으며, 이는 원하는 경우에, 원핵 숙주 세포에서 변형 전에 제거될 수 있다. 예를 들어, 미토콘드리아 리더 서열의 제거는 E. 콜라이의 발현 증가를 초래하였다[Hoffmeister et al., J. Biol. Chem. 280:4329-4338 (2005)]. 효모 또는 다른 진핵 세포에서 외인성 발현을 위해, 유전자는 리더 서열의 첨가 없이 시토솔에서 발현될 수 있거나, 숙주 세포에 대해 적합한 미토콘드리아 표적화 또는 분비 신호와 같은 적합한 표적화 서열의 첨가에 의해 미토콘드리온 또는 다른 소기관에 대해 표적화되거나 분비를 대해 표적화될 수 있다. 이에 따라, 표적화 서열을 제거하거나 포함하기 위한 핵산 서열에 대한 적절한 변형이 원하는 특성을 부여하기 위해 외인성 핵산 서열에 도입될 수 있다는 것이 이해된다. 또한, 유전자는 단백질의 최적화된 발현을 달성하기 위해 당분야에 널리 공지된 기술로 코돈 최적화될 수 있다.
발현 벡터 또는 벡터들은 숙주 유기체에서 기능성인 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결된 본원에서 예시된 하나 이상의 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산 생합성 경로 인코딩 핵산을 포함하도록 작제화될 수 있다. 미생물 숙주 유기체에서 사용하기에 적용 가능한 발현 벡터는 예를 들어, 숙주 염색체 내에 안정한 통합을 위해 작동 가능한 벡터 및 선택 서열 또는 마커를 포함하는, 플라스미드, 파지 벡터, 바이러스 벡터, 에피솜 및 인공 염색체를 포함한다. 추가적으로, 발현 벡터는 하나 이상의 선택 가능한 마커 유전자 및 적절한 발현 제어 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항생제 또는 독소에 대한 내성을 제공하거나, 영양요구성 결핍을 보완하거나, 배양 배지에 중요한 영양소를 공급하지 않는 선택 가능한 마커 유전자가 또한 포함될 수 있다. 발현 제어 서열은 당분야에 널리 공지된, 구성적 및 유도성 프로모터, 전사 인헨서, 전사 종결자 등을 포함할 수 있다. 2개 이상의 외인성 인코딩 핵산이 공동-발현될 때, 두 핵산 모두는 예를 들어, 단일 발현 벡터 내에 또는 별도의 발현 벡터에 삽입될 수 있다. 단일 벡터 발현에 대하여, 인코딩 핵산은 하나의 공통 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결되거나 하나의 유도성 프로모터 및 하나의 구성적 프로모터와 같은, 상이한 발현 제어 서열에 연결될 수 있다. 대사 또는 합성 경로에 관여된 외인성 핵산 서열의 형질전환은 당분야에 널리 공지된 방법을 이용하여 확인될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어, 핵산 분석, 예를 들어, mRNA의 노턴 블롯 또는 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR) 증폭, 또는 유전자 산물의 발현을 위한 면역블롯팅, 또는 도입된 핵산 서열 또는 이의 상응하는 유전자 산물의 발현을 시험하기 위한 다른 적합한 분석 방법을 포함한다. 당업자에 의해, 외인성 핵산이 원하는 산물을 제조하기 위해 충분한 양으로 발현된다는 것이 이해되며, 또한, 발현 수준이 당분야에 널리 공지되고 본원에 개시된 바와 같은 방법을 이용하여 충분한 발현을 얻기 위해 최적화될 수 있다는 것이 이해된다.
일부 구현예에서, 아디페이트, 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산과 같은 원하는 중간체 또는 산물을 제조하는 방법이 제공된다. 예를 들어, 아디페이트를 제조하는 방법은 아디페이트를 제조하기에 충분한 기간 동안 및 조건하에서 아디페이트를 제조하기에 충분한 양으로 발현되는 아디페이트 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하는 아디페이트 경로를 갖는 비천연 미생물 유기체를 배양하는 것을 포함할 수 있으며, 아디페이트 경로는 숙시닐-CoA: 아세틸-CoA 아실 트랜스퍼라아제, 3-하이드록시아실-CoA 데하이드로게나아제, 3-하이드록시아디필-CoA 데하이드라타아제, 5-카복시-2-펜테노일-CoA 리덕타아제, 및 아디필-CoA 신타아제 또는 포스포트랜스아디필라아제/아디페이트 키나아제 또는 아디필-CoA: 아세틸-CoA 트랜스퍼라아제 또는 아디필-CoA 하이드롤라아제를 포함한다. 추가적으로, 아디페이트를 제조하는 방법은 아디페이트 경로, 아디페이트를 제조하기에 충분한 기간 동안 및 조건하에서 아디페이트를 제조하기에 충분한 양으로 발현되는 아디페이트 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하는 경로, 숙시닐-CoA: 아세틸-CoA 아실 트랜스퍼라아제, 3-옥소아디필-CoA 트랜스퍼라아제, 3-옥소아디페이트 리덕타아제, 3-하이드록시아디페이트 데하이드라타아제, 및 2-에노에이트 리덕타아제를 포함하는 아디페이트 경로를 갖는 비천연 미생물 유기체를 배양하는 것을 포함할 수 있다.
또한, 6-아미노카프로산을 제조하는 방법은 6-아미노카프로산 경로, 6-아미노카프로산을 제조하기에 충분한 기간 동안 및 조건하에서 6-아미노카프로산을 제조하기에 충분한 양으로 발현된 6-아미노카프로산 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하는 경로, CoA-의존 알데하이드 데하이드로게나아제 및 트랜스아미나아제 또는 6-아미노카프로에이트 데하이드로게나아제를 포함하는 6-아미노카프로산 경로를 갖는 비천연 미생물 유기체를 배양하는 것을 포함할 수 있다. 추가적으로, 카프로락탐을 제조하기 위한 방법은 카프로락탐 경로, 카프로락탐을 제조하기에 충분한 기간 동안 및 조건하에서 카프로락탐을 제조하기에 충분한 양으로 발현되는 카프로락탐 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하는 경로, CoA-의존 알데하이드 데하이드로게나아제, 트랜스아미나아제 또는 6-아미노카프로에이트 데하이드로게나아제, 및 아미도하이드롤라아제를 포함하는 카프로락탐 경로를 갖는 비천연 미생물 유기체를 배양하는 것을 포함할 수 있다.
6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산의 제조에 대한 적합한 정제 및/또는 시험 검정은 널리 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 적합한 복제물, 예를 들어, 삼중복제 배양물은 시험되는 각 조작된 균주에 대해 성장될 수 있다. 예를 들어, 조작된 생산 숙주에서 산물 및 부산물 형성이 모니터링될 수 있다. 최종 산물 및 중간체, 및 다른 유기 화합물은 HPLC(고성능 액체 크로마토그래피), GC-MS(가스 크로마토그래피-질량 분광법) 및 LC-MS(액체 크로마토그래피-질량 분광법) 또는 당분야에 널리 공지된 일상적인 절차를 이용한 다른 적합한 분석 방법과 같은 방법에 의해 분석될 수 있다. 발효 브로쓰에서 산물의 방출은 또한, 배양 상청액으로 시험될 수 있다. 부산물 및 잔류 글루코오스는 예를 들어, 글루코오스 및 알코올에 대한 굴절률 검출기, 및 유기산에 대한 UV 검출기(Lin et al., Biotechnol. Bioeng. 90:775-779 (2005))를 이용한 HPLC, 또는 당분야에 널리 공지된 다른 적합한 검정 및 검출 방법에 의해 정량화될 수 있다. 외인성 DNA 서열로부터의 개개 효소 활성은 또한, 당분야에 널리 공지된 방법을 이용하여 검정될 수 있다.
6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산은 당분야에 널리 공지된 다양한 방법을 이용하여 배양물 중의 다른 성분들과 분리될 수 있다. 이러한 분리 방법은 예를 들어, 연속 액체-액체 추출, 투과증발, 멤브레인 여과, 멤브레인 분리, 역삼투압, 전기투석, 증류, 결정화, 원심분리, 추출 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 흡수 크로마토그래피, 및 한외여과를 포함하는 추출 절차뿐만 아니라 방법을 포함한다. 상기 모든 방법은 당분야에 널리 공지되어 있다.
본원에 기술된 임의의 비천연 미생물 유기체는 생합성 산물을 제조하고/하거나 분비하기 위해 배양될 수 있다. 예를 들어, 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산 생산자는 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산의 생합성 제조를 위해 배양될 수 있다.
6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산의 제조를 위해, 재조합 균주는 탄소 소스 및 다른 필수 영양물을 갖는 배지에서 배양된다. 전체 과정의 비용을 감소시키기 위해 발효기에서 혐기성 조건을 유지하는 것이 때때로 바람직하고 매우 바람직할 수 있다. 이러한 조건은 예를 들어, 먼저 배지에 질소를 살포하고 이후에 플라스크를 셉텀 및 크림프-캡으로 시일링함으로써 얻어질 수 있다. 성장이 혐기성에서 관찰되지 않은 균주에 대하여, 미세호기성 또는 실질적으로 혐기성 조건은 셉텀에 제한된 통기를 위한 작은 홀을 천공시킴으로써 적용될 수 있다. 대표적인 혐기성 조건은 이전에 기술되었고, 당분야에 널리 공지되어 있다. 대표적인 호기성 및 혐기성 조건은 예를 들어, 미국특허 제7,947,483호(2011년 5월 24일에 발표됨)에 기술되어 있다. 발효는 본원에 개시된 바와 같이, 배치, 유가 또는 연속 방식으로 수행될 수 있다.
원하는 경우에, 배지의 pH는 원하는 pH에서 배양 배지를 유지시키기 위해 필요한 경우에, 염기, 예를 들어, NaOH 또는 다른 염기, 또는 산의 첨가에 의해 원하는 pH, 특히, 중성 pH, 예를 들어, 대략 7의 pH에서 유지될 수 있다. 성장 속도는 분광광도계(600 nm)를 이용하여 광학 밀도를 측정함으로써 결정될 수 있으며, 글루코오스 섭취 속도는 시간에 따라 탄소 소스 고갈을 모니터링함으로써 결정될 수 있다.
성장 배지는 예를 들어, 비천연 미생물에 탄소 소스를 공급할 수 있는 임의의 탄수화물 소스를 포함할 수 있다. 이러한 소스는 예를 들어, 당, 예를 들어, 글루코오스, 자일로오스, 아라비노오스, 갈락토오스, 만노오스, 프룩토오스, 수크로오스 및 전분을 포함한다. 탄수화물의 다른 소스는 예를 들어, 재생 가능한 공급원료 및 바이오매스를 포함한다. 방법에서 공급원료로서 사용될 수 있는 바이오매스의 대표적인 타입은 셀룰로오스 바이오매스, 헤미셀룰로오스 바이오매스 및 리그닌 공급원료 또는 공급원료의 일부를 포함한다. 이러한 바이오매스 공급원료는 예를 들어, 글루코오스, 자일로오스, 아라비노오스, 갈락토오스, 만노오스, 플룩토오스 및 전분과 같은 탄소 소스로서 유용한 탄수화물 기질을 함유한다. 본원에 제공된 교시 및 지침을 고려하면, 당업자는 상기에 예시된 것과는 다른 재생 가능한 공급원료 및 바이오매스가 또한, 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산의 제조를 위한 미생물 유기체를 배양하기 위해 사용될 수 있다.
상기에 예시된 것과 같은 재생 가능한 공급 원료 이외에, 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민, 또는 레불린산 미생물 유기체는 또한, 이의 탄소 소스로서 합성 가스에 성장을 위해 변형될 수 있다. 이러한 특정 구현예에서, 하나 이상의 단백질 또는 효소는 합성 가스 또는 다른 가스상 탄소 소스의 사용을 위한 대사 경로를 제공하기 위해 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산 제조 유기체에서 발현된다.
합성 가스 또는 생산자 가스로도 알려진, 합성 가스는 석탄, 및 농작물 및 잔류물을 포함하는, 바이오매스 물질과 같은 탄소 함유 물질의 가스화의 주요 산물이다. 합성 가스는 주로 H2와 CO의 혼합물이고, 석탄, 석탄 오일, 천연 가스, 바이오매스, 및 폐 유기물을 포함하지만, 이로 제한되지 않는, 임의의 유기 공급원료의 가스화로부터 얻어질 수 있다. 가스화는 일반적으로, 높은 산소에 대한 연료의 비율 하에서 수행된다. 대부분이 H2 및 CO이지만, 합성 가스는 또한, CO2 및 다른 가스를 더 작은 용량으로 포함할 수 있다. 이에 따라, 합성 가스는 가스상 탄소의 비용 효과적인 소스, 예를 들어, CO 및 추가적으로, CO2를 제공한다.
우드-륭달(Wood-Ljungdahl) 경로는 CO 및 H2의 아세틸-CoA 및 다른 산물, 예를 들어, 아세테이트로의 전환을 촉매화한다. CO 및 합성 가스를 사용할 수 있는 유기체는 또한, 일반적으로, 동일한 기본 세트의 효소를 통해 CO2 및 CO2/H2 혼합물을 사용하는 능력 및 우드-륭달 경로에 의해 포함된 형질변환을 갖는다. 미생물에 의한 CO2의 아세테이트로의 H2-의존 전환은 CO가 동일한 유기체에 의해 사용될 수 있고 동일한 경로가 관여된 것을 나타내기 전에 오래 인식되었다. 여러 아세토겐은 필요한 환원 동등물을 공급하기 위해 수소가 존재하는 한, 아세테이트와 같은 CO2 및 생성 화합물의 존재 하에서 성장하는 것을 나타내었다[예를 들어, Drake, Acetogenesis, pp. 3-60 Chapman and Hall, New York, (1994)]. 이는 하기 반응식에 의해 요약될 수 있다:
2 CO2 + 4 H2 + n ADP + n Pi → CH3COOH + 2 H2O + n ATP
이에 따라, 우드-륭달 경로를 지닌 비천연 미생물은 아세틸-CoA 및 다른 원하는 산물의 제조를 위해 또한, CO2 및 H2 혼합물을 사용할 수 있다.
우드-륭달 경로는 당분야에 널리 공지되어 있고, 2개의 분기, 즉, (1) 메틸 분기 및 (2) 카보닐 분기로 분리될 수 있는 12개의 반응으로 이루어진다. 메틸 분기는 합성 가스를 메틸-테트라하이드로폴레이트(메틸-THF)로 전환시키는 반면, 카보닐 분기는 메틸-THF를 아세틸-CoA로 전환시킨다. 메틸 분기에서 반응은 하기 효소에 의해 순서대로 촉매화된다: 페레독신 옥시도리덕타아제, 포르메이트 데하이드로게나아제, 포르밀테트라하이드로폴레이트 신타아제, 메테닐테트라하이드로폴레이트 사이클로데하이드라타아제, 메틸렌테트라하이드로폴레이트 데하이드로게나아제 및 메틸렌테트라하이드로폴레이트 리덕타아제. 카보닐 분기에서 반응은 하기 효소 또는 단백질에 의해 순서대로 촉매화된다: 코발아미드 코리노이드/철-황 단백질, 메틸트랜스퍼라아제, 일산화탄소 데하이드로게나아제, 아세틸-CoA 신타아제, 아세틸-CoA 신타아제 디설파이드 리덕타아제 및 하이드로게나아제, 및 이러한 효소는 또한, 메틸테트라하이드로폴레이트로도 지칭될 수 있음: 코리노이드 단백질 메틸트랜스퍼라아제(예를 들어, AcsE), 코리노이드 철-황 단백질, 니켈-단백질 어셈블리 단백질(예를 들어, AcsF), 페레독신, 아세틸-CoA 신타아제, 일산화탄소 데하이드로게나아제 및 니켈-단백질 어셈블리 단백질(예를 들어, CooC). 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산 경로를 생성하기 위해 상당한 수의 인코딩 핵산을 도입하기 위한 본원에 제공된 교시 및 지침에 따라, 당업자는 동일한 조작 설계가 또한, 적어도, 우드-륭달 효소를 인코딩하는 핵산 또는 숙주 유기체에 존재하지 않는 단백질을 도입하는 것과 관련하여 수행될 수 있음을 이해할 것이다. 이에 따라, 변형된 유기체가 완전 우드-륭달 경로를 함유하게 미생물 유기체 내에 하나 이상의 인코딩 핵산의 도입은 합성 가스 사용 능력을 부여할 것이다.
추가적으로, 일산화탄소 데하이드로게나아제 및/또는 하이드로게나아제 활성과 커플링된 환원성(역) 트리카복실산 사이클은 또한, CO, CO2 및/또는 H2의 아세틸-CoA 및 다른 산물, 예를 들어, 아세테이트로의 전환을 위해 사용될 수 있다. 환원성 TCA 경로를 통해 탄소를 고정시킬 수 있는 유기체는 하기 효소들 중 하나 이상을 사용할 수 있다: ATP 시트레이트-리아제, 시트레이트 리아제, 이코니타아제, 이소시트레이트 데하이드로게나아제, 알파-케토글루타레이트: 페레독신 옥시도리덕타아제, 숙시닐-CoA 신타아제, 숙시닐-CoA 트랜스퍼라아제, 푸마레이트 리덕타아제, 푸마라아제, 말레이트 데하이드로게나아제, NAD(P)페레독신 옥시도리덕타아제, 일산화탄소 데하이드로게나아제, 및 하이드로게나아제. 상세하게는, 일산화탄소 데하이드로게나아제 및 하이드로게나아제에 의해 CO 및/또는 H2로부터 추출된 환원 등가물은 환원성 TCA 사이클을 통해 CO2를 아세틸-CoA 또는 아세테이트에 고정시키기 위해 사용된다. 아세테이트는 효소, 예를 들어, 아세틸-CoA 트랜스퍼라아제, 아세테이트 키나아제/포스포트랜스아세틸라아제, 및 아세틸-CoA 신타아제에 의해 아세틸-CoA로 전환될 수 있다. 아세틸-CoA는 피루베이트:페레독신 옥시도리덕타아제 및 글루코네오생성 효소에 의해 p-톨루에이트, 테레파탈레이트, 또는 (2-하이드록시-3-메틸-4-옥소부톡시) 포스포네이트 전구체, 글리세르알데하이드-3-포스페이트, 포스포에놀피루베이트, 및 피루베이트로 전환될 수 있다. p-톨루에이트, 테레프탈레이트 또는 (2-하이드록시-3-메틸-4-옥소부톡시) 포스포네이트 경로를 생성하기 위해 충분한 수의 인코딩 핵산을 도입하기 위한 본원에 제공된 교시 및 지침에 따라, 당업자는 동일한 조작 설계가 또한, 적어도, 환원성 TCA 경로 효소 또는 숙주 유기체에 존재하지 않는 단백질을 인코딩하는 핵산을 도입하는 것과 관련하여 수행될 수 있다. 이에 따라, 변형된 유기체가 완전 환원성 TCA 경로를 함유하게 미생물 유기체 내에 하나 이상의 인코딩 핵산의 도입은 합성 가스 사용 능력을 부여할 것이다.
본원에 제공된 교시 및 지침을 고려하면, 당업자는 탄수화물과 같은 탄소 공급원에서 성장하였을 때 생합성된 화합물을 분비하는 비천연 미생물 유기체가 제조될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이러한 화합물은 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산 경로에서 예를 들어, 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산 및 임의의 중간 대사물을 제조한다. 요구되는 모든 것은 예를 들어, 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산 생합성 경로 중 일부 또는 모두를 포함하는 원하는 화합물 또는 중간체의 생합성을 달성하기 위해 원하는 효소 활성 중 하나 이상을 조작하는 것이다. 이에 따라, 일부 구현예는 탄수화물에서 성장할 때 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산을 제조하고/하거나 분비하고/하거나 탄수화물에서 성장할 때 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산 경로에서 나타낸 임의의 중간 대사물을 분비하는 비천연 미생물 유기체를 제공한다. 예를 들어, 아디페이트 생산 미생물 유기체는 원하는 경우에, 중간체, 예를 들어, 3-옥소아디필-CoA, 3-하이드록시아디필-CoA, 5-카복시-2-펜테노일-CoA, 또는 아디필-CoA(도 1 참조)로부터 합성을 개시할 수 있다. 또한, 아디페이트 생산 미생물 유기체는 중간체, 예를 들어, 3-옥소아디필-CoA, 3-옥소아디페이트, 3-하이드록시아디페이트, 또는 헥사-2-엔디오에이트로부터 합성을 개시할 수 있다. 6-아미노카프로산 생산 미생물 유기체는 중간체, 예를 들어, 아디페이트 세미알데하이드로부터 합성을 개시할 수 있다. 카프로락탐 생산 미생물 유기체는 원하는 경우에, 중간체, 예를 들어, 아디페이트 세미알데하이드 또는 6-아미노카프로산(도 1 참조)으로부터 합성을 개시할 수 있다.
일부 구현예에서, 비천연 미생물 유기체는 트랜스-에노일 CoA 리덕타아제(TER)를 인코딩하는 외인성으로 발현된 핵산을 추가로 포함한다. TER은 5-카복시-2-펜테노일-CoA와 반응하여 아디필-CoA를 제조한다. 일부 구현예에서, TER은 공지된 TER일 수 있으며, 다른 구현예에서, TER 효소는 조작된다. 일부 구현예에서, 조작된 트랜스-에노일 CoA 리덕타아제는 서열번호 189의 아미노산 서열과 적어도 50% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가지며, 여기서, 조작된 트랜스-에노일 CoA 리덕타아제는 표 2에 나타낸 변이체의 임의의 아미노산 서열 변경을 포함한다.
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
일부 구현예에서, 비천연 미생물 유기체는 (i) 6-아미노아카프로일 CoA 트랜스퍼라아제, (ii) 6-아미노 카프로일 CoA 신타아제, (iii) 6-아미노 카프로일 CoA 리덕타아제, (iv) 헥사메틸렌디아민 트랜스아미나아제, (v) 헥사메틸렌디아민 데하이드로게나아제, 또는 (v) 효소 (i) 내지 (v) 중 하나 이상의 조합을 포함하는 헥사메틸렌디아민 경로를 갖는다. 다른 구현예에서, 비천연 미생물 유기체는 3-옥소아디필-CoA 티올라아제(Thl), 3-옥소아디필-CoA 데하이드로게나아제(Hbd), 및 3-옥소아디필-CoA 데하이드라타아제("크로토나아제" 또는 Crt), 5-카복시-2-펜테노일-CoA 리덕타아제(Ter), 트랜스아미나아제(HMD TA) 및 카복실산 리덕타아제(CAR)를 포함하는 헥사메틸렌디아민 경로를 갖는다.
비천연 미생물 유기체는 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산을 제조하기에 충분한 양으로 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 핵산을 외인성으로 발현시키기 위해 본원에 예시된 바와 같은 당분야에 널리 공지된 방법을 이용하여 작제화된다. 미생물 유기체가 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산을 제조하기에 충분한 조건하에서 배양되는 것으로 이해된다. 본원에 제공된 교시 및 지침에 따라, 비천연 미생물 유기체는 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산의 생합성을 달성하여, 약 0.1 내지 200 mM 또는 그 이상의 세포내 농도를 야기시킬 수 있다. 일반적으로, 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산의 세포내 농도는 약 3 내지 150 mM, 특히, 약 5 내지 125 mM 및 보다 특히, 약 8 내지 100 mM이며, 약 10 mM, 20 mM, 50 mM, 80 mM, 또는 그 이상을 포함한다. 이러한 대표적인 범위 사이 및 각각 이상의 세포내 농도는 또한 비천연 미생물 유기체로부터 달성될 수 있다.
일부 구현예에서, 배양 조건은 혐기성 또는 실질적인 혐기성 성장 또는 유지 조건을 포함한다. 대표적인 혐기성 조건은 이전에 기술되었고, 당분야에 널리 공지되어 있다. 발효 과정을 위한 대표적인 혐기성 조건은 본원에 기술되어 있고, 예를 들어, 미국특허 제7,947,483호(2011년 5월 24일에 발표됨)에 기술되어 있다. 임의의 이러한 조건은 비천연 미생물 유기체뿐만 아니라 당분야에 널리 공지된 다른 혐기성 조건과 함께 이용될 수 있다. 이러한 혐기성 조건하에서, 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산 생산자는 5 내지 10 mM의 또는 그 이상의 세포내 농도뿐만 아니라 본원에 예시된 모든 다른 농도로 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산을 합성할 수 있다. 상기 설명이 세포내 농도를 지칭함에도 불구하고, 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산 생산 미생물 유기체가 세포내에서 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산을 제조하고/하거나 산물을 배양 배지 내로 분비할 수 있는 것으로 이해된다.
배양 조건은 예를 들어, 액체 배양 절차뿐만 아니라 발효 및 다른 대규모 배양 절차를 포함할 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 특히 유용한 수율의 생합성 산물은 혐기성 또는 실질적으로 혐기성 배양 조건하에서 얻어질 수 있다.
본원에 기술된 바와 같이, 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산의 생합성을 달성하기 위한 하나의 대표적인 성장 조건은 혐기성 배양 또는 발효 조건을 포함한다. 특정 구현예에서, 비천연 미생물 유기체는 혐기성 또는 실질적으로 혐기성 조건하에서 유지되거나, 배양되거나, 발효될 수 있다. 간단하게, 혐기성 조건은 산소가 결여된 환경을 지칭한다. 실질적으로 혐기성 조건은 예를 들어, 배지 중의 용해된 산소 농도가 0 내지 10%의 포화를 유지하게 하는, 배양, 배치 발효 또는 연속 발효를 포함한다. 실질적으로 혐기성 조건은 또한, 1% 미만의 산소의 대기로 유지된 시일링된 챔버 내측의 액체 배지 또는 고체 아가에서 세포를 성장 또는 휴지시키는 것을 포함한다. 산소의 백분율은 예를 들어, 배양물에 N2/CO2 혼합물 또는 다른 적합한 비-산소 가스 또는 가스들을 살포함으로써 유지될 수 있다.
본원에 기술된 배양 조건은 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산의 제조를 위해 스케일 업되고 연속적으로 성장될 수 있다. 대표적인 성장 절차는 예를 들어, 유가 발효 및 배치 분리; 유가 발효 및 연속 분리, 또는 연속 발효 및 연속 분리를 포함한다. 이러한 과정 모두는 당분야에 널리 공지되어 있다. 발효 절차는 상업적 양의 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산의 생합성 제조를 위해 특히 유용하다. 일반적으로, 및 비-연속 배양 절차와 관련하여, 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산의 연속 및/또는 거의-연속 제조는 대수 증식기에서 성장을 유지하고/하거나 거의 유지하기 위해 충분한 영양분 및 배지에서 비천연 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산 생산 유기체를 배양하는 것을 포함할 것이다. 이러한 조건하에서 연속 배양은 예를 들어, 1일, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 추가적으로, 연속 배양은 1주, 2, 3, 4 또는 5주 또는 그 이상, 및 최대 수 개월을 포함할 수 있다. 대안적으로, 유기체는 특정 적용을 위해 적합한 경우, 수 시간 동안 배양될 수 있다. 연속 및/또는 거의-연속 배양 조건이 또한 이러한 대표적인 기간 사이의 모든 시간 간격을 포함할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 미생물 유기체를 배양하는 시간이 원하는 목적을 위해 충분한 양의 산물을 제조하기 위해 충분한 시간인 것으로 추가로 이해된다.
발효 절차는 당분야에 널리 공지되어 있다. 간단하게, 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산의 생합성 제조를 위한 발효는 예를 들어, 유가 발효 및 배치 분리; 유가 발효 및 연속 분리, 또는 연속 발효 및 연속 분리에서 사용될 수 있다. 배치 및 연속 발효 절차의 예는 당분야에 널리 공지되어 있다.
실질적인 양의 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산의 연속 제조를 위한 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산 생산자를 이용한 상기 발효 절차 이외에, 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산 생산자는 또한, 산물을 다른 화합물로 전환시키기 위해 화학적 합성 절차로 동시에 처리될 수 있거나, 산물은 발효 배양물로부터 분리될 수 있고, 순차적으로, 원하는 경우, 산물을 다른 화합물로 전환시키기 위한 화학적 전환으로 처리될 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 3-옥소아디페이트, 헥사-2-엔디오에이트를 사용하는 아디페이트 경로에서의 중간체는 예를 들어, 백금 촉매 상에서 화학적 수소화에 의해 아디페이트로 전환될 수 있다.
본원에 기술된 바와 같이, 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 또는 레불린산의 생합성을 달성하기 위한 대표적인 성장 조건은 배양 조건에 삼투 억제제의 첨가를 포함한다. 특정 구현예에서, 비천연 미생물 유기체는 삼투 억제제의 존재 하에 상기에 기술된 바와 같이 유지, 배양 또는 발효될 수 있다. 간단하게, 삼투 억제제는 삼투물질로서 작용하고 본원에 기술된 바와 같은 미생물 유기체가 삼투 스트레스를 유지하는 것을 돕는 화합물을 의미한다. 삼투 억제제는 베타인, 아미노산, 및 당 트레할로오스를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 이의 비제한적인 예에는 글리신 베타인, 프랄린 베타인, 디메틸테틴, 디메틸설포니오프로피오네이트, 3-디메틸설포니오-2-메틸프로프리오네이트, 피페콜린산, 디메틸설포니오아세테이트, 콜린, L-카르니틴 및 엑토인이 있다. 하나의 양태에서, 삼투 억제제는 글리신 베타인이다. 당업자는 삼투 스트레스으로부터 본원에 기술된 미생물 유기체를 보호하기에 적합한 삼투 억제제의 양 및 타입이 사용되는 미생물 유기체에 따라 달라질 것이라는 것을 이해한다. 예를 들어, 실시예 XXII에 기술된 바와 같이, 다양한 양의 6-아미노카프로산의 존재 하에서의 에셔리키아 콜라이는 2 mM 글리신 베타인의 존재 하에서 적합하게 성장된다. 배양 조건에서 삼투 억제제의 양은 예를 들어, 약 0.1 mM 이하, 약 0.5 mM 이하, 약 1.0 mM 이하, 약 1.5 mM 이하, 약 2.0 mM 이하, 약 2.5 mM 이하, 약 3.0 mM 이하, 약 5.0 mM 이하, 약 7.0 mM 이하, 약 10 mM 이하, 약 50 mM 이하, 약 100 mM 또는 약 500 mM 이하일 수 있다.
경로를 성공적으로 조작하는 것은 충분한 활성 및 특이성을 갖는 적절한 효소 세트를 식별하는 것을 포함한다. 이는 적절한 효소 세트를 식별하고, 이의 상응하는 유전자를 생산 숙주 내에 클로닝하고, 발효 조건을 최적화하고, 발효 후 산물 형성에 대해 검정하는 것을 수반한다. 6-아미노카프로산 또는 카프로락탐의 제조를 위한 제조 숙주를 조작하기 위해, 하나 이상의 외인성 DNA 서열(들)은 숙주 미생물에서 발현될 수 있다. 또한, 미생물은 기능적으로 결실된 내인성 유전자(들)를 가질 수 있다. 이러한 변형은 재생 가능한 공급원료를 사용하여 6-아미노카프로에이트 또는 카프로락탐을 제조할 수 있을 것이다.
일부 구현예에서, 6-아미노카프로산의 HMDA로의 전환 동안 환형 이민 또는 카프로락탐의 형성을 최소화하거나 심지어 제거하는 것은 작용기(예를 들어, 아세틸, 숙시닐)을 6-아미노카프로산의 아민 기에 첨가하여 환형화하는 것을 방지하는 것을 수반한다. 이는 에셔리키아 콜라이에서 L-글루타메이트로부터 오르니틴 형성과 유사하다. 상세하게는, 글루타메이트는 먼저, N-아세틸글루타메이트 신타아제에 의해 N-아세틸-L-글루타메이트로 전환된다. N-아세틸-L-글루타메이트는 이후에 N-아세틸글루타밀-포스페이트로 활성화되며, 이는 환원되고 아민교환되어 N-아세틸-L-오르니틴을 형성한다. 아세틸 기는 이후에, N-아세틸-L-오르니틴 데아세틸라아제에 의해 N-아세틸-L-오르니틴으로부터 제거되어 L-오르니틴을 형성한다. 이러한 경로는, 글루타메이트로부터의 글루타메이트-5-포스페이트의 형성 이후 글루타메이트-5-세미알데하이드로의 환원이 글루타메이트-5-세미알데하이드로부터 자발적으로 형성된 환형 이민인 (S)-1-피롤린-5-카복실레이트의 형성을 야기시키기 때문에 필요하다. 6-아미노카프로산으로부터 HMDA를 형성하는 경우에, 단계는 6-아미노카프로산을 아세틸-6-아미노카프로산으로 아세틸화하고, 카복실산 기를 CoA 또는 포스페이트 기로 활성화시키고, 환원하고, 아민화하고, 탈아세틸화하는 것을 포함할 수 있다.
실험
실시예 1. 아디필-CoA에서의 활성에 대한 후보물 알데하이드 데하이드로게나아제의 스크리닝
후보물 알데하이드 데하이드로게나아제(Ald)를 인코딩하는 유전자를 다수의 종의 게놈에서 생체정보학적으로 식별하였다(표 1). 알데하이드 데하이드로게나아제 각각을 인코딩하는 유전자를 합성하고, E. 콜라이에서 발현시키고, Ald 활성에 대해 평가하였다.
표 1의 Ald 효소 후보물을 인코딩하는 유전자를 구성 프로모터 하에서 낮은-카피 벡터 내로 클로닝하고, 작제물을 표준 기술을 이용하여 E. 콜라이 내으로 변형시켰다. 형질전환체를 35℃에서 밤새 항생제의 존재 하에서 LB 배지 중에서 배양하고, 그 후에, 세포를 실온에서 15,000 rpm에서 수확하였다. 용해물을 제조하기 위해, 세포를 리소자임, 뉴클레아제 및 10 mM DTT를 함유한 화학적 용해 용액에서 재현탁시키고, 실온에서 적어도 30분 동안 인큐베이션하였다. 얻어진 용해물을 사용하여 알데하이드 데하이드로게나아제 활성을 시험하였다.
용해물(5 ㎕)을 검정 혼합물에 첨가하여 0.1 M Tris-HCl, pH 7.5, 2.5 mM 아디필-CoA(AdCoA), 및 0.5 mM NADH 또는 0.5 mM NADPH의 최종 농도를 갖는 20 ㎕의 총 부피를 형성하였다. Ald 효소 후보물 모두를 스크리닝하기 위해 이러한 검정을 사용하였다. 일부 Ald 후보물을 또한, 기질로서 숙시닐-CoA(SuCoA) 또는 아세틸-CoA(AcCoA)를 사용하여 검정하였다. AdCoA, SuCoA, 및 AcCoA를 상업적 공급업체로부터 획득하였다. 활성을 CoA 기질의 존재 하에서 NADH 또는 NADPH의 형광의 선형 감소에 의해 모니터링하였다. NADH 또는 NADPH 중 어느 하나를 사용하여 아디필-CoA에서 유의미하게 활성인 Ald는 표 3에서 양성(+)으로 지정되었으며, 활성이 거의 나타내지 않거나 전혀 없는 것은 음성(-)으로 지정되었다.
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
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실시예 2. 기질 특이성을 결정하기 위한 알데하이드 데하이드로게나아제 검정
여러 알데하이드 데하이드로게나아제 효소의 기질 선호도를 결정하기 위해, 숙시닐 CoA 및 아디필 CoA 기질을 사용한 기질 CoA 고갈 검정을 이용하였다. 이러한 검정에서, 기질 용액은 1.5 mM에서 과량의 NADH 또는 NADPH 보조 인자와 함께 0.1 M Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM 아디필-CoA, 0.2 mM 숙시닐-CoA, 및 0.2 mM 아세틸-CoA를 함유하였다. 검정 완충제에 용해물을 첨가함으로써 반응을 개시하고, 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 반응을 1% 포름산으로 켄칭시키고, 이후에, 잔류 기질 CoA 각각을 정량화하기 위해 LC/MS 분석 방법에 의해 평가하였다. Ald 활성을 각 CoA 기질의 고갈 %로서 측정하였다. 검정에 존재하는 다른 CoA 기질과 관련하여 특정 CoA 기질의 더 높은 고갈 %는 특정 기질 CoA에 대한 선호도를 나타내었다. 도 2는 펩토스트렙토코카세애 박테리움 오랄 알데하이드 데하이드로게나아제(서열번호 7), 아시다미노코쿠스 마실리엔시스 알데하이드 데하이드로게나아제(서열번호 28), 콜린셀라 sp. GD7 알데하이드 데하이드로게나아제(서열번호 60), 및 롬보우스트시아 리투세부렌시스 DSM 알데하이드 데하이드로게나아제(서열번호 107)가 검정 혼합물로부터 숙시닐-CoA보다 훨씬 더 많은 아디필-CoA를 고갈시켰고, 이에 따라, 아디필-CoA 선호로서 지정되었다. 포르피로모나스 깅기발리스 W83(서열번호 2)으로부터의 알데하이드 데하이드로게나아제는 숙시닐-CoA 선호인 것으로 확인되었다.
실시예 3. 알데하이드 데하이드로게나아제의 생체내 검정
아디필-CoA 기질 선호를 갖는 것으로 입증된 알데하이드 데하이드로게나아제를 또한, 생체내 검정에서 시험하였으며, 여기서, 3-옥소아디필-CoA 티올라아제(Thl), 3-옥소아디필-CoA 데하이드로게나아제(Hbd), 및 3-옥소아디필-CoA 데하이드라타아제("크로토나아제" 또는 Crt), 5-카복시-2-펜테노일-CoA 리덕타아제(Ter), 및 트랜스아미나아제(TA)를 인코딩하는 유전자를 발현시킨 E. 콜라이 균주를 알데하이드 데하이드로게나아제(Ald) 유전자를 포함한 작제물로 형질전환시켰다. Thl, Hbd, Crt, Ter, TA E. 콜라이 균주는 Ald 효소를 제외하고 6-아미노카프로에이트(6ACA)를 제조하기 위해 필요한 모든 경로 효소를 포함하였다. 포르피로모나스 깅기발리스 W83 Ald(서열번호 2), 펩토스트렙토코카세애 박테리움 오랄 Ald(서열번호 7), 아시다미노코쿠스 마실리엔시스 Ald(서열번호 28), 콜린셀라 sp. GD7 Ald(서열번호 60), 및 롬보우스트시아 리투세부렌시스 DSM Ald(서열번호 107)를 인코딩하는 유전자를 구성 프로모터 하에서 낮은 카피수 플라스미드 벡터에서 별도로 클로닝하였다. Ald 유전자를 발현시키기 위한 플라스미드를 표준 기술을 이용하여 Thl/Hbd/Crt/Ter/TA 균주로 형질변형시켰다. Ald 유전자 중 어느 하나를 포함한 형질변형체를 이후에, 6-아미노카프로에이트(6ACA) 제조에 대해 시험하였다. 조작된 E. 콜라이 세포에 최소 배지 중 2% 글루코오스를 공급하고, 35℃에서 18시간 인큐베이션 후에, 세포를 수확하고, 상청액을 6ACA에 대한 분석 HPLC 또는 표준 LS/MS 분석 방법에 의해 평가하였다. 표 4에 나타낸 바와 같이, Thl, Hbd, Crt, Ter, 및 TA 유전자를 포함한 E. 콜라이드에서 Ald 효소를 인코딩하는 유전자의 발현은 이러한 균주에 의해 6ACA를 제조하였다.
Figure pct00012
실시예 4. 알데하이드 데하이드로게나아제의 동역학 특징 분석
동력학 특징분석을 실시예 1에 기술된 용해물 스크리닝과 유사한 조건하에서 수행하였다. 그러나, 이러한 경우에, 정제된 단백질을, 세포 용해물 대신에 사용하였다. 아시다미노코쿠스 마실리엔시스 Ald(서열번호 28), 콜린셀라 sp. GD7 Ald(서열번호 60), 및 롬보우스트시아 리투세부렌시스 DSM Ald(서열번호 107) 각각을 친화력 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 이러한 검정에서, 전환 수(kcat), 효소의 기질에 대한 효소의 친화력(KM)을 결정하기 위해 기질 CoA 각각의 농도를 변경시키고, 각 기질에 대한 각 선택된 Ald 효소의 촉매 효율(kcat/KM)을 결정하고 하기 표 5에 나타내었다.
Figure pct00013
다양한 기질을 사용한 다양한 알데하이드 데하이드로게나아제의 촉매 효율(kcat/KM)을 비교를 위해 막대 그래프로 플롯팅하였다(도 3a). 숙시닐-CoA에 비해 아디필-CoA에 대한 Ald 동족체의 촉매 효율(kcat/KM)은 숙시닐-CoA의 kcat/KM에 대한 아디필-CoA의 kcat/KM의 비율로서 계산된다. 도 3b는 검정된 3개의 Ald 효소 모두가 숙시닐-CoA에 비해 아디필-CoA에 대해 더 높은 촉매 효율을 가짐을 도시한 것이다. 도 3c는, 검정된 3개의 Ald 효소 모두가 또한 아세틸-CoA에 비해 아디필-CoA에 대해 더 높은 촉매 효율을 가짐을 도시한 것이다.
실시예 5 알데하이드 데하이드로게나아제의 생체내 검정
또한, E. 콜라이 염색체에 통합된 Ald 유전자와 함께 카복실산 리덕타아제(CAR), CAR-WP_003872682.1), 및 다른 TA 유전자(HMD-TA WP_001301395.1)의 2개의 추가 유전자를 포함한 작제물로 형질절환된 실시예 3에 기술된 3-옥소아디필-CoA 티올라아제(Thl), 3-옥소아디필-CoA 데하이드로게나아제(Hbd), 및 3-옥소아디필-CoA 데하이드라타아제("크로토나아제" 또는 Crt), 5-카복시-2-펜테노일-CoA 리덕타아제(Ter), 및 트랜스아미나아제(TA)를 인코딩하는 유전자를 발현시킨 E. 콜라이 균주에서 생체내 검정에서 시험된 아디필-CoA 기질 선호도를 가짐을 나타내었다. 포르피로모나스 깅기발리스 W83 Ald(서열번호 2), 펩토스트렙토코카세애 박테리움 오랄 Ald(서열번호 7), 아시다미노코쿠스 마실리엔시스 Ald(서열번호 28), 콜린셀라 sp. GD7 Ald(서열번호 60), 및 롬보우스트시아 리투세부렌시스 DSM Ald(서열번호 107)를 구조 프로모터 하에서 인코딩하는 유전자를 낮은 카피 수 플라스미드 벡터에서 별도로 클로닝하였다. Ald 유전자를 발현시키기 위한 플라스미드를 표준 기술을 이용하여 Thl/Hbd/Crt/Ter/TA/CAR 균주로 형질전환하였다. 이러한 작제물을 실시예 3의 6ACA 제조를 위해 기술된 바와 동일한 조건 및 시험으로 처리하였다. 작제물은 실시예 3에 기술된 LC/MS 분석 방법에 의해 검출된 바와 같이 HMD를 제조하는 것으로 나타났다.
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KNHs205 <400> 33 Val Asn Leu Lys Glu Ala Gln Val Lys Asp Ile Val Arg Lys Val Leu 1 5 10 15 Leu Gln Met Glu Ala Ser Asn Lys Glu Glu Gln Lys Leu Ser Gly Ile 20 25 30 Phe Thr Glu Met Asn Asp Ala Ile Gly Ala Ser Ile Lys Ala Gln Lys 35 40 45 Val Met Gln Gln Leu Ser Met Asp Ser Arg Glu Lys Ile Ile Ser Asn 50 55 60 Ile Arg Lys Lys Thr Leu Glu Asn Ala Glu Leu Phe Ala Arg Met Gly 65 70 75 80 Val Glu Glu Thr Gly Met Gly Asn Val Gly His Lys Ile Leu Lys His 85 90 95 Gln Leu Leu Ala Glu Lys Thr Pro Gly Thr Glu Asp Ile Ser Thr Val 100 105 110 Ala Trp Ser Gly Asp Arg Gly Leu Thr Leu Val Glu Met Gly Pro Phe 115 120 125 Gly Val Ile Gly Ala Ile Thr Pro Cys Thr Asn Pro Ser Glu Thr Ile 130 135 140 Leu Cys Asn Ser Ile Gly Met Ile Ala Gly Gly Asn Thr Val Val Phe 145 150 155 160 Asn Pro His Pro Ala Ala Ile Gly Val Ser Asn Leu Ala Val His Met 165 170 175 Val Asn Glu Ala Ser Arg Glu Ala Gly Gly Pro Asp Asn Ile Ala Val 180 185 190 Ser Val Val Lys Pro Thr Leu Ala Ser Gly Asp Ile Met Met Lys His 195 200 205 Gln 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D27 <400> 42 Met Glu Ile Ser Thr Ser Gln Ile Ser Arg Tyr Ile Leu Asp Leu Gln 1 5 10 15 Asn Glu Leu Lys Gly Asp Ser Pro Ser Pro Ala His Met Ser Ala Gly 20 25 30 Glu His Gly Ile Phe Gln Asp Ala Glu Cys Ala Ile Met Ala Ala Ser 35 40 45 Gln Ala Gln Lys Arg Leu Met Glu Tyr Ser Leu Lys Glu Arg Glu Thr 50 55 60 Phe Ile Glu Ala Met Arg Ala Ala Ala Arg Glu Asn Ala Arg Lys Leu 65 70 75 80 Ala Glu Thr Ala His Asp Glu Thr Gly Tyr Gly His Val Glu Asp Lys 85 90 95 Val Ala Lys Asn Val Leu Ala Ala Asp Lys Thr Pro Gly Ile Glu Asp 100 105 110 Leu Asn Thr Met Ala Val Ser Gly Asp Ala Gly Leu Met Leu Thr Glu 115 120 125 Met Ala Pro Tyr Gly Val Ile Gly Ala Ile Thr Pro Ser Thr Asn Pro 130 135 140 Thr Ala Thr Val Ile Asn Asn Gly Ile Gly Met Ile Ala Gly Gly Asn 145 150 155 160 Ala Val Val Phe Asn Pro His Pro Gly Ala Lys Lys Ala Ser Leu Leu 165 170 175 Thr Ile Lys Leu Met Asn Glu Ala Ile Val Gly Ala Gly Gly Pro Asp 180 185 190 Asn Leu Leu Cys Ala Pro Glu Glu Pro Thr Leu Asp Thr Ser Ser Val 195 200 205 Ile Met 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GD7 <400> 60 Val Ala Glu Phe Ile Glu Arg Ala Arg Val Ala Gln Ala Glu Phe Glu 1 5 10 15 Thr Tyr Ser Gln Glu Glu Val Asp Arg Ala Val Arg Ala Ile Gly Lys 20 25 30 Ala Val Phe Asp Ala Ala Glu Pro Leu Ala Lys Leu Ala Val Glu Glu 35 40 45 Thr Arg Met Gly Arg Tyr Glu Asp Lys Ile Ala Lys Asn Ser Gly Lys 50 55 60 Thr Lys Ile Thr Trp Asp Arg Leu Lys Gly Val Lys Ser Arg Gly Ile 65 70 75 80 Ile Ala Arg His Glu Asp Glu Gly Ile Val Glu Val Ala Lys Pro Met 85 90 95 Gly Val Ile Gly Cys Ile Pro Pro Thr Thr Asn Pro Thr Met Thr Pro 100 105 110 Ala His Asn Ala Met Cys Ala Leu Lys Gly Gly Asn Ala Leu Leu Ile 115 120 125 Ser Pro His Pro Arg Ala Lys Lys Thr Gly Val Glu Thr Val Arg Ile 130 135 140 Met Arg Glu Ala Leu Glu Ala Met Gly Ala Pro Ala Asp Leu Ile Gln 145 150 155 160 Ile Ile Pro Asp Pro Thr Leu Glu Ile Ser Ser Leu Val Met Ser Met 165 170 175 Cys Asp Cys Thr Ile Ala Thr Gly Gly Pro Gly Met Val Lys Ala Val 180 185 190 Tyr Ser Ser Gly Lys Pro Ala Phe Gly Val Gly Ala Gly Asn Val Gln 195 200 205 Thr Ile 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Blautia wexlerae <400> 100 Met Pro Val Ser Glu Ser Met Val Gln Glu Ile Val Gln Gln Val Met 1 5 10 15 Ala Lys Met Gln Ile Ala Asp Ala Pro Ala Glu Lys Gln His Gly Val 20 25 30 Phe Lys Asp Met Asn Asp Ala Ile Glu Ala Ala Lys Lys Ser Gln Glu 35 40 45 Ile Val His Lys Met Ser Met Asp Gln Arg Glu Lys Ile Ile Ser Cys 50 55 60 Ile Arg Lys Lys Ile Lys Glu Asn Ala Glu Ile Met Ala Arg Met Gly 65 70 75 80 Val Glu Glu Thr Lys Met Gly Asn Val Gly Asp Lys Ile Leu Lys His 85 90 95 His Leu Val Ala Asp Lys Thr Pro Gly Thr Glu Ala Ile Thr Thr Thr 100 105 110 Ala Trp Ser Gly Asp Arg Gly Leu Thr Leu Val Glu Met Gly Pro Phe 115 120 125 Gly Val Ile Gly Ala Ile Thr Pro Cys Thr Asn Pro Ser Glu Thr Val 130 135 140 Leu Cys Asn Thr Met Gly Met Leu Ala Gly Gly Asn Thr Val Val Phe 145 150 155 160 Asn Pro His Pro Ala Ala Val Lys Thr Ser Leu Tyr Ala Val Asn Leu 165 170 175 Val Asn Glu Ala Ser Leu Glu Gln Gly Gly Pro Asp Asn Ile Ala Val 180 185 190 Ser Val Glu Asn Pro Thr Leu Asp Thr Ser Ser Val Met Met Lys His 195 200 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Gly Val Ile 115 120 125 Gly Ser Val Ala Pro Ser Thr Asn Pro Thr Glu Thr Ile Ile Asn Asn 130 135 140 Ser Ile Ser Met Leu Ala Ala Gly Asn Ala Val Tyr Phe Ser Pro His 145 150 155 160 Pro Gly Ala Lys Ala Val Ser Leu Asp Leu Ile Ala Gln Ile Glu Ala 165 170 175 Ile Ile Phe Asn Ser Cys Gly Ile Arg Asn Leu Val Val Thr Val Gln 180 185 190 Glu Pro Ser Phe Glu Ala Thr Gln Gln Met Met Ala His Asp Lys Ile 195 200 205 Ala Leu Leu Ala Ile Thr Gly Gly Pro Ala Ile Val Ala Met Gly Met 210 215 220 Lys Ser Gly Lys Lys Val Ile Gly Ala Gly Ala Gly Asn Pro Pro Cys 225 230 235 240 Leu Val Asp Glu Thr Ala Glu Leu Ala Lys Ala Ala Gln Asp Ile Val 245 250 255 Ser Gly Ala Ser Phe Asp Tyr Asn Leu Pro Cys Ile Ala Glu Lys Ser 260 265 270 Leu Ile Val Val Glu Ser Val Ala Asp Arg Leu Leu Gln Gln Met Gln 275 280 285 Ala Phe Asp Ala Leu Leu Ile Ser Asn Pro Gln Asp Val Asp Ser Leu 290 295 300 Arg Lys Ala Cys Leu Thr Pro Gln Gly His Ala Asn Lys Asn Leu Val 305 310 315 320 Gly Lys Ser Pro Leu Glu Leu Leu Lys Ala Ala Gly Leu 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Gly Asp Tyr Gly Val Phe Glu Thr Met Asp Gln Ala Val Glu 65 70 75 80 Ala Ala Tyr Gln Ala Gln Lys Ile Tyr Gln Ala Lys Phe Gln Leu Lys 85 90 95 Asp Arg Glu Arg Leu Ile Lys Ser Ile Arg Glu Thr Gly Met Lys Asn 100 105 110 Val Glu Lys Leu Ala Arg Met Ser Val Asp Glu Thr Gly Leu Gly Arg 115 120 125 Tyr Glu Asp Lys Ile Leu Lys Asn Thr Leu Val Leu Glu Arg Thr Pro 130 135 140 Gly Thr Glu Cys Leu Lys Thr Glu Ala Ile Ser Gly Asp Asp Gly Leu 145 150 155 160 Thr Ile Ile Glu His Ala Pro Tyr Gly Val Ile Gly Ser Ile Thr Pro 165 170 175 Val Thr Asn Pro Thr Glu Thr Ile Ile Asn Asn Val Ile Ser Met Ile 180 185 190 Ala Gly Gly Asn Ser Val Val Phe Asn Val His Pro Ser Ala Lys Glu 195 200 205 Ser Cys Arg Phe Ala Val Gln Met Ile Asn Lys Ala Ile Glu Glu Val 210 215 220 Gly Gly Pro Lys Asn Leu Val Ser Met Val Lys Gln Pro Thr Leu Asp 225 230 235 240 Thr Val Ser Gln Leu Ser Lys Asn Asp Lys Val Arg Leu Met Ala Gly 245 250 255 Thr Gly Gly Met Pro Met Val Arg Ser Leu Leu Gln Ser Gly Lys Lys 260 265 270 Val Ile Gly Ala 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Gly Met Ile Ala Ala Gly Asn Thr Val 145 150 155 160 Phe Phe Ser Pro His Pro Thr Ala Lys Asn Thr Ser Ile Lys Ile Ile 165 170 175 Thr Leu Leu Asn Asp Ala Ile Val Lys Ala Gly Gly Pro Asn Asn Leu 180 185 190 Leu Thr Ser Val Ala Asn Pro Ser Ile Lys Ala Ala Asn Glu Met Met 195 200 205 Lys His Pro Gly Ile Asn Met Leu Val Ala Thr Gly Gly Pro Gly Val 210 215 220 Val Lys Ala Val Leu Ser Ser Gly Lys Lys Ala Ile Gly Ala Gly Ala 225 230 235 240 Gly Asn Pro Pro Val Ile Val Asp Glu Thr Ala Asp Ile Glu Lys Ala 245 250 255 Ala Arg Asp Ile Val Ala Gly Cys Ser Phe Asp Asn Asn Leu Pro Cys 260 265 270 Ile Ala Glu Lys Glu Val Ile Ala Val Gly Ser Ile Ala Asp Arg Leu 275 280 285 Ile Thr Tyr Met Gln Lys Tyr Gly Ala Tyr Leu Ile Ser Gly Ser Asn 290 295 300 Ile Asp Arg Leu Leu Asp Val Ile Met Thr Val Gln Glu Glu Lys Ile 305 310 315 320 Ala Glu Gly Cys Thr Asp Lys Pro Lys Arg Ser Tyr Gly Ile Asn Lys 325 330 335 Asp Tyr Val Gly Lys Asp Ala Lys Tyr Leu Leu Ser Lys Ile Gly Ile 340 345 350 Asp Val Pro Asp Ser Val Lys Val Val Leu Cys Glu Thr Pro Ala Asp 355 360 365 His Pro Phe Val Ile Glu Glu Leu Met Met Pro Val Leu Pro Val Val 370 375 380 Gln Val Lys Asp Ile Asp Glu Ala Ile Glu Val Ala Val Arg Val Glu 385 390 395 400 His Gly Asn Arg His Thr Ala Ala Met His Ser Lys Asn Val Asp His 405 410 415 Leu Thr Arg Phe Ala Arg Ala Val Glu Thr Thr Ile Phe Val Lys Asn 420 425 430 Ala Pro Ser Tyr Ala Gly Ile Gly Val Gly Gly Glu Gly Phe Thr Ser 435 440 445 Phe Thr Leu Ala Gly Pro Thr Gly Glu Gly Ile Thr Ser Pro Arg Ser 450 455 460 Phe Thr Arg Gln Arg Arg Cys Val Leu Val Asp Ala Phe Ser Ile Val 465 470 475 480 <210> 118 <400> 118 000 <210> 119 <400> 119 000 <210> 120 <400> 120 000 <210> 121 <400> 121 000 <210> 122 <400> 122 000 <210> 123 <400> 123 000 <210> 124 <400> 124 000 <210> 125 <400> 125 000 <210> 126 <400> 126 000 <210> 127 <400> 127 000 <210> 128 <400> 128 000 <210> 129 <400> 129 000 <210> 130 <400> 130 000 <210> 131 <400> 131 000 <210> 132 <400> 132 000 <210> 133 <400> 133 000 <210> 134 <211> 457 <212> PRT <213> Clostridium sp. KLE <400> 134 Met Val Gln Asp Ile Val Lys Glu Val Val Ala Arg Met Gln Leu Ser 1 5 10 15 Gly Thr Ala Gln Ser Ala Gln His Gly Val Phe Asn Asp Met Asn Gln 20 25 30 Ala Ile Glu Ala Ala Lys Glu Ala Glu Lys Thr Val Arg Arg Met Thr 35 40 45 Met Asp Gln Arg Glu Gln Ile Val Ser Asn Ile Arg Lys Lys Thr His 50 55 60 Glu Ala Ala Glu Ile Leu Ala Arg Met Gly Val Glu Glu Thr Gly Met 65 70 75 80 Gly Asn Val Gly Asp Lys Ile Leu Lys His His Leu Leu Ala Asp Lys 85 90 95 Thr Pro Gly Thr Glu Asp Ile Thr Thr Thr Ala Trp Ser Gly Asp Arg 100 105 110 Gly Leu Thr Leu Ile Glu Met Gly Pro Phe Gly Val Ile Gly Ala Ile 115 120 125 Thr Pro Cys Thr Asn Pro Ser Glu Thr Val Leu Cys Asn Ser Ile Gly 130 135 140 Met Ile Ala Ala Gly Asn Thr Val Val Phe Asn Pro His Pro Gln Ala 145 150 155 160 Ile Arg Thr Ser Ile Phe Ala Ile Asn Leu Val Asn Glu Ala Ser Leu 165 170 175 Glu Ala Gly Gly Pro Asp Asn Val Ala Cys Thr Val Phe Lys Pro Thr 180 185 190 Leu Glu Thr Ser Asn Ile Met Met Lys His Lys Asp Ile Pro Leu Ile 195 200 205 Ala Ala 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Gly Gly Glu Gly Phe Cys Thr Phe Thr Ile Ala Ser Arg Thr 420 425 430 Gly Glu Gly Leu Thr Ser Thr Ser Thr Phe Thr Lys Arg Arg Arg Cys 435 440 445 Val Met Ser Asp Ser Leu Cys Ile Arg 450 455 <210> 135 <211> 527 <212> PRT <213> Caldalkalibacillus thermarum TA2.A1 <400> 135 Met Asn Met Thr Glu Lys Asp Ile Glu Lys Ile Val Gln Ser Val Leu 1 5 10 15 His Asn Val Glu Ser Ala Leu Gly Lys Ser Ala Ser Ala Ser Pro Ser 20 25 30 Val Ser Ala Val Ser Val Ala Ser Gly Glu Gly Ile Lys Pro Val Gln 35 40 45 Phe Lys Gln Val Pro Val Phe Gln Gln Glu Thr Val Lys Ser Pro Asn 50 55 60 Arg Asn Arg Asn Leu Gly Gly Ala Glu Glu Lys Trp Gly Val Phe Asn 65 70 75 80 His Met Glu Asp Ala Ile Glu Ala Ser Tyr Arg Ala Gln Met Glu Phe 85 90 95 Val Lys His Phe Gln Leu Lys Asp Arg Glu Lys Ile Ile Thr Ala Ile 100 105 110 Arg Glu Ala Val Leu Arg Glu Lys Glu Val Leu Ala Arg Lys Val Tyr 115 120 125 Glu Glu Thr Lys Ile Gly Arg Tyr Glu Asp Lys Val Ala Lys His Glu 130 135 140 Leu Ala Ala Leu Lys Thr Pro Gly Thr Glu Asp Leu Lys Thr Glu 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Val Phe Asn His Met Glu 20 25 30 Asp Ala Ile Glu Ala Ser Tyr Arg Ala Gln Met Glu Phe Val Lys His 35 40 45 Phe Gln Leu Lys Asp Arg Glu Lys Ile Ile Thr Ala Ile Arg Glu Ala 50 55 60 Val Leu Arg Glu Lys Glu Val Leu Ala Arg Lys Val Tyr Glu Glu Thr 65 70 75 80 Lys Ile Gly Arg Tyr Glu Asp Lys Val Ala Lys His Glu Leu Ala Ala 85 90 95 Leu Lys Thr Pro Gly Thr Glu Asp Leu Lys Thr Glu Ala Phe Ser Gly 100 105 110 Asp Asn Gly Leu Thr Ile Val Glu Arg Ala Pro Tyr Gly Leu Ile Gly 115 120 125 Ala Val Thr Pro Val Thr Asn Pro Thr Glu Thr Ile Ile Asn Asn Ala 130 135 140 Ile Gly Met Leu Ala Ala Gly Asn Ala Val Val Phe Asn Val His Pro 145 150 155 160 Ser Ser Lys Arg Ser Cys Ala Tyr Ala Val Gln Leu Ile Asn Lys Ala 165 170 175 Ile Thr Glu Ala Gly Gly Pro His His Leu Val Thr Met Val Lys Glu 180 185 190 Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Thr Leu Ile Asp Ser Pro Lys Val Lys 195 200 205 Leu Leu Val Gly Thr Gly Gly Pro Gly Leu Val Gln Thr Leu Leu Lys 210 215 220 Ser Gly Lys Lys Ala Ile Gly Ala Gly Ala Gly Asn Pro Pro Val 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Pro 435 440 445 Thr Gly Glu Gly Val Thr Ser Ala Lys Thr Phe Thr Arg Glu Arg Arg 450 455 460 Cys Val Leu Ala Glu Gly Gly Phe Arg Ile Ile Gly 465 470 475 <210> 138 <400> 138 000 <210> 139 <400> 139 000 <210> 140 <400> 140 000 <210> 141 <400> 141 000 <210> 142 <400> 142 000 <210> 143 <400> 143 000 <210> 144 <400> 144 000 <210> 145 <211> 462 <212> PRT <213> Blautia sp. CAG:257 <400> 145 Met Pro Ile Ser Glu Asn Met Val Gln Glu Ile Val Gln Glu Val Met 1 5 10 15 Ala Lys Met Gln Ile Ala Glu Ala Pro Ala Gly Lys His Gly Ile Phe 20 25 30 Lys Asp Met Asn Asp Ala Ile Glu Ala Ala Lys Lys Ala Glu Leu Ile 35 40 45 Val Lys Arg Met Ser Met Asp Gln Arg Glu Lys Ile Ile Thr Cys Ile 50 55 60 Arg Lys Lys Ile Lys Glu Asn Ala Glu Val Leu Ala Arg Met Gly Val 65 70 75 80 Glu Glu Thr Gly Met Gly Asn Val Gly Asp Lys Ile Leu Lys His His 85 90 95 Leu Val Ala Asp Lys Thr Pro Gly Thr Glu Asp Ile Thr Thr Thr Ala 100 105 110 Trp Ser Gly Asp Arg Gly Leu Thr Leu Ile Glu Met Gly Pro Phe Gly 115 120 125 Val Ile Gly Ala Ile Thr Pro Cys Thr Asn Pro Ser Glu Thr Val Leu 130 135 140 Cys Asn Thr Met Gly Met Leu Ala Gly Gly Asn Thr Val Val Phe Asn 145 150 155 160 Pro His Pro Ala Ala Ile Lys Thr Ser Ile Tyr Ala Ile Asn Leu Leu 165 170 175 Asn Glu Ala Ser Leu Glu Ser Gly Gly Pro Asp Asn Ile Ala Val Thr 180 185 190 Val Glu Lys Pro Thr Leu Glu Thr Ser Asp Ile Met Met Lys His Lys 195 200 205 Asp 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Ile Ala Ala Pro Lys Arg Thr Asp Pro Ala Thr Gly Val Leu 145 150 155 160 His Lys Ala Cys Leu Lys Pro Ile Gly Ala Thr Tyr Thr Asn Arg Thr 165 170 175 Val Asn Thr Asp Lys Ala Glu Val Thr Asp Val Ser Ile Glu Pro Ala 180 185 190 Ser Pro Glu Glu Ile Ala Asp Thr Val Lys Val Met Gly Gly Glu Asp 195 200 205 Trp Glu Leu Trp Ile Gln Ala Leu Ser Glu Ala Gly Val Leu Ala Glu 210 215 220 Gly Ala Lys Thr Val Ala Tyr Ser Tyr Ile Gly Pro Glu Met Thr Trp 225 230 235 240 Pro Val Tyr Trp Ser Gly Thr Ile Gly Glu Ala Lys Lys Asp Val Glu 245 250 255 Lys Ala Ala Lys Arg Ile Thr Gln Gln Tyr Gly Cys Pro Ala Tyr Pro 260 265 270 Val Val Ala Lys Ala Leu Val Thr Gln Ala Ser Ser Ala Ile Pro Val 275 280 285 Val Pro Leu Tyr Ile Cys Leu Leu Tyr Arg Val Met Lys Glu Lys Gly 290 295 300 Thr His Glu Gly Cys Ile Glu Gln Met Val Arg Leu Leu Thr Thr Lys 305 310 315 320 Leu Tyr Pro Glu Asn Gly Ala Pro Ile Val Asp Glu Ala Gly Arg Val 325 330 335 Arg Val Asp Asp Trp Glu Met Ala Glu Asp Val Gln Gln Ala Val Lys 340 345 350 Asp Leu Trp Ser Gln Val Ser Thr Ala Asn Leu Lys Asp Ile Ser Asp 355 360 365 Phe Ala Gly Tyr Gln Thr Glu Phe Leu Arg Leu Phe Gly Phe Gly Ile 370 375 380 Asp Gly Val Asp Tyr Asp Gln Pro Val Asp Val Glu Ala Asp Leu Pro 385 390 395 400 Ser Ala Ala Gln Gln 405

Claims (45)

  1. 아디필-CoA와 반응하여 아디페이트-세미알데하이드를 형성하는 알데하이드 데하이드로게나아제 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하는 비천연 미생물 유기체로서, 상기 알데하이드 데하이드로게나아제는, 기질로서 숙시닐-CoA, 아세틸-CoA, 또는 둘 모두와 비교하여, 기질로서 아디필-CoA에 대해 더 높은 촉매 효율을 가지며/가지거나, 상기 알데하이드 데하이드로게나아제는, 숙시닐-CoA, 아세틸-CoA, 또는 숙시닐-CoA와 아세틸-CoA 기질 둘 모두와 비교하여, 아디필-CoA 기질에 대해 더 높은 전환 수(turnover number)를 갖는 것인 비천연 미생물 유기체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 알데하이드 데하이드로게나아제 효소는 서열번호 1, 서열번호 2, 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하지 않는 것인 비천연 미생물 유기체.
  3. 제2항에 있어서, 상기 알데하이드 데하이드로게나아제 효소는 숙시닐-CoA 기질과 비교하여 아디필-CoA 기질에 대해 더 높은 촉매 효율을 갖는 것인 비천연 미생물 유기체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 아디필-CoA 기질에 대한 상기 알데하이드 데하이드로게나아제 효소의 촉매 효율은 숙시닐-CoA 기질에 대한 특이성보다 적어도 2배 높은 것인 비천연 미생물 유기체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 알데하이드 데하이드로게나아제 효소는 숙시닐-CoA 기질과 비교하여 아디필-CoA 기질에 대해 더 높은 전환 수를 갖는 것인 비천연 미생물 유기체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 알데하이드 데하이드로게나아제 효소는 아세틸-CoA 기질과 비교하여 아디필-CoA 기질에 대해 더 높은 촉매 효율을 갖는 것인 비천연 미생물 유기체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 아디필-CoA 기질에 대한 상기 알데하이드 데하이드로게나아제 효소의 촉매 효율은 아세틸-CoA 기질에 대한 촉매 효율보다 적어도 5배 높은 것인 비천연 미생물 유기체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 알데하이드 데하이드로게나아제 효소는 아세틸-CoA 기질과 비교하여 아디필-CoA 기질에 대해 더 높은 전환 수를 갖는 것인 비천연 미생물 유기체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비천연 미생물 유기체는, 대조군 미생물 유기체가 알데하이드 데하이드로게나아제 효소를 인코딩하는 외인성 핵산을 포함하지 않는 것을 제외하고, 상기 비천연 미생물 유기체와 실질적으로 동일한 상기 대조군 미생물 유기체보다 더 많은 아디필-CoA를 아디페이트 세미알데하이드로 전환시키는 것인 비천연 미생물 유기체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 알데하이드 데하이드로게나아제는 서열번호 4, 7, 11, 15, 17, 19, 24, 25, 27, 28, 31-33, 36, 38, 40-42, 44, 45, 47, 53, 58-60, 63, 65-67, 74, 75, 77, 80, 82, 84, 86-88, 90, 91, 94, 95, 97, 100, 101, 103, 107, 109, 111, 112, 117, 134, 135, 137, 145, 146, 148-150, 152, 157-159, 164-167, 176, 187, 및 188 중 어느 하나의 적어도 25개의 인접 아미노산과 적어도 약 60% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 비천연 미생물 유기체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 알데하이드 데하이드로게나아제는 서열번호 7, 28, 60 또는 107 중 어느 하나의 적어도 25개의 인접 아미노산과 적어도 약 60% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 비천연 미생물 유기체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 알데하이드 데하이드로게나아제 효소는 서열번호 7, 28, 60 또는 107의 아미노산 서열을 포함하는 것인 비천연 미생물 유기체.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 알데하이드 데하이드로게나아제 효소는 보조 인자로서 NADH를 사용하는 것인 비천연 미생물 유기체.
  14. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 알데하이드 데하이드로게나아제 효소는 서열번호 53, 77, 82, 94 및 152 중 어느 하나의 적어도 25개의 인접 아미노산과 적어도 약 60% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 비천연 미생물 유기체.
  15. 제14항에 있어서, 상기 알데하이드 데하이드로게나아제 효소는 보조 인자로서, NADH, NADPH, 또는 둘 모두를 사용하는 것인 비천연 미생물 유기체.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 아디필-CoA와 반응하여 아디페이트-세미알데하이드를 형성하는 알데하이드 데하이드로게나아제 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산이 미생물 유기체에 대해 이종인 것인 비천연 미생물 유기체.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 6-아미노카프로산 경로를 포함하는 비천연 미생물 유기체.
  18. 제17항에 있어서, 상기 6-아미노카프로산 경로는 (i) 트랜스아미나아제, (ii) 6-아미노카프로에이트 데하이드로게나아제, 또는 (iii) 트랜스아미나아제 및 6-아미노카프로에이트 데하이드로게나아제 효소 둘 모두를 포함하는 것인 비천연 미생물 유기체.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 6-아미노카프로산 경로 효소 중 하나 이상을 인코딩하는 하나 이상의 추가 외인성 핵산을 추가로 포함하는 비천연 미생물 유기체.
  20. 제19항에 있어서, 상기 6-아미노카프로산 경로 효소 중 하나 이상을 인코딩하는 상기 외인성 핵산은 상기 미생물 유기체에 대해 이종인 것인 비천연 미생물 유기체.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 헥사메틸렌디아민 경로를 포함하는 비천연 미생물 유기체.
  22. 제21항에 있어서, 상기 헥사메틸렌디아민 경로는 (i) 6-아미노아카프로일 CoA 트랜스퍼라아제, (ii) 6-아미노 카프로일 CoA 신타아제, (iii) 6-아미노 카프로일 CoA 리덕타아제, (iv) 헥사메틸렌디아민 트랜스아미나아제, (v) 헥사메틸렌디아민 데하이드로게나아제, 또는 (v) 효소 (i) 내지 (v) 중 하나 이상의 조합을 포함하는 것인 비천연 미생물 유기체.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 헥사메틸렌디아민 경로 효소 중 하나 이상을 인코딩하는 하나 이상의 추가 외인성 핵산을 추가로 포함하는 비천연 미생물 유기체.
  24. 제23항에 있어서, 상기 헥사메틸렌디아민 경로 효소 중 하나 이상을 인코딩하는 상기 외인성 핵산은 상기 미생물 유기체에 대해 이종인 것인 비천연 미생물 유기체.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 카프로락탐 경로를 포함하는 비천연 미생물 유기체.
  26. 제25항에 있어서, 상기 카프로락탐 경로는 아미노하이드롤라아제 효소를 포함하는 것인 비천연 미생물 유기체.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 아미노하이드롤라아제 효소를 인코딩하는 하나 이상의 추가 외인성 핵산을 추가로 포함하는 비천연 미생물 유기체.
  28. 제27항에 있어서, 아미노하이드롤라아제 효소를 인코딩하는 상기 외인성 핵산은 상기 미생물 유기체에 대해 이종인 것인 비천연 미생물 유기체.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 알데하이드 데하이드로게나아제 효소는 원핵생물 종으로부터 유래된 것인 비천연 미생물 유기체.
  30. 제29항에 있어서, 상기 알데하이드 데하이드로게나아제 효소는 아시다미노코쿠스(Acidaminococcus), 콜린셀라(Collinsella), 펩토스트렙토코카세애(Peptostreptococcaceae), 또는 롬보우스트시아(Romboustsia)로부터 유래된 것인 비천연 미생물 유기체.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 아시네토박터(Acinetobacter), 악티노바실러스(Actinobacillus), 아나에로바이오스필리룸(Anaerobiospirillum), 아스페르길루스(Aspergillus), 바실루스(Bacillus), 클로스트리듐(Clostridium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 에셔리키아(Escherichia), 글루코노박터(Gluconobacter), 클렙시엘라(Klebsiella), 클루베로마이세스(Kluyveromyces), 락토코쿠스(Lactococcus), 락토바실루스(Lactobacillus), 만헤이미아(Mannheimia), 피키아(Pichia), 슈도모나스(Pseudomonas), 리조비움(Rhizobium), 리조푸스(Rhizopus), 사카로마이세스(Saccharomyces), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 및 자이모모나스(Zymomonas)의 종을 포함하는 비천연 미생물 유기체.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비천연 미생물 유기체는 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 외인성 핵산을 포함하며, 각각은 6-아미노카프로산 경로, 헥사메틸렌디아민 경로, 카프로락탐 경로, 1,6-헥산디올 경로, 카프로락톤 경로, 또는 2개 이상의 경로의 조합에 대한 효소를 인코딩하는 것인 비천연 미생물 유기체.
  33. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 알데하이드 데하이드로게나아제 효소는 6-아미노카프로일-CoA와 추가로 반응하여 6-아미노카프로에이트 세미알데하이드를 형성하는 것인 비천연 미생물 유기체.
  34. 아디페이트-세미알데하이드를 제조하는 방법으로서, 아디페이트-세미알데하이드를 제조하기 위한 충분한 기간 및 조건으로 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항의 비천연 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 제조 방법.
  35. 6-아미노카프로산(6ACA)을 제조하는 방법으로서, 6ACA를 제조하기 위한 충분한 기간 및 조건으로 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항의 비천연 미생물 유기체를 배양하는 단계를 포함하는 제조 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 미생물 유기체, 발효 브로쓰, 또는 둘 모두로부터 6ACA를 회수하는 단계 추가로 포함하는 제조 방법.
  37. 헥사메틸렌 디아민을 제조하는 방법으로서, 헥사메틸렌 디아민을 제조하기 위한 충분한 기간 및 조건으로 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항의 비천연 미생물 유기체를 배양하는 단계를 포함하는 제조 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 미생물 유기체, 발효 브로쓰, 또는 둘 모두로부터 헥사메틸렌 디아민을 회수하는 단계를 추가로 포함하는 제조 방법.
  39. 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비천연 미생물 유기체는 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 외인성 핵산 서열을 포함하며, 각각은 헥사메틸렌 디아민 경로 효소를 인코딩하는 것인 제조 방법.
  40. 카프로락탐을 제조하는 방법으로서, 카프로락톤, 1,6-헥산디올, 또는 카프로락탐을 제조하기 위한 충분한 기간 및 조건으로 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항의 비천연 미생물 유기체를 배양하는 단계를 포함하는 제조 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 비천연 미생물 유기체, 발효 브로쓰, 또는 둘 모두로부터 카프로락탐을 회수하는 단계를 추가로 포함하는 제조 방법.
  42. 제34항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비천연 미생물 유기체는 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 외인성 핵산을 포함하며, 각각은 카프로락탐 경로 효소를 인코딩하는 것인 제조 방법.
  43. 제34항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양은 당을 포함하는 발효 브로쓰에서 수행되는 것인 제조 방법.
  44. 제34항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비천연 미생물 유기체는 아시네토박터, 악티노바실러스, 아나에로바이오스필리룸, 아스페르길루스, 바실루스, 클로스트리듐, 코리네박테리움, 에셔리키아, 글루코노박터, 클렙시엘라, 클루베로마이세스, 락토코쿠스, 락토바실루스, 만헤이미아, 피키아, 슈도모나스, 리조비움, 리조푸스, 사카로마이세스, 스키조사카로마이세스, 스트렙토마이세스, 및 자이모모나스의 종을 포함하는 것인 제조 방법.
  45. 제34항 내지 제44항 중 어느 한 항의 방법으로 합성된 생체 유래 6-아미노카프로산, 헥사메틸렌디아민, 1,6-헥산디올, 카프로락톤, 또는 카프로락탐.
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