KR20170104489A - 디아민을 제조하고 처리하는 방법 - Google Patents

디아민을 제조하고 처리하는 방법 Download PDF

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KR20170104489A
KR20170104489A KR1020177020317A KR20177020317A KR20170104489A KR 20170104489 A KR20170104489 A KR 20170104489A KR 1020177020317 A KR1020177020317 A KR 1020177020317A KR 20177020317 A KR20177020317 A KR 20177020317A KR 20170104489 A KR20170104489 A KR 20170104489A
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로리 에이치 수오미넨
코너 제이 갤러
마이클 잽스
마크 제이 버크
카라 트레이스웰
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게노마티카 인코포레이티드
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Abstract

본원은 저비용 공정을 제공하기 위해 바람직하지 않은 염 형성을 최소화하는 미생물 발효에 의해 생성된 디아민을 제조하고 단리하는 방법을 제공한다.

Description

디아민을 제조하고 처리하는 방법
우선권 주장
본원은 2015년 8월 28일자로 출원된 미국 가특허출원 제62/211,315호, 2015년 7월 17일자로 출원된 미국 가특허출원 제62/193,693호, 및 2014년 12월 23일자로 출원된 미국 가특허출원 제62/096,309호(각각의 출원의 개시는 본원에 참고로 도입됨)의 이익을 주장한다.
본 발명은 일반적으로 헥사메틸렌디아민(HMD), 카다베린(cadaverine), 푸트레신(putrescine), 에틸렌디아민 및 헵타메틸렌디아민을 포함하는 디아민을 제조하고 단리하고 정제하는 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 디아민, 예를 들면, HMD를 제조하는 미생물을 배양하는 방법, 및 디아민 함유 배양물 또는 배양된 배지로부터 디아민을 단리하는 방법에 관한 것이다. 이러한 디아민 생성물은 폴리아미드를 포함하는 디아민 함유 중합체를 제조하는 데 사용된다.
1,6-디아미노헥산 또는 1,6-헥산디아민으로서도 지칭되는 헥사메틸렌디아민(HMD 또는 HMDA로서 약칭됨)은 화학식 H2N(CH2)6NH2을 가진다. HMD는 화학산업에서 중요한 원료 물질이다. HMD는 예를 들면, 폴리아미드, 폴리우레아 또는 폴리우레탄 및 이들 물질들의 공중합체의 제조에 사용된다. 1,5-디아미노펜탄으로서도 지칭되는 카다베린은 폴리아민 제조를 위한 단량체로서 사용된다. 1,4-디아미노부탄으로서도 지칭되는 푸트레신은 폴리아민 제조를 위한 단량체로서 사용된다. 1,7-디아미노헵탄으로서도 지칭되는 헵타메틸렌디아민은 폴리아민 제조를 위한 단량체로서 사용된다. 에틸렌디아민은 폴리아민 제조를 위한 단량체로서 사용될 뿐만 아니라 다른 화학물질에 대한 전구체로서도 사용된다. 이들 화합물들 및 다른 디아민 또는 이들의 즉시 전구체의 발효 제조를 위한 조작된 미생물이 보고되었다. 전형적으로, 이들의 발효 및 단리 방법은 염 부산물을 생성하는 산 및 염기를 요구한다.
본 발명의 한 실시양태는 배양 또는 발효 공정 동안 외부로부터 첨가되거나 대사적으로 제조된 이산화탄소를 사용하여, 디아민 카보네이트, 디아민 비카보네이트 및/또는 디아민 비스-카보네이트(본원에서 "카보네이트류"로서 총칭함) 중 적어도 하나 이상의 디아민 종, 및 임의적으로 디아민 카바메이트 또는 디아민 비스카바메이트(본원에서 "카바메이트류"로서 총칭함)를 제조한다. 카보네이트 및/또는 카바메이트가 형성될 때, 디아민 종은 중화되고 발효 pH는 조절된다. 미생물의 생장 및 그의 디아민 제조를 위한 탄소원은 이하에 기재된 바와 같이 제공된다. 임의적으로, 이산화탄소(또는 카보네이트, 비카보네이트)는 (CO2 고정을 통한) 미생물을 위한 탄소원 및 디아민을 중화시키는 화합물 둘 다이다. 디아민은 예를 들면, 헥사메틸렌디아민(HMD), 디메틸렌디아민, 트리메틸렌디아민, 카다베린, 푸트레신 또는 헵타메틸렌디아민(2개 내지 7개의 탄소 원자(C2-C7), C3-C7, 바람직하게는 C4-C7 또는 심지어 C4-C12 또는 C2-C12를 갖는 디아민)일 수 있다. 따라서, 디아민 종은 예를 들면, HMD의 경우 HMD 카보네이트, HMD 비카보네이트, HMD 비스-비카보네이트이다. 카바메이트 및 비스카바메이트는 예를 들면, HMD의 경우 HMD 카바메이트 및 HMD 비스카바메이트이다. HMD 종에 대한 화학식은 아래에 제시되어 있다:
Figure pct00001
한 실시양태에서, 본 발명은 배양물 또는 발효 배지, 용액 또는 브로쓰로부터 HMD, 카다베린, 푸트레신 및 헵타메틸렌디아민의 카보네이트류 및 카바메이트류를 포함하는 카보네이트 및/또는 카바메이트의 개선된 단리를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 이산화탄소 및 디아민 유리 염기(예를 들면, HMD 유리 염기, 카다베린 유리 염기, 푸트레신 유리 염기, 헵타메틸렌디아민 유리 염기)를 방출하도록 카보네이트류 및 카바메이트류를 처리한 후, 디아민 유리 염기를 적합한 유기 용매로 추출할 수 있다. 시뮬레이션된 발효 조건 동안 제조된 HMD-카보네이트 및 HMD-카바메이트, 예컨대, HMD 카보네이트, 비카보네이트, 비스-비카보네이트 및 카바메이트 및 비스카바메이트는 CO2 또는 다른 단편을 방출하고 추후에 용매 추출되는 HMD 유리 염기를 생성한다는 것을 발견하였다. 필요에 따라, 디아민 유리 염기 농후 분획을 추가 정제 공정으로 처리한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 디아민(DA)을 제조하는 방법으로서,
a) 배양된 배지에서 DA 카보네이트, DA 비카보네이트, DA 비스-비카보네이트(카보네이트류) 및/또는 DA 카바메이트 또는 DA 비스카바메이트(카바메이트류) 중 하나 이상을 형성하기에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 배지에서 유전적으로 조작된 미생물을 배양하는 단계로서, 이산화탄소, 카보네이트, 비카보네이트 또는 탄산이 배양된 배지로서 배지의 pH를 주로 조절하는 것인 단계;
b) DA 카보네이트, DA 비카보네이트, DA 비스-비카보네이트, DA 카바메이트 또는 DA 비스카바메이트를 HMD 유리 염기 및 이산화탄소로 전환시키는 단계; 및
c) DA 유리 염기를 단리하는 단계
를 포함하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 디아민(DA)을 제조하는 방법으로서,
a) DA 카보네이트, DA 비카보네이트, DA 비스-비카보네이트, DA 카바메이트 및 DA 비스카바메이트 중 하나 이상을 형성하기에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 배지에서 유전적으로 조작된 미생물을 배양하는 단계로서, 용존 무기 탄소 퍼센트(DIC)가 식 DIC/TDCA × 100에 의해 결정되고, DIC %가 40% 이상이고 TDCA가 총 용존 반대 음이온이고 DIC와 다른 음이온의 합계인 단계;
b) DA 카보네이트, DA 비카보네이트, DA 비스-비카보네이트, DA 카바메이트 또는 DA 비스카바메이트를 DA 유리 염기 및 이산화탄소로 전환시키는 단계; 및
c) DA 유리 염기를 단리하는 단계
를 포함하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 디아민(DA)을 제조하는 방법으로서,
a) 배지에서 DA를 제조하고 DA 카보네이트, DA 비카보네이트, DA 비스-비카보네이트(DA 카보네이트류) 및/또는 DA 카바메이트 또는 DA 비스카바메이트(DA 카바메이트류) 중 하나 이상을 형성하기에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 배지에서 유전적으로 조작된 미생물을 배양하는 단계로서, 배지 중의 적어도 40%의 카보네이트류 또는 카바메이트류가 DA 카보네이트, DA 비카보네이트, DA 비스-비카보네이트, DA 카바메이트 및 DA 비스카바메이트 중 하나 이상을 포함하는 것인 단계;
b) 카보네이트류 또는 카바메이트류를 DA 유리 염기 및 이산화탄소로 전환시키는 단계; 및
c) DA 유리 염기를 단리하는 단계
를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 가용성 이온으로 전환되는 CO2 가스의 양 또는 속도를 증가시켜, 보다 큰 양 또는 이용가능성의 이용가능한 가용성 이온을 디아민 또는 HMD에 제공함으로써 디아민 카보네이트 및/또는 디아민 카바메이트(예를 들면, HMDA 카보네이트)의 형성을 촉진하거나 증가시키기 위해 효소 탄산 안하이드라제(CA)를 발효 브로쓰에 첨가할 수 있다. 디아민이 C2 내지 C7 메틸렌 분절, C2 내지 C12 메틸렌 분절 또는 C4 내지 C7 메틸렌 분절을 포함할 때, 예를 들면, 헥사메틸렌디아민(HMD), 카다베린, 푸트레신, 에틸렌디아민 또는 헵타메틸렌디아민일 수 있을 때, 카보네이트, 비카보네이트 또는 비스-비카보네이트를 포함하는 디아민 카보네이트, 및 카바메이트 또는 비스카바메이트를 포함하는 디아민 카바메이트, 또는 이들의 임의의 혼합물의 형성을 증가시키기 위해 CA도 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 탄산 안하이드라제는 하나 이상의 HMD 카보네이트, HMD 비카보네이트, HMD 비스-비카보네이트, HMD 카바메이트 또는 HMD 비스카바메이트를 형성하는 데 사용된다. 탄산 안하이드라제는 가역적 효소이므로, 다른 실시양태에서 DA 유리 염기 및 이산화탄소로의 DA 카보네이트류 또는 DA 카바메이트류의 전환을 촉진하는 데 사용된다.
일부 실시양태에서, 탄산 안하이드라제는 (a) 이산화탄소를 비카보네이트 및/또는 카보네이트 이온으로 전환시킴으로써 DA 카보네이트류 또는 DA 카바메이트류의 형성을 향상시키거나, (b) 비카보네이트 및/또는 카보네이트 이온을 이산화탄소로 전환시킴으로써 DA 카보네이트류 또는 DA 카바메이트류 용액으로부터의 이산화탄소의 방출을 향상시키거나, 또는 (c) (a) 및 (b) 둘 다를 달성하기에 충분한 양으로 존재한다.
CA는 외생적으로 첨가될 수 있거나 유전적으로 조작된 미생물에 의해 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, CA는 DA 합성 경로, 예컨대, HMD 합성 경로를 발현하는 미생물의 일부이다. 다른 실시양태에서, CA는 CA를 생성하는 능력을 갖는 조작된 미생물로서 도입된다.
CA 또는 변이체는 CA 또는 변이체의 부재 하에서의 전환 또는 전환들과 비교될 수 있는, 이온으로의 CO2의 원하는 전환, CO2로의 이온의 원하는 전환, 또는 이들 둘 다를 향상시키기에 충분한 양으로 발현된다. CA 또는 변이체 단백질의 양은 그의 탄산 안하이드라제 활성 및 원하는 향상에 의해 좌우될 것이다. 전형적인 양은 리터당 적어도 0.001 g 내지 리터당 적어도 5 g, 및 적어도 0.01 g/리터, 0.05 g/리터, 0.1 g/리터, 0.2 g/리터, 0.5 g/리터 또는 1 g/리터 내지 적어도 5 g/리터, 예를 들면, 0.05 내지 0.2 g/리터의 범위 내에 있을 수 있다.
대안적인 실시양태는 배지 중의 적어도 50%의 카보네이트 및/또는 카바메이트가 DA 카보네이트, DA 비카보네이트, DA 비스-비카보네이트, DA 카바메이트 및 DA 비스카바메이트(예를 들면, HMDA 카보네이트, HMDA 비카보네이트, HMDA 비스-비카보네이트, HMDA 카바메이트 및 HMDA 비스카바메이트) 중 하나 이상을 포함하는 공정; 배지 중의 적어도 60%의 카보네이트 및/또는 카바메이트가 DA 카보네이트, DA 비카보네이트, DA 비스-비카보네이트, DA 카바메이트 및 DA 비스카바메이트(예를 들면, HMDA 카보네이트, HMDA 비카보네이트, HMDA 비스-비카보네이트, HMDA 카바메이트 및 HMDA 비스카바메이트) 중 하나 이상을 포함하는 공정; 배지 중의 적어도 70%의 카보네이트 및/또는 카바메이트가 DA 카보네이트, DA 비카보네이트, DA 비스-비카보네이트, DA 카바메이트 및 DA 비스카바메이트(예를 들면, HMDA 카보네이트, HMDA 비카보네이트, HMDA 비스-비카보네이트, HMDA 카바메이트 및 HMDA 비스카바메이트) 중 하나 이상을 포함하는 공정; 배지 중의 적어도 80%의 카보네이트 및/또는 카바메이트가 DA 카보네이트, DA 비카보네이트, DA 비스-비카보네이트, DA 카바메이트 및 DA 비스카바메이트(예를 들면, HMDA 카보네이트, HMDA 비카보네이트, HMDA 비스-비카보네이트, HMDA 카바메이트 및 HMDA 비스카바메이트) 중 하나 이상을 포함하는 공정; 배지 중의 적어도 90%의 카보네이트 및/또는 카바메이트가 DA 카보네이트, DA 비카보네이트, DA 비스-비카보네이트, DA 카바메이트 및 DA 비스카바메이트(예를 들면, HMDA 카보네이트, HMDA 비카보네이트, HMDA 비스-비카보네이트, HMDA 카바메이트 및 HMDA 비스카바메이트) 중 하나 이상을 포함하는 공정; 또는 배지 중의 적어도 99.9%의 카보네이트 및/또는 카바메이트가 DA 카보네이트, DA 비카보네이트, DA 비스-비카보네이트, DA 카바메이트 및 DA 비스카바메이트(예를 들면, HMDA 카보네이트, HMDA 비카보네이트, HMDA 비스-비카보네이트, HMDA 카바메이트 및 HMDA 비스카바메이트) 중 하나 이상을 포함하는 공정이다. 일부 실시양태에서, 카보네이트는 우세한 디아민 종이고 적어도 50%, 최대 적어도 90%의 DA 종을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 유전적으로 조작된 미생물은 이산화탄소, 카보네이트, 비카보네이트 및 탄산 중 하나 이상도 형성한다. 유전적으로 조작된 미생물에 의해 형성된 이산화탄소, 카보네이트, 비카보네이트 또는 탄산은 카보네이트류 및/또는 카바메이트류형성으로부터의 화학량론적 이산화탄소를 포함할 수 있거나, 유전적으로 조작된 미생물에 의해 형성된 이산화탄소, 카보네이트, 비카보네이트 또는 탄산은 호흡 이산화탄소 또는 부산물 이산화탄소를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 호흡 이산화탄소는 예를 들면, TCA 사이클의 완료, 글리옥실레이트 션트(shunt), 펜토스 포스페이트 경로(예를 들면, gnd(6-포스포글루코네이트를 리불로아스-5-포스페이트 및 CO2로 전환시키는 6-포스포글루코네이트 데하이드로게나제) 및 엔트너 듀오도로프(Entner Duodoroff) 경로로부터 선택된 적어도 하나의 경로로부터 형성된다. 다른 실시양태에서, 부산물 이산화탄소는 아세테이트, 에탄올, 석시네이트, 3-옥소아디페이트 및 3-하이드록시아디페이트를 포함하는 부산물의 형성과 관련되어 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이, 디아민 합성 경로를 포함하고 임의적으로 CO2를 생성하는 유전적으로 조작된 미생물은 특히, 이 미생물이 CA를 발현할 수 있는 핵산 서열을 갖도록 조작되어 있는 경우 CA 효소를 추가로 포함할 수 있다. 따라서, C2 내지 C7 메틸렌 분절, C2 내지 C12 메틸렌 분절, 또는 C4 내지 C7 메틸렌 분절을 포함하는 디아민, 예를 들면, 헥사메틸렌디아민(HMD), 카다베린, 푸트레신, 에틸렌디아민 또는 헵타메틸렌디아민인 디아민을 생성하는 합성 경로를 포함하는 조작된 미생물은 특히, 이 미생물이 CA를 발현할 수 있는 핵산 서열을 갖도록 조작되어 있는 경우 CA 효소를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전적으로 조작된 미생물은 헥사메틸렌디아민 합성 및 CA를 발현할 수 있는 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 유전적으로 조작된 미생물은 CA를 발현할 수 있는 서열을 포함한다. CA는 천연 상태일 수 있거나, 예컨대, 활성, 또는 열적 안정성 및 알칼리 pH 안정성을 비롯한 안정성을 증가시키도록 유전적으로 조작될 수 있다. 바람직하게는, 알칼리 pH는 약 pH 8 내지 13, pH 8.5 내지 13, pH 9 내지 13, pH 10 내지 13, pH 8 내지 12, pH 8.5 내지 12, pH 9 내지 12, pH 8 내지 11, pH 8.5 내지 11, pH 9 내지 11, pH 10 내지 11 및 pH 10 내지 12이다.
일부 실시양태에서, 유전적으로 조작된 미생물은 약 0.05 대 1 내지 약 7 대 1의 비로 이산화탄소 및 헥사메틸렌디아민을 형성한다. 다른 실시양태에서, 유전적으로 조작된 미생물은 약 0.05 대 1 내지 약 5 대 1의 비, 약 0.05 대 1 내지 약 3.5 대 1의 비, 약 0.05 대 1 내지 약 3 대 1의 비, 약 0.05 대 1 내지 약 2 대 1의 비, 약 0.05 대 1 내지 약 1.5 대 1의 비, 약 0.05 대 1 내지 약 1 대 1의 비, 또는 약 0.2 대 1 내지 약 3 대 1의 비로 이산화탄소 및 헥사메틸렌디아민을 형성한다.
일부 실시양태에서, 유전적으로 조작된 미생물은 적어도 하나의 HMD 카보네이트류 및/또는 카바메이트류화합물을 생성하기에 충분한 양으로 발현되는, HMD 합성 경로의 적어도 하나의 효소를 코딩하는 적어도 하나의 외생성 핵산을 갖는 HMD 합성 경로를 포함한다. 다른 실시양태에서, 유전적으로 조작된 미생물은 적어도 하나의 HMD 카보네이트류 및/또는 카바메이트류화합물을 생성하기에 충분한 양으로 발현되는, HMD 합성 경로의 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 11개의 효소를 코딩하는 적어도 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 11개의 외생성 핵산을 갖는 HMD 합성 경로를 포함한다.
일부 실시양태에서, HMD 합성 경로는 3-옥소아디필-CoA, 아디페이트 세미알데하이드, 6-아미노카프로레이트(6-ACA), 6-ACA 세미알데하이드, 2-아미노피멜레이트, 3,6-디하이드록시헥사노일-CoA 및 호모라이신으로 구성된 군으로부터 선택되는 중간체 화합물을 포함한다.
일부 실시양태에서, HMD 합성 경로는 3-옥소아디필-CoA 티올라제(thiolase), 6-ACA 트랜스아미나제(transaminase) 또는 데하이드로게나제(dehydrogenase), 6-아미노카프로일-CoA 리덕타제(reductase), 6-ACA 리덕타제, 아디필-CoA 리덕타제, 아디페이트 리덕타제, 6-하이드록시 3-옥소헥사노일-CoA 데하이드로게나제, 2-아미노피멜레이트 데카복실라제 및 호모라이신 데카복실라제(decarboxylase)로 구성된 군으로부터 선택되는 효소를 포함한다.
일부 실시양태에서, HMD 합성 경로는 석시닐-CoA 및 아세틸-CoA에 작용하여 3-옥소아디필-CoA를 제조하는 3-옥소아디필-CoA 티올라제, 아디필-CoA에 작용하여 6-ACA를 형성하는 6-ACA 트랜스아미나제, 6-아미노카프로아일-CoA에 작용하여 6-ACA 세미알데하이드를 형성하는 6-아미노카프로일-CoA 리덕타제, 6-ACA에 작용하고 이를 6-ACA 세미알데하이드로 직접적으로 전환시키는 6-ACA 리덕타제, 아디필-CoA에 작용하여 아디페이트 세미알데하이드를 형성하는 아디필-CoA 리덕타제, 아디페이트에 작용하고 이를 아디페이트 세미알데하이드로 직접적으로 전환시키는 아디페이트 리덕타제, 6-하이드록시 3-옥소헥사노일-CoA를 환원시켜 3,6-디하이드록시 헥사노일-CoA를 형성하는 6-하이드록시 3-옥소헥사노일-CoA 데하이드로게나제, 2-아미노피멜레이트를 탈카복실화하여 6-ACA를 형성하는 2-아미노피멜레이트 데카복실라제, 및 호모라이신을 탈카복실화하여 HMD를 형성하는 호모라이신 데카복실라제로 구성된 군으로부터 선택되는 효소 및 기질-생성물 쌍을 포함한다.
일부 실시양태에서, HMD 합성 경로는 하기 경로 (a) 내지 (m)의 군으로부터 선택된다:
(a) 3-옥소아디필-CoA 티올라제, 3-옥소아디필-CoA 데하이드로게나제, 3-하이드록시아디필-CoA 데하이드라타제(dehydratase), 5-카복시-2-펜테노일-CoA 리덕타제, 아디필-CoA 리덕타제, 6-ACA 트랜스아미나제 또는 데하이드로게나제, 6-ACA 트랜스퍼라제(transferase) 또는 신세타제(synthetase) 및 6-ACA-CoA 리덕타제, 또는 6-ACA 리덕타제, HMDA 트랜스아미나제 또는 데하이드로게나제;
(b) 3-옥소아디필-CoA 티올라제, 3-옥소아디필-CoA 데하이드로게나제, 3-하이드록시아디필-CoA 데하이드라타제, 5-카복시-2-펜테노일-CoA 리덕타제, 아디필-CoA 리덕타제, 6-ACA 트랜스아미나제 또는 데하이드로게나제, 6-ACA 리덕타제, HMDA 트랜스아미나제 또는 데하이드로게나제;
(c) 3-옥소아디필-CoA 티올라제, 3-옥소아디필-CoA 데하이드로게나제, 3-하이드록시아디필-CoA 데하이드라타제, 5-카복시-2-펜테노일-CoA 리덕타제, 아디필-CoA 트랜스퍼라제, 하이드롤라제(hydrolase) 또는 트랜스퍼라제, 아디페이트 리덕타제, 6-ACA 트랜스아미나제 또는 데하이드로게나제, 6-ACA 트랜스퍼라제 또는 신세타제, 6-ACA-CoA 리덕타제, HMDA 트랜스아미나제 또는 데하이드로게나제;
(d) 3-옥소아디필-CoA 티올라제, 3-옥소아디필-CoA 데하이드로게나제, 3-하이드록시아디필-CoA 데하이드라타제, 5-카복시-2-펜테노일-CoA 리덕타제, 아디필-CoA 트랜스퍼라제, 하이드롤라제 또는 트랜스퍼라제, 아디페이트 리덕타제, 6-ACA 트랜스아미나제 또는 데하이드로게나제, 6-ACA 리덕타제, HMDA 트랜스아미나제 또는 데하이드로게나제;
(e) 3-옥소아디필-CoA 티올라제, 3-옥소아디페이트 데하이드로게나제, 3-하이드록시아디페이트 데하이드라타제, 5-카복시-2-펜테노에이트 리덕타제, 아디페이트 리덕타제, 6-ACA 트랜스아미나제 또는 데하이드로게나제, 6-ACA 트랜스퍼라제 또는 신세타제, 6-ACA-CoA 리덕타제, HMDA 트랜스아미나제 또는 데하이드로게나제;
(f) 3-옥소아디필-CoA 티올라제, 3-옥소아디페이트 데하이드로게나제, 3-하이드록시아디페이트 데하이드라타제, 5-카복시-2-펜테노에이트 리덕타제, 아디페이트 리덕타제, 6-ACA 트랜스아미나제 또는 데하이드로게나제, 6-ACA 리덕타제, HMDA 트랜스아미나제 또는 데하이드로게나제;
(g) 3-옥소아디필-CoA 티올라제, 3-옥소아디페이트 데하이드로게나제, 3-하이드록시아디페이트 데하이드라타제, 5-카복시-2-펜테노에이트 리덕타제, 아디필-CoA 트랜스퍼라제, 하이드롤라제 또는 트랜스퍼라제, 아디필-CoA 리덕타제, 6-ACA 트랜스아미나제 또는 데하이드로게나제, 6-ACA 트랜스퍼라제 또는 신세타제, 6-ACA-CoA 리덕타제, HMDA 트랜스아미나제 또는 데하이드로게나제;
(h) 3-옥소아디필-CoA 티올라제, 3-옥소아디페이트 데하이드로게나제, 3-하이드록시아디페이트 데하이드라타제, 5-카복시-2-펜테노에이트 리덕타제, 아디필-CoA 트랜스퍼라제, 하이드롤라제 또는 트랜스퍼라제, 아디필-CoA 리덕타제, 6-ACA 트랜스아미나제 또는 데하이드로게나제, 6-ACA 리덕타제, HMDA 트랜스아미나제 또는 데하이드로게나제;
(i) 4-하이드록시-2-옥소헵탄-1,7-디오에이트(HODH 알돌라제(aldolase)); 2-옥소헵트-4-엔-1,7-디오에이트(OHED) 하이드라타제(hydratase); OHED 포르메이트-라이아제(lyase) 및 피루베이트 포르메이트-라이아제 활성화 효소 또는 OHED 데하이드로게나제; 2,3-데하이드로아디필-CoA 리덕타제; 아디필-CoA 데하이드로게나제; 또는 아디페이트 세미알데하이드 아미노트랜스퍼라제(aminotransferase) 또는 아디페이트 세미알데하이드 옥시도리덕타제(oxidoreductase)(아미노화);
(j) β-케토티올라제(ketothiolase) 또는 아세틸-CoA 카복실라제(carboxylase) 및 아세토아세틸-CoA 신타제(synthase), 3-하이드록시아실-CoA 데하이드로게나제 또는 3-옥소아실-CoA 리덕타제, 에노일-CoA 하이드라타제, 및 헥사노일-CoA를 생성하기 위한 트랜스-2-에노일-CoA 리덕타제; 티오에스터라제(thioesterase), 알데하이드 데하이드로게나제 및 부탄알 데하이드로게나제 중 하나 이상, 상기 숙주가 헥산알 또는 헥사노에이트를 생성함; 모노옥시게나제(monooxygenase), 알코올 데하이드로게나제, 알데하이드 데하이드로게나제, 6-하이드록시헥사노에이트 데하이드로게나제, 5-하이드록시펜타노에이트 데하이드로게나제, 4-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제, 6-옥소헥사노에이트 데하이드로게나제 및 7-옥소헵타노에이트 데하이드로게나제 중 하나 이상, 상기 숙주가 아디프산 또는 아디페이트 세미알데하이드를 생성함; 모노옥시게나제, 트랜스아미나제, 6-하이드록시헥사노에이트 데하이드로게나제, 5-하이드록시펜타노에이트 데하이드로게나제, 4-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제 및 알코올 데하이드로게나제 중 하나 이상, 상기 숙주가 6-아미노헥사노에이트를 생성함; 카복실레이트 리덕타제, ω-트랜스아미나제, 데아세틸라제(deacetylase), N-아세틸 트랜스퍼라제 및 알코올 데하이드로게나제 중 하나 이상, 상기 숙주가 헥사메틸렌디아민을 생성함;
(k) 6-하이드록시-3-옥소-헥사노일-CoA를 형성하는 아세틸트랜스퍼라제 또는 티올라제, 6-하이드록시-3-옥소-헥사노일-CoA 데하이드로게나제, 3,4-디하이드록시헥사노일-CoA 데하이드라타제, 6-하이드록시-2-헥사노일-CoA 리덕타제, 6-ACA를 형성하는 6-하이드록시헥사노일-CoA 하이드롤라제, 6-하이드록시카프로에이트 데하이드로게나제 및 HMDA를 형성하는 트랜스아미나제;
(l) 2-케토피멜레이트를 형성하는 호모시트레이트 신타제, 호모아코니타제(homoaconitase) 및 호모이소시트레이트 데하이드로게나제, 아디페이트 세미알데하이드로의 α-케토피멜레이트의 전환을 촉진하는 2-케토 데카복실라제, 2-아미노피멜레이트로의 α-케토피멜레이트의 전환을 촉진하는 2-아미노트랜스퍼라제, 2-아미노피멜레이트를 탈카복실화하고 6-ACA를 형성하는 2-아미노피멜레이트 데카복실라제, 6-아미노헥산알로의 6-ACA의 전환을 촉진하는 알데하이드 데하이드로게나제, 및 6-헥사메틸렌디아민으로의 6-아미노헥산알의 전환을 촉진하는 아미노트랜스퍼라제; 및
(m) 글루타밀-CoA 트랜스퍼라제 및/또는 리가제(ligase), 베타-케토티올라제, 3-옥소-6-아미노피멜로일-CoA 옥시도리덕타제, 3-하이드록시-6-아미노피멜로일-CoA 데하이드라타제, 6-아미노-7-카복시헵트-2-에노일-CoA 리덕타제, 6-아미노피멜로일-CoA 리덕타제(알데하이드 형성), 2-아미노-7-옥소헵타노에이트 아미노트랜스퍼라제 및/또는 아미노화 옥시도리덕타제, 호모라이신 데카복실라제, 6-아미노피멜로일-CoA 하이드롤라제, 트랜스퍼라제 및/또는 리가제, 2-아미노피멜레이트 데카복실라제.
전술된 대안적 경로들에서 실시양태들 중 임의의 실시양태에서, 적합한 효소는 3-옥소아디필-CoA 티올라제, 3-옥소아디필-CoA 데하이드로게나제, 3-하이드록시아디필-CoA 데하이드라타제, 5-카복시-2-펜테노일-CoA 리덕타제, 아디필-CoA 리덕타제, 6-ACA 트랜스아미나제 또는 데하이드로게나제, 3-옥소아디필-CoA:아실 CoA 트랜스퍼라제, 3-옥소아디페이트 데하이드로게나제, 3-하이드록시아디페이트 데하이드라타제, 5-카복시-2-펜테노에이트 리덕타제, 아디필-CoA 트랜스퍼라제, 라이가제(lygase) 또는 하이드롤라제, 6-ACA 트랜스퍼라제 또는 신세타제, 6-ACA-CoA 리덕타제, HMDA 트랜스아미나제 또는 데하이드로게나제, 아디페이트 리덕타제, 6-ACA 트랜스아미나제 또는 데하이드로게나제, 및 6-ACA 리덕타제로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 유전적으로 조작된 미생물은 에스케리키아(Escherichia) 및 클렙시엘라(Klebsiella) 속; 아내로바이오스피릴룸(Anaerobiospirillum) 속을 포함하는, 에어로모나달레스(Aeromonadales) 목, 석시니비브리오나세에(Succinivibrionaceae) 과; 악티노바실러스(Actinobacillus) 및 만헤이미아(Mannheimia) 속을 포함하는, 파스테우렐라레스(Pasteurellales) 목, 파스테우렐라세에(Pasteurellaceae) 과; 리조븀(Rhizobium) 속을 포함하는, 리조비알레스(Rhizobiales) 목, 브라디리조비아세에(Bradyrhizobiaceae) 과; 바실러스(Bacillus) 속을 포함하는, 바실라레스(Bacillales) 목, 바실라세에(Bacillaceae) 과; 각각 코리네박테륨(Corynebacterium) 속 및 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속을 포함하는, 악티노마이세탈레스(Actinomycetales) 목, 코리네박테리아세에(Corynebacteriaceae) 및 스트렙토마이세타세에(Streptomycetaceae) 과; 글루코노박터(Gluconobacter) 속을 포함하는, 로도스피릴라레스(Rhodospirillales) 목, 아세토박터라세에(Acetobacteraceae) 과; 자이모모나스(Zymomonas) 속을 포함하는, 스핑고모나달레스(Sphingomonadales) 목, 스핑고모나다세에(Sphingomonadaceae) 과; 각각 락토바실러스(Lactobacillus) 속 및 락토코커스(Lactococcus) 속을 포함하는, 락토바실라레스(Lactobacillales) 목, 락토바실라세에(Lactobacillaceae) 및 스트렙토코카세에(Streptococcaceae) 과; 클로스트리디알레스(Clostridiales) 목, 클로스트리디아세에(Clostridiaceae) 과, 클로스트리듐(Clostridium) 속; 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 알칼리필러스(Alkaliphilus) 속, 메틸로박테륨(Methylobacterium), 메틸로버사틸리스(Methyloversatilis), 메틸로코커스(Methylococcus), 메틸로사이스티스(Methylocystis) 및 하이포마이크로븀(Hyphomicrobium)을 포함하는, 슈도모나달레스(Pseudomonadales) 목, 슈도모나다세에(Pseudomonadaceae) 과; 사카로마이세스(Saccharomyces), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 및 피키아(Pichia) 속을 포함하는, 사카로마이세탈레스(Saccharomycetales) 목, 사카로마이세타세에(Saccaromycetaceae) 과; 야로위아(Yarrowia) 속을 포함하는, 사카로마이세탈레스(Saccharomycetales) 목, 디포다스카세에(Dipodascaceae) 과; 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 속을 포함하는, 스키조사카로마이세탈레스(Schizosaccharomycetales) 목, 스키조사카로마이세타세에(Schizosaccaromycetaceae) 과; 아스퍼질러스(Aspergillus) 속을 포함하는, 유로티알레스(Eurotiales) 목, 트리코코마세에(Trichocomaceae) 과; 및 리조퍼스(Rhizopus) 속을 포함하는, 뮤코랄레스(Mucorales) 목, 뮤코라세에(Mucoraceae) 과를 포함한다.
다른 실시양태에서, 유전적으로 조작된 미생물은 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 클렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 아내로바이오스피릴룸 석시니시프로두센스(Anaerobiospirillum succiniciproducens), 악티노바실러스 석시노제네스(Actinobacillus succinogenes), 만헤이미아 석시니시프로두센스(Mannheimia succiniciproducens), 리조븀 에틀리(Rhizobium etli), 코리네박테륨 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxydans), 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 스트렙토마이세스 코엘리칼러(Streptomyces coelicolor), 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) 및 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 바실리스 슈도퍼머스(Bacillis pseudofirmus), 바실러스 할로두란스(Bacillus halodurans), 바실러스 알칼로필러스(Bacillus alcalophilus), 클로스트리듐 파라독숨(Clostridium paradoxum), 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 피키아 메탄올리카(Pichia methanolica), 칸디다 보이디니이(Candida boidinii), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 클루이베로마이세스 막시아너스(Kluyveromyces marxianus), 아스퍼질러스 테레우스(Aspergillus terreus), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 리조퍼스 아리저스(Rhizopus arrhizus), 리조버스 오리제(Rhizobus oryzae), 야로위아 리포라이티카(Yarrowia lipolytica), 및 이사첸키아 오리엔탈리스(Issatchenkia orientalis)를 포함한다.
알칼리파일즈(alkaliphiles)의 일부 실시양태는 바실리스 슈도퍼머스(Bacillis pseudofirmus), 바실러스 할로두란스(Bacillus halodurans), 바실러스 알칼로필러스(Bacillus alcalophilus), 클로스트리듐 파라독숨(Clostridium paradoxum), 아쓰로스피라 플라텐시스(Arthrospira platensis), 바실러스 클라우시이(Bacillus clausii), 오세아노바실러스 이헤이엔시스(Oceanobacillus iheyensis), 알칼리필러스 메탈리레디젠스(Alkaliphilus metalliredigens), 알칼리필러스 오렘란디이(Alkaliphilus oremlandii), 바실러스 셀렌티리듀센스(Bacillus selentireducens), 데설포비브리오 알칼리파일즈(Desulfovibrio alkaliphiles), 데티오박터 알칼리파일즈(Dethiobacter alkaliphiles), 티오알칼리비브리오(Thioalkalivibrio) 종, 나트라내로비우스 써모필러스(Natranaerobius thermophilus), 알칼리림니콜라 에를리키이(Alkalilimnicola ehrlichii) 및 데설포나트로노스피라 티오디스뮤탄스(Desulfonatronospira thiodismutans)이다.
일부 실시양태에서, 배양 배지 발효는 완충제를 실질적으로 갖지 않을 수 있거나, 무기산 또는 유기산을 실질적으로 갖지 않을 수 있거나, 외부로부터 첨가된 무기산 또는 유기산을 실질적으로 갖지 않을 수 있거나, DIC를 실질적으로 갖지 않을 수 있다.
일부 실시양태에서, 배지 및/또는 배양된 배지 pH는 배양 배지에 첨가된 이산화탄소 양에 의해 조절되거나, 대안적으로 배양된 배지 pH는 유전적으로 조작된 미생물에 의해 형성된 이산화탄소의 양에 의해 조절된다. 일부 실시양태에서, 배지는 11 미만, 10 미만, 9 미만 또는 8 미만의 pH를 갖고/갖거나, 배양된 배지는 11 미만, 10 미만, 9 미만 또는 8 미만의 pH까지 조절된다. 다른 실시양태에서, 배지는 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6 또는 적어도 7의 pH를 갖고/갖거나, 배양된 배지는 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6 또는 적어도 7의 pH까지 조절된다. 다른 실시양태에서, 배지는 약 6 내지 9.5의 pH, 약 6 내지 9의 pH, 약 6 내지 8의 pH, 약 7 내지 9의 pH, 또는 약 8 내지 9의 pH를 갖고/갖거나, 배양된 배지는 약 6 내지 9.5의 pH, 약 6 내지 9의 pH, 약 6 내지 8의 pH, 약 7 내지 9의 pH, 또는 약 8 내지 9의 pH까지 조절된다.
다른 실시양태에서, 배지는 수크로스, 글루코스, 갈락토스, 프럭토스, 전분, 만노스, 이소말토스, 자일로스, 판노스, 말토스, 아라비노스, 셀로바이오스 및 이들의 3-올리고머, 4-올리고머 또는 5-올리고머로 구성된 군으로부터 선택된, 유전적으로 조작된 미생물을 위한 당 탄소원을 포함하거나, 배지는 메탄올, 에탄올, 글리세롤, 포르메이트 및 지방산으로 구성된 군으로부터 선택된, 유전적으로 조작된 미생물을 위한 알코올 탄소원을 포함하거나, 배지는 합성 가스, 폐가스, 메탄, CO, CO2, 및 CO 또는 CO2와 H2의 임의의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된, 유전적으로 조작된 미생물을 위한 가스로부터 수득된 탄소원을 포함한다.
일부 실시양태에서, 카보네이트 및/또는 카바메이트는 이산화탄소를 생성함으로써 유리 염기, 예를 들면, 헥사메틸렌디아민 유리 염기로 전환된다. 일부 실시양태에서, 카보네이트 및/또는 카바메이트는 가열에 의해 유리 염기로 전환되거나, 카보네이트 및/또는 카바메이트는 진공에 의해 유리 염기로 전환되거나, 카보네이트 및/또는 카바메이트는 압력에 의해 유리 염기로 전환되거나, 카보네이트 및/또는 카바메이트는 이온 교환에 의해 유리 염기로 전환되거나, 카보네이트 및/또는 카바메이트는 증기 스트립핑에 의해 유리 염기로 전환되거나, 카보네이트 및/또는 카바메이트는 양극성 막을 사용한 전기투석에 의해 유리 염기로 전환된다. 다른 실시양태에서, 유리 염기로의 전환은 탄산 안하이드라제 효소의 첨가에 의해 가속화되거나 향상된다. 탄산 안하이드라제는 가열 또는 다른 단계가 DA 카보네이트류 및/또는 DA 카바메이트류를 유리 DA 및 이산화탄소로 전환하는 데 사용될 때 유리 염기로의 방출을 가속화하거나 향상시키는 데 사용될 수도 있다.
일부 실시양태에서, 추출 용매를 사용하여 배지로부터 디아민 유리 염기(예를 들면, HMD)를 단리하고, 추출된 디아민을 증류로 추출 용매로부터 분리한다. 일부 실시양태에서, 추출 용매는 알코올, 아민, 에테르 및 케톤으로 구성된 군으로부터 선택된다. 적합한 추출 용매는 C4-C8 1가 알코올, 예컨대, 부탄올, 헥산알, 1-헥산올, 이소펜탄올 또는 사이클로헥산올, 또는 대안적으로 톨루엔 또는 에틸 에테르 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 알칸은 특히 HMD 유리 염기의 경우 실시예에서 입증된 적합한 용매이다. 알칸, 구체적으로 헥산은 극도로 낮은 수용성으로 인해 스크리닝된 후 시험되었다. 헥산은 물이 존재한다 하더라도 물을 거의 추출하지 않았고 이용가능한 유리 염기의 적정한 회수를 제공하였다. 따라서, 알칸은 디아민 유리 염기의 회수에 사용되기에 적합한 용매이다. 적합한 알칸은 선형 또는 분지형 C5-C12를 포함한다. 한 실시양태에서, 추출될 디아민 및 용매로서 선택된 알칸 둘 다가 동일한 수의 탄소 원자를 가질 것이다. 헵탄은 특히 HMD의 경우 또 다른 적합한 알칸이고, 이것은 하기 인 실리코(in silico) 모델링 연구에 의해 더 뒷받침된다. 헥산 및 헵탄의 이성질체가 적합하다. 헥산 이성질체는 2-메틸펜탄, 3-메틸펜탄, 2,2-디메틸부탄 및 2,3-디메틸부탄이다. 헵탄 이성질체는 2-메틸헥산, 3-메틸헥산, 2,2-디메틸펜탄, 2,3-디메틸펜탄, 2,4-디메틸펜탄, 3,3-디메틸펜탄, 3-에틸펜탄 및 2,2,3-트리메틸부탄이다.
일부 실시양태에서, 유전적으로 조작된 미생물은 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 코리네박테륨 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 바실리스 슈도퍼머스(Bacillis pseudofirmus), 바실러스 할로두란스(Bacillus halodurans), 바실러스 알칼로필러스(Bacillus alcalophilus), 클로스트리듐 파라독숨(Clostridium paradoxum) 또는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)이다. 다른 실시양태에서, 유전적으로 조작된 미생물은 개선된 알칼리 내성을 위해 변경된다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 의해 제조된 DA, 예를 들면, HMD는 DA 카보네이트, DA 비카보네이트, DA 비스-비카보네이트 및 DA 카바메이트 불순물 중 하나 이상을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 방법에 의해 제조된 디아민, 예를 들면, HMD를 포함하는 중합체, 예를 들면, 폴리아미드, 예를 들면, PA66은 불순물로서 DA 카보네이트, DA 비카보네이트, DA 비스-비카보네이트, DA 카바메이트 및 DA 비스카바메이트(예를 들면, HMD 카보네이트, HMD 비카보네이트, HMD 비스-비카보네이트, HMD 카바메이트 및 HMD 비스카바메이트) 중 하나 이상을 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 디아민 합성 경로, 예를 들면, HMD 합성 경로의 적어도 하나의 효소를 코딩하는 적어도 하나의 외생성 핵산을 갖는 디아민 합성 경로, 예를 들면, 헥사메틸렌디아민 합성 경로, 및 CO2 이용가능성을 향상시키거나 증가시키는 유전적 변경이 없는 유전적으로 조작된 미생물에 비해 CO2 이용가능성을 향상시키거나 증가시켜, 디아민 카보네이트 및/또는 카바메이트, 예를 들면, HMD 카보네이트 및/또는 카바메이트의 생성을 증가시키는 적어도 하나의 유전적 변경을 포함하는 유전적으로 조작된 미생물일 수 있다. 한 실시양태에서, 디아민, 예를 들면, HMD 합성 경로의 적어도 하나의 효소 및 적어도 하나의 탄산 안하이드라제 효소를 코딩하는 적어도 하나의 외생성 핵산을 갖는 디아민, 예를 들면, 헥사메틸렌디아민 합성 경로를 포함하는 유전적으로 조작된 미생물은 CA 효소가 없는 유전적으로 조작된 미생물에 비해 디아민, 예를 들면, HMD 카보네이트 및/또는 카바메이트의 생성을 증가시키는 데 사용된다. CA 발현 미생물은 CO2 이용가능성을 증가시키는 적어도 하나의 유전적 변경을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 실시양태들 중 임의의 실시양태에서, 방출된 이산화탄소, 추출 용매 및/또는 물은 재순환될 수 있다. 다른 실시양태에서, CA는 재순환될 수 있다.
상기 실시양태들에 기재된 본 배양, 전환 및 단리 공정 단계 이외에, 본 발명은 대안적 및 임의적 공정 단계도 포함한다. 일부 실시양태에서, 배양된 배지 또는 용액은 DA 유리 염기를 단리하기 전 및/또는 카보네이트 및/또는 카바메이트를 DA 유리 염기로 전환시키기 전에 공정 동안 고체 및 물을 제거하도록 처리될 수 있다. 다른 실시양태에서, 배양된 배지는 바람직하게는 DA 유리 염기를 단리하기 전에 물을 제거하도록 처리될 수 있다. 다른 실시양태에서, DA 유리 염기는 배양된 배지 또는 용액으로부터 직접적으로 증류될 수 있다. 다른 실시양태에서, DA 유리 염기는 추출 용매가 증류에 의해 제거된 후 더 처리될 수 있고/있거나 정제될 수 있다. 다른 실시양태에서, 물 제거 또는 감소 및 DA 유리 염기(예를 들면, HMD 유리 염기)로의 카보네이트 및/또는 카바메이트의 전환은 동일한 단위 조작으로 동시에 및/또는 순차적으로 일어난다. 예를 들면, 존재하는 경우 스트립퍼 유닛(예를 들면, 불활성 가스 또는 증기)을 이용하여 물 및 CO2 둘 다를 제거하거나 감소시켜 유리 염기를 생성할 수 있다. 추가로 예를 들면, 존재하는 경우 물 증발기 유닛을 이용하여 물 및 CO2 둘 다를 제거하거나 감소시켜 유리 염기를 생성할 수 있다. CA는 디아민 카보네이트 및/또는 카바메이트의 형성을 위한 발효 동안 존재할 수 있거나, CO2의 방출 단계 또는 단계들 동안 존재할 수 있거나, 이들 단계들 중 어느 하나 또는 둘 다에서 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, CA는 재순환될 수 있다. 이들 대안적 및/또는 임의적 공정 단계는 이하에 상세히 기재되어 있다.
도 1은 디아민을 제조하는 본 발명의 한 실시양태를 보여주는 순서도이다.
도 2는 디아민을 제조하는 본 발명의 또 다른 실시양태를 보여주는 순서도이다.
도 3은 디아민을 제조하는 발효 공정의 본 발명의 또 다른 실시양태를 보여주는 도식적 순서도이다.
도 4는 디아민을 제조하고 처리하기 위한 실시양태에서 단계들의 블록 선도이다. 각각의 상자 내의 숫자는 다음과 같다:
1: 생성물 발효
2: 미생물 불활성화/가열 사멸은 승온으로 인한 이산화탄소 및 유리 염기의 부분적 방출을 초래할 수 있다.
3: 고체 제거
4: 이산화탄소 및 유리 염기로의 카보네이트/카바메이트 전환. 이산화탄소는 임의적으로, 발효기로 재순환된다.
5: 물 제거. 물은 임의적으로 생성물 발효 단계로 재순환된다. 물 제거 단계가 이산화탄소 및 유리 염기를 방출할 수 있는 조건을 포함하는 경우 이산화탄소도 재순환될 수 있다.
6: 용매 추출. 수성 라피네이트는 임의적으로 카보네이트/카바메이트 전환 단계로 재순환된다.
7: 정제는 유기 용매를 상자(6) 쪽으로 다시 재순환시키는 증류를 포함하고; HMD를 정제하기 위한 더 많은 증류 컬럼 및 발색 화합물을 제거하기 위한 다른 단계 등도 포함할 수 있다.
8: 정제된 HMD
9: 이산화탄소가 방출되지 않는 경우 임의적 멸균
10: 임의적 물 제거. 물은 임의적으로 생성물 발효 단계로 재순환된다. 물 제거 단계가 이산화탄소 및 유리 염기를 방출할 수 있는 조건을 포함하는 경우 이산화탄소도 재순환될 수 있다.
11: 이산화탄소의 방출이 있거나 없이 수성상으로부터의 임의적 직접적인 정제. 이것은 증류, 이온 교환, 전기투석 등을 포함할 수 있다. 물 또는 이산화탄소가 이들 단계들에서 생성되는 경우 물 및 이산화탄소를 재순환시킬 수 있다.
12: HMD로부터 카보네이트를 제거하기 위한 알칼리화(NaOH 또는 CaOH) 또는 다른 단계(이온 교환, 전기투석 등). CaOH가 사용되는 경우, 침전물이 형성될 것이다.
도 5는 시스,시스-뮤콘산을 통해 글루코스로부터 아디프산을 합성하는 예시적인 경로를 보여준다. 생합성 중간체(약어): D-에리쓰로스 4-포스페이트(E4P), 포스포에놀피루브산(PEP), 3-데옥시-D-아라비노헵툴로손산 7-포스페이트(DAHP), 3-데하이드로퀸산(DHQ), 3-데하이드로쉬킴산(DHS), 프로토카테츄산(PCA). 효소(코딩 유전자) 또는 반응 조건: (a) DAHP 신타제(aroFFBR), (b) 3-데하이드로퀴네이트 신타제(aroB), (c) 3-데하이드로퀴네이트 데하이드라타제(aroD), (d) DHS 데하이드라타제(aroZ), (e) 프로토카테츄에이트 데카복실라제(aroY), (f) 카테콜 1,2-디옥시게나제(catA), (g) 10% Pt/C, H.sub.2, 3400 kPa, 25℃. 문헌(Niu et al., Biotechnol. Prog. 18:201-211 (2002))으로부터 발췌된 도면.
도 6은 출발점으로서 알파-케토글루타레이트를 사용하여 알파-케토아디페이트를 통해 아디페이트를 합성하는 예시적인 경로를 보여준다.
도 7은 출발점으로서 라이신을 사용하여 아디페이트를 합성하는 예시적인 경로를 보여준다.
도 8은 출발점으로서 아디필-CoA를 사용하는 예시적인 카프로락탐 합성 경로를 보여준다.
도 9는 출발점으로서 알파-케토아디페이트를 사용하는 예시적인 아디페이트 합성 경로를 보여준다.
도 10은 석시닐-CoA 및 아세틸-CoA부터 헥사메틸렌디아민(HMDA) 및 카프로락탐까지 예시적인 경로를 보여준다. 석시닐-CoA 및 아세틸-CoA로부터 아디페이트, 6-아미노카프로에이트, 카프로락탐 및 헥사메틸렌디아민을 제조하는 경로가 묘사되어 있다. 약어: A) 3-옥소아디필-CoA 티올라제, B) 3-옥소아디필-CoA 리덕타제, C) 3-하이드록시아디필-CoA 데하이드라타제, D) 5-카복시-2-펜테노일-CoA 리덕타제, E) 3-옥소아디필-CoA/아실-CoA 트랜스퍼라제, F) 3-옥소아디필-CoA 신타제, G) 3-옥소아디필-CoA 하이드롤라제, H) 3-옥소아디페이트 리덕타제, I) 3-하이드록시아디페이트 데하이드라타제, J) 5-카복시-2-펜테노에이트 리덕타제, K) 아디필-CoA/아실-CoA 트랜스퍼라제, L) 아디필-CoA 신타제, M) 아디필-CoA 하이드롤라제, N) 아디필-CoA 리덕타제(알데하이드 형성), O) 6-아미노카프로에이트 트랜스아미나제, P) 6-아미노카프로에이트 데하이드로게나제, Q) 6-아미노카프로일-CoA/아실-CoA 트랜스퍼라제, R) 6-아미노카프로일-CoA 신타제, S) 아미도하이드롤라제, T) 자발적인 고리화, U) 6-아미노카프로일-CoA 리덕타제(알데하이드 형성), V) HMDA 트랜스아미나제, W) HMDA 데하이드로게나제.
도 11은 4-아미노부티릴-CoA 및 아세틸-CoA부터 헥사메틸렌디아민 및 카프로락탐까지 예시적인 경로를 보여준다. 4-아미노부티릴-CoA 및 아세틸-CoA로부터 6-아미노카프로에이트, 카프로락탐 및 헥사메틸렌디아민을 제조하는 경로가 묘사되어 있다. 약어: A) 3-옥소-6-아미노헥사노일-CoA 티올라제, B) 3-옥소-6-아미노헥사노일-CoA 리덕타제, C) 3-하이드록시-6-아미노헥사노일-CoA 데하이드라타제, D) 6-아미노헥스-2-에노일-CoA 리덕타제, E) 3-옥소-6-아미노헥사노일-CoA/아실-CoA 트랜스퍼라제, F) 3-옥소-6-아미노헥사노일-CoA 신타제, G) 3-옥소-6-아미노헥사노일-CoA 하이드롤라제, H) 3-옥소-6-아미노헥사노에이트 리덕타제, I) 3-하이드록시-6-아미노헥사노에이트 데하이드라타제, J) 6-아미노헥스-2-에노에이트 리덕타제, K) 6-아미노카프로일-CoA/아실-CoA 트랜스퍼라제, L) 6-아미노카프로일-CoA 신타제, M) 6-아미노카프로일-CoA 하이드롤라제, N) 6-아미노카프로일-CoA 리덕타제(알데하이드 형성), O) HMDA 트랜스아미나제, P) HMDA 데하이드로게나제, Q) 자발적인 고리화, R) 아미도하이드롤라제.
도 12는 피루베이트 및 석신산 세미알데하이드부터 6-아미노카프로에이트까지의 경로를 보여준다. 효소는 A) HODH 알돌라제, B) OHED 하이드라타제, C) OHED 리덕타제, D) 2-OHD 데카복실라제, E) 아디페이트 세미알데하이드 아미노트랜스퍼라제 및/또는 아디페이트 세미알데하이드 옥시도리덕타제(아미노화), F) OHED 데카복실라제, G) 6-OHE 리덕타제, H) 2-OHD 아미노트랜스퍼라제 및/또는 2-OHD 옥시도리덕타제(아미노화), I) 2-AHD 데카복실라제, J) OHED 아미노트랜스퍼라제 및/또는 OHED 옥시도리덕타제(아미노화), K) 2-AHE 리덕타제, L) HODH 포르메이트-라이아제 및/또는 HODH 데하이드로게나제, M) 3-하이드록시아디필-CoA 데하이드라타제, N) 2,3-데하이드로아디필-CoA 리덕타제, O) 아디필-CoA 데하이드로게나제, P) OHED 포르메이트-라이아제 및/또는 OHED 데하이드로게나제, Q) 2-OHD 포르메이트-라이아제 및/또는 2-OHD 데하이드로게나제이다. 약어는 다음과 같다: HODH=4-하이드록시-2-옥소헵탄-1,7-디오에이트, OHED=2-옥소헵트-4-엔-1,7-디오에이트, 2-OHD=2-옥소헵탄-1,7-디오에이트, 2-AHE=2-아미노헵트-4-엔-1,7-디오에이트, 2-AHD=2-아미노헵탄-1,7-디오에이트, 및 6-OHE=6-옥소헥스-4-에노에이트.
도 13은 6-아미노카프로페이트부터 헥사메틸렌디아민까지의 경로를 보여준다. 효소는 A) 6-아미노카프로에이트 키나제, B) 6-AHOP 옥시도리덕타제, C) 6-아미노카프로산 세미알데하이드 아미노트랜스퍼라제 및/또는 6-아미노카프로산 세미알데하이드 옥시도리덕타제(아미노화), D) 6-아미노카프로에이트 N-아세틸트랜스퍼라제, E) 6-아세트아미도헥사노에이트 키나제, F) 6-AAHOP 옥시도리덕타제, G) 6-아세트아미도헥산알 아미노트랜스퍼라제 및/또는 6-아세트아미도헥산알 옥시도리덕타제(아미노화), H) 6-아세트아미도헥산아민 N-아세틸트랜스퍼라제 및/또는 6-아세트아미도헥산아민 하이드롤라제(아미드), I) 6-아세트아미도헥사노에이트 CoA 트랜스퍼라제 및/또는 6-아세트아미도헥사노에이트 CoA 리가제, J) 6-아세트아미도헥사노일-CoA 옥시도리덕타제, K) 6-AAHOP 아실트랜스퍼라제, L) 6-AHOP 아실트랜스퍼라제, M) 6-아미노카프로에이트 CoA 트랜스퍼라제 및/또는 6-아미노카프로에이트 CoA 리가제, N) 6-아미노카프로일-CoA 옥시도리덕타제이다. 약어는 다음과 같다: 6-AAHOP=[(6-아세트아미도헥사노일)옥시]포스포네이트 및 6-AHOP=[(6-아미노헥사노일)옥시]포스포네이트.
도 14a는 아르기닌 생합성의 아세틸-CoA 주기를 보여준다. 반응 (1) 및 (2)는 아세틸글루타메이트 신타제 및 오르니틴 아실트랜스퍼라제 기능을 갖는 오르니틴 아세틸트랜스퍼라제에 의해 촉진된다. 반응 3은 아세틸글루타메이트 키나제, N-아세틸글루타밀포스페이트 리덕타제 및 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라제에 의해 촉진된 집중 반응이다. 도 14b는 HMDA 생합성의 아세틸-CoA 주기를 보여준다. 반응 (1) 및 (2)는 HMDA 아세틸트랜스퍼라제에 의해 촉진된다. 반응 (3)은 도 13에 나타낸, 6-아세트아미도헥사노에이트부터 6-아세트아미도헥산아민까지의 모든 경로들을 포함하는 집중 반응이다.
도 15는 글루타메이트부터 헥사메틸렌디아민(HMDA) 및 6-아미노카프로에이트까지의 예시적인 경로를 보여준다. 효소는 다음과 같이 표시된다: A) 글루타밀-CoA 트랜스퍼라제 및/또는 리가제, B) 베타-케토티올라제, C) 3-옥소-6-아미노피멜로일-CoA 옥시도리덕타제, D) 3-하이드록시-6-아미노피멜로일-CoA 데하이드라타제, E) 6-아미노-7-카복시헵트-2-에노일-CoA 리덕타제, F) 6-아미노피멜로일-CoA 리덕타제 (알데하이드 형성), G) 2-아미노-7-옥소헵타노에이트 아미노트랜스퍼라제 및/또는 아미노화 옥시도리덕타제, H) 호모라이신 데카복실라제, I) 6-아미노피멜로일-CoA 하이드롤라제, 트랜스퍼라제 및/또는 리가제, J) 2-아미노피멜레이트 데카복실라제.
도 16은 글루타릴-CoA부터 헥사메틸렌디아민(HMDA) 및 6-아미노카프로에이트까지의 예시적인 경로를 보여준다. 효소는 다음과 같이 표시된다: A) 글루타릴-CoA 베타-케토티올라제, B) 3-옥소피멜로일-CoA 하이드롤라제, 트랜스퍼라제 및/또는 리가제, C) 3-옥소피멜레이트 리덕타제, D) 3-옥소-1-카복시헵탄알 7-아미노트랜스퍼라제 및/또는 7-아미노화 옥시도리덕타제, E) 3-옥소-7-아미노헵타노에이트 3-아미노트랜스퍼라제 및/또는 3-아미노화 옥시도리덕타제, F) 3-옥소피멜레이트 키나제, G) 5-옥소피멜로일포스포네이트 리덕타제, H) 3-옥소피멜레이트 CoA 트랜스퍼라제 및/또는 리가제, I) 5-옥소피멜로일-CoA 리덕타제(알데하이드 형성), J) 3-옥소피멜레이트 3-아미노트랜스퍼라제 및/또는 3-아미노화 옥시도리덕타제, K) 3-아미노피멜레이트 CoA 트랜스퍼라제 및/또는 리가제, L) 5-아미노피멜로일-CoA 리덕타제(알데하이드 형성), M) 3-아미노피멜레이트 키나제, N) 5-아미노피멜로일포스포네이트 리덕타제, O) 3-아미노피멜레이트 리덕타제, P) 3-아미노-7-옥소헵타노에이트 2,3-아미노뮤타제, Q) 2-아미노-7-옥소헵타노에이트 7-아미노트랜스퍼라제 및/또는 아미노화 옥시도리덕타제, R) 3,7-디아미노헵타노에이트 2,3-아미노뮤타제, S) 호모라이신 데카복실라제, T) 3-아미노피멜레이트 2,3-아미노뮤타제, U) 2-아미노피멜레이트 키나제, V) 2-아미노피멜레이트 CoA 트랜스퍼라제 및/또는 리가제, W) 2-아미노피멜레이트 리덕타제, X) 6-아미노피멜로일포스포네이트 리덕타제, Y) 6-아미노피멜로일-CoA 리덕타제(알데하이드 형성), Z) 3-아미노-7-옥소헵타노에이트 7-아미노트랜스퍼라제 및/또는 7-아미노화 옥시도리덕타제, AA) 2-아미노피멜레이트 데카복실라제 및 AB) 3-옥소-1-카복시헵탄알 3-아미노트랜스퍼라제 및/또는 3-아미노화 옥시도리덕타제.
도 17은 피루베이트 및 4-아미노부탄알부터 헥사메틸렌디아민(HMDA)까지의 예시적인 경로를 보여준다. 효소는 다음과 같이 표시된다: A) 2-옥소-4-하이드록시-7-아미노헵타노에이트 알돌라제, B) 2-옥소-4-하이드록시-7-아미노헵타노에이트 데하이드라타제, C) 2-옥소-7-아미노헵트-3-에노에이트 리덕타제, D) 2-옥소-7-아미노헵타노에이트 아미노트랜스퍼라제 및/또는 아미노화 옥시도리덕타제, E) 호모라이신 데카복실라제, F) 2-옥소-7-아미노헵타노에이트 데카복실라제, G) 6-아미노헥산알 아미노트랜스퍼라제 및/또는 6-아미노헥산알 아미노화 옥시도리덕타제.
도 18은 호모라이신부터 6-아미노카프로에이트까지의 예시적인 경로를 보여준다. 단계 A는 호모라이신 2-모노옥시게나제에 의해 촉진된다. 단계 B는 묽은 산 또는 염기에 의해 촉진되는 가수분해이다.
도 19는 6-아미노카프로에이트부터 헥사메틸렌디아민까지의 예시적인 경로를 보여준다. 이 도면은 도 13에 제시된 경로들 이외의 추가 경로를 묘사한다. 효소는 다음과 같이 표시된다: A) 6-아미노카프로에이트 키나제, B) 6-AHOP 옥시도리덕타제, C) 6-아미노카프로산 세미알데하이드 아미노트랜스퍼라제 및/또는 6-아미노카프로산 세미알데하이드 옥시도리덕타제(아미노화), D) 6-아미노카프로에이트 N-아세틸트랜스퍼라제, E) 6-아세트아미도헥사노에이트 키나제, F) 6-AAHOP 옥시도리덕타제, G) 6-아세트아미도헥산알 아미노트랜스퍼라제 및/또는 6-아세트아미도헥산알 옥시도리덕타제(아미노화), H) 6-아세트아미도헥산아민 N-아세틸트랜스퍼라제 및/또는 6-아세트아미도헥산아민 하이드롤라제(아미드), I) 6-아세트아미도헥사노에이트 CoA 트랜스퍼라제 및/또는 6-아세트아미도헥사노에이트 CoA 리가제, J) 6-아세트아미도헥사노일-CoA 옥시도리덕타제, K) 6-AAHOP 아실트랜스퍼라제, L) 6-AHOP 아실트랜스퍼라제, M) 6-아미노카프로에이트 CoA 트랜스퍼라제 및/또는 6-아미노카프로에이트 CoA 리가제, N) 6-아미노카프로일-CoA 옥시도리덕타제, O) 6-아미노카프로에이트 리덕타제 및 P) 6-아세트아미도헥사노에이트 리덕타제. 약어는 다음과 같다: 6-AAHOP=[(6-아세트아미도헥사노일)옥시]포스포네이트 및 6-AHOP=[(6-아미노헥사노일)옥시]포스포네이트.
도 20은 석시닐-CoA 및 아세틸-CoA부터 헥사메틸렌디아민(HMDA), 카프로락탐 또는 레불린산까지의 예시적인 경로를 보여준다. 석시닐-CoA 및 아세틸-CoA로부터 아디페이트, 6-아미노카프로에이트, 카프로락탐, 헥사메틸렌디아민 및 레불린산을 생성하는 경로가 묘사되어 있다. 이 도면은 도 10에 제시된 경로 이외의 추가 경로를 묘사한다. 효소는 다음과 같이 표시된다: A) 3-옥소아디필-CoA 티올라제, B) 3-옥소아디필-CoA 리덕타제, C) 3-하이드록시아디필-CoA 데하이드라타제, D) 5-카복시-2-펜테노일-CoA 리덕타제, E) 3-옥소아디필-CoA/아실-CoA 트랜스퍼라제, F) 3-옥소아디필-CoA 신타제, G) 3-옥소아디필-CoA 하이드롤라제, H) 3-옥소아디페이트 리덕타제, I) 3-하이드록시아디페이트 데하이드라타제, J) 5-카복시-2-펜테노에이트 리덕타제, K) 아디필-CoA/아실-CoA 트랜스퍼라제, L) 아디필-CoA 신타제, M) 아디필-CoA 하이드롤라제, N) 아디필-CoA 리덕타제(알데하이드 형성), O) 6-아미노카프로에이트 트랜스아미나제, P) 6-아미노카프로에이트 데하이드로게나제, Q) 6-아미노카프로일-CoA/아실-CoA 트랜스퍼라제, R) 6-아미노카프로일-CoA 신타제, S) 아미도하이드롤라제, T) 자발적인 고리화, U) 6-아미노카프로일-CoA 리덕타제(알데하이드 형성), V) HMDA 트랜스아미나제, W) HMDA 데하이드로게나제, X) 아디페이트 리덕타제, Y) 아디페이트 키나제, Z) 아디필포스페이트 리덕타제, 및 AA) 3-옥소아디페이트 데카복실라제.
도 21은 2-아미노-7-옥소수바레이트부터 헥사메틸렌디아민(HMDA) 및 6-아미노카프로에이트까지의 예시적인 경로를 보여준다. 효소는 다음과 같이 표시된다: A) 2-아미노-7-옥소수바레이트 케토산 데카복실라제, B) 2-아미노-7-옥소헵타노에이트 데카복실라제, C) 6-아미노헥산알 아미노화 옥시도리덕타제 및/또는 6-아미노헥산알 아미노트랜스퍼라제, D) 2-아미노-7-옥소헵타노에이트 옥시도리덕타제, E) 2-아미노피멜레이트 데카복실라제, F) 6-아미노헥산알 옥시도리덕타제, G) 2-아미노-7-옥소헵타노에이트 데카복실라제, H) 호모라이신 데카복실라제, I) 2-아미노-7-옥소수바레이트 아미노산 데카복실라제, J) 2-옥소-7-아미노헵타노에이트 아미노화 옥시도리덕타제 및/또는 2-옥소-7-아미노헵타노에이트 아미노트랜스퍼라제, K) 2-아미노-7-옥소수바레이트 아미노화 옥시도리덕타제 및/또는 2-아미노-7-옥소수바레이트 아미노트랜스퍼라제, L) 2,7-디아미노수바레이트 데카복실라제 및 M) 2-아미노-7-옥소헵타노에이트 아미노화 옥시도리덕타제 및/또는 2-아미노-7-옥소헵타노에이트 아미노트랜스퍼라제.
도 22는 글루타메이트-5-세미알데하이드부터 2-아미노-7-옥소수바레이트까지의 예시적인 경로를 보여준다. 효소는 다음과 같이 표시된다: A) 2-아미노-5-하이드록시-7-옥소수바레이트 알돌라제, B) 2-아미노-5-하이드록시-7-옥소수바레이트 데하이드라타제, C) 2-아미노-5-엔-7-옥소수바레이트 리덕타제.
도 23은 페니실륨 크라이소게눔(Penicillium chrysogenum)의 퍼록시좀에서의 예시적인 아디페이트 분해 경로를 보여준다.
도 24는 역방향 분해 경로를 통한 예시적인 아디페이트 형성 경로를 보여준다. 아디페이트로의 아디필-CoA의 최종 전환을 위한 여러 방안들이 제공된다.
도 25는 3-옥소아디페이트 경로를 통한 예시적인 아디페이트 형성 경로를 보여준다.
도 26은 아디페이트 합성 및 환원적 TCA 사이클를 위한 3-옥소아디페이트 경로의 마지막 3개 단계들의 유사한 효소 화학반응을 보여준다.
디아민을 제조하고 단리하는 방법이 개시되어 있다. 본원에서 지칭된 바와 같이, "디아민"은 예를 들면, C2 내지 C7 메틸렌 분절, 예컨대, 헥사메틸렌디아민(HMD), 카다베린, 푸트레신, 에틸렌디아민 및 헵타메틸렌디아민을 포함한다. 디아민은 C2-C7, C3-C7, 바람직하게는 C4-C7 또는 심지어 C4-C12 또는 C2-C12의 탄소 함량을 가질 수 있다. 용이한 판독을 위해 HMD가 상세히 기재될 수 있으나, 개시된 방법은 디아민들 중 임의의 디아민, 예컨대, 카다베린, 푸트레신, 에틸렌디아민 및 헵타메틸렌디아민에 적용될 수 있다는 것을 이해해야 한다.
1,6-디아미노헥산 또는 1,6-헥산디아민으로서도 지칭되는 헥사메틸렌디아민(HMD로서 약칭됨)은 화학식 H2N(CH2)6NH2를 가진다. HMD는 화학산업에서 중요한 원료 물질이다. HMD는 예를 들면, 폴리아미드, 폴리우레아 또는 폴리우레탄 및 이들 물질들의 공중합체의 제조에 사용된다.
1,5-디아미노펜탄으로서도 지칭되는 카다베린은 폴리아민 제조를 위한 단량체로서 사용된다. 카다베린의 발효적 제조에 적합한 조작된 미생물은 보고되어 있다. 예를 들면, 바이오계 아민(예를 들면, 카다베린)을 제조하고 회수하는 방법은 미국 특허 제8,906,653호 및 문헌(Kind et al. "From zero to hero - Production of bio-based nylon from renewable resources using engineered Corynebacterium glutamicum," (Metabolic Engineering, 25 (2014) pp. 113-123) and Kind et al. "Systems-wide metabolic pathway engineering in Corynebacterium glutamicum for bio-based production of diaminopentane," (Metabolic Engineering 12 (2010)341-351))에 보고되어 있다. 이들 보고된 방법들은 무기산(예를 들면, 황산)에 의한 발효 브로쓰 또는 배양된 배지의 활성 중화를 포함한다. 발효 후, 배양된 배지 또는 브로쓰를 강염기로 알칼리화하여 아민을 탈양성자화하고, 그 다음 상기 아민을 유기 용매로 추출한 후 증류한다. 이들 방법들에서, 다량의 원치 않은 부산물이 아민과 함께 생성된다.
또 다른 방법에서, 국제 특허출원 공보 제WO 2006/123778호에 보고된 바와 같이, 탈카복실화 반응에 적합한 pH를 유지하기 위해 디카복실산 염을 첨가하면서 시험관에서 제조된 라이신 카보네이트를 효소로 탈카복실화하여 카다베린 카보네이트를 생성한 후, 농축하여 카다베린 및 카다베린-디카복실산 염을 생성한다. 또 다른 방법에서, 국제 특허출원 공보 제WO 2010/002000호에 보고된 바와 같이, 시험관에서 제조된 라이신 카보네이트를 효소로 탈카복실화하여 카다베린 카보네이트를 생성하고, 이 카다베린 카보네이트를 열처리한 후 증류하여 카다베린을 제공한다.
1,4-디아미노부탄으로서도 지칭되는 푸트레신은 폴리아민 제조를 위한 단량체로서 사용된다. 푸트레신의 발효적 제조에 적합한 조작된 미생물은 보고되어 있다. 예를 들면, 문헌(Schneider et al. "Improving putrescine production by Corynebacterium glutamicum by fine-tuning ornithine transcarbamoylase activity using a plasmid addition system," (Appl Microbiol Biotechnol. 2012; 95(1):169-78)); 및 미국 특허출원 공보 제20140004577A1호("Microorganisms for producing putrescine and method for producing putrescine using same")를 참조한다.
1,7-디아미노헵탄으로서도 지칭되는 헵타메틸렌디아민은 폴리아민 제조를 위한 단량체로서 사용된다. 푸트레신의 발효적 제조에 적합한 조작된 미생물은 보고되어 있다. 예를 들면, 국제 특허출원 공보 제WO2014105790A2호("Methods of producing 7-carbon chemicals via c1 carbon chain elongation associated with coenzyme b synthesis")를 참조한다.
에틸렌디아민은 폴리아민 제조를 위한 단량체로서 사용될 뿐만 아니라 다른 화학물질에 대한 전구체로서도 사용된다. 에틸렌디아민의 발효적 제조를 위한 조작된 미생물은 보고되어 있다. 예를 들면, 국제 특허출원 공보 제WO2014049382A2호("Ethylenediamine fermentative production by a recombinant microorganism")를 참조한다.
1,6-디아미노헥산 또는 1,6-헥산디아민으로서도 지칭되는 헥사메틸렌디아민(HMD로서 약칭됨)은 화학식 H2N(CH2)6NH2를 가진다. HMD는 화학산업에서 중요한 원료 물질이다. HMD는 예를 들면, 폴리아미드, 폴리우레아 또는 폴리우레탄 및 이들 물질들의 공중합체의 제조에 사용된다. 1,5-디아미노펜탄으로서도 지칭되는 카다베린은 폴리아민 제조를 위한 단량체로서 사용된다. 1,4-디아미노부탄으로서도 지칭되는 푸트레신은 폴리아민 제조를 위한 단량체로서 사용된다. 1,7-디아미노헵탄으로서도 지칭되는 헵타메틸렌디아민은 폴리아민 제조를 위한 단량체로서 사용된다. 에틸렌디아민은 폴리아민 제조를 위한 단량체로서 사용될 뿐만 아니라 다른 화학물질에 대한 전구체로서도 사용된다. 이들 화합물들 및 다른 디아민 또는 이들의 즉시 전구체의 발효적 제조를 위한 조작된 미생물은 보고되어 있다. 전형적으로, 이들의 발효 및 단리 공정은 염 부산물을 생성하는 산 및 염기를 요구한다.
이산화탄소를 사용하는 발효 공정 동안, 디아민 카보네이트, 디아민 비카보네이트 및/또는 디아민 비스-비카보네이트(본원에서 디아민 "카보네이트류"로서 지칭됨) 중 적어도 하나 이상, 및 임의적으로 디아민 카바메이트 또는 디아민 비스카바메이트(본원에서 디아민 "카바메이트류"로서 지칭됨)가 생성된다. 개시된 공정은 증가된 수율의 디아민도 제공하고 유기 용매-기반 추출을 이용한 원하는 디아민의 정제를 개선한다.
도 1은 미생물 유기체를 배양하는 공정 단계, 배양된 미생물 유기체를 사용하여 하나 이상의 HMD-카보네이트 및/또는 HMD 카바메이트를 제조하는 공정 단계, 화학식 H2N-(CH2)6-NH2를 갖고 HMD 염 또는 HMD 카보네이트 및/또는 카바메이트에 비해 소수성 유기 용매에서 더 높은 가용성을 갖는 HMD 중성-전하 또는 유리 염기를 제조하는 공정 단계, 및 HMD 중성-전하 또는 HMD 유리 염기를 단리하는 공정 단계를 포함하는 본 발명의 한 실시양태를 도식적으로 보여준다.
도 2는 HMD의 불순한 생합성 공급원을 제공하는 공정 단계, CO2의 존재 하에 하전된 화합물인 하나 이상의 HMD-카보네이트 및/또는 카바메이트를 제조하는 공정 단계, 원치 않은 부산물 또는 물질로부터 HMD 카보네이트 및/또는 카바메이트를 단리하거나 분리하는 공정 단계, 화학식 H2N(CH2)6NH2를 갖고 하전된 HMD 카보네이트 및/또는 카바메이트에 비해 소수성 유기 용매에서 더 높은 가용성을 갖는 HMD 중성-전하 또는 HMD 유리 염기 화합물을 제조하는 공정 단계, 및 HMD 중성-전하 또는 HMD 유리 염기를 단리하는 공정 단계를 포함하는 본 발명의 또 다른 실시양태를 도식적으로 보여준다.
도 3은 HMD를 제조하는 데 사용될 수 있는 발효 시스템의 한 실시양태를 도식적으로 보여준다. 유전적으로 조작된 미생물은 질소원 및 탄소원을 포함하는 적합한 배양 또는 발효 배지에서 반응 용기(10)에서 배양되거나 생장된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 전형적인 배양 또는 발효 배지 및 생장 조건은 하기 실시예 3에 기재되어 있다. 원하는 디아민(예를 들면, HMD)을 제조하기 위해 유전적으로 조작된 미생물을 발효하는 동안, 이산화탄소가 배양된 배지의 pH를 조절하는 데 사용된다. 사용된 이산화탄소는 미생물에 의해 대사적으로 제조될 수 있거나, 인공적으로 제조될 수 있거나, 외부 공급원으로부터 첨가될 수 있다. 한 실시양태에서, 미생물의 생장 조건 및 배양 또는 발효 배지 중의 CO2의 농도는 pH가 발효 주기 동안 선택된 시간 동안 소정의 수준에서 유지되도록 조절된다. 발효 공정의 과정에 걸쳐, pH는 예를 들면, HMD 및 이산화탄소에 의해 생성된 완충제로 인해 약 중성 pH부터 8.5의 안정한 pH까지 상승할 것이다. 발효의 완결 시, 또는 HMD-카보네이트 및/또는 카바메이트가 생성될 때, 보유물에 함유될 원치 않은 부산물로부터 하전된 HMD-카보네이트류 및/또는 카바메이트류물질, 예컨대, HMD 염을 함유하는 미정제 또는 불순한 수성 용액을 분리하기 위해 (예를 들면, 막 여과(20)로) 세포를 제거할 수 있다. 적어도 세포 제거 후, 증기 스트립핑을 통해 불활성 가스 또는 증기를 사용하여 적어도 하전된 HMD-카보네이트류 및/또는 카바메이트류물질을 함유하는 여과된 수성 발효 용액으로부터 이산화탄소를 제거할 수 있다. 증기는 외부 공급원으로부터 첨가될 수 있거나, 반응기(30)에서 상승된 온도 및 압력 하에 브로쓰를 끓임으로써 "제자리(in situ)"에서 생성될 수 있다. CO2의 제거는 수성 용액에서 중성-하전된 또는 유리 염기 HMD를 생성할 것이다. 이산화탄소의 제거에 의해, 용액의 pH는 용매 추출을 이용하여 HMD를 그의 유리 염기 형태로 제거할 수 있는 점까지 상승된다. 중성-하전된 또는 유리 염기 HMD는 수성 라피네이트로부터 유기 성분을 분리하는 추출기(40)에서 수성 용액으로부터 추출될 수 있다. 적어도 용매 및 HMD를 함유하는 유기 성분은 증류 컬럼에서 분리될 수 있고, 증류된 HMD는 증류 컬럼(60)에서 증류에 의해 더 정제될 수 있다. 반응기(30)로부터 회수된 CO2 및 증류 컬럼으로부터 회수된 용매는 기재된 공정에서 재순환되어, 예시된 발효 공정의 공정 및 경제적 성질을 개선할 수 있다.
적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 배지에서 미생물을 배양하여 하나 이상의 디아민 카보네이트 및/또는 카바메이트를 형성한다. 배양된 배지 중의 생성된 화합물은 배양된 배지 중의 적어도 40%의 카보네이트 및/또는 카바메이트를 포함한다. 다른 실시양태에서, 카보네이트 및/또는 카바메이트는 배양된 배지 중의 적어도 50%, 60%, 70%, 80, 90% 또는 99.9%일 수 있다. 상기 정의된 바와 같이, 이것은 원하는 디아민(예를 들면, HMD) 카보네이트류 또는 카바메이트류가 배양된 배지 중의 모든 카보네이트들 및/또는 카바메이트들의 적어도 40% 이상을 차지한다는 것을 의미한다.
배양 배지
사용될 원하는 미생물 또는 균주에 따라, 적절한 배양 배지가 사용될 수 있다. 예를 들면, 다양한 배양 배지의 설명이 문헌("Manual of Methods for General Bacteriology" of the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981))에서 발견될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "배지"는 생장 공급원에 관한 것이기 때문에 출발 배지가 고체 또는 액체 형태라는 것을 의미한다. 다른 한편으로 본원에서 사용된 바와 같이, "배양된 배지"는 발효적으로 생장한 미생물을 함유하는 배지(예를 들면, 액체 배지)를 지칭하고 다른 세포 바이오매스를 포함할 수 있다. 배지는 일반적으로 하나 이상의 탄소원, 질소원, 무기 염, 비타민 및/또는 미량 원소를 포함한다.
예시적인 탄소원은 당 탄소, 예컨대, 수크로스, 글루코스, 갈락토스, 프럭토스, 만노스, 이소말토스, 자일로스, 판노스, 말토스, 아라비노스, 셀로바이오스 및 이들의 3-올리고머, 4-올리고머 또는 5-올리고머를 포함한다. 다른 탄소원은 알코올 탄소원, 예컨대, 메탄올, 에탄올, 글리세롤, 포르메이트 및 지방산을 포함한다. 다른 탄소원은 가스, 예컨대, 합성 가스, 폐가스, 메탄, CO, CO2, 및 CO 또는 CO2와 H2의 임의의 혼합물로부터의 탄소원을 포함한다. 다른 탄소원은 재생 공급원료 및 바이오매스를 포함할 수 있다. 예시적인 재생 공급원료는 셀룰로스성 바이오매스, 헤미셀룰로스성 바이오매스 및 리그닌 공급원료를 포함한다.
일부 실시양태에서, 배양 조건은 혐기성 또는 실질적으로 혐기성 생장 또는 유지 조건을 포함한다. 예시적인 혐기성 조건은 이전에 기재되어 있고 당분야에서 잘 공지되어 있다. 발효 공정을 위한 예시적인 혐기성 조건은 예를 들면, 2007년 8월 10일자로 출원된 미국 특허출원 공보 제2009/0047719호에 개시되어 있다. 이들 조건들 중 임의의 조건이 미생물 유기체뿐만 아니라 당분야에서 잘 공지되어 있는 다른 혐기성 조건과도 함께 사용될 수 있다.
배양 조건은 예를 들면, 액체 배양 절차뿐만 아니라 발효 및 다른 대규모 배양 절차도 포함할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 특히 유용한 수율의 생성물은 혐기성 또는 실질적으로 혐기성 배양 조건 하에 수득될 수 있다.
헥사메틸렌디아민을 달성하기 위한 예시적인 생장 조건은 혐기성 배양 또는 발효 조건을 포함한다. 일부 실시양태에서, 미생물 유기체는 혐기성 또는 실질적으로 혐기성 조건 하에 지속될 수 있거나, 배양될 수 있거나 발효될 수 있다. 요약하건대, 혐기성 조건은 산소를 결여하는 환경을 지칭한다. 실질적으로 혐기성 조건은 예를 들면, 배지 중의 용해된 산소 농도가 0% 내지 10%의 포화도에서 유지되도록 배양, 회분 발효 또는 연속적 발효를 포함한다. 실질적으로 혐기성 조건은 1% 미만의 산소 대기를 갖도록 유지된 밀봉된 챔버 내부의 액체 배지 내의 또는 고체 한천 상의 생장 또는 휴면 세포도 포함한다. 산소의 퍼센트는 예를 들면, 배양물을 N2/CO2 혼합물 또는 다른 적합한 비-산소 가스 또는 가스들로 살포함으로써 유지될 수 있다.
배양 조건은 헥사메틸렌디아민을 제조하기 위해 규모 확장될 수 있고 연속적으로 생장될 수 있다. 예시적인 생장 절차는 예를 들면, 유가 발효 및 회분 분리; 유가 발효 및 연속적 분리; 또는 연속적 발효 및 연속적 분리를 포함한다. 이들 공정들 모두가 당분야에서 잘 공지되어 있다. 발효 절차는 상업적 양의 헥사메틸렌디아민의 생합성 제조에 특히 유용하다. 일반적으로, 비-연속적 배양 절차와 마찬가지로, 헥사메틸렌디아민의 연속적 및/또는 거의 연속적 제조는 대수기에서 생장을 지속하고/하거나 거의 지속하기에 충분한 영양분 및 배지 상에서 헥사메틸렌디아민 생성 유기체를 배양하는 단계를 포함할 것이다. 이러한 조건 하에서의 연속적 배양은 예를 들면, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 또는 7일 이상을 포함할 수 있다. 추가로, 연속적 배양은 1주, 2주, 3주, 4주 또는 5주 이상의 수주 및 최대 수개월을 포함할 수 있다. 대안적으로, 원하는 미생물은 특정 적용에 적합한 경우 수시간 동안 배양될 수 있다. 연속적 및/또는 거의 연속적 배양 조건은 이들 예시적인 기간들 사이의 모든 시간 간격을 포함할 수도 있다는 것을 이해해야 한다. 미생물 유기체를 배양하는 시간은 원하는 목적을 위해 충분한 양의 생성물을 생성하기에 충분한 시간이라는 것도 이해된다.
발효 절차는 당분야에서 잘 공지되어 있다. 요약하건대, 헥사메틸렌디아민의 생합성 제조를 위한 발효는 예를 들면, 유가 발효 및 회분 분리, 유가 발효 및 연속적 분리; 또는 연속적 발효 및 연속적 분리에서 이용될 수 있다. 회분 및 연속적 발효 절차의 예는 당분야에서 잘 공지되어 있다.
발효 시작 시 배양 배지는 약 5 내지 약 7의 pH를 가질 수 있다. pH는 11 미만, 10 미만, 9 미만 또는 8 미만일 수 있다. 다른 실시양태에서, pH는 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6 또는 적어도 7일 수 있다. 다른 실시양태에서, 배지의 pH는 약 6 내지 약 9.5, 6 내지 약 9, 약 6 내지 8, 또는 약 8 내지 9일 수 있다.
CO 2 공급원 및 종
상기 언급된 바와 같이, 원하는 디아민(예를 들면, HMD)을 제조하고 배양 배지의 pH를 조절하기 위해 CO2가 첨가된다. CO2의 공급원은 예를 들면, CO2, 카보네이트, 비카보네이트 또는 탄산의 형태를 취할 수 있다. 한 실시양태에서, CO2는 외부로부터 배양된 배지에 첨가될 수 있다. 다른 실시양태에서, CO2는 예컨대, 호흡에 의해 또는 부산물로서 미생물에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 호흡 CO2는 글리코실레이트 션트, 펜토스 포스페이트 경로(예를 들면, gnd(6-포스포글루코네이트를 리불로아스-5-포스페이트 및 CO2로 전환시키는 6-포스포글루코네이트 데하이드로게나제)) 또는 엔트너 듀오도로프 경로를 통해 트리카복실산(TCA) 주기의 전환으로부터 형성될 수 있다. 다른 실시양태에서, 부산물 CO2는 아세테이트, 에탄올, 석시네이트, 3-옥소아디페이트 또는 3-하이드록시아디페이트로부터 형성될 수 있다.
적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 미생물을 배양하여, 미생물로 하여금 CO2, 카보네이트, 비카보네이트 또는 탄산을 포함하는 하나 이상의 CO2 공급원도 형성하게 한다. 한 실시양태에서, 미생물은 디아민과 화학량론적으로 CO2를 형성한다.
본원에서 언급된 화학량론적 CO2는 화학량론에 기초할 때 소정의 기질로부터의 생성물의 형성과 관련된 CO2의 양이다. 글루코스로부터의 HMD의 생성을 위한 한 예시적인 화학량론은 다음과 같다:
1.47 C6H12O6 + 0.321 O2 + 2NH3 → C6H16N2 + 2.821 CO2 + 3.821 H2O
HMD의 몰당 생성된 화학량론적 CO2 양은 2.821 몰이다. 이 양보다 더 많이 생성된 임의의 CO2는 호흡 또는 부산물 형성에 의해 생성된다.
호흡 CO2의 일부 공급원들은 특히 TCA 사이클, 글리코실레이트 션트, 펜토스 포스페이트 경로(예를 들면, zwf) 및 엔트너-듀오도로프 경로이다. 이들 경로들은 ATP를 형성하기 위해 전자 수송 쇄를 통해 사용될 수 있는 NAD(P)H를 생성한다. 부산물 CO2는 부산물의 형성으로 인해 생성된 CO2로서 정의된다. 예를 들면, 글루코스 몰당 2 몰의 아세테이트가 생성되고, 이것은 2 몰의 CO2의 방출과 관련되어 있다. 따라서, 각각의 몰의 아세테이트의 형성과 관련된 부산물 CO2는 1 몰이다.
또 다른 예에서, 메탄올로부터의 HMD의 생성은 산화적 TCA 분지 및 환원적 TCA 분지 둘 다가 HMD를 제조하는 데 사용되는 경우에 비해 산화적 TCA 분지만이 HMD를 제조하는 데 사용되는지에 따라 다중 화학량론을 가질 수 있다.
6.31 CH3OH + 2 NH3 + 0.97 O2 + C6H16N2 + 7.62 H2O + 0.31 CO2
7 CH3OH + 2 NH3 + 2 O2 + C6H16N2 + 9 H2O + CO2
CO2가 pH를 (예를 들면, 7까지) 떨어뜨리는 데 사용되는 경우, 이산화탄소의 가용성을 증가시키기 위해 발효기 상부의 배압을 적어도 2 bar까지 상승시키되, 10 bar를 초과하지 않게 함으로써 CO2에 대한 배지의 가용성을 향상시킬 수 있다. 다른 실시양태에서, CO2에 대한 배지의 가용성을 향상시키기 위해 온도를 낮출 수 있다. 한 실시양태에서, CO2의 가용성을 증가시키기 위해 온도를 37℃ 미만으로 낮춘다.
한 실시양태에서, 디아민을 생성하는 미생물을 발효기 내부의 액체 배지에서 배양하고, 이때 이산화탄소를 포함하는 입구 가스를 발효기 내로 공급하고, 이산화탄소의 가용성을 증가시키기 위해 발효기 상부의 배압을 적어도 2 bar까지 상승시키되, 10 bar를 초과하지 않게 한다.
또 다른 실시양태에서, 디아민의 발효 제조 공정에서 디아민을 생성하는 미생물을 발효기 내부의 액체 배지에서 배양하고, 이산화탄소를 포함하는 입구 가스를 발효기 내로 공급하고 CO2의 가용성을 증가시키기 위해 온도를 37℃ 미만으로 낮춘다.
일부 실시양태에서, 가용성 이온으로 전환되는 CO2 가스의 양 또는 속도를 증가시켜; 보다 큰 양 또는 이용가능성의 가용성 이온이 디아민 또는 HMD에 의해 이용가능하게 함으로써, 디아민 카보네이트 및/또는 디아민 카바메이트(예를 들면, HMDA 카보네이트)의 형성을 촉진하거나 향상시키기 위해 효소 탄산 안하이드라제(CA)를 발효 브로쓰 또는 배지에 첨가할 수 있다.
탄산 안하이드라제는 가역적 반응을 촉진한다. 정방향 반응에서, CA는 이산화탄소와 물을 조합하고, H2CO3은 해리하여 비카보네이트(HCO3 -) 및 양성자를 형성한다:
Figure pct00002
. 역방향 반응에서, CA는 비카보네이트와 양성자를 조합하여 이산화탄소 및 물을 제공한다. 따라서, DA 카보네이트가 형성된 후 가역적 반응, 특히 역방향 반응을 이용하여 CO2를 제거할 수 있거나 방출할 수 있다. 일부 실시양태에서, CA를 사용하여; DA로 전환될 수 있는 비카보네이트 및 양성자의 형태로 CO2를 수화시킬 수 있다. 반응의 방향에 따라, (예를 들면, 비카보네이트로의 이산화탄소의 수화를 통해) 용액 내로의 이산화탄소의 흡수 및/또는 (예를 들면, 이산화탄소 및 물로의 비카보네이트의 탈수를 통해) 용액으로부터의 이산화탄소의 탈착에 유리한 특정 적합한 조건을 선택할 수 있다.
탄산 안하이드라제는 CA를 발효 용액에 직접적으로 제공함으로써 외생적으로 제공될 수 있거나, 탄산 안하이드라제를 생성할 수 있는 미생물을 통해 도입될 수 있다. 탄산 안하이드라제는 재조합 또는 조작된 CA로서도 제공될 수 있다. 재조합 CA는 디아민 경로(예를 들면, HMD 합성 경로)를 포함하는 미생물의 부분일 수 있거나 CA를 발현할 수 있는 또 다른 미생물에 의해 도입될 수 있다. 예를 들면, 미생물의 천연 CA는 발효 브로쓰 또는 용액 내로 배출되거나 미생물의 주변세포질 내로 분비되도록 이를 과다발현시키거나 조작함으로써 사용될 수 있다. CA는 EC 4.2.1.1. 효소 클래스의 CA일 수 있다. CA는 에스케리키아, 예를 들면, Can 유전자 또는 b1026(KEGG 표기), 또는 본원에 나열된 균주들을 포함하는 다른 숙주 균주의 CA일 수 있다. 일부 실시양태에서, CA는 메타노박테륨(Methanobacterium), 데설포비르바이오(Desulfovirbio), 메타노사르시나(Methanosarcina), 티오마이크로스피라(Thiomicrospira), 아세토박테륨(Acetobacterium), 클로스트리듐(Clostridium), 메틸로박테륨(Methylobacterium), 리조븀(Rhizobium), 로도박터(Rhodobacter), 로도스피릴룸(Rhodospirillum), 스타필로코커스(Staphylococcus), 메타노코커스(Methanococcus), 메타노새타(Methanosaeta), 메타노스피릴룸(Methanospirillum) 또는 설폴로버스(Sulfolobus) 속으로부터 수득될 수 있다(Smith et al., 1999 PNAS 96(26):15184-15189).
CA가 수득될 수 있는 예시적인 유기체는 네이세리아 고노로에애(Neisseria gonorrhoeae)(Jo et al., 2013 Appl. Environ. Microbiol. 79(21):6697-6705), 메타노사르시나(Methanosarcina), 티오마이크로스피라(Thiomicrospira), 아세토박테륨 우디이(Acetobacterium woodii), 클로스트리듐 써모아세티쿰(Clostridium thermoaceticum), 메틸로박테륨 엑토르쿠엔스(Methylobacterium extorquens), 리조븀 멜릴로티(Rhizobium meliloti), 로도박터 캡슐라터스(Rhodobacter capsulatus), 로도박터 스패로이데스(Rhodobacter sphaeroides), 로도스피릴룸 루브룸(Rhodospirillum rubrum), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 메타노코커스 잔나스키이(Methanococcus jannaschii), 메타노새타 콘실리이(Methanosaeta concilii), 메타노사르시나 바케리(Methanosarcina barkeri), 메타노사르시나 써모필라(Methanosarcina thermophila), 메타노스피릴룸 헌가테이이(Methanospirillum hungateii) 및 설폴로버스 솔파타리커스(Sulfolobus solfataricus)를 포함한다(Smith et al., 1999 PNAS 96(26):15184-15189). CA는 네이세리아 고노로에애로부터 수득될 수 있다(Jo et al., 2013 Appl. Environ. Microbiol. 79(21):6697-6705). 일부 실시양태에서, 네이세리아 고노로에애의 탄산 안하이드라제는 문헌(Jo et al., 2013 Appl. Environ. Microbiol. 79(21):6697-6705)에 보고된 바와 같이 이. 콜라이에서의 주변세포질 발현을 위해 조작될 수 있다.
일부 실시양태에서, β형 CA를 코딩하는 유전자는 데설포비르바이오(Desulfovirbio) 속, 예컨대, 데설포비르바이오 프럭토시보란스(Desulfovirbio fructosivorans), 데설포비르바이오 톰(Desulfovirbio Tom) C, 데설포비르바이오 마그네티커스(Desulfovirbio magneticus) 또는 데설포비르바이오 알콜리보란스(Desulfovirbio alcholivorans)로부터 수득될 수 있다. 다른 실시양태에서, CA는 데설포모나일(Desulfomonile) 속, 예컨대, 데설포모나일 티에드제이(Desulfomonile tiedjei), 메타노박테룸(Methanobacterium) 속, 예컨대, 메타노박테륨 써모아우토트로피쿰(Methanobacterium thermoautotrophicum), 메타노아시나(Metanoacina) 속, 예컨대, 메타노아시나 써모필리아(Metanoacina thermophilia), 또는 티오마이크로스피라(Thiomicrospira) 속, 예컨대, 티오마이크로스피라 크루노게나(Thiomicrospira crunogena)로부터 수득될 수 있다.
다른 실시양태에서, CA는 하기 표 A에 나타낸 바와 같이 사용될 수 있다:
[표 A]
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
CA는 데설포비브리오 불가리스(Desulfovibrio vulgaris)에 의해 코딩될 수 있다. 데설포비브리오 불가리스는 승온 및 10 초과의 pH에서 4.2 M N-메틸디에탄올아민(MDEA)에서 높은 활성을 가진다는 독특한 성질을 가진다. 데설포비브리오 불가리스 CA는 탄소 포획 기술에서 사용되기 위해 고농도의 MDEA에서 오랜 시간(8주) 동안 100℃에서 활성을 나타내도록 진화되었다(Alvizo, et. al. 2014 PNAS 111(46): 16436-16441). 일부 실시양태에서, 조작된 CA는 데설포비브리오 불가리스로부터 유래한다(진뱅크(GenBank) 수납 ACL09337.1 GI:218758438). 일부 실시양태에서, 데설포비브리오 불가리스 균주 "Miyazaki F" 탄산 안하이드라제는 A56S, T30R, A40L, A84Q, G120R, T139M, K37R, E68AQ, A95V, Q119M, N145WFC, N213E, A219T, R31P, Q43M, V70I, H124T, H148T, V157A, M170F, H44L, M129F, S144R, Y49F, S126N, D196S, P136R, P174E, D195A, G89A, D96E, V100T, A121Q, A181K, M207A 및 S216D로서 확인된 하나 이상의 치환을 포함함으로써 승온 및 알칼리 pH에서 탄산 안하이드라제 활성을 안정화시키기 위해 아미노산 치환을 가진다.
일부 실시양태에서, CA는 이. 콜라이(EG10176(EcoCyc) 또는 EG12319(EcoCyc), Can 유전자, b1026(KEGG 표기))에 의해 코딩된다.
개시된 효소는 재조합 또는 조작된 CA가 항체 태그(예를 들면, myc 에피토프), 정제 서열(예를 들면, 금속에의 결합을 위한 His 태그) 및 세포 국소화 신호(예를 들면, 분비 또는 배출 신호)에 융합되어 있는 융합 단백질의 형태로도 존재할 수 있다. 주변세포질 공간 내로의 원하는 단백질의 발현을 보조하기 위해, 분비 신호, 예컨대, Sec 태그 또는 Tat 태그가 사용될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, CA는 주변세포질 공간으로 분비되기 보다는 오히려 배지 내로 배출된다. 일부 실시양태에서, 분비 또는 배출 신호는 주변세포질 공간 내로의 발현을 보조하도록 또는 미생물(예를 들면, 이. 콜라이)로부터 세포외로 배출되도록 탄산 안하이드라제 DNA 서열과의 융합체로서 분비 태그를 유전적으로 코딩함으로써 단백질의 N-말단에 융합된다. 또 다른 실시양태에서, CA는 배양 배지로 수송(배출)되는 이. 콜라이 단백질 OmpF에 융합될 수 있다(Nagahari et al., 1985 The EMBO J. 4(13A):3589-3592; Jeong and Lee, 2002 Appl. Environ. Microbiol. 68:4979-4985). 또 다른 실시양태에서, CA는 배양 배지로의 단백질 배출을 뒷받침하는 것으로 확인되었고 비공지된 기능을 갖고 있으나 세포외 단백질인 이. 콜라이 단백질 YebF에 융합될 수 있다(Zhang et al., 2006 Nat. Biotech. 24:100-10). SignalP 4.1 서버(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)를 이용하여 N-말단 분비 신호 펩티드 태그를 확인한다.
탄산 안하이드라제는 발효 브로쓰 중의 유전적으로 조작된 미생물에 의해 제공될 수 있다. 다른 실시양태에서, 탄산 안하이드라제는 DA를 생성하고 임의적으로 브로쓰로 분비되며 임의적으로 미생물의 주변세포질에 존재하는 유전적으로 조작된 미생물에 의해 제공된다. 다른 실시양태에서, 탄산 안하이드라제는 천연 유전자 또는 효소이고, 임의적으로 브로쓰로 분비되도록 조작되고, 임의적으로 미생물의 주변세포질 공간으로 분비되도록 조작된다.
일부 실시양태에서, CA는 발효 브로쓰 내로 배출될 수 있고, 다른 실시양태에서 CA는 미생물의 주변세포질에 존재할 수 있다.
반응의 방향 또는 반응의 속도에 따라, 일부 실시양태에서 천연 CA 유전자(예를 들면, 이. 콜라이 코딩된 CA) 서열은 예를 들면, 그의 프로모터를 변경함으로써 과다발현될 수 있고/있거나, 분비 또는 배출 펩티드 또는 융합체를 갖도록 조작될 수 있다.
일부 실시양태에서, 정방향 반응 및/또는 역방향 반응을 수행할 수 있는 CA의 변이체가 고려된다. 변이체는 상동체(homolog), 오르톨로그(ortholog), 파랄로그(paralogs), 또는 유전적으로 조작된, 예를 들면, 증가된 알칼리 pH 및 열 안정성 변이체일 수 있다.
정방향 반응 및/또는 역방향 반응을 향상시킬 수 있는 개선된 성질(예를 들면, 열 안정성, 용매 안정성 및/또는 염기 안정성)을 갖는 CA가 선택될 수 있고 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 고농도의 DA(예를 들면, HMD)에서 활성 및/또는 안정성을 나타내는 CA 변이체가 선택될 수 있고 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서, 고농도의 C2 내지 C7 메틸렌 분절, 예컨대, 헥사메틸렌디아민(HMD), 카다베린, 푸트레신, 에틸렌디아민 및 헵타메틸렌디아민에서 활성 및/또는 안정성을 나타내는 CA 및 이의 변이체가 선택될 수 있고 사용될 수 있다.
선택된 조건에 따라, CA는 열안정성 CA일 수 있거나 알칼리 pH 안정성 CA일 수 있거나, 둘 다일 수 있다. 바람직하게는, 알칼리 pH는 약 pH 8 내지 13이다. 일부 실시양태에서, pH는 pH 8 내지 13, pH 8.5 내지 13, pH 9 내지 13, pH 10 내지 13, pH 8 내지 12, pH 8.5 내지 12, pH 9 내지 12, pH 8 내지 11, pH 8.5 내지 11, pH 9 내지 11, pH 10 내지 11 및 pH 10 내지 12일 수 있다. CA가 DA 카보네이트류 또는 카바메이트류로부터 CO2를 방출하는 단계 또는 단계들에서 사용되는 경우, 온도 및 염기성 pH 안정성이 유용할 수 있다. CO2가 방출되고 유리 염기가 형성됨에 따라 이 단계는 pH의 증가를 야기할 수 있다. 추가로, 일부 실시양태에서, 실온보다 더 높고 전형적인 발효 온도보다 더 높은 온도가 CO2의 방출을 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다.
정방향 반응이 유리한지 아니면 역방향 반응이 유리한지에 따라, 상이한 활성을 갖는 CA 효소를 발효 브로쓰에 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, CA는 정방향 반응을 위한 최적 활성을 가질 수 있고, 다른 실시양태에서 CA 효소는 역방향 반응을 위한 최적 활성을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 다양한 최적 활성 및/또는 개선된 성질을 갖는 상이한 효소들의 혼합물이 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 개선된 성질, 즉 적합한 조건 하에 이산화탄소를 수화시키거나 비카보네이트를 탈수시키는 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 10배 또는 적어도 25배 증가된 활성을 갖는 탄산 안하이드라제가 사용되는 방법을 수행할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 상기 방법에서 사용되는 적합한 조건은 약 0.1 g/ℓ 내지 약 10 g/ℓ, 약 0.25 g/ℓ 내지 약 7.5 g/ℓ, 약 0.5 g/ℓ 내지 약 5 g/ℓ, 10 g/ℓ 미만, 약 5 g/ℓ 미만 또는 약 2.5 g/ℓ 미만의 농도의 탄산 안하이드라제 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, CA는 외생적으로 제공될 수 있다. 다른 실시양태에서, CA 효소는 브로쓰 또는 발효 용액 내로 직접적으로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, CA는 발효 브로쓰 또는 용액에서 유전적으로 조작된 미생물에 의해 제공되고, 이때 CA는 브로쓰 내로 배출될 수 있거나 미생물의 주변세포질에 존재할 수 있다. 다른 실시양태에서, 효소는 입자 상에 고정된 상태로 제공될 수 있다. 재조합 탄산 안하이드라제 폴리펩티드는 표면 상에 고정될 수 있고, 예를 들면, 이때 효소는 용액 중의 고체-상 입자의 표면에 연결된다. 효소가 생물반응기에서 사용되기 위해 활성을 보유하도록 효소를 고체-상 입자(예를 들면, 다공성 또는 비-다공성 비드, 또는 고체 지지체)에 (공유 또는 비-공유) 연결하는 방법은 당분야에서 잘 공지되어 있다. 고정된 효소를 사용하여 가스 스트림을 처리하는 방법은 예를 들면, 본원에 각각 참고로 도입되는 미국 특허 제6,143,556호, 미국 특허출원 공보 제2007/0004023A1호, 및 PCT 공보 제WO98/55210A1호, 제WO2004/056455A1호 및 제WO2004/028667A1호에 기재되어 있다.
따라서, 일부 실시양태에서, DA 카보네이트류 또는 DA 카바메이트류 용액으로부터의 CO2의 방출을 향상시키는 방법이 수행될 수 있고, 이때 조작된 탄산 안하이드라제 폴리펩티드는 표면 상에 고정되고, 예를 들면, 효소는 고체-상 입자(예를 들면, 비드)의 표면에 연결된다. 일부 실시양태에서, 고정된 폴리펩티드를 사용하는 방법이 수행될 수 있고, 이때 상기 방법은 고정된 탄산 안하이드라제를 브로쓰 또는 발효 용액으로부터 단리하거나 분리하는 단계를 추가로 포함한다. 고정된 탄산 안하이드라제를 브로쓰 또는 발효 용액으로부터 분리한 후, 효소를 불활성화시킬 수 있는 조건, 예를 들면, 고온에서의 CO2의 탈착으로 브로쓰 또는 발효 용액을 처리할 수 있다. 추가로, 따로 보유된 고정된 효소가 또 다른 용액에 첨가될 수 있고 재사용될 수 있다.
CO 2 :DA 비
개시된 공정 하에서, 미생물(예를 들면, 유전적으로 조작된 미생물)은 약 0.05 대 1 내지 약 5 대 1 또는 약 7:1의 비로 CO2 및 DA(예를 들면, HMD)를 형성한다. 다른 적합한 비는 0.2 대 1 내지 약 3 대 1을 포함한다. 다른 실시양태에서, CO2 대 DA(예를 들면, HMD)의 비는 약 0.05 대 1 내지 약 3 대 1; 약 0.05 대 1 내지 약 2.5 대 1; 약 0.05 대 1 내지 약 2 대 1; 약 0.05 대 1 내지 약 1.5 대 1; 약 0.05 대 1 내지 약 1 대 1을 포함한다.
개시된 비는 배양된 배지 중의 총 용존 무기 탄소(DIC)의 형태로 CO2를 측정함으로써 결정될 수 있다. 카보네이트 및/또는 카바메이트를 포함하는 DIC는 예를 들면, 문헌("Handbook of Methods for the Analysis of the Various Parameters of the carbon dioxide System in Sea Water." Prepared for the U. S. Department of Energy, Special Research Grant Program 89-7A: Global survey of carbon dioxide in the oceans.Version 2 - September 1994 Edited by Andrew G. Dickson & Catherine Goyet(핸드북(Handbook)으로서 지칭됨))의 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들면, DIC는 핸드북의 제38면 내지 제55면에 기재된 방법("SOP 2: Determination of total dissolved inorganic carbon in sea water, p. 1-18")에 의해 측정될 수 있다.
다른 실시양태에서, 총 용존 반대 음이온(TDCA)에 비해 DIC인 DIC의 비율이 측정될 수 있다. TDCA는 DIC와 다른 음이온의 합계이다. DIC 이외의 다른 음이온(예를 들면, Cl-, SO-2, PO4 -3, NO3 -, NO2 -)은 임의의 적합한 방법, 예컨대, 이온 교환 크로마토그래피를 이용함으로써 측정될 수 있다. 예를 들면, 전도성 검출기(및 이온 억제제)를 갖는 DIONEX에 의한 상업적으로 이용가능한 이온 교환 크로마토그래피가 이용될 수 있다.
배양된 배지에서 생성된 화합물은 적어도 40%의 DIC/TDCA 값을 갖는 화합물을 포함한다. 다른 실시양태에서, DIC 백분율은 배양된 배지에서 적어도 50%, 60%, 70%, 80, 90% 또는 99.9%일 수 있다. 일부 실시양태에서, DIC는 pH 9의 배양된 배지에서 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 99.9%의 TDCA이다.
발효 pH
상기 언급된 바와 같이, 출발 배양 배지는 약 5 내지 약 7의 pH를 가질 수 있다. 미생물이 배양 배지 상에서 생장하고 원하는 디아민(예를 들면, HMD-카보네이트 및/또는 HMD 카바메이트)을 생성하기 때문에, 디아민 카보네이트 및/또는 카바메이트가 디아민 유리 염기로 전환되기 전에, 배양된 배지의 pH는 11 미만, 10 미만, 9 미만 또는 8 미만일 수 있다. 다른 실시앙태에서, pH는 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6 또는 적어도 7일 수 있다. 다른 실시양태에서, 배지의 pH는 약 6 내지 약 9.5, 약 6 내지 약 9, 약 6 내지 약 8, 약 6.5 내지 약 7.5, 약 7.5 내지 약 9.5, 또는 약 8 내지 약 9일 수 있다.
pH를 조절하기 위해 배지(즉, 출발 배지)를 무기 산, 염기 또는 완충제로 조절할 수 있지만, 배양된 배지는 완충제를 실질적으로 갖지 않거나, 무기산 또는 유기산, 또는 외부로부터 첨가된 무기산 또는 유기산을 실질적으로 포함하지 않는다. 본원에서 사용된 바와 같이, "실질적으로 포함하지 않는"은 배양된 배지와 관련된다. 즉, 염, 완충제, (CO2를 포함하지 않는) 산 또는 염기를 사용하여 출발 배지의 pH를 조절할 수 있다. 유기체의 발효 및 생장이 진행함에 따라 pH 변동을 조절하기 위해 이러한 염, 완충제, (CO2를 포함하지 않는) 산 또는 염기를 사용하는 경우, 최소량이 사용된다. 그러나, 염, 완충제, (CO2를 포함하지 않는) 산 또는 염기는 디아민 카보네이트 및/또는 카바메이트를 중화시키는 데 사용되지 않는다. 미생물은 부산물, 예컨대, 아세테이트, 석시네이트, 다른 염 및/또는 유기산을 생성할 것임을 이해해야 한다. 발효 동안 pH의 조절은 외부로부터 첨가될 수 있거나 미생물의 생장에 의해 생성될 수 있는 이산화탄소의 사용에 의해 달성된다.
CO 2 및 디아민 유리 염기의 방출
일단 디아민-카보네이트 및/또는 카바메이트가 형성되면, 디아민 유리 염기, 예를 들면, HMD 유리 염기로 전환시킴으로써 디아민을 수득한다. 일부 실시양태에서, DA-카보네이트 및/또는 카바메이트를 DA 유리 염기로 전환시키기 전에 배양된 배지 중의 미생물로부터 먼저 분리한다. DA-카보네이트 및/또는 카바메이트를 DA 유리 염기로 전환시킨 예는 가열, 진공, 이온 교환 또는 전기투석에 의한 전환을 포함한다. 한 실시양태에서, 디아민은 이산화탄소를 방출함으로써 전환될 수 있는 HMD 유리 염기이다. 일부 실시양태에서, (정방향 반응과 관련하여 더 완전히 전술되어 있는) 탄산 안하이드라제 효소는 비카보네이트 및/또는 카보네이트 이온을 이산화탄소로 전환시킴으로써 DA 카보네이트류 또는 DA 카바메이트류 용액으로부터의 이산화탄소의 방출을 향상시키기 위해 제공될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 효소는 예를 들면, 미생물의 부분일 수 있거나 외생적으로 첨가될 수 있는 조작된 효소로서 외생적으로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조작된 CA는 발효 브로쓰 또는 발효 용액 내로 배출되도록 조작될 수 있다. 다른 실시양태에서, 조작된 CA는 미생물의 주변세포질에 존재하도록 조작될 수 있다. 일부 실시양태에서, DA-카보네이트 및/또는 카바메이트를 DA 유리 염기로 전환시키기 전에 배양된 배지 중의 미생물로부터 먼저 분리한다. 이러한 실시양태에서, CA는 외생적으로 CA를 첨가함으로써 제공될 수 있다. 다른 실시양태에서, CA는 고정될 수 있다. 다른 실시양태에서, CA는 탄산 안하이드라제 활성을 제공할 수 있는 조작된 미생물의 부분이다. 다른 실시양태에서, 탄산 안하이드라제 활성은 DA 합성 경로, 예컨대, HMD 합성 경로 및 탄산 안하이드라제 활성을 포함하는 조작된 미생물에 의해 제공된다.
가열이 디아민 카보네이트 및/또는 카바메이트(예를 들면, HMD)를 디아민 유리 염기로 전환시키는 데 사용되는 경우, 온도는 70℃ 초과, 80℃ 초과 또는 105℃ 초과의 온도를 포함한다. 일부 실시양태에서, 온도는 200℃ 초과의 온도일 수 있다. 다른 실시양태에서, 온도는 약 315℃일 수 있다. 일부 실시양태에서, 온도는 315℃ 미만, 250℃ 미만 또는 215℃ 미만이다. 다른 실시양태에서, 온도는 20℃ 초과, 30℃ 초과 또는 40℃ 초과의 온도일 수 있고, 이때 진공이 이용된다. 일부 실시양태에서, 상기 개시된 온도에서 유리 염기로 전환된 디아민 카보네이트 및/또는 카바메이트는 HMD일 수 있다. CA는 비카보네이트 및/또는 카보네이트 이온을 이산화탄소 및 유리 염기로 전환시킴으로써 DA 카보네이트류 또는 DA 카바메이트류 용액으로부터의 이산화탄소의 방출을 향상시키기 위해 가열 단계에 첨가될 수도 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 역방향 반응에 유리한 개선된 성질(예를 들면, 열 안정성, 용매 안정성, 고농도의 DA에서의 개선된 안정성 또는 활성 및/또는 염기 안정성)을 갖는 CA가 제공된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 탄산 안하이드라제에 의해 촉진되는 역방향 반응의 방법은 70℃ 초과, 80℃ 초과 또는 105℃ 초과의 온도에서 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 온도는 200℃ 초과의 온도일 수 있다. 다른 실시양태에서, 온도는 약 315℃일 수 있다. 일부 실시양태에서, 온도는 315℃ 미만, 250℃ 미만 또는 215℃ 미만이다. 다른 실시양태에서, 온도는 20℃ 초과, 30℃ 초과 또는 40℃ 초과의 온도일 수 있고, 진공이 이용되는 경우, 70℃ 초과, 80℃ 초과 또는 105℃ 초과의 온도일 수 있다. 일부 실시양태에서, 온도는 200℃ 초과의 온도일 수 있다. 다른 실시양태에서, 온도는 약 315℃일 수 있다. 일부 실시양태에서, 온도는 315℃ 미만, 250℃ 미만 또는 215℃ 미만이다. 다른 실시양태에서, 온도는 20℃ 초과, 30℃ 초과 또는 40℃ 초과의 온도일 수 있고, 이때 진공이 이용된다.
전환은 진공, 예컨대, 대기압보다 더 낮은 압력(예를 들면, 0.01 내지 1 atm)에서 수행될 수도 있다. 다른 실시양태에서, 압력은 약 1 내지 약 10 bar(입구 공기압이 아닌 용기 내부의 압력) 또는 약 1 내지 약 3 bar의 압력을 포함할 수 있다. 온도 및 압력이 병용될 때, 압력은 약 1 내지 약 3 bar일 수 있다. 일부 실시양태에서, 온도는 315℃ 미만, 250℃ 미만 또는 215℃ 미만이다.
방출된 CO2는 시스템(예를 들면, 배양된 배지) 내로 다시 재순환될 수 있다.
디아민-카보네이트 및/또는 카바메이트(예를 들면, HMD)를 디아민 유리 염기(예를 들면, HMD 유리 염기)로 전환시키는 다른 예는 가스(예를 들면, 공기, 또는 불활성 가스, 예컨대, 질소 또는 헬륨)를 사용한 살포 또는 증기 스트립핑을 포함한다. 증기는 외부 공급원으로부터 첨가될 수 있거나, 브로쓰를 끓임으로써 제자리에서 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 유리 염기로의 디아민(예를 들면, HMD) 카보네이트 및/또는 카바메이트의 전환은 가열 및 가스를 사용한 살포에 의한 전환을 포함한다. 한 실시양태에서, 스트립핑은 약 1 내지 약 10 bar의 압력에서 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 전환 단계는 약 적어도 20% 내지 약 적어도 99%의 디아민 유리 염기를 생성할 수 있다. 다른 실시양태에서, 전환 단계는 적어도 약 20% 내지 30%, 30% 내지 40%, 또는 40% 내지 50%의 디아민 유리 염기를 생성할 수 있다.
스트립핑 컬럼 내의 제자리에서 배지로부터 증기를 생성하기 위해 충분한 열이 가해질 때, 효율적인 후속 디아민 회수를 가능하게 하는, 디아민(예를 들면, HMD) 유리 염기가 농축되어 있는 용액을 수득하기 위해 물 및 이산화탄소 둘 다를 충분한 양으로 제거할 수 있다. 일부 실시양태에서, 비카보네이트 및/또는 카보네이트 이온을 이산화탄소로 전환시킴으로써 DA 카보네이트류 또는 DA 카바메이트류 용액으로부터의 이산화탄소의 방출을 향상시키기 위해 CA도 첨가한다. DA 카보네이트 염 용액(예를 들면, HMD-비카보네이트 염 용액)으로부터의 CO2 제거의 효율을 증가시키는 것은 스트립핑 컬럼의 크기를 감소시킴으로써 정제 비용을 낮출 수 있다.
일부 실시양태에서, 디아민 유리 염기로서 회수된 디아민은 40% 초과 또는 50% 초과의 수준일 수 있다. 다른 실시양태에서, 주위 압력, 공기 살포 및 (예를 들면, 315℃ 미만, 215℃ 미만 또는 약 115℃의) 고온 하에 스트립핑 단계로부터 유리 염기 형태로 회수된 디아민은 50% 초과의 수준일 수 있다.
디아민(예를 들면, HMD) 유리 염기가 생성되고 CO2가 제거된 후 강염기(예를 들면, 수산화나트륨 또는 수산화칼슘)의 첨가는 pH를 상승시킴으로써, 추출을 개선할 수 있다. 수산화칼슘이 사용되는 경우, 나중에 액체 상으로부터 분리될 수 있는 카보네이트 침전물이 형성될 것이다.
전환 전 고체 제거
디아민(예를 들면, HMD) 카보네이트 및/또는 카바메이트를 디아민 유리 염기를 전환시키기 전, 고체를 배양된 배지로부터 분리할 수 있다. 이러한 고체는 배양된 배지로부터의 세포 및 다른 바이오매스 부산물 및 불순물을 포함할 수 있다. 생성된 액체 분획에는 디아민(예를 들면, HMD) 카보네이트 및/또는 카바메이트가 풍부할 수 있다.
분리는 원심분리, 여과, 회전 드럼 또는 이들의 병용에 의해 달성될 수 있다. 예시적인 원심분리는 디스크-스택(disc-stack) 원심분리기 또는 디캔터(decanter) 또는 고체 사발 원심분리기에 의해 달성될 수 있다. 원심분리 유형 또는 구성과 원심분리의 수의 임의의 조합을 이용하여 배양 배지로부터의 원하는 고체 분리를 달성할 수 있다는 것을 이해해야 한다. 고체가 원심분리에 의해 분리될 수 없거나 추가 분리가 요구되는 경우, 여과에 의한 분리가 이용될 수 있다. 여과는 한외여과에 의해 달성될 수 있다.
물 감소 또는 제거
일부 실시양태에서, 물은 고체 제거 후 및 전환 전에 제거될 수 있거나 감소될 수 있다. 물 제거 또는 감소를 위한 임의의 공지된 적합한 공정, 예를 들면, 증발, 역삼투 또는 전기투석이 이용될 수 있다.
다른 실시양태에서, 물은 디아민 유리 염기를 단리하는 단계 전에 제거될 수 있다. 단리 단계 전에 물을 제거하는 것의 한 이점은 pH의 증가일 수 있다. 고체 제거 후 및 전환 전에 물 감소 또는 제거와 관련하여 상기 개시된 바와 같이 물을 감소시키거나 제거하는 방법도 이용될 수 있다. 물 제거의 양(예를 들면, 물 제거의 상한)은 배지 성분 또는 부산물, 또는 디아민 염 또는 카바메이트의 가용성 한계에 의해 좌우될 수 있다. 한 실시양태에서, 물 제거는 이것이 디아민 염 또는 카바메이트를 포함하는 배지 성분 또는 부산물의 불용성을 방해하는지에 의해 좌우된다.
증발은 다중 효과 증발기, 열 증기 재압축 또는 기계적 증기 재압축에 의해 수행될 수 있다. 증발기는 저압 증기 생성기이기도 한, 액체를 끓여 증기를 제공하는 열 교환기이다. 이 증기는 또 다른 "효과"로서 지칭되는, 또 다른 증발기에서의 추가 가열을 위해 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 2개의 증발기들은 한 증발기로부터의 증기 선이 나머지 증발기의 증기실에 연결되어 2-효과 또는 이중-효과 증발기를 제공하도록 연결될 수 있다. 이 구성은 예를 들면, 제3 증발기로 확장되어 삼중-효과 증발기를 생성할 수 있다.
한 실시양태에서, 제거되는 물의 양은 10 중량 퍼센트이다. 제거된 물은 예컨대, 단계 a)의 배양 공정에서 또는 도 4에 나타낸 바와 같이 추가로 회수될 수 있고 재순환될 수 있다.
물 및 이산화탄소의 동시적인 제거
물 제거 또는 감소는 더 작은 용매 추출 컬럼 및 더 적은 용매를 사용할 수 있게 하고, 이산화탄소의 제거는 용매 추출 효율을 증가시키기 위한 디아민 조성물(예를 들면, 여과 투과물)의 알칼리화를 가능하게 한다. 전술된 한 실시양태에서, 증발기를 이용하여 충분한 물을 제거한 후(그리고 CO2의 제거도 가능하게 한 후), 스트립핑 컬럼을 이용하여 임의의 잔류 이산화탄소를 제거한다(그리고 물도 제거할 수 있다). 단일 단계에서 물 및 이산화탄소를 후속 추출에 충분한 점까지 동시에 제거하는 것은 다수의 단계들과 관련된 비용 및 고장시간을 감소시킨다는 이점을 가진다. 따라서, 전술된 또 다른 실시양태에서, 단일 단계 또는 유닛 작업을 이용하여 충분한 물 및 이산화탄소(예를 들면, DIC)를 제거함으로써, 예컨대, 용매 추출에 의한 다운스트림 디아민 회수를 향상시킨다. 따라서, 단계 또는 유닛 작업(예를 들면, 물 증발기 또는 스트립핑 컬럼) 및 이의 관련된 장치 비용, 유지, 사용 및 고장시간의 위험이 부재할 수 있거나 감소될 수 있다. 한 실시양태에서, 동시적인 물 및 이산화탄소 제거는 HMD의 다운스트림 회수를 향상시킨다.
물 제거도 이산화탄소 스트립핑을 가능하게 할 수 있을 것이다. 물 제거를 위한 조건은 충분한 이산화탄소 제거를 가능하게 하여, 별도의 CO2 제거 단계에 대한 필요성을 배제할 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 물 및 CO2의 동시적인 제거는 스트립핑 유닛 또는 증발기 유닛에 의해 효과적으로 달성된다. 예를 들면, 증발기, 예를 들면, 다중-효과 증발기, 기계적 증기 재압축기를 이용하여 충분한 물 및 이산화탄소를 제거함으로써, 효율적인 후속 디아민 회수를 가능하게 하는, 디아민 유리 염기가 농축되어 있는 용액을 수득할 수 있다. 예를 들면, 도 4에서, 보유된 단계가 물 및 이산화탄소 둘 다의 충분한 제거를 달성할 때 단계 4 또는 5는 부재할 수 있다. 실시예에서 입증된 바와 같이, 증발기 단계의 이용은 증기 스트립핑 단계에 비해 유리할 수 있다.
탄산 안하이드라제는 DA 카보네이트류 또는 DA 카바메이트류 용액으로부터의 이산화탄소의 방출을 향상시키기 위해 이산화탄소를 방출하고 유리 DA 염기를 생성하는 단계 또는 단계들에서 존재할 수 있다는 것을 이해해야 한다. 일부 실시양태에서, CA는 물 제거 또는 증발 단계에서 존재할 수 있고, 다른 실시양태에서 CA는 CO2 스트립핑 단계에서 존재할 수 있고, 다른 실시양태에서 CA는 물 제거 또는 증발 단계 및 CO2 스트립핑 단계 둘 다에서 존재할 수 있다.
디아민 유리 염기의 단리
일단 전환되면, DA(예를 들면, HMD) 유리 염기는 유기 용매를 사용한 추출에 의해 배양된 배지로부터 단리될 수 있다. 단리된 DA는 공정, 예컨대, 증류에 의해 유기 용매로부터 분리된다. 예시적인 추출 용매는 알코올, 아민, 에테르, 알칸 및 케톤을 포함한다. 예시적인 추출 알코올은 C4 내지 C8 1가 알코올을 포함한다. 일부 실시양태에서, 추출 알코올은 헥산올, 특히 1-헥산올, 이소펜탄올 또는 사이클로헥산올, 톨루엔 또는 에틸 에테르 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 특히 HMD가 디아민일 때, 알칸은 실시예에서 입증된 바와 같이 적합한 용매이다. 알칸, 구체적으로 헥산은 그의 극도로 낮은 수용성 때문에 사용될 수 있다. 헥산은 물이 존재한다 하더라도 물을 거의 추출하지 않았고 이용가능한 유리 염기의 적당한 회수를 제공하였다. 따라서, 알칸은 디아민 유리 염기(예를 들면, HMD)의 회수에 사용되기에 적합한 용매이다. 적합한 알칸은 선형 또는 분지형 C5-C12를 포함한다. 한 실시양태에서, 추출될 디아민 및 용매로서 선택된 알칸 둘 다가 동일한 수의 탄소 원자를 가질 수 있다. 헵탄은 특히 HMD를 위한 또 다른 적합한 알칸이고, 이것은 하기 인 실리코 모델링 연구에 의해 더 뒷받침된다. 헥산 및 헵탄의 이성질체가 적합하다. 헥산 이성질체는 2-메틸펜탄, 3-메틸펜탄, 2,2-디메틸부탄 및 2,3-디메틸부탄이다. 헵탄 이성질체는 2-메틸헥산, 3-메틸헥산, 2,2-디메틸펜탄, 2,3-디메틸펜탄, 2,4-디메틸펜탄, 3,3-디메틸펜탄, 3-에틸펜탄 및 2,2,3-트리메틸부탄이다. 일부 실시양태에서, DA(예를 들면, HMD) 유리 염기는 배양된 배지로부터 직접적으로 증류될 수 있다.
임의의 적합한 용매가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 용매는 HMD 유리 염기 또는 원하는 디아민 유리 염기보다 더 높고 물보다 더 낮은 비점, 또는 HMD 유리 염기(또는 원하는 디아민 유리 염기)와 물 사이의 임의의 끓는 점(중간 비점)을 가질 수 있다.
수성상 또는 DA 유리 염기 함유 유기상을 제공하기 위해 추출 용매를 사용하여 배지 또는 DA 농후 분획(예를 들면, 고체 및/또는 물이 단리 전에 제거될 때)으로부터 DA(예를 들면, HMD) 유리 염기를 단리할 수 있다.
유기상(추출물)은 유리 염기, 카보네이트류 및/또는 카바메이트류형태, 그러나 주로 유리 염기 형태로 적어도 10 중량%, 적어도 20 중량%, 적어도 30 중량%, 적어도 40 중량% 또는 적어도 50 중량%의 DA(예를 들면, HMD)를 포함할 수 있다. 추출 횟수에 따라, 일부 실시양태에서, 추출물 중의 DA(예를 들면, HMD)는 90 중량% 초과의 수준일 수 있다.
추출되는 DA 유리 염기의 양은 약 90 중량% 초과의 수준이다. 일부 실시양태에서, DA 유리 염기는 90 중량% 초과의 HMD 유리 염기이다.
디아민, 예를 들면, HMD, 유리 염기의 용매 추출의 효율은 실시예에서 밝혀진 바와 같이 이산화탄소 농도, 예컨대, DIC의 감소에 따라 증가한다. 이산화탄소의 감소는 pH를 더 높이고 회수가능한 유리 염기 형태의 농도를 더 높인다. 일부 실시양태에서, 용매 추출 전 수성 디아민 용액은 검출가능한 이산화탄소를 함유하지 않거나, 0.01% 미만의 이산화탄소를 함유하거나, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5% 또는 1% 미만, 또는 5% 미만의 이산화탄소를 함유한다. 일부 실시양태에서, 용매 추출 전 수성 디아민 용액은 검출가능한 DIC를 함유하지 않거나, 0.01% 미만의 DIC를 함유하거나, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5% 또는 1% 미만, 또는 5% 미만의 DIC를 함유한다. 다른 실시양태에서, 용매 추출 전 수성 DA 용액은 검출가능한 DIC를 함유하지 않거나, 0.01% 미만의 DIC를 함유하거나, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5% 또는 1% 미만, 또는 5% 미만의 DIC를 함유한다.
한 실시양태에서, 효소 사용 경로에 의해 DA, 예를 들면, HMD와 화학량론적으로 생성된 CO2를 사용하여 DA, 예를 들면, HMD를 중화시킴으로써, 발효에 적합한 pH를 일반적으로 약 9 이하의 pH로 유지한다. 원하는 경우 또는 필요한 경우, 부산물로서 미생물(예를 들면, CO2로 포르메이트화하기 위한 피루베이트의 션트)에 의해 생성된 CO2 또는 CO2의 외부 공급원으로 보충함으로써 추가 pH 조절을 달성할 수 있다. 외부 CO2는 구입될 수 있거나 발효/단리 공정으로부터 재순환된 CO2일 수 있다. 발효 동안 CO2의 존재로 인해, HMD 카보네이트, HMD 비스-비카보네이트, HMD 비카보네이트, 및 소량의 HMD 카바메이트 및 HMD 비스카바메이트가 형성된다. 발효 종료 시, 세포를 임의적으로 제거하고, 배양 배지를 압력 하에 처리하여 HMD 카보네이트류 또는 카바메이트류 화합물(또는 DA 카보네이트류 또는 카바메이트류 화합물)을 분해함으로써 예를 들면, CO2 기체를 방출하고, 배양된 배지의 pH를 증가시키는 유리 염기 HMD(중성 형태 2HN-(CH2)6-NH2)(또는 DA 유리 염기)를 생성한다. 유리 염기 또는 중성 HMD(또는 DA)는 용매 추출을 통해 단리될 수 있다. 공정 동안, 방출된 CO2는 재순환될 수 있다. 한 실시양태에서, 개시된 공정은 pH를 조절하기 위한 산의 사용, 및 용매 추출가능한 유리 염기 HMD(또는 DA)를 생성하도록 산을 중화시키기 위한 염기의 후속 첨가를 요구하지 않는다.
공정의 또 다른 실시양태에서, 배양물 또는 배양된 배지를 예를 들면, 회분식 또는 연속식으로 환류 온도까지, 예를 들면, 대기압에서 90℃ 내지 110℃까지 또는 초과압력에서 더 높은 온도까지 가열함으로써 열처리한다.
공정의 또 다른 실시양태에서, 물과의 혼화성 갭을 갖고 알칼리 pH에서 안정한 유기 용매, 예컨대, 특히 극성, 보다 구체적으로 양극성 양성자성 유기 용매로 DA(예를 들면, HMD)를 추출한다. 적합한 용매는 상기 개시된 바와 같다.
한 실시양태에서, DA(예를 들면, HMD) 추출 및/또는 후속 상 분리는 승온에서 회분식으로 수행된다.
미생물 유기체를 제거하기 전 또는 후, 배양된 배지를 공지된 방법, 예를 들면, 회전 증발기, 박막 증발기, 강하 막 증발기, 역삼투 또는 나노여과로 걸쭉하게 만들 수 있거나 농축할 수 있다. 필요하다면, 농축 절차로 인해 침전되었을 수 있는 염을 예를 들면, 여과 또는 원심분리로 제거할 수 있다. 그 다음, 이 농축된 배양된 배지를 본원에 개시된 방식으로 마무리처리하여 DA(예를 들면, HMD)를 수득할 수 있다. 개시된 공정에 따른 마무리처리를 위해, 이러한 농축 절차가 실행될 수 있으나, 반드시 필요한 것은 아니다.
한 실시양태에 따라, 유기 용매를 사용하여 DA(예를 들면, HMD)를 배양된 배지로부터 추출한다. 유기 용매는 예를 들면, 물과의 혼화성 갭을 가질 수 있고 알칼리 pH에서 안정할 수 있다(예컨대, 특히 극성, 양극성 양성자성, 유기 용매). 적합한 용매는 특히 3개 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 고리형 또는 개방된-쇄, 임의적으로 분지된 알칸올, 특히 n-프로판올 및 이소-프로판올, n-부탄올, sec-부탄올 및 이소-부탄올, 또는 사이클로헥산올, 및 또한 n-펜탄올, n-헥산올, n-헵탄올, n-옥탄올, 2-옥탄올 및 이들의 단일분지된 또는 다중분지된 이성질체 형태이다.
한 실시양태에서, 추출 및/또는 후속 상 분리는 물 및 추출제 또는 가능하게는 형성되는 공비혼합물의 비점에 의해 한정되는 승온에서 회분식으로 수행된다. 예를 들면, 추출제를 사용하여, n-부탄올 추출 및 상 분리를 예를 들면, 약 25℃ 내지 90℃ 또는 바람직하게는 40℃ 내지 70℃에서 수행할 수 있었다. 추출을 위해, 분할 평형이 확립될 때까지, 예를 들면, 10초 내지 2시간, 또는 5분 내지 15분에 걸쳐 2개의 상들을 교반한다. 그 다음, 상기 상들이 완전히 분리될 때까지 이들을 침강시키는데; 이것은 특히 n-부탄올의 경우 약 25℃ 내지 90℃ 또는 40℃ 내지 70℃ 범위 내의 온도에서, 예를 들면, 10초 내지 5시간, 예를 들면, 15분 내지 120분 또는 30분 내지 90분이 걸린다.
추가 실시양태에서, 다단계 공정(예를 들면, 혼합기-침강기 병용)에서 연속적으로 또는 추출 컬럼에서 연속적으로 DA(예를 들면, HMD)를 배양된 배지로부터 추출한다.
당업자는 최적화 관행의 일부로서 각각의 경우에서 상이 분리되도록 개시된 공정에 따라 사용될 수 있는 추출 컬럼의 구성을 확립할 수 있다. 적합한 추출 컬럼은 원칙적으로 동력 입력을 갖지 않는 추출 컬럼 또는 동력 입력을 갖는 추출 컬럼, 예를 들면, 펄스 컬럼 또는 회전하는 내부구조물을 갖는 컬럼이다. 당업자는 상 분리를 최적화하기 위해 관행적인 작업의 일부로서 내부구조물, 예컨대, 시브 트레이(sieve trays) 및 컬럼 트레이의 유형 및 재료를 적합한 방식으로 선택할 수도 있다. 소분자의 액체-액체 추출의 기초 이론은 잘 공지되어 있다(예를 들면, 문헌(H.-J. Rehm and G. Reed, Eds., (1993), Biotechology, Volume 3 Bioprocessing, Chapter 21, VCH, Weinheim) 참조). 산업적으로 적용될 수 있는 추출 컬럼의 구성은 예를 들면, 문헌(Lo et al., Eds., (1983) Handbook of Solvent Extraction, John Wiley & Sons, New York)에 기재되어 있다. 상기 교재의 개시를 분명히 참고한다.
상 분리 후, 그 자체로 공지되어 있는 방식으로 DA(예를 들면, HMD)를 DA 함유 추출물 상으로부터 단리하고 정제한다. DA(예를 들면, HMD)를 회수하는 가능한 방법은 특히 증류, 적합한 유기산 또는 무기산에 의한 염으로서의 침전, 또는 이러한 적합한 방법들의 병용이나, 이들로 한정되지 않는다.
증류
증류는 연속식으로 또는 회분식으로 수행될 수 있다. 단일 증류 컬럼 또는 서로 커플링된 복수의 증류 컬럼들이 사용될 수 있다. 증류 컬럼 장치의 구성 및 작업 파라미터의 확립은 당업자의 책임이다. 각각의 경우 사용되는 증류 컬럼은 그 자체로 공지되어 있는 방식으로 디자인될 수 있다(예를 들면, 문헌(Sattler, Thermische Trennverfahren [Thermal separation methods], 2nd Edition 1995, Weinheim, p. 135ff; Perry's Chemical Engineers Handbook, 7th Edition 1997, New York, Section 13) 참조). 따라서, 사용된 증류 컬럼은 분리 효과적인 내부구조물, 예컨대, 분리 트레이, 예를 들면, 천공된 트레이, 버블-캡 트레이 또는 밸브 트레이, 정렬된 팩킹, 예를 들면, 시트-금속 또는 패브릭 팩킹, 또는 팩킹의 무작위적 층을 가질 수 있다. 사용된 컬럼(들)에서 요구된 플레이트의 수 및 환류 비는 본질적으로 분리될 액체의 순도 요건 및 상대적인 끓는 위치에 의해 좌우되고, 이때 당업자는 공지된 방법으로 특정 디자인 및 작동 데이터를 확인할 수 있다.
일부 실시양태에서, 증류 단계는 물 및 용매를 실질적으로 제거한다. 증류의 온도는 170℃ 미만, 160℃ 미만, 150℃ 미만 또는 140℃ 미만일 수 있다.
염으로서의 침전은 적합한 유기산 또는 무기산, 예를 들면, 황산, 염산, 인산, 아세트산, 포름산, 탄산, 옥살산 등의 첨가에 의해 달성될 수 있다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 후속 다중축합에서 예를 들면, 재결정화에 의해 직접적으로 또는 정제 후 사용되어 폴리아미드를 제공할 수 있는 염을 형성하는 유기 디카복실산이 사용된다. 보다 구체적으로, 이러한 디카복실산은 C4-C12-디카복실산이다.
추출 절차에서 생성된 유기 DA(예를 들면, HMD) 상은 크로마토그래피에 의해 마무리처리될 수도 있다. 크로마토그래피의 경우, DA 상은 적합한 수지, 예를 들면, 강산성 또는 약산성 이온 교환기(예컨대, Lewatit 1468 S, Dowex Marathon C, Amberlyst 119 Wet 등)에 적용되고, 이때 원하는 생성물 또는 오염물질은 크로마토그래피 수지 상에서 부분적으로 또는 전체적으로 체류된다. 필요하다면, 동일한 또는 다른 크로마토그래피 수지를 사용하여 이들 크로마토그래피 단계들을 반복할 수 있다. 당업자는 적절한 크로마토그래피 수지의 선택 및 이의 가장 효과적인 적용에 익숙하다. 정제된 생성물은 여과 또는 한외여과에 의해 농축될 수 있고 적절한 온도에서 저장될 수 있다.
단리된 화합물(들)의 정체(identity) 및 순도는 공지된 기술에 의해 확인될 수 있다. 이 기술은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 가스 크로마토그래피(GC), 분광학적 방법, 염색 방법, 박층 크로마토그래피, NIRS, 효소 어세이 또는 미생물학적 어세이를 포함한다. 이들 분석 방법들은 문헌(Patek et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60:133-140; Malakhova et al. (1996) Biotekhnologiya 11 27-32; Schmidt et al. (1998) Bioprocess Engineer. 19:67-70. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) Vol. A27, VCH: Weinheim, pp. 89-90, pp. 521-540, pp. 540-547, pp. 559-566, 575-581 and pp. 581-587; Michal, G (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons; Fallon, A. et al. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 17)에 요약되어 있다.
개시된 공정은 도 4에 나타낸 단계들 또는 공정들의 다양한 조합을 포함할 수 있다. 도 4를 참조하건대, 시스템 및 단계는 하기 시스템 및 단계를 포함한다:
1: 미생물이 이산화탄소, 카보네이트, 비카보네이트 또는 탄산의 존재 하에, 배양된 배지에서 디아민 카보네이트류 및/또는 카바메이트류중 하나 이상을 형성하기에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 적합한 배지에서 배양될 수 있거나 생장될 수 있는 발효기 또는 임의의 용기.
2: 미생물 가열 사멸/전환: 많은 공정들은 발효 후 미생물 배양물의 불활성화를 요구한다. 일단 디아민 카보네이트 및/또는 카바메이트가 형성되면, 이들은 유리 염기로 전환될 수 있고, 이때 CO2는 멸균/가열 사멸 단계가 승온에서 일어나는 경우 방출된다.
3: 고체 제거: 디아민 카보네이트 및/또는 카바메이트가 전환되어 CO2를 방출하기 전, 배양된 배지로부터의 고체를 임의적으로 제거할 수 있다.
4: 전환(CO2를 방출하는 모든 가능한 방식들). 방출된 CO2는 발효기로 재순환될 수 있다.
5: 물 제거: DA 유리 염기 혼합물로부터의 물 제거, 및 발효기로의 물 및/또는 이산화탄소의 임의적 재순환.
6: 용매 추출: 추출기에서 유기 용매로 DA 혼합물을 추출하여 유기상 DA 용액 및 수성 라피네이트를 형성하고, 임의적으로 수성 라피네이트를 전환 단계로 재순환시키는 단계.
7: 정제: 임의적으로 유기 용매를 용매 추출 단계로 다시 재순환시키는 증류를 포함하고, 정제는 디아민을 정제하기 위한 더 많은 증류 컬럼 및 발색 화합물 등을 제거하기 위한 다른 단계를 포함할 수 있다.
8: 정제된 DA: 결과적으로 상기 단계들로부터 정제된 DA 유리 염기.
9: CO2가 방출되지 않는 경우, 임의적 미생물 가열 사멸.
10: 임의적 물 제거, 물 및 방출된 경우 가능한 CO2의 재순환, 카보네이트류 및/또는 카바메이트류혼합물로부터의 물의 제거, 및 발효기로의 물 및/또는 이산화탄소의 임의적 재순환.
11: CO2의 방출이 있거나 없는, 수성상으로부터의 임의적인 직접적 정제는 증류, 이온 교환, 전기투석 및 다른 적합한 공정 또는 단계를 포함할 수 있다. 이들 단계들에서 생성된 경우 물 및 CO2를 재순환시키는 것이 가능하다: 임의적으로, 배양된 배지로부터의 카보네이트 및/또는 카바메이트를 직접적으로 전환시켜 DA 유리 염기 혼합물을 형성하고, 임의적으로, 발효기로 재순환될 수 있는 물 및/또는 이산화탄소를 방출하는 단계.
12: HMD로부터 카보네이트를 제거하기 위한 알칼리화(NaOH 또는 CaOH) 또는 다른 단계(이온 교환, 전기투석 등): DA 유리 염기 혼합물로부터 카보네이트 및/또는 카바메이트를 제거하기 위해 수성 염기를 첨가하는 단계.
도 4를 참조하건대, 단계들의 다양한 조합들 중 일부는 다음과 같다:
1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8
1, 3, 4, 5, 6, 7, 8
1, 9, 3, 4, 5, 6, 7, 8
1, 2, 3, 10, 4, 5, 6, 7, 8
1, 3, 10, 4, 5, 6, 7, 8
1, 9, 3, 10, 4, 5, 6, 7, 8
1, 2, 3, 10, 11, 8
1, 3, 10, 11, 8
1, 9, 3, 10, 11, 8
1, 2, 3, 11, 8
1, 3, 11, 8
1, 9, 3, 11, 8
1, 2, 3, 4, 11, 8
1, 2, 3, 10, 4, 11, 8
1, 3, 10, 4, 11, 8
1, 3, 4, 11, 8
1, 9, 3, 4, 11, 8
1, 9, 3, 10, 4, 11, 8
1, 2, 3, 4, 12, 6, 7, 8
1, 2, 3, 10, 4, 12, 6, 7, 8
1, 3, 4, 12, 6, 7, 8
1, 3, 10, 4, 12, 6, 7, 8
1, 9, 3, 4, 12, 6, 7, 8
1, 9, 3, 10, 4, 12, 6, 7, 8
1, 2, 3, 4, 5, 12, 6, 7, 8
1, 2, 3, 10, 4, 5, 12, 6, 7, 8
1, 3, 4, 5, 12, 6, 7, 8
1, 3, 10, 4, 5, 12, 6, 7, 8
1, 9, 3, 4, 5, 12, 6, 7, 8
1, 9, 3, 10, 4, 5, 12, 6, 7, 8
원칙적으로 임의의 디아민 함유 배양된 배지(예를 들면, HMD 함유 배양된 배지)를 사용하여 개시된 방법을 적용할 수 있다. 원칙적으로 배양 또는 발효에서 사용되는 미생물에 대한 어떠한 한정도 없다. 미생물은 천연 생성 미생물; 돌연변이 및 선택에 의해 개선된 미생물; 및 재조합적으로 제조된 또는 유전적으로 조작된 미생물, 예컨대, 박테리아 및 진균일 수 있다. 이들 미생물들은 DA 또는 DA 유도체, HMD 및/또는 HMD 유도체, 예컨대, HMD 카보네이트 또는 HMD 비카보네이트를 생성할 수 있다. 보다 구체적으로, 사용된 재조합 유기체는 하기 논의되어 있고 미국 특허 제8,377,680호 또는 여기서 인용된 다른 참고문헌에 개시되어 있는(이러한 개시는 전체로서 본원에 참고로 도입됨) HMD 경로("HMD 경로")를 통해 DA 생합성, 예를 들면, HMD 생합성을 할 수 있다.
일부 실시양태에서, DA 경로의 적어도 하나의 효소를 코딩하는 적어도 하나의 외생성 핵산을 포함하는 DA 경로를 갖는 유전적으로 조작된 미생물은 탄산 안하이드라제 효소를 코딩하는 외생성 핵산도 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 유전적으로 조작된 미생물은 적어도 하나의 DA 카보네이트류 및/또는 DA 카바메이트류, 바람직하게는 HMD 카보네이트류 및/또는 카바메이트류화합물을 생성하기에 충분한 양으로 발현되는, DA 합성 경로, 바람직하게는 HMD 합성 경로의 적어도 하나의 효소 및 탄산 안하이드라제 효소 또는 변이체를 코딩하는 적어도 2종의 외생성 핵산을 갖는 DA 합성 경로, 바람직하게는 HMD 합성 경로를 가진다. 다른 실시양태에서, 유전적으로 조작된 미생물은 적어도 하나 이상의 DA 유리 염기, 바람직하게는 HMD 유리 염기, 및 이산화탄소를 생성하기에 충분한 양으로 발현되는, DA 합성 경로, 바람직하게는 HMD 합성 경로의 적어도 하나의 효소 및 탄산 안하이드라제 효소 또는 변이체를 코딩하는 적어도 2종의 외생성 핵산을 갖는 DA 합성 경로, 바람직하게는 HMD 합성 경로를 가진다. 디아민 제조 방법은 적어도 하나의 DA 카보네이트류 및/또는 DA 카바메이트류, 바람직하게는 HMD 카보네이트류 및/또는 카바메이트류화합물을 생성하기에 충분한 양으로 발현되는, DA 경로, 바람직하게는 HMD 합성 경로 및 탄산 안하이드라제 효소 또는 변이체를 갖거나 적어도 하나 이상의 DA 유리 염기, 바람직하게는 HMD 유리 염기 및 이산화탄소 또는 이들 둘 다를 생성할 수 있는, 상기 논의된 바와 같은 유전적으로 조작된 미생물을 포함할 수 있다는 것을 이해해야 한다.
예시적인 HMD 합성 경로는 도 10, 11, 13, 20, 21, 22, 24, 25 및 26에 묘사된 경로들을 포함한다. HMD의 제조를 위한 다양한 경로들이 개시되어 있다. 예를 들면, HMD 경로는 하기 단계들을 포함한다:
a) 도 13의 A-N으로서 표시된 단계
b) 도 13의 단계 A/L/N/C
c) 도 13의 단계 M/N/C
d) 도 13의 단계 D/E/F/G/H
e) 도 13의 단계 D/I/J/G/H
f) 도 13의 단계 D/E/K/J/G
g) 도 15의 단계 A-H
h) 도 16의 단계 A/B/C/D/E/R/S
i) 도 16의 단계 A/B/F/G/D/E/R/S
j) 도 16의 단계 A/B/H/I/D/E/R/S
k) 도 16의 단계 A/B/C/AB/Z/R/S
l) 도 16의 단계 A/B/H/I/AB/Z/R/S
m) 도 16의 단계 A/B/F/G/AB/Z/R/S
n) 도 16의 단계 A/B//J/O/P/Q/S
o) 도 16의 단계 A/B/J/M/N/P/Q/S
p) 도 16의 단계 A/B/J/K/L/P/Q/S
q) 도 16의 단계 A/B/J/O/Z/R/S
r) 도 16의 단계 A/B/J/K/L/Z/R/S
s) 도 16의 단계 A/B/J/M/N/Z/R/S
t) 도 16의 단계 A/B/J/T/W/Q/S
u) 도 16의 단계 A/B/J/T/U/X/Q/S
v) 도 16의 단계 A/B/J/T/V/Y/Q/S
w) 도 17의 단계 A-G
x) 도 19의 단계 O/C 또는 D/P/G/H
y) 도 21의 단계 A/B/C/G/H/I/J/K/L/M
z) 도 21의 단계 K/L/H
aa) 도 21의 단계 I/J/H
bb) 도 21의 단계 I/G/C
cc) 도 21의 단계 A/B/C
dd) 도 21의 단계 A/M/H
ee) 도 22의 단계 A/B/C
ff) 도 20의 단계 A/E/F/G/AA
개시된 HMD 합성 경로들 중 임의의 HMD 합성 경로를 이용하여, 원하는 경로, 경로 중간체 또는 생성물을 생성하는 유전적으로 조작된 미생물을 생성할 수 있다. 예를 들면, 유전적으로 조작된 미생물은 적어도 하나의 HMD 카보네이트류 및/또는 카바메이트류화합물을 생성하기에 충분한 양으로 발현되는, HMD 합성 경로의 적어도 하나의 효소를 코딩하는 적어도 하나의 외생성 핵산을 포함하는 HMD 경로를 가질 수 있다. 유전적으로 조작된 미생물은 HMD 합성 경로의 효소를 코딩하는 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개 또는 적어도 11개의 외생성 핵산을 포함하는 HMD 경로를 가질 수 있다. 외생성 핵산은 예를 들면, 폴리펩티드를 코딩할 수 있고, 이때 상기 폴리펩티드는 원하는 기질 또는 중간체를 전환시킬 수 있고 원하는 HMD 합성 경로의 생성물을 생성할 수 있는 효소 또는 단백질이다.
일부 실시양태에서, HMD의 적어도 하나의 효소를 코딩하는 적어도 하나의 외생성 핵산을 포함하는 HMD 경로를 갖는 유전적으로 조작된 미생물은 탄산 안하이드라제 효소를 코딩하는 외생성 핵산도 포함할 수 있다.
예를 들면, HMD 합성 경로는 중간체, 예컨대, 3-옥소아디필-CoA, 아디페이트 세미알데하이드, 6-아미노카프로에이트(6-ACA), 6-ACA 세미알데하이드, 2-아미노피멜레이트, 3,6-디하이드록시헥사노일-CoA 및 호모라이신을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, HMD 합성 경로는 효소, 예컨대, 3-옥소아디필-CoA 티올라제, 6-ACA 트랜스아미나제 또는 데하이드로게나제, 6-아미노카프로일-CoA 리덕타제, 6-ACA 리덕타제, 아디필-CoA 리덕타제, 아디페이트 리덕타제, 6-하이드록시 3-옥소헥사노일-CoA 데하이드로게나제, 2-아미노피멜레이트 데카복실라제 및 호모라이신 데카복실라제를 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, HMD 합성 경로는 효소 및 기질-생성물 쌍, 예컨대, 석시닐-CoA 및 아세틸-CoA에 작용하여 3-옥소아디필-CoA를 제조하는 3-옥소아디필-CoA 티올라제, 아디필-CoA에 작용하여 6-ACA를 형성하는 6-ACA 트랜스아미나제, 6-아미노카프로일-CoA에 작용하여 6-ACA 세미알데하이드를 형성하는 6-아미노카프로일-CoA 리덕타제, 6-ACA에 작용하고 이를 6-ACA 세미알데하이드로 직접적으로 전환시키는 6-ACA 리덕타제, 아디필-CoA에 작용하여 아디페이트 세미알데하이드를 형성하는 아디필-CoA 리덕타제, 아디페이트에 작용하고 이를 아디페이트 세미알데하이드로 직접적으로 전환시키는 아디페이트 리덕타제, 6-하이드록시 3-옥소헥사노일-CoA를 환원시켜 3,6-디하이드록시 헥사노일-CoA를 형성하는 6-하이드록시 3-옥소헥사노일-CoA 데하이드로게나제, 2-아미노피멜레이트를 탈카복실화하여 6-ACA를 형성하는 2-아미노피멜레이트 데카복실라제, 및 호모라이신을 탈카복실화하여 HMDA를 형성하는 호모라이신 데카복실라제를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 미생물은 하기 효소들을 포함할 수 있는 원하는 합성 경로를 통해 원하는 디아민(예를 들면, HMD)을 생성할 수 있다:
(a) 3-옥소아디필-CoA 티올라제, 3-옥소아디필-CoA 데하이드로게나제, 3-하이드록시아디필-CoA 데하이드라타제, 5-카복시-2-펜테노일-CoA 리덕타제, 아디필-CoA 리덕타제, 6-ACA 트랜스아미나제 또는 데하이드로게나제, 6-ACA 트랜스퍼라제 또는 신세타제 및 6-ACA-CoA 리덕타제, 또는 6-ACA 리덕타제, HMDA 트랜스아미나제 또는 데하이드로게나제;
(b) 3-옥소아디필-CoA 티올라제, 3-옥소아디필-CoA 데하이드로게나제, 3-하이드록시아디필-CoA 데하이드라타제, 5-카복시-2-펜테노일-CoA 리덕타제, 아디필-CoA 리덕타제, 6-ACA 트랜스아미나제 또는 데하이드로게나제, 6-ACA 리덕타제, HMDA 트랜스아미나제 또는 데하이드로게나제;
(c) 3-옥소아디필-CoA 티올라제, 3-옥소아디필-CoA 데하이드로게나제, 3-하이드록시아디필-CoA 데하이드라타제, 5-카복시-2-펜테노일-CoA 리덕타제, 아디필-CoA 트랜스퍼라제, 하이드롤라제 또는 트랜스퍼라제, 아디페이트 리덕타제, 6-ACA 트랜스아미나제 또는 데하이드로게나제, 6-ACA 트랜스퍼라제 또는 신세타제, 6-ACA-CoA 리덕타제, HMDA 트랜스아미나제 또는 데하이드로게나제;
(d) 3-옥소아디필-CoA 티올라제, 3-옥소아디필-CoA 데하이드로게나제, 3-하이드록시아디필-CoA 데하이드라타제, 5-카복시-2-펜테노일-CoA 리덕타제, 아디필-CoA 트랜스퍼라제, 하이드롤라제 또는 트랜스퍼라제, 아디페이트 리덕타제, 6-ACA 트랜스아미나제 또는 데하이드로게나제, 6-ACA 리덕타제, HMDA 트랜스아미나제 또는 데하이드로게나제;
(e) 3-옥소아디필-CoA 티올라제, 3-옥소아디페이트 데하이드로게나제, 3-하이드록시아디페이트 데하이드라타제, 5-카복시-2-펜테노에이트 리덕타제, 아디페이트 리덕타제, 6-ACA 트랜스아미나제 또는 데하이드로게나제, 6-ACA 트랜스퍼라제 또는 신세타제, 6-ACA-CoA 리덕타제, HMDA 트랜스아미나제 또는 데하이드로게나제;
(f) 3-옥소아디필-CoA 티올라제, 3-옥소아디페이트 데하이드로게나제, 3-하이드록시아디페이트 데하이드라타제, 5-카복시-2-펜테노에이트 리덕타제, 아디페이트 리덕타제, 6-ACA 트랜스아미나제 또는 데하이드로게나제, 6-ACA 리덕타제, HMDA 트랜스아미나제 또는 데하이드로게나제;
(g) 3-옥소아디필-CoA 티올라제, 3-옥소아디페이트 데하이드로게나제, 3-하이드록시아디페이트 데하이드라타제, 5-카복시-2-펜테노에이트 리덕타제, 아디필-CoA 트랜스퍼라제, 하이드롤라제 또는 트랜스퍼라제, 아디필-CoA 리덕타제, 6-ACA 트랜스아미나제 또는 데하이드로게나제, 6-ACA 트랜스퍼라제 또는 신세타제, 6-ACA-CoA 리덕타제, HMDA 트랜스아미나제 또는 데하이드로게나제;
(h) 3-옥소아디필-CoA 티올라제, 3-옥소아디페이트 데하이드로게나제, 3-하이드록시아디페이트 데하이드라타제, 5-카복시-2-펜테노에이트 리덕타제, 아디필-CoA 트랜스퍼라제, 하이드롤라제 또는 트랜스퍼라제, 아디필-CoA 리덕타제, 6-ACA 트랜스아미나제 또는 데하이드로게나제, 6-ACA 리덕타제, HMDA 트랜스아미나제 또는 데하이드로게나제;
(i) 4-하이드록시-2-옥소헵탄-1,7-디오에이트(HODH 알돌라제); 2-옥소헵트-4-엔-1,7-디오에이트(OHED) 하이드라타제; OHED 포르메이트-라이아제 및 피루베이트 포르메이트-라이아제 활성화 효소 또는 OHED 데하이드로게나제; 2,3-데하이드로아디필-CoA 리덕타제; 아디필-CoA 데하이드로게나제; 또는 아디페이트 세미알데하이드 아미노트랜스퍼라제 또는 아디페이트 세미알데하이드 옥시도리덕타제(아미노화);
(j) β-케토티올라제 또는 아세틸-CoA 카복실라제 및 아세토아세틸-CoA 신타제, 3-하이드록시아실-CoA 데하이드로게나제 또는 3-옥소아실-CoA 리덕타제, 에노일-CoA 하이드라타제, 및 헥사노일-CoA를 생성하기 위한 트랜스-2-에노일-CoA 리덕타제; 티오에스터라제, 알데하이드 데하이드로게나제 및 부탄알 데하이드로게나제 중 하나 이상, 상기 숙주가 헥산알 또는 헥사노에이트를 생성함; 모노옥시게나제, 알코올 데하이드로게나제, 알데하이드 데하이드로게나제, 6-하이드록시헥사노에이트 데하이드로게나제, 5-하이드록시펜타노에이트 데하이드로게나제, 4-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제, 6-옥소헥사노에이트 데하이드로게나제 또는 7-옥소헵타노에이트 데하이드로게나제 중 하나 이상, 상기 숙주가 아디프산 또는 아디페이트 세미알데하이드를 생성함; 모노옥시게나제, 트랜스아미나제, 6-하이드록시헥사노에이트 데하이드로게나제, 5-하이드록시펜타노에이트 데하이드로게나제, 4-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제 및 알코올 데하이드로게나제 중 하나 이상, 상기 숙주가 6-아미노헥사노에이트를 생성함; 카복실레이트 리덕타제, ω-트랜스아미나제, 데아세틸라제, N-아세틸 트랜스퍼라제 및 알코올 데하이드로게나제 중 하나 이상(이러한 경로는 미국 특허출원 공보 제20140186902호에 개시되어 있음);
(k) 6-하이드록시-3-옥소-헥사노일-CoA를 형성하는 아세틸트랜스퍼라제 또는 티올라제, 6-하이드록시-3-옥소-헥사노일-CoA 데하이드로게나제, 3,4-디하이드록시헥사노일-CoA 데하이드라타제, 6-하이드록시-2-헥사노일-CoA 리덕타제, 6-ACA를 형성하는 6-하이드록시헥사노일-CoA 하이드롤라제, 6-하이드록시카프로에이트 데하이드로게나제 및 HMDA를 형성하는 트랜스아미나제(이러한 경로는 국제 특허출원 공보 제WO 2014/047407A1호에 개시되어 있음);
(l) 2-케토피멜레이트를 형성하는 호모시트레이트 신타제, 호모아코니타제 및 호모이소시트레이트 데하이드로게나제, 아디페이트 세미알데하이드로의 α-케토피멜레이트의 전환을 촉진하는 2-케토 데카복실라제, 2-아미노피멜레이트로의 α-케토피멜레이트의 전환을 촉진하는 2-아미노트랜스퍼라제, 2-아미노피멜레이트를 탈카복실화하고 6-ACA를 형성하는 2-아미노피멜레이트 데카복실라제, 6-아미노헥산알로의 6-ACA의 전환을 촉진하는 알데하이드 데하이드로게나제, 및 6-헥사메틸렌디아민으로의 6-아미노헥산알의 전환을 촉진하는 아미노트랜스퍼라제(이러한 경로는 국제 특허출원 공보 제WO 2010/068944호에 개시되어 있음); 및
(m) 글루타밀-CoA 트랜스퍼라제 및/또는 리가제, 베타-케토티올라제, 3-옥소-6-아미노피멜로일-CoA 옥시도리덕타제, 3-하이드록시-6-아미노피멜로일-CoA 데하이드라타제, 6-아미노-7-카복시헵트-2-에노일-CoA 리덕타제, 6-아미노피멜로일-CoA 리덕타제(알데하이드 형성), 2-아미노-7-옥소헵타노에이트 아미노트랜스퍼라제 및/또는 아미노화 옥시도리덕타제, 호모라이신 데카복실라제, 6-아미노피멜로일-CoA 하이드롤라제, 트랜스퍼라제 및/또는 리가제, 2-아미노피멜레이트 데카복실라제(이러한 경로는 국제 특허출원 공보 제WO 2010/129936호에 개시되어 있음).
일부 실시양태에서, HMD 합성 경로는 적어도 하나의 효소, 및 3-옥소아디필-CoA 티올라제, 3-옥소아디필-CoA 데하이드로게나제, 3-하이드록시아디필-CoA 데하이드라타제, 5-카복시-2-펜테노일-CoA 리덕타제, 아디필-CoA 리덕타제, 6-ACA 트랜스아미나제 또는 데하이드로게나제, 3-옥소아디필-CoA:아실 CoA 트랜스퍼라제, 3-옥소아디페이트 데하이드로게나제, 3-하이드록시아디페이트 데하이드라타제, 5-카복시-2-펜테노에이트 리덕타제, 아디필-CoA 트랜스퍼라제, 리가제, 또는 하이드롤라제, 6-ACA 트랜스퍼라제 또는 신세타제, 6-ACA-CoA 리덕타제, HMDA 트랜스아미나제 또는 데하이드로게나제, 아디페이트 리덕타제, 6-ACA 트랜스아미나제 또는 데하이드로게나제, 또는 6-ACA 리덕타제에 대한 이러한 하나 이상의 효소를 코딩하는 핵산을 포함한다.
HMD 합성 경로의 하나 이상의 외생성 핵산을 포함하기 위해 숙주로서 사용될 수 있는 적합한 미생물은 예를 들면, 발효 공정에 적용될 수 있거나 pH 4 미만의 pH 조건을 견딜 수 있는 원핵생물, 예컨대, 박테리아, 및 진핵생물, 예컨대, 진균(예를 들면, 효모) 또는 임의의 다른 미생물을 포함한다.
일부 실시양태에서, 유전적으로 조작된 미생물은 에스케리키아(Escherichia), 클렙시엘라(Klebsiella); 아내로바이오스피릴룸(Anaerobiospirillum) 속을 포함하는, 에어로모나달레스(Aeromonadales) 목, 석시니비브리오나세에(Succinivibrionaceae) 과; 악티노바실러스(Actinobacillus) 및 만헤이미아(Mannheimia) 속을 포함하는, 파스테우렐라레스(Pasteurellales) 목, 파스테우렐라세에(Pasteurellaceae) 과; 리조븀(Rhizobium) 속을 포함하는, 리조비알레스(Rhizobiales) 목, 브라디리조비아세에(Bradyrhizobiaceae) 과; 바실러스(Bacillus) 속을 포함하는, 바실라레스(Bacillales) 목, 바실라세에(Bacillaceae) 과; 각각 코리네박테륨(Corynebacterium) 속 및 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속을 포함하는, 악티노마이세탈레스(Actinomycetales) 목, 코리네박테리아세에(Corynebacteriaceae) 및 스트렙토마이세타세에(Streptomycetaceae) 과; 글루코노박터(Gluconobacter) 속을 포함하는, 로도스피릴라레스(Rhodospirillales) 목, 아세토박터라세에(Acetobacteraceae) 과; 자이모모나스(Zymomonas) 속을 포함하는, 스핑고모나달레스(Sphingomonadales) 목, 스핑고모나다세에(Sphingomonadaceae) 과; 각각 락토바실러스(Lactobacillus) 속 및 락토코커스(Lactococcus) 속을 포함하는, 락토바실라레스(Lactobacillales) 목, 락토바실라세에(Lactobacillaceae) 및 스트렙토코카세에(Streptococcaceae) 과; 클로스트리디알레스(Clostridiales) 목, 클로스트리디아세에(Clostridiaceae) 과, 클로스트리듐(Clostridium) 속; 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 알칼리필러스(Alkaliphilus) 속, 메틸로박테륨(Methylobacterium), 메틸로버사틸리스(Methyloversatilis), 메틸로코커스(Methylococcus), 메틸로사이스티스(Methylocystis) 및 하이포마이크로븀(Hyphomicrobium)을 포함하는, 슈도모나달레스(Pseudomonadales) 목, 슈도모나다세에(Pseudomonadaceae) 과; 사카로마이세스(Saccharomyces), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 및 피키아(Pichia) 속을 포함하는, 사카로마이세탈레스(Saccharomycetales) 목, 사카로마이세타세에(Saccaromycetaceae) 과; 야로위아(Yarrowia) 속을 포함하는, 사카로마이세탈레스(Saccharomycetales) 목, 디포다스카세에(Dipodascaceae) 과; 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 속을 포함하는, 스키조사카로마이세탈레스(Schizosaccharomycetales) 목, 스키조사카로마이세타세에(Schizosaccaromycetaceae) 과; 아스퍼질러스(Aspergillus) 속을 포함하는, 유로티알레스(Eurotiales) 목, 트리코코마세에(Trichocomaceae) 과; 및 리조퍼스(Rhizopus) 속을 포함하는, 뮤코랄레스(Mucorales) 목, 뮤코라세에(Mucoraceae) 과를 포함한다.
다른 실시양태에서, 유전적으로 조작된 미생물은 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 클렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 아내로바이오스피릴룸 석시니시프로두센스(Anaerobiospirillum succiniciproducens), 악티노바실러스 석시노제네스(Actinobacillus succinogenes), 만헤이미아 석시니시프로두센스(Mannheimia succiniciproducens), 리조븀 에틀리(Rhizobium etli), 코리네박테륨 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxydans), 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 스트렙토마이세스 코엘리칼러(Streptomyces coelicolor), 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) 및 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 바실리스 슈도퍼머스(Bacillis pseudofirmus), 바실러스 할로두란스(Bacillus halodurans), 바실러스 알칼로필러스(Bacillus alcalophilus), 클로스트리듐 파라독숨(Clostridium paradoxum), 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 피키아 메탄올리카(Pichia methanolica), 칸디다 보이디니이(Candida boidinii), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 클루이베로마이세스 막시아너스(Kluyveromyces marxianus), 아스퍼질러스 테레우스(Aspergillus terreus), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 리조퍼스 아리저스(Rhizopus arrhizus), 리조버스 오리제(Rhizobus oryzae), 야로위아 리포라이티카(Yarrowia lipolytica), 및 이사첸키아 오리엔탈리스(Issatchenkia orientalis)를 포함하는 비한정적 숙주 박테리아 종을 포함한다. 일부 알칼리파일즈는 바실리스 슈도퍼머스(Bacillis pseudofirmus), 바실러스 할로두란스(Bacillus halodurans), 바실러스 알칼로필러스(Bacillus alcalophilus), 클로스트리듐 파라독숨(Clostridium paradoxum), 아쓰로스피라 플라텐시스(Arthrospira platensis), 바실러스 클라우시이(Bacillus clausii), 오세아노바실러스 이헤이엔시스(Oceanobacillus iheyensis), 알칼리필러스 메탈리레디젠스(Alkaliphilus metalliredigens), 알칼리필러스 오렘란디이(Alkaliphilus oremlandii), 바실러스 셀렌티리듀센스(Bacillus selentireducens), 데설포비브리오 알칼리파일즈(Desulfovibrio alkaliphiles), 데티오박터 알칼리파일즈(Dethiobacter alkaliphiles), 티오알칼리비브리오(Thioalkalivibrio) 종, 나트라내로비우스 써모필러스(Natranaerobius thermophilus), 알칼리림니콜라 에를리키이(Alkalilimnicola ehrlichii) 및 데설포나트로노스피라 티오디스뮤탄스(Desulfonatronospira thiodismutans)이다.
일부 실시양태에서, 진균 또는 효모의 종은 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 피키아 메탄올리카(Pichia methanolica), 칸디다 보이디니이(Candida boidinii), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 클루이베로마이세스 막시아너스(Kluyveromyces marxianus), 아스퍼질러스 테레우스(Aspergillus terreus), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 리조퍼스 아리저스(Rhizopus arrhizus), 리조버스 오리제(Rhizobus oryzae), 야로위아 리포라이티카(Yarrowia lipolytica), 및 이사첸키아 오리엔탈리스(Issatchenkia orientalis) 등으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 유전적으로 조작된 미생물은 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 코리네박테륨 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 바실리스 슈도퍼머스(Bacillis pseudofirmus), 바실러스 할로두란스(Bacillus halodurans), 바실러스 알칼로필러스(Bacillus alcalophilus), 클로스트리듐 파라독숨(Clostridium paradoxum) 및 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)이다.
예를 들면, 이. 콜라이는 유전적 조작에 적합한 잘 특징규명된 미생물 유기체이기 때문에 특히 유용한 숙주 유기체이다. 다른 특히 유용한 숙주 유기체는 효모, 예컨대, 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 유전적으로 조작된 미생물은 개선된 알칼리 내성을 갖도록 변경된다.
적응 진화를 이용하여 전형적으로 알칼리 내성을 갖지 않는 유기체 내로 알칼리 내성을 도입할 수 있다. 세포들이 원하는 높은 pH(알칼리 pH)에서 최적으로 생장하도록 그들의 세포 기작을 적응시킬 때까지 상기 세포들을 점차적으로 더 높은 pH 조건 하에 생장시킨다. 전형적으로, 여전히 대수기에서 생장하는 작은 부피의 세포들이 특정 바이오매스 농도에 도달할 때까지 이들을 소정의 pH에서 새로운 배지로 옮긴다. 그 다음, 이 세포들을 새로운 배지 내로 희석하고, 이때 점차적으로 더 높은 pH를 유지한다. 이 공정은 더 높은 pH에서 생장하기에 더 알맞은 세포를 선택한다. 작은 부피의 대수적으로 생장하는 세포들을 더 높은 pH의 새로운 배지로 옮기는 공정은 상기 세포들이 목표 pH 수준에서 생장하도록 진화될 때까지 계속된다.
적응 진화는 여러 다른 목적들 중에서 비-천연 기질 상에서 생장하도록 균주를 진화시키기 위해(Lee and Palsson, Appl Environ Microbiol. 2010 Jul;76(13):4158-68, Adaptive evolution of Escherichia coli K-12 MG1655 during growth on a Nonnative carbon source, L-1,2-propanediol), 개선된 염 내성을 위해(Ketola and Hiltunen, Ecol Evol. 2014 Oct;4:3901-8, Rapid evolutionary adaptation to elevated salt concentrations in pathogenic freshwater bacteria Serratia marcescens), 개선된 생성물 내성을 위해(Kildegaard KR et al., Metab Eng. 2014 Sep 28;26C:57-66, Evolution reveals a glutathione-dependent mechanism of 3-hydroxypropionic acid tolerance), 고온에서 생장하기 위해(Sandeberg et al., Mol Biol Evol. 2014 Oct;31(10):2647-62, Evolution of Escherichia coli to 42℃ and subsequent genetic engineering reveals adaptive mechanisms and novel mutations), 또는 호기성 조건 하에 발효하도록 진화시키기 위해(Portnoy et al., Appl Environ Microbiol. 2008 Dec;74(24), Aerobic fermentation of D-glucose by an evolved cytochrome oxidase-deficient Escherichia coli strain) 사용되고 있다.
예를 들면, 경로들 중 하나는 트랜스퍼라제 또는 신타제 효소에 의한 6-아미노카프로일-CoA로의 6-아미노카프로에이트의 활성화(도 10, 단계 Q 또는 R)에 이은, 카프로락탐을 형성하기 위한 6-아미노카프로일-CoA의 자발적인 고리화(도 10, 단계 T)를 수반한다. 다른 기재된 경로에서, 경로는 6-아미노카프로일-CoA로의 6-아미노카프로에이트의 활성화(도 10, 단계 Q 또는 R)에 이은, HMD를 형성하기 위한 환원(도 10, 단계 U) 및 아미노화(도 10, 단계 V 또는 W)를 수반한다. 6-아미노카프로산은 대안적으로 6-아미노카프로일-CoA 대신에 6-아미노카프로일-포스페이트로 활성화될 수 있다. 6-아미노카프로일-포스페이트는 카프로락탐을 형성하도록 자발적으로 고리화할 수 있다. 대안적으로, 6-아미노카프로일-포스페이트는 도 10 및 11에 묘사된 바와 같이 나중에 HMD로 전환될 수 있는 6-아미노카프로에이트 세미알데하이드로 환원될 수 있다. 어느 경우, 아미노화 반응은 6-아미노카프로에이트 세미알데하이드의 고리형 이민의 자발적 형성을 최소화하기 위해 상대적으로 신속히 일어나야 한다. 참여하는 효소들의 연결 또는 스카폴딩은 6-아미노카프로에이트 세미알데하이드 중간체가 리덕타제 효소부터 아미노화 효소까지 효율적으로 전해지는 것을 보장하기 위한 잠재적으로 강력한 방법을 대표한다.
HMD로의 6-아미노카프로산의 전환 동안 고리형 이민 또는 카프로락탐의 형성을 최소화하거나 심지어 제거하는 또 다른 방법은 고리화로부터 보호하기 위해 작용기(예를 들면, 아세틸, 석시닐)를 6-아미노카프로산의 아민 기에 추가하는 단계를 수반한다. 이것은 에스케리키아 콜라이에서 L-글루타메이트로부터의 오르니틴 형성과 유사하다. 구체적으로, 글루타메이트는 N-아세틸글루타메이트 신타제에 의해 N-아세틸-L-글루타메이트로 먼저 전환된다. 그 다음, N-아세틸-L-글루타메이트는 환원되고 아미노기 전이되어 N-아세틸-L-오르니틴을 형성하는 N-아세틸글루타밀-포스페이트로 활성화된다. 그 다음, 아세틸 기는 N-아세틸-L-오르니틴 데아세틸라제에 의해 N-아세틸-L-오르니틴으로부터 제거되어, L-오르니틴을 형성한다. 이러한 경로는 글루타메이트로부터의 글루타메이트-5-포스페이트의 형성에 이은 글루타메이트-5-세미알데하이드로의 환원이 글루타메이트-5-세미알데하이드로부터 자발적으로 형성된 고리형 이민인 (S)-1-피롤린-5-카복실레이트의 형성을 유발하기 때문에 필요하다. 6-아미노카프로산으로부터 HMD를 형성하는 경우, 단계는 아세틸-6-아미노카프로산으로의 6-아미노카프로산의 아세틸화, CoA 또는 포스페이트 기에 의한 카복실산 기의 활성화, 환원, 아미노화 및 탈아세틸화를 포함할 수 있다.
6-아미노카프로에이트는 다양한 출발 물질들로부터 형성될 수 있다는 것을 주목한다. 예를 들면, 6-아미노카프로에이트의 탄소 골격은 도 10에 묘사되어 있고 도 2, 3 및 8에도 기재되어 있는 바와 같이 석시닐-CoA 및 아세틸-CoA로부터 유도될 수 있다. 대안적으로, 6-아미노카프로에이트는 알파-케토아디페이트로부터 유도될 수 있고, 이때 알파-케토아디페이트는 아디필-CoA로 전환되고(도 9 참조), 아디필-CoA는 도 10에 나타낸 바와 같이 6-아미노카프로에이트로 전환된다.
도 11은 4-아미노부티릴-CoA 및 아세틸-CoA로부터 출발하는 6-아미노카프로에이트 또는 6-아미노카프로필-CoA까지의 2개 추가 대사 경로들을 제공한다. 제1 경로는 3-옥소-6-아미노헥사노일-CoA를 형성하기 위한 4-아미노부티릴-CoA와 아세틸-CoA의 축합(단계 A)에 이은, 6-아미노카프로일-CoA를 형성하기 위한 환원(단계 B), 탈수(단계 C) 및 환원(단계 D)을 수반한다. 6-아미노카프로일-CoA는 트랜스퍼라제(단계 K), 신타제(단계 L) 또는 하이드롤라제(단계 M) 효소에 의해 6-아미노카프로에이트로 전환될 수 있다. 대안적으로, 6-아미노카프로일-CoA는 자발적인 고리화에 의해 카프로락탐으로 전환될 수 있거나(단계 Q), 그의 환원(단계 N) 및 아미노화(단계 O 또는 P) 후 HMD로 전환될 수 있다. 도 11에 기재된 제2 경로는 나중에 트랜스퍼라제(단계 E), 신타제(단계 F) 또는 하이드롤라제(단계 G)에 의해 3-옥소-6-아미노헥사노에이트로 전환되는 3-옥소-6-아미노헥사노일-CoA를 형성하기 위한 4-아미노부티릴-CoA 및 아세틸-CoA의 축합(단계 A)을 수반한다. 그 다음, 3-옥소-6-아미노헥사노에이트는 환원되고(단계 H) 탈수되고(단계 I) 환원되어(단계 J) 6-아미노카프로에이트를 형성한다.
출발 분자인 4-아미노부티릴-CoA는 다양한 공통의 핵심 대사물질들로부터 형성될 수 있다. 예를 들면, 글루타메이트는 나중에 CoA-트랜스퍼라제 또는 신타제에 의해 4-아미노부티릴-CoA로 활성화되는 4-아미노부티레이트로 탈카복실화될 수 있다. 대안적으로, 석시닐-CoA의 환원 또는 알파-케토글루타레이트의 탈카복실화로부터 형성된 석시네이트 세미알데하이드는 CoA-트랜스퍼라제 또는 신타제에 의해 활성화 전에 4-아미노부티레이트로 아미노기 전이되어 4-아미노부티릴-CoA를 형성할 수 있다. 4-아미노부티릴-CoA, 및 4-아미노부티릴-CoA부터 6-아미노카프로일-CoA까지 경로의 여러 중간체들은 그들의 상응하는 락탐으로 자발적으로 고리화할 수 있다는 것이 주목된다. 따라서, 4-아미노부티릴-CoA 및/또는 여러 아미노-CoA 중간체들의 말단 아민 기에의 보호 작용기의 추가는 원치 않은 고리형 부산물의 형성을 최소화하는 데 이용될 수 있다. 이 경우, 2개의 추가 단계들, 예를 들면, 아세틸라제 및 데아세틸라제가 경로에 추가될 수 있을지라도, 도 11에 나타낸 변환들의 동일한 일반적인 세트가 적용될 것이다.
도 10 및 11에 나타낸 모든 변환들은 표 8에 표시된 변환들의 12개 일반적인 범주에 속한다. 각각의 범주에서 다수의 생화학적으로 특징규명된 후보 유전자들이 아래에 기재되어 있다. 클로닝되고 발현될 때, 도 10 및 11에서 적절한 변환을 촉진하는 데 적용될 있는 유전자들이 구체적으로 나열되어 있다.
[표 8]
Figure pct00007
1.1.1.a 옥시도리덕타제. 도 10 및 11에 나타낸 4종의 변환은 케톤 작용기를 하이드록실 기로 전환시키는 옥시도리덕타제를 요구한다. 도 10 및 11 둘 다에서 단계 B는 3-옥소아실-CoA를 3-하이드록시아실-CoA로 전환시키는 것을 포함한다. 도 1 및 2 둘 다에서 단계 H는 3-옥소산을 3-하이드록시산으로 전환시키는 것을 포함한다.
3-옥소아실-CoA 분자, 예컨대, 3-옥소아디필-CoA 및 3-옥소-6-아미노헥사노일-CoA를 3-하이드록시아실-CoA 분자, 예컨대, 각각 3-하이드록시아디필-CoA 및 3-하이드록시-6-아미노헥사노일-CoA로 전환시킬 수 있는 예시적인 효소는 지방산 베타-산화 또는 페닐아세테이트 이화작용에서 천연 생리학적 역할을 수행하는 효소를 포함한다. 예를 들면, fadB 및 fadJ에 의해 코딩되는, 이. 콜라이 내의 2개 지방산 산화 복합체들의 서브유닛은 3-하이드록시아실-CoA 데하이드로게나제로서 기능한다(Binstock et al., Methods Enzymol. 71:403-411 (1981)). 나아가, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) U 내의 phaC에 의해 코딩된 유전자 생성물(Olivera et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:6419-6424 (1998)) 및 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) ST 내의 paaC에 의해 코딩된 유전자 생성물(Di Gennaro et al., Arch. Microbiol. 188:117-125 (2007))은 페닐아세테이트 또는 스티렌의 이화작용 동안 도 10의 단계 B의 역방향 반응, 즉 3-옥소아디필-CoA를 형성하기 위한 3-하이드록시아디필-CoA의 산화를 촉진한다. 이러한 효소에 의해 촉진되는 반응은 가역적이라는 것을 주목해야 한다. 추가로, 이. 콜라이에서 paaH가 페닐아세테이트 분해 오페론 내의 다른 유전자와 인접해 있다는 사실(Nogales et al., Microbiology 153:357-365 (2007)) 및 paaH 돌연변이체가 페닐아세테이트 상에서 생장할 수 없다는 사실(Ismail et al., Eur. J. Biochem. 270:3047-3054 (2003))을 고려해볼 때, 이. 콜라이 paaH 유전자는 3-하이드록시아실-CoA 데하이드로게나제를 코딩할 것으로 예상된다.
Figure pct00008
3-옥소아실-CoA 분자를 그의 상응하는 3-하이드록시아실-CoA 분자로 전환시킬 수 있는 추가 예시적인 옥시도리덕타제는 3-하이드록시부티릴-CoA 데하이드로게나제를 포함한다. hbd에 의해 코딩된, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum)으로부터의 효소는 이. 콜라이에서 클로닝되었고 기능적으로 발현되었다(Youngleson et al., J. Bacteriol. 171:6800-6807 (1989)). 추가 유전자 후보는 클로스트리듐 클루이베리(Clostridium kluyveri) 내의 Hbd1(C-말단 도메인) 및 Hbd2(N-말단 도메인)(Hillmer et al., FEBS Lett. 21:351-354 (1972)), 및 보스 타우러스(Bos taurus) 내의 HSD17B10(Wakil et al., J. Biol. Chem. 207:631-638 (1954))을 포함한다. 아세토아세틸-CoA를 3-하이드록시부티릴-CoA로 환원시키는 것으로 입증된 다른 유전자 후보는 주글로에아 라미게라(Zoogloea ramigera)로부터의 phbB(Ploux et al., Eur. J. Biochem. 174:177-182 (1988)) 및 로도박터 스패로이데스(Rhodobacter sphaeroides)로부터의 phaB(Alber et al., Mol. Microbiol 61:297-309 (2006))이다. 전자 유전자 후보는 NADPH 의존적이고, 그의 뉴클레오티드 서열은 확인되었고(Peoples et al., Mol. Microbiol. 3:349-357 (1989)), 상기 유전자는 이. 콜라이에서 발현되었다. 상기 유전자에 대한 기질 특이성 연구는 상기 유전자가 아세토아세틸-CoA 이외의 기질로서 3-옥소프로피오닐-CoA를 수용할 수 있다는 결론을 이끌어내었다(Ploux et al., supra).
Figure pct00009
다수의 유사한 효소들이 클로스트리디아(Clostridia) 및 메탈로스패라 세둘라(Metallosphaera sedula)의 다른 종에서 발견되었다(Berg et al., Science 318:1782-1786 (2007)).
Figure pct00010
다양한 알코올 데하이드로게나제들이 3-옥소아디페이트를 3-하이드록시아디페이트로 전환시키거나(단계 H, 도 10) 3-옥소-6-아미노헥사노에이트를 3-하이드록시-6-아미노헥사노에이트로 전환시키는(단계 H, 도 11) 우수한 후보를 대표한다. 옥소산을 하이드록시산으로 전환시킬 수 있는 2종의 이러한 효소들은 이. 콜라이에서 말레이트 데하이드로게나제(mdh) 및 락테이트 데하이드로게나제(ldhA) 유전자에 의해 코딩된다. 추가로, 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha)로부터의 락테이트 데하이드로게나제는 다양한 쇄 길이의 기질, 예컨대, 락테이트, 2-옥소부티레이트, 2-옥소펜타노에이트 및 2-옥소글루타레이트에 대한 고활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다(Steinbuchel et al., Eur. J. Biochem. 130:329-334 (1983)). 알파-하이드록시아디페이트로의 알파-케토아디페이트의 전환은 래트 및 인간 태반에서 발견된 것으로 보고된 효소인 2-케토아디페이트 리덕타제에 의해 촉진될 수 있다(Suda et al., Arch. Biochem. Biophys. 176:610-620 (1976); Suda et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 77:586-591 (1977)). 이들 단계들을 위한 추가 후보는 클로닝되고 특징규명된, 인간 심장으로부터의 미토콘드리아 3-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제(bdh)이다(Marks et al., J. Biol. Chem. 267:15459-15463 (1992)). 이 효소는 3-하이드록시산에 작용하는 데하이드로게나제이다. 또 다른 예시적인 알코올 데하이드로게나제는 씨. 베이제린키이(C. beijerinckii)(Ismaiel et al., J. Bacteriol. 175:5097-5105 (1993); 및 티. 브록키이(T. brockii)(Lamed et al., Biochem. J. 195:183-190 (1981); Peretz et al., Biochemistry 28:6549-6555 (1989))에서 밝혀진 바와 같이 아세톤을 이소프로판올로 전환시킨다.
Figure pct00011
1.2.1.b 옥시도리덕타제(알데하이드로의 아실-CoA의 변환).
아디페이트 세미알데하이드로의 아디필-CoA의 변환(단계 N, 도 10) 및 6-아미노카프로에이트 세미알데하이드로의 6-아미노카프로일-CoA의 변환(단계 U, 도 10; 단계 N, 도 11)은 아실-CoA를 그의 상응하는 알데하이드로 환원시킬 수 있는 아실-CoA 데하이드로게나제를 요구한다. 이러한 효소를 코딩하는 예시적인 유전자는 지방 아실-CoA 리덕타제를 코딩하는 악시네토박터 칼코아세티커스(Acinetobacter calcoaceticus) acr1(Reiser et al., J. Bacteriology 179:2969-2975 (1997)), 악시네토박터 종 M-1 지방 아실-CoA 리덕타제(Ishige et al., Appl. Environ. Microbiol. 68:1192-1195 (2002)), 및 클로스트리듐 클루이베리(Clostridium kluyveri) 내의 sucD 유전자에 의해 코딩된 CoA 및 NADP 의존성 석시네이트 세미알데하이드 데하이드로게나제(Sohling et al., J. Bacteriol. 178:871-880 (1996))를 포함한다. 피. 진지발리스(P. gingivalis)의 SucD는 또 다른 석시네이트 세미알데하이드 데하이드로게나제이다(Takahashi et al., J. Bacteriol. 182:4704-4710 (2000)). bphG에 의해 코딩된, 슈도모나스 종 내의 효소 아실화 아세트알데하이드 데하이드로게나제는 아세트알데하이드, 프로피온알데하이드, 부티르알데하이드, 이소부티르알데하이드 및 포름알데하이드를 산화시키고 아실화하는 것으로 입증되었기 때문에 또 다른 후보이다(Powlowski et al., J Bacteriol. 175:377-385 (1993)). 아세틸-CoA를 에탄올로 환원시키는 것 이외에, 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 내의 adhE에 의해 코딩된 효소는 분지쇄 화합물 이소부티르알데하이드를 이소부티릴-CoA로 산화시키는 것으로 확인되었다(Kazahaya et al., J. Gen. Appl. Microbiol. 18:43-55 (1972); Koo et al., Biotechnol Lett. 27:505-510 (2005)).
Figure pct00012
아실-CoA를 이의 상응하는 알데하이드로 전환시키는 추가 효소 유형은 말로닐-CoA를 말론산 세미알데하이드로 변환시키는 말로닐-CoA 리덕타제이다. 말로닐-CoA 리덕타제는 호열호산성 고세균에서 3-하이드록시프로피오네이트 주기를 통한 영양요구성 탄소 고정에서 핵심 효소이다(Berg et al., supra; Thauer R. K., Science 318:1732-1733 (2007)). 상기 효소는 NADPH를 보조인자로서 사용하고 메탈로스패라(Metallosphaera) 및 설폴로버스(Sulfolobus) 종에서 특징규명되었다(Alber et al., J. Bacteriol. 188:8551-8559 (2006); Hugler et al., J. Bacteriol. 184:2404-2410 (2002)). 상기 효소는 메탈로스패라 세둘라(Metallosphaera sedula)에서 Msed_0709에 의해 코딩된다(Alber et al., supra; Berg et al., supra). 설폴로버스 토코다이이(Sulfolobus tokodaii)로부터의 말로닐-CoA 리덕타제를 코딩하는 유전자는 이. 콜라이에서 클로닝되었고 이종적으로 발현되었다(Alber et al., supra). 이 효소가 메틸말로닐-CoA를 그의 상응하는 알데하이드로 전환시키는 것을 촉진한다는 것도 밝혀졌다(WO2007/141208). 이들 효소의 알데하이드 데하이드로게나제 기능이 클로로플렉서스 아우란티아커스(Chloroflexus aurantiacus)로부터의 이기능성 데하이드로게나제와 유사할지라도, 서열 유사성은 거의 없다. 말로닐-CoA 리덕타제 효소 후보 둘 다가 아스파르테이트 세미알데하이드로의 아스파르틸-4-포스페이트의 환원 및 동시적인 탈인산화를 촉진하는 효소인 아스파르테이트-세미알데하이드 데하이드로게나제와 높은 서열 유사성을 가진다. 추가 유전자 후보는 설폴로버스 솔파타리커스(Sulfolobus solfataricus) 및 설폴로버스 악시도칼다리우스(Sulfolobus acidocaldarius)를 포함하는 다른 유기체 내의 단백질과의 서열 상동성에 의해 확인될 수 있고 아래에 나열되어 있다. CoA-아실화 알데하이드 데하이드로게나제에 대한 또 다른 후보는 클로스트리듐 베이제린키이(Clostridium beijerinckii)로부터의 ald 유전자이다(Toth et al., Appl Environ Microbiol 65:4973-4980 (1999)). 이 효소는 아세틸-CoA 및 부티릴-CoA를 이들의 상응하는 알데하이드로 환원시키는 것으로 보고되어 있다. 이 유전자는 살모넬라 티피뮤륨(Salmonella typhimurium) 및 이. 콜라이의 아세트알데하이드 데하이드로게나제를 코딩하는 eutE와 매우 유사하다(Toth et al., supra).
Figure pct00013
1.3.1.a CH-CH 기증자에 작용하는 옥시도리덕타제. 도 10을 참조하건대, 단계 D는 5-카복시-2-펜테노일-CoA 리덕타제에 의한 아디필-CoA로의 5-카복시-2-펜테노일-CoA의 전환을 언급한다. 도 11을 참조하건대, 단계 D는 6-아미노카프로일-CoA로의 6-아미노헥스-2-에노일-CoA의 전환을 언급한다. 에노일-CoA 리덕타제 효소는 어느 한 변환에 적합한 효소이다. 한 예시적인 에노일-CoA 리덕타제는 부티릴-CoA로의 크로토닐-CoA의 환원을 천연적으로 촉진하는, 씨. 아세토부틸리쿰(C. acetobutylicum)으로부터의 bcd의 유전자 생성물이다(Boynton et al., J Bacteriol. 178:3015-3024 (1996); Atsumi et al., Metab. Eng. 2008 10(6):305-311 (2008)(Epub Sep. 14, 2007)). 이 효소의 활성은 전자 전달 플라보단백질을 코딩하는 씨. 아세토부틸리쿰 etfAB 유전자의 발현과 함께 bcd를 발현시킴으로써 향상될 수 있다. 에노일-CoA 리덕타제 단계를 위한 추가 후보는 이. 그라실리스(E. gracilis)로부터의 미토콘드리아 에노일-CoA 리덕타제이다(Hoffmeister et al., J. Biol. Chem. 280:4329-4338 (2005)). 이 서열로부터 유도된 구축물을 그의 미토콘드리아 표적화 리더 서열의 제거 후 이. 콜라이에서 클로닝하여 활성 효소를 생성하였다(Hoffmeister et al., supra). 이 방법은 원핵 유기체에서 진핵 유전자, 특히 유전자 생성물을 특정 세포내 구획으로 표적화할 수 있는 리더 서열을 갖는 진핵 유전자를 발현시키는 분야에서 숙련된 자에게 잘 공지되어 있다. 원핵생물 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola)로부터의 이 유전자의 가까운 상동체인 TDE0597은 이. 콜라이에서 클로닝되고 발현된 세 번째 에노일-CoA 리덕타제를 대표한다(Tucci et al., FEBS Letters 581:1561-1566 (2007)).
Figure pct00014
도 10 및 11 둘 다의 단계 J는 2-에노에이트 리덕타제 효소를 요구한다. 2-에노에이트 리덕타제(EC 1.3.1.31)는 매우 다양한 α,β-불포화 카복실산 및 알데하이드의 NAD(P)H 의존성 환원을 촉진하는 것으로 공지되어 있다(Rohdich et al., J. Biol. Chem. 276:5779-5787 (2001)). 2-에노에이트 리덕타제는 씨. 티로부티리쿰(C. tyrobutyricum) 및 씨. 써모아세티쿰(C. thermoaceticum)(현재 모오렐라 써모아세티쿰(Moorella thermoaceticum)으로서 지칭됨)(Rohdich et al., supra)을 포함하는 클로스트리디아의 여러 종들에서 enr에 의해 코딩된다(Giesel et al., Arch Microbiol 135:51-57 (1983)). 씨. 클루이베리(C. kluyveri)의 공개된 게놈 서열에서, 에노에이트 리덕타제에 대한 9개의 코딩 서열들이 보고되었고, 이들 중 하나는 특징규명되었다(Seedorf et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105:2128-2133 (2008)). 씨. 티로부티리쿰(C. tyrobutyricum) 및 씨. 써모아세티쿰(C. thermoaceticum)으로부터의 enr 유전자는 클로닝되었고 서열결정되었고 서로에 대해 59% 동일성을 보여준다. 전자 유전자는 씨. 클루이베리(C. kluyveri)에서 특징규명된 유전자와도 대략 75% 유사성을 갖는 것으로 확인되었다(Giesel et al., supra). 이들 서열 결과를 기초로, enr이 이. 콜라이 내의 디에노일 CoA 리덕타제(fadH)와 매우 유사하다는 것이 보고되었다(Rohdich et al., supra). 씨. 써모아세티쿰(C. thermoaceticum) enr 유전자는 이. 콜라이에서 효소적 활성 형태로도 발현되었다(Rohdich et al., supra).
Figure pct00015
1.4.1.a 아미노산에 작용하는 옥시도리덕타제. 도 10은 2종의 환원성 아미노화를 보여준다. 구체적으로, 도 10의 단계 P는 6-아미노카프로에이트로의 아디페이트 세미알데하이드의 전환을 수반하고, 도 10의 단계 W는 헥사메틸렌디아민으로의 6-아미노카프로에이트 세미알데하이드의 전환을 수반한다. 후자 변환은 도 11의 단계 P에서도 요구된다.
반응이 전형적으로 가역적일지라도, 아미노산에 작용하는 대다수의 옥시도리덕타제들은 수용자로서 NAD+ 또는 NADP+를 사용하는 알파-아미노산의 산화적 탈아미노화를 촉진한다. 아미노산에 작용하는 예시적인 옥시도리덕타제는 gdhA에 의해 코딩된 글루타메이트 데하이드로게나제(탈아미노화), ldh에 의해 코딩된 류신 데하이드로게나제(탈아미노화), 및 nadX에 의해 코딩된 아스파르테이트 데하이드로게나제(탈아미노화)를 포함한다. 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 gdhA 유전자 생성물(McPherson et al., Nucleic. Acids Res. 11:5257-5266 (1983); Korber et al., J. Mol. Biol. 234:1270-1273 (1993)), 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima)로부터의 gdh(Kort et al., Extremophiles 1:52-60 (1997); Lebbink et al., J. Mol. Biol. 280:287-296 (1998); Lebbink et al., J. Mol. Biol. 289:357-369 (1999)), 및 할로박테륨 살리나룸(Halobacterium salinarum)으로부터의 gdhA1(Ingoldsby et al., Gene. 349:237-244 (2005))은 각각 NADP(H), NAD(H) 또는 이들 둘 다에 유리하면서 2-옥소글루타레이트 및 암모니아로의 글루타메이트의 가역적 상호전환을 촉진한다. 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)의 ldh 유전자는 류신, 이소류신, 발린 및 2-아미노부타노에이트를 포함하는 광범위한 기질들을 갖는 LeuDH 단백질을 코딩한다(Stoyan et al., J. Biotechnol 54:77-80 (1997); Ansorge et al., Biotechnol Bioeng. 68:557-562 (2000)). 아스파르테이트 데하이드로게나제를 코딩하는, 써모토가 마리티마로부터의 nadX 유전자는 NAD의 생합성에 관여한다(Yang et al., J. Biol. Chem. 278:8804-8808 (2003)).
Figure pct00016
lysDH 유전자에 의해 코딩된 라이신 6-데하이드로게나제(탈아미노화)는 L-라이신의 ε-아미노 기의 산화적 탈아미노화를 촉진하여 2-아미노아디페이트-6-세미알데하이드를 형성하고, 그 다음, 2-아미노아디페이트-6-세미알데하이드는 비효소적으로 고리화하여 Δ1-피페리데인-6-카복실레이트를 형성한다(Misono et al., J. Bacteriol. 150:398-401 (1982)). 예시적인 효소는 게오바실러스 스테아로써모필러스(Geobacillus stearothermophilus)(Heydari et al., Appl Environ. Microbiol 70:937-942 (2004)), 아그로박테륨 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)(Hashimoto et al., J Biochem 106:76-80 (1989); Misono et al., supra) 및 아크로모박터 데니트리피칸스(Achromobacter denitrificans)(Ruldeekulthamrong et al., BMB. Rep. 41:790-795 (2008))에서 확인될 수 있다. 아디페이트 세미알데하이드와 2-아미노아디페이트-6-세미알데하이드 사이의 구조적 유사성을 고려해 볼 때, 이러한 효소는 아디페이트 세미알데하이드를 6-아미노카프로에이트로 전환시키는 특히 우수한 후보이다.
Figure pct00017
2.3.1.b 아실 트랜스퍼라제. 도 10을 참조하건대, 단계 A는 3-옥소아디필-CoA 티올라제, 또는 등등하게는 석시닐 CoA:아세틸 CoA 아실 트랜스퍼라제(β-케토티올라제)를 이용한다. 슈도모나스 균주 B13에서 pcaF에 의해 코딩된 유전자 생성물(Kaschabek et al., J. Bacteriol. 184:207-215 (2002)), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) U에서 phaD에 의해 코딩된 유전자 생성물(Olivera et al., supra), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) ST에서 paaE에 의해 코딩된 유전자 생성물(Di Gennaro et al., supra), 및 이. 콜라이로부터의 paaJ에 의해 코딩된 유전자 생성물(Nogales et al., supra)은 방향족 화합물, 예컨대, 페닐아세테이트 또는 스티렌의 분해 동안 석시닐-CoA 및 아세틸-CoA로의 3-옥소아디필-CoA의 전환을 촉진한다. β-케토티올라제 효소는 가역적 변환을 촉진하기 때문에, 이들 효소들은 3-옥소아디필-CoA의 합성을 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 알. 유트로파(R. eutropha)로부터의 케토티올라제 phaA는 2개의 아세틸-CoA 분자들을 조합하여 아세토아세틸-CoA를 형성한다(Sato et al., J Biosci Bioeng 103:38-44 (2007)). 유사하게, β-케토티올라제(bktB)는 알. 유트로파(R. eutropha)에서 아세틸-CoA와 프로피오닐-CoA의 축합을 촉진하여 β-케토발레릴-CoA를 형성하는 것으로 보고되어 있다(Slater et al., J. Bacteriol. 180:1979-1987 (1998)). 3-옥소아디필-CoA 티올라제 활성을 보유할 가능성 이외에, 모든 이러한 효소들은 그들의 천연 형태로 또는 일단 적절하게 조작되면 4-아미노부티릴-CoA 및 아세틸-CoA를 축합시켜 3-옥소-6-아미노헥사노일-CoA를 형성하는 우수한 후보를 대표한다(단계 A, 도 11).
Figure pct00018
2-아미노-4-옥소펜타노에이트(AKP) 티올라제 또는 AKP 티올라제(AKPT) 효소는 도 10 및 11에서 단계 A를 수행하는 추가 후보를 제시한다. AKPT는 클로스트리듐 스티클란디이(Clostridium sticklandii)에서 오르니틴 분해에 참여하는 피리독살 포스페이트 의존성 효소이다(Jeng et al., Biochemistry 13:2898-2903 (1974); Kenklies et al., Microbiology 145:819-826 (1999)). AKPT의 알파 및 베타 서브유닛(또는 -2(ortA) 및/또는 -3(ortB))을 코딩하는 유전자 클러스터는 최근에 확인되었고, 이 효소의 생화학적 성질은 특징규명되었다(Fonknechten et al., J. Bacteriol. In Press (2009)). 상기 효소는 양 방향으로 작동할 수 있고 알라닌의 D-이성질체와 천연적으로 반응한다. 클로스트리듐 스티클란디이로부터의 AKPT는 특징규명되었으나, 그의 단백질 서열은 아직 공개되지 않았다. 높은 서열 상동성을 갖는 효소들이 클로스트리듐 디피사일(Clostridium difficile), 알칼리필러스 메탈리레디게네스(Alkaliphilus metalliredigenes) QYF, 써모아내로박터(Thermoanaerobacter) 종 X514, 및 써모아내로박터 텡콘겐시스(Thermoanaerobacter tengcongensis) MB4에서 확인된다(Fonknechten et al., supra).
Figure pct00019
2.6.1.a 아미노트랜스퍼라제. 도 10 및 11의 단계 O, 및 도 10의 단계 V는 아민으로의 6-알데하이드의 아미노기 전이를 요구한다. 이 변환은 감마-아미노부티레이트 트랜스아미나제(GABA 트랜스아미나제)에 의해 촉진될 수 있다. 한 이. 콜라이 GABA 트랜스아미나제는 gabT에 의해 코딩되고 아미노 기를 글루타메이트로부터 석시닐 세미알데하이드의 말단 알데하이드로 전달한다(Bartsch et al., J. Bacteriol. 172:7035-7042 (1990)). puuE의 유전자 생성물은 이. 콜라이에서 또 다른 4-아미노부티레이트 트랜스아미나제를 촉진한다(Kurihara et al., J. Biol. Chem. 280:4602-4608 (2005)). 머스 머스큘러스(Mus musculus), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) 및 서스 스크로파(Sus scrofa)에서 GABA 트랜스아미나제는 6-아미노카프로산과 반응하는 것으로 확인되었다(Cooper, Methods Enzymol. 113:80-82 (1985); Scott et al., J. Biol. Chem. 234:932-936 (1959)).
Figure pct00020
추가 효소 후보는 푸트레신 아미노트랜스퍼라제 또는 다른 디아민 아미노트랜스퍼라제를 포함한다. 이러한 효소는 헥사메틸렌디아민으로의 6-아미노카프로에이트 세미알데하이드의 전환을 수행하는 데 특히 매우 적합하다. 이. 콜라이 푸트레신 아미노트랜스퍼라제는 ygjG 유전자에 의해 코딩되고, 정제된 효소도 카다베린 및 스퍼미딘을 아미노기 전이할 수 있었다(Samsonova et al., BMC Microbiol 3:2 (2003)). 추가로, 2-옥소글루타레이트 이외의 아미노 수용자(예를 들면, 피루베이트, 2-옥소부타노에이트)의 사용 시 1,7-디아미노헵탄에 대한 이 효소의 활성은 보고되어 있다(Samsonova et al., supra; Kim, K. H., J Biol Chem 239:783-786 (1964)). 알파-케토글루타레이트보다 아미노 수용자로서 피루베이트를 사용하였을 때 더 높은 활성을 나타내는 푸트레신 아미노트랜스퍼라제는 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa)의 spuC 유전자이다(Lu et al., J Bacteriol 184:3765-3773 (2002)).
Figure pct00021
1. 추가 후보 효소는 베타-알라닌으로부터 말로네이트 세미알데하이드를 생성하는 베타-알라닌/알파-케토글루타레이트 아미노트랜스퍼라제를 포함한다(WO08027742). 사카로마이세스 클루이베리(Saccharomyces kluyveri) 내의 SkPYD4의 유전자 생성물도 아미노 기 기증자로서 베타-알라닌을 우선적으로 사용하는 것으로 밝혀졌다(Andersen et al., FEBS. J. 274:1804-1817 (2007)). SkUGA1은 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) GABA 아미노트랜스퍼라제의 상동체인 UGA1을 코딩하는 반면(Ramos et al., Eur. J. Biochem., 149:401-404 (1985)), SkPYD4는 β-알라닌 및 GABA 아미노기 전이 둘 다에 관여하는 효소를 코딩한다(Andersen et al., supra). 3-아미노-2-메틸프로피오네이트 트랜스아미나제는 메틸말로네이트 세미알데하이드로부터 3-아미노-2-메틸프로피오네이트로의 변환을 촉진한다. 이 효소는 라터스 노르베기커스(Rattus norvegicus) 및 서스 스크로파(Sus scrofa)에서 특징규명되어 있고 Abat에 의해 코딩된다(Tamaki et al, Methods Enzymol, 324:376-389 (2000)).
Figure pct00022
2.8.3.a 보조효소-A 트랜스퍼라제. CoA 트랜스퍼라제는 CoA 모이어티를 한 분자로부터 또 다른 분자에게 전달하는 단계를 포함하는 가역적 반응을 촉진한다. 예를 들면, 도 10의 단계 E는 3-옥소아디필-CoA 트랜스퍼라제에 의해 촉진된다. 이 단계에서, 3-옥소아디페이트는 CoA 기를 3-옥소아디필-CoA로부터 석시네이트, 아세테이트 또는 또 다른 CoA 수용자에게 전달함으로써 형성된다. 도 11의 단계 E는 또 다른 3-옥소아실-CoA인 3-옥소-6-아미노헥사노일-CoA로부터의 CoA 모이어티의 전달을 수반한다. 이들 단계들을 위한 한 후보 효소는 3-옥소아디필-CoA/석시네이트 트랜스퍼라제 활성을 갖는 것으로 입증된, 슈도모나스 내의 pcaI 및 pcaJ에 의해 코딩된 2-유닛 효소이다(Kaschabek et al., supra). 상동성에 기초할 때, 유사한 효소가 악시네토박터(Acinetobacter) 종 ADP1(Kowalchuk et al., Gene 146:23-30 (1994)) 및 스트렙토마이세스 코엘리칼러(Streptomyces coelicolor)에 존재한다. 추가 예시적인 석시닐-CoA:3:옥소산-CoA 트랜스퍼라제는 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)(Corthesy-Theulaz et al., J. Biol. Chem. 272:25659-25667 (1997)) 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)(Stols et al., Protein. Expr. Purif. 53:396-403 (2007))에 존재한다.
Figure pct00023
CoA 수용자로서 아세테이트를 사용할 수 있는 3-옥소아실-CoA 트랜스퍼라제는 이. 콜라이 atoA(알파 서브유닛) 및 atoD(베타 서브유닛) 유전자에 의해 코딩된 아세토아세틸-CoA 트랜스퍼라제이다(Vanderwinkel et al., Biochem. Biophys. Res Commun. 33:902-908 (1968); Korolev et al., Acta Crystallogr. D Biol Crystallogr. 58:2116-2121 (2002)). 이 효소도 이소부티레이트(Matthies et al., Appl Environ Microbiol 58:1435-1439 (1992)), 발레레이트(Vanderwinkel et al., supra) 및 부타노에이트(Vanderwinkel et al., supra)를 포함하는, 다양한 분지된 아실-CoA 기질들 및 선형 아실-CoA 기질들로부터 CoA 모이어티를 아세테이트에게 전달하는 것으로 밝혀졌다. 유사한 효소가 코리네박테륨 글루타미쿰 ATCC 13032(Duncan et al., Appl Environ Microbiol 68:5186-5190 (2002)), 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Cary et al., Appl Environ Microbiol 56:1576-1583 (1990)) 및 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)(Kosaka et al., Biosci. Biotechnol Biochem. 71:58-68 (2007))에 존재한다.
Figure pct00024
상기 효소들은 아디필-CoA 및 아디페이트(도 10, 단계 K) 또는 6-아미노카프로에이트 및 6-아미노카프로일-CoA(도 10, 단계 Q; 도 2, 단계 K)에 대한 원하는 활성도 나타낼 수 있다. 그럼에도 불구하고, 추가 예시적인 트랜스퍼라제 후보는 각각 석시닐-CoA, 4-하이드록시부티릴-CoA 및 부티릴-CoA 트랜스퍼라제 활성을 나타내는 것으로 확인된, 클로스트리듐 클루이베리의 cat1, cat2 및 cat3의 유전자 생성물에 의해 촉진된다(Seedorf et al., supra; Sohling et al., Eur. J. Biochem. 212:121-127 (1993); Sohling et al., J. Bacteriol. 178:871-880 (1996)).
Figure pct00025
혐기성 박테리아 악시다미노코커스 퍼멘탄스(Acidaminococcus fermentans)로부터의 글루타코네이트-CoA-트랜스퍼라제(EC 2.8.3.12) 효소는 이산 글루타코닐-CoA 및 3-부테노일-CoA와 반응한다(Mack et al., FEBS Lett. 405:209-212 (1997)). 이 효소를 코딩하는 유전자는 gctA 및 gctB이다. 이 효소는 글루타릴-CoA, 2-하이드록시글루타릴-CoA, 아디필-CoA 및 아크릴릴-CoA를 포함하는 다른 CoA 유도체의 사용 시 감소되었으나 검출가능한 활성을 가진다(Buckel et al., Eur. J. Biochem. 118:315-321 (1981)). 상기 효소는 이. 콜라이에서 클로닝되었고 발현되었다(Mack et al., Eur. J. Biochem. 226:41-51 (1994)).
Figure pct00026
3.1.2.a 티올에스테르 하이드롤라제(CoA 특이적). 여러 진핵 아세틸-CoA 하이드롤라제는 넓은 기질 특이성을 가짐으로써, 3-옥소아디필-CoA, 아디필-CoA, 3-옥소-6-아미노헥사노일-CoA 또는 6-아미노카프로일-CoA를 가수분해하기에 적합한 후보 효소를 대표한다(도 10 및 11의 단계 G 및 M). 예를 들면, 라터스 노르베기커스(Rattus norvegicus) 뇌로부터의 상기 효소(Robinson et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 71:959-965 (1976))는 부티릴-CoA, 헥사노일-CoA 및 말로닐-CoA와 반응할 수 있다.
Figure pct00027
추가 하이드롤라제 효소는 발린 분해 동안 3-하이드록시이소부티레이트로의 3-하이드록시이소부티릴-CoA의 전환을 효율적으로 촉진하는 것으로 기재된 3-하이드록시이소부티릴-CoA 하이드롤라제를 포함한다(Shimomura et al., J Biol Chem. 269:14248-14253 (1994)). 이 효소를 코딩하는 유전자는 라터스 노르베기커스(Shimomura et al., supra; Shimomura et al., Methods Enzymol. 324:229-240 (2000)) 및 호모 사피엔스(Shimomura et al., supra)의 hibch를 포함한다. 서열 상동성에 의한 후보 유전자는 사카로마이세스 세레비지에의 hibch 및 바실러스 세레우스의 BC 2292를 포함한다.
Figure pct00028
또 다른 후보 하이드롤라제는 글루타릴-CoA, 아디필-CoA, 수베릴-CoA, 세바실-CoA 및 도데칸디오일-CoA에 대한 활성을 나타내는 인간 디카복실산 티오에스터라제인 acot8(Westin et al., J. Biol. Chem. 280:38125-38132 (2005)), 및 넓은 범위의 CoA 티올에스테르도 가수분해할 수 있는 가장 가까운 이. 콜라이 상동체인 tesB(Naggert et al., J Biol Chem 266:11044-11050 (1991))이다. 유사한 효소도 래트 간에서 특징규명되었다(Deana R., Biochem Int 26:767-773 (1992)).
Figure pct00029
다른 잠재적인 이. 콜라이 티올에스테르 하이드롤라제는 tesA(Bonner et al., J Biol Chem 247:3123-3133 (1972)), ybgC(Kuznetsova et al., FEMS Microbiol Rev 29:263-279 (2005); Zhuang et al., FEBS Lett 516:161-163 (2002)), paaI(Song et al., J Biol Chem 281:11028-11038 (2006)) 및 ybdB(Leduc et al., J Bacteriol 189:7112-7126 (2007))의 유전자 생성물을 포함한다.
Figure pct00030
6.3.1.a/6.3.2.a 아미드 신타제/펩티드 신타제. 카프로락탐으로의 6-아미노카프로에이트의 직접적인 전환(단계 S, 도 10; 단계 R, 도 11)은 분자내 펩티드 결합의 형성을 요구한다. 번역 동안 아미노산을 단백질로 조립하는 리보좀은 자연의 가장 풍부한 펩티드 결합 형성 촉매이다. 비리보좀 펩티드 신세타제는 메신저 mRNA를 수반하지 않는 펩티드 결합 형성 촉매이다(Schwarzer et al., Nat. Prod. Rep. 20:275-287 (2003)). 펩티드 결합을 형성할 수 있는 추가 효소는 슈도모나스 클로로라피스(Pseudomonas chlororaphis)(Abe et al., J Biol Chem 283:11312-11321 (2008)), 이. 콜라이로부터의 감마-글루타밀푸트레신 신세타제(Kurihara et al., J Biol Chem 283:19981-19990 (2008)) 및 스트렙토마이세스 클라불리게러스(Streptomyces clavuligerus)로부터의 베타-락탐 신세타제(Bachmann et al., Proc Natl Acad Sci USA 95:9082-9086 (1998); Bachmann et al., Biochemistry 39:11187-11193 (2000); Miller et al., Nat. Struct. Biol 8:684-689 (2001); Miller et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:14752-14757 (2002); Tahlan et al., Antimicrob. Agents. Chemother. 48:930-939 (2004))를 포함한다.
Figure pct00031
4.2.1.a 하이드로라이아제(Hydrolyase). 대다수의 데하이드라타제들은 물의 α,β-제거를 촉진한다. 이것은 전자 구인성 카보닐, 카복실레이트 또는 CoA-티올 에스테르 기에 의한 α-수소의 활성화, 및 β-위치로부터의 하이드록실 기의 제거를 수반한다. 전자 구인성 카복실레이트 기를 갖는 기질에 대한 활성을 나타내는 효소는 3-하이드록시아디페이트(도 10, 단계 I) 또는 3-하이드록시-6-아미노헥사노에이트(도 11, 단계 I)를 탈수시키는 뛰어난 후보이다.
예를 들면, 푸마라제(fumarase) 효소는 푸마레이트로의 말레이트의 가역적 탈수를 천연적으로 촉진한다. 이. 콜라이는 3종의 푸마라제, 즉 생장 조건에 의해 조절되는 FumA, FumB 및 FumC를 가진다. FumB는 산소 민감성을 띠고 혐기성 조건 하에서만 활성을 나타낸다. FumA는 미세혐기성 조건 하에 활성을 나타내고, FumC는 호기성 생장에서 유일한 활성 효소이다(Tseng et al., J Bacteriol 183:461-467 (2001); Woods et al., Biochim Biophys Acta 954:14-26 (1988); Guest et al., J Gen Microbiol 131:2971-2984 (1985)). 추가 효소 후보는 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)(Smith et al., Int. J Biochem. Cell Biol 31:961-975 (1999)), 써머스 써모필러스(Thermus thermophilus)(Mizobata et al., Arch. Biochem. Biophys. 355:49-55 (1998)) 및 라터스 노르베기커스(Kobayashi et al., J Biochem. 89:1923-1931 (1981))에서 발견된다. 높은 서열 상동성을 갖는 유사한 효소는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)로부터의 fuml 및 코리네박테륨 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)으로부터의 fumC를 포함한다. 펠로토마큘룸 써모프로피오니쿰(Pelotomaculum thermopropionicum)으로부터의 MmcBC 푸마라제는 2개의 서브유닛들을 갖는 푸마라제의 또 다른 클래스이다(Shimoyama et al., FEMS Microbiol Lett 270:207-213 (2007)).
Figure pct00032
2개의 추가 데하이드라타제 후보는 유박테륨 바케리(Eubacterium barkeri)(이전에 클로스트리듐 바케리(Clostridium barkeri))에서의 니코티네이트 이화작용에서 그들의 역할에 대해 연구된 효소들인 2-(하이드록시메틸)글루타레이트 데하이드라타제 및 디메틸말레에이트 하이드라타제이다(Alhapel et al., Proc Natl Acad Sci USA 103:12341-6 (2006)). 2-(하이드록시메틸)글루타레이트 데하이드라타제는 2-(하이드록시메틸)글루타레이트를 2-메틸렌-글루타레이트로 탈수시키는 [4Fe-4S] 함유 효소이다. 이 효소는 유박테륨 바케리에서 hmd에 의해 코딩된다(Alhapel et al., supra). 높은 서열 상동성을 갖는 유사한 효소는 박테로이데스 카필로서스(Bacteroides capillosus), 아내로트룬커스 콜리호미니스(Anaerotruncus colihominis) 및 나트라내로비우스 써모필리우스(Natranaerobius thermophilius)에서 발견된다. 이들 효소들은 [4Fe-45] 함유 박테리아 세린 데하이드라타제(예를 들면, tdcG, sdhB 및 sdaA에 의해 코딩된 이. 콜라이 효소들)의 알파 및 베타 서브유닛과 상동하다.
Figure pct00033
디메틸말레에이트 하이드라타제(EC 4.2.1.85)는 디메틸말레에이트를 수화시켜 (2R,3S)-2,3-디메틸말레이트를 형성하는, 아코니타제 패밀리 내의 가역적 Fe2+ 의존성 및 산소 민감성 효소이다. 이 효소는 유박테륨 바케리에서 dmdAB에 의해 코딩된다(Alhapel et al., supra; Kollmann-Koch et al., Hoppe Seylers. Z. Physiol Chem. 365:847-857 (1984)).
Figure pct00034
추가 효소 후보는 시트라말레이트로부터의 물의 알파,베타 제거를 촉진하여 메사코네이트를 형성하는 가역적 하이드로라이아제인, 시트라말레이트 하이드로라이아제로서도 지칭되는 2-메틸말레이트 데하이드라타제이다. 이 효소는 클로스트리듐 테타노모르품(Clostridium tetanomorphum)에서 정제되었고 특징규명되었다(Wang et al., J. Biol. Chem. 244:2516-2526 (1969)). 이 효소의 활성은 글루타메이트 분해 VI 경로의 환경에서 시트로박터(Citrobacter) 및 모르가넬라(Morganella) 속 내의 여러 박테리아들에서도 검출되었다(Kato et al., Arch. Microbiol 168:457-463 (1997)). 이 효소를 코딩하는 유전자는 최근까지 어느 유기체에서도 확인되지 않았다.
α-수소에 인접한 전자 구인성 CoA-티올 에스테르 기를 갖는 기질에 대한 활성을 나타내는 효소는 3-하이드록시아디필-CoA(도 10, 단계 C) 또는 3-하이드록시-6-아미노헥사노일-CoA(도 11, 단계 C)를 탈수시키는 뛰어난 후보이다. 피. 푸티다(P. putida)의 에노일-CoA 하이드라타제인 phaA 및 phaB는 페닐아세테이트 이화작용 동안 이중 결합의 하이드록실화를 수행하는 것으로 생각된다(Olivera et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:6419-6424 (1998)). 피. 플루오레센스(P. fluorescens)로부터의 paaA 및 paaB는 유사한 변환을 촉진한다(Olivera et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:6419-6424 (1998)). 마지막으로, maoC(Park et al., J. Bacteriol. 185:5391-5397 (2003)), paaF(Ismail et al., supra; Park et al., Appl. Biochem. Biotechnol 113-116: 335-346 (2004); Park et al., Biotechnol Bioeng 86:681-686 (2004)) 및 paaG(Ismail et al., supra; Park et al., Appl. Biochem. Biotechnol 113-116:335-346 (2004); Park et al., Biotechnol Bioeng 86:681-686 (2004))를 비롯한 다수의 에스케리키아 콜라이 유전자들이 에노일-CoA 하이드라타제 기능을 나타내는 것으로 밝혀져 있다. 크로토나제 효소는 도 10 및 11에 나타낸 요구된 3-하이드록시아실-CoA 분자를 탈수시키는 추가 후보이다. 이들 효소들은 일부 유기체들, 특히 클로스트리디아 종에서 n-부탄올 형성을 위해 요구되고, 또한 설폴로버스, 악시디아너스 및 메탈로스패라 속의 호열호산성 고세균에서 3-하이드록시프로피오네이트/4-하이드록시부티레이트 주기의 한 단계를 구성한다. 크로토나제 효소를 코딩하는 예시적인 유전자는 씨. 아세토부틸리쿰(Boynton et al., supra), 씨. 클루이베리(Hillmer et al., FEBS Lett. 21:351-354 (1972)) 및 메탈로스패라 세둘라(Berg et al., supra)에서 발견될 수 있지만, 후자 유전자의 서열은 공지되어 있다. 다양한 아미노산들의 지방산 베타-산화 및/또는 대사에 관여하는 에노일-CoA 하이드라타제는 크로토닐-CoA의 수화를 촉진하여 3-하이드록시부티릴-CoA를 형성할 수도 있다(Roberts et al., Arch. Microbiol 117:99-108 (1978); Agnihotri et al., Bioorg. Med. Chem. 11:9-20 (2003); Conrad et al., J Bacteriol. 118:103-111 (1974)).
Figure pct00035
6.2.1.a 산-티올 리가제. 도 10의 단계 F, L 및 R, 및 도 11의 단계 F 및 L은 산-티올 리가제 또는 신세타제 기능을 요구한다(용어 리가제, 신세타제 및 신타제는 본원에서 상호교환적으로 사용되고 동일한 효소 클래스를 지칭한다). 이들 변환을 수행할 가능성이 있는 효소를 코딩하는 예시적인 유전자는 석시닐-CoA 신세타제 복합체를 천연적으로 형성하는, 이. 콜라이의 sucCD 유전자를 포함한다. 이 효소 복합체는 생체내에서 가역적인 반응인, 1개의 ATP의 소비를 동반하는 석시네이트로부터의 석시닐-CoA의 형성을 천연적으로 촉진한다(Buck et al., Biochem. 24:6245-6252 (1985)). 석시네이트와 아디페이트 사이의 구조적 유사성, 즉 둘 다가 직쇄 디카복실산이라는 점을 고려해 볼 때, 아디필-CoA에 대한 sucCD 효소의 일부 활성을 예상하는 것은 타당하다.
Figure pct00036
추가 예시적인 CoA-리가제는 서열이 아직 특징규명되어 있지 않은 래트 디카복실레이트-CoA 리가제(Vamecq et al., Biochemical Journal 230:683-693 (1985)), 피. 크라이소게눔(P. chrysogenum)으로부터의 2종의 특징규명된 페닐아세테이트-CoA 리가제들 중 어느 하나(Lamas-Maceiras et al., Biochem. J. 395:147-155 (2005); Wang et al., Biochem Biophy Res Commun 360(2):453-458 (2007)), 슈도모나스 푸티다로부터의 페닐아세테이트-CoA 리가제(Martinez-Blanco et al., J. Biol. Chem. 265:7084-7090 (1990)) 및 바실리스 서브틸리스로부터의 6-카복시헥사노에이트-CoA 리가제(Bower et al., J. Bacteriol. 178(14):4122-4130 (1996))를 포함한다. 추가 후보 효소는 아세토아세틸-CoA로의 아세토아세테이트의 ATP 의존성 전환을 천연적으로 촉진하는 머스 머스큘러스(Hasegawa et al., Biochim Biophys Acta 1779:414-419 (2008)) 및 호모 사피엔스(Ohgami et al., Biochem Pharmacol. 65:989-994 (2003))로부터의 아세토아세틸-CoA 신세타제이다.
Figure pct00037
ADP 형성 아세틸-CoA 신세타제(ACD, EC 6.2.1.13)는 상응하는 산으로의 아실-CoA 에스테르의 전환을 ATP의 동시발생적 합성과 커플링하는 또 다른 후보 효소이다. 넓은 기질 특이성을 갖는 여러 효소들은 문헌에 기재되어 있다. AF1211에 의해 코딩된, 아캐오글로버스 풀기더스(Archaeoglobus fulgidus)로부터의 ACD I은 아세틸-CoA, 프로피오닐-CoA, 부티릴-CoA, 아세테이트, 프로피오네이트, 부티레이트, 이소부티레이트, 이소발레레이트, 석시네이트, 푸마레이트, 페닐아세테이트 및 인돌아세테이트를 비롯한 다양한 직쇄 기질들 및 분지쇄 기질들에 작동하는 것으로 확인되었다(Musfeldt et al., J Bacteriol 184:636-644 (2002)). 할로아큘라 마리스모르투이(Haloarcula marismortui)로부터의 효소(석시닐-CoA 신세타제로서 해석됨)는 프로피오네이트, 부티레이트 및 분지쇄 산(이소발레레이트 및 이소부티레이트)을 기질로서 수용하고, 정방향 및 역방향으로 작동하는 것으로 밝혀졌다(Brasen et al., Arch Microbiol 182:277-287 (2004)). 고호열성 크렌고세균 파이로바큘룸 애로필룸(crenarchaeon Pyrobaculum aerophilum)으로부터의 PAE3250에 의해 코딩된 ACD는 아세틸-CoA, 이소부티릴-CoA(바람직한 기질) 및 페닐아세틸-CoA와 반응하는, 모든 특징규명된 ACD들 중 가장 넓은 기질 범위를 보였다(Brasen et al., supra). 에이. 풀기더스(A. fulgidus), 에이치. 마리스모르투이(H. marismortui) 및 피. 애로필룸(P. aerophilum)으로부터의 상기 효소는 모두 이. 콜라이에서 클로닝되었고 기능적으로 발현되었고 특징규명되었다(Musfeldt et al., supra; Brasen et al., supra).
Figure pct00038
또 다른 방법은 순(net) 리가제 또는 신세타제 활성을 갖는 효소들의 세트를 사용하는 것이다. 예를 들면, 포스포트랜스아디필라제 및 아디페이트 키나제 효소는 씨. 아세토부틸리쿰(C. acetobutylicum)으로부터의 buk1, buk2 및 ptb의 유전자 생성물에 의해 촉진된다(Walter et al., Gene 134:107-111 (1993); Huang et al., J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2:33-38 (2000)). ptb 유전자는 부티릴-CoA를 부티릴-포스페이트로 전환시킬 수 있는 효소를 코딩하고, 그 후 부티릴-포스페이트는 ATP의 생성을 동반하면서 buk 유전자 생성물들 중 어느 하나를 통해 부티레이트로 전환된다.
Figure pct00039
효소를 요구하지 않는 자발적인 고리화. 6-아미노카프로일-CoA는 카프로락탐으로 자발적으로 고리화함으로써, 이 단계를 위한 전용 효소에 대한 필요성을 제거할 것이다. 유사한 자발적인 고리화는 피롤리디논을 형성하는 4-아미노부티릴-CoA의 사용 시 관찰된다(Ohsugi et al., J Biol Chem 256:7642-7651 (1981)).
아세틸-CoA 및 석시닐-CoA로부터 헥사메틸렌디아민을 생성할 수 있고 도 10에 나타낸 바와 같이 아세틸-CoA 및 석시닐-CoA로부터 출발하는 미생물 유기체도 생성될 수 있다. 이. 콜라이는 헥사메틸렌디아민을 생성할 수 있는 비-천연 생성 미생물을 생성하는 우수한 숙주를 제공한다. 이. 콜라이가 이 경로를 기술하는 데 사용될 수 있지만, 임의의 미생물이 이러한 경로를 생성하도록 적응될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 헥사메틸렌디아민을 생성하도록 조작된 이. 콜라이 균주를 생성하기 위해, 잘 공지되어 있는 분자생물학 기법을 이용하여 필수 효소를 코딩하는 핵산을 이. 콜라이에서 발현시킨다(예를 들면, 문헌(Sambrook, supra, 2001; Ausubel, supra, 1999) 참조). 구체적으로, 각각 3-옥소아디필-CoA 티올라제, 3-옥소아디필-CoA 리덕타제 및 3-하이드록시아디필-CoA 데하이드라타제 활성을 코딩하는 paaJ(NP-415915.1), paaH(NP-415913.1) 및 maoC(NP-415905.1) 유전자를 PA1/lacO 프로모터 하에 pZE13 벡터(Expressys, Ruelzheim, Germany) 내로 클로닝한다. 추가로, 5-카복시-2-펜테노일-CoA 리덕타제 활성을 코딩하는 bcd (NP-349317.1) 및 eftAB(NP-349315.1 및 NP-349316.1) 유전자를 PA1/lacO 프로모터 하에 pZA33 벡터(Expressys, Ruelzheim, Germany) 내로 클로닝한다. 마지막으로, 아디필-CoA 리덕타제(알데하이드 형성), 6-아미노카프로일-CoA 리덕타제(알데하이드 형성), 6-아미노카프로산 트랜스아미나제, 6-아미노카프로일-CoA 신타제, 및 헥사메틸렌디아민 트랜스아미나제 활성을 코딩하는 acrl(YP-047869.1), gabT(NP-417148.1), bioW(NP-390902.2) 및 ygjG(NP-417544) 유전자를 PA1/lacO 프로모터 하에 제3 상용가능한 플라스미드인 pZS23 내로 클로닝한다. pZS23은 잘 공지되어 있는 분자생물학 기법으로 pZS13 벡터(Expressys, Ruelzheim, Germany)의 앰피실린 내성 모듈을 카나마이신 내성 모듈로 대체함으로써 수득된다. 3개의 플라스미드 세트들을 이. 콜라이 균주 MG1655 내로 형질전환시켜, 헥사메틸렌디아민 합성을 위해 요구되는 단백질 및 효소를 발현시킨다.
다른 예에서, 아세틸-CoA 및 4-아미노부티릴-CoA를 6-아미노카프로일-CoA로 전환시키는 경로를 통해 헥사메틸렌디아민을 생성할 수 있다.
헥사메틸렌디아민을 생성하는 또 다른 경로는 아세틸-CoA 및 4-아미노부티릴-CoA로부터 출발한다.
각각 3-옥소-6-아미노헥사노일-CoA 티올라제, 3-옥소-6-아미노헥사노일-CoA 리덕타제 및 3-하이드록시-6-아미노헥사노일-CoA 데하이드라타제 활성을 코딩하는 paaJ(NP-415915.1), paaH(NP-415913.1) 및 maoC(NP-415905.1) 유전자들을 PA1/lacO 프로모터 하에 pZE13 벡터(Expressys, Ruelzheim, Germany) 내로 클로닝할 수 있다. 추가로, 6-아미노헥스-2-에노일-CoA 리덕타제, 6-아미노카프로일-CoA 리덕타제(알데하이드 형성) 및 헥사메틸렌디아민 트랜스아미나제 활성을 코딩하는 bcd(NP-349317.1), etfAB(NP-349315.1 및 NP-349316.1), acrl(YP-047869.1) 및 ygjG(NP-417544) 유전자들을 PA1/lacO 프로모터 하에 pZA33 벡터(Expressys, Ruelzheim, Germany) 내로 클로닝한다. 마지막으로, 석시닐-CoA 리덕타제(알데하이드 형성), GABA 트랜스아미나제 및 4-아미노부티릴-CoA/아실-CoA 트랜스퍼라제 활성을 코딩하는 sucD(NP-904963.1), gabT(NP-417148.1) 및 cat2(P38942.2) 유전자들을 PA1/lacO 프로모터 하에 제3 상용가능한 플라스미드 pZS23 내로 클로닝하여 4-아미노부티릴-CoA의 이용가능성을 증가시킨다. pZS23은 잘 공지되어 있는 분자생물학 기법으로 pZS13 벡터(Expressys, Ruelzheim, Germany)의 앰피실린 내성 모듈을 카나마이신 내성 모듈로 대체함으로써 수득된다. 3개의 플라스미드 세트들을 이. 콜라이 MG1655 내로 형질전환시켜, 헥사메틸렌디아민 합성을 위해 요구된 단백질 및 효소를 발현시킨다.
헥사메틸렌디아민은 6-아미노카프로레이트(6-ACA)로부터 생성될 수도 있다. 이 경로는 인산화 및/또는 아실화에 의한 산 기의 활성화를 포함한다. 말단 아미노 기의 아세틸화는 경로 중간체의 자발적인 고리화로부터의 보호를 제공한다.
6-아미노카프로에이트로부터 HMD를 생성하는 여러 경로들은 도 13에 상세히 기재되어 있다. 모든 경로들은 카복실산 기의 활성화에 이은 환원 및 아미노기 전이를 수반한다. 3개의 경로들에서는 6-아미노카프로에이트가 직접적으로 활성화되는 반면, 다른 경로에서는 말단 아민 기는 N-아세틸화에 의해 보호되어 자발적인 고리화를 방지한다.
한 경로에서, 6-아미노카프로에이트는 6-아미노카프로에이트 키나제에 의해 6-AHOP로 인산화된다(도 13, 단계 A). 그 다음, 6-AHOP는 6-아미노카프로산 세미알데하이드로 환원된 후(도 13, 단계 B), 아미노트랜스퍼라제 또는 아미노화 옥시도리덕타제에 의해 아미노기 전이된다(도 13, 단계 C).
대안적으로, 6-AHOP는 아실트랜스퍼라제에 의해 6-아미노카프로일-CoA로 전환된다(도 13, 단계 L). 그 다음, 6-아미노카프로일-CoA는 CoA 의존성 알데하이드 데하이드로게나제에 의해 6-아미노카프로산 세미알데하이드로 환원된다(도 13, 단계 N). 그 다음, HMD는 아미노트랜스퍼라제 또는 아미노화 옥시도리덕타제에 의한 6-아미노카프로산 세미알데하이드의 아미노기 전이에 의해 형성된다(도 13, 단계 C).
또 다른 경로에서, 6-아미노카프로에이트가 먼저 CoA 트랜스퍼라제 또는 CoA 리가제에 의해 CoA 유도체로 활성화된다(도 13, 단계 M). 생성물인 6-아미노카프로일-CoA는 알데하이드 형성 CoA 의존성 알데하이드 데하이드로게나제에 의해 6-아미노카프로산 세미알데하이드로 자발적으로 환형화할 수 있거나 전환될 수 있다(도 13, 단계 N). 6-아미노카프로산 세미알데하이드는 아미노트랜스퍼라제 또는 아미노화 옥시도리덕타제에 의해 HMD로 전환된다(도 13, 단계 C).
추가 경로는 6-아미노카프로에이트 N-아세틸트랜스퍼라제의 아세틸화된 생성물인 6-아세트아미도헥사노에이트로부터 진행한다. 6-아세트아미도헥사노에이트는 상이한 경로에 의해 6-아세트아미도헥산알로 전환된다(후술됨). 이들 경로들의 최종 2개 단계들에서, 6-아세트아미도헥산알이 먼저 아미노트랜스퍼라제 또는 아미노화 옥시도리덕타제에 의해 6-아세트아미도헥산아민으로 전환된다(도 13, 단계 G). 그 후, 6-아세트아미도헥산아민은 아미드 하이드롤라제 또는 N-아세틸트랜스퍼라제에 의해 HMD로 전환된다(도 13, 단계 H).
한 경로에서, 6-아세트아미도헥사노에이트는 6-아세트아미도헥사노에이트 키나제에 의해 인산화된다(도 13, 단계 E). 생성물인 6-AAHOP는 환원되어 6-아세트아미도헥산알을 형성하고(도 13, 단계 F), 그 후 6-아세트아미도헥산알은 전술된 바와 같이 HMD로 전환된다.
또 다른 경로에서, 6-아세트아미도헥사노에이트는 CoA 트랜스퍼라제 또는 CoA 리가제에 의해 6-아세트아미도헥사노일-CoA로 활성화된다(도 13, 단계 I). 그 다음, CoA 유도체는 알데하이드 형성 CoA 의존성 옥시도리덕타제에 의해 6-아세트아미도헥산알로 환원된다(도 13, 단계 J). 그 후, 6-아세트아미도헥산알은 전술된 바와 같이 HMD로 전환된다.
대안적으로, 6-아세트아미도헥사노에이트는 6-AAHOP로 인산화된 후(도 13, 단계 E), 아실트랜스퍼라제에 의해 6-아세트아미도헥사노일-CoA로 전환된다(도 13, 단계 K). 그 다음, 6-아세트아미도헥사노일-CoA는 전술된 바와 같이 HMD로 환원된다.
도 12 및 13에 표시된 변환은 표 9에 제시된 변환의 일반적인 범주에 속한다. 각각의 범주에서 다수의 생화학적으로 특징규명된 유전자들이 아래에 기재되어 있다. 적절하게 클로닝되고 발현될 때, 도 12 및 13에서 적절한 변환을 촉진하기 위해 적용될 수 있는 유전자들이 구체적으로 나열되어 있다.
표 9는 공통의 핵심 대사 중간체를 6-아미노카프로에이트 및 헥사메틸렌디아민으로 전환시키는 데 유용한 효소 유형을 보인다. 각각의 표지의 처음 3개 숫자는 기질 특이성과 무관한 변환의 일반적인 유형을 표시하는 처음 3개 효소 위원회(Enzyme Commission) 번호 숫자에 상응한다.
[표 9]
Figure pct00040
1.2.1.b 옥시도리덕타제(알데하이드로의 아실-CoA의 변환). 6-아세트아미도헥산알로의 6-아세트아미도헥사노일-CoA의 변환(도 13, 단계 J) 및 6-아미노카프로산 세미알데하이드로의 6-아미노카프로일-CoA의 변환(도 13, 단계 N)은 EC 클래스 1.2.1의 CoA 의존성 옥시도리덕타제 효소에 의해 촉진된다. 아디필-CoA는 유사한 기능을 갖는 효소인 아디필-CoA 옥시도리덕타제에 의해 아디페이트 세미알데하이드로 전환된다(도 12, 단계 O). 석시닐-CoA로부터 도 12의 전구체 석신산 세미알데하이드를 형성하는 효소인 석신산 세미알데하이드 데하이드로게나제도 CoA 의존성 옥시도리덕타제이다. EC 클래스 1.2.1의 옥시도리덕타제는 아실-CoA를 이의 상응하는 알데하이드로 환원시킬 수 있다. 이러한 효소를 코딩하는 예시적인 유전자는 지방 아실-CoA 리덕타제를 코딩하는 악시네토박터 칼코아세티커스(Acinetobacter calcoaceticus) acrl(Reiser and Somerville, Journal of Bacteriology 179:2969-2975 (1997)), 악시네토박터 종 M-1 지방 아실-CoA 리덕타제(Ishige et al., Appl. Environ. Microbiol. 68:1192-1195 (2002)), 및 클로스트리듐 클루이베리의 sucD 유전자에 의해 코딩된 CoA 및 NADP 의존성 석신산 세미알데하이드 데하이드로게나제(Sohling and Gottschalk, J. Bacteriol. 178:871-880 (1996))를 포함한다. 피. 진지발리스(P. gingivalis)의 SucD는 또 다른 석신산 세미알데하이드 데하이드로게나제이다(Takahashi et al., J. Bacteriol. 182:4704-4710 (2000)). bphG에 의해 코딩된, 슈도모나스 종의 아실화 아세트알데하이드 데하이드로게나제는 아세트알데하이드, 프로피온알데하이드, 부티르알데하이드, 이소부티르알데하이드 및 포름알데하이드를 산화시키고 아실화하는 것으로 입증되었기 때문에 또 다른 후보이다(Powlowski et al., J Bacteriol. 175:377-385 (1993)). 아세틸-CoA를 에탄올로 환원시키는 것 이외에, 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides)의 adhE에 의해 코딩된 효소는 분지쇄 화합물 이소부티르알데하이드를 이소부티릴-CoA로 산화시키는 것으로 확인되었다(Kazahaya et al., J. Gen. Appl. Microbiol. 18:43-55 (1972); Koo et al., Biotechnol Lett. 27:505-510 (2005)).
Figure pct00041
아실-CoA를 이의 상응하는 알데하이드로 전환시키는 추가 효소는 말로닐-CoA를 말론산 세미알데하이드로 변환시키는 말로닐-CoA 리덕타제이다. 말로닐-CoA 리덕타제는 호열호산성 고세균에서 3-하이드록시프로피오네이트 주기를 통한 영양요구성 탄소 고정에서 핵심 효소이다(Berg et al., Science 318:1782-1786 (2007); and Thauer R. K., Science 318:1732-1733 (2007)). 상기 효소는 NADPH를 보조인자로서 사용하고 메탈로스패라 및 설폴로버스 종에서 특징규명되었다(Alber et al., J. Bacteriol. 188:8551-8559 (2006); and Hugler et al., J. Bacteriol. 184:2404-2410 (2002)). 상기 효소는 메탈로스패라 세둘라(Metallosphaera sedula)에서 Msed_0709에 의해 코딩된다(Alber et al., J. Bacteriol. 188:8551-8559 (2006); and Berg et al., Science. 318:1782-1786 (2007)). 설폴로버스 토코다이이(Sulfolobus tokodaii)로부터의 말로닐-CoA 리덕타제를 코딩하는 유전자는 이. 콜라이에서 클로닝되었고 이종적으로 발현되었다(Alber et al., J. Bacteriol. 188:8551-8559 (2006)). 이 효소가 메틸말로닐-CoA를 그의 상응하는 알데하이드로 전환시키는 것을 촉진한다는 것도 밝혀졌다(WIPO 특허출원 공보 제WO2007/141208호 Kind Code: A2). 이들 효소의 알데하이드 데하이드로게나제 기능이 클로로플렉서스 아우란티아커스로부터의 이기능성 데하이드로게나제와 유사할지라도, 서열 유사성은 거의 없다. 말로닐-CoA 리덕타제 효소 후보 둘 다가 아스파르테이트 세미알데하이드로의 아스파르틸-4-포스페이트의 환원 및 동시발생적 탈인산화를 촉진하는 효소인 아스파르테이트-세미알데하이드 데하이드로게나제와 높은 서열 유사성을 가진다. 추가 유전자 후보는 설폴로버스 솔파타리커스 및 설폴로버스 악시도칼다리우스를 포함하는 다른 유기체 내의 단백질과의 서열 상동성에 의해 확인될 수 있고 아래에 나열되어 있다. CoA-아실화 알데하이드 데하이드로게나제에 대한 또 다른 후보는 클로스트리듐 베이제린키이로부터의 ald 유전자이다(Toth et al., Appl Environ Microbiol 65:4973-4980 (1999)). 이 효소는 아세틸-CoA 및 부티릴-CoA를 이들의 상응하는 알데하이드로 환원시키는 것으로 보고되어 있다. 이 유전자는 살모넬라 티피뮤륨 및 이. 콜라이의 아세트알데하이드 데하이드로게나제를 코딩하는 eutE와 매우 유사하다(Toth et al., Appl Environ Microbiol 65:4973-4980 (1999)).
Figure pct00042
1.2.1.c 옥시도리덕타제(아실-CoA로의 2-케토산의 변환). 도 12의 여러 변환들은 EC 클래스 1.2.1의 효소에 의한 아실-CoA로의 2-케토산의 전환(단계 L, P 및 Q)을 요구한다. 이러한 반응은 2-케토산의 아실화 산화적 탈카복실화를 야기하는 일련의 부분적 반응들을 촉진하는 다중효소 복합체에 의해 촉진된다. 예시적인 효소는 1) 분지쇄 2-케토산 데하이드로게나제, 2) 알파-케토글루타레이트 데하이드로게나제, 및 3) 피루베이트 데하이드로게나제 다중효소 복합체(PDHC)를 포함한다. 각각의 2-케토산 데하이드로게나제 복합체는 중간 대사에서 핵심 위치를 차지하고, 효소 활성은 전형적으로 엄격히 조절된다(Fries et al., Biochemistry 42:6996-7002 (2003)). 효소는 3개 촉매활성 성분들인 알파-케토산 데카복실라제(E1), 디하이드로리포아미드 아실트랜스퍼라제(E2) 및 디하이드로리포아미드 데하이드로게나제(E3)의 다수의 카피들로 구성된, 복합하지만 공통된 구조를 공유한다. E3 성분은 유기체에서 모든 2-케토산 데하이드로게나제 복합체들 사이에 공유되는 반면, E1 및 E2 성분은 상이한 유전자에 의해 코딩된다. 상기 효소 성분들은 상기 복합체에 다수의 카피로 존재하고, 기질 채널링을 통해 지정된 순서의 반응들을 촉매하기 위해 다수의 보조인자들을 사용한다. 이들 데하이드로게나제 복합체들의 전체 크기는 매우 크고, 이때 분자 질량은 4 내지 10 밀리 Da이다(즉, 리보좀보다 더 큼).
2-케토산 데하이드로게나제 패밀리 내의 효소의 활성은 이. 콜라이에서 혐기성 조건 하에 정상적으로 낮거나 한정된다. NADH(또는 NADPH)의 증가된 생성은 산화환원-불균형을 유발할 수 있고, NADH 그 자체는 효소 기능에 대한 억제제로서 작용한다. 조작 노력은 이. 콜라이 피루베이트 데하이드로게나제 복합체의 혐기성 활성을 증가시켰다(Kim et al., Appl. Environ. Microbiol. 73:1766-1771 (2007); Kim et al., J. Bacteriol. 190:3851-3858 (2008); and Zhou et al., Biotechnol. Lett. 30:335-342 (2008)). 예를 들면, NADH의 억제 효과는 E3 성분에서 H322Y 돌연변이를 조작함으로써 극복될 수 있다(Kim et al., J. Bacteriol. 190:3851-3858 (2008)). 개별 성분들의 구조적 연구 및 이들이 복합체로 함께 작용하는 방법은 이 패밀리 내의 효소의 촉매활성 기작 및 구성에 대한 통찰력을 제공한다(Aevarsson et al., Nat. Struct. Biol. 6:785-792 (1999); and Zhou et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 98:14802-14807 (2001)). 데하이드로게나제 복합체의 기질 특이성은 상이한 유기체에서 달라지지만, 일반적으로 분지쇄 케토산 데하이드로게나제는 가장 넓은 기질 범위를 가진다.
알파-케토글루타레이트 데하이드로게나제(AKGD)는 알파-케토글루타레이트를 석시닐-CoA로 전환시키고 TCA 사이클를 통한 대사 유동의 조절의 일차 부위이다(Hansford, Curr. Top. Bioenerg. 10:217-278 (1980)). 이. 콜라이에서 유전자 sucA, sucB 및 lpd에 의해 코딩될 때, AKGD 유전자 발현은 혐기성 조건 하에 및 글루코스 상에서의 생장 동안 하향조절된다(Park et al., Mol. Microbiol. 15:473-482 (1995)). AKGD의 기질 범위가 좁을지라도, E2 성분의 촉매활성 코어의 구조적 연구는 기질 특이성을 담당하는 특정 잔기를 정확히 찾아낸다(Knapp et al., J. Mol. Biol. 280:655-668 (1998)). odhAB(E1 및 E2) 및 pdhD(E3, 공유된 도메인)에 의해 코딩된 바실러스 서브틸리스 AKGD는 전사 수준에서 조절되고 탄소원 및 유기체의 생장기에 의해 좌우된다(Resnekov et al., Mol. Gen. Genet. 234:285-296 (1992)). 효모에서, E3 성분을 코딩하는 LPD1 유전자는 글루코스에 의해 전사 수준에서 조절된다(Roy and Dawes, J. Gen. Microbiol. 133:925-933 (1987)). KGD1에 의해 코딩된 E1 성분도 글루코스에 의해 조절되고 HAP2 및 HAP3의 생성물에 의해 활성화된다(Repetto and Tzagoloff, Mol. Cell. Biol. 9:2695-2705 (1989)). 생성물 NADH 및 석시닐-CoA에 의해 억제되는 AKGD 효소 복합체는 그의 손상된 기능이 여러 신경학적 질환들과 연관되어 있기 때문에 포유동물 시스템에서 잘 연구되어 있다(Tretter and dam-Vizi, Philos. Trans. R. Soc. Lond B Biol. Sci. 360:2335-2345 (2005)).
Figure pct00043
2-옥소이소발레레이트 데하이드로게나제로서도 공지되어 있는 분지쇄 2-케토산 데하이드로게나제 복합체(BCKAD)는 발린, 류신 및 이소류신의 2-케토산 유도체들을 그들의 아실-CoA 유도체 및 CO2로 전환시키는, 분지쇄 아미노산 분해 경로에 참여한다. 상기 복합체는 바실러스 서브틸리스(Wang et al., Eur. J. Biochem. 213:1091-1099 (1993)), 라터스 노르베기커스(Namba et al., J. Biol. Chem. 244:4437-4447 (1969)) 및 슈도모나스 푸티다(Sokatch et al., J. Bacteriol. 148:647-652 (1981))를 포함하는 많은 유기체들에서 연구되었다. 바실러스 서브틸리스에서, 효소는 유전자 pdhD(E3 성분), bfmBB(E2 성분), bfmBAA 및 bfmBAB(E1 성분)에 의해 코딩된다(Wang et al., Eur. J. Biochem. 213:1091-1099 (1993)). 포유동물에서, 상기 복합체는 특정 포스파타제 및 단백질 키나제에 의한 인산화에 의해 조절된다. 상기 복합체는 래트 헤파토사이트(hepatocites)에서 연구되었고(Chicco et al., J. Biol. Chem. 269:19427-19434 (1994)) 유전자 Bckdha(E1 알파), Bckdhb(E1 베타), Dbt(E2) 및 Dld(E3)에 의해 코딩된다. 슈도모나스 푸티다 BCKAD 복합체의 E1 및 E3 성분들은 결정화되었고(Aevarsson et al., Nat. Struct. Biol. 6:785-792 (1999); and Mattevi et al., Science. 255:1544-1550 (1992)), 효소 복합체는 연구되었다(Sokatch et al., J. Bacteriol. 148:647-652 (1981)). 슈도모나스 푸티다 BCKAD 유전자의 전사는 bkdR의 유전자 생성물에 의해 활성된다(Hesslinger et al., Mol. Microbiol. 27:477-492 (1998)). 라터스 노르베기커스(Paxton et al., Biochem. J. 234:295-303 (1986)) 및 사카로마이세스 세레비지에(Sinclair et al., Biochem. Mol. Biol. Int. 31: 911-922 (1993))를 포함하는 일부 유기체들에서, 이 복합체는 분지쇄 아미노산 전구체 이외에 선형 옥소산, 예컨대, 2-옥소부타노에이트 및 알파-케토글루타레이트를 포함하는 넓은 기질 범위를 갖는 것으로 밝혀졌다. 소 BCKAD의 활성 부위는 대안적 기질인 아세틸-CoA에 유리하도록 조작되었다(Meng and Chuang, Biochemistry. 33:12879-12885 (1994)).
Figure pct00044
아세틸-CoA로의 피루베이트의 전환을 촉진하는 피루베이트 데하이드로게나제 복합체도 광범위하게 연구되었다. 이. 콜라이 효소에서, E1 성분 내의 특정 잔기는 기질 특이성을 담당한다(Bisswanger, J Biol Chem. 256:815-822 (1981); Bremer, Eur. J Biochem. 8:535-540 (1969); and Gong et al., J Biol Chem. 275:13645-13653 (2000)). 이미 언급된 바와 같이, 효소 조작 노력은 혐기성 조건 하에서의 이. 콜라이 PDH 효소 활성을 개선하였다(Kim et al., Appl. Environ. Microbiol. 73:1766-1771 (2007); Kim et al., J. Bacteriol. 190:3851-3858 (2008)); and Zhou et al., Biotechnol. Lett. 30:335-342 (2008)). 이. 콜라이 PDH와 대조적으로, 비. 서브틸리스 복합체는 활성을 나타내고 혐기성 조건 하에 생장을 위해 요구된다(Nakano et al., J. Bacteriol. 179:6749-6755 (1997)). 글리세롤 상에서의 생장 동안 특징규명된 클렙시엘라 뉴모니아 PDH도 혐기성 조건 하에 활성을 나타낸다(Menzel et al., J. Biotechnol. 56:135-142 (1997)). 소 신장으로부터의 상기 효소 복합체의 결정 구조(Zhou et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 98:14802-14807 (2001)) 및 아조토박터 비넬란디이(Azotobacter vinelandii)로부터의 E2 촉매활성 도메인이 이용가능하다(Mattevi et al., Science. 255:1544-1550 (1992)). 라터스 노르베기커스 PDH 및 BCKAD의 비교 동력학은 BCKAD가 기질로서 2-옥소부타노에이트에 대한 더 높은 활성을 가진다는 것을 시사할지라도, 일부 포유동물 PDH 효소 복합체들은 대안적 기질, 예컨대, 2-옥소부타노에이트에 대해 반응할 수 있다(Paxton et al., Biochem. J. 234:295-303 (1986)).
Figure pct00045
전술된 큰 다중효소 2-케토산 데하이드로게나제 복합체에 대한 대안으로서, 일부 혐기성 유기체들은 2-케토산 옥시도리덕타제 패밀리(OFOR) 내의 효소를 사용하여 2-케토산의 아실화 산화적 탈카복실화를 촉진한다. 데하이드로게나제 복합체와 달리, 이 효소는 철-황 클러스터를 함유하고, 상이한 보조인자를 사용하고, 전자 수용자로서 NAD(P)H 대신에 페레독신 또는 플라보독신을 사용한다. 이 패밀리 내의 대다수의 효소들은 기질(POR)인 피루베이트에 특이적인 반면, 일부 2-케토산:페레독신 옥시도리덕타제는 알파-케토글루타레이트 및 2-옥소부타노에이트를 포함하는 기질로서 광범위한 2-케토산들을 수용하는 것으로 밝혀졌다(Fukuda and Wakagi, Biochim. Biophys. Acta 1597:74-80 (2002); and Zhang et al., J. Biochem. 120:587-599 (1996)). 이러한 효소 중 하나는 유전자 ST2300에 의해 코딩된 알파 및 베타 서브유닛을 함유하는, 호열호산성 고세균 설폴로버스 토코다이이 7로부터의 OFOR이다(Fukuda and Wakagi, Biochim. Biophys. Acta 1597:74-80 (2002); and Zhang et al., J. Biochem. 120:587-599 (1996)). 이. 콜라이에서 이 단백질을 효율적으로 발현시키기 위한 플라스미드-기반 발현 시스템이 개발되었고(Fukuda et al., Eur. J. Biochem. 268:5639-5646 (2001)), 기질 특이성에 관여하는 잔기가 확인되었다(Fukuda and Wakagi, Biochim. Biophys. Acta 1597:74-80 (2002)). 애로파이룸 퍼닉스(Aeropyrum pernix) 균주 K1로부터의 2개의 OFOR들도 이. 콜라이 내로 최근에 클로닝되었고, 특징규명되었고, 광범위한 2-옥소산들과 반응하는 것으로 확인되었다(Nishizawa et al., FEBS Lett. 579:2319-2322 (2005)). 이들 OFOR 후보들의 유전자 서열들은 최근까지 배정된 진뱅크 식별번호를 갖지 않을지라도 입수가능하다. 유사한 효소가 모든 고세균들, 일부 혐기성 박테리아들 및 아미토콘드리아 진핵생물류(amitochondrial eukarya)에 존재한다는 생물정보학적 증거가 있다(Fukuda and Wakagi, Biochim. Biophys. Acta 1597:74-80 (2002)). 환원된 페레독신은 페레독신-NAD 리덕타제로 NADH를 생성하는 데 사용될 수 있기 때문에, 이 클래스의 효소는 에너지 관점에서 볼 때에도 흥미롭다(Petitdemange et al., Biochim. Biophys. Acta 421:334-337 (1976)). 또한, 대다수의 효소들은 혐기성 조건 하에 작동하도록 디자인되기 때문에, 혐기성 환경에서 활성을 위해 2-케토산 데하이드로게나제 복합체 패밀리 내의 효소에 비해 더 적은 효소 조작이 요구될 수 있다.
Figure pct00046
1.2.1.d 옥시도리덕타제(알데하이드로의 포스폰산의 환원). 포스폰산을 그의 상응하는 알데하이드로 환원시키는 것은 EC 클래스 1.2.1의 옥시도리덕타제에 의해 촉진된다. 도 13에서 단계 B 및 F는 6-AHOP 및 6-AAHOP를 그들의 상응하는 알데하이드로 환원시키기 위해 이러한 효소를 요구한다. 이들 반응은 공지된 효소에 의해 촉진되지 않으나, 유사한 반응은 아스파르테이트 세미알데하이드 데하이드로게나제(ASD, EC 1.2.1.11)에 의해 촉진된다: 아스파르테이트-4-세미알데하이드로의 4-아스파르틸 포스페이트의 NADPH 의존성 환원. ASD는 아미노산 생합성에 참여하고 최근에 항균 표적으로서 연구되었다(Hadfield et al., Biochemistry 40:14475-14483 (2001)). 이. 콜라이 ASD 구조는 해석되었고(Hadfield et al., J. Mol. Biol. 289:991-1002 (1999)), 효소는 대안적 기질 베타-3-메틸아스파르틸 포스페이트를 수용하는 것으로 확인되었다(Shames et al., J. Biol. Chem. 259:15331-15339 (1984)). 해모필러스 인플루엔자 효소는 활성 부위에서의 기질 결합 친화성을 변경시키기 위한 효소 조작 연구의 객체이다(Blanco et al., Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 60:1388-1395 (2004); and Blanco et al., Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 60:1808-1815 (2004)). 다른 ASD 후보는 마이코박테륨 투버큘로시스(Mycobacterium tuberculosis)(Shafiani et al., J Appl Microbiol 98:832-838 (2005)), 메타노코커스 잔나스키이(Methanococcus jannaschii)(Faehnle et al., J Mol. Biol. 353:1055-1068 (2005)) 및 감염성 미생물 비브리오 콜레라(Vibrio cholera) 및 헬리오박터 파일로리(Heliobacter pylori)(Moore et al., Protein Expr. Purif. 25:189-194 (2002))에서 발견된다. 관련된 효소 후보는 에스. 세레비지에(Pauwels et al., Eur. J Biochem. 270:1014-1024 (2003)), 비. 서브틸리스(O'Reilly and Devine, Microbiology 140 (Pt 5):1023-1025 (1994)) 및 다른 유기체에서 발견되는, 아세틸글루타밀포스페이트를 아세틸글루타메이트-5-세미알데하이드로 천연적으로 환원시키는 효소인 아세틸글루타밀포스페이트 리덕타제(EC 1.2.1.38)이다.
Figure pct00047
1.3.1.a 옥시도리덕타제(알칸으로의 알켄의 변환). 여러 변환들이 알켄을 알칸으로 환원시키는 옥시도리덕타제의 범주에 속한다(EC 1.3.1.-). 예를 들면, 각각 OHED 리덕타제, 6-OHE 리덕타제, 2-AHE 리덕타제 및 2,3-데하이드로아디필-CoA 리덕타제에 의해 촉진되는 도 12의 단계 C, G, K 및 N은 이 범주에 속한다. 에논 리덕타제, 알켄알 리덕타제 및 에노에이트 리덕타제 효소는 단계 C, G 및 K의 변환을 촉진하기에 적합한 효소 후보이다. 에노일-CoA 리덕타제 효소는 아디필-CoA로의 2,3-데하이드로아디필-CoA의 전환을 촉진한다(단계 N).
에논 리덕타제 활성을 갖는 효소는 원핵생물, 진핵생물 및 식물에서 확인되었다(Shimoda et al., Bulletin of the chemical Society of Japan 77:2269-2 (2004); and Wanner and Tressl, Eur. J Biochem. 255:271-278 (1998)). 사카로마이세스 세레비지에의 세포질 분획으로부터 2개의 에논 리덕타제들이 정제되었고 특징규명되었고, 기질로서 다양한 알켄알들(6-OHE와 유사함) 및 에노일 케톤들(OHED와 유사함)을 수용하는 것으로 확인되었다(Wanner and Tressl, Eur. J Biochem. 255:271-278 (1998)). 이들 효소들을 코딩하는 유전자들은 최근까지 확인되지 않았다. 사이노박테륨 사이네코코커스(cyanobacterium Synechococcus) 종 PCC7942의 세포 추출물은 다양한 에논 기질들을 그들의 상응하는 알킬 케톤들로 환원시켰다(Shimoda et al., Bulletin of the chemical Society of Japan 77:2269-2 (2004)). 유전자는 이 유기체에서 이 활성과 관련되어 있지 않았다. 다른 유기체의 에논 리덕타제도 이 변환을 촉진할 수 있다.
NtRed1에 의해 코딩된, 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum)으로부터의 재조합 NADPH 의존성 에논 리덕타제는 이. 콜라이에서 기능적으로 발현되었고 특징규명되었다(Matsushima et al., Bioorganic Chemistry 36:23-28 (2008)). 이 리덕타제는 외향고리형(exocyclic) 에노일 케톤 풀레곤(pulegone)에 작용하였다(Matsushima et al., Bioorganic Chemistry 36:23-28 (2008)). 에스. 세레비지에에서 좌위 YML131W에 있는 효소 후보는 NtRed1과 30%의 동일성을 가진다(evalue=1e-26). NtRed1의 아미노산 서열은 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)로부터의 2-알켄알 리덕타제, 아라비돕시스 탈리아나로부터의 제타-크리스탈린 상동체, 멘테 피페리타(Menthe piperita)로부터의 풀레곤 리덕타제 및 피너스 태다(Pinus taeda)로부터의 페닐프로펜알 알켄 리덕타제와 상당한 상동성을 공유한다. 이들 효소들은 α,β-불포화 케톤 및 알데하이드의 알켄의 환원을 촉진하는 것으로 공지되어 있다.
Figure pct00048
2-알켄알 리덕타제는 알데하이드 및 케톤의 α,β-불포화 이중 결합의 환원을 촉진한다. 보리 알켄알 하이드로게나제 ALH1은 트랜스-2-노넨알, 2-헥센알, 트라우마틴(traumatin) 및 1-옥텐-3-온을 비롯한 다양한 α,β-불포화 케톤들 및 알데하이드들에 대한 활성을 갖는 것으로 확인되었다(Hambraeus and Nyberg, J Agric. Food Chem. 53:8714-8721 (2005)). 여섯줄보리(Hordeum vulgare) ALH1 cDNA는 이. 콜라이에서 클로닝되었고 발현되었다(Hambraeus and Nyberg, J Agric. Food Chem. 53:8714-8721 (2005)).
Figure pct00049
2-에노에이트 리덕타제 효소는 매우 다양한 α,β-불포화 카복실산 및 알데하이드의 NAD(P)H 의존성 환원을 촉진하는 것으로 공지되어 있다(Rohdich et al., J. Biol. Chem. 276:5779-5787 (2001)). 씨. 클루이베리(C. kluyveri)의 최근에 공개된 게놈 서열에서, 에노에이트 리덕타제에 대한 9개의 코딩 서열들이 보고되었고, 이들 중 하나는 특징규명되었다(Seedorf et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A 105:2128-2133 (2008)). 씨. 티로부티리쿰(C. tyrobutyricum) 및 엠. 써모아세티쿰(M. thermoaceticum) 둘 다로부터의 enr 유전자는 클로닝되었고 서열결정되었고 서로에 대해 59%의 동일성을 보인다. 전자 유전자는 씨. 클루이베리의 특징규명된 유전자와 대략 75%의 유사성도 갖는 것으로 확인된다(Giesel and Simon, Arch. Microbiol 135:51-57 (1983)). 이들 서열 결과를 기초로, enr이 이. 콜라이의 디에노일 CoA 리덕타제(fadH)와 매우 유사하다고 보고되었다(Rohdich et al., J. Biol. Chem. 276:5779-5787 (2001)). 씨. 써모아세티쿰(C. thermoaceticum) enr 유전자도 이. 콜라이에서 촉매 활성 형태로 발현되었다(Rohdich et al., J. Biol. Chem. 276:5779-5787 (2001)).
Figure pct00050
또 다른 후보 에노에이트 리덕타제는 3-옥소아디페이트로의 2-말레일아세테이트(4-옥소헥스-2-엔디오에이트)의 환원을 촉진하는 효소인 3-옥소아디페이트 옥시도리덕타제(말레일아세테이트 리덕타제)이다. 효소 활성은 슈도모나스 종 균주 B13(Kaschabek and Reineke, J. Bacteriol. 177:320-325 (1995); and Kaschabek. and Reineke, J. Bacteriol. 175:6075-6081 (1993))에서 확인되고 특징규명되었고, 코딩 유전자는 클로닝되었고 서열결정되었다(Kasberg et al., J. Bacteriol. 179:3801-3803 (1997)). 3-옥소아디페이트 옥시도리덕타제에 대한 후보 유전자는 슈도모나스 균주 종 B13으로부터의 clcE 유전자(Kasberg et al., J. Bacteriol. 179:3801-3803 (1997)), 로도코커스 오파커스(Rhodococcus opacus)로부터의 macA 유전자(Seibert et al., J. Bacteriol. 180:3503-3508 (1998)), 및 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha)(쿠프리아비더스 네카터(Cupriavidus necator)로서 공지되어 있음)로부터의 macA 유전자(Seibert et al., Microbiology 150:463-472 (2004))를 포함한다.
Figure pct00051
에노일-CoA 리덕타제 효소는 아디필-CoA로의 2,3-데하이드로아디필-CoA의 환원을 촉진하기에 적합한 효소이다(도 12, 단계 N). 한 예시적인 에노일-CoA 리덕타제는 부티릴-CoA로의 크로토닐-CoA의 환원을 천연적으로 촉진하는, 씨. 아세토부틸리쿰으로부터의 bcd의 유전자 생성물이다(Atsumi et al., Metab Eng 10:305-311 (2008); and Boynton et al., J. Bacteriol. 178:3015-3024 (1996)). 이 효소의 활성은 전자 전달 플라보단백질을 코딩하는, 씨. 아세토부틸리쿰 etfAB 유전자의 발현과 함께 bcd의 발현에 의해 향상될 수 있다. 에노일-CoA 리덕타제 단계를 위한 추가 후보는 이. 그라실리스(E. gracilis)로부터의 미토콘드리아 에노일-CoA 리덕타제이다(Hoffmeister et al., J. Biol. Chem. 280:4329-4338 (2005)). 이 서열로부터 유도된 구축물을 그의 미토콘드리아 표적화 리더 서열의 제거 후 이. 콜라이에서 클로닝하여 활성 효소를 생성하였다(Hoffmeister et al., J Biol. Chem. 280:4329-4338 (2005)). 이 방법은 원핵 유기체에서 진핵 유전자, 특히 유전자 생성물을 특정 세포내 구획으로 표적화할 수 있는 리더 서열을 갖는 진핵 유전자를 발현시키는 분야에서 숙련된 자에게 잘 공지되어 있다. 원핵생물 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola)로부터의 이 유전자의 가까운 상동체인 TDE0597은 이. 콜라이에서 클로닝되고 발현된 세 번째 에노일-CoA 리덕타제를 대표한다(Tucci and Martin, Febs Letters 581:1561-1566 (2007)).
Figure pct00052
추가 에노일-CoA 리덕타제 효소 후보는 방향족 화합물을 분해하는 유기체에서 발견된다. 벤조에이트 분해에 대한 모델 유기체인 로도슈도모나스 팔루스트리스(Rhodopseudomonas palustris)는 피멜로일-CoA의 베타-산화를 통해 피멜레이트를 분해하는 효소 능력을 가진다. pim 오페론 내의 인접 유전자들인 pimC 및 pimD는 씨. 아세토부틸리쿰 bcd와 서열 상동성을 갖고 플라빈 함유 피멜로일-CoA 데하이드로게나제를 코딩할 것으로 예측된다(Harrison and Harwood, Microbiology 151:727-736 (2005)). 질소 고정 대두 공생자인 브라디리조븀 자포니쿰(Bradyrhizobium japonicum)의 게놈도 알. 팔루스트리스(R. palustris)의 pimC 및 pimD와 높은 서열 유사성을 갖는 유전자들로 구성된 pim 오페론을 함유한다(Harrison and Harwood, Microbiology 151:727-736 (2005)).
Figure pct00053
추가 후보는 입체적으로 방해된 트랜스-에노일-CoA 기질의 환원을 촉진하는 효소인 2-메틸-분지쇄 에노일-CoA 리덕타제(EC 1.3.1.52)이다. 이 효소는 선충 아스카리우스 수움(Ascarius suum)에서 분지쇄 지방산 합성에 참여하고, 2-메틸부타노일-CoA, 2-메틸펜타노일-CoA, 옥타노일-CoA 및 펜타노일-CoA를 비롯한 다양한 직쇄 기질들 및 분지쇄 기질들을 환원시킬 수 있다(Duran et al., J Biol. Chem. 268:22391-22396 (1993)). 유전자 acad1 및 acad에 의해 코딩되는, 상기 효소의 두 동형체들이 특징규명되었다.
Figure pct00054
1.4.1.a 옥시도리덕타제(아미노로의 케톤 또는 알데하이드의 전환). 알데하이드 또는 케톤을 그의 상응하는 아민 기로 전환시키는 EC 클래스 1.4.1의 옥시도리덕타제는 개시된 경로에서 여러 생합성 단계들을 촉진한다. 도 12에서, 2-AHE(단계 J)로의 OHED의 전환, 2-AHD로의 2-OHD의 전환(단계 H) 및 6-아미노카프로에이트로의 아디페이트 세미알데하이드의 전환(단계 E)은 OHED 아미노화 옥시도리덕타제, 2-OHD 아미노화 옥시도리덕타제 및 아디페이트 세미알데하이드 아미노화 옥시도리덕타제에 의해 촉진된다. 도 13에서, HMD로의 6-아미노카프로에이트 세미알데하이드의 전환(단계 H) 및 6-아세트아미도헥산아민으로의 6-아세트아미도헥산알의 전환(단계 G)도 아미노화 옥시도리덕타제에 의해 촉진된다.
대다수의 아미노화 옥시도리덕타제들은 수용자로서 NAD+ 또는 NADP+를 사용하는 알파-아미노산의 가역적 산화적 탈아미노화를 촉진하고, 반응은 전형적으로 가역적이다. 예시적인 효소는 gdhA에 의해 코딩된 글루타메이트 데하이드로게나제(탈아미노화), ldh에 의해 코딩된 류신 데하이드로게나제(탈아미노화), 및 nadX에 의해 코딩된 아스파르테이트 데하이드로게나제(탈아미노화)를 포함한다. 에스케리키아 콜라이로부터의 gdhA 유전자 생성물(Korber et al., J. Mol. Biol. 234:1270-1273 (1993); and McPherson et al., Nucleic Acids Res. 11:5257-5266 (1983)), 써모토가 마리타임(Thermotoga maritime)으로부터의 gdh(Kort et al., Extremophiles. 1:52-60 (1997); Lebbink et al., J Mol. Biol. 280:287-296 (1998); and Lebbink et al., J Mol. Biol. 289:357-369 (1999)), 할로박테륨 살리나룸(Halobacterium salinarum)으로부터의 gdhA1은 각각 NADP(H), NAD(H) 또는 이들 둘 다에 유리하면서 2-옥소글루타레이트 및 암모니아로의 글루타메이트의 가역적 상호전환을 촉진한다. 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)의 ldh 유전자는 류신, 이소류신, 발린 및 2-아미노부타노에이트를 포함하는 광범위한 기질들을 갖는 LeuDH 단백질을 코딩한다(Ansorge and Kula, Biotechnol Bioeng 68:557-562 (2000); and Stoyan et al., J Biotechnol. 54:77-80 (1997)). 아스파르테이트 데하이드로게나제를 코딩하는, 써모토가 마리타임으로부터의 nadX 유전자는 NAD의 생합성에 관여한다(Yang et al., J Biol. Chem. 278:8804-8808 (2003)).
Figure pct00055
lysDH에 의해 코딩된 라이신 6-데하이드로게나제(탈아미노화)는 L-라이신의 6-아미노 기의 산화적 탈아미노화를 촉진하여 2-아미노아디페이트-6-세미알데하이드를 형성하고, 그 다음 2-아미노아디페이트-6-세미알데하이드는 비-효소적으로 고리화하여 Δ1-피페리데인-6-카복실레이트를 형성한다(Misono and Nagasaki, J. Bacteriol. 150:398-401 (1982)). 예시적인 효소는 제오바실러스 스테아로써모필러스(Geobacillus stearothermophilus)(Heydari et al., Appl Environ. Microbiol 70:937-942 (2004)), 아그로박테륨 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)(Hashimoto et al., J Biochem. 106:76-80 (1989); and Misono and Nagasaki, J. Bacteriol. 150:398-401 (1982)) 및 아크로모박터 데니트리피칸스(Achromobacter denitrificans)(Ruldeekulthamrong et al., BMB. Rep. 41:790-795 (2008))에서 발견될 수 있다. 아디페이트 세미알데하이드와 2-아미노아디페이트-6-세미알데하이드 사이의 구조적 유사성을 고려해 볼 때, 이러한 효소는 아디페이트 세미알데하이드를 6-아미노카프로에이트로 전환시키는 특히 우수한 후보이다.
Figure pct00056
2.3.1.a 아실트랜스퍼라제(CoA를 인에게 전달). CoA 모이어티를 포스페이트로 교환하는 아실트랜스퍼라제는 EC 클래스 2.3.1 내에 있다. 이 범주 내에서의 변환은 6-아세트아미도헥사노일-CoA로의 6-AAHOP의 전환(도 13, 단계 K) 및 6-아미노카프로일-CoA로의 6-AHOP의 전환(도 13, 단계 L)을 포함한다. 예시적인 포스페이트 전달 아실트랜스퍼라제는 pta에 의해 코딩된 포스포트랜스아세틸라제(EC 2.3.1.8) 및 ptb에 의해 코딩된 포스포트랜스부티릴라제(EC 2.3.1.19)를 포함한다. 이. 콜라이로부터의 pta 유전자는 아세틸-CoA를 아세틸-포스페이트로 가역적으로 전환시키는 효소를 코딩한다(Suzuki, T., Biochim. Biophys. Acta 191:559-569 (1969)). 이 효소는 공정에서 기질로서 프로피오닐-CoA를 사용하여 프로피오네이트를 형성할 수도 있다(Hesslinger et al., Mol. Microbiol 27:477-492 (1998)). 유사하게, 씨. 아세토부틸리쿰으로부터의 ptb 유전자는 부티릴-CoA를 부티릴-포스페이트로 가역적으로 전환시키는 효소인 포스페이트 트랜스부티릴라제를 코딩한다(Walter et al., Gene 134:107-111 (1993); and Wiesenborn et al., Appl Environ. Microbiol 55:317-322 (1989)). 추가 ptb 유전자는 부티레이트 생성 박테륨 L2-50(Louis et al., J. Bacteriol. 186:2099-2106 (2004)) 및 바실러스 메가테륨(Bacillus megaterium)(Vazquez et al., Curr. Microbiol 42:345-349 (2001))에서 발견된다.
Figure pct00057
2.3.1.c 아실트랜스퍼라제(N-아세틸트랜스퍼라제). N-아세틸트랜스퍼라제는 아세틸 기를 아민에게 전달하여 N-아세틸 기를 형성한다. N-아세틸화는 생물학적 시스템에서 전사 조절, 핵 이입, 염색체 조립 및 뉴클레오좀 리모델링을 포함하는 다양한 기능들을 수행한다(Kouzarides, EMBO J 19:1176-1179 (2000)). 아르기닌 생합성 경로의 대사 중간체의 N-아세틸화는 반응성 중간체를 자발적인 고리화로부터 보호하는 데에 기여하고 경로 중간체를 경쟁 경로로부터 격리시키는 데에도 기여한다(Caldovic and Tuchman, Biochem. J 372:279-290 (2003)). 6-ACA의 아세틸화(도 13, 단계 D)는 반응성 중간체를 자발적인 고리화로부터 보호하는, 도 13의 제안된 HMD 생합성 경로에서 유사한 역할을 수행한다.
6-ACA를 아세틸화하는 한 후보 효소는 아세틸 모이어티를 아세틸 포스페이트로부터 L-라이신, 베타-L-라이신 또는 L-오르니틴의 말단 아미노 기에게 선택적으로 전달하는 효소인 라이신 N-아세틸트랜스퍼라제(EC 2.3.1.32)이다. 이 효소는 6-ACA를 아세틸화하는 것으로 공지되어 있지 않지만, 이 기질은 천연 기질과 구조적으로 유사하다. 라이신 N-아세틸트랜스퍼라제는 보스 타우러스(Bos taurus)(Paik. and Kim, Arch. Biochem. Biophys. 108:221-229, 1964) 및 메타노사르시나 마제이(Methanosarcina mazei)(Pfluger et al., Appl Environ. Microbiol 69:6047-6055 (2003))에서 특징규명되었다. 메탄생성 고세균 엠. 마리팔루디스(M. maripaludis), 엠. 아세티보란스(M. acetivorans), 엠. 바케리(M. barkeri) 및 엠. 잔나스키이(M. jannaschii)도 이 기능을 갖는 효소를 코딩할 것으로 예상된다(Pfluger et al., Appl Environ. Microbiol 69:6047-6055 (2003)).
Figure pct00058
대안적으로, 6-ACA 아세틸화는 N-아세틸트랜스퍼라제의 GNAT 패밀리 내의 효소에 의해 촉진될 수 있다. 이러한 효소는 아세틸 기를 아세틸-CoA로부터 일차 아민에게 전달한다. 디아민 N-아세틸트랜스퍼라제(EC 2.3.1.57)로서도 공지되어 있는 효소 스퍼미딘 N-아세틸트랜스퍼라제(S SAT)는 다양한 소분자 기질들을 아세틸화할 수 있다. 아스카리스 수움(Ascaris suum) 및 온코서카 볼불러스(Onchocerca volvulus)로부터 정제된 효소는 HMD를 포함하는 넓은 기질 범위를 나타내지만(Davids et al., Mol. Biochem. Parasitol. 64:341-344 (1994); and Wittich and Walter, Mol. Biochem. Parasitol. 38:13-17 (1990)), 관련된 유전자는 현재까지 확인되지 않았다. 이 기능을 갖는 다른 효소는 바실러스 서브틸리스(Forouhar et al., J. Biol. Chem. 280:40328-40336 (2005)) 및 호모 사피엔스(Casero and Pegg, FASEB J 7:653-661 (1993))에서 발견된다. 밀접하게 관련된 효소는 라이신, 오르니틴, 티아라이신 등을 포함하는 다양한 기질들을 수용하는 효소인, 씨. 엘레간스(C. elegans)의 티아라이신 N-아세틸트랜스퍼라제이다(bo-Dalo et al., Biochem. J 384:129-137 (2004)). 기질 결합에 관여하는 아미노산 잔기는 레이쉬마니아 메이저(Leishmania major)로부터의 티아라이신 N-아세틸트랜스퍼라제에서 확인되었다(Luersen, K., FEBS Lett. 579:5347-5352 (2005)). 추가 후보는 메틸로마이크로븀 알칼리필룸(Methylomicrobium alcaliphilum)(Reshetnikov et al., Arch. Microbiol 184:286-297 (2006)) 및 씨. 살렉시겐스(C. salexigens)(이전에 할로모나스 엘롱가타(Halomonas elongata))(Canovas et al., Syst. Appl Microbiol 21:487-497 (1998))에서 엑토인(ectoine) 생합성에 참여하는 효소인 디아미노부티레이트 아세틸트랜스퍼라제(EC 2.3.1.178)이다.
Figure pct00059
6-ACA를 아세틸화하고(도 13, 단계 D) 6-아세트아미드헥산아민을 탈아세틸화하는(도 13, 단계 H) 추가 효소 후보는 아르기닌 생합성의 두 단계들을 촉진하는 이기능성 효소인 오르니틴 아세틸트랜스퍼라제(OAT, EC 2.3.1.35 및 EC 2.3.1.1)이다(도 14a). 아르기닌 생합성의 첫 번째 단계(도 14a, 단계 1)는 아세틸 기증자로서 아세틸-CoA를 사용하는 OAT에 의해 촉진된, 글루타메이트의 N-아세틸화이다(O'Reilly and Devine, Microbiology 140 (Pt 5):1023-1025 (1994)). OAT는 N-아세틸 기가 N-아세틸-L-오르니틴으로부터 아르기닌 생합성 경로의 첫 번째 대사물질인 L-글루타메이트에게 전달되는 아르기닌 생합성의 다섯 번째 단계(도 14a, 단계 2)도 촉진한다. 이 변환은 아세틸 기를 재순환시키고 N-아세틸글루타메이트를 재생시켜, 에너지를 보존함으로써 선형 경로를 고리형 경로로 만드는 데 기여한다. 6-아미노카프로에이트를 아세틸화하고 6-아세트아미도헥산아민을 탈아세틸화하여 HMD를 형성하는 단일 효소를 사용하는 유사한 방법이 6-아미노카프로에이트로부터의 HMD 생합성에 이용될 수 있다(도 14B). 예시적인 OAT 효소는 바실러스 서브틸리스에서 argJ에 의해 코딩되고(O'Reilly and Devine, Microbiology 140 (Pt 5):1023-1025 (1994); and Sakanyan et al., Journal of General Microbiology 138:125-130 (1992)), 에스. 세레비지에에서 ECM40에 의해 코딩된다(Abadjieva et al., J Biol. Chem. 275:11361-11367 (2000); and Liu et al., Eur. J Biochem. 228:291-296 (1995)). 효모(Maes et al., Acta Crystallogr. Sect. F. Struct. Biol. Cryst. Commun. 62:1294-1297 (2006)) 및 마이코박테륨 투버큘로시스(Sankaranarayanan et al., Acta Crystallogr. Sect. F. Struct. Biol. Cryst. Commun. 65:173-176 (2009))로부터의 효소의 결정 구조는 이용가능하다. OAT 효소는, 단일 개방 판독 프레임에 의해 코딩될지라도, 상이한 알파 및 베타 서브유닛 펩티드를 가진다(Liu et al., Eur. J Biochem. 228:291-296 (1995)).
Figure pct00060
2.3.1.d 아실트랜스퍼라제(포르메이트 C-아실트랜스퍼라제). 그들의 상응하는 CoA 유도체로의 케토산 HODH, OHED 및 2-OHD의 아실화(도 12, 단계 L, P 및 Q) 및 포르메이트의 동시발생적 방출은 EC 클래스 2.3.1 내의 포르메이트 C-아실트랜스퍼라제 효소에 의해 촉진된다. 이 클래스 내의 효소는 피루베이트 포르메이트-라이아제 및 케토산 포르메이트-라이아제를 포함한다. 이. 콜라이에서 pflB에 의해 코딩된 피루베이트 포르메이트-라이아제(PFL, EC 2.3.1.54)는 피루베이트를 아세틸-CoA 및 포르메이트로 전환시킨다. PFL의 활성 부위는 pflA에 의해 코딩된 PFL-활성화 효소(PFL-AE, EC 1.97.1.4)에 의해 혐기성 조건 하에 번역 후 활성되는 촉매활성 필수 글리실 라디칼을 함유한다(Knappe et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A 81:1332-1335 (1984); and Wong et al., Biochemistry 32:14102-14110 (1993)). pflD에 의해 코딩된, 아캐글루버스 풀기더스(Archaeglubus fulgidus)로부터의 피루베이트 포르메이트-라이아제는 클로닝되었고 이. 콜라이에서 발현되었고 특징규명되었다(Lehtio, L. and A. Goldman, Protein Eng Des Sel 17:545-552 (2004)). 에이. 풀기더스 및 이. 콜라이 효소의 결정 구조는 해석되었다(Lehtio et al., J Mol. Biol. 357:221-235 (2006)). 추가 PFL 및 PFL-AE 후보는 클로스트리듐 파스테우리아눔(Clostridium pasteurianum)(Weidner and Sawers, J. Bacteriol. 178:2440-2444 (1996)) 및 진핵 조류 클라마이도모나스 레인하르티이(Chlamydomonas reinhardtii)에서 발견된다(Cary et al., Appl. Environ. Microbiol 56:1576-1583 (1990)). 2-케토부티레이트 포르메이트-라이아제(KFL) 및 피루베이트 포르메이트-라이아제 4로서도 공지되어 있는 케토산 포르메이트-라이아제(EC 2.3.1.-)는 이. 콜라이에서 tdcE의 유전자 생성물이다. 이 효소는 혐기성 쓰레오닌 분해 동안 프로피오닐-CoA 및 포르메이트로의 2-케토부티레이트의 전환을 촉진하고, 혐기성 이화작용에서 피루베이트 포르메이트-라이아제를 대신할 수도 있다(Simanshu et al., J Biosci. 32:1195-1206 (2007)). 상기 효소는 산소 민감성을 나타내고, PflB처럼 활성 부위에서 글리실 라디칼을 활성화시키기 위해 PFL-AE에 의한 번역 후 변경을 요구한다(Hesslinger et al., Mol. Microbiol 27:477-492 (1998)).
Figure pct00061
2.6.1.a 아미노트랜스퍼라제. 도 12의 단계 E, H 및 J, 및 도 13의 단계 C 및 G는 아미노 기로의 알데하이드 또는 케톤의 전환을 요구한다. 이 변환은 아미노트랜스퍼라제(EC 2.6.1.-)에 의해 달성될 수 있다. 말단 아민으로의 알데하이드의 전환(도 12, 단계 E; 도 13, 단계 C 및 G)은 감마-아미노부티레이트 트랜스아미나제(GABA 트랜스아미나제)에 의해 촉진될 수 있다. 한 이. 콜라이 GABA 트랜스아미나제는 gabT에 의해 코딩되고 아미노 기를 글루타메이트로부터 석신산 세미알데하이드의 말단 알데하이드에게 전달한다(Bartsch et al., J. Bacteriol. 172:7035-7042 (1990)). 이 효소는 넓은 기질 범위를 나타낸다(Liu et al., Biochemistry 43:10896-10905 (2004)). puuE의 유전자 생성물은 이. 콜라이에서 다른 4-아미노부티레이트 트랜스아미나제를 코딩한다(Kurihara et al., J. Biol. Chem. 280:4602-4608 (2005)). 머스 머스큘러스, 슈도모나스 플루오레센스 및 서스 스크로파의 GABA 트랜스아미나제는 6-아미노카프로산과 반응하는 것으로 밝혀졌다(Cooper, Methods Enzymol. 113:80-82 (1985); and Scott and Jakoby, J Biol. Chem. 234:932-936 (1959)).
Figure pct00062
추가 효소 후보는 푸트레신 아미노트랜스퍼라제 또는 다른 디아민 아미노트랜스퍼라제를 포함한다. 이러한 효소는 HMD로의 6-아미노카프로에이트 세미알데하이드의 전환을 수행하기에 특히 매우 적합하다. 이. 콜라이 푸트레신 아미노트랜스퍼라제는 ygjG 유전자에 의해 코딩되고, 정제된 효소도 카다베린 및 스퍼미딘을 아미노기 전이할 수 있었다(Samsonova et al., BMC. Microbiol 3:2 (2003)). 추가로, 2-옥소글루타레이트 이외의 아미노 수용자(예를 들면, 피루베이트, 2-옥소부타노에이트)의 사용 시 1,7-디아미노헵탄에 대한 이 효소의 활성이 보고되었다(Kim, J Biol. Chem. 239:783-786 (1964); and Samsonova et al., BMC. Microbiol 3:2 (2003)). 알파-케토글루타레이트보다 피루베이트를 아미노 수용자로서 사용할 때 더 높은 활성을 갖는 푸트레신 아미노트랜스퍼라제는 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa)의 spuC 유전자이다(Lu et al., J. Bacteriol. 184:3765-3773 (2002)).
Figure pct00063
추가 후보 효소는 베타-알라닌으로부터 말론산 세미알데하이드를 생성하는 베타-알라닌/알파-케토글루타레이트 아미노트랜스퍼라제를 포함한다(WO08027742). 사카로마이세스 클루이베리(Saccharomyces kluyveri)에서 SkPYD4의 유전자 생성물은 아미노 기 기증자로서 베타-알라닌을 우선적으로 사용하는 것으로 밝혀졌다(Andersen and Hansen, Gene 124:105-109 (1993)). SkUGA1은 사카로마이세스 세레비지에 GABA 아미노트랜스퍼라제의 상동체인 UGA1(Ramos et al., Eur. J. Biochem. 149:401-404 (1985))을 코딩하는 반면, SkPYD4는 β-알라닌 및 GABA 아미노기 전이 둘 다에 관여하는 효소를 코딩한다(Andersen and Hansen, Gene 124:105-109 (1993)). 3-아미노-2-메틸프로피오네이트 트랜스아미나제는 3-아미노-2-메틸프로피오네이트로의 메틸말로네이트 세미알데하이드의 변환을 촉진한다. 효소는 라터스 노르베기커스 및 서스 스크로파에서 특징규명되었고, Abat 1968에 의해 코딩된다(Kakimoto et al., Biochim. Biophys. Acta 156:374-380 (1968); and Tamaki et al., Methods Enzymol. 324:376-389 (2000)).
Figure pct00064
도 12의 단계 J 및 H는 아미노산을 옥소산으로 변환시키는 아미노트랜스퍼라제에 의해 촉진된다. 단계 J에서, OHED는 OHED 아미노트랜스퍼라제에 의해 아미노기 전이되어 2-AHE를 형성한다. 2-OHD 아미노트랜스퍼라제에 의한 2-AHD로의 2-OHD의 아미노기 전이(단계 H)는 유사한 반응이다. 이들 반응들을 촉진하는 예시적인 효소 후보는 옥소 기를 옥살로아세테이트로부터 글루타메이트에게 천연적으로 전달하여 알파-케토글루타레이트 및 아스파르테이트를 형성하는 효소인 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제이다. 아스파르테이트는 OHED 및 2-AHD와 구조 면에서 유사하다. 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 활성은 예를 들면, 에스케리키아 콜라이로부터의 aspC의 유전자 생성물(Yagi et al., FEBS Lett. 100:81-84, (1979); and Yagi et al., Methods Enzymol. 113:83-89 (1985)), 사카로마이세스 세레비지에로부터의 AAT2의 유전자 생성물(Yagi et al., J. Biochem. 92:35-43 (1982)) 및 아라비돕시스 탈리아나로부터의 ASP5의 유전자 생성물(de la Torre et al., Plant J 46:414-425 (2006); Kwok and Hanson, J Exp. Bot. 55:595-604 (2004); and Wilkie and Warren, Protein Expr. Purif. 12:381-389 (1998))에 의해 촉진된다. 라터스 노르베기커스로부터의 효소는 대안적 기질, 예컨대, 2-아미노헥산디오산 및 2,4-디아미노부티르산을 아미노기 전이하는 것으로 확인되었다(Recasens et al., Biochemistry 19:4583-4589 (1980)). 다른 아미노산 기질에 작용하는 아미노트랜스퍼라제는 이 변환을 촉진할 수 있다. 발린 아미노트랜스퍼라제는 2-케토이소발레레이트 및 알라닌으로의 발린 및 피루베이트로의 전환을 촉진한다. 이. 콜라이 유전자인 avtA는 이러한 효소들 중 하나를 코딩한다(Whalen and Berg, C. J. Bacteriol. 150:739-746 (1982)). 이 반응에서 아민 기증자가 확인되지 않았을지라도, 이 유전자 생성물도 α-케토부티레이트의 아미노기 전이를 촉진하여 α-아미노부티레이트를 생성한다(Whalen and Berg, J. Bacteriol. 158:571-574 (1984)). 이. 콜라이 serC의 유전자 생성물은 두 반응들, 포스포세린 아미노트랜스퍼라제 및 포스포하이드록시쓰레오닌 아미노트랜스퍼라제를 촉진하고(Lam and Winkler, J. Bacteriol. 172:6518-6528 (1990)), 비-인산화된 기질에 대한 활성은 검출될 수 없었다(Drewke et al., FEBS. Lett. 390:179-182 (1996)).
Figure pct00065
2.7.2.a 포스포트랜스퍼라제(카복시 수용자). EC 클래스 2.7.2의 포스포트랜스퍼라제 효소는 1개의 ATP의 가수분해를 동반하면서 카복실산을 포스폰산으로 변환시킨다. 도 13의 단계 A 및 E는 6-ACA(단계 A) 및 6-아세트아미도헥사노에이트(단계 E)의 카복실 기를 그들의 상응하는 포스폰산으로 활성화시키기 위해 포스포트랜스퍼라제를 요구한다. 부티레이트 키나제는 씨. 아세토부틸리쿰에서 산생성 동안 부티레이트로의 부티릴-포스페이트의 가역적 전환을 수행한다(Cary et al., Appl. Environ. Microbiol 56:1576-1583 (1990)). 이 효소는 2종의 buk 유전자 생성들 중 어느 하나에 의해 코딩된다(Huang et al., J. Mol. Microbiol Biotechnol 2:33-38 (2000)). 써모토가 마리티마로부터의 관련 효소 이소부티레이트 키나제도 이. 콜라이에서 발현되었고 결정화되었다(Diao et al., Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 59:1100-1102 (2003); and Diao and Hasson, J. Bacteriol. 191:2521-2529 (2009)). 아스파르토키나제(Aspartokinase)는 아스파르테이트의 ATP 의존성 인산화를 촉진하고 여러 아미노산들의 합성에 참여한다. lysC에 의해 코딩된, 이. 콜라이의 아스파르토키나제 III 효소는 넓은 기질 범위를 갖고, 기질 특이성에 관여하는 촉매 잔기는 밝혀졌다(Keng and Viola, Arch. Biochem. Biophys. 335:73-81 (1996)). 이. 콜라이의 두 추가 키나제들도 우수한 후보들이다: 아세테이트 키나제 및 감마-글루타밀 키나제. ackA에 의해 코딩된 이. 콜라이 아세테이트 키나제(Skarstedt and Silverstein, J. Biol. Chem. 251:6775-6783 (1976))는 아세테이트 이외에 프로피오네이트를 인산화시킨다(Hesslinger et al., Mol. Microbiol 27:477-492 (1998)). proB에 의해 코딩된 이. 콜라이 감마-글루타밀 키나제(Smith et al., J. Bacteriol. 157:545-551 (1984))는 글루타메이트의 감마 탄산 기를 인산화시킨다.
Figure pct00066
아세틸글루타메이트 키나제는 아르기닌 생합성 동안 아세틸화된 글루타메이트를 인산화시키고, 6-아세트아미도헥사노에이트를 인산화시키는 우수한 후보이다(도 13, 단계 E). 이 효소는 대안적 기질을 수용하지 않는 것으로 공지되어 있으나, 기질 결합 및 인산화에 관여하는 이. 콜라이 효소의 여러 잔기들은 부위-유도된 돌연변이유발에 의해 밝혀졌다(Marco-Martin et al., J Mol. Biol. 334:459-476 (2003); and Ramon-Maiques et al., Structure. 10:329-342 (2002)). 효소는 바실러스 서브틸리스 및 이. 콜라이에서 argB에 의해 코딩되고(Parsot et al., Gene 68:275-283 (1988)), 에스. 세레비지에에서 ARG5,6에 의해 코딩된다(Pauwels et al., Eur. J Biochem. 270:1014-1024 (2003)). 에스. 세레비지에의 ARG5,6 유전자는 아세틸글루타메이트 키나제 및 아세틸글루타밀포스페이트 리덕타제(6-AAHOP의 환원을 위한 효소 후보)가 되도록 미토콘드리아 매트릭스에서 성숙되는 폴리단백질 전구체를 코딩한다(도 13, 단계 F).
Figure pct00067
2.8.3.a 보조효소-A 트랜스퍼라제. 보조효소-A(CoA) 트랜스퍼라제는 한 분자로부터 또 다른 분자로의 CoA 모이어티의 가역적 전달을 촉진한다. 도 13의 단계 M에서, 3-아미노카프로일-CoA는 아세틸-CoA, 석시닐-CoA 또는 또 다른 CoA 기증자로부터의 CoA 기의 전달에 의해 형성된다. 유사한 변환은 도 13의 단계 I에 표시된 6-아세트아미도헥사노에이트 CoA-트랜스퍼라제에 의해 촉진된다. 예시적인 CoA 트랜스퍼라제 후보는 각각 석시닐-CoA, 4-하이드록시부티릴-CoA 및 부티릴-CoA 트랜스퍼라제 활성을 나타내는 것으로 확인된, 클로스트리듐 클루이베리의 cat1, cat2 및 cat3의 유전자 생성물들에 의해 촉진된다(Seedorf et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A 105:2128-2133 (2008); and Sohling and Gottschalk, J. Bacteriol. 178:871-880 (1996)). 유사한 CoA 트랜스퍼라제 활성이 트리코모나스 바기날리스(Trichomonas vaginalis)(van Grinsven et al., J. Biol. Chem. 283:1411-1418 (2008)) 및 트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei)(Riviere et al., J. Biol. Chem. 279:45337-45346 (2004))에도 존재한다.
Figure pct00068
아세틸-CoA를 CoA 기증자로서 사용할 수 있는 CoA 트랜스퍼라제는 이. 콜라이 atoA(알파 서브유닛) 및 atoD(베타 서브유닛) 유전자에 의해 코딩된 아세토아세틸-CoA 트랜스퍼라제이다(Korolev et al., Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 58:2116-2121 (2002); and Vanderwinkel et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 33:902-908 (1968)). 이 효소는 넓은 기질 범위를 갖고(Sramek and Frerman, Arch. Biochem. Biophys. 171:14-26 (1975)), 이소부티레이트(Matthies and Schink, Appl Environ. Microbiol 58:1435-1439 (1992)), 발레레이트(Vanderwinkel et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 33:902-908 (1968)) 및 부타노에이트(Vanderwinkel et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 33:902-908 (1968))를 포함하는 다양한 분지된 아실-CoA 기질들 및 선형 아실-CoA 기질들로부터 CoA 모이어티를 아세테이트에게 전달하는 것으로 확인되었다. 이 효소는 아세토아세테이트에 의해 전사 수준에서 유도되므로, 이 효소를 경로 내로 조작하기 위해 조절 제어의 변경이 필요할 수 있다(Pauli and Overath, Eur. J Biochem. 29:553-562 (1972)). 유사한 효소가 코리네박테륨 글루타미쿰 ATCC 13032(Duncan et al., Appl. Environ. Microbiol 68:5186-5190 (2002)), 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Cary et al., Appl. Environ. Microbiol 56:1576-1583 (1990); and Wiesenborn et al., Appl. Environ. Microbiol 55:323-329 (1989)), 및 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰(Kosaka et al., Biosci. Biotechnol Biochem. 71:58-68 (2007))에 존재한다.
Figure pct00069
혐기성 박테리아 악시다미노코커스 퍼멘탄스(Acidaminococcus fermentans)로부터의 글루타코닐-CoA-트랜스퍼라제(EC 2.8.3.12) 효소는 글루타코닐-CoA 및 3-부테노일-CoA와 반응한다(Mack et al., Eur. J. Biochem. 226:41-51 (1994)). 이 효소를 코딩하는 유전자는 gctA 및 gctB이다. 이 효소는 글루타릴-CoA, 2-하이드록시글루타릴-CoA, 아디필-CoA 및 아크릴릴-CoA를 포함하는 다른 CoA 유도체의 사용 시 감소되었으나 검출가능한 활성을 가진다(Buckel et al., Eur. J Biochem. 118:315-321 (1981)). 상기 효소는 이. 콜라이에서 클로닝되었고 발현되었다(Mack et al., Eur. J. Biochem. 226:41-51 (1994)).
Figure pct00070
또 다른 CoA 트랜스퍼라제는 슈도모나스 푸티다에서 pcaI 및 pcaJ에 의해 코딩된 2-유닛 석시닐-CoA:3:옥소산-CoA 트랜스퍼라제이다(Kaschabek et al., J. Bacteriol. 184:207-215 (2002)). 상동성에 기초할 때, 유사한 효소는 악시네토박터 종 ADP1에 존재한다(Kowalchuk et al., Gene 146:23-30 (1994)). 추가 예시적인 석시닐-CoA:3:옥소산-CoA 트랜스퍼라제는 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)(Corthesy-Theulaz et al., J. Biol. Chem. 272:25659-25667 (1997)) 및 바실러스 서브틸리스(Stols et al., Protein Expr. Purif. 53:396-403 (2007))에 존재한다.
Figure pct00071
3.5.1.a 하이드롤라제(선형 아미드에 작용함). 선형 아세트아미드의 탈아세틸화는 3.5.1 효소 패밀리 내의 아미도하이드롤라제에 의해 촉진된다. 이러한 효소는 HMD로의 6-아세트아미도헥산아민의 탈아세틸화를 위해 요구된다(도 13, 단계 H). 유사한 변환을 촉진하는 효소는 4-아세트아미도부티레이트를 천연적으로 탈아세틸화하는 4-아세트아미도부티레이트 데아세틸라제(EC 3.5.1.63)이다. 칸디다 보이디니이(Candida boidinii)에서의 푸트레신 분해에서 그의 역할에 대해 연구된 효소(Gillyon et al., Journal of General Microbiology 133:2477-2485 (1987))는 6-아세트아미도헥사노에이트를 포함하는 다양한 기질들을 탈아세틸화하는 것으로 밝혀졌다(Haywood and Large, Journal of General Microbiology 132:7-14 (1986)). 6-아세트아미도헥사노에이트가 원하는 기질과 구조 면에서 유사할지라도, 이 화합물의 탈아세틸화(도 13, 단계 D, 역방향 반응)는 HMD의 효율적인 생성을 방해할 수 있다. 단백질 조작 또는 유도 진화는 6-아세트아미도헥산아민에 대한 특이성을 개선하기 위해 요구될 수 있다. 이 활성과 관련된 유전자는 현재까지 확인되지 않았다.
2. 아세틸폴리아민 아미도하이드롤라제(EC 3.5.1.62)는 디아민 푸트레신 및 카다베린을 그들의 아세틸화된 전구체들로부터 형성하는 또 다른 후보 효소이다. 마이코플라나 라모사(Mycoplana ramosa)로부터의 아세틸폴리아민 데아세틸라제(AphA)가 이. 콜라이에서 클로닝되었고 특징규명되었고(Sakurada et al., J. Bacteriol. 178:5781-5786 (1996)), 결정 구조가 이용가능하다(Fujishiro et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 157:1169-1174 (1988)). 이 효소도 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus)에서 연구되었으나, 관련된 유전자는 현재까지 확인되지 않았다(Suzuki et al., Biochim. Biophys. Acta 882:140-142 (1986)). AphA와 높은 서열 유사성을 가진, 히스톤 데아세틸라제 수퍼패밀리 내의 단백질은 엠. 루테우스 게놈에서 확인되었다(evalue=1e-18, 37% 동일성). 이. 콜라이로부터의 N-아세틸-L-오르니틴 데아세틸라제는 또 다른 후보 아미도하이드롤라제(EC 3.5.1.16)이다. argE 유전자에 의해 코딩된 이. 콜라이 효소(McGregor et al., J Am. Chem. Soc. 127:14100-14107 (2005); and Meinnel et al., J. Bacteriol. 174:2323-2331 (1992))는 오르니틴, 라이신, 글루타민 및 다른 아미노산을 포함하는 다양한 기질들로부터 N-아세틸 기를 제거한다(Javid-Majd and Blanchard, Biochemistry 39:1285-1293 (2000)).
Figure pct00072
4.1.1.a 카복시-라이아제. 도 12의 단계 D 및 F는 OHED(단계 F) 및 2-OHD(단계 D)로부터 6-OHE 및 아디페이트 세미알데하이드를 생성하는 2-케토산 데카복실라제 효소에 의해 촉진된다. 추가로, 알파-케토글루타레이트는 케토산 데카복실라제인 알파-케토글루타레이트 데카복실라제에 의해 탈카복실화되어 경로 전구체 석신산 세미알데하이드를 형성한다. 케토산의 탈카복실화는 피루베이트 데카복실라제(EC 4.1.1.1), 벤조일포르메이트 데카복실라제(EC 4.1.1.7), 알파-케토글루타레이트 데카복실라제 및 분지쇄 알파-케토산 데카복실라제를 포함하는, 다양한 기질 특이성을 갖는 다양한 효소들에 의해 촉진된다. 케토산 데카복실라제로서도 지칭되는 피루베이트 데카복실라제(PDC)는 아세트알데하이드로의 피루베이트의 탈카복실화를 촉진하는, 알코올성 발효에서의 핵심 효소이다. 사카로마이세스 세레비지에로부터의 효소는 2-케토부티레이트, 2-케토발레레이트, 3-하이드록시피루베이트 및 2-페닐피루베이트를 포함하는 지방족 2-케토산에 대한 넓은 기질 범위를 가진다(22). 이 효소는 이. 콜라이에서 광범위하게 연구되었고 변경된 활성에 대해 조작되었고 기능적으로 발현되었다(Killenberg-Jabs et al., Eur. J. Biochem. 268:1698-1704 (2001); Li, H. and F. Jordan, Biochemistry. 38:10004-10012 (1999); and ter Schure et al., Appl. Environ. Microbiol. 64:1303-1307 (1998)). pdc에 의해 코딩된, 자이모모나스 모빌러스(Zymomonas mobilus)로부터의 PDC도 넓은 기질 범위를 갖고, 상이한 기질에 대한 친화성을 변경시키기 위한 유도 조작 연구의 대상이었다(Siegert et al., Protein Eng Des Sel 18:345-357 (2005)). 이 효소의 결정 구조는 이용가능하다(Killenberg-Jabs et al., Eur. J. Biochem. 268:1698-1704 (2001)). 다른 잘 특징규명된 PDC 후보는 아세토박터 파스테우리안스(Acetobacter pasteurians)(Chandra et al., Arch. Microbiol. 176:443-451 (2001)) 및 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)(Krieger et al., Eur. J. Biochem. 269:3256-3263 (2002))로부터의 효소를 포함한다.
Figure pct00073
PDC처럼, 벤조일포르메이트 데카복실라제(EC 4.1.1.7)는 넓은 기질 범위를 갖고 효소 조작 연구의 표적이었다. 슈도모나스 푸티다로부터의 효소는 광범위하게 연구되었고, 이 효소의 결정 구조는 이용가능하다(Hasson et al., Biochemistry 37:9918-9930 (1998); and Polovnikova et al., Biochemistry 42:1820-1830 (2003)). 슈도모나스 푸티다 효소의 활성 부위에 있는 두 잔기들의 부위-유도된 돌연변이유발은 천연 생성 기질 및 비-천연 생성 기질의 친화성(Km)을 변경시켰다(Siegert et al., Protein Eng Des Sel 18:345-357 (2005)). 이 효소의 성질은 유도 조작에 의해 더 변경되었다(Lingen et al., Protein Eng 15:585-593 (2002); and Lingen et al., Chembiochem. 4:721-726 (2003)). mdlC에 의해 코딩된, 슈도모나스 애루기노사로부터의 효소도 실험적으로 특징규명되었다(Barrowman et al., FEMS Microbiology Letters 34:57-60 (1986)). 슈도모나스 스튜트제리(Pseudomonas stutzeri), 슈도모나스 플루오레센스 및 다른 유기체로부터의 추가 유전자 후보는 서열 상동성에 의해 유추될 수 있거나 슈도모나스 푸티다에서 개발된 생장 선택 시스템의 이용을 통해 확인될 수 있다(Henning et al., Appl. Environ. Microbiol. 72:7510-7517 (2006)).
Figure pct00074
2-옥소산을 탈카복실화할 수 있는 세 번째 효소는 알파-케토글루타레이트 데카복실라제(KGD)이다. 이 클래스의 효소들의 기질 범위는 현재까지 연구되지 않았다. 마이코박테륨 투버큘로시스로부터의 KDC(Tian et al., Proc Natl Acad Sci US.A 102:10670-10675 (2005))는 게노마티카(Genomatica)에서 다른 내부 프로젝트에서 클로닝되었고 기능적으로 발현되었다. 그러나, 이것은 크고(약 130 kD) 풍부한 GC를 갖기 때문에 균주 조작을 위한 이상적인 후보가 아니다. KDC 효소 활성은 브라디리조븀 자포니쿰(Bradyrhizobium japonicum) 및 메소리조븀 로티(Mesorhizobium loti)를 포함하는 여러 리조비아 종들에서 검출되었다(Green et al., J. Bacteriol. 182:2838-2844 (2000)). KDC 코딩 유전자(들)가 이들 유기체들에서 단리되지 않았지만, 게놈 서열이 이용가능하고 각각의 게놈에서 여러 유전자들이 잠정적인 KDC로서 해석된다. 유글레나 그라실리스(Euglena gracilis)로부터의 KDC도 특징규명되었으나, 이 활성과 관련된 유전자는 현재까지 확인되지 않았다(Shigeoka and Nakano, Arch. Biochem. Biophys. 288:22-28 (1991)). N-말단부터 시작되는 처음 20개의 아미노산들은 MTYKAPVKDVKFLLDKVFKV(서열번호 1)로서 서열결정되었다(Shigeoka and Nakano, Arch. Biochem. Biophys. 288:22-28 (1991)). 유전자는 이 N-말단 서열을 함유하는 후보 유전자를 KDC 활성에 대해 시험함으로써 확인될 수 있다.
Figure pct00075
이 단계를 촉진하는 네 번째 후보 효소는 분지쇄 알파-케토산 데카복실라제(BCKA)이다. 이 클래스의 효소는 쇄 길이에서 3개 내지 6개의 탄소들을 갖는 다양한 화합물들에 작용하는 것으로 확인되었다(Oku and Kaneda, J Biol Chem. 263:18386-18396 (1988); and Smit et al., Appl Environ Microbiol. 71:303-311 (2005)). 락토코커스 락티스에서 상기 효소는 2-옥소부타노에이트, 2-옥소헥사노에이트, 2-옥소펜타노에이트, 3-메틸-2-옥소부타노에이트, 4-메틸-2-옥소부타노에이트 및 이소카프로에이트를 포함하는 다양한 분지된 기질들 및 선형 기질들에 대해 특징규명되었다(Smit et al., Appl Environ Microbiol. 71:303-311 (2005)). 상기 효소는 구조적으로 특징규명되었다(Berg et al., Science. 318:1782-1786 (2007)). 락토코커스 락티스 효소와 자이모모나스 모빌러스의 피루베이트 데카복실라제 사이의 서열 정렬은 촉매활성 잔기와 기질 인식 잔기가 거의 동일하다는 것을 시사하므로(Siegert et al., Protein Eng Des Sel 18:345-357 (2005)), 이 효소는 유도 조작을 위한 기대되는 후보일 것이다. BCKA에 의한 알파-케토글루타레이트의 탈카복실화는 바실러스 서브틸리스에서 검출되었으나; 이 활성은 다른 분지쇄 기질에 대한 활성에 비해 낮고(5%)(Oku and Kaneda, J Biol Chem. 263:18386-18396 (1988)), 이 효소를 코딩하는 유전자는 현재까지 확인되지 않았다. 추가 BCKA 유전자 후보는 락토코커스 락티스 단백질 서열과의 상동성에 의해 확인될 수 있다. 이 효소에 대한 고-점수화 BLASTp 히트들 중 대다수는 인돌피루베이트 데카복실라제(EC 4.1.1.74)로서 해석된다. 인돌피루베이트 데카복실라제(IPDA)는 식물 및 식물 박테리아에서 인돌아세트알데하이드로의 인돌피루베이트의 탈카복실화를 촉진하는 효소이다.
Figure pct00076
호모 사피엔스 및 보스 타우러스로부터의 미토콘드리아 분지쇄 케토산 데하이드로게나제 복합체의 E1 서브유닛으로부터 유도된 재조합 분지쇄 알파-케토산 데카복실라제 효소는 이. 콜라이에서 클로닝되었고 기능적으로 발현되었다(Davie et al., J. Biol. Chem. 267:16601-16606 (1992); Wynn et al., J. Biol. Chem. 267:1881-1887 (1992); and Wynn et al., J. Biol. Chem. 267:12400-12403 (1992)). 이들 연구에서, 저자는 샤페로닌 GroEL 및 GroES의 공-발현은 데카복실라제의 특이적 활성을 500배까지 향상시켰다(Wynn et al., J. Biol. Chem. 267:12400-12403 (1992)). 이들 효소는 2개의 알파 서브유닛들 및 2개의 베타 서브유닛들로 구성된다.
Figure pct00077
6-아미노카프로에이트로의 2-AHD의 탈카복실화(도 12, 단계 I)는 아미노산 데카복실라제, 예컨대, 아스파르테이트 데카복실라제에 의해 촉진된다. 아스파르테이트 데카복실라제는 판토테네이트 생합성에 참여하고 에스케리키아 콜라이에서 유전자 panD에 의해 코딩된다(Dusch et al., Appl. Environ. Microbiol 65:1530-1539 (1999); Merke and Nichols, FEMS Microbiol Lett. 143:247-252 (1996); Ramjee et al., Biochem. J 323 (Pt 3):661-669 (1997); and Schmitzberger et al., EMBO J 22:6193-6204 (2003)). 마이코박테륨 투버큘로시스(Chopra et al., Protein Expr. Purif. 25:533-540 (2002)) 및 코리네박테륨 글루타미쿰(Dusch et al., Appl. Environ. Microbiol 65:1530-1539 (1999))으로부터의 유사한 효소가 이. 콜라이에서 발현되었고 특징규명되었다.
Figure pct00078
4.1.2.a 알데하이드-라이아제. HHED 알돌라제로서도 공지되어 있는 HOHD 알돌라제는 피루베이트 및 석신산 세미알데하이드로의 4-하이드록시-2-옥소-헵탄-1,7-디오에이트(HOHD)의 전환을 촉진한다(도 12, 단계 A). 상기 효소는 이. 콜라이 C, 이. 콜라이 W 및 다른 유기체에서 4-하이드록시페닐아세트산 분해의 최종 단계를 촉진하는 2가 금속 이온 의존성 클래스 II 알돌라제이다. 천연 환경에서, 상기 효소는 분해 방향으로 작용한다. 역방향 (축합) 반응은 열역학적으로 불리하지만; 평형은 HOHD 알돌라제와, 반응 생성물에 효율적으로 작용하는 다운스트림 경로 효소의 커플링을 통해 변동될 수 있다. 이러한 전략은 다른 알돌라제의 평형을 축합 방향으로 변동시키는 데 효과적이었다(Nagata et al., Appl Microbiol Biotechnol 44:432-438 (1995); and Pollard et al., Appl Environ. Microbiol 64:4093-4094 (1998)). hpcH에 의해 코딩된 이. 콜라이 C 효소는 광범위하게 연구되었고 최근에 결정화되었다(Rea et al., J Mol. Biol. 373:866-876 (2007); and Stringfellow et al., Gene 166:73-76 (1995)). 이. 콜라이 W 효소는 hpaI에 의해 코딩된다(Prieto et al., J. Bacteriol. 178:111-120 (1996)).
Figure pct00079
4.2.1.a 하이드로-라이아제. 효소 OHED 하이드라타제는 4-하이드록시페닐아세트산 분해에 참여하고, 여기서 이것은 마그네슘을 보조인자로서 사용하여 2-옥소-헵트-4-엔-1,7-디오에이트(OHED)를 2-옥소-4-하이드록시-헵타-1,7-디오에이트(HODH)로 전환시킨다(Burks et al., J. Am. Chem. Soc. 120 (1998))(도 12, 단계 B). OHED 하이드라타제 효소 후보는 이. 콜라이 C(Izumi et al., J Mol. Biol. 370:899-911 (2007); and Roper et al., Gene 156:47-51 (1995)) 및 이. 콜라이 W(Prieto et al., J. Bacteriol. 178:111-120 (1996))에서 확인되었고 특징규명되었다. 서열 비교는 다양한 박테리아들, 식물들 및 동물들에서 상동체를 보여준다. 매우 유사한 서열을 갖는 효소들은 특히 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumonia)(91% 동일성, evalue=2e-138) 및 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica)(91% 동일성, evalue=4e-138)에 함유되어 있다.
Figure pct00080
2,3-데하이드로아디필-CoA로의 3-하이드록시아디필-CoA의 탈수(도 12, 단계 M)는 에노일-CoA 하이드라타제 활성을 갖는 효소에 의해 촉진된다. 크로토나제(crotonase)로서도 지칭되는 3-하이드록시부티릴-CoA 데하이드라타제(EC 4.2.1.55)는 3-하이드록시이소부티릴-CoA를 탈수시켜 크로토노일-CoA를 형성한다(도 14, 단계 2). 크로토나제 효소는 일부 유기체들, 특히 클로스트리아 종에서 n-부탄올 형성을 위해 요구되고, 설폴로버스, 악시디아너스 및 메탈로스패라 속의 호열호산성 고세균에서 3-하이드록시프로피오네이트/4-하이드록시부티레이트 주기의 한 단계도 구성한다. 크로토나제 효소를 코딩하는 예시적인 유전자는 씨. 아세토부틸리쿰(Atsumi et al., Metab Eng 10:305-311 (2008); and Boynton et al., J. Bacteriol. 178:3015-3024 (1996)), 씨. 클루이베리(Hillmer and Gottschalk, FEBS Lett. 21:351-354 (1972)) 및 매탈로스패라 세둘라(Metallosphaera sedula)(Berg et al., Science. 318:1782-1786 (2007))에서 발견될 수 있지만, 후자 유전자의 서열은 공지되어 있지 않다.
Figure pct00081
에노일-CoA 하이드라타제(EC 4.2.1.17)도 3-하이드록시아실-CoA 기질의 탈수를 촉진한다(Agnihotri and Liu., J. Bacteriol. 188:8551-8559 (2003); Conrad et al., J. Bacteriol. 118:103-111 (1974); and Roberts et al., Arch. Microbiol 117:99-108 (1978)). ech에 의해 코딩된, 슈도모나스 푸티다의 에노일-CoA 하이드라타제는 크로토노일-CoA로의 3-하이드록시부티릴-CoA의 전환을 촉진한다(Roberts et al., Arch. Microbiol 117:99-108 (1978)). 추가 에노일-CoA 하이드라타제 후보는 피. 푸티다의 phaA 및 phaB, 및 피. 플루오레센스의 paaA 및 paaB이다(Olivera et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A 95:6419-6424 (1998)). 로돕슈도모나스 팔루스트리스에서 pimF의 유전자 생성물은 피멜로일-CoA 분해에 참여하는 에노일-CoA 하이드라타제를 코딩할 것으로 예상된다(Harrison and Harwood, Microbiology 151:727-736 (2005)). 마지막으로, maoC(Park and Lee, J. Bacteriol. 185:5391-5397 (2003)), paaF(Ismail et al., J. Biochem. 270:3047-3054 (2003); Park and Lee, Appl. Biochem. Biotechnol 113-116:335-346 (2004); and Park and Yup, Biotechnol Bioeng 86:681-686 (2004)) 및 paaG(Ismail et al., J. Biochem. 270:3047-3054 (2003); Park and Lee, Appl. Biochem. Biotechnol 113-116:335-346 (2004); and Park and Yup, Biotechnol Bioeng 86:681-686 (2004))를 포함하는 다수의 에스케리키아 콜라이 유전자들이 에노일-CoA 하이드라타제 기능을 나타내는 것으로 확인되었다.
Figure pct00082
대안적으로, fadA 및 fadB의 이. 콜라이 유전자 생성물은 에노일-CoA 하이드라타제 활성을 나타내는, 지방산 산화에 관여하는 다중효소 복합체를 코딩한다(Nakahigashi and Inokuchi, Nucleic Acids Res. 18:4937 (1990); Yang, J. Bacteriol. 173:7405-7406 (1991); and Yang et al., Biochemistry 30:6788-6795 (1991)). fadR에 의해 코딩된 음성 조절제의 넉아웃을 이용하여 fadB 유전자 생성물을 활성화시킬 수 있다(Sato et al., J Biosci. Bioeng 103:38-44 (2007)). fadI 및 fadJ 유전자는 유사한 기능을 코딩하고 혐기성 조건 하에 천연적으로 발현된다(Campbell et al., Mol. Microbiol 47:793-805 (2003)).
Figure pct00083
6.2.1.a 산-티올 리가제(CoA 신세타제로서도 지칭됨). 도 13의 단계 I 및 M은 6-ACA 및 6-아세트아미도헥사노에이트를 그들의 상응하는 CoA 유도체로 변환시키기 위해 산-티올 리가제 또는 CoA 신세타제 기능을 요구한다(용어 리가제, 신세타제 및 신타제는 본원에서 상호교환적으로 사용되고 동일한 효소 클래스를 지칭한다). 이들 정확한 변형을 촉진하는 효소는 현재까지 특징규명되어 있지 않으나; 넓은 기질 특이성을 갖는 여러 효소들이 문헌에 기재되어 있다. ADP 형성 아세틸-CoA 신세타제(ACD, EC 6.2.1.13)는 상응하는 산으로의 아실-CoA 에스테르의 전환을 ATP의 동반된 합성과 커플링시키는 효소이다. AF1211에 의해 코딩된, 아캐오글로버스 풀기더스로부터의 ACD I은 이소부티레이트, 이소펜타노에이트 및 푸마레이트를 포함하는 다양한 직쇄 기질들 및 분지쇄 기질들에 작동하는 것으로 밝혀졌다(Musfeldt and Schonheit, J. Bacteriol. 184:636-644 (2002)). AF1983에 의해 코딩된, 아캐오글로버스 풀기더스의 제2 가역적 ACD도 고리형 화합물 페닐아세테이트 및 인돌아세테이트에 대한 높은 활성과 함께 넓은 기질 범위를 갖는 것으로 확인되었다(Musfeldt and Schonheit, J. Bacteriol. 184:636-644 (2002)). 할로아큘라 마리스모르투이(Haloarcula marismortui)로부터의 효소(석시닐-CoA 신세타제로서 해석됨)는 기질로서 프로피오네이트, 부티레이트 및 분지쇄 산(이소발레레이트 및 이소부티레이트)을 수용하고, 정방향 및 역방향으로 작동하는 것으로 밝혀졌다(Brasen and Schonheit, Arch. Microbiol 182:277-287 (2004)). 고호열성 크랜고세균 파이로바큘룸 애로필룸(Pyrobaculum aerophilum)으로부터의 PAE3250에 의해 코딩된 ACD는 아세틸-CoA, 이소부티릴-CoA(바람직한 기질) 및 페닐아세틸-CoA와 반응함으로써, 모든 특징규명된 ACD들 중 가장 넓은 기질 범위를 보였다(Brasen and Schonheit, Arch. Microbiol 182:277-287 (2004)). 유도 진화 또는 조작을 이용하여, 숙주 유기체의 생리학적 온도에서 작동하도록 이 효소를 변경시킬 수 있다. 에이. 풀기더스(A. fulgidus), 에이치. 마리스모르투이(H. marismortui) 및 피. 애로필룸(P. aerophilum)으로부터의 상기 효소는 모두 이. 콜라이에서 클로닝되었고 기능적으로 발현되었고 특징규명되었다(Brasen and Schonheit, Arch. Microbiol 182:277-287 (2004); and Musfeldt and Schonheit, J. Bacteriol. 184:636-644 (2002)). 추가 후보는 1개의 ATP의 소모를 동반하면서 석시네이트로부터의 석시닐-CoA의 형성을 천연적으로 촉진하는, 이. 콜라이의 sucCD에 의해 코딩된 효소이고, 이 반응은 생체내에서 가역적이다(Buck et al., Biochemistry 24:6245-6252 (1985)).
Figure pct00084
이 단계를 위한 또 다른 후보 효소는 그람 양성 박테리아에서 바이오틴 생합성 동안 피멜레이트를 피멜로일-CoA로 천연적으로 활성화시키는, 피멜로일-CoA 리가제(EC 6.2.1.14)로서도 공지되어 있는 6-카복시헥사노에이트-CoA 리가제이다. 이. 콜라이 내로 클로닝된, 슈도모나스 멘도시나(Pseudomonas mendocina)로부터의 효소는 대안적 기질 헥산디오에이트 및 노난디오에이트를 수용하는 것으로 입증되었다(Binieda et al., Biochem. J 340 (Pt 3):793-801 (1999)). 다른 후보는 바실러스 서브틸리스(Bower et al., J. Bacteriol. 178:4122-4130 (1996)) 및 라이시니바실러스 스패리커스(Lysinibacillus sphaericus)(이전에 바실러스 스패리커스(Bacillus sphaericus))(Ploux et al., Biochem. J 287 (Pt 3):685-690 (1992))에서 발견된다.
Figure pct00085
추가 CoA-리가제는 아직 특징규명되지 않은 서열을 갖는 래트 디카복실레이트-CoA 리가제(Vamecq et al., Biochem. J 230:683-693 (1985)), 피. 크리소게눔(P. chrysogenum)으로부터의 2종의 특징규명된 페닐아세테이트-CoA 리가제들 중 어느 하나(Lamas-Maceiras et al., Biochem. J 395:147-155 (2006); and Wang et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 360:453-458 (2007)), 및 슈도모나스 푸티다로부터의 페닐아세테이트-CoA 리가제(Martinez-Blanco et al., J. Biol. Chem. 265:7084-7090 (1990))를 포함한다. 추가 후보 효소는 아세토아세틸-CoA로의 아세토아세테이트의 ATP 의존성 전환을 천연적으로 촉진하는, 머스 머스큘러스(Hasegawa et al., Biochim. Biophys. Acta 1779:414-419 (2008)) 및 호모 사피엔스(Ohgami et al., Biochem. Pharmacol. 65:989-994 (2003))로부터의 아세토아세틸-CoA 신세타제이다.
Figure pct00086
본 발명은 첨부된 도면을 참고하면서 하기 비한정적 실시예를 기초로 더 상세히 기재될 것이다.
실시예
실시예 1
본 실험은 변화하는 조건 하에 HMD/CO2 pH 평형을 예증한다. 본 실시예에서, 10%w/w 수성 HMD 용액을 제조하였다(시그마 알드리치(Sigma Aldrich)로부터 구입된 70% HMD). HMD 용액을 30℃까지 가열하고 초기 pH를 기록하였다. 그 다음, pH를 모니터링하면서 CO2(대략 95% 순수)를 60분 동안 상기 용액 내로 버블링하였다. CO2 살포를 중단하였다. pH를 모니터링하면서 공기를 30분 동안 상기 용액 내로 살포하였다. 공기 살포를 유지하였고 상기 용액을 40분 동안 80℃까지 가열하였다. 3 ㎖를 팔콘 튜브에 샘플링하고 30℃까지 냉각시킴으로써 pH를 측정하였다. 용액을 20분 동안 88℃까지 가열하였다. 상기 용액을 30℃까지 냉각시켰고 최종 pH를 기록하였다. 측정된 pH 값을 하기 그래프 1-1, 1-2 및 1-3에 작도하였다. pH 미터 상에서의 온도 프로브는 300분에서 44.4℃로 판독되었고 60분이 경과될 때까지 30℃로 다시 냉각되었다는 것이 인지되었다. 이것은 발열성 산/염기 반응에 의해 야기되었을 가능성이 가장 높다. pH가 온도의 증가에 따라 감소하기 때문에, 이 온도 증가는 그래프 1-3에서 비선형성도 설명할 수 있다.
Figure pct00087
Figure pct00088
[표 1-1]
Figure pct00089
Figure pct00090
표 1-2는 pH를 기준으로 CO2:HMD의 시뮬레이션된 몰비를 보여준다. 1.8 당량의 CO2가 매우 신속히 용액 내로 들어간다는 것을 관찰할 수 있다. 흡수 속도는 2 당량에 도달될 때 상당히 느려지기 시작한다.
[표 1-2]
Figure pct00091
결과는 공기 및 열이 pH를 온전히 11.02까지 다시 회복시킬 수 있다는 것을 보여준다. 추출은 이 pH에서 가능해야 한다. 발효 동안 통기는 용해된 CO2 중 일부를 떼어낼 수 있다.
실시예 2
본 실시예는 시뮬레이션된 발효 공정의 결과를 보고한다. 요약하건대, CO2(대략 98% 순수) 및 HMD(시그마 알드리치로부터의 70% HMD)를, 하기 조성을 갖는 MM9 용액 내로 공급하였다:
Figure pct00092
0.68%(6.8 g/ℓ) 인산이나트륨 Na2HPO4
Figure pct00093
0.3%(3 g/ℓ) 인산일칼륨 KH2PO4
Figure pct00094
0.15%(1.5 g/ℓ) 염화암모늄 NH4Cl
Figure pct00095
0.1%(1 g/ℓ) 황산암모늄 (NH4)2SO4
Figure pct00096
0.05%(0.5 g/ℓ) 염화나트륨 NaCl.
본 실시예에 대한 실험 조건은 하기 표 2-1에 요약되어 있다.
[표 2-1]
Figure pct00097
용액의 측정된 pH 및 시간에 따라 첨가된 HMD의 농도는 그래프 2-1에 기재되어 있다.
Figure pct00098
본 실시예에서 사용된 이 공급 속도는 3.31 g/ℓ/hr의 평균 속도에 상응한다(산업적 발효 공정에서 적당한 생성 속도). HMD의 최종 역가 및 공급 농도를 LCMS로 확인하였다. HMD 및 CO2는 약 pH 8.5에서 동적 평형에 도달한다. 보다 많은 HMD가 첨가될수록, 보다 많은 CO2가 흡수된다. 시뮬레이션된 HMD:CO2 비는 pH = 8.53의 경우 1.95이다. 이 비는 용액 중의 주요 종이 HMD2+(HCO3 -)2 염(헥사메틸렌디아민 비스-비카보네이트)이라는 것을 시사한다. 도 2-2 및 2-3은 각각 HMD 및 H2CO3에 대한 상대적 종 농도를 pH의 함수로서 보여준다.
Figure pct00099
Figure pct00100
pH 8.5(흑색 쇄선)에서, 용액 중의 주요 종은 이양성자화된(diprotonated) HMD 및 비카보네이트이다. 소량의 HMD-카바메이트도 존재할 수 있다.
실시예 3
본 실시예는 HMD 수성 용액과 CO2 가스의 접촉에 의해 형성된 양성자화된 및/또는 카보네이트/카바메이트 화합물로부터 HMD를 유리 염기로서 생성하는 것을 입증하고, 이때 상기 수성 용액은 MM9 배지이었다.
축합기, 온도 프로브 및 공기 살포 바늘을 250 ㎖ 4-구 플라스크에 장착시켰다. 축합기의 상부를 통해 공기가 들어가도록 시스템을 개방하였다. 공급물은 MM9 중의 수성 HMD 용액이었고, 이때 pH를 CO2로 8.68까지 조절하였다. 공급물 용액을 LCMS로 HMD 농도에 대해 분석하였고, pH를 측정하였다. 용액을 공기로 살포하고 3시간 동안 85℃에서 재환류시켰다. 생성된 용액의 pH를 측정하였고 HMD의 농도를 LCMS로 측정하였다.
[표 3-1]
Figure pct00101
표 3-1에 나타낸, 8.68부터 11.26까지 양성 pH 변화는 CO2가 용액으로부터 제거되었다는 것을 시사한다. 일부 물이 축합기를 통해 빠져나감에 따라 농도는 다소 증가하였고, 용액은 농축되었다. pH 11.26에서 유리 염기 형태의 HMD의 비율은 57%이다.
실시예 4
본 실시예는 상기 실시예 3에서 제조된 CO2-제거된 용액으로부터의 HMD의 용매 추출뿐만 아니라, 용매 성능에 대한 대조군으로서 pH가 조절되지 않은 수성 용액으로부터의 HMD의 추출도 기술한다. 하기 프로토콜이 본 실시예에서 사용되었다:
수성 공급물의 pH를 측정하였다. 50 ㎖ 팔콘 튜브에서, 20 g의 용매를 20 g의 공급물과 혼합하였다. 이 조합물을 5분 동안 팔콘 튜브에서 더 철저히 혼합하였고 1분 동안 볼텍싱하였다. 상 분리가 완료될 때까지, 혼합된 용매 및 공급물을 갖는 튜브를 가만히 놓아두었다. 하부 수성 층의 부피를 기록하였다. 상부 층의 샘플을 상부 층으로부터 조심스럽게 피펫팅하였다. 하부 층의 샘플도 수득하였고, 하부 층의 pH를 측정하였다. 질량 균형을 기초로 회수, 분포 계수 및 선택성을 계산하였다.
물로부터 HMD를 추출하는 3종의 용매들에 대한 추출 데이터는 표 4-1에 기재되어 있다.
[표 4-1]
Figure pct00102
표 4-1에 보고된 스크리닝에 기초할 때, 1-헥산올은 이소펜탄올 및 사이클로헥산올보다 더 낮은 수용성을 갖기 때문에 상기 실시예 3에서 제조된 HMD 재생 용액의 생성물을 추출하는 데 먼저 사용되었다. 극도로 낮은 수용성으로 인해 알칸, 구체적으로 헥산을 스크리닝한 후 시험하였다. 헥산은 물이 존재한다 하더라도 물을 거의 추출하지 않았고 이용가능한 유리 염기의 적당한 회수를 제공하였다.
표 4-2는 1:1 용매 대 공급물 비를 사용한 경우, HMD가 25.8%의 전체 회수율 또는 헥산의 경우 4%의 전체 회수율로 추출될 수 있다는 것을 보여준다. 추출 전 pH에 기초할 때, 단지 60%의 유리 염기 HMD가 이용가능하다. 따라서, 대략 43%의 이용가능한 유리 염기 HMD가 용매 1-헥산올에 의해 추출되었고 약 7%의 이용가능한 유리 염기 HMD가 헥산에 의해 추출되었다. 헥산은 물이 존재한다 하더라도 물을 거의 추출하지 않았고 이용가능한 유리 염기의 적당한 회수를 제공하였다.
[표 4-2]
Figure pct00103
실시예 5
비교예
질량 기준으로 88%의 글루코스가 HMD로 전환되고 최종 HMD 역가가 116 g/ℓ라는 가정 하에, 모델링된 HMD 발효가 H2SO4에 의해 pH 7까지 조절되었을 때, HMD g당 0.843 g H2SO4이 pH를 7에서 유지하는 데 필요하다. 사용된 황산의 양으로 인해, 이산화탄소는 용이하게 흡수되지 않는다. 이것은 0.5% 미만의 최종 DIC/TDCA 값을 야기하였다. 발효 모델은 특히 세포 생장 및 호흡, 부산물 형성 및 요구된 배지 조성을 고려한다.
실시예 5A
질량 기준으로 88%의 글루코스가 HMD로 전환되고 최종 HMD 역가가 116 g/ℓ라는 가정 하에, HMD 발효가 8.5의 pH에서 모델링되었을 때, (실험 결과를 기초로) 8.5의 pH를 유지하기 위해 황산이 요구되지 않는다. 이산화탄소는 HMD에 의해 용이하게 흡수된다. 시드 발효 동안, DIC/TDCA는 1% 미만부터 대략 54%까지 상승하였다. 생성물 발효 동안, 값은 대략 54%부터 대략 96%까지 상승하였다. 발효 모델은 특히 세포 생장 및 호흡, 부산물 형성 및 요구된 배지 조성을 고려한다.
실시예 5B
질량 기준으로 88%의 글루코스가 HMD로 전환되고 최종 HMD 역가가 116 g/ℓ라는 가정 하에, 모델링된 HMD 발효가 단지 CO2에 의해 7의 pH까지 조절되었을 때, HMD의 몰당 2.5 몰의 CO2가 흡수될 필요가 있을 것임이 입증된다. 7의 pH가 pH 조절에서 사용된 유일한 산으로서 CO2를 사용할 때 도달될 수 있다는 것은 다른 실시예에서 실험적으로 입증되었다. 시드(seed) 발효 모델 동안, DIC/TDCA는 1% 미만부터 대략 82%까지 상승하였다. 생성물 발효 모델 동안, 값은 대략 82%부터 대략 92%까지 상승하였다. 발효 모델은 특히 세포 생장 및 호흡, 부산물 형성 및 요구된 배지 조성을 고려한다.
실시예 6
수성 용액으로부터 HMD 유리 염기를 회수하기에 적합한 용매로서 용매, 예컨대, 알칸을 평가하였다. 헥산 또는 헵탄을 사용한 용매 추출에 의해 HMD의 50% 수성 용액으로부터 회수된 퍼센트 HMD를 모델링하기 위해 ASPEN(Aspen Plus ver 8.6; Aspen Technology, Inc., USA) 소프트웨어를 이용하였다. Aspen 모델에 포함된 성분들은 물, HMD, DIC(용존 무기 탄소) 및 용매(헥산 또는 헵탄)이었다. ASPEN에서 전해질 NRTL 모델(ENRTL-RK)을 사용하였다. 50% HMD 용액은 특히 본원에 기재된 물 및 CO2 제거 방법을 이용하여 달성할 수 있는 농도이고 HMD의 침전을 피하거나 감소시키는 농도인 것으로 생각되기 때문에 모델링되었다. 상기 모델의 경우, 50% HMD 용액 중의 CO2 함량은 0.3%이었다. 그러나, HMD 농도가 높아질수록 용매 추출의 효율이 증가하기 때문에, 용매 추출을 위한 HMD 농도 한계는 훨씬 더 높을 수 있다.
본 실시예에서, 추출 컬럼은 10개의 이론상 스테이지(stages)를 가진다. 이 모델에서, HMD는 약 96.6% 유리 염기(용매 추출가능한 형태)를 포함하였으므로, 작도된 값은 회수가능한 형태의 HMD의 퍼센트 회수를 다소 과소평가한다. 이들 인 실리코(in silico) 모델링 결과는 알칸이 다양한 용매 대 HMD 용액 비에서 수성 용액으로부터의 HMD 회수에 효과적인 용매일 수 있다는 것을 입증한다.
Figure pct00104
용매 추출의 효율은 하기 표시된 바와 같이 DIC 농도의 감소에 따라 증가하고, 이것은 CO2 제거의 중요성을 뒷받침한다. DIC 감소는 pH를 더 높이고 회수가능한 유리 염기 형태의 농도를 더 높인다.
Figure pct00105
실시예 7
HMD 회수 전에 물 및 CO2 제거를 달성하기 위한 물 증발기(다중-효과 증발기) 또는 증기 스트립핑 컬럼의 사용을 모델링하기 위해 ASPEN Plus를 이용하였다. 조건은 전술된 바와 같았고; ASPEN 모델에 포함된 성분은 물, HMD, DIC 종 및 헥산이었고; 전해질 NRTL 모델을 이용하였다. 어느 한 단계가 제거될 수 있지만, 보다 많은 물이 증발될 때 증발기에서 전기 및 증기 사용의 증가에도 불구하고, 증발기가 물 제거에 있어서 스트립핑 컬럼보다 더 효율적이기 때문에 증발기의 사용에 의해 효용 비용의 절약이 실현된다. 하기 도면은 스트립핑 컬럼이 존재하지 않을 때 증기 및 전기 사용을 제거된 총 물의 함수로서 보여준다. 작도된 효용 비용은 증발기 단계에 대한 것이다. 최대("Max") 증기 및 전기 사용은 50 중량%의 HMD 수성 용액이 달성된 점을 지칭한다. 상기 언급된 바와 같이, 이 HMD 농도는 용액이 농축될 때 침전물 형성을 유발할 수 있는 추가 물 및 CO2 제거를 피하면서 추출에 적합한 것으로 생각되기 때문에 상기 모델을 위해 선택되었다. HMD 농도가 높아질수록 용매 추출의 효율이 증가하기 때문에, 추가 농축이 유용할 수 있다.
Figure pct00106
하기 도면은 증발기가 존재하지 않는 경우 스트립핑 컬럼에서의 증기 사용을 보여준다. 농도 한계는 50 중량%의 HMD 용액이다. 공급물로부터 증발되는 물이 많아짐에 따라, 재가열기의 능률(duty) 및 증기 사용은 상당히 증가한다. 그러나, 이것은 증발 유닛에 비해 스트립핑 컬럼의 보다 낮은 자본 비용에 의해 부분적으로 상쇄된다. 그래프 상의 "Max" 점은 50% HMD 용액이 수득되는 점을 표시한다.
Figure pct00107
실시예 8
탄산 안하이드라제를 갖는 HMDA 생성 미생물 유기체의 제조
HMDA 경로에서 사용된 효소 및 탄산 안하이드라제를 코딩하는 핵산을 갖는 에스케리키아 콜라이를, HMDA를 생성하도록 조작하기 위한 표적 유기체로서 사용한다.
데설포비브리오 불가이스(Desulfovibrio vulgais)(진뱅크 수납 ACL09337.1 GI:218758438, SEQ ID)를 코딩하는 유전자를 이. 콜라이에서 발현되도록 코돈-최적화하고 항시성 프로모터의 조절 하에 발현 벡터 내로 클로닝한다. 이 벡터는 복제 기점 및 항생제 내성 유전자도 함유한다. 디아민, 예를 들면, HMD의 생성을 위한 효소를 코딩하는 유전자도 발현 벡터 내로 클로닝하거나 숙주(본 실시예에서 이. 콜라이) 내로 삽입한다.
수득된 플라스미드를 화학적 형질전환 또는 전기천공으로 이. 콜라이, 예를 들면, MG1655 또는 ATCC 8739 내로 형질전환시킨다. 화학적 형질전환의 경우, 세포를 600 nm에서 광학 밀도(0.5-0.8)에 의해 측정될 때 중간-로그 생장기까지 생장시킨다. 세포를 회수하고 세척하고 최종적으로 CaCl2로 처리한다. 이들 이. 콜라이 세포를 화학적으로 형질전환시키기 위해, 정제된 플라스미드 DNA를 얼음 상의 마이크로원심분리 튜브에서 세포 현탁액과 혼합한다. 열 충격을 혼합물에 인가한 후, 풍부 배양 배지에서 30분 내지 60분 회수 항온처리한다. 전기천공의 경우, 중간-로그 생장기까지 생장된 이. 콜라이 세포를 물로 수회 세척하고 마지막으로 10% 글리세롤 용액 내에 재현탁한다. DNA를 이들 세포 내로 전기천공하기 위해, 세포와 DNA의 혼합물을 일회용 플라스틱 큐벳 함유 전극 내로 피펫팅한다. 그 다음, 짧은 전기적 펄스를 세포에 인가하여, DNA가 들어갈 수 있는 작은 구멍을 막에서 형성한다. 그 다음, 세포 현탁액을 풍부 액체 배지와 함께 항온처리한 후, 고체 한천 플레이트 상에서 플레이팅한다. 상세한 프로토콜은 문헌(Molecular Cloning: A Laboratory Manual Third Edition, Sambrook and Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd Edition)에 기재되어 있다.
수득된 유전적으로 조작된 이. 콜라이를 당분야에서 잘 공지되어 있는 절차에 따라 글루코스 함유 배지에서 배양한다(예를 들면, 문헌(Sambrook et al., supra, 2001) 참조). 예를 들면, 노던 블롯, mRNA의 PCR 증폭, 면역블롯팅 등을 포함하는, 당분야에서 잘 공지되어 있는 폴리펩티드 발현 또는 효소 활성 측정 방법을 이용하여 탄산 안하이드라제 및 HMDA 유전자의 발현을 확인한다. 개별 활성에 특이적인 어세이를 이용하여 발현된 효소의 효소 활성을 확인한다. 탄산 안하이드라제가 카보네이트를 CO2로 전환시키고, 그 결과 DA를 함유하는 용액의 pH가 증가하기 때문에 페놀프텔레인(phenolphtheleine) pH 표시기를 이용하여 pH 변화를 모니터링함으로써 탄산 안하이드라제를 생성하는 조작된 이. 콜라이 균주의 능력을 확인할 수 있다. 페놀프텔레인의 색채 변화는 550 nm에서 흡광도에 의해 모니터링될 수 있다. 300 mM 내지 400 mM의 KHCO3 및 400 μM 내지 1100 μM의 페놀프탈레인과 함께 300 mM 내지 1000 mM의 DA를 세포 용해물 또는 세포외 배지에 첨가함으로써 어세이를 수행한다(Alvizo, et. al. 2014 PNAS 111(46): 16436-16441). 탄산 안하이드라제 활성에 대한 또 다른 어세이는 기질로서 4-니트로페닐아세테이트(3 mM 4-니트로페닐아세테이트)를 사용하는 비색 어세이이다(Verpoorte et. al. 1967 J. Biol. Chem. 242: 4221-4229). 탄산 안하이드라제는 CO2의 생성에 의해 모니터링될 수도 있다. HMD는 HPLC에 의해 확인될 수 있다.

Claims (217)

  1. a) 배지에서 디아민(DA)을 생성하고 DA 카보네이트, DA 비카보네이트, DA 비스-비카보네이트(본원에서 DA 카보네이트류로서 총칭함) 및/또는 DA 카바메이트 또는 DA 비스카바메이트(본원에서 DA 카바메이트류로서 총칭함) 중 하나 이상을 형성하기에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 배지에서 유전적으로 조작된 미생물을 배양하는 단계로서, 이산화탄소, 카보네이트, 비카보네이트 또는 탄산이 주로 배지의 pH를 조절하는 것인 단계;
    b) DA 카보네이트 및 DA 카바메이트 중 적어도 하나 이상을 DA 유리 염기 및 이산화탄소로 전환시키는 단계; 및
    c) DA 유리 염기를 단리하는 단계
    를 포함하는, 디아민(DA)의 제조 방법.
  2. a) 배지에서 DA를 생성하고 DA 카보네이트, DA 비카보네이트, DA 비스-비카보네이트 또는 DA 카바메이트 또는 DA 비스카바메이트 중 하나 이상을 형성하기에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 배지에서 유전적으로 조작된 미생물을 배양하는 단계로서, 배지 중의 퍼센트 용존 무기 탄소(DIC)가 40% 이상이고, DIC는 식 DIC/TDCA×100에 의해 결정되고, TDCA는 총 용존 반대 음이온이고 DIC와 다른 음이온의 합계인 단계;
    b) DA 카보네이트, DA 비카보네이트, DA 비스-비카보네이트, DA 카바메이트 또는 DA 비스카바메이트를 DA 유리 염기 및 이산화탄소로 전환시키는 단계; 및
    c) DA 유리 염기를 단리하는 단계
    를 포함하는, 디아민(DA)의 제조 방법.
  3. a) 배지에서 DA를 생성하고 DA 카보네이트, DA 비카보네이트, DA 비스-비카보네이트(DA 카보네이트류) 및/또는 DA 카바메이트 또는 DA 비스카바메이트(DA 카바메이트류) 중 하나 이상을 형성하기에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 배지에서 유전적으로 조작된 미생물을 배양하는 단계로서, 배지 중의 디아민 종의 적어도 40%가 DA 카보네이트, DA 비카보네이트, DA 비스-비카보네이트, DA 카바메이트 또는 DA 비스카바메이트 중 하나 이상을 포함하는 것인 단계;
    b) DA 카보네이트류 및/또는 DA 카바메이트류를 DA 유리 염기 및 이산화탄소로 전환시키는 단계; 및
    c) DA 유리 염기를 단리하는 단계
    를 포함하는, 디아민(DA)의 제조 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 디아민이 C2 내지 C7 메틸렌 분절 또는 C2 내지 C12 메틸렌 분절을 포함하는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 디아민이 C4 내지 C7 메틸렌 분절을 포함하는 것인 방법.
  6. 제4항에 있어서, 디아민이 헥사메틸렌디아민(HMD), 카다베린(cadaverin), 푸트레신(putrescine), 에틸렌디아민 또는 헵타메틸렌디아민을 포함하는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 디아민이 헥사메틸렌디아민인 방법.
  8. 제6항에 있어서, 디아민 카보네이트류가 카보네이트, 비카보네이트 또는 비스-비카보네이트를 포함하고, 디아민 카바메이트류가 헥사메틸렌디아민(HMD), 카다베린, 푸트레신, 에틸렌디아민 또는 헵타메틸렌디아민의 카바메이트 또는 비스카바메이트, 또는 이들의 임의의 혼합물을 포함하는 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 디아민이 헥사메틸렌디아민인 방법.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 배지 중의 디아민의 적어도 50%가 DA 카보네이트류(DA 카보네이트, DA 비카보네이트 또는 DA 비스-비카보네이트) 또는 DA 카바메이트류(DA 카바메이트 또는 DA 비스카바메이트) 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 배지 중의 디아민의 적어도 60%가 DA 카보네이트, DA 비카보네이트, DA 비스-비카보네이트 또는 DA 카바메이트 또는 DA 비스카바메이트 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 배지 중의 디아민의 적어도 70%가 DA 카보네이트, DA 비카보네이트, DA 비스-비카보네이트 또는 DA 카바메이트 또는 DA 비스카바메이트 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  13. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 배지 중의 디아민의 적어도 80%가 DA 카보네이트, DA 비카보네이트, DA 비스-비카보네이트 또는 DA 카바메이트 또는 DA 비스카바메이트 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 배지 중의 디아민의 적어도 90%가 DA 카보네이트, DA 비카보네이트, DA 비스-비카보네이트 또는 DA 카바메이트 또는 DA 비스카바메이트 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  15. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 배지 중의 디아민의 적어도 99.9%가 DA 카보네이트, DA 비카보네이트, DA 비스-비카보네이트 또는 DA 카바메이트 또는 DA 비스카바메이트 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  16. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항 또는 선행 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 유전적으로 조작된 미생물이 이산화탄소, 카보네이트, 비카보네이트 또는 탄산 중 하나 이상을 추가로 형성하는 것인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 유전적으로 조작된 미생물에 의해 형성된 이산화탄소, 카보네이트, 비카보네이트 또는 탄산이 디아민 제조로부터의 화학량론적 이산화탄소를 포함하는 것인 방법.
  18. 제16항에 있어서, 유전적으로 조작된 미생물에 의해 형성된 이산화탄소, 카보네이트, 비카보네이트 또는 탄산이 호흡 이산화탄소 또는 부산물 이산화탄소를 포함하는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 호흡 이산화탄소가 TCA 사이클의 완결을 통해, 글리옥실레이트 션트(glyoxylate shunt)를 통해, 펜토스 포스페이트 경로(예를 들면, zwf)를 통해 또는 엔트너 듀오도로프(Entner Duodoroff) 경로를 통해 적어도 하나의 경로로부터 형성되는 것인 방법.
  20. 제18항에 있어서, 부산물 이산화탄소가 아세테이트, 에탄올, 석시네이트, 3-옥소아디페이트 또는 3-하이드록시아디페이트인 부산물의 형성과 관련되어 있는 것인 방법.
  21. 제1항 내지 제3항 및 제6항 중 어느 한 항 또는 선행 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 이산화탄소, 카보네이트, 비카보네이트 및 탄산 중 하나 이상을 외부로부터 배지에 첨가하는 것인 방법.
  22. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항 또는 선행 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 카보네이트류가 적어도 HMD 카보네이트를 포함하는 것인 방법.
  23. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항 또는 선행 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 카보네이트류가 적어도 HMD 비카보네이트를 포함하는 것인 방법.
  24. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항 또는 선행 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 카보네이트류가 적어도 HMD 비스-비카보네이트를 포함하는 것인 방법.
  25. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항 또는 선행 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 카바메이트류가 적어도 HMD 카바메이트를 포함하거나, 카바메이트류가 적어도 HMD 비스카바메이트를 포함하는 것인 방법.
  26. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 카보네이트류가 적어도 HMD 비카보네이트 및 HMD 비스-비카보네이트를 포함하는 것인 방법.
  27. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항 또는 선행 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 배지 중의 이산화탄소와 DA의 비가 약 0.05 대 1 내지 약 7 대 1인 방법.
  28. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항 또는 선행 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 유전적으로 조작된 미생물이 약 0.05 대 1 내지 약 5 대 1의 비로 이산화탄소 및 DA를 형성하는 것인 방법.
  29. 제28항 또는 선행 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 유전적으로 조작된 미생물이 약 0.05 대 1 내지 약 3.5 대 1의 비로 이산화탄소 및 DA를 형성하는 것인 방법.
  30. 제28항 또는 선행 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 유전적으로 조작된 미생물이 약 0.05 대 1 내지 약 3 대 1의 비로 이산화탄소 및 DA를 형성하는 것인 방법.
  31. 제28항 또는 선행 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 유전적으로 조작된 미생물이 약 0.05 대 1 내지 약 2.5 대 1의 비로 이산화탄소 및 DA를 형성하는 것인 방법.
  32. 제28항 또는 선행 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 유전적으로 조작된 미생물이 약 0.05 대 1 내지 약 2 대 1의 비로 이산화탄소 및 DA를 형성하는 것인 방법.
  33. 제28항 또는 선행 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 유전적으로 조작된 미생물이 약 0.05 대 1 내지 약 1.5 대 1의 비로 이산화탄소 및 DA를 형성하는 것인 방법.
  34. 제28항 또는 선행 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 유전적으로 조작된 미생물이 약 0.05 대 1 내지 약 1 대 1의 비로 이산화탄소 및 DA를 형성하는 것인 방법.
  35. 제28항에 있어서, 유전적으로 조작된 미생물이 약 0.2 대 1 내지 약 3 대 1의 비로 이산화탄소 및 DA를 형성하는 것인 방법.
  36. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)에서의 배양 동안 배지가 외부로부터 첨가된 완충제를 실질적으로 포함하지 않는 것인 방법.
  37. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)에서의 배양 동안 배지가 외부로부터 첨가된 무기산 또는 유기산을 실질적으로 포함하지 않는 것인 방법.
  38. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항 또는 선행 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 배양된 배지가 11 미만, 10 미만, 9 미만 또는 8 미만의 pH를 갖는 것인 방법.
  39. 제1항 내지 제3항 및 제38항 중 어느 한 항 또는 선행 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 배양된 배지가 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6 또는 적어도 7의 pH를 갖는 것인 방법.
  40. 제39항 또는 선행 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 배양된 배지가 약 6 내지 9.5의 pH를 갖는 것인 방법.
  41. 제39항 또는 선행 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 배양된 배지가 약 6 내지 9의 pH를 갖는 것인 방법.
  42. 제39항 또는 선행 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 배양된 배지가 약 6 내지 8의 pH를 갖는 것인 방법.
  43. 제39항 또는 선행 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 배양된 배지가 약 6.5 내지 7.5의 pH를 갖는 것인 방법.
  44. 제39항 또는 선행 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 배양된 배지가 약 7.5 내지 9.5의 pH를 갖는 것인 방법.
  45. 제39항 또는 선행 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 배양된 배지가 약 8 내지 9의 pH를 갖는 것인 방법.
  46. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항 또는 선행 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 탄산 안하이드라제(carbonic anhydrase)가 (a) 이산화탄소를 비카보네이트 및/또는 카보네이트 이온으로 전환시킴으로써 DA 카보네이트류 또는 DA 카바메이트류의 형성을 향상시키거나, (b) 비카보네이트 및/또는 카보네이트 이온을 이산화탄소로 전환시킴으로써 DA 카보네이트류 또는 DA 카바메이트류 용액으로부터의 이산화탄소의 방출을 향상시키거나, (c) (a) 및 (b) 둘 다를 달성하기에 충분한 양으로 존재하는 것인 방법.
  47. 제46항에 있어서, 탄산 안하이드라제가 DA 카보네이트류의 형성을 향상시키는 것인 방법.
  48. 제46항 또는 제47항에 있어서, 탄산 안하이드라제가 DA 카보네이트류 용액으로부터의 이산화탄소의 방출을 향상시키는 것인 방법.
  49. 제46항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 탄산 안하이드라제가 DA 카보네이트류의 형성을 향상시키고 DA 카보네이트류 용액으로부터의 이산화탄소의 방출을 향상시키는 것인 방법.
  50. 제46항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 탄산 안하이드라제가 DA 카보네이트류 또는 DA 카바메이트류의 형성을 향상시키기 위해 발효 브로쓰(broth)에 존재하는 것인 방법.
  51. 제46항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 탄산 안하이드라제가 DA 카보네이트류 또는 DA 카바메이트류 용액으로부터의 이산화탄소의 방출을 향상시키기 위해 이산화탄소를 방출하고 유리 DA 염기를 생성하는 단계 또는 단계들에 존재하는 것인 방법.
  52. 제46항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 탄산 안하이드라제가 DA 카보네이트류 또는 DA 카바메이트류의 형성을 향상시키기 위해 발효 브로쓰 중에 존재하고, DA 카보네이트류 또는 DA 카바메이트류 용액으로부터의 이산화탄소의 방출을 향상시키기 위해 이산화탄소를 방출하고 유리 DA 염기를 생성하는 단계 또는 단계들에 존재하는 것인 방법.
  53. 제46항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 탄산 안하이드라제를 외생적으로 첨가하는 것인 방법.
  54. 제46항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 탄산 안하이드라제가 발효 브로쓰 중의 유전적으로 조작된 미생물에 의해 제공되고, 임의적으로 브로쓰로 분비되며, 임의적으로 미생물의 주변세포질(periplasm)에 존재하는 것인 방법.
  55. 제46항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 탄산 안하이드라제가 DA를 생성하는 유전적으로 조작된 미생물에 의해 제공되고, 임의적으로 브로쓰로 분비되며, 임의적으로 미생물의 주변세포질에 존재하는 것인 방법.
  56. 제46항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 탄산 안하이드라제가 천연 유전자 또는 효소이고, 임의적으로 탄산 안하이드라제가 조작된 유전자 또는 효소로서, 임의적으로 브로쓰로 분비되도록 조작되고, 임의적으로 미생물의 주변세포질 공간으로 분비되도록 조작된 것인 방법.
  57. 제46항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 탄산 안하이드라제가 조작된 효소로서, 임의적으로 안정성, 열 안정성, 알칼리 pH 안정성 또는 증가된 활성을 향상시키도록 조작된 것인 방법.
  58. 제46항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, DA가 HMD, 카다베린, 푸트레신, 에틸렌디아민, 헵타메틸렌디아민, 또는 C2 내지 C7 메틸렌 분절, C2 내지 C12 메틸렌 분절 또는 C4 내지 C7 메틸렌 분절을 포함하는 디아민이고, 임의적으로 DA가 HMD인 방법.
  59. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항 또는 선행 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 카보네이트류 및/또는 카바메이트류를 DA 유리 염기로 전환시키기 전에 세포를 포함하는 고체 분획으로부터, DA-카보네이트류 및/또는 DA-카바메이트류가 농후한 액체 분획을 분리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  60. 제59항에 있어서, 분리 단계가 원심분리, 미세여과, 회전 드럼 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
  61. 제60항에 있어서, 원심분리가 디스크-스택(disc-stack) 원심분리기 또는 디캔터(decanter) 원심분리기를 포함하는 것인 방법.
  62. 제59항에 있어서, 카보네이트류 및/또는 카바메이트류가 농후한 액체 분획의 여과를 추가로 포함하는 방법.
  63. 제62항에 있어서, 여과가 한외여과를 포함하는 것인 방법.
  64. 제1항 내지 제3항 및 제59항 중 어느 한 항 또는 선행 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 카보네이트류 및/또는 카바메이트류를 DA 유리 염기를 전환시키기 전에 배양된 배지로부터 물을 제거하는 단계를 추가로 포함하고, 임의적으로 물을 회수하여 단계 (a)의 배양 공정으로 재순환시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  65. 제64항에 있어서, 물 제거 단계가 증발, 역삼투 또는 전기투석을 포함하는 것인 방법.
  66. 제64항에 있어서, 증발이 다중 효과 증발기, 열 증기 재압축 또는 기계적 증기 재압축을 포함하는 것인 방법.
  67. 제1항 내지 제3항, 제59항 및 제64항 중 어느 한 항 또는 선행 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 가열에 의해 카보네이트류 및/또는 카바메이트류를 유리 염기로 전환시키는 것인 방법.
  68. 제1항 내지 제3항, 제59항 및 제64항 중 어느 한 항 또는 선행 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 진공에 의해 카보네이트류 및/또는 카바메이트류를 유리 염기로 전환시키는 것인 방법.
  69. 제1항 내지 제3항, 제59항 및 제64항 중 어느 한 항 또는 선행 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 이온 교환에 의해 카보네이트류 및/또는 카바메이트류를 유리 염기로 전환시키는 것인 방법.
  70. 제1항 내지 제3항, 제59항 및 제64항 중 어느 한 항 또는 선행 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 전기투석에 의해 카보네이트류 및/또는 카바메이트류를 유리 염기로 전환시키는 것인 방법.
  71. 제70항에 있어서, 전기투석이 양극성 막을 사용하는 전기투석인 방법.
  72. 제67항에 있어서, 카보네이트류 및/또는 카바메이트류를 70℃ 초과, 80℃ 초과, 105℃ 초과 또는 200℃ 초과의 온도에서 유리 염기로 열적으로 전환시키는 것인 방법.
  73. 제67항에 있어서, 카보네이트류 및/또는 카바메이트류를 20℃ 초과, 30℃ 초과 또는 40℃ 초과의 온도에서 유리 염기로 열적으로 전환시키고, 진공이 존재하는 것인 방법.
  74. 제1항 내지 제3항, 제59항 및 제64항 중 어느 한 항 또는 선행 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 카보네이트류 및/또는 카바메이트류를 용기 내에서 1 내지 10 bar의 압력에서 유리 염기로 전환시키는 것인 방법.
  75. 제1항 내지 제3항, 제59항 및 제64항 중 어느 한 항 또는 선행 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 분획을 가스로 스트립핑함으로써 카보네이트류 및/또는 카바메이트류를 DA 유리 염기로 전환시키는 것인 방법.
  76. 제75항에 있어서, 가스가 공기 또는 불활성 가스이고, 임의적으로 불활성 가스가 질소, 공기 또는 헬륨인 방법.
  77. 제75항 또는 제76항에 있어서, 스트립핑을 약 1 내지 10 bar의 압력에서 수행하는 것인 방법.
  78. 제1항 내지 제3항, 제59항 및 제64항 중 어느 한 항 또는 선행 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 증기 스트립핑에 의해 DA 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 화합물, 바람직하게는 HMD 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 화합물을 유리 염기로 전환시키는 것인 방법.
  79. 제1항 내지 제3항, 제59항 및 제64항 중 어느 한 항 또는 선행 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 물 제거 및 DA 유리 염기로의 카보네이트류 및/또는 카바메이트류의 전환이 동시에 또는 동일한 단위 조작으로 일어나는 것인 방법.
  80. 제1항 내지 제3항, 제59항 및 제64항 중 어느 한 항 또는 선행 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 물 제거 및 DA 유리 염기로의 카보네이트류 및/또는 카바메이트류의 전환이 가열에 의해, 또는 임의적으로 불활성 가스 또는 증기를 사용한 스트립핑에 의해 동시에 일어나는 것인 방법.
  81. 선행 청구항 중 어느 한 항에 있어서, DA 추출 전에 pH를 더 높이기에 충분한 강염기, 임의적으로 수산화나트륨 또는 수산화칼슘을 DA 유리 염기 농후 용액에 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  82. 선행 청구항 중 어느 한 항 항에 있어서, 전환 단계가 적어도 20% 내지 적어도 99%의 DA 유리 염기를 생성하는 것인 방법.
  83. 제2항 또는 선행 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 퍼센트 용존 무기 탄소(DIC)가 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상 또는 90% 이상인 방법.
  84. 제1항 또는 선행 청구항 중 어느 한 항에 있어서, pH를 조절하기 위한, 외부로부터 첨가된 이산화탄소 대 외부로부터 첨가된 다른 산의 몰비가 적어도 1:1, 적어도 2:1, 적어도 5:1, 적어도 10:1, 적어도 50:1 또는 적어도 100:1인 방법.
  85. 선행 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 디아민이 헥사메틸렌디아민, 카다베린, 푸트레신, 에틸렌디아민 또는 헵타메틸렌디아민인 방법.
  86. 제85항에 있어서, 디아민이 헥사메틸렌디아민인 방법.
  87. 제85항에 있어서, 디아민이 카다베린인 방법.
  88. 제85항에 있어서, 디아민이 푸트레신인 방법.
  89. 제85항에 있어서, 디아민이 에틸렌디아민인 방법.
  90. 제85항에 있어서, 디아민이 헵타메틸렌디아민인 방법.
  91. 제64항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 탄산 안하이드라제가 비카보네이트 및/또는 카보네이트 이온을 이산화탄소로 전환시킴으로써 DA 카보네이트류 또는 DA 카바메이트류 용액으로부터의 이산화탄소의 방출을 향상시키기에 충분한 양으로 존재하는 것인 방법.
  92. 제91항에 있어서, 탄산 안하이드라제가 DA 카보네이트류 용액으로부터의 이산화탄소의 방출을 향상시키는 것인 방법.
  93. 제91항 또는 제92항에 있어서, 탄산 안하이드라제가 발효 브로쓰 중에 존재하는 것인 방법.
  94. 제91항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 탄산 안하이드라제가 DA 카보네이트류 또는 DA 카바메이트류 용액으로부터의 이산화탄소의 방출을 향상시키기 위해 이산화탄소를 방출하고 유리 DA 염기를 생성하는 단계 또는 단계들에 존재하고, 임의적으로 CA가 물 제거 또는 증발 단계에 존재하고, 임의적으로 CA가 CO2 스트립핑 단계에 존재하고, 임의적으로 CA가 물 제거 또는 증발 단계 및 CO2 스트립핑 단계 둘 다에 존재하는 것인 방법.
  95. 제91항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 탄산 안하이드라제를 외생적으로 첨가하는 것인 방법.
  96. 제91항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 탄산 안하이드라제가 발효 브로쓰 중의 유전적으로 조작된 미생물에 의해 제공되고, 임의적으로 브로쓰로 분비되며, 임의적으로 미생물의 주변세포질에 존재하는 것인 방법.
  97. 제91항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 탄산 안하이드라제가 DA를 생성하는 유전적으로 조작된 미생물에 의해 제공되고, 임의적으로 브로쓰로 분비되며, 임의적으로 미생물의 주변세포질에 존재하는 것인 방법.
  98. 제91항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 탄산 안하이드라제가 천연 유전자 또는 효소이고, 임의적으로 탄산 안하이드라제가 조작된 유전자 또는 효소로서, 임의적으로 브로쓰로 분비되도록 조작되고, 임의적으로 미생물의 주변세포질 공간으로 분비되도록 조작된 것인 방법.
  99. 제91항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 탄산 안하이드라제가 조작된 효소로서, 임의적으로 안정성, 열 안정성, 알칼리 pH 안정성 또는 증가된 활성을 향상시키도록 조작된 것인 방법.
  100. 제91항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, DA가 HMD, 카다베린, 푸트레신, 에틸렌디아민, 헵타메틸렌디아민, 또는 C2 내지 C7 메틸렌 분절, C2 내지 C12 메틸렌 분절 또는 C4 내지 C7 메틸렌 분절을 포함하는 디아민인 방법.
  101. 선행 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 전환 단계가 적어도 20% 내지 적어도 99%의 디아민 유리 염기를 생성하는 것인 방법.
  102. 제101항에 있어서, 추출 용매를 사용하여 디아민 유리 염기, 바람직하게는 HMD 유리 염기를 배지 또는 디아민 농후 분획으로부터 단리하여, 수성상 및 디아민 유리 염기 함유 유기상을 제공하는 것인 방법.
  103. 제1항 내지 제3항 및 제67항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 유기 용매를 사용하여 DA 유리 염기, 바람직하게는 HMD 유리 염기를 배지 또는 DA 농후 분획으로부터 단리하여, 수성상 및 DA 유리 염기 함유 유기상을 제공하는 것인 방법.
  104. 제103항에 있어서, 유기 용매로부터 DA 유리 염기를 분리하기 위한 유기상의 증류를 추가로 포함하는 방법.
  105. 제103항에 있어서, 추출 용매를 사용하여 DA 유리 염기를 배지 또는 DA 농후 분획으로부터 단리하여, 수성상 및 DA 유리 염기 함유 유기상을 생성하고, 증류에 의해 DA를 추출 용매로부터 분리하는 것인 방법.
  106. 제103항에 있어서, 추출 용매가 물보다 더 낮은 비점을 갖는 것인 방법.
  107. 제103항에 있어서, 추출 용매가 DA 유리 염기 또는 HMD 유리 염기보다 더 높은 비점을 갖는 것인 방법.
  108. 제103항에 있어서, 추출 용매가 물의 비점과 DA 유리 염기 또는 HMD 유리 염기의 비점 사이의 중간 비점을 갖는 것인 방법.
  109. 제103항에 있어서, 추출 용매가 알코올, 알칸, 아민, 에테르 및 케톤으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  110. 제109항에 있어서, 추출 용매가 C4-C8 1가 알코올을 포함하는 것인 방법.
  111. 제109항에 있어서, 추출 용매가 부탄올, 헥산올, 1-헥산올, 이소펜탄올 또는 사이클로헥산올을 포함하는 것인 방법.
  112. 제109항에 있어서, 추출 용매가 톨루엔 또는 에틸 에테르를 포함하는 것인 방법.
  113. 제109항에 있어서, 추출 용매가 C5-C12 선형 또는 분지형 알칸을 포함하는 것인 방법.
  114. 제109항에 있어서, 추출 용매가 헵탄, 헥산, 이들의 이성질체 및 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
  115. 제109항에 있어서, 추출 용매가 추출되는 디아민의 탄소 원자의 수를 포함하는 것인 방법.
  116. 제103항에 있어서, 유기상(추출물)이 유리 염기 형태 또는 HMD 유리 염기 형태로 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40% 또는 적어도 50%의 DA를 포함하는 것인 방법.
  117. 제103항에 있어서, 용매 추출 단계의 수성상(라피네이트)을 처리하여, DA 또는 HMD를 회수하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  118. 제117항에 있어서, 수성상 라피네이트를 전환 단계로 재순환시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  119. 제103항에 있어서, 증류 단계가 물 및 용매를 실질적으로 제거하는 것인 방법.
  120. 제103항에 있어서, 물 및 용매를 실질적으로 제거하기 위한 증류를 170℃ 미만, 160℃ 미만, 150℃ 미만 또는 140℃ 미만의 온도에서 수행하는 것인 방법.
  121. 제103항에 있어서, 물 또는 용매를 실질적으로 포함하지 않는 DA 유리 염기, 및 임의적으로 적어도 90%의 DA, 적어도 94%의 DA 또는 적어도 123%의 DA에 대해 암모니아 침전을 실시하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  122. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단리 단계가 탄소 흡착, 수소화 및 증류 단계들 중 하나 이상을 추가로 포함하는 것인 방법.
  123. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단리 단계가 발색 화합물을 제거하거나 감소시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  124. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항 또는 제103항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 용매 추출 후 적어도 하나의 증류 단계가 존재하는 것인 방법.
  125. 제124항에 있어서, 용매 추출 후 적어도 2개의 증류 단계가 존재하는 것인 방법.
  126. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, DA 유리 염기를 하나 이상의 증류 단계에서 배지로부터 직접적으로 증류하는 것인 방법.
  127. 선행 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 DA 유리 염기가 약 90% 초과, 95% 초과, 99% 초과 또는 99.9% 초과의 순도를 갖는 것인 방법.
  128. 제103항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 추출 용매를 DA 유리 염기로부터 분리한 후 재순환시키는 것인 방법.
  129. 선행 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 이산화탄소를 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 단계 (a)의 배양 공정으로 첨가함으로써 이산화탄소의 적어도 일부를 재순환시키는 것인 방법.
  130. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항 또는 선행 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 유전적으로 조작된 미생물이, 적어도 하나의 HMD 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 화합물을 생성하기에 충분한 양으로 발현되는, HMD 합성 경로의 적어도 하나의 효소를 코딩하는 적어도 하나의 외생성 핵산을 갖는 HMD 합성 경로를 포함하는 것인 방법.
  131. 제130항에 있어서, 유전적으로 조작된 미생물이, 적어도 하나의 HMD 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 화합물을 생성하기에 충분한 양으로 발현되는, HMD 합성 경로의 적어도 2종의 효소를 코딩하는 적어도 2종의 외생성 핵산을 갖는 HMD 합성 경로를 포함하는 것인 방법.
  132. 제130항에 있어서, 유전적으로 조작된 미생물이, 적어도 하나의 HMD 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 화합물을 생성하기에 충분한 양으로 발현되는, HMD 합성 경로의 적어도 3종의 효소를 코딩하는 적어도 3종의 외생성 핵산을 갖는 HMD 합성 경로를 포함하는 것인 방법.
  133. 제130항에 있어서, 유전적으로 조작된 미생물이, 적어도 하나의 HMD 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 화합물을 생성하기에 충분한 양으로 발현되는, HMD 합성 경로의 적어도 4종의 효소를 코딩하는 적어도 4종의 외생성 핵산을 갖는 HMD 합성 경로를 포함하는 것인 방법.
  134. 제130항에 있어서, 유전적으로 조작된 미생물이, 적어도 하나의 HMD 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 화합물을 생성하기에 충분한 양으로 발현되는, HMD 합성 경로의 적어도 5종의 효소를 코딩하는 적어도 5종의 외생성 핵산을 갖는 HMD 합성 경로를 포함하는 것인 방법.
  135. 제130항에 있어서, 유전적으로 조작된 미생물이, 적어도 하나의 HMD 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 화합물을 생성하기에 충분한 양으로 발현되는, HMD 합성 경로의 적어도 6종의 효소를 코딩하는 적어도 6종의 외생성 핵산을 갖는 HMD 합성 경로를 포함하는 것인 방법.
  136. 제130항에 있어서, 유전적으로 조작된 미생물이, 적어도 하나의 HMD 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 화합물을 생성하기에 충분한 양으로 발현되는, HMD 합성 경로의 적어도 7종의 효소를 코딩하는 적어도 7종의 외생성 핵산을 갖는 HMD 합성 경로를 포함하는 것인 방법.
  137. 제130항에 있어서, 유전적으로 조작된 미생물이, 적어도 하나의 HMD 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 화합물을 생성하기에 충분한 양으로 발현되는, HMD 합성 경로의 적어도 8종의 효소를 코딩하는 적어도 8종의 외생성 핵산을 갖는 HMD 합성 경로를 포함하는 것인 방법.
  138. 제130항에 있어서, 유전적으로 조작된 미생물이, 적어도 하나의 HMD 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 화합물을 생성하기에 충분한 양으로 발현되는, HMD 합성 경로의 적어도 9종의 효소를 코딩하는 적어도 9종의 외생성 핵산을 갖는 HMD 합성 경로를 포함하는 것인 방법.
  139. 제130항에 있어서, 유전적으로 조작된 미생물이, 적어도 하나의 HMD 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 화합물을 생성하기에 충분한 양으로 발현되는, HMD 합성 경로의 적어도 10종의 효소를 코딩하는 적어도 10종의 외생성 핵산을 갖는 HMD 합성 경로를 포함하는 것인 방법.
  140. 제130항에 있어서, 유전적으로 조작된 미생물이, 적어도 하나의 HMD 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 화합물을 생성하기에 충분한 양으로 발현되는, HMD 합성 경로의 적어도 11종의 효소를 코딩하는 적어도 11종의 외생성 핵산을 갖는 HMD 합성 경로를 포함하는 것인 방법.
  141. 제130항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서, HMD 합성 경로가 3-옥소아디필-CoA, 아디페이트 세미알데하이드, 6-아미노카프로에이트(6-ACA), 6-ACA 세미알데하이드, 2-아미노피멜레이트, 3,6-디하이드록시헥사노일-CoA 및 호모라이신으로 구성된 군으로부터 선택되는 중간체 화합물을 포함하는 것인 방법.
  142. 제130항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서, HMD 합성 경로가 3-옥소아디필-CoA 티올라제(thiolase), 6-ACA 트랜스아미나제(transaminase) 또는 데하이드로게나제(dehydrogenase), 6-아미노카프로일-CoA 리덕타제(reductase), 6-ACA 리덕타제, 아디필-CoA 리덕타제, 아디페이트 리덕타제, 6-하이드록시 3-옥소헥사노일-CoA 데하이드로게나제, 2-아미노피멜레이트 데카복실라제(decarboxylase) 및 호모라이신 데카복실라제로 구성된 군으로부터 선택되는 효소를 포함하는 것인 방법.
  143. 제130항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서, HMD 합성 경로가 석시닐-CoA 및 아세틸-CoA에 작용하여 3-옥소아디필-CoA를 제조하는 3-옥소아디필-CoA 티올라제, 아디필-CoA에 작용하여 6-ACA를 형성하는 6-ACA 트랜스아미나제, 6-아미노카프로아일-CoA에 작용하여 6-ACA 세미알데하이드를 형성하는 6-아미노카프로일-CoA 리덕타제, 6-ACA에 작용하고 이를 6-ACA 세미알데하이드로 직접적으로 전환시키는 6-ACA 리덕타제, 아디필-CoA에 작용하여 아디페이트 세미알데하이드를 형성하는 아디필-CoA 리덕타제, 아디페이트에 작용하고 이를 아디페이트 세미알데하이드로 직접적으로 전환시키는 아디페이트 리덕타제, 6-하이드록시 3-옥소헥사노일-CoA를 환원시켜 3,6-디하이드록시 헥사노일-CoA를 형성하는 6-하이드록시 3-옥소헥사노일-CoA 데하이드로게나제, 2-아미노피멜레이트를 탈카복실화하여 6-ACA를 형성하는 2-아미노피멜레이트 데카복실라제, 및 호모라이신을 탈카복실화하여 HMDA를 형성하는 호모라이신 데카복실라제로 구성된 군으로부터 선택되는 효소 및 기질-생성물 쌍을 포함하는 것인 방법.
  144. 제130항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서, HMD 합성 경로가 하기 경로 (a) 내지 (m)의 군으로부터 선택되는 것인 방법:
    (a) 3-옥소아디필-CoA 티올라제, 3-옥소아디필-CoA 데하이드로게나제, 3-하이드록시아디필-CoA 데하이드라타제(dehydratase), 5-카복시-2-펜테노일-CoA 리덕타제, 아디필-CoA 리덕타제, 6-ACA 트랜스아미나제 또는 데하이드로게나제, 6-ACA 트랜스퍼라제(transferase) 또는 신세타제(synthetase) 및 6-ACA-CoA 리덕타제, 또는 6-ACA 리덕타제, HMDA 트랜스아미나제 또는 데하이드로게나제;
    (b) 3-옥소아디필-CoA 티올라제, 3-옥소아디필-CoA 데하이드로게나제, 3-하이드록시아디필-CoA 데하이드라타제, 5-카복시-2-펜테노일-CoA 리덕타제, 아디필-CoA 리덕타제, 6-ACA 트랜스아미나제 또는 데하이드로게나제, 6-ACA 리덕타제, HMDA 트랜스아미나제 또는 데하이드로게나제;
    (c) 3-옥소아디필-CoA 티올라제, 3-옥소아디필-CoA 데하이드로게나제, 3-하이드록시아디필-CoA 데하이드라타제, 5-카복시-2-펜테노일-CoA 리덕타제, 아디필-CoA 트랜스퍼라제, 하이드롤라제(hydrolase) 또는 트랜스퍼라제, 아디페이트 리덕타제, 6-ACA 트랜스아미나제 또는 데하이드로게나제, 6-ACA 트랜스퍼라제 또는 신세타제, 6-ACA-CoA 리덕타제, HMDA 트랜스아미나제 또는 데하이드로게나제;
    (d) 3-옥소아디필-CoA 티올라제, 3-옥소아디필-CoA 데하이드로게나제, 3-하이드록시아디필-CoA 데하이드라타제, 5-카복시-2-펜테노일-CoA 리덕타제, 아디필-CoA 트랜스퍼라제, 하이드롤라제 또는 트랜스퍼라제, 아디페이트 리덕타제, 6-ACA 트랜스아미나제 또는 데하이드로게나제, 6-ACA 리덕타제, HMDA 트랜스아미나제 또는 데하이드로게나제;
    (e) 3-옥소아디필-CoA 티올라제, 3-옥소아디페이트 데하이드로게나제, 3-하이드록시아디페이트 데하이드라타제, 5-카복시-2-펜테노에이트 리덕타제, 아디페이트 리덕타제, 6-ACA 트랜스아미나제 또는 데하이드로게나제, 6-ACA 트랜스퍼라제 또는 신세타제, 6-ACA-CoA 리덕타제, HMDA 트랜스아미나제 또는 데하이드로게나제;
    (f) 3-옥소아디필-CoA 티올라제, 3-옥소아디페이트 데하이드로게나제, 3-하이드록시아디페이트 데하이드라타제, 5-카복시-2-펜테노에이트 리덕타제, 아디페이트 리덕타제, 6-ACA 트랜스아미나제 또는 데하이드로게나제, 6-ACA 리덕타제, HMDA 트랜스아미나제 또는 데하이드로게나제;
    (g) 3-옥소아디필-CoA 티올라제, 3-옥소아디페이트 데하이드로게나제, 3-하이드록시아디페이트 데하이드라타제, 5-카복시-2-펜테노에이트 리덕타제, 아디필-CoA 트랜스퍼라제, 하이드롤라제 또는 트랜스퍼라제, 아디필-CoA 리덕타제, 6-ACA 트랜스아미나제 또는 데하이드로게나제, 6-ACA 트랜스퍼라제 또는 신세타제, 6-ACA-CoA 리덕타제, HMDA 트랜스아미나제 또는 데하이드로게나제;
    (h) 3-옥소아디필-CoA 티올라제, 3-옥소아디페이트 데하이드로게나제, 3-하이드록시아디페이트 데하이드라타제, 5-카복시-2-펜테노에이트 리덕타제, 아디필-CoA 트랜스퍼라제, 하이드롤라제 또는 트랜스퍼라제, 아디필-CoA 리덕타제, 6-ACA 트랜스아미나제 또는 데하이드로게나제, 6-ACA 리덕타제, HMDA 트랜스아미나제 또는 데하이드로게나제;
    (i) 4-하이드록시-2-옥소헵탄-1,7-디오에이트(HODH 알돌라제(aldolase)); 2-옥소헵트-4-엔-1,7-디오에이트(OHED) 하이드라타제(hydratase); OHED 포르메이트-라이아제(lyase) 및 피루베이트 포르메이트-라이아제 활성화 효소 또는 OHED 데하이드로게나제; 2,3-데하이드로아디필-CoA 리덕타제; 아디필-CoA 데하이드로게나제; 또는 아디페이트 세미알데하이드 아미노트랜스퍼라제(aminotransferase) 또는 아디페이트 세미알데하이드 옥시도리덕타제(oxidoreductase)(아미노화);
    (j) β-케토티올라제(ketothiolase) 또는 아세틸-CoA 카복실라제(carboxylase) 및 아세토아세틸-CoA 신타제(synthase), 3-하이드록시아실-CoA 데하이드로게나제 또는 3-옥소아실-CoA 리덕타제, 에노일-CoA 하이드라타제, 및 헥사노일-CoA를 생성하기 위한 트랜스-2-에노일-CoA 리덕타제, 티오에스터라제(thioesterase), 알데하이드 데하이드로게나제 및 부탄알 데하이드로게나제 중 하나 이상, 상기 숙주가 헥산알 또는 헥사노에이트를 생성함; 모노옥시게나제(monooxygenase), 알코올 데하이드로게나제, 알데하이드 데하이드로게나제, 6-하이드록시헥사노에이트 데하이드로게나제, 5-하이드록시펜타노에이트 데하이드로게나제, 4-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제, 6-옥소헥사노에이트 데하이드로게나제 및 7-옥소헵타노에이트 데하이드로게나제 중 하나 이상, 상기 숙주가 아디프산 또는 아디페이트 세미알데하이드를 생성함; 모노옥시게나제, 트랜스아미나제, 6-하이드록시헥사노에이트 데하이드로게나제, 5-하이드록시펜타노에이트 데하이드로게나제, 4-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제 및 알코올 데하이드로게나제 중 하나 이상, 상기 숙주가 6-아미노헥사노에이트를 생성함; 카복실레이트 리덕타제, ω-트랜스아미나제, 데아세틸라제(deacetylase), N-아세틸 트랜스퍼라제 및 알코올 데하이드로게나제 중 하나 이상, 상기 숙주가 헥사메틸렌디아민을 생성함;
    (k) 6-하이드록시-3-옥소-헥사노일-CoA를 형성하는 아세틸트랜스퍼라제 또는 티올라제, 6-하이드록시-3-옥소-헥사노일-CoA 데하이드로게나제, 3,4-디하이드록시헥사노일-CoA 데하이드라타제, 6-하이드록시-2-헥세노일-CoA 리덕타제, 6-ACA를 형성하는 6-하이드록시헥사노일-CoA 하이드롤라제, 6-하이드록시카프로에이트 데하이드로게나제 및 HMDA를 형성하는 트랜스아미나제;
    (l) 2-케토피멜레이트를 형성하는 호모시트레이트 신타제, 호모아코니타제(homoaconitase) 및 호모이소시트레이트 데하이드로게나제, 아디페이트 세미알데하이드로의 α-케토피멜레이트의 전환을 촉진하는 2-케토 데카복실라제, 2-아미노피멜레이트로의 α-케토피멜레이트의 전환을 촉진하는 2-아미노트랜스퍼라제, 2-아미노피멜레이트를 탈카복실화하고 6-ACA를 형성하는 2-아미노피멜레이트 데카복실라제, 6-아미노헥산알로의 6-ACA의 전환을 촉진하는 알데하이드 데하이드로게나제, 및 6-헥사메틸렌디아민으로의 6-아미노헥산알의 전환을 촉진하는 아미노트랜스퍼라제; 및
    (m) 글루타밀-CoA 트랜스퍼라제 및/또는 리가제, 베타-케토티올라제, 3-옥소-6-아미노피멜로일-CoA 옥시도리덕타제, 3-하이드록시-6-아미노피멜로일-CoA 데하이드라타제, 6-아미노-7-카복시헵트-2-에노일-CoA 리덕타제, 6-아미노피멜로일-CoA 리덕타제(알데하이드 형성), 2-아미노-7-옥소헵타노에이트 아미노트랜스퍼라제 및/또는 아미노화 옥시도리덕타제, 호모라이신 데카복실라제, 6-아미노피멜로일-CoA 하이드롤라제, 트랜스퍼라제 및/또는 리가제(ligase), 2-아미노피멜레이트 데카복실라제.
  145. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 유전적으로 조작된 미생물이, 3-옥소아디필-CoA 티올라제, 3-옥소아디필-CoA 데하이드로게나제, 3-하이드록시아디필-CoA 데하이드라타제, 5-카복시-2-펜테노일-CoA 리덕타제, 아디필-CoA 리덕타제, 6-ACA 트랜스아미나제 또는 데하이드로게나제, 3-옥소아디필-CoA:아실 CoA 트랜스퍼라제, 3-옥소아디페이트 데하이드로게나제, 3-하이드록시아디페이트 데하이드라타제, 5-카복시-2-펜테노에이트 리덕타제, 아디필-CoA 트랜스퍼라제, 리가제, 하이드롤라제, 6-ACA 트랜스퍼라제 또는 신세타제, 6-ACA-CoA 리덕타제, HMDA 트랜스아미나제 또는 데하이드로게나제, 아디페이트 리덕타제, 6-ACA 트랜스아미나제 또는 데하이드로게나제, 또는 6-ACA 리덕타제로 구성된 군으로부터 선택된, 적어도 하나의 HMD 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 화합물을 생성하기에 충분한 양으로 발현되는, HMD 합성 경로의 적어도 하나의 효소를 코딩하는 적어도 하나의 외생성 핵산을 갖는 HMD 합성 경로를 포함하는 것인 방법.
  146. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 유전적으로 조작된 미생물이 에스케리키아(Escherichia), 클렙시엘라(Klebsiella); 아내로바이오스피릴룸(Anaerobiospirillum) 속을 포함하는, 에어로모나달레스(Aeromonadales) 목, 석시니비브리오나세에(Succinivibrionaceae) 과; 악티노바실러스(Actinobacillus) 및 만헤이미아(Mannheimia) 속을 포함하는, 파스테우렐라레스(Pasteurellales) 목, 파스테우렐라세에(Pasteurellaceae) 과; 리조븀(Rhizobium) 속을 포함하는, 리조비알레스(Rhizobiales) 목, 브라디리조비아세에(Bradyrhizobiaceae) 과; 바실러스(Bacillus) 속을 포함하는, 바실라레스(Bacillales) 목, 바실라세에(Bacillaceae) 과; 각각 코리네박테륨(Corynebacterium) 속 및 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속을 포함하는, 악티노마이세탈레스(Actinomycetales) 목, 코리네박테리아세에(Corynebacteriaceae) 및 스트렙토마이세타세에(Streptomycetaceae) 과; 글루코노박터(Gluconobacter) 속을 포함하는, 로도스피릴라레스(Rhodospirillales) 목, 아세토박터라세에(Acetobacteraceae) 과; 자이모모나스(Zymomonas) 속을 포함하는, 스핑고모나달레스(Sphingomonadales) 목, 스핑고모나다세에(Sphingomonadaceae) 과; 각각 락토바실러스(Lactobacillus) 속 및 락토코커스(Lactococcus) 속을 포함하는, 락토바실라레스(Lactobacillales) 목, 락토바실라세에(Lactobacillaceae) 및 스트렙토코카세에(Streptococcaceae) 과; 클로스트리디알레스(Clostridiales) 목, 클로스트리디아세에(Clostridiaceae) 과, 클로스트리듐(Clostridium) 속; 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 알칼리필러스(Alkaliphilus) 속, 메틸로박테륨(Methylobacterium), 메틸로버사틸리스(Methyloversatilis), 메틸로코커스(Methylococcus), 메틸로사이스티스(Methylocystis) 및 하이포마이크로븀(Hyphomicrobium)을 포함하는, 슈도모나달레스(Pseudomonadales) 목, 슈도모나다세에(Pseudomonadaceae) 과; 사카로마이세스(Saccharomyces), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 및 피키아(Pichia) 속을 포함하는, 사카로마이세탈레스(Saccharomycetales) 목, 사카로마이세타세에(Saccaromycetaceae) 과; 야로위아(Yarrowia) 속을 포함하는, 사카로마이세탈레스(Saccharomycetales) 목, 디포다스카세에(Dipodascaceae) 과; 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 속을 포함하는, 스키조사카로마이세탈레스(Schizosaccharomycetales) 목, 스키조사카로마이세타세에(Schizosaccaromycetaceae) 과; 아스퍼질러스(Aspergillus) 속을 포함하는, 유로티알레스(Eurotiales) 목, 트리코코마세에(Trichocomaceae) 과; 및 리조퍼스(Rhizopus) 속을 포함하는, 뮤코랄레스(Mucorales) 목, 뮤코라세에(Mucoraceae) 과인 방법.
  147. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 유전적으로 조작된 미생물이 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 클렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 아내로바이오스피릴룸 석시니시프로두센스(Anaerobiospirillum succiniciproducens), 악티노바실러스 석시노제네스(Actinobacillus succinogenes), 만헤이미아 석시니시프로두센스(Mannheimia succiniciproducens), 리조븀 에틀리(Rhizobium etli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus Subtilis), 코리네박테륨 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxydans), 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 스트렙토마이세스 코엘리칼러(Streptomyces coelicolor), 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) 및 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 바실리스 슈도퍼머스(Bacillis pseudofirmus), 바실러스 할로두란스(Bacillus halodurans), 바실러스 알칼로필러스(Bacillus alcalophilus), 클로스트리듐 파라독숨(Clostridium paradoxum), 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 피키아 메탄올리카(Pichia methanolica), 칸디다 보이디니이(Candida boidinii), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 클루이베로마이세스 막시아너스(Kluyveromyces marxianus), 아스퍼질러스 테레우스(Aspergillus terreus), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 리조퍼스 아리저스(Rhizopus arrhizus), 리조버스 오리제(Rhizobus oryzae), 야로위아 리포라이티카(Yarrowia lipolytica), 이사첸키아 오리엔탈리스(Issatchenkia orientalis), 바실리스 슈도퍼머스(Bacillis pseudofirmus), 바실러스 할로두란스(Bacillus halodurans), 바실러스 알칼로필러스(Bacillus alcalophilus), 클로스트리듐 파라독숨(Clostridium paradoxum), 아쓰로스피라 플라텐시스(Arthrospira platensis), 바실러스 클라우시이(Bacillus clausii), 오세아노바실러스 이헤이엔시스(Oceanobacillus iheyensis), 알칼리필러스 메탈리레디젠스(Alkaliphilus metalliredigens), 알칼리필러스 오렘란디이(Alkaliphilus oremlandii), 바실러스 셀렌티리듀센스(Bacillus selentireducens), 데설포비브리오 알칼리파일즈(Desulfovibrio alkaliphiles), 데티오박터 알칼리파일즈(Dethiobacter alkaliphiles), 티오알칼리비브리오(Thioalkalivibrio) 종, 나트라내로비우스 써모필러스(Natranaerobius thermophilus), 알칼리림니콜라 에를리키이(Alkalilimnicola ehrlichii) 및 데설포나트로노스피라 티오디스뮤탄스(Desulfonatronospira thiodismutans)를 포함하는 비한정적 숙주 박테리아 종을 포함하는 것인 방법.
  148. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 유전적으로 조작된 미생물이 개선된 알칼리 내성을 위해 변경되어 있는 것인 방법.
  149. 선행 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 유전적으로 조작된 미생물이, 적어도 하나의 디아민 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 화합물을 생성하기에 충분한 양으로 발현되는, 디아민 합성 경로의 적어도 1종, 2종, 3종, 4종, 5종, 6종, 7종, 8종, 9종, 10종 또는 11종의 효소를 코딩하는 적어도 1종, 2종, 3종, 4종, 5종, 6종, 7종, 8종, 9종, 10종 또는 11종의 외생성 핵산을 갖는 디아민 합성 경로를 포함하는 것인 방법.
  150. 제149항에 있어서, 디아민이 헥사메틸렌디아민, 카다베린, 푸트라신, 헵타메틸렌디아민 또는 에틸렌디아민인 방법.
  151. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 배지가 수크로스, 글루코스, 갈락토스, 프럭토스, 만노스, 이소말토스, 자일로스, 판노스, 말토스, 아라비노스, 셀로바이오스 및 이들의 3-올리고머, 4-올리고머 또는 5-올리고머로 구성된 군으로부터 선택된, 유전적으로 조작된 미생물을 위한 당 탄소원을 포함하거나; 배지가 메탄올, 에탄올, 글리세롤, 포르메이트 및 지방산으로 구성된 군으로부터 선택된, 유전적으로 조작된 미생물을 위한 알코올 탄소원을 포함하거나; 배지가 합성 가스, 폐가스, 메탄, CO, CO2, 및 CO 또는 CO2와 H2의 임의의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된, 유전적으로 조작된 미생물을 위한 가스로부터의 탄소원을 포함하는 것인 방법.
  152. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항 또는 선행 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 유전적으로 조작된 미생물이, 적어도 하나의 DA 카보네이트류 및/또는 DA 카바메이트류, 바람직하게는 HMD 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 화합물을 생성하기에 충분한 양으로 발현되는, DA 합성 경로, 바람직하게는 HMD 합성 경로의 적어도 하나의 효소 및 탄산 안하이드라제 효소 또는 변이체를 코딩하는 적어도 2종의 외생성 핵산을 갖는 DA 합성 경로, 바람직하게는 HMD 합성 경로를 포함하는 것인 방법.
  153. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항 또는 선행 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 유전적으로 조작된 미생물이, 적어도 하나 이상의 DA 유리 염기, 바람직하게는 HMD 유리 염기, 및 이산화탄소를 생성하기에 충분한 양으로 발현되는, DA 합성 경로, 바람직하게는 HMD 합성 경로의 적어도 하나의 효소 및 탄산 안하이드라제 효소 또는 변이체를 코딩하는 적어도 2종의 외생성 핵산을 갖는 DA 합성 경로, 바람직하게는 HMD 합성 경로를 포함하는 것인 방법.
  154. DA를 포함하고 임의적으로 불순물을 포함하는, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항 또는 선행 청구항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 DA 조성물로서, 상기 불순물이 DA 카보네이트, DA 비카보네이트, DA 비스-비카보네이트, DA 카바메이트, DA 비스카바메이트, 또는 DA 이외의 질소 함유 화합물 중 하나 이상으로부터 선택되고, 상기 질소 함유 화합물이 아미노산, 단백질, 암모늄염, 우레아 및 발효 미생물로부터 유래하고, 임의적으로 상기 질소 함유 화합물이 약 0.01 내지 약 1000 ppm인 DA 조성물.
  155. 제154항의 DA를 포함하거나 사용함으로써 제조된 중합체.
  156. HMD 합성 경로의 적어도 하나의 효소를 코딩하는 적어도 하나의 외생성 핵산을 갖는 헥사메틸렌디아민 합성 경로, 및 CO2 이용가능성(availability)을 증가시키는 유전적 변경이 없는 유전적으로 조작된 미생물에 비해 CO2 이용가능성을 증가시켜 CO2 화합물로부터의 HMD 카보네이트류 및/또는 카바메이트류의 생성을 증가시키는 적어도 하나의 유전적 변경을 포함하는 유전적으로 조작된 미생물.
  157. 제156항에 있어서, 적어도 하나의 DA 카보네이트류 및/또는 DA 카바메이트류, 바람직하게는 HMD 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 화합물을 생성하기에 충분한 양으로 발현되는, DA 합성 경로, 바람직하게는 HMD 합성 경로의 적어도 하나의 효소 및 탄산 안하이드라제 효소 또는 변이체를 코딩하는 적어도 2종의 외생성 핵산을 갖는 DA 합성 경로, 바람직하게는 HMD 합성 경로를 포함하는 유전적으로 조작된 미생물.
  158. 제156항에 있어서, 적어도 하나 이상의 DA 유리 염기, 바람직하게는 HMD 유리 염기, 및 이산화탄소를 생성하기에 충분한 양으로 발현되는, DA 합성 경로, 바람직하게는 HMD 합성 경로의 적어도 하나의 효소 및 탄산 안하이드라제 효소 또는 변이체를 코딩하는 적어도 2종의 외생성 핵산을 갖는 DA 합성 경로, 바람직하게는 HMD 합성 경로를 포함하는 유전적으로 조작된 미생물.
  159. a) 배양된 배지에서 헥사메틸렌디아민(HMD) 카보네이트, HMD 비카보네이트, HMD 비스-비카보네이트, HMD 카바메이트 또는 HMD 비스카바메이트 중 하나 이상을 형성하기에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 배지에서 유전적으로 조작된 미생물을 배양하는 단계로서, 이산화탄소, 카보네이트, 비카보네이트 또는 탄산이 배양된 배지로서의 배지의 pH를 주로 조절하는 것인 단계;
    b) HMD 카보네이트, HMD 비카보네이트, HMD 비스-비카보네이트, 또는 HMD 카바메이트 또는 비스카바메이트를 HMD 유리 염기 및 이산화탄소로 전환시키는 단계; 및
    c) HMD 유리 염기를 단리하는 단계
    를 포함하는, 헥사메틸렌디아민(HMD)의 제조 방법.
  160. 제159항에 있어서, 이산화탄소, 카보네이트, 비카보네이트 또는 탄산 대 모든 다른 산들의 합계의 몰비가 1:1보다 더 큰 것인 방법.
  161. 제159항에 있어서, 이산화탄소, 카보네이트, 비카보네이트 또는 탄산이 외부로부터 첨가된 이산화탄소, 카보네이트, 비카보네이트 또는 탄산을 포함하는 것인 방법.
  162. 제159항에 있어서, 모든 다른 산들이 적어도 하나의 외부로부터 첨가된 다른 산을 포함하는 것인 방법.
  163. 제159항에 있어서, 외부로부터 첨가된 이산화탄소, 카보네이트, 비카보네이트 또는 탄산 대 외부로부터 첨가된 모든 다른 산들의 합계의 몰비가 1:1보다 더 큰 것인 방법.
  164. 제159항에 있어서, 발효 종료 시 pH가 11 미만인 방법.
  165. a) 헥사메틸렌디아민(HMD) 카보네이트, HMD 비카보네이트, HMD 비스-비카보네이트, 또는 HMD 카바메이트 또는 비스카바메이트 중 하나 이상을 형성하기에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 배지에서 유전적으로 조작된 미생물을 배양하는 단계로서, 퍼센트 용존 무기 탄소(DIC)가 40% 이상이고, DIC는 식 DIC/TDCA×100에 의해 결정되는 것인 단계;
    b) HMD 카보네이트, HMD 비카보네이트, HMD 비스-비카보네이트, 또는 HMD 카바메이트 또는 비스카바메이트를 HMD 유리 염기 및 이산화탄소로 전환시키는 단계; 및
    c) HMD 유리 염기를 단리하는 단계
    를 포함하는, 헥사메틸렌디아민(HMD)의 제조 방법.
  166. 제165항에 있어서, 발효 시작 시 DIC가 TDCA의 10% 이하인 방법.
  167. 제165항에 있어서, 발효 종료 시 DIC 대 HMD 비가 0.25:1 내지 3:1, 보다 바람직하게는 1.5:1 내지 2:1인 방법.
  168. 제165항에 있어서, 발효 종료 시 pH가 11 미만인 방법.
  169. a) 배지에서 헥사메틸렌디아민(HMD)을 생성하고 HMD 카보네이트, HMD 비카보네이트, HMD 비스-비카보네이트, HMD 카바메이트 또는 HMD 비스카바메이트 중 하나 이상을 형성하기에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 이산화탄소, 카보네이트, 비카보네이트 및 탄산 중 하나 이상을 포함하는 배지에서 유전적으로 조작된 미생물을 배양하는 단계로서, 배지 중의 카보네이트류 및/또는 카바메이트류의 적어도 40%가 HMD 카보네이트, HMD 비카보네이트, HMD 비스-비카보네이트 또는 HMD 카바메이트 중 하나 이상을 포함하는 것인 단계;
    b) HMD 카보네이트, HMD 비카보네이트, HMD 비스-비카보네이트 또는 HMD 카바메이트를 HMD 유리 염기 및 이산화탄소로 전환시키는 단계; 및
    c) HMD 유리 염기를 단리하는 단계
    를 포함하는, 헥사메틸렌디아민(HMD)의 제조 방법.
  170. 선행 청구항 중 어느 한 항에 있어서, HMD 카바메이트 및/또는 HMD 비스카바메이트가 존재하는 것인 방법.
  171. 선행 청구항 중 어느 한 항에 있어서, HMD 유리 염기가 존재하는 것인 방법.
  172. a) 카보네이트류 및/또는 카바메이트류를 형성하기에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 배지에서 유전적으로 조작된 미생물을 배양하는 단계로서, 배지 중의 카보네이트류 또는 카바메이트류의 적어도 40%가 헥사메틸렌디아민(HMD) 카보네이트, HMD 비카보네이트, HMD 비스-비카보네이트 또는 HMD 카바메이트 중 하나 이상을 포함하는 것인 단계;
    b) 세포를 포함하는 고체 분획으로부터 HMD가 농후한 액체 분획을 분리하는 단계;
    c) 상기 액체 분획으로부터 물을 제거하고, 상기 액체 분획으로부터 염을 제거하고, HMD를 정제하는 단계;
    d) 카보네이트류 또는 카바메이트류를 식 C6H16N2의 탈양성자화된 HMD 유리 염기로 전환시키는 단계; 및
    e) HMD 유리 염기를 단리하는 단계
    를 포함하는, 헥사메틸렌디아민(HMD)의 제조 방법.
  173. a) 이산화탄소, 카보네이트, 비카보네이트 또는 탄산의 존재 하에, 배양된 배지에서 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 중 하나 이상을 형성하기에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 발효기 내의 배지에서 유전적으로 조작된 미생물을 배양하는 단계;
    b) 배양된 배지를 멸균하고, 임의적으로 카보네이트류 및/또는 카바메이트류의 적어도 일부를 DA 유리 염기로 전환시키고 이산화탄소를 방출하는 단계;
    c) 배양된 배지로부터 고체를 제거하여, 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물을 형성하는 단계;
    d) 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물을 DA 유리 염기 혼합물 및 이산화탄소로 전환시키는 단계;
    e) DA 유리 염기 혼합물로부터 물을 제거하고, 임의적으로 물 및/또는 이산화탄소를 발효기로 재순환시키는 단계;
    f) 추출기에서 DA 유리 염기 혼합물을 유기 용매로 추출하여, 추출된 DA 유리 염기 용액 및 수성 라피네이트를 형성하고, 임의적으로 상기 수성 라피네이트를 추출기로 재순환시키는 단계;
    g) DA 유리 염기 용액을 증류하여, 정제된 DA 유리 염기 및 유기 용매를 형성하고, 임의적으로 상기 용매를 추출기로 재순환시키고, 임의적으로 원치 않는 불순물을 제거하는 단계; 및
    h) 정제된 DA 유리 염기를 단리하는 단계
    를 포함하는, DA의 제조 방법.
  174. a) 이산화탄소, 카보네이트, 비카보네이트 또는 탄산의 존재 하에, 배양된 배지에서 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 중 하나 이상을 형성하기에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 발효기 내의 배지에서 유전적으로 조작된 미생물을 배양하는 단계;
    b) 배양된 배지로부터 고체를 제거하여, 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물을 형성하는 단계;
    c) 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물을 DA 유리 염기 혼합물 및 이산화탄소로 전환시키는 단계;
    d) DA 유리 염기 혼합물로부터 물을 제거하고, 임의적으로 물 및/또는 이산화탄소를 발효기로 재순환시키는 단계;
    e) 추출기에서 DA 유리 염기 혼합물을 유기 용매로 추출하여, 추출된 DA 유리 염기 용액 및 수성 라피네이트를 형성하고, 임의적으로 상기 수성 라피네이트를 추출기로 재순환시키는 단계;
    f) DA 유리 염기 용액을 증류하여, 정제된 DA 유리 염기 및 유기 용매를 형성하고, 임의적으로 상기 용매를 추출기로 재순환시키고, 임의적으로 원치 않는 불순물을 제거하는 단계; 및
    g) 정제된 DA 유리 염기를 단리하는 단계
    를 포함하는, DA의 제조 방법.
  175. a) 이산화탄소, 카보네이트, 비카보네이트 또는 탄산의 존재 하에, 배양된 배지에서 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 중 하나 이상을 형성하기에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 발효기 내의 배지에서 유전적으로 조작된 미생물을 배양하는 단계;
    b) 임의적으로, 배양된 배지를 멸균하는 단계;
    c) 배양된 배지로부터 고체를 제거하여, 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물을 형성하는 단계;
    d) 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물을 DA 유리 염기 혼합물 및 이산화탄소로 전환시키고, 임의적으로 이산화탄소를 발효기로 재순환시키는 단계;
    e) DA 유리 염기 혼합물로부터 물을 제거하고, 임의적으로 물 및/또는 이산화탄소를 발효기로 재순환시키는 단계;
    f) 추출기에서 DA 유리 염기 혼합물을 유기 용매로 추출하여, 추출된 DA 유리 염기 용액 및 수성 라피네이트를 형성하고, 임의적으로 상기 수성 라피네이트를 추출기로 재순환시키는 단계;
    g) DA 유리 염기 용액을 증류하여, 정제된 DA 유리 염기 및 유기 용매를 형성하고, 임의적으로 상기 용매를 추출기로 재순환시키고, 임의적으로 원치 않는 불순물을 제거하는 단계; 및
    h) 정제된 DA 유리 염기를 단리하는 단계
    를 포함하는, DA의 제조 방법.
  176. a) 이산화탄소, 카보네이트, 비카보네이트 또는 탄산의 존재 하에, 배양된 배지에서 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 중 하나 이상을 형성하기에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 발효기 내의 배지에서 유전적으로 조작된 미생물을 배양하는 단계;
    b) 배양된 배지를 멸균하고, 임의적으로 카보네이트류 및/또는 카바메이트류의 적어도 일부를 DA 유리 염기로 전환시키고 이산화탄소를 방출하는 단계;
    c) 배양된 배지로부터 고체를 제거하여, 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물을 형성하는 단계;
    d) 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물로부터 물을 제거하고, 임의적으로 물 및/또는 이산화탄소를 발효기로 재순환시키는 단계;
    e) 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물을 DA 유리 염기 혼합물 및 이산화탄소로 전환시키는 단계;
    f) DA 유리 염기 혼합물로부터 물을 제거하고, 임의적으로 물 및/또는 이산화탄소를 발효기로 재순환시키는 단계;
    g) 추출기에서 DA 유리 염기 혼합물을 유기 용매로 추출하여, 추출된 DA 유리 염기 용액 및 수성 라피네이트를 형성하고, 임의적으로 상기 수성 라피네이트를 추출기로 재순환시키는 단계;
    h) DA 유리 염기 용액을 증류하여, 정제된 DA 유리 염기 및 유기 용매를 형성하고, 임의적으로 상기 용매를 추출기로 재순환시키고, 임의적으로 원치 않는 불순물을 제거하는 단계; 및
    i) 정제된 DA 유리 염기를 단리하는 단계
    를 포함하는, DA의 제조 방법.
  177. a) 이산화탄소, 카보네이트, 비카보네이트 또는 탄산의 존재 하에, 배양된 배지에서 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 중 하나 이상을 형성하기에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 발효기 내의 배지에서 유전적으로 조작된 미생물을 배양하는 단계;
    b) 배양된 배지로부터 고체를 제거하여, 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물을 형성하는 단계;
    c) 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물로부터 물을 제거하고, 임의적으로 물 및/또는 이산화탄소를 발효기로 재순환시키는 단계;
    d) 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물을 DA 유리 염기 혼합물 및 이산화탄소로 전환시키는 단계;
    e) DA 유리 염기 혼합물로부터 물을 제거하고, 임의적으로 물 및/또는 이산화탄소를 발효기로 재순환시키는 단계;
    f) 추출기에서 DA 유리 염기 혼합물을 유기 용매로 추출하여, 추출된 DA 유리 염기 용액 및 수성 라피네이트를 형성하고, 임의적으로 상기 수성 라피네이트를 추출기로 재순환시키는 단계;
    g) DA 유리 염기 용액을 증류하여, 정제된 DA 유리 염기 및 유기 용매를 형성하고, 임의적으로 상기 용매를 추출기로 재순환시키고, 임의적으로 원치 않는 불순물을 제거하는 단계; 및
    h) 정제된 DA 유리 염기를 단리하는 단계
    를 포함하는, DA의 제조 방법.
  178. a) 이산화탄소, 카보네이트, 비카보네이트 또는 탄산의 존재 하에, 배양된 배지에서 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 중 하나 이상을 형성하기에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 발효기 내의 배지에서 유전적으로 조작된 미생물을 배양하는 단계;
    b) 임의적으로, 배양된 배지를 멸균하는 단계;
    c) 배양된 배지로부터 고체를 제거하여, 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물을 형성하는 단계;
    d) 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물로부터 물을 제거하고, 임의적으로 물 및/또는 이산화탄소를 발효기로 재순환시키는 단계;
    e) 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물을 DA 유리 염기 혼합물 및 이산화탄소로 전환시키고, 임의적으로 이산화탄소를 발효기로 재순환시키는 단계;
    f) DA 유리 염기 혼합물로부터 물을 제거하고, 임의적으로 물 및/또는 이산화탄소를 발효기로 재순환시키는 단계;
    g) 추출기에서 DA 유리 염기 혼합물을 유기 용매로 추출하여, 추출된 DA 유리 염기 용액 및 수성 라피네이트를 형성하고, 임의적으로 상기 수성 라피네이트를 추출기로 재순환시키는 단계;
    h) DA 유리 염기 용액을 증류하여, 정제된 DA 유리 염기 및 유기 용매를 형성하고, 임의적으로 상기 용매를 추출기로 재순환시키고, 임의적으로 원치 않는 불순물을 제거하는 단계; 및
    i) 정제된 DA 유리 염기를 단리하는 단계
    를 포함하는, DA의 제조 방법.
  179. a) 이산화탄소, 카보네이트, 비카보네이트 또는 탄산의 존재 하에, 배양된 배지에서 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 중 하나 이상을 형성하기에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 발효기 내의 배지에서 유전적으로 조작된 미생물을 배양하는 단계;
    b) 배양된 배지를 멸균하고, 임의적으로 카보네이트류 및/또는 카바메이트류의 적어도 일부를 DA 유리 염기 및 이산화탄소로 전환시키는 단계;
    c) 배양된 배지로부터 고체를 제거하여, 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물을 형성하는 단계;
    d) 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물로부터 물을 제거하고, 임의적으로 물 및/또는 이산화탄소를 발효기로 재순환시키는 단계;
    e) 임의적으로, 배양된 배지로부터의 카보네이트류 및/또는 카바메이트류를 직접적으로 전환시켜 DA 유리 염기 혼합물을 형성하고, 임의적으로, 발효기로 재순환될 수 있는 물 및/또는 이산화탄소를 방출하는 단계; 및
    f) 정제된 DA 유리 염기를 단리하는 단계
    를 포함하는, DA의 제조 방법.
  180. a) 이산화탄소, 카보네이트, 비카보네이트 또는 탄산의 존재 하에, 배양된 배지에서 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 중 하나 이상을 형성하기에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 발효기 내의 배지에서 유전적으로 조작된 미생물을 배양하는 단계;
    b) 배양된 배지로부터 고체를 제거하여, 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물을 형성하는 단계;
    c) 임의적으로, 배양된 배지로부터의 카보네이트류 및/또는 카바메이트류를 직접적으로 전환시켜 DA 유리 염기 혼합물을 형성하고, 임의적으로, 발효기로 재순환될 수 있는 물 및/또는 이산화탄소를 방출하는 단계;
    d) 임의적으로, 배양된 배지로부터의 카보네이트류 및/또는 카바메이트류를 직접적으로 전환시켜 DA 유리 염기 혼합물을 형성하고, 임의적으로, 발효기로 재순환될 수 있는 물 및/또는 이산화탄소를 방출하는 단계; 및
    e) 정제된 DA 유리 염기를 단리하는 단계
    를 포함하는, DA의 제조 방법.
  181. a) 이산화탄소, 카보네이트, 비카보네이트 또는 탄산의 존재 하에, 배양된 배지에서 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 중 하나 이상을 형성하기에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 발효기 내의 배지에서 유전적으로 조작된 미생물을 배양하는 단계;
    b) 임의적으로, 배양된 배지를 멸균하는 단계;
    c) 배양된 배지로부터 고체를 제거하여, 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물을 형성하는 단계;
    d) 임의적으로, 배양된 배지로부터의 카보네이트류 및/또는 카바메이트류를 직접적으로 전환시켜 DA 유리 염기 혼합물을 형성하고, 임의적으로, 발효기로 재순환될 수 있는 물 및/또는 이산화탄소를 방출하는 단계;
    e) 임의적으로, 배양된 배지로부터의 카보네이트류 및/또는 카바메이트류를 직접적으로 전환시켜 DA 유리 염기 혼합물을 형성하고, 임의적으로, 발효기로 재순환될 수 있는 물 및/또는 이산화탄소를 방출하는 단계; 및
    f) 정제된 DA 유리 염기를 단리하는 단계
    를 포함하는, DA의 제조 방법.
  182. a) 이산화탄소, 카보네이트, 비카보네이트 또는 탄산의 존재 하에, 배양된 배지에서 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 중 하나 이상을 형성하기에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 발효기 내의 배지에서 유전적으로 조작된 미생물을 배양하는 단계;
    b) 배양된 배지를 멸균하고, 임의적으로 카보네이트류 및/또는 카바메이트류의 적어도 일부를 DA 유리 염기 및 이산화탄소로 전환시키는 단계;
    c) 배양된 배지로부터 고체를 제거하여, 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물을 형성하는 단계;
    d) 임의적으로, 배양된 배지로부터의 카보네이트류 및/또는 카바메이트류를 직접적으로 전환시켜 DA 유리 염기 혼합물을 형성하고, 임의적으로, 발효기로 재순환될 수 있는 물 및/또는 이산화탄소를 방출하는 단계; 및
    e) 정제된 DA 유리 염기를 단리하는 단계
    를 포함하는, DA의 제조 방법.
  183. a) 이산화탄소, 카보네이트, 비카보네이트 또는 탄산의 존재 하에, 배양된 배지에서 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 중 하나 이상을 형성하기에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 발효기 내의 배지에서 유전적으로 조작된 미생물을 배양하는 단계;
    b) 배양된 배지로부터 고체를 제거하여, 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물을 형성하는 단계;
    c) 임의적으로, 배양된 배지로부터의 카보네이트류 및/또는 카바메이트류를 직접적으로 전환시켜 DA 유리 염기 혼합물을 형성하고, 임의적으로, 발효기로 재순환될 수 있는 물 및/또는 이산화탄소를 방출하는 단계; 및
    d) 정제된 DA 유리 염기를 단리하는 단계
    를 포함하는, DA의 제조 방법.
  184. a) 이산화탄소, 카보네이트, 비카보네이트 또는 탄산의 존재 하에, 배양된 배지에서 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 중 하나 이상을 형성하기에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 발효기 내의 배지에서 유전적으로 조작된 미생물을 배양하는 단계;
    b) 임의적으로, 배양된 배지를 멸균하는 단계;
    c) 배양된 배지로부터 고체를 제거하여, 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물을 형성하는 단계;
    d) 임의적으로, 배양된 배지로부터의 카보네이트류 및/또는 카바메이트류를 직접적으로 전환시켜 DA 유리 염기 혼합물을 형성하고, 임의적으로, 발효기로 재순환될 수 있는 물 및/또는 이산화탄소를 방출하는 단계; 및
    e) 정제된 DA 유리 염기를 단리하는 단계
    를 포함하는, DA의 제조 방법.
  185. a) 이산화탄소, 카보네이트, 비카보네이트 또는 탄산의 존재 하에, 배양된 배지에서 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 중 하나 이상을 형성하기에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 발효기 내의 배지에서 유전적으로 조작된 미생물을 배양하는 단계;
    b) 배양된 배지를 멸균하고, 임의적으로 카보네이트류 및/또는 카바메이트류의 적어도 일부를 DA 유리 염기 및 이산화탄소로 전환시키는 단계;
    c) 배양된 배지로부터 고체를 제거하여, 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물을 형성하는 단계;
    d) 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물을 DA 유리 염기 혼합물 및 이산화탄소로 전환시키고, 임의적으로 이산화탄소를 발효기로 재순환시키는 단계;
    e) 임의적으로, 배양된 배지로부터의 카보네이트류 및/또는 카바메이트류를 직접적으로 전환시켜 DA 유리 염기 혼합물을 형성하고, 임의적으로, 발효기로 재순환될 수 있는 물 및/또는 이산화탄소를 방출하는 단계; 및
    f) 정제된 DA 유리 염기를 단리하는 단계
    를 포함하는, DA의 제조 방법.
  186. a) 이산화탄소, 카보네이트, 비카보네이트 또는 탄산의 존재 하에, 배양된 배지에서 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 중 하나 이상을 형성하기에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 발효기 내의 배지에서 유전적으로 조작된 미생물을 배양하는 단계;
    b) 배양된 배지를 멸균하고, 임의적으로 카보네이트류 및/또는 카바메이트류의 적어도 일부를 DA 유리 염기 및 이산화탄소로 전환시키는 단계;
    c) 배양된 배지로부터 고체를 제거하여, 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물을 형성하는 단계;
    d) 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물로부터 물을 제거하고, 임의적으로 물 및/또는 이산화탄소를 발효기로 재순환시키는 단계;
    e) 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물을 DA 유리 염기 혼합물 및 이산화탄소로 전환시키고, 임의적으로 이산화탄소를 발효기로 재순환시키는 단계;
    f) 임의적으로, 배양된 배지로부터의 카보네이트류 및/또는 카바메이트류를 직접적으로 전환시켜 DA 유리 염기 혼합물을 형성하고, 임의적으로, 발효기로 재순환될 수 있는 물 및/또는 이산화탄소를 방출하는 단계; 및
    g) 정제된 DA 유리 염기를 단리하는 단계
    를 포함하는, DA의 제조 방법.
  187. a) 이산화탄소, 카보네이트, 비카보네이트 또는 탄산의 존재 하에, 배양된 배지에서 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 중 하나 이상을 형성하기에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 발효기 내의 배지에서 유전적으로 조작된 미생물을 배양하는 단계;
    b) 배양된 배지로부터 고체를 제거하여, 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물을 형성하는 단계;
    c) 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물로부터 물을 제거하고, 임의적으로 물 및/또는 이산화탄소를 발효기로 재순환시키는 단계;
    d) 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물을 DA 유리 염기 혼합물 및 이산화탄소로 전환시키고, 임의적으로 이산화탄소를 발효기로 재순환시키는 단계;
    e) 임의적으로, 배양된 배지로부터의 카보네이트류 및/또는 카바메이트류를 직접적으로 전환시켜 DA 유리 염기 혼합물을 형성하고, 임의적으로, 발효기로 재순환될 수 있는 물 및/또는 이산화탄소를 방출하는 단계; 및
    f) 정제된 DA 유리 염기를 단리하는 단계
    를 포함하는, DA의 제조 방법.
  188. a) 이산화탄소, 카보네이트, 비카보네이트 또는 탄산의 존재 하에, 배양된 배지에서 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 중 하나 이상을 형성하기에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 발효기 내의 배지에서 유전적으로 조작된 미생물을 배양하는 단계;
    b) 배양된 배지로부터 고체를 제거하여, 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물을 형성하는 단계;
    c) 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물을 DA 유리 염기 혼합물 및 이산화탄소로 전환시키고, 임의적으로 이산화탄소를 발효기로 재순환시키는 단계;
    d) 임의적으로, 배양된 배지로부터의 카보네이트류 및/또는 카바메이트류를 직접적으로 전환시켜 DA 유리 염기 혼합물을 형성하고, 임의적으로, 발효기로 재순환될 수 있는 물 및/또는 이산화탄소를 방출하는 단계; 및
    e) 정제된 DA 유리 염기를 단리하는 단계
    를 포함하는, DA의 제조 방법.
  189. a) 이산화탄소, 카보네이트, 비카보네이트 또는 탄산의 존재 하에, 배양된 배지에서 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 중 하나 이상을 형성하기에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 발효기 내의 배지에서 유전적으로 조작된 미생물을 배양하는 단계;
    b) 임의적으로, 배양된 배지를 멸균하는 단계;
    c) 배양된 배지로부터 고체를 제거하여, 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물을 형성하는 단계;
    d) 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물을 DA 유리 염기 혼합물 및 이산화탄소로 전환시키고, 임의적으로 이산화탄소를 발효기로 재순환시키는 단계;
    e) 임의적으로, 배양된 배지로부터의 카보네이트류 및/또는 카바메이트류를 직접적으로 전환시켜 DA 유리 염기 혼합물을 형성하고, 임의적으로, 발효기로 재순환될 수 있는 물 및/또는 이산화탄소를 방출하는 단계; 및
    f) 정제된 DA 유리 염기를 단리하는 단계
    를 포함하는, DA의 제조 방법.
  190. a) 이산화탄소, 카보네이트, 비카보네이트 또는 탄산의 존재 하에, 배양된 배지에서 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 중 하나 이상을 형성하기에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 발효기 내의 배지에서 유전적으로 조작된 미생물을 배양하는 단계;
    b) 임의적으로, 배양된 배지를 멸균하는 단계;
    c) 배양된 배지로부터 고체를 제거하여, 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물을 형성하는 단계;
    d) 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물로부터 물을 제거하고, 임의적으로 물 및/또는 이산화탄소를 발효기로 재순환시키는 단계;
    e) 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물을 DA 유리 염기 혼합물 및 이산화탄소로 전환시키고, 임의적으로 이산화탄소를 발효기로 재순환시키는 단계;
    f) 임의적으로, 배양된 배지로부터의 카보네이트류 및/또는 카바메이트류를 직접적으로 전환시켜 DA 유리 염기 혼합물을 형성하고, 임의적으로, 발효기로 재순환될 수 있는 물 및/또는 이산화탄소를 방출하는 단계; 및
    g) 정제된 DA 유리 염기를 단리하는 단계
    를 포함하는, DA의 제조 방법.
  191. a) 이산화탄소, 카보네이트, 비카보네이트 또는 탄산의 존재 하에, 배양된 배지에서 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 중 하나 이상을 형성하기에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 발효기 내의 배지에서 유전적으로 조작된 미생물을 배양하는 단계;
    b) 배양된 배지를 멸균하고, 임의적으로 카보네이트류 및/또는 카바메이트류의 적어도 일부를 DA 유리 염기 및 이산화탄소로 전환시키는 단계;
    c) 배양된 배지로부터 고체를 제거하여, 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물을 형성하는 단계;
    d) 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물을 DA 유리 염기 혼합물 및 이산화탄소로 전환시키고, 임의적으로 이산화탄소를 발효기로 재순환시키는 단계;
    e) 수성 염기를 첨가하여 DA 유리 염기 혼합물로부터 카보네이트류 및/또는 카바메이트류를 제거하는 단계;
    f) 추출기에서 DA 유리 염기 혼합물을 유기 용매로 추출하여, 추출된 DA 유리 염기 용액 및 수성 라피네이트를 형성하고, 임의적으로 상기 수성 라피네이트를 추출기로 재순환시키는 단계;
    g) DA 유리 염기 용액을 증류하여, 정제된 DA 유리 염기 및 유기 용매를 형성하고, 임의적으로 상기 용매를 추출기로 재순환시키고, 임의적으로 원치 않는 불순물을 제거하는 단계; 및
    h) 정제된 DA 유리 염기를 단리하는 단계
    를 포함하는, DA의 제조 방법.
  192. a) 이산화탄소, 카보네이트, 비카보네이트 또는 탄산의 존재 하에, 배양된 배지에서 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 중 하나 이상을 형성하기에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 발효기 내의 배지에서 유전적으로 조작된 미생물을 배양하는 단계;
    b) 배양된 배지를 멸균하고, 임의적으로 카보네이트류 및/또는 카바메이트류의 적어도 일부를 DA 유리 염기 및 이산화탄소로 전환시키는 단계;
    c) 배양된 배지로부터 고체를 제거하여, 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물을 형성하는 단계;
    d) 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물로부터 물을 제거하고, 임의적으로 물 및/또는 이산화탄소를 발효기로 재순환시키는 단계;
    e) 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물을 DA 유리 염기 혼합물 및 이산화탄소로 전환시키고, 임의적으로 이산화탄소를 발효기로 재순환시키는 단계;
    f) 수성 염기를 첨가하여 DA 유리 염기 혼합물로부터 카보네이트류 및/또는 카바메이트류를 제거하는 단계;
    g) 추출기에서 DA 유리 염기 혼합물을 유기 용매로 추출하여, 추출된 DA 유리 염기 용액 및 수성 라피네이트를 형성하고, 임의적으로 상기 수성 라피네이트를 추출기로 재순환시키는 단계;
    h) DA 유리 염기 용액을 증류하여, 정제된 DA 유리 염기 및 유기 용매를 형성하고, 임의적으로 상기 용매를 추출기로 재순환시키고, 임의적으로 원치 않는 불순물을 제거하는 단계; 및
    i) 정제된 DA 유리 염기를 단리하는 단계
    를 포함하는, DA의 제조 방법.
  193. a) 이산화탄소, 카보네이트, 비카보네이트 또는 탄산의 존재 하에, 배양된 배지에서 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 중 하나 이상을 형성하기에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 발효기 내의 배지에서 유전적으로 조작된 미생물을 배양하는 단계;
    b) 배양된 배지로부터 고체를 제거하여, 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물을 형성하는 단계;
    c) 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물을 DA 유리 염기 혼합물 및 이산화탄소로 전환시키고, 임의적으로 이산화탄소를 발효기로 재순환시키는 단계;
    d) 수성 염기를 첨가하여 DA 유리 염기 혼합물로부터 카보네이트류 및/또는 카바메이트류를 제거하는 단계;
    e) 추출기에서 DA 유리 염기 혼합물을 유기 용매로 추출하여, 추출된 DA 유리 염기 용액 및 수성 라피네이트를 형성하고, 임의적으로 상기 수성 라피네이트를 추출기로 재순환시키는 단계;
    f) DA 유리 염기 용액을 증류하여, 정제된 DA 유리 염기 및 유기 용매를 형성하고, 임의적으로 상기 용매를 추출기로 재순환시키고, 임의적으로 원치 않는 불순물을 제거하는 단계; 및
    g) 정제된 DA 유리 염기를 단리하는 단계
    를 포함하는, DA의 제조 방법.
  194. a) 이산화탄소, 카보네이트, 비카보네이트 또는 탄산의 존재 하에, 배양된 배지에서 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 중 하나 이상을 형성하기에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 발효기 내의 배지에서 유전적으로 조작된 미생물을 배양하는 단계;
    b) 배양된 배지로부터 고체를 제거하여, 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물을 형성하는 단계;
    c) 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물로부터 물을 제거하고, 임의적으로 물 및/또는 이산화탄소를 발효기로 재순환시키는 단계;
    d) 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물을 DA 유리 염기 혼합물 및 이산화탄소로 전환시키고, 임의적으로 이산화탄소를 발효기로 재순환시키는 단계;
    e) 수성 염기를 첨가하여 DA 유리 염기 혼합물로부터 카보네이트류 및/또는 카바메이트류를 제거하는 단계;
    f) 추출기에서 DA 유리 염기 혼합물을 유기 용매로 추출하여, 추출된 DA 유리 염기 용액 및 수성 라피네이트를 형성하고, 임의적으로 상기 수성 라피네이트를 추출기로 재순환시키는 단계;
    g) DA 유리 염기 용액을 증류하여, 정제된 DA 유리 염기 및 유기 용매를 형성하고, 임의적으로 상기 용매를 추출기로 재순환시키고, 임의적으로 원치 않는 불순물을 제거하는 단계; 및
    h) 정제된 DA 유리 염기를 단리하는 단계
    를 포함하는, DA의 제조 방법.
  195. a) 이산화탄소, 카보네이트, 비카보네이트 또는 탄산의 존재 하에, 배양된 배지에서 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 중 하나 이상을 형성하기에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 발효기 내의 배지에서 유전적으로 조작된 미생물을 배양하는 단계;
    b) 임의적으로, 배양된 배지를 멸균하는 단계;
    c) 배양된 배지로부터 고체를 제거하여, 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물을 형성하는 단계;
    d) 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물을 DA 유리 염기 혼합물 및 이산화탄소로 전환시키고, 임의적으로 이산화탄소를 발효기로 재순환시키는 단계;
    e) 수성 염기를 첨가하여 DA 유리 염기 혼합물로부터 카보네이트류 및/또는 카바메이트류를 제거하는 단계;
    f) 추출기에서 DA 유리 염기 혼합물을 유기 용매로 추출하여, 추출된 DA 유리 염기 용액 및 수성 라피네이트를 형성하고, 임의적으로 상기 수성 라피네이트를 추출기로 재순환시키는 단계;
    g) DA 유리 염기 용액을 증류하여, 정제된 DA 유리 염기 및 유기 용매를 형성하고, 임의적으로 상기 용매를 추출기로 재순환시키고, 임의적으로 원치 않는 불순물을 제거하는 단계; 및
    h) 정제된 DA 유리 염기를 단리하는 단계
    를 포함하는, DA의 제조 방법.
  196. a) 이산화탄소, 카보네이트, 비카보네이트 또는 탄산의 존재 하에, 배양된 배지에서 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 중 하나 이상을 형성하기에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 발효기 내의 배지에서 유전적으로 조작된 미생물을 배양하는 단계;
    b) 임의적으로, 배양된 배지를 멸균하는 단계;
    c) 배양된 배지로부터 고체를 제거하여, 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물을 형성하는 단계;
    d) 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물로부터 물을 제거하고, 임의적으로 물 및/또는 이산화탄소를 발효기로 재순환시키는 단계;
    e) 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물을 DA 유리 염기 혼합물 및 이산화탄소로 전환시키고, 임의적으로 이산화탄소를 발효기로 재순환시키는 단계;
    f) 수성 염기를 첨가하여 DA 유리 염기 혼합물로부터 카보네이트류 및/또는 카바메이트류를 제거하는 단계;
    g) 추출기에서 DA 유리 염기 혼합물을 유기 용매로 추출하여, 추출된 DA 유리 염기 용액 및 수성 라피네이트를 형성하고, 임의적으로 상기 수성 라피네이트를 추출기로 재순환시키는 단계;
    h) DA 유리 염기 용액을 증류하여, 정제된 DA 유리 염기 및 유기 용매를 형성하고, 임의적으로 상기 용매를 추출기로 재순환시키고, 임의적으로 원치 않는 불순물을 제거하는 단계; 및
    i) 정제된 DA 유리 염기를 단리하는 단계
    를 포함하는, DA의 제조 방법.
  197. a) 이산화탄소, 카보네이트, 비카보네이트 또는 탄산의 존재 하에, 배양된 배지에서 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 중 하나 이상을 형성하기에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 발효기 내의 배지에서 유전적으로 조작된 미생물을 배양하는 단계;
    b) 배양된 배지를 멸균하고, 임의적으로 카보네이트류 및/또는 카바메이트류의 적어도 일부를 DA 유리 염기 및 이산화탄소로 전환시키는 단계;
    c) 배양된 배지로부터 고체를 제거하여, 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물을 형성하는 단계;
    d) 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물을 DA 유리 염기 혼합물 및 이산화탄소로 전환시키고, 임의적으로 이산화탄소를 발효기로 재순환시키는 단계;
    e) DA 유리 염기 혼합물로부터 물을 제거하고, 임의적으로 물 및/또는 이산화탄소를 발효기로 재순환시키는 단계;
    g) 수성 염기를 첨가하여 DA 유리 염기 혼합물로부터 카보네이트류 및/또는 카바메이트류를 제거하는 단계;
    h) 추출기에서 DA 유리 염기 혼합물을 유기 용매로 추출하여, 추출된 DA 유리 염기 용액 및 수성 라피네이트를 형성하고, 임의적으로 상기 수성 라피네이트를 추출기로 재순환시키는 단계;
    i) DA 유리 염기 용액을 증류하여, 정제된 DA 유리 염기 및 유기 용매를 형성하고, 임의적으로 상기 용매를 추출기로 재순환시키고, 임의적으로 원치 않는 불순물을 제거하는 단계; 및
    j) 정제된 DA 유리 염기를 단리하는 단계
    를 포함하는, DA의 제조 방법.
  198. a) 이산화탄소, 카보네이트, 비카보네이트 또는 탄산의 존재 하에, 배양된 배지에서 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 중 하나 이상을 형성하기에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 발효기 내의 배지에서 유전적으로 조작된 미생물을 배양하는 단계;
    b) 배양된 배지를 멸균하고, 임의적으로 카보네이트류 및/또는 카바메이트류의 적어도 일부를 DA 유리 염기 및 이산화탄소로 전환시키는 단계;
    c) 배양된 배지로부터 고체를 제거하여, 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물을 형성하는 단계;
    d) 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물로부터 물을 제거하고, 임의적으로 물 및/또는 이산화탄소를 발효기로 재순환시키는 단계;
    e) 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물을 DA 유리 염기 혼합물 및 이산화탄소로 전환시키고, 임의적으로 이산화탄소를 발효기로 재순환시키는 단계;
    f) DA 유리 염기 혼합물로부터 물을 제거하고, 임의적으로 물 및/또는 이산화탄소를 발효기로 재순환시키는 단계;
    g) 수성 염기를 첨가하여 DA 유리 염기 혼합물로부터 카보네이트류 및/또는 카바메이트류를 제거하는 단계;
    h) 추출기에서 DA 유리 염기 혼합물을 유기 용매로 추출하여, 추출된 DA 유리 염기 용액 및 수성 라피네이트를 형성하고, 임의적으로 상기 수성 라피네이트를 추출기로 재순환시키는 단계;
    i) DA 유리 염기 용액을 증류하여, 정제된 DA 유리 염기 및 유기 용매를 형성하고, 임의적으로 상기 용매를 추출기로 재순환시키고, 임의적으로 원치 않는 불순물을 제거하는 단계; 및
    j) 정제된 DA 유리 염기를 단리하는 단계
    를 포함하는, DA의 제조 방법.
  199. a) 이산화탄소, 카보네이트, 비카보네이트 또는 탄산의 존재 하에, 배양된 배지에서 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 중 하나 이상을 형성하기에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 발효기 내의 배지에서 유전적으로 조작된 미생물을 배양하는 단계;
    b) 배양된 배지로부터 고체를 제거하여, 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물을 형성하는 단계;
    c) 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물을 DA 유리 염기 혼합물 및 이산화탄소로 전환시키고, 임의적으로 이산화탄소를 발효기로 재순환시키는 단계;
    d) DA 유리 염기 혼합물로부터 물을 제거하고, 임의적으로 물 및/또는 이산화탄소를 발효기로 재순환시키는 단계;
    e) 수성 염기를 첨가하여 DA 유리 염기 혼합물로부터 카보네이트류 및/또는 카바메이트류를 제거하는 단계;
    f) 추출기에서 DA 유리 염기 혼합물을 유기 용매로 추출하여, 추출된 DA 유리 염기 용액 및 수성 라피네이트를 형성하고, 임의적으로 상기 수성 라피네이트를 추출기로 재순환시키는 단계;
    g) DA 유리 염기 용액을 증류하여, 정제된 DA 유리 염기 및 유기 용매를 형성하고, 임의적으로 상기 용매를 추출기로 재순환시키고, 임의적으로 원치 않는 불순물을 제거하는 단계; 및
    h) 정제된 DA 유리 염기를 단리하는 단계
    를 포함하는, DA의 제조 방법.
  200. a) 이산화탄소, 카보네이트, 비카보네이트 또는 탄산의 존재 하에, 배양된 배지에서 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 중 하나 이상을 형성하기에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 발효기 내의 배지에서 유전적으로 조작된 미생물을 배양하는 단계;
    b) 배양된 배지로부터 고체를 제거하여, 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물을 형성하는 단계;
    c) 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물로부터 물을 제거하고, 임의적으로 물 및/또는 이산화탄소를 발효기로 재순환시키는 단계;
    d) 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물을 DA 유리 염기 혼합물 및 이산화탄소로 전환시키고, 임의적으로 이산화탄소를 발효기로 재순환시키는 단계;
    e) DA 유리 염기 혼합물로부터 물을 제거하고, 임의적으로 물 및/또는 이산화탄소를 발효기로 재순환시키는 단계;
    f) 수성 염기를 첨가하여 DA 유리 염기 혼합물로부터 카보네이트류 및/또는 카바메이트류를 제거하는 단계;
    g) 추출기에서 DA 유리 염기 혼합물을 유기 용매로 추출하여, 추출된 DA 유리 염기 용액 및 수성 라피네이트를 형성하고, 임의적으로 상기 수성 라피네이트를 추출기로 재순환시키는 단계;
    h) DA 유리 염기 용액을 증류하여, 정제된 DA 유리 염기 및 유기 용매를 형성하고, 임의적으로 상기 용매를 추출기로 재순환시키고, 임의적으로 원치 않는 불순물을 제거하는 단계; 및
    i) 정제된 DA 유리 염기를 단리하는 단계
    를 포함하는, DA의 제조 방법.
  201. a) 이산화탄소, 카보네이트, 비카보네이트 또는 탄산의 존재 하에, 배양된 배지에서 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 중 하나 이상을 형성하기에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 발효기 내의 배지에서 유전적으로 조작된 미생물을 배양하는 단계;
    b) 임의적으로, 배양된 배지를 멸균하는 단계;
    c) 배양된 배지로부터 고체를 제거하여, 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물을 형성하는 단계;
    d) 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물을 DA 유리 염기 혼합물 및 이산화탄소로 전환시키고, 임의적으로 이산화탄소를 발효기로 재순환시키는 단계;
    e) DA 유리 염기 혼합물로부터 물을 제거하고, 임의적으로 물 및/또는 이산화탄소를 발효기로 재순환시키는 단계;
    f) 수성 염기를 첨가하여 DA 유리 염기 혼합물로부터 카보네이트류 및/또는 카바메이트류를 제거하는 단계;
    g) 추출기에서 DA 유리 염기 혼합물을 유기 용매로 추출하여, 추출된 DA 유리 염기 용액 및 수성 라피네이트를 형성하고, 임의적으로 상기 수성 라피네이트를 추출기로 재순환시키는 단계;
    h) DA 유리 염기 용액을 증류하여, 정제된 DA 유리 염기 및 유기 용매를 형성하고, 임의적으로 상기 용매를 추출기로 재순환시키고, 임의적으로 원치 않는 불순물을 제거하는 단계; 및
    i) 정제된 DA 유리 염기를 단리하는 단계
    를 포함하는, DA의 제조 방법.
  202. a) 이산화탄소, 카보네이트, 비카보네이트 또는 탄산의 존재 하에, 배양된 배지에서 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 중 하나 이상을 형성하기에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 발효기 내의 배지에서 유전적으로 조작된 미생물을 배양하는 단계;
    b) 임의적으로, 배양된 배지를 멸균하는 단계;
    c) 배양된 배지로부터 고체를 제거하여, 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물을 형성하는 단계;
    d) 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물로부터 물을 제거하고, 임의적으로 물 및/또는 이산화탄소를 발효기로 재순환시키는 단계;
    e) 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 혼합물을 DA 유리 염기 혼합물 및 이산화탄소로 전환시키고, 임의적으로 이산화탄소를 발효기로 재순환시키는 단계;
    f) DA 유리 염기 혼합물로부터 물을 제거하고, 임의적으로 물 및/또는 이산화탄소를 발효기로 재순환시키는 단계;
    g) 수성 염기를 첨가하여 DA 유리 염기 혼합물로부터 카보네이트류 및/또는 카바메이트류를 제거하는 단계;
    h) 추출기에서 DA 유리 염기 혼합물을 유기 용매로 추출하여, 추출된 DA 유리 염기 용액 및 수성 라피네이트를 형성하고, 임의적으로 상기 수성 라피네이트를 추출기로 재순환시키는 단계;
    i) DA 유리 염기 용액을 증류하여, 정제된 DA 유리 염기 및 유기 용매를 형성하고, 임의적으로 상기 용매를 추출기로 재순환시키고, 임의적으로 원치 않는 불순물을 제거하는 단계; 및
    j) 정제된 DA 유리 염기를 단리하는 단계
    를 포함하는, DA의 제조 방법.
  203. 제159항 내지 제202항 중 어느 한 항에 있어서, 탄산 안하이드라제가 (a) 이산화탄소를 비카보네이트 및/또는 카보네이트 이온으로 전환시킴으로써 DA 카보네이트류 또는 DA 카바메이트류의 형성을 향상시키거나, (b) 비카보네이트 및/또는 카보네이트 이온을 이산화탄소로 전환시킴으로써 DA 카보네이트류 또는 DA 카바메이트류 용액으로부터의 이산화탄소의 방출을 향상시키거나, (c) (a) 및 (b) 둘 다를 달성하기에 충분한 양으로 존재하는 것인 방법.
  204. 제203항에 있어서, 탄산 안하이드라제가 DA 카보네이트의 형성을 향상시키는 것인 방법.
  205. 제203항 또는 제204항에 있어서, 탄산 안하이드라제가 DA 카보네이트류 용액으로부터의 이산화탄소의 방출을 향상시키는 것인 방법.
  206. 제203항 내지 제205항 중 어느 한 항에 있어서, 탄산 안하이드라제가 DA 카보네이트의 형성을 향상시키고 DA 카보네이트류 용액으로부터의 이산화탄소의 방출을 향상시키는 것인 방법.
  207. 제203항 내지 제206항 중 어느 한 항에 있어서, 탄산 안하이드라제가 DA 카보네이트류 또는 DA 카바메이트류의 형성을 향상시키기 위해 발효 브로쓰 중에 존재하는 것인 방법.
  208. 제203항 내지 제207항 중 어느 한 항에 있어서, 탄산 안하이드라제가 DA 카보네이트류 또는 DA 카바메이트류 용액으로부터의 이산화탄소의 방출을 향상시키기 위해 이산화탄소를 방출하고 유리 DA 염기를 생성하는 단계 또는 단계들에 존재하고, 임의적으로 CA가 물 제거 또는 증발 단계에 존재하고, 임의적으로 CA가 CO2 스트립핑 단계에 존재하고, 임의적으로 CA가 물 제거 또는 증발 단계 및 CO2 스트립핑 단계 둘 다에 존재하는 것인 방법.
  209. 제203항 내지 제208항 중 어느 한 항에 있어서, 탄산 안하이드라제가 DA 카보네이트류 또는 DA 카바메이트류의 형성을 향상시키기 위해 발효 브로쓰 중에 존재하고, DA 카보네이트류 또는 DA 카바메이트류 용액으로부터의 이산화탄소의 방출을 향상시키기 위해 이산화탄소를 방출하고 유리 DA 염기를 생성하는 단계 또는 단계들에 존재하는 것인 방법.
  210. 제203항 내지 제209항 중 어느 한 항에 있어서, 탄산 안하이드라제가 외생적으로 첨가되는 것인 방법.
  211. 제203항 내지 제210항 중 어느 한 항에 있어서, 탄산 안하이드라제가 발효 브로쓰 중의 유전적으로 조작된 미생물에 의해 제공되고, 임의적으로 브로쓰로 분비되며, 임의적으로 미생물의 주변세포질에 존재하는 것인 방법.
  212. 제203항 내지 제211항 중 어느 한 항에 있어서, 탄산 안하이드라제가 DA를 생성하는 유전적으로 조작된 미생물에 의해 제공되고, 임의적으로 브로쓰로 분비되며, 임의적으로 미생물의 주변세포질에 존재하는 것인 방법.
  213. 제203항 내지 제212항 중 어느 한 항에 있어서, 탄산 안하이드라제가 천연 유전자 또는 효소이고, 임의적으로 탄산 안하이드라제가 조작된 유전자 또는 효소로서, 임의적으로 브로쓰로 분비되도록 조작되고, 임의적으로 미생물의 주변세포질 공간으로 분비되도록 조작된 것인 방법.
  214. 제203항 내지 제213항 중 어느 한 항에 있어서, 탄산 안하이드라제가 조작된 효소로서, 임의적으로 안정성, 열 안정성, 알칼리 pH 안정성 또는 증가된 활성을 향상시키도록 조작된 것인 방법.
  215. 제203항 내지 제214항 중 어느 한 항에 있어서, DA가 HMD, 카다베린, 푸트레신, 에틸렌디아민, 헵타메틸렌디아민, 또는 C2 내지 C7 메틸렌 분절, C2 내지 C12 메틸렌 분절 또는 C4 내지 C7 메틸렌 분절을 포함하는 디아민이고, 임의적으로 DA가 HMD인 방법.
  216. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항, 선행 청구항 및 제159항 내지 제215항 중 어느 한 항에 있어서, 유전적으로 조작된 미생물이, 적어도 하나의 DA 카보네이트류 및/또는 DA 카바메이트류, 바람직하게는 HMD 카보네이트류 및/또는 카바메이트류 화합물을 생성하기에 충분한 양으로 발현되는, DA 합성 경로, 바람직하게는 HMD 합성 경로의 적어도 하나의 효소 및 탄산 안하이드라제 효소 또는 변이체를 코딩하는 적어도 2종의 외생성 핵산을 갖는 DA 합성 경로, 바람직하게는 HMD 합성 경로를 포함하는 것인 방법.
  217. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항, 선행 청구항 및 제159항 내지 제215항 중 어느 한 항에 있어서, 유전적으로 조작된 미생물이, 적어도 하나 이상의 DA 유리 염기, 바람직하게는 HMD 유리 염기 및 이산화탄소를 생성하기에 충분한 양으로 발현되는, DA 합성 경로, 바람직하게는 HMD 합성 경로의 적어도 하나의 효소 및 탄산 안하이드라제 효소 또는 변이체를 코딩하는 적어도 2종의 외생성 핵산을 갖는 DA 합성 경로, 바람직하게는 HMD 합성 경로를 포함하는 것인 방법.
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