JP2022522276A - 細菌による組換えglp-1ペプチドの連続生産方法 - Google Patents
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Abstract
Description
スターター培養用増殖培地にて37℃で225rpmで12時間培養して、培養物のOD600が5.0-6.0に達するまで増殖させる、組換え大腸菌のスターター培養物を調製する工程;
10g/Lの濃度のグルコース/デキストロースを含む発酵槽に開始バッチ培地を添加し、pHを6.9に維持することにより、潅流型発酵槽システムを調製する工程;
前記スターター培養物を発酵槽に加え、最初の1時間は3NのNaOHを使用し、その1時間後に4M液体アンモニアを使用してpHを6.9に維持する工程;
前記開始バッチ培地の残留グルコース/デキストロース濃度が約5g/Lに減少したときに、ラクトースまたはラクトース類似体などのlacオペロン誘導剤を前記発酵槽に添加し、組換え大腸菌から組換えGLP-1ペプチドの産生および分泌を誘導する工程;
誘導後、30~40分経過後に、前記潅流型発酵システムを開始して、分泌された組換えGLP-1ペプチドを含む使用済み培地を透過液として、組換え大腸菌を保持液(retantate)として分離し、前記透過液から組換えGLP-1ペプチドを回収し、前記発酵槽に新鮮な灌流培地および前記組換え大腸菌の保持液を再供給して、組換えGLP-1ペプチドの継続的な産生および分泌する工程を含む。
1)GLP-1ペプチドをコードするID1のDNA配列;
2)a)pelB、ompA、yebF、およびompFからなる群から選択される遺伝子のシグナル配列をコードする少なくとも1つのDNA配列、および、b)キャリアペプチドをコードする少なくとも1つのDNA配列(好ましくは、配列ID4またはID5の切断型yebFをコードするDNA配列ID2またはID3)の組み合わせである少なくとも1つの分泌シグナル配列;
3)少なくとも1つの遺伝子発現カセットであって、少なくとも1つの誘導性プロモーター、RBS、組換えGLP-1ペプチドをコードするDNA配列、アフィニティータグをコードするDNA配列、および少なくとも1つの遺伝子ターミネーターを含み、前記アフィニティータグのDNA配列は、前記分泌シグナル配列とともに、前記組換えGLP-1ペプチドのDNA配列に作動可能に連結されている遺伝子発現カセット;
4)宿主細菌細胞におけるベクターの複製のための少なくとも1つの細菌ori遺伝子配列;
5)選択可能なマーカーをコードするための少なくとも1つのDNA配列であって、当該選択可能なマーカーのDNA配列に隣接する遺伝子ターミネーター配列と適切なプロモーターを伴っているDNA配列。
pelB:pectatelyase BのN末端アミノ酸残基をコードするリーダーDNA配列。
ompA:外膜タンパク質Aのアミノ酸残基をコードするリーダーDNA配列。
ompF:外膜タンパク質Fのアミノ酸残基をコードするリーダーDNA配列。
yebF:タンパク質yebFのアミノ酸残基をコードするリーダーDNA配列。
AmpR:アンピシリン耐性遺伝子をコードするDNA配列。
F1 Ori:複製起点。
IPTG:イソプロピルβ-d-1-チオガラクトピラノシド。
LacまたはLac1:lacリプレッサーをコードするDNA配列。
RBS:リボソーム結合部位。
a)pelB、ompA、yebF、およびompFからなる群から選択される遺伝子101のシグナル配列をコードする少なくとも1つのDNA配列、
b)キャリアペプチド102をコードする少なくとも1つのDNA配列で、好ましくは、配列ID4の切断型yebFをコードするDNA配列ID2、または配列ID5の切断型yebFをコードするDNA配列ID3。
前記発現ベクターは、GLP-1ペプチド103をコードするDNA配列が作動可能であるように連結された少なくとも1つの遺伝子発現カセットを、さらに含む。この遺伝子発現カセットは、誘導性プロモーター104、RBS105、アフィニティータグのDNA配列および少なくとも1つの遺伝子ターミネーター106を含む。前記分泌シグナル配列101および102、ならびにアフィニティータグのDNA配列は、組換えGLP-1ペプチド103のDNA配列に作動可能に連結されている。さらに、前記発現ベクターは、宿主細胞中での前記ベクターの複製のための少なくとも1つの細菌ori遺伝子配列110;少なくとも1つの抗生物質抵抗性遺伝子109(遺伝子プロモーター108により制御されている),及び少なくとも1つの追加的選択マーカー112(遺伝子プロモーター113により制御されている)を含む。当該発現ベクターは、追加的に、F1バクテリアファージシステム内に組換えGLP-1ペプチドのパッケージングを可能にするための少なくとも1つのf1 ori配列111を含む。
a)組換えGLP-1ペプチドをコードする発現ベクターで大腸菌を形質転換して、組換え大腸菌を生産する工程;
b)スターター培養の増殖培地37℃で225rpmで12時間、培養して、培養物のOD600を5.0-6.0に達するまで増殖させる、組換え大腸菌のスターター培養物を調製する工程;
c)グルコース/デキストロースを10g/Lの濃度で含み、pHを6.9に維持している発酵槽に、開始バッチ培地を添加して、潅流型発酵システムを調製する工程;
d)前記スターター培養物を前記発酵槽に加え、最初の1時間は3NのNaOHでpHを6.9に維持し、その後は、4M液体アンモニアを用いてpHを6.9に維持する工程;
e)前記開始バッチ培地の残留グルコース/デキストロース濃度が約5g/Lに減少したときに、ラクトースまたはラクトース類似体などのlacオペロン誘導剤を前記発酵槽に添加して、大腸菌から組換えGLP-1ペプチドの産生および分泌を誘導する工程;
f)誘導から30~40分後に前記潅流型発酵システムを開始し、分泌された組換えGLP-1ペプチドを含む使用済み培地を透過液として、組換え大腸菌を保持液(retantate)として分離し、前記透過液から組換えGLP-1ペプチドを収穫し、前記発酵槽に新鮮な灌流培地と前記組換え大腸菌保持液(retantate)を再供給して、組換えGLP-1ペプチドを連続的に産生及び分泌する工程。
大腸菌の培養と形質転換
以下のすべての実施例において、DNA配列(配列ID6)の発現ベクターを使用した。この発現ベクターは、組換えGLP-1ペプチドのコードDNA配列(配列ID1)を含む。前記配列ID1は、切断型yebfペプチド(配列ID5)をコードするキャリアペプチド(配列ID3)のDNA配列とシグナルペプチドの遺伝子ompfとの組み合わせを有する分泌シグナル配列と結合している。
バッチ発酵および潅流型発酵
a)スターター培養物の調製
表3に記載の組成のオートクレーブ処理したスターター培養培地を使用して流加発酵を実施するために、適切な量のプレ培養物を調製した。通常、300mlの増殖培地を2リットルのフラスコに取り、形質転換プレートから無菌的に単一コロニー形成単位を接種し、37℃に維持された回転式インキュベーター内で、225rpmで12時間インキュベートする。チアミンなどのフィルター滅菌済み培地成分、微量元素はスターター培養のセットアップ中に再構成され、12時間のインキュベーション終了時には、OD600は約5.0に達した。
表3に記載されている開始バッチ培地の組成を有する増殖培地を備えたバイオリアクターは、45分の保持時間で、121℃でオートクレーブ処理され、その後、組み立てられたバイオリアクター全体が、SCADAソフトウェアを備えたコントロールタワーによる制御により、37℃に下げられる。バイオリアクターのパッキングでは、必要なすべてのもの、すなわち吸気口および排気ユニット用の投与チューブ0.2ミクロン疎水性フィルター、溶存酸素プローブ、pHプローブ、バッフル、L/D比が1:1のインペラーブレードが取り付けられる。
適切なプラスミドを有するBL21(DE3)の形質転換細胞を調製する。当該調製は、ヒートショックを与え、選択用抗生物質を含有したLB寒天プレートに広げ、37℃のインキュベーターで12時間インキュベートすることにより行われる。培地成分を取り、脱イオン水に溶解し、5NのNaOHを使用してpH6.90に調整することにより、増殖培地を調製した。スターター培養物の培地は、オートクレーブで45分間保持しながら121℃で滅菌する。熱に弱い他のすべての培地成分は、フィルター滅菌された。すなわち、チアミン、カナマイシン、微量元素、デキストロース、MgS04・7H2Oは別々にオートクレーブ処理された。スターター培養物は、LB寒天プレートから振とうフラスコにコロニーを接種することによって調製される。フィルター滅菌培地成分、すなわちチアミン、カナマイシン50mg/リットル、微量元素1000xを、1%デキストロース、MgSO4・7H2O(5mM)、酵母エキス(0.2%)とともに添加した。フラスコを振盪型インキュベーター内で37℃、225rpmで一晩インキュベートした。
組換え細菌の増殖効率および組換えGLP-1ペプチドの分泌効率
培養培地における増殖動態、グルコース消費、および組換えタンパク質の産生と分泌を、バッチ発酵プロセス法にて別々の時間で測定した。
組換えGLP-1ペプチドのエンテロキナーゼ消化
組換えGLP-1ペプチドをコードするDNA配列は、エンテロキナーゼ認識配列(DDDDK)によって分泌シグナル配列から分離され、組換えGLP-1ペプチドを収穫した後、分泌シグナル配列から組換えGLP-1ペプチドを分離することを可能にする。GLP-1ペプチドは、精製プロセス用のHisタグと連結している。
潅流型発酵による組換えGLP-1ペプチド生産
潅流型発酵プロセスは、実施例2cで説明したように、配列ID6で形質転換された組換え大腸菌を用いて実施された。発酵槽は常時、発酵用の培地1リットルを保持し、培地は、組換え細菌と分泌された組換えGLP-1ペプチドを含む使用済み培地とを回収するためにろ過された。分泌された組換えタンパク質は、使用済み培地を分離することにより、1L/時間の速度で連続的に収穫された。この使用済み培地を分離した後、発酵槽に等量の新鮮な灌流培地を再供給し、大腸菌を保持液(retantate)とする連続発酵を行った。定量化と分析のために、1時間ごとに少量のサンプルを収集した。1つの連続バッチの灌流発酵では、合計10Lの培地が10時間発酵される。
Claims (8)
- 細菌、より具体的には大腸菌による組換えGLP-1ペプチドの連続生産および分泌のための方法であって、
a)組換えGLP-1ペプチドをコードする発現ベクターで大腸菌を形質転換して組換え大腸菌を調製する工程;
b)スターター培養の増殖培地37℃、225rpmで12時間培養して、培養物のOD600が5.0-6.0に達するようにした、組換え大腸菌のスターター培養物を調製する工程;
c)10g/Lの濃度のグルコース/デキストロースを含み、pHを6.9に維持する発酵槽に開始バッチ培地を添加することにより、潅流型発酵システムを調製する工程;
d)前記スターター培養物を前記発酵槽に加え、最初の1時間は3NのNaOHを使用し、この1時間後には、4Mの液体アンモニアを使用してpHを6.9に維持する工程;
e)前記開始バッチ培地の残留グルコース/デキストロース濃度が約5g/Lに減少したときに、ラクトースまたはラクトース類似体などのlacオペロン誘導剤を前記発酵槽に添加して、前記組換え大腸菌から組換えGLP-1ペプチドの産生および分泌を誘導する工程;及び
f)前記誘導から30~40分後に、前記潅流型発酵システムを開始して、分泌された組換えGLP-1ペプチドを含む使用済み培地を透過液として、組換え大腸菌を保持液(retantate)として分離し、
前記透過液から組換えGLP-1ペプチドを採集し、
前記発酵槽に新鮮な灌流培地および前記組換え大腸菌保持液(retantate)を再供給して、組換えGLP-1ペプチドを連続的に産生および分泌する工程;
を含み、
前記組換えGLP-1をコードするDNA配列は配列ID1であり、
遺伝子ompfのシグナルペプチド及びキャリアペプチドとしての切断型yebfペプチド(配列ID5)をコードするDNA配列(配列ID3)の組み合わせを含む分泌シグナル配列は、前記配列ID1に連結していて、
前記組換え発現ベクターは配列ID6であり、
配列ID6の組換え発現ベクターを用いた前記潅流型発酵システムにより、1~1.2g/L/hrの範囲で組換えGLP-1ペプチドを分泌及び生産する方法。
- 前記開始バッチ培地は、
139mMグルコース/デキストロース;
30.2mM窒素源、より具体的にはリン酸二アンモニウム;
安定化剤として54.29mMグリセロール;
8.84mMクエン酸;
必須アミノ酸として1mMグリシン;
正に帯電したアミノ酸としての1mMアルギニン;
0.06mMチアミン;
5mM硫酸マグネシウム七水和物;
97.73mMリン酸二水素カリウム;
2.13mM塩化ナトリウム;
0.09mM塩化カルシウム;及び
微量元素の塩
を含む化学的に規定された培地である、請求項1に記載の方法。
- 前記灌流培地は、
13.9mMのグルコース/デキストロース;
30.2mM窒素源、より具体的にはリン酸二アンモニウム;
安定化剤として54.29mMグリセロール;
8.84mMクエン酸;
必須アミノ酸として1mMグリシン;
正に帯電したアミノ酸としての1mMアルギニン;
0.06mMチアミン;
5mM硫酸マグネシウム七水和物;
97.73mMリン酸二水素カリウム;
2.13mM塩化ナトリウム;
0.09mM塩化カルシウム;及び
微量元素の塩
を含む化学的に規定された培地である、請求項1に記載の方法。
- 前記潅流型発酵システムは、
供給タンク(201)、フィードポンプ(202)、レベルセンサー(203)、モーター(204)、発酵槽(205)、磁気浮上ポンプ(206)、分離モジュール(207)、収穫用ポンプ(208)、および収穫用タンク(209)を含み、
前記分離モジュール(207)は、培養培地から分泌された組換えタンパク質の分離に適した中空糸膜のフィルターモジュールを含み、
前記フィルターモジュールは、0.4μmから0.1μmの間の多孔度、より具体的には0.2μmの多孔度を有する、ポリスルホン製中空糸膜、及びメチルエステルまたはセルロースエステル製中空糸膜のフィルターモジュールであり、
前記中空糸膜のカットオフポアサイズは500kDaである
請求項1に記載の方法。
- 前記潅流型発酵システムは、組換え大腸菌を含む培養培地(組換え大腸菌培養培地)を、交互のタンジェント流で分離系内を循環できるものであり、
前記分離系は、前記組換え大腸菌培養培地から、組換えGLP―1ペプチドを含む使用済み培地を含む濾液を分離し、前記培養培地に前記組換え大腸菌を保持して、組換えGLP―1ペプチドを連続生産する
請求項1に記載の方法
- 細菌、より具体的には大腸菌によって組換えGLP-1ペプチドを産生および分泌するための発現ベクターであって、
GLP-1ペプチドをコードするDNA配列;
a)pelB、ompA、yebF、およびompFからなる群から選択される遺伝子のシグナル配列をコードする少なくとも1つのDNA配列と、b)キャリアペプチド(好ましくは切断型yebFをコードするDNA配列ID2またはID3)をコードする少なくとも1つのDNA配列との組み合わせである少なくとも1つの分泌シグナル配列;
少なくとも1つの誘導性プロモーター、RBS、組換えGLP-1ペプチドをコードするDNA配列、アフィニティータグをコードするDNA配列、及び少なくとも1つの遺伝子ターミネーターを含む少なくとも1つの遺伝子発現カセットであって、前記アフィニティータグは、前記分泌シグナル配列とともに前記組換えGLP-1ペプチドのDNA配列に作動可能に連結されたDNA配列である遺伝子発現カセット;
前記宿主細菌細胞におけるベクターの複製のための少なくとも1つの細菌ori遺伝子配列;並びに
適切なプロモーターを有する選択マーカーをコードする少なくとも1つのDNA配列、及び当該選択マーカーのDNA配列に隣接する遺伝子ターミネーター配列;
を含み、
組換えGLP-1ペプチドをコードするDNA配列は配列ID1であり、
遺伝子ompfのシグナルペプチドと、切断型yebfペプチド(配列ID5)をコードするキャリアペプチドDNA配列(配列ID3)との組み合わせを含む分泌シグナル配列と、前記配列ID1のDNA配列とが結合していて、
組換えGLP-1ペプチドをコードする前記組換え発現ベクターは配列ID6であり、
組換え発現ベクター(配列ID6)を使用することで、潅流型発酵システムにより、1~1.2g/L/hrの範囲で組換えGLP-1ペプチドを分泌できる
発現ベクター。 - 請求項6に記載の組換えGLP-1ペプチドを産生および分泌するための発現ベクターにおいて、
配列ID3の切断型yebFをコードするDNA配列が、配列ID2の40位のTGCコドンをGCGコドンに変異させることによって合成され、配列ID4で表されるアミノ酸配列の14位のCysが、配列ID5で表されるアミノ酸配列の14位のAlaに変異している発現ベクター。 - 前記発現ベクター中の選択可能なマーカーは、少なくとも1つの抗生物質耐性遺伝子配列、およびlacオペロンを含む追加の選択マーカーを含む、請求項6に記載の組換えGLP-1ペプチドを産生および分泌するための発現ベクター。
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