KR20210138014A - 박테리아에 의한 재조합 glp-1 펩타이드의 연속 생성 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 박테리아, 보다 구체적으로 대장균(E. coli)에 의한 재조합 글루카곤 유사 펩타이드-1(GLP-1)의 연속 생성 및 분비 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 GLP-1의 세포외 분비를 생성 및 가능하게 하기 위한 신규한 박테리아 발현 벡터의 용도, 분비를 향상시키고 정제를 가능하게 하는 신규 배지 조성물의 용도, 및 재조합 GLP-1 펩타이드의 연속 생성 및 분리를 위한 관류 기반 발효 시스템에 관한 것이다.
Description
본 발명은 박테리아, 보다 구체적으로 대장균(E. coli)에 의한 재조합 글루카곤 유사 펩타이드-1(GLP-1)의 연속 생성 및 분비 방법에 관한 것이다.
글루카곤 유사 펩타이드 1(GLP-1)은 원위 회장 및 결장의 L 세포에서 생성되는 31개 아미노산의 강력한 인크레틴(incretin) 호르몬이다. L 세포에서 GLP-1은 프로글루카곤 유전자의 조직 특이적 번역 후 처리에 의해 생성된다. 글루코오스, 지방산 및 식이섬유를 포함한 영양소는 모두 GLP-1을 인코딩하는(encoding) 유전자의 전사를 상향 조절하는 것으로 알려져 있으며, 이 호르몬의 방출을 자극할 수 있다.
초기 생성물 GLP-1(1-37)은 아미드화 및 단백질 분해 절단에 민감하여 2개의 절단된 등능(equipotent) 생물학적 활성 형태인 GLP-1(7-36) 아미드 및 GLP-1(7-37)을 생성하게 된다.
GLP-1은 인크레틴이며, 따라서 인슐린 분비(insulinotropic) 효과를 나타내며, 즉 인슐린 분비를 향상시켜 글루코오스 의존적 방식으로 혈당 수치를 낮추는 능력을 갖는다. 인슐린 분비 효과 외에도 GLP-1은 수많은 조절 및 보호 효과와 관련이 있다. GLP-1의 작용은 제2형 당뇨병 환자에게 알려져 있으며 이에 따라 실질적인 제약 연구는 GLP-1 기반 치료의 개발을 지향하고 있다. GLP-1은 또한 비만과 같은 관련된 대사 장애의 관리에 대한 가능한 치료제를 시사한다.
따라서, GLP-1 생성의 중요성으로 인해 재조합 박테리아, 보다 구체적으로는 생성율이 높은 대장균을 이용하여 재조합 GLP-1 펩타이드의 생성 방법이 요구되는 기술적인 격차가 존재한다.
본 발명의 주요 목적은 박테리아, 보다 구체적으로는 대장균에 의한 재조합 GLP-1 펩타이드의 연속 생성 및 분비 방법으로서, 재조합 GLP-1가 신규한 박테리아 발현 벡터를 사용하여 박테리아에서 생성되며 관류 기반(perfusion-based) 발효 시스템을 사용하여 화학적으로 정의된 배지에서 박테리아를 배양함으로써 세포 외로 분비되는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 서열 번호 1로 표시되는 GLP-1 펩타이드를 인코딩하는 DNA 서열; 및 DNA 서열을 포함하는 적어도 하나의 분비 신호 서열; 및 GLP-1 펩타이드의 정제를 가능하게 하기 위한 적어도 하나의 친화성 태그(tag) 서열을 포함하는 신규한 박테리아 발현 벡터를 사용하여 재조합 GLP-1의 분비를 향상시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 화학적으로 정의된 배지를 사용하여 용이하게 정제되는 재조합 GLP-1의 생성 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 분비된 재조합 GLP-1을 배양 현탁액으로부터 계속 제거하기 위해 교호 접선 여과(alternating tangential filtration) 흐름용 맞춤형 분리 시스템을 사용하여 박테리아에서 재조합 GLP-1의 생성 및 분비를 향상시키는 시스템 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 박테리아를 사용하여 재조합 GLP-1의 생성 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 대장균에 의한 재조합 GLP-1의 생성 및 분비에 관한 것이다.
주요 실시형태에서, 본 발명은 박테리아, 보다 구체적으로는 대장균에서 GLP-1의 생성 방법으로서, 대장균을 적어도 하나의 분비 신호 서열과 함께, 서열 번호 1로 표시되는 GLP-1을 인코딩하는 DNA 서열을 보유하는 서열 번호 6의 박테리아 발현 벡터로 형질전환시키는 단계; 스타터 배양물의 OD600이 5.0 내지 6.0에 도달할 때까지 스타터 배양 성장 배지에서 배양물을 37℃에서, 225 rpm으로 12시간 동안 성장시킴으로써 재조합 대장균의 스타터 배양물을 제조하는 단계; 10 g/L 농도의 글루코오스/덱스트로오스를 포함하는 발효기 용기에 초기 회분식(batch) 배지를 첨가하고 pH를 6.9에서 유지함으로써 관류 기반 발효기 시스템을 제조하는 단계; 발효기 용기에 스타터 배양물을 첨가하고 최초 1시간에는 3 N NaOH를 사용하고 최초 1시간 이후에는 4 M 액체 암모니아를 사용하여 pH를 6.9로 유지하는 단계; 재조합 대장균로부터 재조합 GLP-1 펩타이드의 생성 및 분비를 유도하기 위해 초기 회분식 배지 중의 잔류 글루코오스/덱스트로오스 농도가 약 5 g/L로 감소한 경우 락토오스 또는 락토오스 유사체와 같은 lac 오페론 유도제를 발효기 용기에 첨가하는 단계; 및 투과액으로서 분비된 재조합 GLP-1 펩타이드를 함유하는 소비된(spent) 배양 배지로부터 잔류물(retentate)로서 재조합 대장균을 분리하기 위해 유도 30 내지 40분 후 관류 기반 발효 시스템을 시작하고, 투과액으로부터 재조합 GLP-1 펩타이드를 수거하며, 재조합 GLP-1 펩타이드의 연속 생성 및 분비를 위해 발효기 용기에 신선한 관류 배지 및 잔류물 재조합 대장균을 재공급하는 단계;를 포함하는, 박테리아, 보다 구체적으로는 대장균에서 GLP-1의 생성 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 서열 번호 6을 사용하는 재조합 발현 벡터는 관류 기반 발효 시스템을 사용하여 1 내지 1.2 g/L/hr의 범위에서 재조합 GLP-1 펩타이드를 분비한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 표 2에 기재된 바와 같은 조성을 갖는 화학적으로 정의된 배지인 스타터 배양 배지, 초기 회분식 배지, 및 관류 배지를 제공한다
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 재조합 대장균을 포함하는 배양 배지가 교호 접선 흐름에서 분리 시스템을 통해 순환될 수 있게 하는 관류 기반 발효 시스템을 제공하며, 분리 시스템은 재조합 GLP-1을 함유하는 소비된 배지를 함유하는 여액을 제거하고 연속 생성을 위해 배양 배지에서 재조합 대장균을 유지한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은
1) GLP-1 펩타이드를 인코딩하는 서열 번호 1인 DNA 서열;
2) a) pelB, ompA, yebF 및 ompF로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 신호 서열을 인코딩하는 적어도 하나의 DNA 서열, 및 b) 캐리어(carrier) 펩타이드를 인코딩하는 적어도 하나의 DNA 서열, 바람직하게는 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 절단된 yebF를 각각 인코딩하는 DNA 서열인 서열 번호 2 또는 서열 번호 3의 조합인 적어도 하나의 분비 신호 서열;
3) 적어도 하나의 유도성 프로모터, RBS, 재조합 GLP-1 펩타이드를 인코딩하는 DNA 서열, 친화성 태그를 인코딩하는 DNA 서열, 및 적어도 하나의 유전자 터미네이터(terminator);를 분비 신호 서열, 및 재조합 GLP-1 펩타이드의 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 친화성 태그의 DNA 서열과 함께 포함하는 적어도 하나의 유전자 발현 카세트(cassette);
4) 숙주 박테리아 세포에서 벡터의 복제를 위한 적어도 하나의 박테리아 ori 유전자 서열; 및
5) 적합한 프로모터로 선택 가능한 마커를 코딩하기 위한 적어도 하나의 DNA 서열 및 선택 가능한 마커의 DNA 서열에 인접하는 유전자 터미네이터 서열;을 포함하는 신규한 박테리아 발현 벡터를 제공한다.
본 발명은 재조합 GLP-1 서열 번호 1을 인코딩하는 DNA 서열을 더 제공한다.
본 발명은 또한 대장균에서 재조합 GLP-1 펩타이드의 생성 및 분비를 위한 발현 벡터 서열 번호 6을 제공한다.
본 발명은 또한 관류 기반 발효기 시스템에 관한 것으로, 시스템은 공급 탱크; 공급 펌프; 레벨 센서(level sensor), 모터; 발효기 용기; 자기 부상 펌프, 분리 모듈, 수거 펌프, 및 수거 탱크를 포함하며, 분리 모듈에서 중공사 컬럼은 배양 배지로부터 분비된 재조합 단백질의 제거에 적합한 중공사 멤브레인의 필터 모듈을 포함하는 필터 모듈을 포함한다. 분리 모듈은 중공사, 예를 들어, 0.4 μm 내지 0.1 μm의 다공도(porosity), 예를 들어, 0.2 μm의 다공도를 갖는, 폴리설폰, 메틸 에스테르 또는 셀룰로오스 에스테르로 제조된 중공사를 포함하는 필터 모듈을 포함한다. 분리 시스템은 500 kDa의 분자량 컷오프(cut-off) 기공 크기를 갖는 멤브레인을 포함하는 필터 모듈을 포함한다.
본 발명의 시스템 및 방법에 대한 완전한 이해는 하기 도면(들)을 참조하여 얻는다:
도 1은 대장균으로부터 재조합 GLP-1 펩타이드를 인코딩 및 분비하기 위한 박테리아 발현 벡터의 개략도이고;
도 2는 관류 기반 발효 시스템의 개략도를 설명하고;
도 3a는 회분식(batch) 발효 공정에서 시간 경과에 따른 발현 벡터 서열 번호 6으로 형질전환된 재조합 대장균의 성장 속도 및 재조합 GLP-1 펩타이드 분비의 그래프 표현이고;
도 3b는 0.25 mM IPTG 유도의 상이한 시점 이후 재조합 GLP-1 펩타이드를 검출하기 위해 세포 용해물 및 배양 배지에서 발현 벡터 서열 번호 6으로 형질전환된 재조합 대장균을 비교한 SDS-PAGE의 대표적인 이미지이고;
도 4는 회분식 발효 공정에서 시간 경과에 따른 발현 벡터 서열 번호 6으로 형질전환된 재조합 대장균의 성장 속도 및 글루코오스 소비의 그래프 표현이고;
도 5는 발현 벡터 서열 번호 6으로 형질전환된 재조합 대장균 및 회분식 발효 공정의 배지에서 재조합 GLP-1 펩타이드; His-정제된 재조합 GLP-1 펩타이드; 및 엔테로키나제(enterokinase) 분해된 재조합 GLP-1 펩타이드에 대한 SDS-PAGE의 대표적인 이미지이고;
도 6a는 관류 기반 발효 공정에서 시간 경과에 따른 발현 벡터 서열 번호 6으로 형질전환된 재조합 대장균의 성장 속도 및 글루코오스 소비의 그래프 표현이고;
도 6b는 10 kDa GLP-1 펩타이드 분비가 보이는 SDS-PAGE 분석의 대표적인 이미지이다. 배지 샘플을 수집하고 0.25 mM IPTG로 유도 0, 2, 4 및 6시간 후에 분석하였다; 그리고
도 6c는 10시간 동안의 관류 기반 발효 시스템의 매 시간에서의 재조합 GLP-1 펩타이드의 생성 속도의 그래프적 표현이다.
도 1은 대장균으로부터 재조합 GLP-1 펩타이드를 인코딩 및 분비하기 위한 박테리아 발현 벡터의 개략도이고;
도 2는 관류 기반 발효 시스템의 개략도를 설명하고;
도 3a는 회분식(batch) 발효 공정에서 시간 경과에 따른 발현 벡터 서열 번호 6으로 형질전환된 재조합 대장균의 성장 속도 및 재조합 GLP-1 펩타이드 분비의 그래프 표현이고;
도 3b는 0.25 mM IPTG 유도의 상이한 시점 이후 재조합 GLP-1 펩타이드를 검출하기 위해 세포 용해물 및 배양 배지에서 발현 벡터 서열 번호 6으로 형질전환된 재조합 대장균을 비교한 SDS-PAGE의 대표적인 이미지이고;
도 4는 회분식 발효 공정에서 시간 경과에 따른 발현 벡터 서열 번호 6으로 형질전환된 재조합 대장균의 성장 속도 및 글루코오스 소비의 그래프 표현이고;
도 5는 발현 벡터 서열 번호 6으로 형질전환된 재조합 대장균 및 회분식 발효 공정의 배지에서 재조합 GLP-1 펩타이드; His-정제된 재조합 GLP-1 펩타이드; 및 엔테로키나제(enterokinase) 분해된 재조합 GLP-1 펩타이드에 대한 SDS-PAGE의 대표적인 이미지이고;
도 6a는 관류 기반 발효 공정에서 시간 경과에 따른 발현 벡터 서열 번호 6으로 형질전환된 재조합 대장균의 성장 속도 및 글루코오스 소비의 그래프 표현이고;
도 6b는 10 kDa GLP-1 펩타이드 분비가 보이는 SDS-PAGE 분석의 대표적인 이미지이다. 배지 샘플을 수집하고 0.25 mM IPTG로 유도 0, 2, 4 및 6시간 후에 분석하였다; 그리고
도 6c는 10시간 동안의 관류 기반 발효 시스템의 매 시간에서의 재조합 GLP-1 펩타이드의 생성 속도의 그래프적 표현이다.
사용된 약어:
pelB는 펙타텔리에이즈 B(pectatelyase B)의 N-말단 아미노산 잔기를 인코딩하는 리더(leader) DNA 서열을 지칭한다.
ompA는 외막 단백질 A의 아미노산 잔기를 인코딩하는 리더 DNA 서열을 지칭한다.
ompF는 외막 단백질 F의 아미노산 잔기를 인코딩하는 리더 DNA 서열을 지칭한다.
yebF는 단백질 yebF의 아미노산 잔기를 인코딩하는 리더 DNA 서열을 지칭한다.
AmpR은 암피실린 내성 유전자를 인코딩하는 DNA 서열을 지칭한다.
F1 Ori
복제 원점
IPTG
이소프로필 β-d-1-티오갈락토피라노사이드
Lac 또는 Lac1
lac 억제인자를 인코딩하는 DNA 서열
RBS
리보솜 결합 부위
이제 본 발명은 본 발명의 모든 실시형태가 아닌 일부가 표시되는 상세한 설명을 참조하여 이하에서 설명될 것이다. 실제로, 본 발명은 많은 상이한 형태로 구현될 수 있고 본원에서 설명된 실시형태로 제한되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 오히려, 이러한 실시형태는 본 개시내용이 적용 가능한 법적 요건을 충족시키도록 제공된다. 유사한 숫자는 전체에 걸쳐 유사한 요소를 나타낸다. 본 발명은 비제한적인 실시형태 및 예시적인 실험으로 본원에서 충분히 설명된다.
본 발명은 대장균에 의한 재조합 GLP-1의 생성 및 분비에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 대장균에 의한 재조합 GLP-1의 생성 및 분비 이후에 관류 기반 발효 시스템을 사용하여 이의 분리에 관한 것이다.
주요 실시형태에서, 도 1에 기재된 바와 같이, 본 발명은 재조합 GLP-1 펩타이드를 생성하고 분비하기 위한 특히 대장균을 위한 박테리아 발현 벡터(100)를 제공한다. 발현 벡터는 GLP-1 펩타이드(103)를 인코딩하는 DNA 서열; 및 a) pelB, ompA, yebF 및 ompF로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자(101)의 신호 서열을 인코딩하는 적어도 하나의 DNA 서열, 및 b) 캐리어 펩타이드(102)를 인코딩하는 적어도 하나의 DNA 서열, 바람직하게는 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 절단된 yebF를 각각 인코딩하는 DNA 서열인 서열 번호 2 또는 서열 번호 3의 조합인 적어도 하나의 분비 신호 서열;을 포함한다. 발현 벡터는 적어도 하나의 유도성 프로모터(104), RBS(105), 친화성 태그의 DNA 서열, 및 적어도 하나의 유전자 터미네이터(106)를 포함하는 GLP-1 펩타이드(103)를 인코딩하는 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 유전자 발현 카세트를 더 포함한다. 분비 신호 서열(101 및 102), 및 친화성 태그의 DNA 서열은 재조합 GLP-1 펩타이드(103)의 DNA 서열에 작동가능하게 연결된다. 또한, 발현 벡터는 숙주 박테리아 세포에서 벡터의 복제를 위한 적어도 하나의 박테리아 ori 유전자 서열(110); 및 이들 각각의 유전자 프로모터(108 및 113)에 의해 각각 제어되는 적어도 하나의 항생제 내성 유전자(109) 및 적어도 하나의 추가 선택 마커(112)를 포함한다. 발현 벡터는 FI 박테리파지(bacteriphage) 시스템에서 재조합 GLP-1 펩타이드의 패키징을 가능하게 하기 위한 적어도 하나의 f1 ori 서열(111)을 추가로 포함한다.
친화성 태그 서열은 재조합 GLP-1 펩타이드의 정제를 가능하게 하기 위한 것이다.
또한, 재조합 GLP-1 펩타이드를 인코딩하는 DNA 서열은 엔테로키나제 인식 서열(DDDDK)에 의해 분비 신호 서열로부터 분리되어, 재조합 GLP-1 펩타이드를 수거한 후 분비 신호 서열로부터 재조합 GLP-1 펩타이드를 분리할 수 있게 된다.
GLP-1 펩타이드는 서열 번호 1에 의해 인코딩되는 인간 GLP-1 단백질(NCBI 참조 번호 AAP35459)의 7 내지 37 아미노산 스트레치(stretch)를 포함하며; 그리고 표 1은 박테리아 발현 벡터에 사용되는 DNA 및 펩타이드 서열을 제공한다.
표 1은 DNA 및 펩타이드 서열을 제공한다
서열 번호 2는 서열 번호 4로 표시되는 절단된 yebf 펩타이드인 33개의 아미노산 캐리어 펩타이드를 인코딩하며, 서열 번호 3은 서열 번호 5로 표시되는 펩타이드를 인코딩한다. 서열 번호 3은 서열 번호 2에서 위치 40에 있는 TGC 코돈은 GCG 코돈으로 변이되는 서열 번호 2의 변이를 통해 합성되어 서열 번호 4의 위치 14에 있는 Cys를 서열 번호 5의 위치 14에 있는 Ala로 변이시킨다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 유전자 ompf의 신호 펩타이드 및 서열 번호 5의 절단된 yebf 펩타이드를 인코딩하는 서열 번호 3의 DNA 서열 캐리어 펩타이드의 조합을 포함하는 분비 신호 서열과 함께 재조합 GLP-1 펩타이드를 인코딩하는 서열 번호 1을 포함하는 발현 벡터의 DNA 서열을 표시하는 서열 번호 6을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 표 2에 기재된 바와 같이, 본 발명은 재조합 GLP-1 펩타이드를 인코딩하는 DNA 서열을 갖는 박테리아 발현 벡터로 형질전환된 박테리아의 성장 및 배양용 화학적으로 정의된 배지를 제공하며, 배지는 배양 배지에서 분비된 재조합 단백질의 용해도를 감소시키고 정제된 재조합 단백질의 최종 양을 감소시키는 경향이 있는 임의의 복잡한 정의되지 않은 물질이 없다. 배지는 적어도 하나의 탄소원, 보다 구체적으로 글루코오스/덱스트로오스; 및 안정화제로서의 글리세롤을 포함하며, 글루코오스/덱스트로오스와 글리세롤의 비는 1:0.25 내지 1:1, 바람직하게는 1:0.5이다. 배지에서 글리세롤의 존재는 높은 전단력을 방지하고 박테리아를 손상으로부터 보호하며 재조합 단백질의 변성을 감소하기 위한 것이다. 배지는 적어도 하나의 질소원을 더 포함하며, 질소원은 암모니아 염이다. 또한, 배지는 5 내지 25 mM 범위의 시트르산을 포함한다. 상기 화학적으로 정의된 배지에서 시트르산의 기능은 대장균이 박테리오파지에 감염되는 것을 방지하는 것이다. 대장균의 박테리오파지 감염은 박테리아 배양에서 흔한 문제로 배양에서 살아있는 박테리아 세포의 수를 감소시키며, 이는 역으로 재조합 단백질의 생성에 영향을 미쳐 이의 생성을 감소시킨다. 기계적으로, 박테리오파지는 시트르산에 매우 민감하며 시트르산의 존재 하에서는 박테리아를 감염시킬 수 없다. 재조합 단백질 생성에 사용되는 일반적인 LB 브로스(broth)는 시트르산이 부족하며 대장균에서 박테리오파지 감염 방지에 효과적이지 않다. 배지는 또한 마그네슘, 칼륨, 인, 및 나트륨의 염; 및 철, 코발트, 망간, 구리, 붕소, 몰리브덴, 및 아연으로 이루어지지만 이에 한정되지 않는 군으로부터 선택된 미량 원소의 염을 포함한다. 또한, 배지는 박테리아 세포의 멤브레인 전위 유지에 중요한 역할을 하고 단백질 분비를 향상시키는 글리신; 및 샤페론(chaperone) 분자로 작용하고 세포 내에서 재조합 단백질 폴딩(folding)을 향상시켜 봉입체 또는 응집체의 형성을 감소시키고 폴딩된 재조합 단백질의 세포외 분비를 촉진하는 아르기닌을 포함한다. 글리신은 분비를 향상시키는 반면 아르기닌은 분비 전에 단백질의 접힘을 보조한다. 글리신과 아르기닌은 함께 재조합 단백질의 분비를 보조한다. 또한, 배지는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA: ethylenediaminetetraacetic acid)을 포함하지만 이에 한정되지 않는 적어도 하나의 킬레이트제, 및 적어도 하나의 비타민, 보다 구체적으로 티아민을 포함한다.
표 2: 화학적으로 정의된 스타터 배양 배지, 초기 회분식 배지 및 관류 배지의 조성.
다른 실시형태에서, 본 발명은 분비된 재조합 GLP-1 펩타이드의 연속 생성 및 분리를 위한 관류 기반 발효 시스템을 사용하는, 대장균에 의한 재조합 GLP-1의 생성 및 분비 방법을 제공한다. 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 재조합 GLP-1 펩타이드를 인코딩하는 발현 벡터로 대장균을 형질전환시켜 재조합 대장균을 생성하는 단계;
b) 스타터 배양물의 OD600이 5.0 내지 6.0에 도달할 때까지 스타터 배양 성장 배지에서 배양물을 37℃에서, 225 rpm으로, 12시간 동안 성장시킴으로써 재조합 대장균의 스타터 배양물을 제조하는 단계;
c) 10 g/L 농도의 글루코오스/덱스트로오스를 포함하는 발효기 용기에 초기 회분식 배지를 첨가하고 pH를 6.9로 유지함으로써 관류 기반 발효기 시스템을 제조하는 단계;
d) 발효기 용기에 스타터 배양물을 첨가하고 pH를 6.9로 유지하기 위해 최초 1시간에는 3 N NaOH를 사용하고 최초 1시간 이후에 4 M 액체 암모니아를 사용하여 pH를 6.9로 유지하는 단계;
e) 재조합 대장균로부터 재조합 GLP-1 펩타이드의 생성 및 분비를 유도하기 위해 초기 회분식 배지 중의 잔류 글루코오스/덱스트로오스 농도가 약 5 g/L로 감소한 경우 락토오스 또는 락토오스 유사체와 같은 lac 오페론 유도제를 발효기 용기에 첨가하는 단계; 및
f) 투과액으로서 분비된 재조합 GLP-1 펩타이드를 함유하는 소비된 배양 배지로부터 잔류물로서 재조합 대장균을 분리하기 위해 유도 30 내지 40분 후 관류 기반 발효 시스템을 시작하고, 투과액으로부터 재조합 GLP-1 펩타이드를 수거하며, 재조합 GLP-1 펩타이드의 연속 생성 및 분비를 위해 발효기 용기에 신선한 관류 배지 및 잔류물 재조합 대장균을 재공급하는 단계.
관류 시스템은 관류 현탁 배양물에서 재조합 대장균을 성장시키는 것을 포함하며, 박테리아를 포함하는 배양 배지는 교호 접선 흐름에서 분리 시스템을 통해 순환되며, 분리 시스템은 재조합 GLP-1을 함유하는 소비된 배지를 함유하는 여액을 제거하고 연속 생성을 위해 배양 배지에서 대장균을 유지한다.
도 2는 공급 탱크(201); 공급 펌프(202); 레벨 센서(203); 모터(204); 발효기 용기(205); 자기 부상 펌프(206); 분리 모듈(207); 수거 펌프(208), 및 수거 탱크(209)를 포함하는 관류 기반 발효 및 분리 시스템의 개략도를 설명하며, 분리 모듈(207)에서 중공사 컬럼은 배양 배지로부터 분비된 재조합 GLP-1 펩타이드의 제거에 적합한 중공사 멤브레인의 필터 모듈을 포함한다.
공급 탱크(201)는 공급 펌프(202)를 통해 발효기 용기(205)로 펌핑되는 배지를 저장한다. 대장균 스타터 배양물 및 배지를 포함하는 배양 현탁액을 보유하는 발효기 용기(205)는 모터(204)에 의해 교반된다. 발효기 용기(205)는 자기 부상 펌프(206)를 통해 연속적으로 또는 간헐적으로 배수된다. 배지의 레벨은 레벨 센서(203)를 통해 유지된다. 배수된 액체는 중공사 멤브레인을 포함하는 필터 모듈을 더 통과한다. 발효기 용기(205)에서 배양 현탁액은 교호 접선 여과 흐름에서 분리 시스템을 통해 순환된다. 분리 모듈(207)은 잔류물로서 재조합 대장균 및 투과액으로서 재조합 GLP-1 펩타이드를 포함하는 소비된 배양 배지를 분리한다. 중공사 멤브레인을 더 포함하는 필터 모듈을 통해 여과된 현탁액은 소비된 배양 배지로부터 재조합 GLP-1을 적합하게 제거한다. 잔류물에서 여과된 대장균은 발효기 용기에 재도입된다. 소비된 배양 배지는 수거 펌프(208)를 통해 수거 탱크(209)로 펌핑된다.
바람직한 발명의 일 실시형태에서, 분리 모듈은 중공사, 예를 들어, 0.4 μm 내지 0.1 μm의 다공도, 예를 들어, 소비된 배양 배지로부터 분비된 재조합 GLP-1 펩타이드 제거를 위한 0.2 μm의 다공도를 갖는, 폴리설폰, 메틸 에스테르 또는 셀룰로오스 에스테르로 제조된 중공사를 포함하는 필터 모듈을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 분리 시스템은 500 kDa의 분자량 컷오프 기공 크기를 갖는 멤브레인을 포함하는 필터 모듈을 포함한다.
실시예 1
대장균 배양 및 형질전환
유전자 ompf의 신호 펩타이드 및 서열 번호 5의 절단된 yebf 펩타이드를 인코딩하는 서열 번호 3의 DNA 서열 캐리어 펩타이드의 조합을 갖는 분비 신호 서열과 함께 재조합 GLP-1 펩타이드를 인코딩하는 서열 번호 1을 포함하는 발현 벡터의 DNA 서열을 표시하는 서열 번호 6를 모든 실험 절차에 사용하였다.
대장균 BL21(DE3) 균주를 발현 시스템으로 선택하고 100 ng의 재조합 벡터 서열 번호 6을 취하여 화학적 형질전환법(즉, CaCl2)으로 형질전환시켰다. 화학 컴피턴트(competent) 세포(즉, B21(DE3))를 -80℃ 냉동고에서 꺼낸 후 4℃에서 인큐베이션하고 해동되도록 두었다. 세포를 4℃로 해동시킨 후, 벡터를 첨가하고 15분 동안 4℃에서 인큐베이션하고, 인큐베이션 후에 세포를 42℃에 약 1분 동안 노출시켜 열 충격을 가하였다. 열 충격을 가한 후 형질전환된 대장균 세포를 4℃에서 약 15분 동안 유지하였다. 거기에 루리아(Luria) 브로스(LB) 배지를 40분 동안 첨가하여 세포를 성장시켰다. 이후에 성장한 세포를 적절한 항생제 선택 기준에 따라 LB 한천 상에 도말하였다.
실시예 2
회분식 발효 및 관류 기반 발효
a) 스타터 배양물의 제조
표 3에 기재된 조성의 고압증기멸균된(autoclaved) 스타터 배양 배지를 사용하여 유가식 발효를 수행하기 위해 적절한 양의 예비 배양물을 제조하였다. 통상적으로, 300 ml의 성장 배지를 2리터 플라스크에 취하고 형질전환된 플레이트로부터 단일 콜로니 형성 단위를 무균적으로 접종하고 37℃에서 225 rpm으로 12시간 동안 유지된 회전 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 티아민, 미량 원소와 같은 필터 멸균된 배지 성분을 스타터 배양물을 설정하는 동안 재구성한다. 12시간의 배양이 끝나면, OD600이 약 5.0에 도달한다.
b) 회분식-발효 공정
표 3에 기재된 초기 회분식 배지의 조성의 성장 배지를 갖는 생물반응기를 45분의 유지 시간으로 121℃에서 고압증기멸균하고 나중에 전체 조립된 생물반응기를 SCADA 소프트웨어가 있는 컨트롤 타워의 도움으로 37℃로 낮췄다. 생물반응기를 패킹하는 동안 공기 흡입구 및 배출 장치용 0.2 마이크론 소수성 필터, 용존 산소 프로브, pH 프로브, 배플(baffle), 1:1 L/D 비로 유지되는 임펠러 블레이드를 도징 튜빙하는(dosing tubing) 모든 요구 사항을 부착한다.
발효 공정을 pH 6.90, 온도 37℃ 등 필요한 물리적 조건을 유지함으로써 시작한다. 통기와 같은 성장 프로파일 가변 매개변수를 기반으로 교반을 제어 장치에 의해 자동으로 제어한다. 무균적으로 스타터 배양물을 생물반응기로 이전한다. 티아민, 미량 원소와 같은 필터 멸균된 배지 성분의 재구성을 주입구로부터 생물반응기로 무균적으로 제공한다. 발효가 시작되는 동안 덱스트로오스를 10 g/L의 최종 농도가 되도록 첨가한다. MgSO4 스톡(stock) 용액을 배지 침전을 회피하기 위해 보충물 형태로 제공한다. pH를 최초 1시간 동안 3 N NaOH 및 발효 공정이 끝날 때까지 4 N 암모니아의 도움으로 유지한다. 세포를 약 0.6 /hr의 최대 성장률로 성장한다.
매 시간 샘플을 생물반응기에서 무균적으로 채취하고 블랭크(blank) 배지에 대해 600 nm로 설정된 분광광도계를 사용하여 세포 밀도를 측정한다. 잔여 글루코오스를 동일한 샘플로 디지털 혈당계를 사용하여 측정한다. 발효 3시간 후 공급을 지수(exponential) 형태로 수행한다. 약 40의 OD600에 도달한 후 잔여 글루코오스가 약 5 g/L인지 확인하여 IPTG, 즉 약 0.25 mM으로 배양을 유도한다.
유도 후 pH를 4 N 암모니아만 사용하여 6.90으로 유지한다. 발효 공정 전체를 통해 산을 사용하지 않는다. 글리신, 아르기닌, 글루타민산을 포함하는 배양물에 보충제를 첨가하여 최종 농도가 각각 2mM이 되도록 한다. 매 시간 샘플을 채취하고 원심분리하여 세포와 배지를 분리한 다음 나중에 PAGE를 사용하여 분석하여 세포에서 재조합 단백질 발현의 존재 및 배지에서 분비량을 검출한다. 6시간의 유도 종료 후 배양물을 채취하고 원심분리하여 세포와 배지를 분리한다.
c) 관류 기반 발효 프로토콜
BL21(DE3)을 사용하여 적절한 플라스미드를 취하여 열 충격을 가하고 선택적 항생제 LB 한천 플레이트에 도말한 후 37℃의 인큐베이터에서 12시간 동안 인큐베이션하여 형질전환된 세포를 준비한다. 성장 배지를 배지 성분을 취하고 탈이온수에 용해하여 제조하고 5 N NaOH를 사용하여 pH 6.90으로 조정한다. 스타터 배양 배지를 고압증기멸균기에서 45분 유지 시간으로 121℃에서 멸균한다. 열에 약한 다른 모든 배지 성분, 예를 들어, 티아민, 카나마이신, 미량 원소를 필터로 멸균한다. 덱스트로오스와 MgSO4.7H2O를 별도로 고압증기멸균한다. 스타터 배양물을 LB 한천 플레이트의 콜로니를 진탕 플라스크에 접종하여 준비한다. 필터 멸균된 배지 성분, 즉 티아민, 카나마이신 50 mg/Lit, 미량 원소 1000x를 1% 덱스트로오스, MgSO4.7H2O- 5 mM, 효모 추출물 0.2%와 함께 첨가하였다. 플라스크를 37℃에서, 225 rpm으로, 진탕 인큐베이터에서 밤새 인큐베이션하였다.
사전 보정된(pre-calibrated) pH 프로브로 충진된 생물반응기 용기, 옥실라이트(oxylyte)로 재충전한 이후 용존 산소(DO) 프로브에 장착된 새로운 멤브레인과 함께 소포 센서, 스파저 파이프(sparger pipe) 및 각각 0.2 μ 소수성 벤트(vent) 필터, 배플이 장착된 배기 파이프. 표 3에 기재된 바와 같이 초기 회분식 배지를 재구성 가능한 배지 성분에 해당하는 부피를 제외하고 발효기 용기에 붓는다. 발효기 용기를 121℃, 45분 유지 시간, 15 psi에서 고압증기멸균한 후 실온으로 냉각하고 제어 장치에 부착하였다. 발효기 용기를 DO 프로브 분극화(polarization)를 위해 밤새 0.1 분당 표준 리터(SLPM)의 공기로 퍼지한다. DO를 스타터 배양물을 추가하기 직전에 보정한다. 배지 재구성을 스타터 배양물을 추가하기 전에 수행한다. 도징(dosing) 병을 부착하고 튜브를 프라이밍한다. 모든 매개변수를 제어 장치에서 설정한다. 즉, pH를 0.1% 데드 밴드(Dead band)로 6.90으로 설정하고, DO를 캐스캐이드(cascade) 모드에서 30%, 오토 모드에서 산/염기, 0.1% Sigma Antifoam 204로 소포 센서로 설정하고, 온도를 37℃로 설정한다. DO를 교반, 분당 가스 유량, 순수 산소 퍼징의 %로 캐스케이드 모드에서 제어한다. 초기 RPM를 200으로 설정한다. 사전 배양물을 무균적으로 생물 반응기로 이전한다. 최초 1시간 pH는 3 N NaOH를 갖는 도징 병을 부착하여 유지한다. 나머지 배치 pH를 4 M 액체 암모니아로 유지한다. MgSO4.7H2O를 발효 0시간부터 3회분 동안 무균적으로 재구성한다. 매 시간 샘플링을 수행하여 UV/Vis 분광광도계로 세포 밀도 및 혈당계로 잔류 글루코오스를 확인한다. 5시간 후 또는 약 5 g/L의 잔류 글루코오스가 있는 배치를 0.2 mM IPTG로 배양을 유도하기 위한 이상적인 시점으로 선택한다. 멸균 500 kDa 중공사를 관류 장비에 연결하고 멸균 초기 회분식 배지로 평형화하며, 이후 튜브를 생물반응기에 연결한다. 유도 관류를 시작한지 30분 후, 여기에서 배양물을 펌프에 의해 자동으로 용기 밖으로 빼내고 중공사를 통과하고, 재조합 대장균 세포를 함유하는 중공사로부터의 잔류물을 생물반응기로 다시 보낸다. 펌프 속도를 약 16.6 ml/분으로 설정하여 중공사의 투과액 말단에서 수거물을 수집하고 동시에 동일한 유량으로 관류 배지를 발효기 용기에 첨가한다. 관류 배지가 완료될 때까지 전체 발효를 실행한다. 관류 배지 공급이 완료된 후, 투과액의 1/3을 끌어 들여 배치 부피의 2/3로 배양물을 농축하고 회분을 종료한다. 유도 후 매 시간 샘플을 채취하여 재조합 GLP-1 펩타이드의 발현 및 분비를 확인한다. 중공사를 0.5 N NaOH로 소독하고 0.1 N NaOH에 저장한다.
표 3: 배지의 조성
실시예 3
재조합 박테리아의 성장 및 재조합 GLP-1 펩타이드의 분비의 효율
배양 배지에서 성장 속도, 글루코오스 소비, 재조합 단백질 생성 및 분비를 회분식 발효 공정을 사용하여 다른 시간에 시험하였다.
도 3a는 표시된 시점에서의 분비 신호 서열 및 친화성 태그 및 재조합 대장균의 성장과 함께 10 kDa의 재조합 GLP-1 펩타이드의 생성을 나타내는 선 그래프를 제공하고, 이는 박테리아의 꾸준한 성장 및 배지에서 재조합 단백질 분비의 증가를 시사한다. 그러나, 회분식 방법 하에서는, 회분식 발효공정이 4시간에 완료될 때 2.5 g/L 미만이 생성된다.
또한, 발효 중 IPTG를 이용한 유도 후 표시된 시점에서 5 마이크로리터의 배양 상청액을 수집하고, 각 시점의 재조합 대장균 세포 용해물을 또한 수집한 다음 환원 SDS-PAGE로 분석하여 비교하였다. 도 3b에 도시된 바와 같이, 유도 1시간 이내에 재조합 GLP-1 펩타이드가 박테리아에 의해 생성되고 분비되기 시작하였다. 이것은 시간이 지남에 따라 꾸준히 증가하였다. 또한, 세포 용해물에는 재조합 GLP-1 펩타이드가 거의 존재하지 않아 재조합 박테리아에 의한 효율적인 분비를 시사한다. 이는 화학식적으로 정의된 회분식 배지 조성에 의해 가능하게 되는 재조합 GLP-1 펩타이드의 분비에서 벡터 서열 번호 6의 효율을 시사하였다.
발효 공정 동안에 글루코오스 소비를 또한 분석하였다. 도 4에 도시된 바와 같이, 관류 기반 발효 공정에 스타터 배양물을 접종한 지 1시간 직후에 최적 속도로 글루코오스 소비가 시작된다. 본 발명자들은 최대 성장률을 달성하고 그에 따라 적절한 세포 밀도를 달성하기 위해 세포 증식 단계를 시작하기 전에 추가해야 할 필요가 있는 적절한 양의 글루코오스를 표준화하고 설정하였다. 그램 당 수율은 최적으로 유지되므로 전통적인 세포 증식 기법에 비해 방법을 경제적이고 신뢰할 수 있도록 한다. 초기 회분식 배지는 10 g/L 농도의 글루코오스/덱스트로오스를 가지며, 잔류 글루코오스/덱스트로오스 농도가 약 5 g/L에 도달하면 유도를 수행한다. 그러므로, 화학적으로 정의된 회분식 배지와 함께 서열 번호 6의 벡터를 사용하는 것은 재조합 GLP-1 펩타이드의 성장 및 분비에 최적이다.
실시예 4
재조합 GLP-1 펩타이드의 엔테로키나제 분해
재조합 GLP-1 펩타이드를 인코딩하는 DNA 서열은 엔테로키나제 인식 서열(DDDDK)에 의해 분비 신호 서열로부터 분리되어 재조합 GLP-1 펩타이드를 수거한 후 분비 신호 서열로부터 재조합 GLP-1 펩타이드를 분리할 수 있게 된다. GLP-1 펩타이드는 정제 과정을 위해 His-tag와 함께 탠덤으로 있다.
도 5에 도시된 바와 같이, 재조합 GLP-1 펩타이드는 배지에서 분비되고, 일단 엔테로키나제로 분해되면 His-친화성 크로마토그래피를 사용한 정제 후 분비 신호 서열의 분리를 시사하는 더 작은 밴드를 생성한다.
실시예 5
관류 기반 발효에 의한 재조합 GLP-1 펩타이드 생성
관류 기반 발효 공정을 실시예 2c에 설명된 바와 같이 서열 번호 6으로 형질전환된 재조합 대장균을 사용하여 수행하였다. 임의의 시점에서 발효기는 1 리터의 발효용 배지를 보유할 수 있으며, 이 배지는 재조합 박테리아를 회수하기 위해 여과되고 분비된 재조합 GLP-1 펩타이드를 함유하는 소비된 배지이다. 분비된 재조합 단백질을 소비된 배지를 제거하여 시간당 1 L의 속도로 연속적으로 수거한다. 소비된 배지가 제거되면 발효기에 동일한 양의 신선한 관류 배지 및 잔류물 대장균을 재공급하여 연속 발효 등을 수행한다. 매 시간 소량의 샘플을 정량화 및 분석을 위해 수집한다. 관류 발효의 하나의 연속 배치에서 총 10 L의 배지를 10시간 동안 발효한다.
도 6a는 관류 기반 발효 시스템에서 발효된 박테리아 세포의 성장 곡선을 설명한다. 5시간 후 또는 약 5 g/L의 잔류 글루코오스가 있는 배치 이후에, IPTG를 사용한 유도를 시작하였다. 유도 1시간 후, 세포 증식을 최소 속도로 유지하기 위해 제한 영양소를 보충하기 위해 관류를 시작하였다. 도 6a에 도시된 바와 같이, 대장균 OD600을 8 내지 10 사이에서 유지한다. 또한, 대부분의 시간을 박테리아 수의 증가 대신 재조합 단백질 생성에 사용한다.
SDS-PAGE 분석을 위해 재조합 단백질을 함유하는 총 9 리터의 배지를 수집하는 관류 방법에서 0.25 mM IPTG로 유도 0, 2, 4 및 6시간 후에 배지 샘플을 수집하고 분석하였다. 도 6b에 도시된 바와 같이, 10 kDa 재조합 GLP-1 펩타이드 분비는 IPTG 유도 후 2시간 만에 확인되었으며, 분비되는 재조합 GLP-1 펩타이드의 양은 6시간 후에도 거의 동일하다. 이는 재조합 GLP-1 펩타이드의 연속적인 생성이 장기간에 걸쳐 일관되게 관류 기반 발효 방법으로 보인다는 것을 분명히 나타낸다.
도 6c에 도시된 바와 같이, 1시간 이내에 재조합 GLP-1 펩타이드의 생성 자체가 1 g/L에 도달하고, 10시간 후에도 생성율은 약 1 g/L였다. 이는 관류 기반 발효 방법을 사용하여 화학적으로 정의된 배지로 서열 번호 6을 사용하여 1 g/L/hr의 속도로 재조합 GLP-1 펩타이드의 꾸준한 생성을 시사하였다.
특정 예시적인 실시형태가 첨부된 도면에서 설명되고 도시되었지만, 상기 단락에 명시된 것 외에도 다양한 다른 변경, 조합, 생략, 수정 및 치환이 가능하기 때문에 이러한 실시형태는 광범위한 발명의 단지 예시적인 것이고 광범위한 발명을 제한하지 않으며 본 발명은 도시되고 설명된 특정 구성 및 배열로 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 당업자는 방금 설명된 실시형태의 다양한 적응 및 수정이 본 발명의 범위 및 사상을 벗어나지 않고 구성될 수 있음을 이해할 것이다.
SEQUENCE LISTING
<110> ONCOSIMIS BIOTECH PRIVATE LIMITED
<120> METHOD FOR CONTINOUS PRODUCTION OF RECOMBINANT GLP-1 PEPTIDE BY
BACTERIA
<130> Sudarshan -GLP1
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<210> 1
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
cacgcggaag gcaccttcac cagcgatgtg agcagctacc tggagggtca ggcggcgaaa 60
gaatttatcg cgtggctggt tcgtggtcgt ggc 93
<210> 2
<211> 99
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 2
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<211> 99
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 3
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ggtattgcgg cgagcgttaa acgtgactac cagcaaaac 99
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<211> 33
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 4
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Leu Asp Ala Ala Gly Ile Ala Ala Ser Val Lys Arg Asp Tyr Gln Gln
20 25 30
Asn
<210> 5
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<212> PRT
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1 5 10 15
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20 25 30
Asn
<210> 6
<211> 6793
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Bacterial Expression vector encoding recombinant GLP-1 peptide in
conjugation with secretory sequence
<400> 6
tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60
cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120
ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180
gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240
acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300
ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360
ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420
acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480
tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540
tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600
tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660
actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720
gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780
aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840
agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900
cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960
aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020
tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080
tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140
taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200
ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260
tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320
tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380
cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440
cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500
gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560
gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620
agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680
aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740
agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800
cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860
accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920
aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980
ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040
cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100
gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160
tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220
agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280
tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340
caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400
ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460
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gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580
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aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700
ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760
acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820
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ttgacacgcc cgggcgacgg atggtgatcc ccctggccag tgcacgtctg ctgtcagata 5520
aagtctcccg tgaactttac ccggtggtgc atatcgggga tgaaagctgg cgcatgatga 5580
ccaccgatat ggccagtgtg ccggtctccg ttatcgggga agaagtggct gatctcagcc 5640
accgcgaaaa tgacatcaaa aacgccatta acctgatgtt ctggggaata taaatgtcag 5700
gctccgttat acacagccag tctgcagcga tcccgcgaaa tttgacaatt aatcatcggc 5760
tcgtataatg tgtggaattg tgagcggata acaattcccc tctagaaata attttgttta 5820
actttaagaa ggagatatac atatgatgaa acgtaatatc ctggcggtga ttgttccggc 5880
gctgctggtt gcgggcaccg cgaatgcggc gaataatgag accagcaaaa gcgtgacctt 5940
tccgaaggcg gaggacctgg atgcggcggg tattgcggcg agcgttaaac gtgactacca 6000
gcaaaacggt ggcagcggtg gcagcggtag ccaccatcat catcaccaca gcagcggtgg 6060
cagcggtacc gactataagg acgatgacga taaacacgcg gaaggcacct ttaccagcga 6120
tgtgagcagc tacctggagg gtcaagcggc gaaggagttc attgcgtggc tggtgcgtgg 6180
tcgtggctaa tagtgagcgg ccgcggctgt tttggcggat gagagaagat tttcagcctg 6240
atacagatta aatcagaacg cagaagcggt ctgataaaac agaatttgcc tggcggcagt 6300
agcgcggtgg tcccacctga ccccatgccg aactcagaag tgaaacgccg tagcgccgat 6360
ggtagtgtgg ggtctcccca tgcgagagta gggaactgcc aggcatcaaa taaaacgaaa 6420
ggctcagtcg aaagactggg cctttcgttt tatctgttgt ttgtcggtga acgctctcct 6480
gagtaggaca aatccgccgg gagcggattt gaacgttgcg aagcaacggc ccggagggtg 6540
gcgggcagga cgcccgccat aaactgccag gcatcaaatt aagcagaagg ccatcctgac 6600
ggatggcctt tttgcgtttc tacaaactct ctcgagcacc accaccacca ccactgagat 6660
ccggctgcta acaaagcccg aaaggaagct gagttggctg ctgccaccgc tgagcaataa 6720
ctagcataac cccttggggc ctctaaacgg gtcttgaggg gttttttgct gaaaggagga 6780
actatatccg gat 6793
Claims (8)
- 박테리아, 보다 구체적으로 대장균(E. coli)에 의한 재조합 GLP-1의 연속 생성 및 분비 방법으로서,
a) 재조합 GLP-1 펩타이드를 인코딩하는 발현 벡터로 대장균을 형질전환시켜 재조합 대장균을 생성하는 단계;
b) 스타터 배양물의 OD600이 5.0 내지 6.0에 도달할 때까지 스타터 배양 성장 배지에서 상기 배양물을 37℃에서, 225 rpm으로, 12시간 동안 성장시킴으로써 재조합 대장균의 스타터 배양물을 제조하는 단계;
c) 10 g/L 농도의 글루코오스/덱스트로오스를 포함하는 발효기 용기에 초기 회분식(batch) 배지를 첨가하고 pH를 6.9로 유지함으로써 관류 기반 발효기 시스템을 제조하는 단계;
d) 상기 발효기 용기에 상기 스타터 배양물을 첨가하고 최초 1시간에는 3 N NaOH를 사용하고 최초 1시간 이후에 4 M 액체 암모니아를 사용하여 상기 pH를 6.9로 유지하는 단계;
e) 재조합 대장균로부터 재조합 GLP-1 펩타이드의 생성 및 분비를 유도하기 위해 상기 초기 회분식 배지 중의 잔류 글루코오스/덱스트로오스 농도가 약 5 g/L로 감소한 경우 락토오스 또는 락토오스 유사체와 같은 lac 오페론 유도제를 상기 발효기 용기에 첨가하는 단계; 및
f) 투과액(permeate)으로서 분비된 재조합 GLP-1 펩타이드를 함유하는 소비된(spent) 배양 배지로부터 잔류물(retantate)로서 재조합 대장균을 분리하기 위해 유도 30 내지 40분 후 관류 기반 발효 시스템을 시작하고, 상기 투과액으로부터 재조합 GLP-1 펩타이드를 수거하며, 재조합 GLP-1 펩타이드의 연속 생성 및 분비를 위해 상기 발효기 용기에 신선한 관류 배지 및 상기 잔류물 재조합 대장균을 재공급하는 단계;를 포함하며,
여기서,
재조합 GLP-1을 인코딩하는 상기 DNA 서열은 서열 번호 1이고;
유전자 ompf의 신호 펩타이드 및 서열 번호 5의 절단된 yebf 펩타이드를 인코딩하는 서열 번호 3의 DNA 서열 캐리어(carrier) 펩타이드의 조합을 포함하는 분비 신호 서열과 함께 DNA 서열인 서열 번호 1;
상기 재조합 발현 벡터는 서열 번호 6이며; 그리고
서열 번호 6을 사용하는 재조합 발현 벡터는 관류 기반 발효 시스템을 사용하여 1 내지 1.2 g/L/시의 범위에서 재조합 GLP-1 펩타이드를 분비하는, 방법. - 제1항에 있어서,
상기 초기 회분식 배지는 139 mM 글루코오스/덱스트로오스; 30.2 mM 질소원, 보다 구체적으로, 인산이암모늄; 안정화제로서 54.29 mM 글리세롤; 8.84 mM 시트르산; 필수 아미노산으로서 1 mM 글리신; 양으로 하전된 아미노산으로서 1 mM 아르기닌; 0.06 mM 티아민; 5 mM 황산마그네슘 칠수화물; 97.73 mM 인산이수소 칼륨; 2.13 mM 염화나트륨; 0.09 mM 염화칼슘; 및 미량 원소의 염을 포함하는 화학적으로 정의된 배지인, 방법. - 제1항에 있어서,
상기 관류 배지는 13.9 mM 글루코오스/덱스트로오스; 30.2 mM 질소원, 보다 구체적으로, 인산이암모늄; 안정화제로서 54.29 mM 글리세롤; 8.84 mM 시트르산; 필수 아미노산으로서 1 mM 글리신; 양으로 하전된 아미노산으로서 1 mM 아르기닌; 0.06 mM 티아민; 5 mM 황산마그네슘 칠수화물; 97.73 mM 인산이수소 칼륨; 2.13 mM 염화나트륨; 0.09 mM 염화칼슘; 및 미량 원소의 염을 포함하는 화학적으로 정의된 배지인, 방법. - 제1항에 있어서,
상기 관류 기반 발효 시스템은 공급 탱크(201); 공급 펌프(202); 레벨 센서(203); 모터(204); 발효기 용기(205); 자기 부상 펌프(206); 분리 모듈(207); 수거 펌프(208), 및 수거 탱크(209)를 포함하며, 상기 분리 모듈(207)은 상기 배양 배지로부터 분비된 재조합 단백질의 제거에 적합한 중공사 멤브레인의 필터 모듈을 포함하고; 상기 중공사막의 필터 모듈은 0.4 μm 내지 0.1 μm, 보다 구체적으로 0.2 μm의 다공도를 갖는 폴리설폰 및 메틸 에스테르 또는 셀룰로오스 에스테르를 포함하고; 상기 멤브레인은 500 kDa의 컷오프 기공 크기를 가지고 있는, 방법. - 제1항에 있어서,
상기 관류 기반 발효 시스템은 상기 재조합 대장균을 포함하는 배양 배지가 교호(alternating) 접선 흐름에서 분리 시스템을 통해 순환될 수 있게 하고, 상기 분리 시스템은 상기 배양 배지에서 재조합 GTP-1 펩타이드를 함유하는 소비된(spent) 배지를 함유하는 여액을 제거하고 연속 생성을 위해 상기 배양 배지에서 상기 재조합 대장균을 유지하는, 방법. - 박테리아, 보다 구체적으로 대장균에 의해 재조합 GTP-1 펩타이드의 생성 및 분비를 위한 발현 벡터로서,
GTP-1 펩타이드를 인코딩하는 DNA 서열;
a) pelB, ompA, yebF 및 ompF로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 신호 서열을 인코딩하는 적어도 하나의 DNA 서열, 및 b) 캐리어(carrier) 펩타이드를 인코딩하는 적어도 하나의 DNA 서열, 절단된 yebF를 각각 인코딩하는 DNA 서열인 서열 번호 2 또는 서열 번호 3의 조합인 적어도 하나의 분비 신호 서열;
적어도 하나의 유도성 프로모터, RBS, 상기 재조합 GLP-1 펩타이드를 인코딩하는 DNA 서열, 친화성 태그(tag)를 인코딩하는 DNA 서열, 및 적어도 하나의 유전자 터미네이터(terminator)를 상기 분비 신호 서열, 및 상기 재조합 GLP-1 펩타이드의 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 친화성 태그의 DNA 서열과 함께 포함하는 적어도 하나의 유전자 발현 카세트(cassette);
숙주 박테리아 세포에서 상기 벡터의 복제를 위한 적어도 하나의 박테리아 ori 유전자 서열; 및
적합한 프로모터로 선택 가능한 마커를 코딩하기 위한 적어도 하나의 DNA 서열 및 상기 선택 가능한 마커의 DNA 서열에 인접하는 유전자 터미네이터 서열;을 포함하며,
여기서,
재조합 GLP-1 펩타이드를 인코딩하는 상기 DNA 서열은 서열 번호 1이고;
유전자 ompf의 신호 펩타이드 및 서열 번호 5의 절단된 yebf 펩타이드를 인코딩하는 서열 번호 3의 DNA 서열 캐리어 펩타이드의 조합을 포함하는 분비 신호 서열과 함께 DNA 서열인 서열 번호 1;
재조합 GLP-1을 인코딩하는 상기 제조합 발현 벡터는 서열 번호 6이고;
서열 번호 6을 사용하는 재조합 발현 벡터는 관류 기반 발효 시스템을 사용하여 1 내지 1.2 g/L/시의 범위에서 재조합 GLP-1 펩타이드를 분비하는, 발현 벡터. - 제6항에 있어서,
서열 번호 3의 절단된 yebF를 인코딩하는 상기 DNA 서열은 서열 번호 2를 변이함으로써 합성되며, 서열 번호 2에서 위치 40에 있는 TGC 코돈은 GCG 코돈으로 변이되어 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열의 위치 14에 있는 Cys를 서열 번호 5로 표시된 아미노산 서열의 위치 14에 있는 Ala로 변이시키는, 발현 벡터. - 제6항에 있어서,
상기 벡터에서 선택 가능한 마커는 적어도 하나의 항생제 내성 유전자 서열, 및 lac 오페론을 포함하는 추가 선택 마커를 포함하는, 발현 벡터.
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