CN109439680B - 一种制备抗菌重组蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，涉及一种抗菌蛋白基因设计合成、表达、分离纯化方法，具体是制备基于III型人纤维连接蛋白(Fn3)和海蛇抗菌肽(Hc‑CATH)抗菌重组蛋白的方法。该方法通过基因重组，将编码III型人纤维连接蛋白(Fn3)的核苷酸序列通过编码10‑15个天冬酰胺(Asn)序列与编码海蛇抗菌肽(Hc‑CATH)核苷酸序列重组，合成III型人纤维连接蛋白Fn3与海蛇抗菌肽Hc‑CATH融合基因，利用大肠杆菌表达系统高效表达、制备具有抗菌活性的融合蛋白。本发明的有益效果是可以简单、快速、高效制备具有抗菌活性的融合蛋白。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种抗菌蛋白基因设计合成、表达、分离纯化方法，具体是制备基于III型人纤维连接蛋白(Fn3)和海蛇抗菌肽(Hc-CATH)的抗菌重组蛋白的方法。
背景技术
海蛇抗菌肽Hc-CATH是近期发现的来源青环海蛇(Hydrophis cyanocinctus)的一种由30个氨基酸组成的抗菌肽，具有广谱抗菌和抗炎症反应的耐热性的多肽，对革兰阳性和革兰阴性菌和人病原菌均有抗性。Hc-CATH抗菌肽对真核生物细胞具有非常低的毒性，包括肿瘤细胞、正常细胞株、红细胞、巨噬细胞等。而且该抗菌肽耐高盐、高温及蛋白酶水解。
天然抗菌肽提取工艺复杂，成本昂贵，而且资源有限。目前，主要采取化学合成的方法生产抗菌肽，但该方法成本高，从而限制了抗菌肽在实际上的应用。目前人们应用基因工程方法研究生产抗菌肽主要采取将抗菌肽和硫氧还蛋白、G蛋白等融合的方法生产融合多肽的重组蛋白，获得融合蛋白后通过酶法或化学方法切断融合蛋白释放出多肽,再进一步纯化获得抗菌肽单体,提取步骤比较繁琐。另外重组抗菌肽在大肠杆菌中表达的过程中往往产生包涵体，增加了生产抗菌肽工艺步骤、降低收率、提高成本。因此需要探寻一种高效低成本制备具有抗菌和抗炎活性抗菌重组蛋白的方法。
发明内容
为解决现有技术中的缺陷，本发明提供一种制备基于III型人纤维连接蛋白(Fn3)和海蛇抗菌肽(Hc-CATH)抗菌重组蛋白的方法。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种制备基于III型人纤维连接蛋白(Fn3)和海蛇抗菌肽(Hc-CATH)抗菌重组蛋白的方法，其特征在于，所述方法采用III型人纤维连接蛋白结构域(Fn3)蛋白为融合蛋白，通过编码多聚天冬酰胺(Asn)核苷酸序列与编码海蛇抗菌肽(Hc-CATH)核苷酸序列重组，合成III型人纤维连接蛋白Fn3与海蛇抗菌肽Hc-CATH融合基因后，在大肠杆菌体内表达后进行分离纯化，该重组蛋白命名为Fn3-Hc-CATH。
上述一种制备Fn3-Hc-CATH抗菌重组蛋白的方法，所述方法具体包括以下步骤：
(1)III型人纤维连接蛋白Fn3融合Hc-CATH重组蛋白表达载体构建：
在Fn3基因的5′-端前面引入编码6个组氨酸残基，在Fn3的3′末端通过编码多聚天冬酰胺(Asn)的核苷酸序列与编码Hc-CATH核苷酸序列相连，构成Fn3-Hc-CATH的融合基因，将所述融合基因化学合成后，克隆到大肠杆菌胞内表达载体pET28a(+)上得到重组表达质粒pET28a-Fn3-Hc-CATH重组质粒；
(2)重组蛋白Fn3-Hc-CATH BL21(DE3)菌株的筛选及表达：
步骤(1)中获得的pET28a-Fn3-Hc-CATH重组质粒用转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)，筛选出阳性转化子进行诱导表达后，收集菌体，检测蛋白质表达量及是否表达Fn3-Hc-CATH融合重组抗菌蛋白，筛选出高水平诱导表达Fn3-Hc-CATH重组蛋白工程菌株。
(3)重组Fn3-Hc-CATH抗菌蛋白分离纯化
将步骤(2)诱导表达的菌体，提取胞内可溶重组蛋白，通过镍柱亲和层析方法，分离纯化携带His-tag的重组蛋白，获得纯化的重组Fn3-Hc-CATH抗菌蛋白。
(4)将步骤(3)纯化后的重组Fn3-Hc-CATH抗菌蛋白采用脱盐柱的方法除盐，低温保存。
上述一种制备Fn3-Hc-CATH抗菌重组蛋白的方法，步骤(1)中在所述融合基因上游引入编码6个组氨酸的分离纯化标签(His-tag)，以便于分离纯化。
上述一种制备Fn3-Hc-CATH抗菌重组蛋白的方法，步骤(1)中多聚天冬酰胺可由编码10-15个天冬酰胺碱基序列组成。
上述一种制备Fn3-Hc-CATH抗菌重组蛋白的方法，步骤(1)中多聚天冬酰胺可由编码10-15个天冬酰胺碱基序列组成。
上述制备方法得到的Fn3-Hc-CATH抗菌重组蛋白在杀灭病原菌中的应用。
本发明采用人III型纤维连接蛋白Fn3通过设计合理的柔链与抗菌肽Hc-CATH融合，在大肠杆菌体内高效表达具有抗菌活性的Fn3-Hc-CATH重组蛋白，本发明方法可以简单、快速、高效制备具有抗菌活性的融合蛋白，也可用于Fn3通过编码多聚天冬酰胺融合其它具有抗菌活性的短肽，获得抗菌重组基因，进而通过大肠杆菌大量表达重组抗菌蛋白，为高效低成本制备具有抗菌活性的抗菌重组蛋白奠定基础。用本发明方法制备的Fn3-Hc-CATH重组抗菌蛋白还具有杀灭病原菌的作用，有望在临床治疗创伤感染提供一条崭新的途径。
附图说明
图1是本发明的Fn3-Hc-CATH基因结构图；
图2是本发明的pET28a-Fn3-Hc-CATH的载体结构图；
图3是本发明的Fn3-Hc-CATH在大肠杆菌BL21(DE3)中表达的重组蛋白SDS-PAGE图；
图中，1.标准蛋白质；2.IPTG诱导前上清液；3.IPTG诱导前菌体；4.IPTG诱导4小时上清液；5.IPTG诱导4小时菌体；6.无诱导4小时上清液；7.无诱导4小时菌体；8.IPTG诱导4小时收集菌体超声破碎后的上清(用PBS进行十倍稀释)；9.IPTG诱导4小时收集菌体超声破碎后的上清；10.PTG诱导4小时收集菌体超声破碎后的沉淀；
图4是本发明的Fn3-Hc-CATH在大肠杆菌BL21(DE3)中表达的重组蛋白wastern-blot图；
图中，1.IPTG诱导3小时后的上清；2.IPTG诱导3小时后菌体；
图5是本发明的重组Fn3-Hc-CATH蛋白分离纯化SDS-PAGE图；
图中，1-3为100nM咪唑洗脱分离纯化的Fn3-Hc-CATH重组蛋白，M.标准蛋白质
具体实施方式
以下结合具体实施方式对本发明做进一步说明。
实施例1
制备Fn3-Hc-CATH抗菌重组蛋白，具体步骤为：
(1)III型人纤维连接蛋白Fn3融合Hc-CATH重组蛋白表达载体构建：采用III型人纤维连接蛋白结构域(Fn3)蛋白为融合蛋白(EMBL登入号码AJ320527)。在Fn3基因的5′-端前面引入编码6个组氨酸残基，在Fn3的3′末端通过编码13个天冬酰胺(Asn)的基因序列(aacaacaacaacaacaacaacaacaacaacaacaacaac)(简称Poly N)与编码Hc-CATH基因序列相连，构成Fn3-Hc-CATH的重组基因片段，重组基因结构见图1。
将Fn3-Hc-CATH序列表所示的Fn3-Hc-CATH基因序列,通过Nco Ⅰ和Hind Ⅲ构建到大肠杆菌表达载体pET28a(+)上，得到重组载体pET28a-Fn3-Hc-CATH，载体结构见图2。(合成基因由苏州省心生物技术有限公司完成)
(2)重组蛋白Fn3-Hc-CATH BL21(DE3)菌株的筛选及表达：
步骤(1)中获得的重组表达质粒pET28a-Fn3-Hc-CATH重组质粒用热激方法转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)，用含有50μg/mL卡那霉素筛选出的阳性转化子在LB培养基中培养OD600＝0.6-0.8时,进行IPTG诱导表达，诱导表达3-6小时后，收集菌体SDS-PAGE检测蛋白质表达量，并用蛋白印迹方法检测是否表达Fn3-Hc-CATH融合重组抗菌蛋白，筛选出高水平诱导表达Fn3-Hc-CATH抗菌蛋白菌株；
具体操作为：从步骤(1)中筛选出的诱导型阳性转化子在LB平板上划线培养1天,挑取单菌落接种于含有50μg/mL卡那霉素的1ml LB培养基的5ml离心管中，37℃200rpm过夜培养,第二天，按1％的接种量,接种到新的含有50μg/mL卡那霉素的500ml的LB培养基中，37℃200rpm培养OD600＝0.6-0.8时,加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)终浓度为1毫摩尔，28℃200rpm进行重组蛋白的诱导表达，诱导3-5小时后，经4000rpm离心10min，收集菌体。用SDS-PAGE检测蛋白表达量，最终筛选获得高水平并正确表达可溶性重组Fn3-Hc-CATH抗菌蛋白的大肠杆菌菌株；其中，LB培养基是由酵母粉5g、10g蛋白胨、5g氯化钠，调节pH值至7.2-7.4，加水至1000ml制成。
(3)重组Fn3-Hc-CATH抗菌蛋白分离纯化
将步骤(2)中筛选出的高表达可溶性重组Fn3-Hc-CATH抗菌蛋白的大肠杆菌菌株，进行诱导表达后，4000rpm/min，离心10min，收集菌体，置-20℃，反复冻融三次，加溶菌酶使终浓度为加溶菌酶至100μg/ml，37℃，孵育20min，超声破碎，超声破碎条件：300w，4s，间6s，20min，破菌缓冲液：20nM PBS(含150nM NaCl),pH＝7.4。12000rpm，4℃离心20min，留取上清，离心2次，加DNase终浓度为0.1％，冰浴20min，12000rpm，4℃离心15min，留上清，上清加20nM PBS(含150nM NaCl)混匀后，加3％的Tween 20，过膜后，用Ni-NTA SepharoseTMexcel column一步法进行纯化，获得纯化的Fn3-Hc-CATH抗菌蛋白。
用Ni-NTA SepharoseTM excel column一步法进行纯化，获得纯化的Fn3融合Hc-CATH抗菌肽，具体步骤如下：
用平衡缓冲液平衡Ni-NAT层析柱10个柱体积，将上述蛋白样品上柱，进行亲和交换层析，样品上柱完毕后，继续用平衡缓冲液洗10个柱体积，接着分别用含有40、60、80、100、120和200mM咪唑浓度的平衡缓冲液进行梯度分段洗脱，收集洗脱液，即获得纯化后的Fn3融合Hc-CATH抗菌肽，用SDS-PAGE检测蛋白纯化的效果。
(4)将步骤(3)纯化后的重组Fn3-Hc-CATH抗菌蛋白采用脱盐柱的方法除盐，集洗脱液，用酶标仪测定OD280，根据该抗菌蛋白的分子量，计算出获该重组抗菌蛋白的浓度2.80mg/ml。
实施例2
Fn3-Hc-CATH抗菌重组蛋白对对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌在不同作用时间的杀菌作用
悬液定量杀菌实验方法和杀菌率计算方法：将实施例1获得Fn3-Hc-CATH重组抗菌蛋白，用Ф＝0.22μm滤菌器，滤过除菌后，作为测试用重组抗菌蛋白，用无菌生理盐水做对照，采用悬液定量杀菌试验，具体方法如下：取无菌生理盐水稀释后的重组抗菌蛋白380μl+20μl的大肠埃希菌菌悬液，混匀后，重组蛋白终浓度为1.4mg/ml，孵育后不同时间取样，取50μl，涂布于MH平板上，置37℃恒温培养18-24小时，进行常规活菌计数，每个处理重复3次，无菌生理盐水做对照。菌量终浓度大约为104CFU/ml,观察其杀菌效果，计算杀菌率，重复2次。活菌计数方法为：活菌数(CFU/ml)＝菌落数/平板*稀释倍数；杀菌率(％)＝(1-对照组菌落数/对照组菌落数)×100％。活菌计数所用培养基为MH培养基，其配方如下：牛肉粉5.0g/L，可溶性淀粉1.5g/L，酪蛋白水解物17.5g/L，琼脂粉：12.5g/L，pH值7.4±0.2，参考SN/T1086-2002标准配方。重组抗菌肽药物终浓度为0.234mg/ml，供试菌分别为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，ATCC 29213)、大肠埃希菌(E.coli ATCC 25922)。对照细菌计数结果为：金黄色葡萄球菌为5*104CFU/ml,大肠埃希菌为1.4*105CFU/ml。实验结果见表1。
表1不同作用时间重组Fn3-Hc-CATH对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌杀菌作用(杀菌率％)
实施例3
重组Fn3-Hc-CATH对不同病原菌的杀菌作用
按实施例1方法获得重组抗菌蛋白，用Ф＝0.22μm滤菌器，滤过除菌后，作为试验用重组抗菌蛋白，采用悬液定量杀菌试验观察Fn3-Hc-CATH对不同病原菌的杀菌作用，供试菌株分别为金黄色葡萄球菌S.aureus，ATCC 29213)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis ATCC 12228)铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa ATCC27853)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae ATCC700603)、变形杆菌(Proteus ATCC49132)、大肠杆菌(Escherichia coli ATCC35218)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii多重耐药)以及嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)。方法如下：取浓度为1.4mg/ml的重组抗菌蛋白380μl+20μl的供试菌悬液，混匀后，分别于作用5小时，每个处理重复3次，分别以无菌生理盐水做对照，菌量终浓度大约为104CFU/ml,作用取50μl，涂布于MH平板上，置37℃恒温培养18-20小时，进行常规活菌计数，计算杀菌率，观察其杀菌效果，重复3次。活菌计数方法为：活菌数(CFU/ml)＝菌落数/平板*稀释倍数；杀菌率(％)＝(1-对照组菌落数/对照组菌落数)×100％。活菌计数所用培养基为MH培养基，其配方如下：牛肉粉5.0g/L，可溶性淀粉1.5g/L，酪蛋白水解物17.5g/L，琼脂粉：12.5g/L，pH值7.4±0.2，参考SN/T1086-2002标准配方。
表2 Fn3-Hc-CATH对不同病原菌的杀菌作用(杀菌率％)
实施例4
不同浓度的Fn3-Hc-TACH对大肠埃希菌的杀菌效果检测。
按实施例一方法获得重组抗菌蛋白，用Ф＝0.22μm滤菌器，滤过除菌后，作为试验用重组抗菌蛋白，以大肠埃希菌为供试菌株，采用悬液定量杀菌试验观察不同浓度的Fn3-Hc-TACH对大肠埃希菌的杀菌效果检测。方法如下：取重组抗菌蛋白用无菌生理盐水稀释成不同浓度后，各取380μl+20μl的大肠埃希菌菌悬液，混匀后，作用5小时后，取50μl，涂布于MH平板上，置37℃恒温培养18-20小时，进行常规活菌计数，每个处理重复3次，无菌生理盐水做对照。菌量终浓度大约为104CFU/ml,观察其杀菌效果，计算杀菌率，重复2次。活菌计数方法为：活菌数(CFU/ml)＝菌落数/平板*稀释倍数；杀菌率(％)＝(1-对照组菌落数/对照组菌落数)×100％。活菌计数所用培养基为MH培养基，其配方如下：牛肉粉5.0g/L，可溶性淀粉1.5g/L，酪蛋白水解物17.5g/L，琼脂粉：12.5g/L，pH值7.4±0.2，参考SN/T1086-2002标准配方。结果如下表3。
表3 不同浓度的Fn3-Hc-TACH对大肠埃希菌的杀菌效果(％)
本发明实施方式不限此，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和通用方法，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，本发明还可以有其它的实施方式。如可以用其它的大肠杆菌胞内表达载体等表达该类型的重组蛋白。因此，本发明还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更，均落在本发明权利保护范围之内。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 大连大学
<120> 一种制备抗菌重组蛋白的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 453
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 1
atgggtagtg gtcatcatca tcatcatcac ggcggtagtc gcgatctgga agttgttgca 60
gcaaccccga ccagtctgct gatttcttgg gatgcaccgg cagttaccgt tcgttattat 120
cgtattacct acggcgaaac cggcggtaat agtccggttc aggaatttac cgttccgggt 180
agtaaaagca ccgcgaccat tagcggtctg aaaccgggcg ttgattacac cattaccgtt 240
tacgcagtta ccggtcgcgg cgatagtccg gcaagcagca aaccgattag catcaactac 300
cgcaccgaga tcagcagcaa caacaacaac aacaacaaca acaacaacaa caacaacggc 360
ggcaaattct tcaaacgcct gctgaaaagc gttcgtcgcg cggtcaaaaa attccgcaaa 420
aaaccgcgcc tgattggtct gagtaccctg ctg 453
<210> 2
<211> 5705
<212> DNA
<213> 人工序列 (人工序列 )
<400> 2
tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60
cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120
ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180
gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240
acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300
ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360
ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420
acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480
tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540
tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600
tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660
actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720
gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780
aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840
agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900
cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960
aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020
tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080
tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140
taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200
ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260
tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320
tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380
cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440
cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500
gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560
gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620
agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680
aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740
agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800
cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860
accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920
aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980
ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040
cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100
gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160
tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220
agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280
tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340
caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400
ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460
gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520
gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580
gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640
aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700
ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760
acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820
ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880
tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940
tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000
cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060
gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120
ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180
catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240
ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300
gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360
gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420
ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480
atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540
cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600
tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660
ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720
aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780
atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840
cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900
gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960
tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020
agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080
gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140
ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200
catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260
tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320
tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380
gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440
ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500
tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560
catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620
cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680
tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740
ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800
ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860
cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920
gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga 4980
aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa 5040
ttttgtttaa ctttaagaag gagatatacc atgggtagtg gtcatcatca tcatcatcac 5100
ggcggtagtc gcgatctgga agttgttgca gcaaccccga ccagtctgct gatttcttgg 5160
gatgcaccgg cagttaccgt tcgttattat cgtattacct acggcgaaac cggcggtaat 5220
agtccggttc aggaatttac cgttccgggt agtaaaagca ccgcgaccat tagcggtctg 5280
aaaccgggcg ttgattacac cattaccgtt tacgcagtta ccggtcgcgg cgatagtccg 5340
gcaagcagca aaccgattag catcaactac cgcaccgaga tcagcagcaa caacaacaac 5400
aacaacaaca acaacaacaa caacaacggc ggcaaattct tcaaacgcct gctgaaaagc 5460
gttcgtcgcg cggtcaaaaa attccgcaaa aaaccgcgcc tgattggtct gagtaccctg 5520
ctgtaataag cttgcggccg cactcgagca ccaccaccac caccactgag atccggctgc 5580
taacaaagcc cgaaaggaag ctgagttggc tgctgccacc gctgagcaat aactagcata 5640
accccttggg gcctctaaac gggtcttgag gggttttttg ctgaaaggag gaactatatc 5700
cggat 5705
Claims (3)
1.一种制备抗菌重组蛋白的方法，其特征在于，所述方法采用编码Ⅲ型人纤维连接蛋白结构域(Fn3)蛋白的核苷酸序列，通过编码多聚天冬酰胺(Asn)核苷酸序列与编码海蛇抗菌肽(Hc-CATH)核苷酸序列重组，合成Ⅲ型人纤维连接蛋白Fn3与海蛇抗菌肽Hc-CATH融合基因后，在大肠杆菌体内表达后进行分离纯化。
2.如权利要求1所述的一种制备抗菌重组蛋白的方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：
(1)Ⅲ型人纤维连接蛋白Fn3融合Hc-CATH重组蛋白表达载体构建：在Fn3基因的5′-端前面引入编码6个组氨酸残基的核苷酸序列，在Fn3的3′末端通过编码多聚天冬酰胺(Asn)的核苷酸序列与编码Hc-CATH核苷酸序列依次首尾相连，构成Fn3-Hc-CATH的融合基因，即在所述融合基因上游-5’端引入编码6个组氨酸的分离纯化标签(His-tag)，将该融合基因用常规化学法合成后，克隆到大肠杆菌胞内表达载体pET28a(+)上得到重组表达质粒pET28a-Fn3-Hc-CATH重组质粒；
(2)重组蛋白Fn3-Hc-CATH BL21(DE3)菌株的筛选及表达：步骤(1)中获得的pET28a-Fn3-Hc-CATH重组质粒用于转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)，筛选出阳性转化子进行诱导表达后，收集菌体，检测蛋白质表达量及是否表达Fn3-Hc-CATH融合重组抗菌蛋白，筛选出高水平诱导表达Fn3-Hc-CATH重组蛋白工程菌株；
(3)重组Fn3-Hc-CATH抗菌蛋白分离纯化将步骤(2)诱导表达的菌体，提取胞内可溶重组蛋白，通过镍柱亲和层析方法，分离纯化携带His-tag的重组蛋白，获得纯化的重组Fn3-Hc-CATH抗菌蛋白；
(4)将步骤(3)纯化后的重组Fn3-Hc-CATH抗菌蛋白采用脱盐柱的方法除盐，低温保存。
3.如权利要求2所述的一种制备抗菌重组蛋白的方法，其特征在于，步骤(1)中组成多聚天冬酰胺的碱基序列数量为10-15个。
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| CN201811196799.0A CN109439680B (zh) | 2018-10-15 | 2018-10-15 | 一种制备抗菌重组蛋白的方法 |
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Citations (4)
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|---|---|---|---|---|
| CN103945704A (zh) * | 2011-06-09 | 2014-07-23 | 诺维信专利公司 | 生物活性分子的融合 |
| CN104497119A (zh) * | 2013-12-09 | 2015-04-08 | 王义鹏 | 一种天然抗菌肽及其应用 |
| CN106755042A (zh) * | 2016-12-29 | 2017-05-31 | 华东理工大学 | 一种基于组合自剪切与蛋白支架的生物活性小肽制备方法 |
| US9931437B2 (en) * | 2012-06-26 | 2018-04-03 | Worcester Polytechnic Institute | Matrix scaffold with antimicrobial activity |
-
2018
- 2018-10-15 CN CN201811196799.0A patent/CN109439680B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103945704A (zh) * | 2011-06-09 | 2014-07-23 | 诺维信专利公司 | 生物活性分子的融合 |
| US9931437B2 (en) * | 2012-06-26 | 2018-04-03 | Worcester Polytechnic Institute | Matrix scaffold with antimicrobial activity |
| CN104497119A (zh) * | 2013-12-09 | 2015-04-08 | 王义鹏 | 一种天然抗菌肽及其应用 |
| CN106755042A (zh) * | 2016-12-29 | 2017-05-31 | 华东理工大学 | 一种基于组合自剪切与蛋白支架的生物活性小肽制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Fusion peptide P15‐CSP shows antibiofilm activity and pro‐osteogenic activity when deposited as a coating on hydrophilic but not hydrophobic surfaces;Xian Li等;《Journal of Biomedical Materials Research Part A》;20151231;第103卷(第12期);第3736-3746页 * |
Also Published As
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|---|---|
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