CN103945704A - 生物活性分子的融合 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了融合蛋白，其包含与肠表面结合性结构域连接的酶，优选地饲料酶或食品酶。融合蛋白可用来促进动物中的饲料利用。在具体的实施例中，包含与植酸酶连接的肠表面结合性多肽区段的根据本发明的融合酶，在肠中显示增加的停留时间，使得给予酶增加的时间来催化相应反应，最终导致改善的饲料利用。

Description

生物活性分子的融合
本发明涉及，基于具有如本文下面所讨论的有黏附性质的微生物的适应特性，构建用于增加动物胃肠道中停留时间的多肽和酶的创新方法。
本发明尤其涉及与参考多肽或酶相比在动物饲料中显示改善性能的新型多肽和酶，例如饲料酶。
背景技术
农场动物，例如猪和家禽二者是通常被补充饲料酶以提高饲料利用的动物。
例如，植酸酶是单胃动物的常用饲料酶，用来改善动物饲料的营养价值并且减少对饲料进行的磷补充，从而降低集中型家畜生产地区的环境污染。
就任何饲料酶而言，产生的产物(本文是磷)量是底物(本文是植酸盐)浓度、酶活性和给予酶进行催化反应的时间量的函数，仍需要通过修饰酶制剂或通过开发新型的酶来优化饲料利用和酶活性。
技术背景简述
乳酸菌属（Lactobacillus）的成员以及其他细菌，特别是芽孢杆菌属（Bacillus）的成员经常出现在鸟类和哺乳动物的胃肠道中。对于能够定居在该开放流动环境中的细菌，对黏膜的黏附被认为是必要条件。肠的上皮细胞由保护性粘液层覆盖，所述保护性粘液层是糖蛋白和糖脂的复杂混合物，大的糖蛋白黏蛋白（mucin）是主要组分。定居在黏膜上的细菌可在粘液层中找到并且黏附在上皮细胞上。在大部分情况下，已经报道，黏附由蛋白质介导，但是也已经描述了在乳酸杆菌（lactobacilli）细胞表面上的糖类部分与黏膜组分相互作用。总结现有知识已知，微生物菌株黏附至胃肠组分上的能力，基于微生物菌株与胃肠粘液或其主要组分黏蛋白的亲和力，以及微生物菌株与由于肠上皮细胞脱落而陷入粘液中的胶原或当上皮细胞损伤时可获取的胶原的亲和力。还已知，天然肠生细菌(包括芽孢杆菌属的成员)能够形成生物膜并黏附到上皮细胞上，其比不能产生生物膜的细菌在肠道中明显坚持更长时间。所以，自产的胞外生物膜基质对于微生物菌株黏附至胃肠组分的能力而言也起必要的作用。
粘液结合蛋白已经主要在乳酸杆菌中表征。已知来自Lactobacillisreuteri1063的基因编码命名为Mub的细胞表面蛋白，所述细胞表面蛋白黏附到粘液组分上。Mub是大的多结构域蛋白质(357kDa)，其作为黏蛋白结合性结构域(MucBP，Pfam06458)共价地附着到细胞表面上。
胶原结合性结构域可分为两种类型：
Cna型蛋白，其原型是来自Staphylococcus aureus的蛋白A(Pfam05738)，介导细菌黏附至胶原上
CBD结构域，其是梭菌胶原酶的一部分。
TasA是由芽孢杆菌属的成员产生的生物膜的主要蛋白质组分。已经检测了与EPS(胞外聚合物质)和孢子二者相关的TasA，并且TasA被认为对表面黏附而言是必需的。
发明内容
本发明尤其涉及与多肽或酶，优选饲料酶或食物酶连接的肠表面结合性多肽区段。本发明还涉及编码由酶和肠表面结合性多肽区段组成的这种融合蛋白的DNA、包含该DNA的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及生产它们的方法，以及它们在例如动物饲料和动物饲料添加剂中的用途。
本发明还涉及促进动物中的饲料消化率的方法，其包括给动物施用根据本发明的融合蛋白。本发明还提供了包含这种融合蛋白的饲料组合物或预混物。
包含与酶连接的肠表面结合多肽区段的融合蛋白，特别是融合酶显示肠中增加的停留时间，这导致给予酶增加的时间量来进行催化相应，在饲料酶的情况下最终使得饲料利用改善。
基于蛋白质的同源性，本发明人已经在候选菌株益生菌Bacillussubtilis BSP1的基因组中鉴定了一种胶原结合性蛋白，所述胶原结合性蛋白参与前面提到的黏附现象。该蛋白质是本文后面描述的肠表面结合性多肽区段的第一个例子。根据本发明可使用的另一肠表面结合性多肽区段是来自Staphyloccus aureus的胶原结合结构域。其已知为Cna(ProtA)。
本发明人已经从与Citrobacter braakii的植酸酶基因appA融合的益生菌菌株B.subtilis BSP1基因bbsp1100和bbsp1101或来自S.aureus的cna基因的一部分构建了含有胶原结合结构域的融合蛋白。
在融合蛋白的一些实施方式中，胶原结合性多肽区段是细菌胶原-结合多肽区段。在更具体的实施方式中，胶原结合性多肽区段是梭菌属（Clostridium）胶原结合性多肽区段。
在本发明的另一实施方式中，胶原结合性多肽区段是胶原酶或细菌胶原酶或梭菌属胶原酶的区段。优选地，区段仅仅是胶原酶的一部分且胶原结合性多肽区段没有胶原酶活性。
本发明还涉及TasA或来自生物膜胞外基质的另一蛋白质用作间接肠结合性肽的用途，所述间接肠结合性肽来自Bacillus subtilis并且靶向肠中细菌生物膜和孢子二者。已经发现TasA蛋白的序列在如下所示的芽孢杆菌属的成员中高度保守。
芽孢杆菌属成员中TasA蛋白序列的保守性。
来自国立生物技术信息中心的BLASTP的结果(www.ncbi.nlm.nih.gov)
编码TasA，或来自生物膜胞外基质的另一蛋白质的DNA序列可融合在将与肠中生物膜和孢子结合的任何感兴趣的分子(例如肽、酶)的羧基末端或氨基末端部分处。本发明人已经从与Citrobacter braakii的植酸酶基因appA融合的益生菌菌株B.subtilis BSP1的基因bbsp3753构建了包含生物膜结合肽的融合蛋白。
本发明还涉及与如实施例中所公开的肠表面结合性多肽区段具有至少90%同一性的肠表面结合性多肽区段。
术语“融合蛋白”、“融合多肽”或“融合酶”可用来指单个多肽，其包含两个功能区段，例如，肠表面结合性多肽区段和酶，优选地饲料酶多肽区段。融合蛋白可以是任何大小，并且例如，通过单个多肽的两个单体的半胱氨酸二硫化物连接，融合蛋白的单个多肽可以在其功能状态时以多聚体形式存在。多肽区段可以是合成多肽或天然存在的多肽。这种多肽可以是多肽的一部分或可包括突变或更多。
术语“肠表面结合”可用来指与鸟类和哺乳动物的胃肠道的表面结合的任何类型的多肽序列，所述结合直接进行（与胶原或胞外基质(ECM)如纤连蛋白、纤维蛋白原、层粘连蛋白等结合），或间接地通过胃肠道分泌的粘液（与黏蛋白结合）和在肠上皮细胞脱落之后捕获的分子（胶原和ECM）进行，或通过由微生物群产生并黏附到肠表面上的生物膜或结构（structures）来实现。
根据本发明的优选的酶选自饲料或食品工业中使用的酶，本文也称为“饲料酶”或“食品酶”。特别有用的酶选自植酸酶(EC3.1.3.8或3.1.3.26)、木聚糖酶(EC3.2.1.8)、半乳聚糖酶(EC3.2.1.89)、α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)、蛋白酶(EC3.4.)、磷脂酶、β-葡糖醛酸糖苷酶(EC3.2.1.31)、碱性磷酸酶、淀粉酶，比如，例如，α-淀粉酶(EC3.2.1.1)、β-葡聚糖酶(EC3.2.1.4或EC3.2.1.6)或纤维素酶。磷脂酶的例子是磷脂酶A1(EC3.1.1.32)、磷脂酶A2(EC3.1.1.4)、溶血磷脂酶(EC3.1.1.5)、磷脂酶C(EC3.1.4.3)或磷脂酶D(EC3.1.4.4)。
本发明的植酸酶可以是任何野生型植酸酶或变体植酸酶的变体。
在本文上下文中，植酸酶是具有植酸酶活性的多肽，即这样的酶，其催化植酸盐(肌醇六磷酸盐)向(1)肌醇和/或(2)其单-、二-、三-、四-和/或五-磷酸盐和(3)无机磷酸盐的水解。
因特网(http://www.expasy.ch/enzyme/)上的酶位点是与酶命名相关的信息库。其主要基于生物化学和分子生物学国际联盟命名委员会(IUB-MB)的建议，并且其描述了已经提供EC(酶学委员会)编号的每一类型的表征过的酶(Bairoch A.The enzyme database,2000,Nucleic Acids Res28:304-305。也见来自NC-IUBMB的酶学命名手册，1992)。
根据酶位点，已知3种不同类型的植酸酶：所谓的3-植酸酶(替换名1-植酸酶；肌醇六磷酸酯3-磷酸水解酶，EC3.1.3.8)、所谓的4-植酸酶(替换名6-植酸酶，名字基于1L-编号系统而不是1D-编号，EC3.1.3.26)，和所谓的5-植酸酶(EC3.1.3.72)。就本发明的目的而言，所有3个类型包括在植酸酶的定义中。
植酸酶的例子是细菌植酸酶，例如革兰氏阴性植酸酶，比如大肠杆菌（E.coli）、柠檬酸杆菌（Citrobacter）和哈夫尼亚菌（Hafnia）植酸酶和其变体，包括本发明的植酸酶。真菌表达宿主的例子是Pichia、Saccharomyces和Aspergillus的物种。
根据本发明可与肠表面结合性区段连接的多肽是抗微生物肽或抗真菌肽。
抗微生物肽(AMP)的例子是CAP18、明串珠菌素(Leucocin A)、三色肽（Tritrpticin）、保护素-1（Protegrin-1）、死亡素（Thanatin）、防御素（Defensin）、乳铁蛋白、乳铁蛋白抗菌肽（Lactoferricin）和Ovispirin，比如Novispirin(Robert Lehrer，2000)、Plectasins，和抑制素(Statins)，包括WO03/044049和WO03/048148中公开的化合物和多肽，以及保留抗微生物活性的上述变体或片段。
抗真菌多肽(AFP)的例子是Aspergillus giganteus和Aspergillus niger肽，以及如WO94/01459和WO02/090384中公开的保留抗真菌活性的其变体和片段。
动物饲料中的性能
在具体的实施方式中，本发明的融合植酸酶通过增加其在动物胃肠道中的停留时间而与参考酶相比在动物中具有改善的性能。
在优选的实施方式中，本发明的交联植酸酶就酶活性而言与参考酶相比具有类似的性能。可在体外模型中通过如下测定酶活性：制备由30%大豆粉和70%玉米面组成的饲料样品；在40℃和pH3.0下预孵育它们30分钟，随后添加胃蛋白酶(3000U/g饲料)和植酸酶；在40℃和pH3.0下孵育样品60分钟，随后在pH4.0下孵育30分钟；停止反应；通过添加HCl至0.5M的终浓度并且在40℃下孵育2小时，接着进行一个冷冻-融解循环并在40℃下孵育1小时，来提取植酸和肌醇-磷酸盐；通过高效离子色谱分离植酸和肌醇-磷酸盐；测定残留的植酸磷(IP6-P)的量；计算植酸酶处理的和非植酸酶处理的空白样品中残留IP6-P的差异(该差异是降解的IP6-P)；和相对于参考植酸酶降解的IP6-P，表示本发明的植酸酶降解的IP6-P。
当然，施用相同量的参考植酸酶和本发明的融合植酸酶，所述量优选地基于植酸酶活性单位(FYT)。优选的剂量是125FYT/kg饲料。另一优选的剂量是250FYT/kg饲料。植酸酶可以纯化的植酸酶形式施用，或以发酵上清液的形式施用。优选地，纯化的植酸酶纯度为至少95%，所述纯度如通过SDS-PAGE测定。
在优选的实施方式中，相对于参考植酸酶降解的IP6-P值，本发明的纯化的融合植酸酶降解的IP6-P值至少是90%、95%、98%或至少相等。在仍进一步优选的实施方式中，相对于参考植酸酶降解的IP6-P值，本发明纯化的植酸酶降解的IP6-P值至少是105%、110%。
在仍进一步的具体实施方式中，可相对于参考植酸酶释放的磷的量，将本发明的融合植酸酶的相对性能计算为本发明的植酸酶释放的磷百分数。
核酸序列和构建体
本发明还涉及核酸序列，其包含编码根据本发明的融合蛋白或融合多肽，优选地融合植酸酶的核酸序列。
术语“分离的核酸序列”是指基本上没有其他核酸序列的核酸序列，例如，所述核酸序列是如通过琼脂电泳测定的至少约20%纯的、优选至少约40%纯的、更优选至少约60%纯的、甚至更优选至少约80%纯的和最优选至少约90%纯的核酸序列。例如，分离的核酸序列可通过基因工程中使用的标准克隆程序获得，以将来自其天然位置的核酸序列重新定位至其将进行复制的不同位点。克隆程序可包括切除和分离包含编码多肽的核酸序列的期望核酸片段，将片段插入载体分子，和将重组载体整合至其中将复制核酸序列的多个拷贝或克隆的宿主细胞。核酸序列可以是基因组来源、cDNA来源、RNA来源、半合成来源、合成来源，或其任何组合。
核酸构建体
核酸构建体包括可操作地与一种或多种下述控制序列连接的本发明的核酸序列，所述控制序列在与控制序列兼容的条件下指导编码序列在合适的宿主细胞中表达。表达将理解为包括参与多肽生产的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
如本文所使用的，术语“核酸构建体”指单链或双链的核酸分子，所述核酸分子分离自天然存在的基因或被修饰以含有以其他方式不能存在于自然界的核酸区段。当核酸构建体含有表达本发明的编码序列需要的控制序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”是同义词。
术语“控制序列”在本文定义为包括对于表达编码本发明的多肽的多核苷酸而言必要的或有利的所有组件。每个控制序列对编码多肽的核苷酸序列而言可以是天然的或外源的。这种控制序列包括但不限于前导序列、多腺苷化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。至少，控制序列包括启动子和转录以及翻译终止信号。为了引入便于控制序列与编码多肽的核苷酸序列编码区连接的特异性限制位点，控制序列可设置连接体（linker）。
术语“可操作地连接”在本文表示这样的构造（configuration），其中控制序列相对于多核苷酸序列的编码序列被放置在适当的位置处，从而控制序列指导多肽的编码序列表达。
当本文使用时，术语“编码序列”(CDS)意思是核苷酸序列，其直接指定其蛋白质产物的氨基酸序列。编码序列的边界一般由开放阅读框确定，其通常开始于ATG起始密码子或替代性的起始密码子，比如GTG和TTG。编码序列可以是DNA、cDNA或重组体核苷酸序列。
表达载体
术语“表达”包括参与本发明的多肽，即融合蛋白或融合多肽生产的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
术语“表达载体”在本文被定义为线性或环形DNA分子，其包含编码本发明多肽的多核苷酸，并且其可操作地与提供其表达的另外核苷酸连接。
可使用表达载体来表达编码本发明融合酶的核酸序列，所述表达载体通常包含编码启动子、操纵子、核糖体结合位点、翻译启动信号，和任选地，阻遏子基因或各种激活子基因的控制序列。
携带编码本发明融合植酸酶的DNA序列的重组体表达载体可以是可方便地进行重组体DNA程序的任何载体，并且载体的选择将通常取决于其将引入的宿主细胞。载体可以是当引入宿主细胞时被整入宿主细胞基因组并与其中已经整合了载体的染色体一起复制的载体。
宿主细胞
如本文所使用的，术语“宿主细胞”包括容易用包含本发明多核苷酸的核酸构建体进行转化、转染、转导等等的任何类型的细胞。
本发明还涉及包含本发明多核苷酸、有利地用于多肽重组生产的重组宿主细胞。包含本发明多核苷酸的载体被引入宿主细胞，从而载体作为如前面描述的染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体而被保持。术语“宿主细胞”包括由于复制期间发生突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何子代。宿主细胞的选择很大程度上将取决于编码多肽的基因和其来源。
宿主细胞可以是单细胞微生物，例如原核生物，或非单细胞微生物，例如真核生物。
有用的单细胞微生物是细菌细胞，比如革兰氏阳性细菌，包括但不限于芽孢杆菌属细胞，例如，Bacillus alkalophilus、Bacillusamyloliquefaciens、Bacillus brevis、Bacillus circulans、Bacillus clausii、Bacillus coagulans、Bacillus lautus、Bacillus lentus、Bacillus licheniformis、Bacillus megaterium、Bacillus stearothermophilus、Bacillus subtilis，和Bacillus thuringiensis；或链霉菌属（Streptomyces）细胞，例如，Streptomyces lividans和Streptomyces murinus，或革兰氏阴性细菌，比如大肠杆菌和Pseudomonas sp。在优选的方面中，细菌宿主细胞是Bacilluslentus、Bacillus licheniformis、Bacillus stearothermophilus或Bacillus subtilis细胞。在另一优选的方面中，芽孢杆菌属细胞是嗜碱性的芽孢杆菌属。
载体引入细菌宿主细胞可通过下述来实现：例如，原生质体转化(见，例如，Chang和Cohen,1979,Molecular General Genetics168:111-115)、使用感受态细胞(见，例如，Young和Spizizen,1961,Journal of Bacteriology81:823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,Journal of MolecularBiology56:209-221)、电穿孔(见，例如，Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques6：742-751)或接合(见，例如，Koehler和Thorne,1987,Journal of Bacteriology169：5771-5278)。
宿主细胞还可以是真核生物，比如哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞，或真菌细胞。
在优选的方面中，宿主细胞是真菌细胞。如本文所使用的“真菌”包括Ascomycota、Basidiomycota、Chytridiomycota和Zygomycota门(如Hawksworth等人，In,Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi,8thedition,1995,CAB International,University Press,Cambridge,UK中定义的)以及Oomycota门(如Hawksworth等人，1995，上文，171页引用的)和所有有丝分裂孢子真菌(Hawksworth等人，1995，上文)。
在更优选的方面中，真菌宿主细胞是酵母细胞。如本文所使用的“酵母”包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产单子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知真菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。因为将来酵母的分类可能发生变化，就本发明的目的而言，酵母应是如Biology and Activities of Yeast(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.,and Davenport,R.R.,eds,Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeries No.9,1980)所述定义的。
在甚至更优选的方面中，酵母宿主细胞是Candida、Hansenula、Kluyveromyces、Pichia、Saccharomyces、Schizosaccharomyces或Yarrowia细胞。
在最优选的方面中，酵母宿主细胞是Pichia pastoris、Pichiamethanolica、Saccharomyces carlsbergensis、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces diastaticus、Saccharomyces douglasii、Saccharomyceskluyveri、Saccharomyces norbensis或Saccharomyces oviformis细胞。在另一最优选的方面中，酵母宿主细胞是Kluyveromyces lactis细胞。在另一最优选的方面中，酵母宿主细胞是Yarrowia lipolytica细胞。
生产方法
本发明还涉及生产本发明的融合多肽或融合酶的方法，其包括：(a)在有助于生产融合多肽或融合酶的条件下培养宿主细胞；和(b)回收融合多肽或融合酶。
在本发明的生产方法中，使用本领域熟知的方法在适于生产融合多肽或融合酶的营养培养基中培养细胞。例如，可通在合适的培养基中且在使得多肽(或酶)被表达和/或分离的条件下，在实验室或工业发酵罐中通过摇瓶培养和小规模或大规模发酵(包括连续、分批、分批进料或固态发酵)进行培养细胞。在包含碳源和氮源以及无机盐的合适的营养培养基中使用本领域已知的程序进行培养。合适的培养基获得自商业供应商或可根据公开的组成来制备(例如，美国典型培养物保藏中心的产品目录中)。如果多肽被分泌至营养培养基，可直接从培养基中回收多肽。如果多肽没有被分泌，其可从细胞溶胞产物中回收。
可使用本领域已知的方法回收所得的融合多肽或融合酶。例如，可通过常规程序从营养培养基中回收多肽或酶，所述常规程序包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。
可通过本领域已知的各种程序纯化本发明的融合多肽或融合酶，所述程序包括但不限于色谱法(例如，离子交换、亲和性、疏水性、色谱聚焦和尺寸排阻)，电泳程序(例如，制备的等电子聚焦)、差别性溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(见，例如，Protein Purification,J.-C.Jansonand Lars Ryden,editors,VCH Publishers,New York,1989)。
组合物和用途
在仍进一步的方面中，本发明涉及包含本发明的融合多肽或融合酶，特别是融合饲料酶的组合物，以及使用这些组合物的方法。
可根据本领域已知的方法制备组合物，并且所述组合物可以是液态或干燥组合物的形式。例如，组合物可以是颗粒或微颗粒的形式。可根据本领域已知的方法稳定包括在组合物中的融合酶。
因此，本发明融合酶的优选用途是用在动物饲料制剂(包括人食品)或这种制剂的添加剂中。
在具体的实施方式中，本发明的融合酶可用于改善动物饲料的营养价值。改善动物饲料(包括人食品)营养价值的非限制性例子是：改善饲料消化率；促进动物的生长；改善饲料利用率；改善蛋白质的生物利用度；提高可消化的磷酸盐的水平；改善植酸盐的释放和/或降解；改善痕量矿物质的生物利用度；改善宏量矿物质的生物利用度；消除或减少对添加补充磷酸盐、痕量矿物质，和/或宏量矿物质的需要；和/或改善蛋壳质量。因而提高了饲料的营养价值，并且改善了动物的生长速度和/或体重增加和/或饲料转化率(即摄入的饲料的重量相对于体重增加)。
此外，本发明的融合-酶可用于降低粪便的植酸盐水平。
动物、动物饲料和动物饲料添加剂
术语动物包括所有动物，包括人类。动物的例子是非反刍动物，和反刍动物。反刍动物动物包括，例如绵羊、山羊和牛（例如母牛，比如肉牛和奶牛）的动物。在具体实施方式中，动物是非反刍动物。非反刍动物包括单胃动物，例如猪(pig或swine)(包括但不限于小猪、生长中的猪和母猪)；家禽，比如火鸡、鸭和鸡(包括但不限于肉雏鸡、蛋鸡)；鱼(包括但不限于鲑鱼、鲟鱼、罗非鱼、鲶鱼和鲤鱼)；和甲壳虫类(包括但不限于小虾和对虾)。
术语饲料或饲料组合物表示适于或打算被动物摄取的任何化合物、制剂、混合物，或组合物。
在根据本发明的用途中，融合酶在可在饮食之前、之后或与饮食同时地喂养给动物。优选后者。
在具体实施方式中，以添加至饲料的形式或当包括在饲料添加剂中时，融合酶基本上是纯的。在具体实施方式中，其被明确定义。术语“明确定义”表示如通过尺寸排阻色谱测定(见WO01/58275的实施例12)的，酶制剂是至少50%纯的。在其他具体的实施方式中，如通过该方法测定的，酶，例如植酸酶制剂是至少60%、70%、80%、85%、88%、90%、92%、94%或至少95%纯的。
酶制剂可被(a)直接添加至饲料(或直接用于蛋白质的处理方法中)，或(b)其可用于生产随后被添加至饲料(或用于处理过程)的一种或多种中间体组合物，比如饲料添加剂或预混物。不论按照上面的(a)还是(b)使用，上述的纯度程度指起始多肽制剂的纯度。
本发明的进一步方面涉及用于动物饲料的组合物，比如动物饲料添加剂，例如预混物。
通常，脂溶性和水溶性维生素，以及痕量矿物质形成打算添加至饲料的所谓预混物的一部分，而宏量矿物质通常被单独地添加至饲料。当富含本发明的酶时，这些组合物类型的任一种是本发明的动物饲料添加剂。
脂溶性维生素的例子是维生素A、维生素D3、维生素E和维生素K，例如维生素K3。
水溶性维生素的例子是维生素B12、生物素和胆碱、维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸、叶酸和泛酸，例如Ca-D-泛酸。
痕量矿物质的例子是锰、锌、铁、铜、碘、硒和钴。
宏量矿物质的例子是钙、磷和钠。
进一步地，任选的饲料添加剂成分是着色剂，例如类胡萝卜素，比如β-胡萝卜素、虾青素和叶黄素；香料化合物；稳定剂；抗微生物肽；多不饱和脂肪酸；产活性氧物质；和/或选自下述的至少一种其他多肽：植酸酶(EC3.1.3.8或3.1.3.26)；磷酸酯酶(EC3.1.3.1；EC3.1.3.2；EC3.1.3.39)；木聚糖酶(EC3.2.1.8)；半乳聚糖酶(EC3.2.1.89)；α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)；蛋白酶(EC3.4.-.-)，磷脂酶A1(EC3.1.1.32)；磷脂酶A2(EC3.1.1.4)；溶血磷脂酶(EC3.1.1.5)；磷脂酶C(3.1.4.3)；磷脂酶D(EC3.1.4.4)；淀粉酶比如，例如，α-淀粉酶(EC3.2.1.1)；和/或β-葡聚糖酶(EC3.2.1.4或EC3.2.1.6)。
多不饱和脂肪酸的例子是C18、C20和C22多不饱和脂肪酸，比如花生四烯酸、二十二碳六烯酸(docosohexaenoic acid)、二十碳五烯酸和γ-亚油酸。
产活性氧物质的例子是比如过硼酸盐(perborate)、过硫酸盐(persulphate)，或过碳酸盐(percarbonate)的化学品；和比如氧化酶、加氧酶或合成酶的多肽。
本发明还涉及动物饲料组合物。动物饲料组合物或膳食具有相对高的蛋白质含量。可如在WO01/58275，2-3栏的表B中所指示的对家禽和猪膳食进行表征。可如该表B的第4列所指示的对鱼膳食进行表征。此外，这种鱼膳食通常具有200-310g/kg的粗脂肪含量。
根据本发明的动物饲料组合物具有含量为50-800g/kg的粗蛋白质，和进一步地包括至少一种如本文所要求保护的融合酶。
此外，或可选地(针对上面指出的粗蛋白质含量)，本发明的动物饲料组合物的代谢能（metabolisable energy）含量为10-30MJ/kg；和/或钙的含量为0.1-200g/kg；和/或可用的磷含量为0.1-200g/kg；和/或甲硫氨酸的含量为0.1-100g/kg；和/或甲硫氨酸加半胱氨酸的含量为0.1-150g/kg；和/或赖氨酸的含量为0.5-50g/kg。
在具体的实施方式中，代谢能、粗蛋白质、钙、磷、甲硫氨酸、甲硫氨酸加半胱氨酸，和/或赖氨酸的含量在WO01/58275的表B的范围2、3、4或5的任何一个中(R.2-5)。
粗蛋白质计算为氮(N)乘以因子6.25，即粗蛋白质(g/kg)=N(g/kg)×6.25。通过Kjeldahl方法测定氮含量(A.O.A.C.,1984,OfficialMethods of Analhysis14th ed.,Association of Official Analytical Chemists,Washington DC)。
可基于如下计算代谢能：NRC publication Nutrient requirements inswine,ninth revised edition1988,subcommittee on swine nutrition,committeeon animal nutrition,board of agriculture,national research council。NationalAcademy Press,Washington,D.C.,pp.2-6以及the European Table of EnergyValues for Poultry Feed-stuffs,Spelderholt centre for poultry research andextension,7361DA Beekbergen,The Netherlands.Grafisch bedrijf Ponsen&looijen bv,Wageningen.ISBN90-71463-12-5。
基于比如Veevoedertabel1997,gegevens over chemische samenstelling,verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen,CentralVeevoederbureau,Runderweg6,8219pk Lelystad.ISBN90-72839-13-7的饲料表，计算完全动物膳食中钙、可用磷和氨基酸的膳食含量。
在具体实施方式中，本发明的动物饲料组合物包含至少一种蛋白质。蛋白质可以是动物蛋白质，比如肉和骨粉，和/或鱼粉；或其可以是植物蛋白。如本文所使用的术语植物蛋白指包括源自或来自植物的至少一种蛋白质(包括改性的蛋白质和蛋白质衍生物)的任何化合物、组合物、制剂或混合物。在具体的实施方式中，植物蛋白质的蛋白质含量是至少10、20、30、40、50或60%(w/w)。
植物蛋白质可衍生自植物蛋白质来源，比如豆类和谷类，例如来自Fabaceae(Leguminosae)、Cruciferaceae、Chenopodiaceae和Poaceae科的植物的材料，比如大豆粉、羽扇豆和油菜粉。
在仍进一步具体的实施方式中，本发明的动物饲料组合物包含0-80%的玉米；和/或0-80%高粱；和/或0-70%小麦；和/或0-70%大麦；和/或0-30%燕麦；和/或0-40%大豆粉；和/或0-25%鱼粉；和/或0-25%肉和骨粉；和/或0-20%乳清。
动物膳食可例如被加工成为麦芽浆饲料(非粒状)或粒状饲料或挤压的饲料。通常地，根据所叙述物质的说明，混合粉碎的饲料原料并且添加足够量的必需维生素和矿物质。根据本发明的融合酶可作为固态或液态多肽制剂添加。例如，通常在混合步骤之前或期间添加固体多肽制剂；并且通常在成粒步骤之后添加液态多肽制剂。
膳食中的最终融合酶浓度在每kg膳食为0.01-200mg多肽蛋白质的范围内，例如在每kg动物膳食为5-30mg多肽蛋白质的范围内。
当然，应当以有效量，即以足以改善饲料的溶解性和/或改善饲料的营养价值的量应用本发明的融合酶，特别是融合植酸酶。目前考虑，以下列量(剂量范围)的一种或多种施用多肽：0.01-200；0.01-100；0.5-100；1-50；5-100；10-100；0.05-50；或0.10-10–所有这些范围以每kg饲料的mg(ppm)酶或植酸酶多肽蛋白质为单位。
为了测定每kg饲料的mg酶或植酸酶多肽蛋白质，从饲料组合物纯化酶或植酸酶，并且使用相关检验测定纯化的酶的比活性。
实施例
本文描述和要求保护的本发明不限于本文公开的具体实施方式的范围，因为这些实施方式意图阐释本发明的若干方面。意图使任何等同实施方式处在本发明的范围内。的确，除了本文显示和描述的那些，从前面的描述中本发明的各种改变对本领域技术人员是明显的。这种改变也意图落在所附的权利要求范围内。
一般方法
在第一段，如下概括一般方法：
菌株和质粒。本发明的Bacillus subtilis菌株衍生自菌株1A747(Bacillus Genetic Stock Center,The Ohio State University,Columbus,Ohio43210USA)，其是B.subtilis168(trpC2)(GenBank AL009126)的原养型衍生物。
培养基。用于B.subtilis的标准基本培养基(MM)包含1X Spizizen盐、0.04%谷氨酸钠和0.5%葡萄糖。标准固体完全培养基是胰蛋白胨血琼脂发酵液（Tryptone Blood Agar Broth，TBAB，Difco)。标准液体完全培养基是小牛肉浸出液-酵母提取物发酵液(Veal Infusion-Yeast Extract broth，VY)。如下描述这些培养基的组成：
TBAB培养基：33g Difco胰蛋白胨血琼脂培养基（Tryptone BloodAgar Base，目录#0232)，1L水。高压灭菌。
VY培养基：25g Difco小牛肉浸出液发酵液（Veal Infusion Broth，目录#0344)，5g Difco酵母提取物(目录#0127)，1L水。高压灭菌。
基本培养基(MM)：100ml10X Spizizen盐；10ml50%葡萄糖；1ml40%谷氨酸钠，用水补足1L。
10X Spizizen盐：140g K2HPO4；20g(NH4)2SO4；60g KH2PO4；10g2H2O柠檬酸钠；2g MgSO4.7H2O；用水补足1L。
10X VFB基本培养基(10X VFB MM)：2.5g谷氨酸钠；15.7gKH2PO4；15.7g K2HPO4；27.4g Na2HPO4.12H2O；40g NH4Cl；1g柠檬酸；68g(NH4)2SO4；用水补足1L。
痕量元素溶液：1.4g MnSO4·H2O；0.4g CoCl2·6H2O；0.15g(NH4)6Mo7O24·4H2O；0.1g AlCl3·6H2O；0.075g CuCl2·2H2O；用水补足200ml。
Fe溶液：0.21g FeSO4.7H2O；用水补足10ml。
CaCl2溶液：15.6g CaCl2.2H2O；用水补足500ml。
Mg/Zn溶液：100g MgSO4.7H2O；0.4g ZnSO4.7H2O；用水补足200ml。
VFB MM培养基：100ml10X VFB MM；10ml50%葡萄糖；2ml痕量元素溶液；2ml Fe溶液；2ml CaCl2溶液；2ml Mg/Zn溶液；882ml灭菌蒸馏水。
促进生物膜发展的MSgg培养基：2.5mM KH2PO4、2.5mM K2HPO4、100mM MOPS、2mM MgCl2、700μM CaCl2、50μM MnCl2、1μM ZnCl2、50μM FeCl3、2μM硫胺、0.5%甘油、0.5%谷氨酸、50μg/ml色氨酸、50μg/ml苯丙氨酸。
分子和遗传技术。标准遗传和分子生物技术学通常是本领域已知的并且之前已经描述过了。DNA转化、PBS1普遍性转导和其他标准的B.subtilis遗传技术也是本领域普遍已知的并且之前已经描述过(Harwood和Cutting，1992)。
蛋白质纯化。在VY培养基中在37℃下孵育24h之后，在6000rpm下离心培养物10min。为了浓缩蛋白质，通过在4℃下缓慢添加，将80%硫酸铵添加至含有感兴趣的带His-标签的蛋白质的上清液中。10,000rpm下离心15min之后，在20mM Tris-HCl、20mM咪唑、500mM NaCl，pH7.4下的5mL缓冲液中回收球团蛋白质，然后在4℃下1L的相同缓冲液中进行两次连续的透析。过滤之后，将浓缩的蛋白质应用至组氨酸亲和色谱柱(HisTrap Fast Flow，GE Healthcare)。根据制造商建议并且如本领域技术人员已知的，纯化感兴趣的带His-标签的蛋白质。透析通过SDS-PAGE鉴定出的含感兴趣蛋白质的馏分，以去除痕量咪唑。
植酸酶活性检验。如Han Woo等(2003)描述的，在50℃和pH4下评定Citrobacter braakii植酸酶活性。首先，在50℃下用100mM C4H6O4、2mM C6H18O24P6、1mM CaCl2，pH4下的300μL的反应缓冲液，孵育75μL的样品。在30min之后通过添加375μL15%三氯乙酸(v/w)，终止酶反应。然后，通过用450μL蒸馏水和500μL600mM H2SO4、100mMC6H7NaO6、4mM(NH4)6Mo7O24的溶液在50℃下孵育50μL停止的初步反应液20min，来测量释放的正磷酸盐。然后在820nm下测量光密度。然后根据下式测量酶活性：
活性(U/L)=[(OD样品–OD空白)×稀释因子]/(系数cal×30min)
斑点印迹结合检验。根据ELISA程序，使用抗-HisTag的第一抗体(Santa Cruz Biotechnologies)和与过氧化物酶连接的第二抗-兔抗体(Sigma)，进行与I型和IV型胶原的结合试验。用ECL Plus试剂盒(GE Healthcare)根据制造商的建议来展示。根据本领域技术人员熟知的斑点印迹程序，蛋白质初次显现为斑点。
生物膜结合检验。在如“蛋白质纯化”章节描述的纯化之后，将Bacillus subtilis的生物膜结合性结构域TasA与Citrobacter braakii植酸酶氨基端的融合体混合至在VY培养基中过夜制备的Bacillus subtilis BSP1生物膜形成者（biofilm former）的预培养物中。通过下列相同程序制备对照，而省略将TasA_BSP1-Phy融合蛋白混合至Bacillus subtilis BSP1预培养物中的步骤。将100μl的各自混合物倾注在补充0.5%琼脂的MSgg培养基的表面上。将静止的培养物在22℃下孵育5天，以诱导生物膜形成。然后用灭菌环收集生物膜并且用由20mM Tris-HCl、300mM NaCl和1mMCaCl2制成的溶液冲洗3次，以便除去未并入Bacillus subtilis BSP1生物膜中的TasA_BSP1-Phy蛋白质融合体。然后，将生物膜悬浮在反应缓冲液中用于检验植酸酶活性，如“植酸酶活性检验”章节所描述的。
实施例1–设计翻译融合体Cna_BSP1-phy
该实施例描述了下述合成基因，所述合成基因被设计为过表达在未驯化的有益菌株B.subtilis BSP1中鉴定的Cna型胶原结合性结构域与Citrobacter braakii植酸酶氨基端的融合体。
从5’至3’，构建体分别含有(表1)：
-)来自B.sutbilis amyQ的启动子区域
-)来自B.subtilis ytwD基因的信号肽(编码前32个AA)
-)B.subtilis BSP1基因序列，其编码可能包含3个结合基序并且缺失其前36个AA(信号肽)的1076AA Cna型胶原结合性蛋白
-)10个丙氨酸间隔物(包括PvuII限制位点)
-)缺失其前22个AA(信号肽)的密码子对优化的Citrobacter brakii植酸酶基因appA
-)56bp序列，其分别含有凝血酶原酶切位点、六组氨酸标签、两个连续的终止密码子和NheI酶切位点。
表1。Cna_BSP1-phy翻译融合体的序列。BamHI、SalI、PvuII和NheI克隆位点为粗体加下划线。丙氨酸间隔物区域为大写加下划线。密码子对优化的植酸酶序列为斜体大写。His-标签为粗体小写。终止密码子为粗体大写。肽信号为下划线小写。启动子为斜体小写。
实施例2–设计翻译融合体Cna-phy
该实施例描述了下述合成基因，所述合成基因被设计为过表达Staphyloccus aureus的胶原结合性结构域Cna与Citrobacter braakii植酸酶氨基端的融合体。
从5’至3’，构建体分别含有(表2)：
-)来自B.sutbilis amyQ的启动子区域
-)来自B.subtilis ytwD基因的信号肽(编码前32个AA)
-)编码缺失其前30个AA(信号肽)的313AA胶原结合性蛋白的Staphylococcus aureus cna序列
-)10个丙氨酸间隔物(包括PvuII限制位点)
-)缺失其前22个AA(信号肽)的密码子对优化的Citrobacter brakii植酸酶基因appA
-)56bp序列，其分别包含凝血酶原酶切位点、六组氨酸标签、两个连续的终止密码子和NheI酶切位点。
表2。Cna-phy翻译融合体的序列。BamHI、SalI、PvuII和NheI克隆位点为粗体加下划线。丙氨酸间隔物区域为大写加下划线。密码子对优化的植酸酶序列为斜体大写。His-标签为粗体小写。终止密码子为粗体大写。肽信号为下划线小写。启动子为斜体小写。
实施例3-构建表达融合体Cna_BSP1-phy的B.subtilis菌株
该实施例描述被设计为过表达Cna_BSP1-phy融合体的B.subtilis菌株BSPB29的构建。
如本领域技术人员已知的，cna_BSP1-phy合成基因被插入进多拷贝质粒中，然后转化进蛋白酶缺陷型B.subtilis菌株。
实施例4-构建表达融合体Cna-phy的B.subtilis菌株
该实施例描述被设计为过表达Cna-phy的B.subtilis菌株BSPB32的构建。
如本领域技术人员已知的，Cna-phy合成基因被插入多拷贝质粒中，然后转化进蛋白酶缺陷型B.subtilis菌株。
实施例5–设计翻译融合体Cna_Dd-amy
该实施例描述了下述合成基因，所述合成基因被设计为过表达Denitrobacterium detoxificans的胶原结合性结构域Cna(来自Dr.Stanton,National Animal Disease Ctr,USDA-Agricultural Research Service,Ames,Iowa，美国的馈赠)与α-淀粉酶的氨基端的融合体。
从5’至3’，构建体分别含有(表3)：
-)来自B.sutbilis amyQ的启动子区域
-)来自B.subtilis ytwD基因的信号肽(编码前32个AA)
-)Denitrobacterium detoxificans Dd01g014920序列，其编码771个AA的胶原结合性蛋白
-)10个丙氨酸间隔物(包括PvuII限制位点)
-)缺失其前38个AA(信号肽)的Bacillus licheniformis α-淀粉酶基因amyL，
-)56bp序列，其分别包含凝血酶原酶切位点、六组氨酸标签、两个连续的终止密码子和NheI酶切位点。
表3。Cna_Dd-amy翻译融合体的序列。BamHI、SalI、PvuII和NheI克隆位点为粗体加下划线。丙氨酸间隔物区域为大写加下划线。B.licheniformisα-淀粉酶序列为小写。His-标签为粗体小写。终止密码子为粗体大写。肽信号为下划线小写。启动子为斜体粗体小写。
实施例6–Cna_BSP1-phy融合体的胶原-亲和力结合
该实施例表明纯化的Cna_BSP1-phy融合体与I型和IV型胶原的体外结合。
图1显示与Cna_BSP1-phy融合体的斑点印迹。不同递减量的胶原已经在膜上出现，然后用恒定量的Cna_BSP1-phy融合体(5nM)孵育。使用抗翻译融合体his-标签的第一抗体通过ELISA来展示。
实施例7–Cna-phy融合体的胶原-亲和力结合
该实施例表明纯化的Cna-phy融合体与I型和IV型胶原的体外结合。
图2显示与Cna-phy融合体的斑点印迹。不同递减量的胶原已经在膜上出现，然后用恒定量的Cna-phy融合体(5nM)孵育。使用抗翻译融合体his-标签的第一抗体通过ELISA来展示。
实施例8–Cna-BSP1-phy的亲和力图谱
该实施例表明含胶原结合性结构域的融合体也能够体外结合其他胞外基质(ECM)蛋白，即层粘连蛋白、纤连蛋白和纤维蛋白原。
图3显示与Cna_BSP1-phy融合体的斑点印迹。两种不同量的胞外基质(ECM)蛋白已经在膜上出现，然后用恒定量的Cna_BSP1-phy融合体(5nM)孵育。使用抗翻译融合体his-标签的第一抗体通过ELISA来展示。
实施例9–结合胶原的Cna-phy融合体的植酸酶活性
该实施例表明，结合胶原的融合体展示显著的植酸酶活性。
图4显示与I型和IV型胶原结合的植酸酶酶活性的直方图。如图4中提到的不同量的靶胶原已经包被在微量滴定板上，然后用恒定量的Cna-phy融合体(50nM)孵育。冲洗之后，如一般方法中所描述的，评定结合了胶原的融合体的植酸酶活性。结合了胶原的植酸酶活性显著高于在用BSA(10ug)包被的孔中孵育后观察到的活性。
实施例10–设计翻译融合体CBD-phy
该实施例描述了下述合成基因，所述合成基因被设计为过表达Clostridium histolyticum胶原酶的胶原结合性结构域CBD与Citrobacterbraakii植酸酶氨基端的融合体。
从5’至3’，构建体分别含有(表4)：
-)来自B.sutbilis amyQ的启动子区域
-)来自B.subtilis ytwD基因的信号肽(编码前32个AA)
-)Clostridium histolyticum序列，其编码来自colH S2B和S3结构域的215个AA(Yoshihara等，1994)
-)10个丙氨酸间隔物(包括PvuII限制位点)
-)缺失其前22个AA(信号肽)的密码子对优化的Citrobacter brakii植酸酶基因appA
-)56bp序列，其分别包含凝血酶原酶切位点、六组氨酸标签、两个连续的终止密码子和NheI酶切位点。
表4。CBD-phy翻译融合体的序列。BamHI、SalI、PvuII和NheI克隆位点为粗体加下划线。丙氨酸间隔物区域为大写加下划线。密码子对优化的植酸酶序列为斜体大写。His-标签为粗体小写。终止密码子为粗体大写。肽信号为下划线小写。启动子为斜体小写。
实施例11–设计翻译融合体MubBP(RI+RII)-phy
该实施例描述了下述合成基因，所述合成基因被设计为过表达Lactobacillus reuteri1063的黏蛋白结合性结构域与Citrobacter braakii植酸酶氨基端的融合体。
从5’至3’，构建体分别含有(表5)：
-)来自B.sutbilis amyQ的启动子区域
-)来自B.subtilis ytwD基因的信号肽(编码前32个AA)
-)序列Genebank AF120104中位置549和位置939之间的Lactobacillusreuteri1063Mub1(RI+RII重复序列)的390个AA(Roos和Jonsson，2002)
-)10个丙氨酸间隔物(包括PvuII限制位点)
-)缺失其前22个AA(信号肽)的密码子对优化的Citrobacter brakii植酸酶基因appA
-)56bp序列，其分别包含凝血酶原酶切位点、六组氨酸标签、两个连续的终止密码子和NheI酶切位点。
表5。MubBP(RI+RII)-phy翻译融合体的序列。BamHI、SalI、PvuII和NheI克隆位点为粗体加下划线。丙氨酸间隔物区域为大写加下划线。密码子对优化的植酸酶序列为斜体大写。His-标签为粗体小写。终止密码子为粗体大写。肽信号为下划线小写。启动子为斜体小写。
实施例12–生产融合体MubBP(RI+RII)-phy
该实施例描述被设计为过表达MubBP(RI+RII)-phy的B.subtilis菌株BSPB33的构建以及所述菌株的纯化。
如本领域技术人员已知的，MubBP(RI+RII)-phy合成基因被插入多拷贝质粒，然后转化进蛋白酶-缺陷型B.subtilis菌株中。根据在一般方法章节所描述的程序进行纯化之后，获得植酸酶比活性为3500U/g的MubBP(RI+RII)融合体。
实施例13–MubBP(RI+RII)-phy融合体的黏蛋白-亲和力结合
该实施例表明纯化的MubBP(RI+RII)-phy融合体与黏蛋白的体外结合。
图5显示与MubBP(RI+RII)-phy融合体的斑点印迹。两种不同量的黏蛋白已经在膜上出现，然后用恒定量的MubBP(RI+RII)-phy融合体(30nM)孵育。使用抗翻译融合体his-标签的第一抗体通过ELISA来展示。
实施例14–设计翻译融合体MubBP(R5+R6)-phy
该实施例描述了下述合成基因，所述合成基因被设计为过表达Lactobacillus reuteri1063的黏蛋白结合性结构域R5和R6与Citrobacterbraakii植酸酶氨基端的融合体。
从5’至3’，构建体分别含有(表6)：
-)来自B.sutbilis amyQ的启动子区域
-)来自B.subtilis ytwD基因的信号肽(编码前32个AA)
-)序列Genebank AF120104中位置2105和位置2475之间的Lactobacillus reuteri1063R5+R6重复序列的370个AA(Roos和Jonsson，2002)
-)10个丙氨酸间隔物(包括PvuII限制位点)
-)缺失其前22个AA(信号肽)的密码子对优化的Citrobacter brakii植酸酶基因appA
-)56bp序列，其分别包含凝血酶原酶切位点、六组氨酸标签、两个连续的终止密码子和NheI酶切位点。
表6、MubBP(R5+R6)-phy翻译融合体的序列。BamHI、SalI、PvuII和NheI克隆位点为粗体加下划线。丙氨酸间隔物区域为大写加下划线。密码子对优化的植酸酶序列为斜体大写。His-标签为粗体小写。终止密码子为粗体大写。肽信号为下划线小写。启动子为斜体小写。
实施例15–设计翻译融合体SpaB-phy
该实施例描述了下述合成基因，所述合成基因被设计为过表达来自Lactobacillus rhamnosus GG的SpaB的黏附结构域与Citrobacter braakii植酸酶氨基端的融合体。
从5’至3’，构建体分别含有(表7)：
-)来自B.sutbilis amyQ的启动子区域
-)来自B.subtilis ytwD基因的信号肽(编码前32个AA)
-)序列LGG_00443中位置27和位置203之间Lactobacillus rhamnosusGG黏附结构域177个AA
-)10个丙氨酸间隔物(包括PvuII限制位点)
-)缺失其前22个AA(信号肽)的密码子对优化的Citrobacter brakii植酸酶基因appA
-)56bp序列，其分别包含凝血酶原酶切位点、六组氨酸标签、两个连续的终止密码子和NheI酶切位点。
表7、SpaB-phy翻译融合体的序列。BamHI、SalI、PvuII和NheI克隆位点为粗体加下划线。丙氨酸间隔物区域为下划线小写斜体。密码子对优化的植酸酶序列为斜体大写。His-标签为粗体小写。终止密码子为粗体大写。肽信号为下划线小写。启动子为斜体小写。
实施例16–设计翻译融合体Msa-phy
该实施例描述了下述合成基因，所述合成基因被设计为过表达Lactobacillus platarum甘露糖特异性黏附Msa的conA样凝集素结构域与Citrobacter braakii植酸酶氨基端的融合体。
从5’至3’，构建体分别含有(表8)：
-)来自B.sutbilis amyQ的启动子区域
-)来自B.subtilis ytwD基因的信号肽(编码前32个AA)
-)来自Lactobacillus plantarum Msa的刀豆素样凝集素结构域：序列EHS83650中位置263和位置517之间的257个AA
-)10个丙氨酸间隔物(包括PvuII限制位点)
-)缺失其前22个AA(信号肽)的密码子对优化的Citrobacter brakii植酸酶基因appA
-)56bp序列，其分别包含凝血酶原酶切位点、六组氨酸标签、两个连续的终止密码子和NheI酶切位点。
表8、Msa-phy翻译融合体的序列。BamHI、SalI、PvuII和NheI克隆位点为粗体加下划线。丙氨酸间隔物区域为下划线小写斜体。密码子对优化的植酸酶序列为斜体大写。His-标签为粗体小写。终止密码子为粗体大写。肽信号为下划线小写。启动子为斜体小写。
实施例17–设计翻译融合体tasA_BSP1-phy
该实施例描述下述基因序列，设计所述基因序列来过表达未驯化的优势菌株B.subtilis BSP1的TasA蛋白与Citrobacter braakii植酸酶氨基端的融合体。
从5’至3’，构建体分别含有(表9)：
-)来自B.sutbilis amyQ的启动子区域
-)来自B.subtilis ytwD基因的信号肽(编码前32个AA)
-)B.subtilis BSP1基因序列，其编码261个AA TasA蛋白(编码生物膜基质的主要组分)，缺失其终止子
-)10个丙氨酸间隔物(包括PvuII限制位点)
-)缺失其前22个AA15(信号肽)的密码子对优化的Citrobacter brakii植酸酶基因appA
-)56bp序列，其分别包含凝血酶原酶切位点、六组氨酸标签、两个连续的终止密码子和NheI酶切位点。
表9、tasA_BSP1-phy翻译融合体的序列。BamHI、SalI、PvuII和NheI克隆位点为粗体加下划线。丙氨酸间隔物区域为大写加下划线。密码子对优化的植酸酶序列为斜体大写。His-标签为粗体。
实施例18-构建表达融合体tasA_BSP1-phy的B.subtilis菌株
该实施例描述被设计为过表达tasA_BSP1-phy融合体的B.subtilis菌株BSP1-28的构建。
用具有SalI限制位点的引物(5’-GCATGTCGACATGGGTATGAAAAAGAAATTGAG)和具有PvuII限制性位点的引物(5’-GCATCAGCTGCTGCATTTTTATCCTCGCTGTGCGCTTTTTC)，通过PCR扩增tasA_BSP1基因。所得PCR产物被SalI和PvuII限制酶双消化。凝胶纯化之后，将tasA_BSP1片段插入之前已经被SalI和PvuII限制酶双消化的多拷贝质粒(描述于实施例GS3中)中。如本领域技术人员已知的，接着将携带tasA_BSP1-phy融合体的重组载体转化进B.subtilis168菌株中。
实施例19–生物膜结合性TasA_BSP1-Phy融合体的植酸酶活性
该实施例表明，与细菌生物膜结合的融合体展示显著的植酸酶活性。图6(补充有TasA_BSP1-Phy融合蛋白的B.subtilis BSP1生物膜的植酸酶活性)显示与B.subtilis BSP1生物膜结合的植酸酶酶活性的直方图。冲洗之后，如“一般方法”章节中描述的，评定结合了生物膜的融合体的植酸酶活性。通过省略将TasA_BSP1-Phy融合体蛋白混合至Bacillus subtilisBSP1生物膜形成者的预培养物这一步骤所制备的对照显示B.subtilis的内源性植酸酶活性。已经用TasA_BSP1-Phy融合蛋白孵育的生物膜中测定的植酸酶活性(720U/mg总蛋白质)显著高于B.subtilis BSP1的内源性植酸酶活性。这种额外的活性归因于结合了生物膜的植酸酶。一个单位的植酸酶被定义为，在1min内从植酸钠中释放1μmol的无机磷酸盐需要的酶量。

Claims (14)

1.一种组合物，其包含与多肽或酶，优选饲料酶或食品酶连接的肠表面结合性多肽区段。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述肠表面结合性多肽区段是细菌胶原结合性多肽区段。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述肠表面结合性多肽区段是粘液结合性蛋白的区段。
4.权利要求1-3任一项所述的组合物，其中所述酶是植酸酶。
5.权利要求1-4任一项所述的组合物，其中所述肠表面结合性多肽区段和酶是融合蛋白的部分。
6.一种经分离的核酸序列，其包含编码权利要求1-5任一项所述的组合物的核酸序列。
7.一种核酸构建体，其包含与一种或多种控制序列可操作地连接的如权利要求6所述的核酸序列，所述控制序列指导在合适的表达宿主中生产所述融合蛋白。
8.一种重组体表达载体，其包含权利要求7所述的核酸构建体。
9.一种重组体宿主细胞，其包含权利要求7所述的核酸构建体和/或权利要求8所述的表达载体。
10.生产权利要求1-5任一项所述的组合物或融合蛋白的方法，其包括：(a)培养权利要求9所述的宿主细胞，以生产包含所述融合蛋白的上清液，和(b)回收所述融合蛋白。
11.一种动物饲料组合物，其包含权利要求1-5任一项所述的至少一种组合物或融合蛋白，和
(a)至少一种脂溶性维生素；
(b)至少一种水溶性维生素；和/或
(c)至少一种痕量矿物质。
12.改善动物饲料的营养价值的方法，其中将权利要求1-5任一项所述的至少一种组合物或融合蛋白添加至所述饲料。
13.促进动物中饲料利用的方法，其包括给所述动物施用权利要求1-5任一项所述的组合物。
14.权利要求1-5任一项所述的组合物用于促进动物中饲料利用的用途。
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